DE2100445A1

DE2100445A1 - Verfahren zur Herstellung von L Dopa und L m Tyrosin

Info

Publication number: DE2100445A1
Application number: DE19712100445
Authority: DE
Inventors: Dr Enhorna Sjoberg Berndt Olof Harald Dr Sodertalje Bamberg Peter, (Schweden)
Original assignee: Astra Lakemedel AB, Sodertalje (Schweden)
Priority date: 1970-01-19
Filing date: 1971-01-07
Publication date: 1971-07-29
Also published as: US3838008A; AT313224B; GB1334591A; CA981612A; FR2081441A1; FR2081441B1; NL7100156A

Description

ν.25.Juni I97O in Schweden Anm.No.i 8836/70

Die Erfindung betrifft L-Dopa und L-m-Tyrosin und speziell ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen sowie Zwischenprodukte für die Verwendung in eine« soldien Verfahren* L-Dopa erwies sich als brauchbar gegen Parkinson¹sehe Krankheit, und L-meta-Tyrosin, das strukturell dem L-Dopa nahe verwandt ist, sowie dessen Derivate besitzen solche Eigenschaften, daß auch diese Substanzen als Auegangematerial für diesen Zweck verwendet werden können. Ea wurden verschiedene Erklärungen dafür gegeben, wie L-Dopa bei der Behandlung von Parkinson*scher

- 2

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Krankheit wirkt. Di« Erklärung, die von der Mehrheit der Forscher auf diese» Gebiet vertreten wird, ist folgendet Die Pathophysiologie von Parkinsonismus bei Menschen kann wenigstens teilweise mit einer Degenerierung in dem Dopamin-Neuron-äyatsm in Gehirn i« Bereich des Nucleus caudatua, des Putamen und der Substantia nigra erklärt werden. £ine vernüftige Therapie würde dann in einer Ergänzung des fehlenden Dopamins durch Verabreichung von außen bestehen. Leider ist verabreichtes Dopamin nioht in der Lage, die Blut-Gehirnbarriere »u Überwinden» und daher erreicht peroral oder parenteral verabreichtes Dopamin nioht das Dapamin-Neuron-System.

Dihydroxyphenylalanin, weiohes der Vorläufer voa Dopamin ist, überschreitet die Blut-Gehirnbarriere und wird in des Gehirn »u Dopamin deearboxyliert.

Cotsias et al seigten, daß das rasemische Dopa eine vorteilhafte Wirkung auf die Parkinson¹sehen Symptome habn kann. Häufig traten jedeoh Nebenwirkungen auf. Diese konnten vermindert werden, wenn L-Dopa verwendet wurde* £s wird daher empfohlen, daß möglichst reines L-Dopa in der Therapie verwendet wird. Gotsias et al xeigten auoh_t daß L-Dopa im Vasoularsystem deoarboxyliert wird, weswegen große Dosen an L-Dopa erforderlich sind, um den erwünschten therapeutischen Jßffekt su ersielen.

L-Dopa kann peroral verabreicht werden und wird dann in

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21QQ445

■teigenden Dosen von 100 mg dreimal täglioh bis au einer täglichen Dosis von 8 g verabreicht. Die Behandlung mit L-Dopa erwies sich als besonders günstig hinsiohtlioh der Steifheit, die die Parkinson'sehe Krankheit kennaeioh« net.

L-Dopa ist 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanin der Struktur» formel

UH₉CJiICOpH ²I ² NHo

L-m-Tyrosin, 3*-(3-Hydroxyphenyl)-L-alanin besitzt die Strukturformel

OH

ZI

Von den beiden optischen Antipoden, in denen diese beiden Verbindungen gefunden werden, besitzen nur die L-Formen die erwünschte Wirkung.

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BAD OWGINAL

Bisher war es sehr schwierig, ausreichende Mengen an L-Isomer in reiner Form zu erhalten. Gemäß der vorliegenden Erfindung zeigte sich nun Überraschenderwelse, daß es möglich ist, stereoselektiv bestimmte N-Aoylaminosäurederivate unter Verwendung von E.coli-Acylaee in derartiger Weise aufzutrennen, daß nur die L-Aminosäurederivate deacyllert werden. Das Ausgangsmaterial für die stereo* selektive Trennung mit E.coli-Acylaee besteht aus Verbindüngen der allgemeinen Formel

CH₂-CH-COOH

NHCO-CH₂

III

R¹"

worin X ein Wasserstoffatom, Fluoratom, Chloratom oder Bromatom oder eine N0„-Gruppe bedeutet, R¹'eine Hydroxyl- oder Alkoxygruppe mit nicht mehr als 5 Kohlenstoffatomen, wie eine der Gruppen -OCH₀, -OC-H_n. oder -0O₀H_n bedeutet

3 2 .5 3 7

und R" ' ein Wasserstoffatom, β±*φ Hydroxylgruppe oder Alkoxygruppe mit nicht mehr air 5 Kohlenstoffatomen bedeutet, wie eine der Gruppen -OCH₀, -OC₂H-, oder -OC₀H₇, oder worin R¹* zusammengenommen mit R¹'' eine Alkylendioxygruppe mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen bedeutet. Die

Verbindungen der Formel III werden stereoselektiv unter Verwendung von E.ooli-Acylase unter Bildung der L(-)-Form der Verbindungen der allgemeinen Formel

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CH₂-CH-COOH

IV

und der therapeutisch verträglichen Salze hiervon, worin R* ' und R^MI die obige Bedeutung haben, aufgetrennt.

Die Erfindung betrifft auch Verbindungen der allgemeinen

Formel ~—— —-

CH₂-CH-COOH ;'·

NHo " · '

in der L-ForJSy pharmazeutische Präparate, die solche Verbindungen ip deg Tj-Form enthalten, sowie die medizinieds Anwendung solcher Verbindungen zur Behandlung von Parkinsonismus, wobei in der Formel V R² eine Hydroxyl- oder Alkoxygruppe mit nicht mehr als 5 Kohlenstoffatomen, wie eine der Gruppen -OCH., -OC„H- oder -OCJH-, bedeutet

3 und worin R ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder Alkoxygruppe mit nicht mehr als" 5 Kohlenstoffatomen bedeutet, wie eine der Gruppen -OCH», -OC₂H. oder -OC„H„,

3 nlt der Maßgabe, daß R ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder Alkoxygruppe ist, wenn R eine Alkoxygruppe be·

3 ο

deutet, und daß R eine Alkoxygruppe ist, wenn R eine

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210OA45

Hydroxylgruppe bedeutet, oder worin R zusammengenommen

mit R eine Alkylendioxygruppe mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen bedeutet.

Die Verbindungen der Formel IXX enthalten ein asymmetrisches Kohlenstoffatom und können in der Raoematform oder in der Form optisch aktiver Isomere vorkommen.

Die Herstellung des racemischen Ausgangsmaterials der Formel XIX, welches bei der Trennung mit E.coli-Acylase verwendet wird, kann gemäß dem nachfolgenden Reaktionsschema durchgeführt werdent

CHO

R"

+ CH₂-COOH

NHCO-CH

CHs=C - C

Ac₂O NaOAc

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CH=C-COOH

NH-CO-CH

-GH« —('

χ H₂/Pd/C

'CH₂-CH-COOH

NH-CO-CH,

■-er

wobei die Formeln X, R¹¹ und R**' die obige Bedeutung haben.

Die Auftrennung des Ausgangsmaterials, das gemäß dem obigen Formelschema erhalten wurde, in die stereoisomeren Aiy;ipoden erfolgt durch Inkubieren des erhaltenen Raoemats bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 8 mit einer E.coli-Acylase während der hierfür erforderlichen Zeit, gewöhnlich etwa 1 Stunde bis etwa 72 Stunden. Danach wird der pH-Wert auf 1 bis 3 herabgesetzt, worauf nichtumgesetzte Acylaminosäure mit Äthylacetat oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel extrahiert wird. Beispiele für Reste der Formel

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sind t

-CH

Das hler erwähnte B.coli-Acylaseenzym 1st vorzugsweise ein zellfreies Präparat, das ggf. an einen polymerenTräger gebunden sein kann, wie in der schwedischen Patentanmeldung 1820/69 beschrieben ist. Eine besonders geeignete E.coli-Acylase ist eine solche, die in der schwedischen Patentanmeldung 1820/69 beschrieben 1st. Für den Fachmann liegt jedoch auf der Hand, daß für die stereospezifisohe enzymatisohe Hydrolyse auch nichtzellfreie E.ooli-Bakteriensuspensionen, E.coli-Bakterienextrakte oder E.coli-Enzymkonzentrate, die die stereoeelektiraktive Aoylase enthalten, verwendet werden können.

An Hand der Beispiele wird nunmehr die Erfindung weiter erläutert.

A. Herstellung von Ausgangsmaterialien der Formel XXX Beispiel 1 Herstellung von DL-N-Phenylacetyl-3*:(3-methoxyphenyl)-alanin

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a) 4-(3-Methoxybenzylid*n)-2-benzyloxazoäion-5«

N-Phenylacetylglycin (4l_t8 g, 0,216 Mol) und 3-Methoxybenzaldehyd (46,5 g, 0,342 Hol) wurden zu einem Gemisch von trockenem Natriumacetat (l3>2 g) in Acetanhydrid (54 ml) zugesetzte Nach einstündigem Erhitzen auf einem Wasserbad wurde das Gemisch in l4O ml Jöiswasser eingegossen s, und die gebildete Substanz wurde mit Äthylacetat extrahiert· Nach dem Verdampfen und Trocknen wurde der Rückstand mit Äthanol verrieben, filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknete Schmelzpunkt 104,5 bis 105 C (Äthanol). Analyse! C 73,57 #, H 5,26 #; N 4,69 #} 0 16,50 ^. Berechnet für ⁰XgH₁₅^* 0 73,71 #, H 5,15 ^, N 4,78 #} 0 16,36 56.

b) O^ -Phenylacetylamido-m-methoxy-zimtsäure*

4-(3-Methoxybenzyliden)-2-benzyloxazolon-5 (39 g) wurde in einem Gemisdivon 325 ml Aceton, 115 ml Wasser und 3,25 ml 2» Salzsäure suspendiert und drei Stunden gekocht. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde unter Zugabe von Natriumbicarbonat gelöst. Nach dem Waschen mit Äthylacetat wurde 41e Wasserphase auf einen pH-Wert zwischen 2 und 3 angesäuert, und das auefallende Produkt wurde aufgesammelt. Schmelzpunkt 168,5 bis 19,0,5⁹O (Äthanol). Analyses C 69,32 &t H 5,67 ^f N 4,32 ti 0,20,71- £· Berechnet für C₁₈H₁₇NO^i C 69,44 %j H 5,51 ** N ^,30 %i 0 20,56 1>.

-Ie-

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c) DL-N-Phenylacetyl-3-(3-m·thoxyphenyl)-alanin_o

CN -Phenylaoetylamido-m-methoxyzimj&tsäure (l6 g) wurde bei Normaldruck in 320 ml Äthanol untr Verwendung von 10 #-iger Palladiumkohle als Katalysator hydriert, bis die theoretische Wassermenge absorbiert war. Nach Abtrennen des Katalysators und des Lösungsmittels wurde das Produkt in der Form weißer Kristalle erhalten. Schmelzpunkt 130 bis 132,5°C (Chloroform). Analyser C 68,83 $i H 6,29 #5 N 4,57 #J 0 20,51 #. Berechnet für C₁₈H NO^j C 68,99 H 6,11 £; N 4,47 %', 0 20,42 #.

Beispiel 2

Herstellung von N-Phenylacetyl-3-(3,4-methylendioxyphenyl)-alanin.

a) 2-Benzy1-4-(3,4-methylendioxybenzyliden)-oxaz ölon-5

wurde wie in Beispiel 1 a) hergestellt, indem man 98 g Piperonal, 85 g N-Phenylacetylglycin, 105 ml Acetanhydrid und 27 g wasserfreies Natriumacetat als Ausgangematerialien verwendete. Das erhaltene Produkt besaß einen Schmelzpunkt von 146 bis l47°C (Äthanol) und ein NMR-Spektrum in Übereinstimmung mit der angenommenen Struktur.

b) ^v-Phenylaoetamide-3,4-methylendioxyzimeltsäure

wurde in analoger Weise zu dem in Beispiel 1 b) beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei man 2-Benzyl-4-(3,4-

-

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methylendioxybenzyliden)-oxazolon-5 (36 g), Aceton (2>0 ml), Wasser (105ml) und 2n Salzsäure ( 3 ml) ale Ausgangsmaterialien verwendete. Das erhaltene Produkt besaß einen Schmelzpunkt von 197 bis 200°C (Äthanol) und ein NMR-Spektrum in Übereinstimmung mit der angenommenen Struktur.

c) N-.Phenylacetyl-.3- (3,4-methylendioxyphenyl)-alanin

wurde wie in Beispiel 1 c) hergestellt, wobei man 55 S Q*-Phenylacetamido-3»4-methylendioxyzimjfttsäure zusammen mit 10 $-iger Palladiumkohle (5,5 g) in 1000 ml Äthanol als Katalysator einsetzte. Die Hydrierung ergab ein Endprodukt mit einem Schmelzpunkt von 154 bis 158 C (Äthanol/Vasser) und ein ;.. NMR-Spektrum in Übereinstimmung mit der angenommenen Struktur. Analyseι C 65,94; H 5»08; N 4,37; 0 24,60 i»\ berechnet für C₁₈H₁₇NO₅I C 66,05} H 5,24; N 4,28·, 0 24,44 <f>.

Beispiel 3

Herstellung von N-Phenyiacetyl-3-(3,4-dimethoxyphen_vl)-alanin

a) 2-Benzyl-4-(3,4-dimethoxybenzyliden)-oxazo3ton-5

wurde wie in Beispiel 1 a) durch Umsetzung von N-Phenylacetylglycin (200 g) und 3,4-Dimethoxybenzaldehyd (256 g) in Acetanhydrid/Natriumacetat (2k6 g/46 g) hergestellt. Schmelzpunkt 154 bis 155,5°C (Aceton/Äthanol), NMR-Spektrum in Übereinstimmung mit der angenommenen Struktur.

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b)^-Phenylacetamido-3»4-dimethoxyzimtsäure

wurde aus 2-Benzyl-4-(3|4-dimethoxybenzyliden)-oxazol«n-5 (69 g) in gleicher Weise erhalten, wie in Beispiel 1 b) beschrieben ist. Schmelzpunkt 211 bis 217°C (Äthanol), NMR-Spektrum in Übereinstimmung mit der angeommenen Struktur.

c) N-Phenylaoetyl-3-(3,4-dimethoxyphunyl)-alanin

wurde wie in Beispiel Ic) aus^-Phenylacetamido-3,4-dimethoxyzimtsäure (70 g) in Äthanol (l,6 l) und 10 ^6-iger Palladiumkohle (7 g) erhalten. Schmelzpunkt 145,5 bis 1^9,5°C (Chloroform). NMR-Spektrum in Übereinstimmung mit der angenommenen Struktur.

Beispiel 4

Herstellung von N-Phenylacetyl-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanin

a) Äthyl-N-phenylacetyl-3-(314-dihydroxyphenyl)»alaninat.

Zu einem eisgekühlten Gemisch von Äthyl-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-alaninathydrochlorid (8,3 g) in sauerβtoffreiem Methylenchlsrid (25Ο ml) wurden unter Rühren in einer Argftnatmosphäre Triäthylamin (8,7 ml) und Phenylacetylchlorid (4,2 ml) in 35 ml Methylenchlorid allmählich zugesetzt. Nach einer Stunde bei 25⁰C wurde das Gemisdiin 100 ml Wasser eingegossen. Die organische Schicht wurde abgetrennt und nacheinander mit 2n H_SO|., Im KHCO₃, Wasser und Salzwasser gewaschen. Nach dem Trocken und Verdampfen

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des Lösungsmittels erhielt man einen öligen Bückstand (7,1 g).

b) N-Phenylacetyl-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanin.

Bin Gemisch von Äthyl-N-phenylacetyl-3-(3,4-dlhydroxy-

phenyl)-alaninat (7,1 g) in Zn NaOK (32 ml) wurde zwei

ο Stunden bei etwa 25 C gerührt. Die resultierende klare Lösung wurde mit Äthylacetat gewaschen, auf pH 2 mit konzentrierter H-SOk angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert· Die organische Schicht wurde mit Salzwasser gewaschen, getrocknet und eingedampft und hinterließ das Produkt, N-Phenylaoetyl-3-(3,4-dlhydroxyphenyl)-alanin, als ein braanes Öl in einer beinahe quantitativen Ausbeute.

Beispiel 5

Herstellung von N-Phenylaoetyl-3-(3T»**koxyphenyl)-alanin·

N-Phenylacetyl-3-(3-m©thoxyphe»ylX~alanin.

Phenylacetylchlorld (6,6 ml) in Äther (20 ml) wurde tropfenweise zu einem gerührten und eisgekühlten Gemisch von 3-Methoxyphenylaianin * 1/2 H₂O (10,2 g) in Wasser (250 ml) und Äther (20 ml) zugesetzt, während der pH-Wert mit 5n NaOH auf 11,5 gehalten wurde« Die wässrige Phase wurde abgetrennt, mit Äther gewasohen und mit konzentrier ter HCl auf pH 2 angesäuert» Das kristalline Produkt, das ausfiel, wurde gesammelt und mit Wasser und Äther gewasohen, P. 130 bis 133°C (CHCl₃).

109831/2249 " ^l

Beispiel 6

Herstellung von N-Phenylacetyl-3-(3,4-methylendi oxyphenyl)-alanin·

N-Phenylacetyl-3-(3,4-methylendloxyphenyl)-alanin

wurde wie in Beispiel 5 hergestellt, wobei man von 3-(3,4-Methylendioxyphenyl)-alanin und Phenylacetyüilorid ausging ο Das Produkt war identisch mit dem in Beispiel 2 c) erhaltenen.

Beispiel 7

Herstellung von N-(^-Pluorphenylacetyl)-3-methoxyphenylalanin.

N-(4-Fluorphenylaoetyl)-3-methoxyphenylalanin

wurde in gleicher Weise erhalten, wie ftr die entsprechende N-Phenylacetylverbindung (Beispiel 5) beschrieben wurde, wobei man von 3-Methoxypheny!alanin (7,8 g) und 4-Pluorphenylacetylchiorid (6,9 β) ausging. Weiße Kristalle, P. 115 bis 120⁰C (CHCl ).

Beispiel 8

Herstellung von N-(4-Nitrophenylacetyl)-3-methoxyphenylalanin·

N(4-Nitrophenylacetyl)-3-methoxyphenylalanin

wurde in der Weise erhalten, wie für die entsprechende N-Phenylacetylverbindung (Beispiel 5) beschrieben wurde, wobei man von 3-Methoxyphenylalanin (7,8 g) und p-Nitrophenylaoetylohlorld (8,0 g) ausging. Hellgelbe Kristalle,

- 15

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F,l45 bis 147°C (CHCl ). Beispiel 9

Herstellung von N-Phenylacetyl-3-(3-n»ethoxy-4-hydroxyphenyl)-alanin.

N-Phenylacetyl-3-(3-m©thoxy-^-hydroxyphenyl)-alaninο

Zu 3-(3-Methoxy-4-hydroxyphenyl)-alanin (2,11 g, 0,01 Mol) in 50 ml Wasser und 10 ml Äther wurde unter Rühren und Eiskühlen Phenylacetylen!orid (l,k ml, 0,01 Mol) in 10 ml Äther zugesetzt, wobei der pH-Wert auf 11»5 gehalten wurde« Die Wasserphase wurde abgetrennt, zweimal mit Äther gewaschen und auf pH 1 bis 2 angesäuert. Das Gemisch wurde 2 bis 5 Stunden gekühlt, das ausgefällte Produkt wurde gesammelt, getrocknet und mit etwas Chloroform gewaschen« F.172 bis 173°C (Aceton).

Analyse* C 65,5* £$ H 5,96 #5 N k,Zk #j 0,24,35 #.

Berechn

0,24,49

Berechnet für C₁₈H₁₉NO . C 65,64#ί H 5,81 #f N 4,25 Beispiel 10 Herstellung von N-Phenylacetyl-m-tyrosin. N-Phenylacetyl-m-tyrosin.

Bin Gemisch von Äthyl-N-Phenylacetyl-m-tyrosinat, dessen Struktur durch NMR-Spektroskopie bestimmt worden war, (0,05 Mol) in 2n NaOH (72 ml, 0,15 Mol) wurde 2 Stunden bei etwa 25 C gerührt. Die resultierende klare Lösung

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wurde mit Äthylacetat gewaschen, mit konzentrierter H₂SO. auf pH 2 angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Salzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft, wobei als Produkt ein gelbes Öl in beinahe quantitativer Ausbeute zurückblieb. Das NMR-Spektrum war in Übereinstimmung mit der angenommenen Struktur, und bei einer DünnschichtChromatographie wurde nur ein Flecken festgestellt (Äthanol)·

B.Enzymatisehe Trennung von Verbindungen der Formel III. Beispiel 11

Trennung von DL-N-Phenylacetyl-3-(3»^-methylendioxyphenyl)-alanin.

L(-)-3-(3,4-Methylendioxyphenyl)-alanin und D(-)-N-Phenylacetyl-3-(3,4-methylendioxyphenyl)-alanin

wurden durch Inkubieren von DL-N-Phenylacetyl-3-(3»^-methylendioxyphenyl)-alanin (5 g) mit einer ^.coli-Acylase (6000 Einheiten) in 50 ml Wasser bei pH 7,8, wobei zur Regulierung des pH-Wertes Ammoniak, Natriumhydroxyd oder Lithiumhydroxyd als Base verwendet wurden, erhalltenο tos wurden verschiedene Inkubationsexperimente durchgeführt, und die angewendete Zeit variierte zwisdan 1 und IZ Stunden und die Inkubationstemperatur zwischen 25 und 37 C. Wenn die Inkubation beendet war, wurde der pH-Wert mit 2 η Salzsäure oder Schwefelsäure auf 1,5 eingestellt, wonach restliche, nicht aufgetrennte phenylacetylierte Aminosäure mit Äthylacetat extrahiert wurde. Di*restliche Wasserphase wurde konzentriert und ergab nach Einstellung des

109831/??49 " ¹⁷ "

pH-Wertes auf 5,5 eine Li-)Aminosäure_ä diö nicht mehr am Äminostickstoffatom geschützt war. Man erhielt sie in der Form weißer kristalle mit einem Schmelzpunkt von

20
202 bis 210,5 C (Wasser) ßK] _D « - 28,12° (Wasser),

c m l). Analyses gef« 0 57,53 #? H 5,26 %\ N 6,82 #; 0 30,70 #; ber.für O₁₀H₁₁NO^i C 57,kl fa H 5,30 %t N 6,70 #; 0 30,59 $>> Die Äthylacetatphase enthielt die N-phenylacetylierte D(-)-Amlnosäure, die einen Schmelz-

20 hanol) und /&J

(Äthylacetat, c » l) besaß.

20 punfct von 1^3 bis 157°C (Äthanol) und /&J _m -59,k6°

Beispiel 12

Auftrennung von DL-N-Phenylaoetyl-3-(3-methoxyphenyl)-alanin.

L-(-)-3-(3-Methoxyphenyl)-alanin und D(~)-N-phenylacetyl)-3-(3-methoxyphenyl)-alanin

wurden in gleicher Weise hergestellt, wie oben in Beispiel 11 beschrieben ist. Das Ausgangsmaterial war DL-N-Phenylacetyl-3-(3-methoxyphenyl)-alanin (5 g)» und die Auftrennung erfolgte mit k ml E.coli-Acylase (6000 Einheiten)« Dabei erhielt man die L(-)-Aminosäure ohne Schutzgruppen als Monohydrat mit einem Schmelzpunkt von

20
173 bis 176,5°C und einem /BJ _D = -27,81 ° (Wasser, c β l). Analyses gef. 0 56,18 ; H 6,98; N 6,70 1 0 30,01; ber.für C_1nH₁-NO-H₀Oi C 56,33! H 7,P9i N 6,5?!

0 30,02* Die D(-)-N-phenylaoetylierte Aminosäure besaß

ο ²⁰

einen Schmelzpunkt von 117,5 bis 133 0 und ein /jkj _D = ^3,93° (Äthylaeetat, ο « l).

- 18 -

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Beispiel 13

Auftrennung von DL-N-Phenylacetyl-3-(3,4-dimethoxyphenyl )-alanin.

L-(-JO-*(3,4-Dimethoxyphenyl)-alanin und d(-)-N-phenylacetyl-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin

wurden durch Inkubation von DL-N-Phenylaoetyl-3-(3,4-dlmethoxyphenyl)-alanin (5 g) in Wasser (73 ml) bei pH 6,5 oder 7»0 (NH_ als Base) mit zollfreier Jü.coli-Acylase (665O Einheiten) während 3 Stunden hergestellt. Das Gemisch wurde danach einig«« Minuten mit "Hyflo" und Aktivkohle gerührt und filtriert. Der pH-Wert des Filtrate wurde mit Schwefelsäure auf 2,3 bis 3 eingestellt, und das ausgefällte D (-)-N-Phenylaoetyl-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin wurde mit Äthylacetat extrahiert, die Wasserphase wurde auf etwa 5 ml eingedampft und der pH-Wert auf 6,5 gesteigert ο Das als weiße Kristalle ausgefällte Produkt Li-)-3-Ö,4-Dimethoxyphenyl)-alanin besaß

20
ein /y^J _D = -5*6k° (mHCl, c = I)₀ Schmelzpunkt

209 bis 2l4,5 Co Aus der Äthylacetatphase wurde die D(-)-Form der phenylacetylierten Aminosäure erhalten, Schmelzpunkt 11
acetat, c = l).

20 Schmelzpunkt 117 bis 142 Cj /Q^7 _D = -^9,75 (Äthyl

Beispiel Ik

Auftrennung von DL-N-Ph#nylacetyl-3-(3-m«thoxyphenyl )-alanin.

L(-)-3-$-Methoxyphenyl)-alanln und D(-)-N-ph*mylacetyl-3-(3-methoxyphenyl)-alanin

wurden duroh Inkubation von DL-N-Phenylacetyl-3-(3-»«thoxy-

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2100U5

phenyl)-alanin (lO g) mit zellfreier E.coli-Acylase (21^5 Jüinheiten) in Wasser (l6O ml) bei pH-6,5 (NH„ als Base) während 3,25 Stunden bei einer Temperatur von 45°C hergestellt. Das Gemisch wurde danach einige ^winuten mit "Hyflo" und Aktivkohle gerührt und filtriert» Der pH-Wert des Filtrats wurde mit konzentrierter Schwefelsäure auf 2,6 eingestellt, und das Gemisch wurde mit Äthylacetat extrahierte Die Wasserphase wurde in einem Walzenverdampfer auf etwa 15 ml eingedampft, und der pH-Wert wurde auf 6,5 eingestellt. Die ausgefällte L(-)-Amino-

²⁰ ο säure wurde durch Filtration erhalten» Ißj jj = -6,18 (n HCl, c β l)o Die Äthylacetatphase wurde neutral gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit Äther behandelt, wobei die D(-)-Form der N-phenylacetylierten Aminosäure als weiße Kristalle aus-

20 __ 20

fiel* Z⁰LA₁₅ = -^,93 (Äthylacetat, c = l) /<*_7 _D nach

einmaligem Umkristallisiören aus Äthylacetat = -51135 (Äthylacetat, c = l).

Beispiel 15

Auftrennung von DL-N-Phenylacetyl-3-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-alanin.

L(-) -φ-Methoxy-4-hydroxyphanyl)-alanin.

109831/??49

r CH₃CL^ ^s.

,.CH₂CHCOOH

HO"

NHCOCH

CH₂CHCOOH

^mz.

Eine Lösung von N-Phenylacetyl-3-(3-niethoxy-4-hydroxyphenyl)-alanin (3,29 g, 0,01 Mol) in 100 ml 0,2 m Na₂^ und E.coli-Acylase in verschiedenen Mengen gemäß der nachfolgenden Tabelle wurde bei unterschiedlichen pH-Werten gemäß der Tabelle während 3,5 Stunden bei $0°C inkubiert. Danach wurde die Lösung mit "Hyflo" und Aktivkohle filtriert, und der pH-Wert wurde mit konzentrierter Schwefelsäure auf 1,5 eingestv, ij c''. Die oben schwimmende Schicht wurde von dem ausgefällten Öl abgegossen und mit Äthylacetat gewaschen. Die Wasserphase wurde bei etwa 10 mm auf 25 ml eingedampft, und die Aminosäure wurde durch Einstellung des pH-Wertes auf 5,5 ausgefällt.

Das öl, das zuerst aus der Wasserphase ausgefällt worden war, und die Äthylacetatphase wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Chloroform gerührt, und das kristallisierte D(-)-N-Phenylacetyl-3-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-alanin

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2100AA5

wurde durch Filtration erhalten. Die Reaktionsbedingungen wurden gemäß der nachfolgenden Tabelle variiert, wobei die angegebenen Ergebnisse erzielt wurden .

CH₉CHCO₉H NEU ■

Tabelle

	Acylaseein- heiten ^K 0,01 Mol Substrat	20 ßj _D (C»2, η HCl)	Ausbeute in $
pH	1500	-5,74	. 68,6
6,25	I75O	-5,78	85,2
6,25	I5OO	-6,06	83,3
6,50	I50O	-5Λ0	81,4
6,75	I75O	-6,10	76,9
6,75	I5OO	-5,62	69,4
7,00	I5OO	-5,89	71,1
7,10	I75O ,	-6,47	75,6
7,25	I5OO	-5,99	49,7
7,50	I5OO	-6,02	34,1
7,75	I5OO	-6,04	30_s0
8,00

χ eine Acylaseeinheit ist die Enzymmenge, die bei 35 C 1/2 mg 6-AminopenicillansäuxO aus Benzylpenicillin während 90 Minuten produziert.

xx eine Reaktion der Hälfte der racemischen Menge dee Substrat· wurde als 100 $ berechnet.

~ 22

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Beispiel 16

Auftrennung von DL-N-Phenylacetyl-m-tyrosin. Li-)-m-Tyrosin.

Zu einer Lösung von N-Phenylacetyl-m-tyrosin (6 g, 0,02 Mol) in 0,025 m Na₂HPO. bei pH 6,7^ (pH eingestellt mit 2 η NaOH) wurden 3000 Acylaseeinheiten zugesetzt, und das Gemisch wurde k Stunden bei kO C inkubiert. Dann wurde die Lösung mit Aktivkohle behandelt, mit konzwntriörter H₂SO. auf pH 2 angesäuert und mit Acetylacetat gewaschen. Die wässrige Phase wurde auf 17 ml konzentriert, und das Produkt wurde bei pH 5 mit konzentriertem Ammoniak ausgefällt. Nach dem Kühlen während 15 Stunden bei k°C wurde das L(-)-m-Tyrosin durch Filtration gesammelt.

_ 20
/<Λ_7 _D = -9,25° (c = 2, η HCl), Wassergehalt 1,7 ^.

Die Äthylacetatphase ergab nach dem Eindampfen das nichthydrolysierte D(-)-N-Phenylacetyl-m-tyrosin.

Beispiel 17

Auftrennung von DL-N-Phenylacetyl-3-(3-methoxy-4-hydroxypheny1)-alanin.

Li-)-3-Methoxy-4-hydroxyphenylalanin.

Zu einer Lösung von N-Phenylacetyl-3-(3-methoxy-4-hydroxy- phenyl)-alanin (3,29 g) in 0,025 η Na₂HPO^ bei 6,75 (pH mit 2 η NaOH eingestellt) wurden 1500 Acylaseeinheiten zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 50°C 3*5 Stunden inkubiert. Sodann wurde die Lösung mit Aktivkohle behandelt,

- 23 -

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" ²³ " 210 044

mit konzentrierter H-SCV auf pH 2 aogesäuert und mit Äthylacetat gewaschen· Die wässrige Phase wurde auf 20 ml konzentriert, und das Produkt wurde bei pH 5,6 mit konzentriertem Ammoniak ausgefällt, Nach dem Kühlen während 15 Stunden bex k°C wurde das L(-)-3-Methoxy-4-hydroxyphenylalanin durch Filtration gesammelt,

⁰= -5f27° (C = 2, η HCl), Wassergehalt 8,7 ^.

Die Athylacetatphase ergab beim Eindampfen das unhydrolysierte D(-)-N-Phenylacetyl-3-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-alanin, das racemisiert und wieder für die sterospezifische enzymatisch^ Hydrolyse verwendet werden konnte.

Beispiel 18

Auftrennung von DL-N-(k-FIuorphenylaoetyl)-3-methoxyphenylaianin und DL-N-(4-Nitrophenylaoetyl)-3-methoxyphenylalanin.

L(-)-3-Methoxyphenylalanin

wurde in der gleichen Weise hergestellt, wie für L(-)-3-Methoxy-4-hydroxyphenylalanin (Beispiel 17) beschrieben wurde, wobei man von N-(4-Fluorpheniacetyl)-3-methoxyphenylalanin bzw· N-(4-Nitrophenylacetyl)-3-methoxyphenylalanin und Acylase ausging. Das erhaltene Produkt war identiech mit dem in Beispiel 13 erhaltenen Produkt.

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Beispiel 19

Auftrennung von DL-N-Phenylaoetyl-3-(3,^-dihydroxyphenyl)-alanin.

L(-)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-alanin und D(-)-N-Phenylacetyl-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanin

wurden erhalten, wie für die entsprechenden 3-Hydroxyderivate beschrieben wurde, wobei man von N-Phenylacetyl-3-(3»^—dihydroxyphönyl)-alania und Jö.coli-Acylase ausging und die Reaktion in einer sauerstoffreien Argonatmosphäre durchführte. Das so erhaltene L(-)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-alanin besaß eine optische Drehung /P^y — = -10,57 (c = 2, η HCl) und das D-(-)-N-Phenylacetyl-3-(3,4-dihydroxyphenyl) -alanin besaß eine optische Drehung J° = -35,0° (c β 1, Äthylacetat).

C.Hydrolyse der L(-)-Isomeren.

Beispiel 20

Hydrolyse von L(-)-3-(3-Methoxyphenyl)-alanin. L(-)-m-Tyrosin

wurde durch Rückflußkochen eines Gemisches von L(-)-3-(3-Methoxyphenyl)-alanin (l g), einer bei konstanter Temperatur siedenden, 57 ^-igen Jodwasserstoffsäure (5 ml), Eisessig (5 ml) und 0,33 g rotem Phosphor während 3 Stunden unter einer Argonatmosphäre erhalten. Danach wurde das Gemisch filtriert und wiederholt mit Wasser eingedampft. Der schließlich erhaltene kristalline Rückstand wurde in einer kleinen Vassermsngo aufgelöst und der pH-Wert auf 5

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bis 6 eingestellt, las fielen weiße Kristella aus, die nach Umkristallisieren aus Wasser einen Schmelzpunkt

von 243 bis 259°C besaßen. /j&J ²⁰ = -8,4° (2 η HCl,

D c m l). Analyse» C 59,42 #$ H 6,78 #; N 7,59 #{ O 26,44 #5 berechnet für C₉H₁₂NO₃! C 59,33 #| H 6,64 %-, N 7,69 1»\ O 26,35 #»

Beispiel 21

Hydrolyse von L(-)-3-(3»4-Methylendioxyphenyl)-alanin. L(-)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-alanin

wurde durch Kochen von 1,5 g L(-)-3-(3,4-MethylendioxyphenydL)-alanin in einem Gemisch (lsi) von 5? ^-iger Jodwasserstoff säure und iCseigsäureanhydrid (20 ml) und rotem Phosphor (4 g) unier einer Argonatmosphäre während 3 Stunden erhalten. Danach wurde das Gemisch filtriert, gekühlt und mehrfach mit Wasser unter einer Argonatmosphäre und vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde zusammen mit 10 ml Wasser filtriert, worauf der pH-Wert mit Ammoniak unter gleichzeitiger Argonzufuhr zu dem Gemisch auf 4,5 eingestellt wurde» 10 ml Hexan wurden zugesetzt, und nach 12-*stündigem kühlem Lagern wurde das Produkt gesanmelt* Die erhalt·»· Substanz besaß einen Schmelzpunkt von 276 bi« 278°C.

B«l»piel 22

Hydrolyse v*a L(-)-3-(3-M«tao3cy-4-hydroxyphenyl)-alanin.

L(-*) -3- ( 3,4-Dihydroxyphenyl) -alanin

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-CH₂CHCOOH

NH,

CH₉CHCOOH NH_n

L(-}-3-(3-Methoxy-4-hydroxyphenyl)-alanin (2,14 g, 0,0095 Mol) wurde mit 7,5 ml 47 #-igem HBr und Phenol (2,3 g) vermischt und unter Rückfluß 3 Stunden gekocht. Das Gemisch wurde unter Vakuum eingedampft, der Rückstand in 3 ml Wasser und 7 ml Äthylacetat aufgelöst. Die Wasserphase wurde mit SO.-behandelter Aktivkohle behandelt, etwas NaHS0„ wurde zugesetzt, und der pH-Wert wurde mit konzentriertem Ammoniak unter Kühlen auf

20

4 gesteigert, wobei die Aminosäure ausfiel.- £&[/ (o a 2, N HCl) (einmal aus Wasser).

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Claims

Patentansprüche L(-)-Form der Verbindungen der allgemeinen Formel

R² —- CH₀-CH-COOH
I "X ^{1 NH}2 R³

2 und deren therapeutisch verträgliche Salze, worin R eine Hydroxyl- oder Alkoxygruppe mit nicht mehr als 5

3
Kohlenstoffatomen und R ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder Alkoxygruppe mit nicht mehr als 5 Kohlenstoffatomen unter der Maßgabe bedeutet, daß

R ein ¥asserstoffatotn, eine Hydroxylgruppe oder eine

2
Alkoxygruppe ist, wenn R eino Alkoxygruppe bedeutet,

3 2

und R eine Alkoxygruppe ist, wer»/- R eine Hydroxyl-

2 . 3

gruppe bedeutet, oder R zusammengenommen mit R eine Alkylendioxygruppe mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen bedeutet.

2.) Verfahren zur Herstellung von therapeutisch aktiven Verbindungen der allgemeinen Formel

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- BtJ - · ."

worin R¹¹ eine Hydroxyl- oder Alkoxygruppe mit nicht mehr als 5 Kohlenstoffatomen und R¹·' ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder Alkoxygruppe mit nioht mehr als 5 Kohlenstoffatomen oder R'* zusammengenommen mit R¹¹¹ eine Alkylendioxygruppe mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen ;bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel

CH₀-CH-CO₉H

NHrCO-CH₂-// ^S

worin R'* und R¹'' die obige Bedeutung haben und X ein Wasserstoffatom, Fluoratom, Chloratom, Bromatom oder eine Nitrogruppe bedeutet, mit einer etereoselektiv wirkenden S.coli-Acylase unter Bildung der L(-)-Form einer Verbindung der allgemeinen Formel

CH₂-CH-COOH

NH₂

inkubiert und anschließend ggf. die Gruppen R¹¹ und R'¹*, wenn diese beide etwas anderes als ein Wasserstoffato m bedeuten, nach an sich bekannten Methoden in Hydroxylgruppen oder, wenn R¹¹¹ ein Wasseretoffatom bedeutet, die Gruppe R¹'nach an sich bekannten Methoden in eine Hydroxyl-

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gruppe überführt.

3.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gruppe R*' und R¹'' in die entsprechenden Hydroxylgruppen durch Behandlung mit Jodwasseretoffsäure und rotem Phosphor überführt,

4.) Verfahren nach Anspruch 2 und 3» dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert von 6 bis 8 während einer Zeit von 1 bis 72 Stunden und bei einer Temperatur zwischen O und 60 C, vorzugsweise bei etwa 45 C, inkubiert.

5·) Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Inkubation den pH-Wert auf einen Wert zwischen 1,5 und 3*5 einstellt und nichtaufgespaltene N-Acylaminosäura mit einem organischen Lösungsmittel, zweckmäßig Äthylacetat, extrahiext, worauf man die gebildete L(-)-Aminosäure aus der Vaeserphase isoliert.

6.) Verbindung als Ausgangsmaterial für das Verfahren gemäß Anspruch 2 bis 5» gekennzeichnot,durch die allgemeine Formel

.CH₂-CH-CO₂H

NH-CO-CH

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- 3ο -

2100A

worin X, R¹' und R''¹ die obige Bedeutung haben.

7.) DL-N-Phenylaoetyl-3-(3,^-methylendioxyphenyl)-alanin, 8.) DL-N-Phenylacetyl-3-(3-methoxyphenyl)-alanin.

9.) DL-N-Phenylacetyl-3-(3-methoxy-4-hydroxypheny1)-alanin.

10. DL-N-Phenylacetyl-3-(3-hydroxy-^-methoxyphenyl)-alanin.

11.) DL-N-Phenylacetyl-(3,4-d!hydroxyphenyl)-alanin. 12.) DL-N-Phenylacetyl-(3-hydroxyphenyl)-alanin. 13.) Athyl-N-phenylaoetyl-m-tyroslnat der Formel

.CH₂-CH-COOC₂H₅ NH-CO-CH₂-^

OH

Ik.) Verbindung der allgemeinem Formel

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■- J* *-

worin R die Gruppe -OCH bedeutet oder die beiden Gruppen R zusammengenommen eine Methylendioxygruppe bedeuten.

15·) Verbindung der allgemeinen Formel

worin R die obige Bedeutung hat.

16.) Verbindung der Formel

OCH

17·) Verbindung der Formel

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18.) Pharmazeutisches Mittel, insbesondere zur Behandlung von Parkinsonismus, gekennzeichnet durch den Gehalt wenigstens einer Verbindung gemäß Anspruch 1, ggf. in Kombination mit einem an sich bekannten pharmazeutisch verträglichen Trägermaterial.

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