DE814296C - Verfahren zur Trennung und Gewinnung der optischen Antipoden von racemischen Aminosaeuren - Google Patents

Verfahren zur Trennung und Gewinnung der optischen Antipoden von racemischen Aminosaeuren

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DE814296C
DE814296C DEJ287D DEJ0000287D DE814296C DE 814296 C DE814296 C DE 814296C DE J287 D DEJ287 D DE J287D DE J0000287 D DEJ0000287 D DE J0000287D DE 814296 C DE814296 C DE 814296C
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Description

(WiGBl. S. 175)
AUSGEGEBEN AM 20. SEPTEMBER 1951
J 287 IV c112 q
Es ist bekannt, daß sich Hippursäure (Benzoylaminoessigsäure) durch das Enzym Hippuricase in Benzoesäure und Aminoessigsäure spalten läßt. Nach einer Veröffentlichung von C. N e u b e r g und K. Linhardt (Biochemische Zeitschrift 1924; 147, 372—76) ist es bekannt, daß Benzoylaminopropionsäure, die der Hippursäure ähnlich ist, sich durch das Enzym Hippuricase vorwiegend asymmetrisch spalten läßt. Die Spaltungswirkung des Enzyms setzte hierbei nach kurzer Zeit aus. Das Verfahren konnte infolgedessen für eine Trennung der beiden Isomeren unter Gewinnung des D-Isomeren und des L-Isomeren nicht in Betracht kommen.
Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein allgemein anwendbares Verfahren, das eine vollkommene Trennung der Isomeren racemischer Aminosäuren unter Gewinnung des reinen D-Isomeren und des reinen L-Isomeren gestattet. Die Erfindung beruht im wesentlichen darauf, daß eine acylierte Aminosäure der Einwirkung einer Amidase bei einem für den Vorgang geeigneten ph-Wert bei geeigneter Temperatur unterworfen und das Verfahren unter praktischer Konstanthaltung des pH-Werts so lange fortgeführt wird, bis das optische Drehvermögen der Lösung konstant geworden ist. Unter diesen Bedingungen bleibt die Spaltungstätigkeit der Amidase erhalten, bis das gesamte acylierte L-Isomer der Aminosäure in die Acylverbindung und die freie L-Aminosäure hydrolysiert ist. Der nicht hydrolysierte Teil der Acylaminosäure und der Teil der Aminosäure, von der die Acylverbindung abgespalten wurde, können alsdann z. B. auf Grund ihrer verschiedenen Löslichkeit getrennt werden. In Ausübung der Erfindung kann man z. B. wie
folgt verfahren: Zunächst wird die zu behandelnde racemische Aminosäure z. B. durch Einwirkung eines Anhydrids oder Säurechlorids einer einbasischen . Carbonsäure acyliert. Hierbei werden vorteilhaft niedrige Fettsäuren, wie z. B., Ameisensäure oder Essigsäure verwendet, da sich die Formyl- und Acetylverbindungen der meisten Aminosäuren leicht durch einfaches Erhitzen der Aminosäure, z. B. mit Essigsäureanhydrid, wasserfreier ίο Ameisensäure oder einem Gemisch beider herstellen lassen. Die mit niedrigen Fettsäuren hergestellten Acylaminosäureverbindungen besitzen den Vorzug, daß sie im allgemeinen in Wasser leicht löslich sind, wodurch die Herstellung von für die Spaltung mittels Enzymen geeigneten Lösungen erleichtert wird. Ein weiterer "Vorteil der Anwendung niedriger Fettsäuren liegt in ihrer Flüchtigkeit, weiche eine leichte Entfernung der Fettsäuren nach erfolgter Enzymspaltung gestattet. In Fällen, ao in denen einbasische Carbonsäuren angewendet werden, die sich nicht durch einfaches Erhitzen in Reaktion mit der Aminosäure bringen lassen, kann man sich anderer bekannter Methoden bedienen, wie solche in den Ausführungsbeispielen enthalten »5 sind.
Zwecks Durchführung des Spaltungsvorgangs wird die acylierte Aminosäure in eine vorzugsweise verdünnte, z. B. i- bis 2%ige Lösung übergeführt. Als Lösungsmittel wird vorzugsweise Wasser verwendet. Andere geeignete Lösungsmittel sind z. B. verdünnter Methyl- oder Äthylalkohol.
Als Spaltungsmittel werden Enzyme aus der Gruppe der Amidasen verwendet, die tierischer oder pflanzlicher Herkunft sein können. Amidase ist z. B. in Pankreatin und in. Enzympräparaten aus Pflanzen, z. B. Aspergillus Oryzae, enthalten. Zweckmäßig werden handelsübliche amidasehaltige Enzympräparate verwendet.
Es empfiehlt sich, der Lösung der acylierten Aminosäure eine größere Menge an Enzym zuzusetzen, als für die Spaltung notwendig" ist. Im allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, auf ιoo Teile der acylierten Aminosäure mindestens etwa 25 Teile, z. B. 25 bis 100 Teile des Amidasepräparats anzuwenden. Zwecks Vorbereitung der Lösung wird diese auf eine Temperatur gebracht, bei der das anzuwendende Enzym am aktivsten ist. Die Temperaturen, auf welche die verschiedenen Amidasepräparate erhitzt werden sollen, sind bekannt; sie liegen zumeist bei etwa 370. Der pH-Wert wird ebenfalls auf den Wert eingestellt, bei dem das Enzym optimale Wirksamkeit zeigt. Die für die einzelnen Enzympräparate bestgeeigneten pirWerte sind bekannt; sie liegen im allgemeinen bei 7.
Es empfiehlt sich, den Vorgang unter Vermeidung von Infektionen durchzuführen. Infektionsschutz kann z. B. in einfachster Weise dadurch gesichert werden, daß die Lösung mit einer mit ihr nicht mischbaren aseptischen Flüssigkeit von niedrigerem spezifischem Gewicht, wie z. B. Toluol, überschichtet wird.
Infolge der Spaltungstätigkeit des Enzyms wird Säure in Freiheit gesetzt, was eine Abnahme des pH-Werts der Lösung zur Folge hat. Wie bereits erwähnt, ist es für die erfolgreiche Durchführung des Verfahrens wichtig, den pH-Wert konstant oder annähernd konstant zu halten. Dies kann z. B. derart geschehen, daß der mit Hilfe von löslichem Alkali auf den gewünschten pH-Wert eingestellten Ausgangslösung im Verlaufe des Vorgangs von Zeit zu Zeit Proben entnommen und auf Grund des pH-Werts der Proben der Lösung so viel Alkali zugefügt wird, daß der pH-Wert immer wieder auf den Ursprungswert gebracht wird. '
Vorteilhafter wird derart verfahren, daß der Lösung vor oder bei Zusatz des Enzyms ein alkalischer Puffer in geeignetem Überschuß zugesetzt wird, der mit der gebildeten Säure unter Aufrechterhaltung des Anfangs-pH-Werts reagiert. In Fällen, in denen der pH-Wert = 7 ist, kann z. B. Calciumcarbonat im Überschuß als Puffer zugefügt werden; ein Teil dieser Verbindung reagiert mit den Säuren unter Bildung von löslichen Calciumsalzen, die einen pH-Wert von 7 haben, während der Rest der Verbindung ungelöst bleibt und zur Bindung der durch Enzymwirkung freigesetzten Säure zur Verfügung steht.
Wie bereits erwähnt, wird der Vorgang unter Aufrechterhaltung des geeigneten pH-Werts und der geeigneten Temperatur so lange fortgeführt, bis der optische Drehungswinkel der Lösung sich nicht mehr ändert. Der Zeitpunkt des Abbruchs kann durch Entnahme von Proben und Bestimmung des Drehungswinkels derselben ermittelt werden. Nachdem das Drehungsvermögen der Lösung konstant geworden ist, wird der Teil der Aminosäure, der in aCylierter Form vorhanden ist, von dem in freier Form vorliegenden Teil, z. B. 1Oo auf Grund ihrer verschiedenen Löslichkeit, getrennt. Dies kann in einfachster Weise durch Extraktion mittels einer Flüssigkeit erfolgen, in der die acylierte Aminosäure löslich und die freie Aminosäure unlöslich ist oder umgekehrt. Vor oder nach der Trennung kann gewünschtenfalls eine Reinigung stattfinden. Die Reinigung der Aminosäure von den verwendeten Reagenzien kann z. B. wie folgt stattfinden:
Der Teil der angewendeten Monocarbonsäure, der während der Enzymeinwirkung abgespalten wurde, wird durch Eindampfen entfernt, wenn die Säure flüchtig ist. Nichtflüchtige Säuren können durch Extraktion entfernt werden. Das Enzym wird durch Kochen der Lösung niedergeschlagen und kann alsdann durch Abfiltrieren beseitigt werden. In Fällen, bei welchen ein Teil der Aminosäure im Verlauf des Vorgangs ausgefallen ist, wird der gesamte Niederschlag abfiltriert, worauf die Aminosäure von den anderen festen Bestand- "0 teilen durch Extraktion mit Hilfe von Lösungsmitteln getrennt wird.
Beispiele
i. Die racemische Aminosäure D, L-Tryptophan »as wird in bekannter Weise durch Acetylieren in
D, L-Acetyltryptophan übergeführt. 5 g dieser Verbindung werden in 300 ecm Wasser gelöst und der erwärmten Lösung 2,5 g Calciumcarbonat zugefügt. Ein Teil des Calciumcarbonats geht unter Bildung des Calciumsalzes des D, L-Acetyltryptophans in Lösung, die einen pH-Wert von 7 annimmt. Der ungelöste Teil des Calciumcarbonats dient bei der nachfolgenden Enzymspaltung als Puffer. Das Volumen der Lösung wird auf 400 ecm gebracht, die Temperatur auf etwa 400 eingestellt und 3 g eines Amidasepräparats, das aus Bakterienkulturen gewonnen ist, zugefügt. Die Lösung wird alsdann mit Toluol überschichtet und hierauf in einen auf 370 gehaltenen Brutschrank gebracht. Infolge des vorhandenen, als Puffer wirkenden Calciumcarbonats wird der pH-Wert während der Gesamtdauer der Enzymwirkung auf 7 gehalten. Von Zeit zu Zeit werden Proben entnommen, filtriert, mit Aktivkohle geklärt und im Polarimeter geprüft. Durch Zusatz von einigen Tropfen Aceton kann Adsorption der Aminosäure durch die Aktivkohle verhindert werden. Nachdem das Drehvermögen der Lösung konstant geworden ist, wird der Vorgang unterbrochen. Die Zersetzungszeit betrug bei diesem Präparat ungefähr 10 Tage. Nachdem die für die Spaltung benötigte Zeit ermittelt worden ist, können weitere entsprechende Ansätze gleich lange behandelt werden, ohne den Fortgang des Spaltungsvorgangs durch Entnahme von Proben zu verfolgen.
Nach Abbrechen des Spaltungsverfahrens wird die Lösung von Enzym und Calciumcarbonat befreit. Die Beseitigung des Enzyms kann dadurch erfolgen, daß es durch Kochen der Lösung koaguliert wird und das Koagulat zusammen mit dem ungelösten Calciumcarbonat durch Filtrieren entfernt wird. Das gelöste Calciumcarbonat kann durch Fällung mit Oxalsäure und Abfiltrieren des ausgefallenen Calciumoxalats beseitigt- werden. Die durch die Enzymwirkung in Freiheit gesetzte Essigsäure kann durch Verflüchtigen entfernt werden, z. B. derart, daß die Lösung vorteilhaft bei etwa 400 im Vakuum zur Trockene eingedampft wird.
Der Trockenrückstand wird mit einem Lösungsmittel für Acetyltryptophan behandelt, das freies Tryptophan nicht löst. Dies kann z. B. derart geschehen, daß der Rückstand dreimal mit kochendem Aceton oder Äthylacetat am Rückflußkühler extrahiert wird und das Lösungsmittel zwecks Gewinnung des Acetyltryptophans verdampft wird. Durch Umkristallisieren aus dem verdünnten Lösungsmittel erhält man reines weißes Acetyltryptophan mit einem spezifischen Drehungsvermögen von (α)π = —26° (in Methanol), das ausschließlich aus dem D-Antipoden besteht. Die Ausbeute beträgt mehr als 90% der Theorie.
Der bei der Extraktion verbleibende unlösliche Rückstand besteht aus freiem Tryptophan, das nach an sich bekannter Reinigung ein optisches Drehvermögen von (a)ü — —32° (in Wasser) besitzt und völlig aus dem L-Antipoden besteht. Die Ausbeute beträgt 85 % der Theorie.
2. D, L-Methionin wird in bekannter Weise benzoyliert. 5 g des gebildeten D, L-Benzoylmethionine werden in 300 ecm Wasser gelöst, die Lösung erwärmt, 2,5 g Calciumcarbonat zugefügt und die Lösung auf 400 ecm aufgefüllt. Nunmehr werden bei 400 4 g Takadiastase zugefügt, die Lösung mit Toluol überschichtet, in einen auf 370 gehaltenen Brutschrank gebracht und dort belassen, bis ihr Drehvermögen konstant geworden ist. Dies dauert je nach der Wirksamkeit des angewendeten Enzympräparats 7 bis 10 Tage. Die anschließenden Maßnahmen mit Bezug auf die Entfernung des Enzyms und des Calciums und die Verdampfung der Flüssigkeit zur Trockene erfolgen im Sinne des Beispiels 1. Der verbleibende Rückstand wird mit Petroläther unter Rückfluß gekocht, um die durch das Enzym frei gewordene Benzoesäure zu entfernen. Der nach der Petrolätherextraktion verbleibende Rückstand wird dreimal mit je 150 ecm Aceton oder Äthylacetat unter Rückfluß ausgekocht. Durch Abdampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren aus verdünntem Äthylalkohol erhält man reines Benzoylmethionin. Das Drehvermögen von (o)d = +19° zeigt, daß es zur Gänze aus der D-Form besteht. Der in Aceton oder Äthylacetat unlösliche Rückstand besteht aus freiem Methionin, das nach üblicher Reinigung ein Drehungsvermögen von (a)D = —6° hat, also ganz aus der L-Form besteht. Die Ausbeute an beiden optischen Antipoden beträgt etwa 80% der Theorie. Beim Arbeiten in größerem Maßstab sind höhere Ausbeuten zu erzielen.
3. 5 g D, L-Formylphenylalanin, das nach der Methode von V i g η a u d und Mayer (Jour. Biol. Chem. 48, 302, 1932) hergestellt werden kann, werden gemäß Beispiel 1 für die Enzymreaktion vorbereitet. Es gelangte ein anderes Enzympräparat zur Verwendung. Das optische Drehvermögen der Lösung ist zunächst —0,6°, am 2., 3. -und 4. Tag —2°, —2,5° und —3° und bleibt dann konstant bei —3°. Die aus dem Brutschrank genommene Lösung wird gemäß Beispiel 1 von Enzym und Calcium befreit. Die durch das Enzym abgespaltene Ameisensäure wird durch Eindampfen zur Trockene, vorzugsweise im -Vakuum bei 400, entfernt. Der Rückstand wird mit Äthylalkohol extrahiert. Der Extrakt hinterläßt bei Verdampfung einen Rückstand, der ohne weitere Reinigung ein optisches Drehvermögen von (α)ο = —76° (in Alkohol) zeigt; er besteht also zur Gänze aus D-Formylphenylalanin. Die Ausbeute ist praktisch quantitativ. Der in Äthylalkohol unlösliche Anteil besteht aus freiem Phenylalanin, das nach Reinigung ein Drehvermögen von (a)D= —34° zeigt, entsprechend dem Drehvermögen von reinem L-Phenylalanin. Die iao Ausbeute übersteigt 80% der Theorie.
4. Das Formylderivat des D, L-Tryptophans wird nach dem in Beispiel 3 angewendeten Verfahren hergestellt mit der Maßgabe, daß es aus der Lösung durch Abdampfen und Trocknen im "5 Vakuum gewonnen wird, da es nicht direkt
kristallisiert. 5 g D, L-Formyltryptophan werden gemäß Beispiel 2 für die Enzymbehandlung vorbereitet. Als Enzym wird Takadiastase in einer Menge von ig gegenüber 4 g bei Beispiel 2 verwendet. Nachdem das optische Drehvermögen konstant geworden ist, wird die Lösung von Enzym und Calcium gemäß Beispiel 1 befreit. Die vorhandene Ameisensäure wird durch Verdampfen zur Trockene entfernt. Der Rückstand wird mit Aceton behandelt, um die freie Tryptophanfr?.ktion von nicht hydrolysiertem Formyltryptophan zu trennen. Aus der Acetonfraktion erhält man reines D-Formyltryptophan in theoretischer Ausbeute. Der Rückstand wird mit Wasser aufge-
»5 nommen,* wobei etwas Tryptophan auskristallisiert. Der Rest wird in bekannter Weise als Kupfersalz gewonnen. Die Gesamtausbeute beträgt 90% der Theorie. Das Drehvermögen ist (<*)d = —320 entsprechend dem Drehvermögen
*o von reinem L-Tryptophan.
5.4 g D, L-Phenylacethylphenylalanin, das durch Acylieren von D, L-Phenylalanin mit Phenylacetylch-lorid erhältlich ist, werden in heißem Wasser gelöst, 2,5 g Calciumcarbonat zugefügt,
a5 das Volumen auf 400 ecm gebracht und auf 370 abgekühlt. Nach Zugabe von 2 g des Amidasepräparats von Beispiel 1 und von etwas Toluol wird die Lösung bei 370 im Brutschrank gehalten, bis die optische Drehung konstant geworden ist.
Alsdann wird die Entfernung der frei gewordenen Phenylessigsäure und die Trennung des Phenylacetylphenylalanins von freiem Phenylalanin gemäß Beispiel 3 vorgenommen. Die reinen optischen Isomeren werden in Ausbeuten von über 80 % erhalten.
6. HgD, L-Formylisoleucin, das nach F i scher und W a r b u r g (Ber. 38, 3997, 1905) gewonnen werden kann, werden in 1000 ecm heißen Wassers gelöst, 9 g Calciumcarbonat zugegeben und
auf 370 abgekühlt. Durch die Ausscheidung eines Teils des wenig löslichen Calciumsalzes des D, L-Formylisoleucins beim .Abkühlen wird die Spaltung durch das Encym nicht beeinträchtigt. Nach Zufügen von 3 g Takadiastase wird die Lösung 5 Tage bei 370 im Brutschrank gehalten. Alsdann werden weitere 0,5 g des Enzympräparats zugefügt und die Lösung im Brutschrank belassen, bis der optische Drehwinkel konstant geworden ist. Nach Entfernung des Enzyms, des überschüssigen Calciums und der Calciumionen und nach Eindampfung zur Trockene gemäß Beispiel 1 wird der Rückstand dreimal mit 300 ecm Aceton am Rückflußkühler ausgekocht, wobei Formylisoleucin sowie etwas freies Isoleucin in Lösung gehen. Um eine völlige Trennung der beiden Verbindungen zu erzielen, wird dem Acetonextrakt ungefähr 10 % Petroläther zugefügt, bezogen auf das Volumen an Aceton. Der Extrakt wird mehrere Stunden in der Kälte stehengelassen. Das hierbei ausfallende freie Isoleucin wird abgetrennt und mit der Hauptmenge, d. h. der in Aceton unlöslichen Fraktion vereinigt. Das Isoleucin wird in heißem Wasser gelöst und die Lösung durch Kochen eingeengt.
Ein Teil des Isoleucine kristallisiert dabei in solcher Reinheit aus, daß eine Entfärbung unnötig ist. Der noch in der Mutterlauge gelöste Teil wird abgeschieden und auf bekannte Weise gereinigt. Die Gesamtausbeute beträgt 82 % der Theorie. Das spezifische Drehungsvermögen ist (o)d = +37,5° (in 20% HCl) entsprechend dem Drehungsvermögen von reinem L-Isoleucin.
7. D, L-Methionin wird nach KoIb und Toenn i s (Jour. Biol. Chem. 144, 199, 1942) acetyliert. 5 g des Produkts werden gemäß Beispiel 1 behandelt. Der nach Verdampfung im Vakuum verbleibende Rückstand wird mit Aceton extrahiert, um die Acetylmethioninfraktion, die aus der Acetonlösung in bekannter Weise als reines D-Acetylmethionin gewonnen werden kann, zu entfernen. Die in Aceton unlösliche Fraktion wird mit Wasser extrahiert und der Extrakt teilweise verdampft. Das wenig lösliche, aus der wäßrigen Lösung direkt auskristallisierende Methionin besteht zur Gänze aus L-Methionin.
8. D, L-Asparaginsäure wird nach Michael und Wing (Ber. 17, 2984, 1884) benzoyliert. 5g des Produkts werden mit Takadiastase gemäß Beispiel 2 digeriert. Nach etwa ntägigem Verweilen im Brutschrank ist das optische Drehvermögen konstant. Die Lösung wird gemäß Beispiel 2 weiterbehandelt. Der erhaltene Acetonextrakt bzw. Äthylacetatextrakt wird zur Trockene verdampft und liefert fast genau die Hälfte der ursprünglichen Menge von Benzoylasparaginsäure. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus heißem Wasser zeigt das Produkt ein spezifisches Drehvermögen von (a)o = —370 (in n-KOH) und einen Schmelzpunkt von i8o°, woraus sich ergibt, daß es zur Gänze aus D-Benzoylasparaginsäure besteht. Die in Aceton oder Äthylacetat unlösliche Fraktion besteht aus einer äquivalenten Menge an freier Asparaginsäure; sie zeigt nach Reinigung ein spezifisches Drehvermögen von (o)d = —2° (in n-Na O H), wodurch sie als reine L-Asparaginsäure identifiziert ist.
9. Freies D, L-Lysin wird aus salzsaurem D, L-Lysin in bekannter Weise gewonnen und nach Fischer und Weigert (Ber. 35, 3772, 1902) in D, L-Dibenzoyllysin übergeführt, das zwecks Überführung in N-Monobenzoyllysin mit Salzsäure behandelt wird. 5 g D, L-Monobenzoyllysin werden, wie in Beispiel 2 angegeben, digeriert. Der nach Extraktion der frei gewordenen Benzoesäure erhaltene Rückstand besteht aus N-Monobenzoyllysin und freiem Lysin. Er wird wiederholt mit Äthylalkohol ausgekocht, wobei das N-Monobenzoyllysin in Lösung geht und das freie Lysin ungelöst bleiht. Das letztere wird nach bekannten Verfahren in salzsaures Lysin übergeführt, das ein optisches Drehvermögen (a)ü = — 2o,2° (in n-H Cl) zeigt, woraus sich ergibt, daß es aus dem reinen L-Isomeren besteht. Die Äthanolextrakte werden vereinigt und eingedampft, wobei D-Monobenzoyllysin in praktisch 5o°/oiger Ausbeute erhalten wird. Durch Hydrolysieren mit Salzsäure erhält man reines, salzsaures D-Lysin.
ίο. 5 g β» L-Laurylalanin, das nach Bondi ] (Biochem. Z., 17, 543) aus Laurylchlorid und D, j L-Alanin erhalten wird, werden in einer eben ausreichenden Menge Methanol gelöst. Das Volumen der Lösung wird mit Wasser auf 400 ecm gebracht, worauf 3 g Calciumcarbonat, 3 g Takadiastase und etwas Toluol zugefügt werden und die Lösung bei 370 unter zeitweiligem Um- : schütteln im Brutschrank gehalten wird, bis das optische Drehvermögen konstant geworden ist. Hierauf wird die Lösung gekocht und filtriert, um überschüssiges Calciumcarbonat, das Enzym und einen während des Aufenthalts im Brutschrank gebildeten Niederschlag zu entfernen. Das abgetrennte Material wird teilweise getrocknet, mit verdünnter Salzsäure gegen Kongorot angesäuert und durch Schütteln mit acetonhaltigem Äther ausgezogen. Nach Verdampfung des Extrakts bleibt ein öl zurück, das nach Stehen in der Kälte
ao halbfest wird. Durch Umkristallisieren aus heißem Benzol und Petroläther erhält man reines D-Laurylalanin, das einen Schmelzpunkt von 102 bis 1030 und ein spezifisches Drehvermögen von (o)d = + 40 (in Äthylalkohol) hat. Die Ausbeute be-
»5 trägt 85% der Theorie. Das Filtrat wird mit Oxalsäure behandelt, um die Calciumionen zu entfernen. Hierauf wird zweimal mit Äther extrahiert, umkleine Mengen von D-Laurylalanin zu entfernen, worauf zur Trockene verdampft wird. Der Rückstand zeigt ein optisches Drehvermögen von (o)d = — 14,2° (in HCl), woraus sich ergibt, daß es zur Gänze aus L-Alanin besteht. Die Ausbeute beträgt 90% der Theorie.
11. 5 g D, L-Palmitylalanin, das aus Palmitylchlorid und D, L-Alanin nach Bondi und F r a η k 1 (Bioch. Z. 17, 553) erhältlich ist, werden gemäß Beispiel 10 mit der Maßgabe behandelt, daß der durch Kochen und Filtrieren erhaltene Niederschlag durch Ausschütteln mit Chloroform extrahiert wird. Nach Verdampfen des Chloroformextrakts erhält man D-Palmitylalanin in einer Ausbeute, die 90% der Theorie übersteigt. Das optische Drehungsvermögen des nicht weiter gereinigten Produkts beträgt (a)n = +6° (in Äthylalkohol).
Das L-Alanin, das aus dem Filtrat gemäß Beispiel 10 gewonnen wird, hat ein optisches Drehvermögen von (a)r> = +14,2° (in HCl). Die Ausbeute beträgt 90% der Theorie.
12. 5 g des in Beispiel 1 verwendeten D, L-Acetyltryptophans werden in 400 ecm Wasser gelöst und die saure Lösung mit Ammoniak auf pH = 6 eingestellt. 3 g eines Enzympräparats werden der Lösung zugefügt und die mit Toluol überschichtete Lösung bei 500 im Brutschrank gehalten. Alle 12 Stunden wird eine Probe genommen. Sobald eine Probe zeigt, daß der pn-Wert auf 5 oder nahezu auf 5 gefallen ist, wird die Lösung mit Ammoniak auf den ursprünglichen pH-Wert = 6 eingestellt.
Sobald der Drehwinkel der Lösung konstant geworden ist, wird das Enzym durch Erhitzen der Lösung koaguliert und abfiltriert. Das Filtrat wird vorteilhaft im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand mit Aceton oder Äther, wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert, um das D-Isomer in Form der Acetylverbindung von freiem L-Tryptophan zu trennen. Die Ausbeuten entsprechen den Ausbeuten nach Beispiel 1.
J3- 5 g D' L-Chloracetyltyrosin, das durch Behandlung von D, L-Tyrosin mit Chloressigsäurechlorid nach der Vorschrift von Fischer (Ber. 37, 2494, 1904) erhältlich ist, werden in 300 ecm Wasser gelöst und der Lösung 2,5 g Calciumcarbonat, 3 g eines Enzympräparats und etwas Toluol zugefügt. Das Volumen wird auf 400 ecm ergänzt und die Lösung bei 370 im Brutschrank gehalten. Nach kurzer Zeit wird außer dem überschüssigen Calciumcarbonat ein kristalliner Niederschlag sichtbar. Nach 6 Tagen ist der optische Drehwinkel konstant geworden. Alsdann wird der Niederschlag von der Lösung getrennt und mit verdünnter Essigsäure behandelt, um das Calciumcarbonat zu lösen. Der Rückstand wird abgetrennt und gewaschen; er besteht aus L-Tyrosin mit einem spezifischen Drehvermögen von (<x)d = —io° (in η = H Cl). Das Filtrat wird gekocht, um das Enzym durch Koagulierung zu entfernen und durch Zusatz der genau berechneten Menge Oxalsäure von Calciumionen befreit. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, wobei weitere kleine Mengen von L-Tyrosin auskristallisieren, die entfernt und der Hauptmenge zugefügt werden. Die Eindampfung wird bis zur Trockene fortgeführt und der Rückstand mit heißem Aceton extrahiert. Das aus dem Acetonextrakt erhaltene Produkt zeigt nach Umkristallisieren aus heißem Wasser ein optisches Drehvermögen von (<z)d = —250 (in H2 O), woraus sich ergibt, daß es zur Gänze aus D-Chloracetyltyrosin besteht. Die Ausbeute beträgt 85% der Theorie.

Claims (9)

PATENTANSPRÜCHE:
1. Verfahren zur Trennung und Gewinnung der optischen Antipoden von racemischen Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß die acylierte Aminosäure in verdünnter Lösung der Einwirkung von Amidase bei einem für die Wirkung der Amidase günstigen pH-Wert unterworfen und die Behandlung bei einer für die Wirkung der Amidase günstigen Temperatur unter Konstanthaltung des pH-Werts, z. B. durch Neutralisation der durch die Wirkung der Amidase frei werdenden Säure so lange fortgeführt wird, bis das optische Drehvermögen der Lösung konstant geworden ist und alsdann die freie, das L-Isomere darstellende Aminosäure von der das D-Isomere darstellenden Acylaminosäure getrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu spaltende racemische Aminosäure zunächst mit Hilfe des Radikals einer einbasischen Carbonsäure, z. B. durch Einwirkung des Anhydrids oder Säurechlorids der Carbonsäure acyliert wird, die acylierte Aminosäure in eine verdünnte Lösung, z. B.
eine ι- bis 2"Zeige Lösung in-Wasser oder verdünntem Methyl- oder Äthylalkohol übergeführt wird, diese der Einwirkung von Amidase bei geeigneter Temperatur, z. R etwa 370, und geeignetem pH-Wert, der z. B. zwischen 7 und 5 liegen kann, unter Konstanthaltung des pH-Werts unterworfen wird, bis das optische Drehvermögen der Lösung konstant geworden ist und alsdann die Trennung in die beiden optischen Antipoden durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Acylierung der racemischen Aminosäure eine niedrige Fettsäure, wie z. B. Ameisensäure und Essigsäure, verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung mittels Ammoniak auf den für die Wirkung der Amidase günstigsten pH-Wert eingestellt und die während der Einwirkungsdauer der Amidase frei werdende Säure mittels Ammoniak neutralisiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konstanthaltung des pH-Werts durch Pufferung mittels einer alkaiischen Verbindung, z. B. von Calciumcarbonat, erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis S, dadurch gekennzeichnet, daß der Spaltungsvorgang unter aseptischen Bedingungen durchgeführt wird, z. B. derart, daß die Lösung mit einer spezifisch leichteren Schutzflüssigkeit, wie z. B. Toluol, überschichtet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis S, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung nach Vollendung des Spaltungsvorgangs der Kochung unterworfen und das hierbei koagulierte Enzym gegebenenfalls zusammen mit ungelösten Stoffen, wie z. B. Calciumcarbonat, durch Maßnahmen wie Filtration beseitigt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die racemische Aminosäure mit Acetylchlorid, Phenylacetylchlorid oder Benzoylchlorid acyliert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als zu spaltende Aminosäuren D, L-Tryptophan, D, L-Phenylalanin oder D, L-Lysin verwendet werden.
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