DE69938003T2

DE69938003T2 - Sammlungen von verbindungen

Info

Publication number: DE69938003T2
Application number: DE69938003T
Authority: DE
Inventors: David Edwin Nottingham THURSTON; Philip Wilson Portsmouth HOWARD
Original assignee: ADC Products UK Ltd
Current assignee: ADC Products UK Ltd
Priority date: 1998-08-27
Filing date: 1999-08-27
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2019-08-28
Also published as: DE69938003D1; WO2000012506A3; AU763214B2; JP2002525283A; GB9818730D0; AU5526099A; NZ510490A; ATE384063T1; CA2341434A1; US20040092736A1; EP1107969A2; US6608192B1; JP4689826B2; WO2000012506A2; CA2341434C; EP1107969B1; US7704924B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Sammlungen von Pyrrolobenzodiazepinen und Syntheseverfahren solcher Verbindungen auf festen Trägern.
Stand der Technik
Verbindungen mit biologischer Aktivität können durch Screenen von Sammlungen von Verbindungen (nämlich Bibliotheken von Verbindungen), die mittels chemischer Syntheseverfahren hergestellt wurden, identifiziert werden. Solche Screeningverfahren umfassen Verfahren, bei denen die Bibliothek eine Vielzahl von Verbindungen umfasst, die an spezifischen Stellen auf der Oberfläche eines festen Trägers synthetisiert werden, wobei ein Rezeptor geeignet markiert ist, um die Bindung an die Verbindung zu identifizieren, z. B. fluoreszierende oder radioaktive Markierungen. Die Korrelation des an den Träger gebundenen markierten Rezeptors mit seinem Ort auf dem Träger identifiziert die Bindungsverbindung ( US-Patent 5.143.854 ).
Diese Verfahren zeichnen sich hauptsächlich durch das Screenen einer Vielzahl von Verbindungen in der Bibliothek und die Fähigkeit aus, die Strukturen der Verbindungen, welche eine erforderliche biologische Aktivität aufweisen, zu identifizieren. Um die Synthese und Identifizierung zu erleichtern, werden die Verbindungen in der Bibliothek üblicherweise auf festen Trägern ausgebildet. Jede solche Verbindung ist für gewöhnlich über einen spaltbaren oder nicht spaltbaren Verbindungsarm kovalent an den Träger gebunden. Die Bibliotheken der Verbindungen können entweder auf dem festen Träger oder als gespaltene Produkte gescreent werden, um Verbindungen mit guter biologischer Aktivität zu identifizieren.
Stand der Technik
Eine große Anzahl an sowohl synthetisch und natürlich vorkommenden niedermolekularen Liganden ist bekannt, die über eine Reihe unterschiedlicher Mechanismen mit DNA Wechselwirken, einschließlich kovalenter oder nicht kovalenter Wechselwirkung in den kleinen oder großen Furchen, Einschiebung zwischen Basenpaaren oder anderen Typen nicht spezifischer Wechselwirkungen.
Pyrrolobenzodiazepine (PBDs) sind eine bestimmte Klasse von Verbindungen, die mit der kleinen Furche Wechselwirken. PBDs weisen die Fähigkeit auf, spezifische DNA-Sequenzen zu erkennen und zu binden; die bevorzugteste Sequenz ist PuGPu (Purin-Guanin-Purin). Das erste PBD-Antitumorantibiotikum, Anthramycin, wurde 1965 entdeckt (Leimgruber et al., J. Am. Chem. Soc. 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber et al., J. Am. Chem. Soc. 87, 5791-5793 (1965)). Seit damals ist über eine Reihe von natürlich vorkommenden PBDs berichtet worden, und über 10 Synthesewege für eine Vielzahl von Analoga wurden entwickelt (Thurston et al., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994)). Zu dieser Familie gehören Abbeymycin (Hochlowski et al., J. Antibiotics 40, 145-148 (1987)), Chicamycin (Konishi et al., J. Antibiotics 37, 200-206 (1984)), DC-81 ( Japanisches Patent 58-180 487 ; Thurston et al., Chem. Brit. 26, 767-772 (1990); Bose et al., Tetrahedron 48, 751-758 (1992)), Mazethramycin (Kuminoto et al., J. Antibiotics 33, 665-667 (1980)), Neothramycine A und B (Takeuchi et al., J. Antibiotics 29, 93-96 (1976)), Porothramycin (Tsunakawa et al., J. Antibiotics 41, 1366-1373 (1988)), Prothracarcin (Shimizu et al., J. Antibiotics 29, 2492-2503 (1982); Langley und Thurston, J. Org. Chem. 52, 91-97 (1987)), Sibanomicin (DC-102) (Hara et al., J. Antibiotics 41, 702-704 (1988); Itoh et al., J. Antibiotics 41, 1281-1284 (1988)), Sibiromycin (Leber et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 2992-2993 (1988)) und Tomamycin (Arima et al., J. Antibiotics 25, 437-444 (1972)).
PBDs weisen folgende allgemeine Struktur auf:
Sie unterscheiden sich durch die Anzahl, Art und Position von Substituenten sowohl an ihren aromatischen Ringen A als auch an ihren Pyrrolo-Ringen C und durch den Sättigungsgrad des C-Rings. An der N10-C11-Position, die das für das Alkylieren von DNA verantwortliche elektrophile Zentrum ist, ist entweder ein Imin (N=C), ein Carbinolamin (NH-CH(OH)) oder ein Carbinolaminmethylether (NH-CH(OMe)) vorhanden. Alle bekannten natürlichen Produkte weisen eine (S)-Konfiguration an der chiralen C11a-Position auf, die sie, vom C-Ring Richtung A-Ring gesehen, mit einer Rechtsdrehung versieht. Das verleiht ihnen die angemessene dreidimensionale Gestalt für Isohelizität mit der kleinen Furche der B-DNA, was zu einem guten Sitz an der Bindungsstelle führt (Kohn, Antibiotics III, 3-11, Springer-Verlag, New York, USA (1975); Hurley und Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Resultierende 19, 230-237 (1986)). Ihre Fähigkeit, ein Addukt in der kleinen Furche zu bilden, ermöglicht es ihnen, in DNA-Processing einzugreifen, woraus sich ihr Einsatz als Antitumormittel begründet.
Offenbarung der Erfindung
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verbindungen der Formel (I):
worin X aus COOH, NHZ, SH oder OH ausgewählt ist, worin Z entweder H oder eine Aminschutzgruppe ist;
A = O, S, NH oder eine Einfachbindung ist;
R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus: H, R, OH, OR, =O, =CH-R, =CH₂, CH₂-CO₂R, CH₂-CO₂H, CH₂-SO₂R, O-SO₂R, CO₂R, COR und CN, und gegebenenfalls liegt eine Doppelbindung zwischen C₁ und C₂ oder C₂ und C₃ vor;
R₆, R₇ und R₉ unabhängig voneinander aus H, R, OH, OR, Halogen, Nitro, Amino, Me₃Sn ausgewählt sind;
R₁₁ entweder H oder R ist;
Q = S, O oder NH ist;
R₁₀ eine Stickstoffschutzgruppe ist;
worin R eine Niederalkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe (nämlich eine Alkylgruppe mit einem oder mehreren Arylsubstituenten) mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, wovon die Alkylgruppe gegebenenfalls eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen oder -Dreifachbindungen enthält, die Teil eines konjugierten Systems bilden können, oder eine Arylgruppe mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist; und gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- oder Nitrogruppen substituiert ist; und
Y eine zweiwertige Gruppe ist, sodass HY = R ist.
Diese Verbindungen sind für die Synthese von Pyrrolobenzodiazepin-Sammlungen geeignet. Verbindungen der Formel I können z. B. über einen Linker, der gegebenenfalls eine Kette aus kombinatorischen Einheiten umfasst, an einen festen Träger gebunden sein. Ohne N10-Schutz bestünde ein größeres Risiko, dass es während des Bindungsschritts zu ungewünschten Nebenreaktionen mit der Iminbindung kommt.
Wenn R eine Arylgruppe ist und ein Heteroatom umfasst, dann ist R eine heterozyklische Gruppe. Wenn R eine Alkylkette ist und ein Heteroatom enthält, kann das Heteroatom an einer beliebigen Stelle in der Alkylkette, z. B. -O-C₂H₅, -CH₂-S-CH₃, vorliegen oder einen Teil einer funktionellen Gruppe, z. B. Carbonyl, Hydroxy, bilden oder diese sein.
R- und HY-Gruppen sind vorzugsweise unabhängig voneinander aus einer Niederalkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder einer Aralkylgruppe mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen oder einer Arylgruppe mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- oder Nitrogruppen substituiert ist, ausgewählt. Noch bevorzugter sind die R- und HY-Gruppen unabhängig voneinander aus Niederalkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- oder Nitrogruppen substituiert sind, ausgewählt. Es wird besonders bevorzugt, dass R oder HY unsubstituierte, unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 6, noch bevorzugter 1 bis 4, Kohlenstoffatomen sind, wie z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl.
Alternativ dazu können R₆, R₇ und R₉ vorzugsweise unabhängig voneinander aus R-Gruppen ausgewählt sein, die nachstehende Struktureigenschaften aufweisen:

(i) eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe;
(ii) eine gegebenenfalls substituierte Ethenylgruppe;
(iii) eine an eine Elektronensenke konjugierte Ethenylgruppe.

Die Bezeichnung „Elektronensenke" steht für eine Gruppierung, die kovalent an eine Verbindung gebunden ist, welche in der Lage ist, die Elektronendichte in anderen Teilen der Verbindung zu reduzieren. Beispiele für Elektronensenken umfassen Cyano-, Carbonyl- und Estergruppen.
Die Bezeichnung „Stickstoffschutzgruppe" (oder „Aminschutzgruppe") steht für die in der präparativen Chemie, insbesondere in der präparativen Peptidchemie, übliche Bedeutung. Sie steht für eine beliebige Gruppe, die kovalent an das Stickstoffatom der Pyrrolobenzodiazepin-(oder Amin-)Gruppierung gebunden sein kann und die Durchführung von Reaktionen auf dem diese Gruppierung enthaltenden Molekül ermöglicht, ohne dass diese entfernt werden muss. Sie kann dennoch ohne Auswirkung auf den Rest des Moleküls von dem Stickstoffatom entfernt werden. Geeignete Stickstoffschutzgruppen für die vorliegende Erfindung umfassen Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl), Nvoc (6-Nitroveratryloxycarbonyl), Teoc (2-Trimethylsilylethyloxycarbonyl), Troc (2,2,2-Trichlorethyloxycarbonyl), Boc (t-Butyloxycarbonyl), CBZ (Benzyloxycarbonyl), Alloc (Allyloxycarbonyl) und Psec (2(-Phenylsulfonyl)ethyloxycarbonyl). Andere geeignete Gruppen sind beschrieben in „Protective Groups in Or ganic Synthesis", T. Green und P. Wuts, veröffentlicht von Wiley (1991), hierin mittels Verweis aufgenommen. Es wird bevorzugt, dass die Stickstoffschutzgruppe eine Carbamatfunktionalität aufweist, wo sie sich an das Stickstoffatom an Position 10 der PBD-Ringstruktur bindet.
R₇ ist vorzugsweise eine elektronenspendende Gruppe. „Elektronenspendende Gruppe" steht für eine Gruppierung, die kovalent an eine Verbindung gebunden ist, die in der Lage ist, die Elektronendichte in anderen Teilen des Moleküls zu erhöhen. Beispiele für elektronenspendende Gruppen, die sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, umfassen Alkyl, Amin, Hydroxyl, Alkoxy und dergleichen.
In Verbindungen der Formel I ist Q vorzugsweise O, und R₁₁ ist vorzugsweise H. Unabhängig voneinander sind R₆ und R₉ vorzugsweise H, und R₇ ist vorzugsweise eine Alkoxygruppe und noch bevorzugter Methoxy oder Ethoxy. Es wird ferner bevorzugt, dass, wenn eine Doppelbindung in dem C-Ring vorliegt, diese zwischen C2 und C3 ist. In einem solchen Fall sind R₂ und R₃ vorzugsweise H.
-Y-A ist vorzugsweise eine Alkoxykette, vorzugsweise eine Ethoxykette.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel II dargestellt sind:
worin Y, A, R₇, R₂, R₃, R₆ und R₉ wie in dem ersten Aspekt der Erfindung definiert sind;
X' = CO, NH, S oder O ist;
T ein Aminosäurerest; und
n eine positive ganze Zahl ist, worin jedes T unterschiedlich sein kann, wenn n größer als 1 ist.
Es wird bevorzugt, dass X' entweder CO oder NH ist. n kann vorzugsweise 1 bis 16 und noch bevorzugter 3 bis 14 sein.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel III dargestellt sind:
worin X', Y, A, R₇, R₂, R₃, R₆, R₉ und T wie in dem zweiten Aspekt der Erfindung definiert sind;
n Null oder eine positive ganze Zahl ist;
L eine Bindungsgruppe oder weniger bevorzugt eine Einfachbindung ist; und
O ein fester Träger ist, worin jedes T unterschiedlich sein kann, wenn n größer als 1 ist.
Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel IV dargestellt sind:
worin X', Y, A, R₇, R₂, R₃, R₆, R₉, T, n, L und O wie in dem dritten Aspekt der Erfindung definiert sind und R₁₀, R₁₁ und Q wie in dem ersten Aspekt der Erfindung definiert sind.
Ein fünfter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel VI dargestellt sind:
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉ und T wie im zweiten Aspekt der Erfindung definiert sind;
n und m positive ganze Zahlen sind oder eines davon gegebenenfalls Null ist;
T' ein Aminosäurerest ist, worin jedes T' unterschiedlich sein kann, wenn m größer als 1 ist;
T'' ein Aminosäurerest ist, der eine Bindungsstelle für X' bereitstellt; und
p eine positive ganze Zahl ist, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'' und die Werte von n und m für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Wenn beispielsweise X' = CO ist, ist die Stelle auf T'' gegebenenfalls NH, und wenn X' = NH, S oder O ist, ist die Stelle auf T'' gegebenenfalls CO.
In einem bevorzugten Aspekt des fünften Aspekts der vorliegenden Erfindung ist die Sammlung der Verbindungen in allen Fällen durch Formel (VIa) dargestellt:
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T'' wie oben definiert sind.
Ein sechster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel VII dargestellt sind:
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', n, m und p wie in dem fünften Aspekt und Q, R₁₀ und R₁₁ wie in dem ersten Aspekt der Erfindung definiert sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', Q, R₁₀, R₁₁ und die Werte von n und m für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Ein siebter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel VIII dargestellt sind:
worin X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', n, m und p wie in dem fünften Aspekt der Erfindung definiert sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'' und die Werte von n und m für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Ein achter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel IX dargestellt sind:
worin X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, Q, R₁₀, R₁₁, T, T', T'', n, m und p wie in dem sechsten Aspekt der Erfindung definiert sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', Q, R₁₀, R₁₁ und die Werte von n und m für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Ein neunter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel X dargestellt sind:
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', n, m und p wie in dem fünften Aspekt der Erfindung definiert sind, und X'', Y', A', R'₂, R'₃, R'₆, R'₇ und R'₉ aus den gleichen Möglichkeiten wie X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇ bzw. R₉ gewählt sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'' und die Werte von n und m für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Ein zehnter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel XI dargestellt sind:
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, X'', Y', A', R'₂, R'₃, R'₆, R'₇, R'₉, T, T', T'', n, m und p wie in dem neunten Aspekt der Erfindung definiert sind, Q, R₁₀ und R₁₁ wie in dem ersten Aspekt der Erfindung definiert sind und Q', R'₁₀ und R'₁₁ die gleichen Definitionen wie Q, R₁₀ bzw. R₁₁ aufweisen, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', Q, R₁₀, R₁₁ und die Werte von n und m für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Ein elfter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel XII dargestellt sind:
worin X', Y, A, R₇, R₂, R₃, R₆, R₉, X'', Y', A', R'₇, R'₂, R'₃, R'₆, R'₉, T, T', T'', n, m und p wie in dem neunten Aspekt der Erfindung definiert sind und worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'' und die Werte von n und m für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Ein zwölfter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel XIII dargestellt sind:
worin X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, Q, R₁₀, R₁₁, X'', Y', A', R'₂, R'₃, R'₆, R'₇, R'₉, Q', R'₁₀, R'₁₁, T, T', T'', n, m und p wie in dem zehnten Aspekt der Erfindung definiert sind und worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', Q, R₁₀, R₁₁ und die Werte von n und m für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Ein dreizehnter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel XIV dargestellt sind:
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', n, m und p wie in dem fünften Aspekt der Erfindung definiert sind und T''' und q aus den gleichen Möglichkeiten wie T bzw. n gewählt sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von T, T', T'', T''' und die Werte von n, m und q für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Ein vierzehnter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel XV dargestellt sind:
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', T''', n, m, p und q wie in dem dreizehnten Aspekt der Erfindung definiert sind und Q, R₁₀ und R₁₁ wie in dem ersten Aspekt der Erfindung definiert sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von T, T', T'', T''' und die Werte von n, m und q für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Ein fünfzehnter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel XVI dargestellt sind:
worin X', Y, A, R₇, R₂, R₃, R₆, R₉, T, T', T'', T''', n, m, p und q wie in dem dreizehnten Aspekt der Erfindung definiert sind und worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von T, T', T'', T''' und die Werte von n, m und q für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Ein sechzehnter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sammlung von Verbindungen, die alle durch Formel XVII dargestellt sind:
worin X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, Q, R₁₀, R₁₁, T, T', T'', T''', n, m, p und q wie in dem dreizehnten Aspekt der Erfindung definiert sind und worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von T, T', T'', T''' und die Werte von n, m und q für jede Grundeinheit unabhängig voneinander gewählt sind.
Fester Träger
Die Bezeichnung „fester Träger" betrifft ein Material mit einer harten oder halb-harten Oberfläche, die reaktive Funktionalitäten enthält oder derivatisiert werden kann, um diese zu enthalten, welche dazu dienen können, eine Verbindung kovalent an die Oberfläche davon zu binden. Solche Materialien sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt; Beispiele dafür umfassen Siliciumdioxidträger, die reaktive Si-OH-Gruppen enthalten, Polyacrylamidträger, Polystyrolträger, Polyethylenglykolträger und dergleichen. Solche Träger weisen vorzugsweise die Form von kleinen Kügelchen, Stiften/Kronen, Laminaroberflächen, Pellets, Scheiben auf. Andere herkömmliche Formen können ebenfalls eingesetzt werden.
Bindungsgruppe
Eine Klasse von Bindungsgruppen, die sich für die vorliegende Anwendung eignet, ist eine, die in der Struktur:
zumindest eine kovalente Bindung bereitstellt, die durch spezifische chemische Reaktionen (oder durch Licht oder Veränderung des pH-Werts) leicht aufgespalten werden kann, wodurch das Freisetzen von Verbindungen von dem festen Träger bereitgestellt wird. Die zur Aufspaltung der kovalenten Bindung angewandten Verfahren sind so gewählt, dass sie für die Aufspaltung der gewünschten Bindung spezifisch sind, wodurch an einer anderen Stelle auf dem Komplex auftretende unbeabsichtigte Reaktionen verhindert werden. Die Bindungsgruppe wird in Bezug auf die Synthese der auf dem festen Träger auszubildenden Verbindungen gewählt, um eine vorzeitige Abspaltung dieser Verbindung von dem festen Träger zu verhindern sowie durch beliebige während der Verbindungssynthese auf dem Träger angewandte Verfahren verursachte Interferenzen einzuschränken.

Beispiele für Harze, die Bindungsgruppen aufnehmen, sind in nachstehender Tabelle dargelegt, die auch die darauf immobilisierbaren Gruppen zusammen mit den empfohlenen Abspaltungsverfahren für die Bindungsgruppe anführt. Solche Harze sind im Handel erhältlich (z. B. von NovaBiochem). Die Tabelle führt auch an, welche der Bindungsgruppen für Verbindungen geeignet ist, bei denen die N10-Position nicht geschützt ist, und zwar bei denen die Abspaltungsverfahren sich nicht auf eine N10-C11-Iminbindung auswirken würden.

Bindungsgruppe/Harz-Typ	immobilisiert	Abspaltungsverfahren	verträglich mit nicht geschütztem PBD
2-Chlortritylchlorid	RNH₂, RCO₂H, ROH, RSH	1–50% TFA	möglicherweise
Tritylchlorid	RNH₂, RCO₂H, ROH, RSH	1–5% TFA	ja
2-Methoxytritylchlorid	RNH₂, RCO₂H, ROH, RSH	1–5%	ja
Rinkamidharz	RCO₂H	95% TFA	ja
Sieberamidharz	RCO₂H	1% TFA	ja
4-Sulfamylbenzoyl	RCO₂H	Alkylierung/Amine	ja
Wangharz	ROH, ArOH, RNH₂, RCO₂H	15–95% TFA oder DDQ oder CAN	möglicherweise
HMPB-BHA	ROH, ArOH, RCO₂H	1% TFA	möglicherweise
Bromethyl-Photolinker	RNH₂, RCO₂H, ROH, RSH	hv	ja
Hydroxyethyl-Photolinker	RCO₂H	hv	ja
Aminoethyl-Photolinker	RCO₂H	hv	ja

Strukturen
Für geschützte PBDs ist die bevorzugteste Bindungsgruppe die Rink-Linkergruppe, welche mittels TFA abspaltbar ist. Die N-geschützten PBDs können anschließend mittels Photolyse entschützt werden. Für nicht geschützte PBDs sind die Bindungsgruppen der Wahl solche, die photolabil sind.
Es ist auch möglich, dass die Bindungsgruppe eine auf dem festen Träger bereitgestellte einfache Funktionalität ist, z. B. Amin, und in einem solchen Fall ist die Bindungsgruppe nicht leicht abspaltbar. Diese Art der Bindungsgruppe ist für die Synthese von grßen „Split-and-Mix"-Bibliotheken geeignet, die einem Screening auf Kügelchen (siehe unten) unterzogen werden, bei dem keine Abspaltung erforderlich ist. Solche Harze sind im Handel von einer großen Anzahl an Firmen, einschließlich NovaBiochem, Advanced ChemTech und Rapp Polymere, erhältlich. Solche Harze umfassen Aminotentagel und aminomethyliertes Polystyrolharz.
Aminosäurerest
Die T-Gruppe ist ein Aminosäurerest. Ketten können mittels amingeschützten Aminosäuren synthetisiert werden. Fmoc-geschützte Aminosäuren sind von einer Reihe von Quellen erhältlich, wie z. B. Sigma und Nova Biochem. Es können sowohl natürliche als auch künstliche Aminosäuren eingesetzt werden, z. B. D- und L-Aminosäuren und heterozyklische Aminosäuren. Insbesondere sind heterozyklische Aminosäuren des im Aufbau von Netropsin und Distamycin vorliegenden Typs aufgrund ihrer DNA-Erkennungseigenschaften von Interesse.
Ein Aminosäureresttyp von besonderer Bedeutung für die vorliegende Erfindung ist ein auf den Pyrrolobenzodiazepinstrukturen basierender Typ; diese weisen die allgemeinen Formeln XVIIIa und XVIIIb auf:
worin R₃, R₆, R₇, R₉, R₁₀, R₁₁, Q, A und Y wie in dem ersten Aspekt der Erfindung definiert sind und A' und Y' unabhängig voneinander aus den möglichen Gruppen für A bzw. Y gewählt sind.
Ein weiterer Typ eines besonders relevanten Aminosäurerests ist ein auf einem Cyclopropylindol basierender Typ („eine CPI-Einheit"). Solche Einheiten sind dafür bekannt, mit der kleinen DNA-Furche kovalent wechselzuwirken, was für AT spezifisch ist. Diese Einheiten weisen die allgemeinen Formeln XIXa und XIXb auf:
worin P_x (falls vorhanden) eine elektrophile Abgangsgruppe ist; P_y (falls vorhanden) aus NH-Prot, O-Prot, S-Prot, NO₂, NHOH, N₃, NHR, NRR, N=NR, N(O)RR, NHSO₂R, N=NPhR, SR oder SSR gewählt ist, wobei Prot für eine Schutzgruppe steht; P'_y (falls vorhanden) aus NH, O und S gewählt ist; D und E zusammen für einen kondensierten Benzol- oder Pyrrolring (in beiden Ausrichtungen) stehen, der gegebenenfalls mit bis zu jeweils 3 oder 1 zusätzlichen Gruppen substituiert ist, die unabhängig voneinander aus R, OH, OR, Halogen, Nitro, Amino, Me₃Sn, CO₂H, CO₂R gewählt sind; P₂ und P₇ unabhängig voneinander aus H, R, OH, OR, Halogen, Nitro, Amino, Me₃Sn gewählt sind.
R ist vorzugsweise wie oben. P_y ist vorzugsweise NH-Prot, O-Prot, S-Prot, und P_x ist vorzugsweise Halogen oder OSO₂R. Es ist ferner bevorzugt, dass der (-CO₂-)-Substituent in Position 2 oder 3 des Benzolrings oder Position 2 des Pyrrolrings vorliegt. P₂ und P₇ sind vorzugsweise H.
Diese Verbindungen können unter Anwendung der von Boger et al., Chem. Rev. 97, 787-828 (1997); Cava et al., Drost, K. J.; Cava, M. P., J. Org. Chem. 56, 2240-2244 (1991); Rawal, V. H.; Jones, R. J.; Cava, M. P., J. Org. Chem. 52, 19-28 (1987); und Aristoff, J. Med. Chem. 57, 6234-6239 (1993, 1992), beschriebenen Verfahren synthetisiert werden.
Die nachstehende Synthese ist als Beispiel für die Anwendung des Boger-Verfahrens bereitgestellt.
Synthese eines CPI-Aminosäurerests
Die Synthese beginnt mit einer Wadsworth-Horner-Emmons-Kondensation von 3-Brombenzaldehyd mit dem Sargent-Phosphonat, das in erster Linie das E-Isomer bereitstellt, welches wiederum eine säurekatalysierte Entschützung und eine Friedel-Crafts-Acylierung erfährt. Dadurch wird der funktionalisierte Vorläufer gebildet, worauf eine 5-Exo-Trigarylrest-Alkylen-Zyklisierung folgt.
Reagenzien und Bedingungen: a: NaH, Sargent-Phosphat; b: TFA; c: 1) Ac₂O-KOAc; 2) K₂CO₃; 3) BnBr, K₂CO₃; d: CuCN; e: 1) LiOH; 2) DPPA, t-BuOH; f: NIS; g: Allyl-Br, NaH; h: Bu₃SnH, TEMPO; i: Zn-HOAc; j: Ph₃P-CCl₄; k: NaOH.
Nach einer aromatischen nucleophilen Substitution, Esterhydrolyse und Curtius-Umlagerungen, die durch die Behandlung mit DPPA bewirkt werden, folgt eine regioselektive C4-Iodierung und N-Alkylierung mit Allylbromid. Die wie in der Boger-Synthese von CBI beschriebene Arylrest-Alkylen-Zyklisierung mittels TEMPO als Radikalfänger stellt das trizyklische System bereit, das nach der Überführung in pri märes Chlorid und basenkatalysierten Hydrolyse der Cyanogruppe die gewünschte kombinatorische Einheit ergibt. Die vorliegende Erfindung betrifft Bibliotheken oder Sammlungen von Verbindungen, die alle durch eine einzige der Formeln I bis IV, VI bis XVII dargestellt sind. Die Diversität der Verbindungen in einer Bibliothek gibt Aufschluss über die Gegenwart von Verbindungen, die sich hinsichtlich der Identitäten einer oder mehrerer der Substituentengruppen und/oder hinsichtlich der Identitäten der kombinatorischen T-Einheiten (falls vorhanden) unterscheiden. Die Anzahl der Mitglieder in der Bibliothek hängt von der Anzahl der Varianten und der Anzahl der Möglichkeiten für jede Variante ab. Wenn beispielsweise die kombinatorischen Einheiten variiert werden und es 3 kombinatorische Einheiten mit 3 Möglichkeiten für jede Einheit gibt, weist die Bibliothek 27 Verbindungen auf. 4 kombinatorische Einheiten und 5 Möglichkeiten für jede Einheit ergibt eine Bibliothek mit 625 Einheiten. Wenn es beispielsweise eine Kette mit 5 kombinatorischen Einheiten mit 17 Möglichkeiten für jede Einheit gibt, würde die Gesamtanzahl der Mitglieder in der Bibliothek 1,4 Millionen betragen. Eine Bibliothek kann daher mehr als 1.000, 5.000, 10.000, 100.000 oder eine Million Verbindungen umfassen, die wie unten beschrieben angeordnet werden können.
Im Falle der freien Verbindungen (Formeln I, II, VIII, IX, XII, XIII, XVI und XVII) liegen die einzelnen Verbindungen vorzugsweise in diskreten Volumina von Lösungsmitteln, z. B. in Röhrchen oder Wells, vor. Im Falle von gebundenen Verbindungen (Formeln III, IV, VI, VII, X, XI, XIV und XV) sind die einzelnen Verbindungen vorzugsweise an diskreten Stellen, z. B. auf den jeweiligen Stiften/Kronen oder Kügelchen, gebunden. Die Bibliothek der Verbindungen kann auf einer Platte, die eine geeignete Größe für die Bibliothek aufweist, oder auf einer Reihe von Platten mit Standardgröße, z. B. 96-Well-Platten, bereitgestellt sein. Wenn die Anzahl der Mitglieder der Bibliothek groß ist, enthält jeder Well auf einer Platte vorzugsweise eine Reihe von verwandten Verbindungen aus der Bibliothek, z. B. 10 bis 100. Eine Möglichkeit für diesen Typ der Gruppierung von Verbindungen ist jene, bei der lediglich eine Untergruppe der kombinatorischen Einheiten oder Substituenten bekannt ist und der Rest randomisiert ist; diese Anordnung ist für iterative Screeningverfahren (siehe unten) geeignet. Die Bibliothek kann in anderen als den allgemein bekannten Formen vorhanden sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer wie oben beschriebenen diversen Sammlung oder Bibliothek von Verbindungen. Liegt die Diversität der Bibliothek in den kombinatorischen Einheiten vor, kann die Bibliothek durch schrittweise Zugabe von ungeschützten kombinatorischen Einheiten zu einem PBD-Kern synthetisiert werden, wobei zwischen jedem Schritt ein Entschützungsschritt liegt. Ein solches Verfahren wird später veranschaulicht. Bibliotheken dieses Typs können mittels eines Verfahrens hergestellt werden, das als „Split-and-Mix"-Verfahren bekannt ist, welches in Furka, A., Sebestyen, F., Asgedom, M. und Dibo, G., General Method of Rapid Synthesis of Multicomponent Peptide Mixtures, International Journal of Peptide and Protein Research 37, 487-193 (1991), das hierin durch Verweis aufgenommen ist, beschrieben ist. Liegt die Diversität der Bibliothek in den Substituentengruppen, kann die Bibliothek durch Durchführen der gleichen Syntheseverfahren auf einer Vielzahl von Ausgangsmaterialien oder Schlüsselzwischenprodukten, die bereits über die erforderlichen Substituentenmuster verfügen, synthetisiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Screenen der Verbindungen der Formel II, III, VI, VIII, X, XII, XIV und XVI, um biologisch aktive Verbindungen zu entdecken. Das Screenen kann dazu dienen, die Bindungswechselwirkung mit Nucleinsäuren, z. B. DNA oder RNA, oder Proteinen zu bewerten oder um die Wirkung der Verbindungen gegenüber Protein-Protein- oder Nucleinsäure-Protein-Wechselwirkungen, wie z. B. Transkriptionsfaktor DP-1 mit E2F-1 oder Östrogenantwortmitglied (ERE) mit menschlichem Östrogenrezeptor (einem 66-kd-Protein, das als hormonaktivierter Transkriptionsfaktor fungiert, dessen Sequenz auf dem Gebiet der Erfindung veröffentlicht und allgemein erhältlich ist), zu bewerten. Das Screenen kann durchgeführt werden, indem die Zielmakromoleküle mit einzelnen Verbindungen oder den oben beschriebenen Anordnungen oder Bibliotheken in Kontakt gebracht werden und solche Verbindungen oder Wells mit Verbindungsgemischen ausgewählt werden, die die stärkste Wirkung zeigen.
Diese Wirkung kann einfach nur die Zytotoxizität der betreffenden Verbindungen gegenüber Zellen oder der Bindung der Verbindungen an Nucleinsäuren sein. Im Falle der Protein-Protein- oder Nucleinsäure-Protein-Wechselwirkung kann die Wirkung die Unterbrechung der erforschten Wechselwirkung sein.
Die Bindung der Verbindungen an Nucleinsäuren kann durch Markieren von Oligomeren, die eine Zielsequenz enthalten, und durch Messen der Menge der markierten Oligomere, die sich an die getesteten Verbindungen binden, bewertet werden. Die Markierung kann entweder eine radioaktive Markierung sein oder alternativ dazu eine Markierung sein, die unter sichtbarem Licht oder UV-Licht detektierbar ist. Wird das letztere Screening-Verfahren auf Verbindungen durchgeführt, die an feste Träger gebunden sind, welche sich an unterschiedlichen Stellen befinden, kann das Screening nach Ergebnissen visuell unter einem Mikroskop durchgeführt werden. Ein ähnliches Verfahren ist detailliert in „DNA-Binding ligands from peptide libraries containing unnatural amino acids", Lescrinier et al., Chem. Eur. J., 425-433 (1998), beschrieben. Solche Verfahren eignen sich besonders für ein Einschritt-Screening einer vollständigen Bibliothek von Verbindungen, insbesondere einer großen, durch oben beschriebenes „Split-and-Mix"-Verfahren hergestellten Bibliothek.
Protein-Protein-Wechselwirkungen können in einer Reihe von Möglichkeiten gemessen werden, z. B. mittels FRET (Fluoreszenzresonanz-Energietransfer), die das Markieren eines der Proteine mit einer fluoreszierenden Donorgruppierung und des anderen mit einem Akzeptor, der in der Lage ist, die Emission aus dem Spender zu absorbieren, umfasst; das Fluoreszenzsignal des Donors ändert sich je nach Wechselwirkung zwischen den zwei Proteinen. Ein weiteres Verfahren zur Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist durch enzymatisches Markieren, beispielsweise mittels Meerrettichperoxidase.
Das Screening-Verfahren durchläuft gegebenenfalls mehrere Wiederholungen durch Auswahl der aktivsten Verbindungen oder Gruppen von Verbindungen, die in jeder Wiederholung getestet werden; dies ist besonders nützlich, wenn Anordnungen von Wells getestet werden, die Gemische verwandter Verbindungen umfassen. Enthalten die Wells darüber hinaus Verbindungen, für die nur eine Untergruppe der kombinatorischen Einheiten oder Substituenten bekannt sind, aber der Rest randomisiert ist, können anschließende Wiederholungen durch Synthetisieren von Verbindungen, die die/den gewählte(n) bekannte(n) (und erfolgreiche(n)) kombinatorische Einheit oder Substituenten, Struktur, jedoch mit weiter spezifizierten kombinatorischen Einheiten oder Substituenten aufweisen, Ersetzen der zuvor randomisierten kombinatorischen Einheiten oder Substituenten, die an bereits bekannte Strukturen angrenzen, durchgeführt werden; die restlichen kombinatorischen Einheiten oder Substituenten werden wie in der zuvorigen Wiederholung randomisiert. Dieses Wiederholungsverfahren ermöglicht die Identifizierung von aktiven Mitgliedern großer Bibliotheken ohne die Erfordernis, jedes Mitglied der Bibliothek zu isolieren.
Bevorzugte Synthesestrategien
Ein entscheidender Schritt auf einem bevorzugten Weg zu Verbindungen der Formel I ist ein Ringschluss zur Bildung des B-Rings, der die Bildung eines Aldehyds (oder eines funktionellen Äquivalents davon) an der zukünftigen Position 11 und einen Angriff darauf durch den Pro-10-Stickstoff umfasst:
In dieser Struktur steht D für XY oder eine maskierte Form davon. Der „maskierte Aldehyd", -CPQ, kann ein Acetal oder Thioacetal sein, wodurch der Ringschluss dann eine Demaskierung umfasst. Andererseits kann der maskierte Aldehyd auch ein Aldehydvorläufer, wie beispielsweise ein Alkohol, -CHOH, sein, wodurch die Reaktion dann eine Oxidation umfasst, beispielsweise mithilfe von TPAP oder DMSO (Swern-Oxidation).
Die maskierte Aldehydverbindung kann durch Kondensation eines entsprechenden 2-substituierten Pyrrolidins mit einer 2-Nitrobenzoesäure hergestellt werden:
Die Nitrogruppe kann dann zu -NH₂ reduziert und durch Umsetzung mit einem geeigneten Mittel, beispielsweise einem Chlorformiat, das die entfernbare Stickstoff-Schutzgruppe in der Verbindung der Formel I bereitstellt, geschützt werden.
Ein Verfahren, welches das Oxidations-Ringschlussverfahren umfasst, ist in Schema 1 dargestellt (eine alternative Art des Ringschlusses wird weiter unten in Bezug auf Schema 2 beschrieben).
Schema 1
Wenn R₁₁ etwas anderes ist als Wasserstoff, kann die Verbindung der Formel I durch direkte Veretherung des Alkohols Ia erhalten werden. Verbindungen, bei denen Q = S ist, können durch Behandlung des entsprechenden Alkohols Ia mit R₁₁SH und einem Katalysator (üblicherweise eine saure HCl-Lösung und manchmal eine Lewis-Säure, wie z. B. Al₂O₃) hergestellt werden. Wenn Q = NH ist, können diese Verbin dungen durch Umsetzen von Ia mit einem Amin R₁₁NH und einem Katalysator (üblicherweise eine wässrige Säure oder eine Lewis-Säure) hergestellt werden.
Wird der Alkohol B (in dem der 10-Stickstoff im Allgemeinen als Carbamat geschützt ist) über A4-Sieben Tetrapropylammoniumperruthenat (TPAP)/N-Methylmorpholin-N-oxid (NMO) ausgesetzt, führt das zur einer Oxidation, begleitet von einem spontanen B-Ringschluss, um das gewünschte Produkt zu ergeben. Der TPAP/NMO-Oxidationsvorgang ist besonders für Reaktionen im kleinen Maßstab geeignet, während der Einsatz von Oxidationsverfahren auf DMSO-Basis, insbesondere Swern-Oxidation, für großtechnische Arbeiten besser geeignet ist (z. B. > 1 g).
Der unzyklisierte Alkohol B kann durch die Zugabe eines Stickstoffschutzreagens der Formel D, das vorzugsweise ein Chlorformiat oder Säurechlorid ist, zu einer Lösung des Aminoalkohols C, im Allgemeinen in gelöster Form, üblicherweise in Gegenwart einer Base, wie z. B. Pyridin (vorzugsweise 2 Äquivalente), bei mäßiger Temperatur (z. B. bei 0°C), hergestellt werden. Unter diesen Bedingungen tritt normalerweise kaum oder keine O-Acylierung auf.
Der wesentliche Aminoalkohol C kann durch Reduktion der entsprechenden Nitroverbindung E hergestellt werden, wobei ein Verfahren gewählt wird, das den Rest des Moleküls intakt lässt. Die Behandlung von E mit Zinn(II)-chlorid in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Methanol unter Rückfluss, führt normalerweise nach Entfernen der Zinnsalze zum gewünschten Produkt in hoher Ausbeute.
Wird E Hydrazin/Raney-Nickel ausgesetzt, wird die Bildung von Zinnsalzen vermieden, was zu einer höheren Ausbeute von C führen kann, obwohl dieses Verfahren mit dem Bereich der möglichen C- und A-Ring-Substituenten weniger verträglich ist. Wenn beispielsweise eine C-Ring-Unsättigung vorliegt (entweder im Ring selbst oder in R₂ oder R₃), kann dieses Verfahren eventuell nicht geeignet sein.
Die Nitroverbindung der Formel E kann hergestellt werden, indem das geeignete o-Nitrobenzoylchlorid an eine Verbindung der Formel F gebunden wird, beispielsweise in Gegenwart von K₂CO₃ bei –25°C unter N₂-Atmosphäre. Verbindungen der Formel F können leicht hergestellt werden, beispielsweise durch Olefinierung des Ketons, das von L-trans-4-Hydroxyprolin abgeleitet ist. Das Keton-Zwischenprodukt kann auch durch Überführung in das Enoltriflat zur Verwendung in Palladium-vermittelten Bindungsreaktionen genutzt werden.
Das o-Nitrobenzoylchlorid wird aus der o-Nitrobenzoesäure (oder einem Alkylester nach einer Hydrolyse) der Formel G synthetisiert, das selbst aus einem Vanillinsäure-(oder einem Alkylester-)Derivat H hergestellt wird. Viele davon sind im Handel erhältlich, und manche sind in Althuis, T. H., und Hess, H. J., J. Medicinal Chem. 20(1), 146-266 (1977), offenbart.
Alternative Zyklisierung (Schema 2)
Schema 2
In Schema 1 bestand der letzte oder vorletzte Schritt in einer oxidativen Zyklisierung. Eine Alternative dazu, unter Einsatz von Thioacetal-Bindung, ist in Schema 2 darge stellt. Quecksilber-vermittelte Demaskierung verursacht eine Zyklisierung zur gewünschten Verbindung (Ia).
Die Thioacetal-Zwischenprodukte können wie in Schema 2 dargestellt hergestellt werden: Der Thioacetal-geschützte C-Ring [hergestellt nach dem Literatur-Verfahren von Langley, D. R., & Thurston, D. E., J. Organic Chemistry 52, 91-97 (1987)] wird mithilfe eines in der Literatur beschriebenen Verfahrens an die o-Nitrobenzoesäure (oder nach Hydrolyse den Alkylester) G gebunden. Die erhaltene Nitroverbindung kann aufgrund der Thioacetalgruppe nicht durch Hydrierung reduziert werden, so dass das Zinn(II)-chlorid-Verfahren eingesetzt wird, um das Amin zu erhalten. Dieses wird dann N-geschützt, beispielsweise durch Umsetzung mit einem Chlorformiat oder Säurechlorid, wie z. B. p-Nitrobenzylchlorformiat.
Acetal enthaltende C-Ringe können in dieser Art des Wegs als Alternative eingesetzt werden, wobei die Entschützung andere Verfahren, einschließlich des Einsatzes von Lewis-Säure-Bedingungen, umfasst.
In den obigen Syntheseschemata wird gezeigt, dass die Derivatisierung des A-Rings abgeschlossen ist, bevor die Verbindungen an den festen Träger gebunden sind. Dies wird bevorzugt, wenn die Substituenten Gruppen, wie z. B. Alkoxy oder Nitro, sind. Andererseits könnten Substituentengruppen, wie z. B. Alkyl oder Alkenyl, nach der Bindung der Verbindung an den festen Träger zu dem A-Ring hinzugefügt werden. Dies kann mittels R₅, R₇ oder R₉ erzielt werden, welche einfach zu ersetzende Gruppen, wie z. B. Halogenatome, darstellen.
Ein alternativer Syntheseansatz zu dem oben Beschriebenen ist das Schützen der Pro-N10-Position auf der Komponente, die den A-Ring bilden wird, bevor die Komponente verbunden wird, welche den C-Ring bilden wird.
Nachstehend sind Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anhand von Beispielen bezugnehmend auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, worin:
1 ein Reaktionsschema für die Synthese der Verbindungen der Formel I ist;
2 ein Reaktionsschema für die Synthese der alternativen Verbindungen der Formel I ist;
die 3a und 3b ein Reaktionsschema für die Synthese der Verbindungen der Formeln V, IV, III und II sind;
die 4a und 4b ein Reaktionsschema für die Synthese weiterer Verbindungen der Formeln V, IV, III und II sind;
5 ein Reaktionsschema für die Synthese der Verbindungen der Formel III und IV ist;
die 6a, 6b und 6c ein Reaktionsschema für die Synthese der Verbindungen der Formel VI und VII sind;
7 ein Reaktionsschema für die Synthese der Verbindungen der Formel III und IV ist;
die 8 und 9 Reaktionsschemata für die Synthese der Verbindungen der Formel III und IV sind;
die 10a, b und c ein Reaktionsschema für die Synthese von Verbindungen der Formel X und XI sind;
11 ein Reaktionsschema für die Synthese von Verbindungen der Formel XIII und XIV ist; und
die 12 bis 15 Reaktionsschemata für die Synthese der Verbindungen der Formel III und IV sind.
Allgemeine Verfahren
Schmelzpunkte (Fp.) wurden auf einem digitalen Schmelzpunktbestimmungsgerät Electrothermal 9100 bestimmt und sind unkorrigiert. Infrarot-(IR-)Spektren wurden unter Einsatz eines Spektralphotometers Perkin-Elmer 1000 gemessen. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren wurden auf einem Jeol-GSX-270-MHz-FT-NMR-Spektrometer bei 20°C +/– 1°C gemessen. Chemische Verschiebungen sind in Teilen pro Million (δ) Tieffeld von Tetramethylsilan (TMS) angegeben. Spinmultiplizitäten sind wie folgt beschrieben: s (Singulett), bs (breites Singulett), d (Dublett), dd (Dublett von Dubletts), t (Triplett), q (Quartett), p (Pentuplett) oder m (Multiplett). Massenspektren (MS) wurden unter Einsatz eines Jeol-JMS-DX-303-GC-Massenspektrometers (EI-Modus: 70 eV, Quelle 117–147°C) bestimmt. Exakte Molekülmassen (HRMS) wurden durch Peak-Vergleiche unter Einsatz von Perfluorkerosin (PFK) als inneren Massenmarker bestimmt, und FAB-Massenspektren wurden von einer Glycerin/Thioglycerin/Trifluoressigsäure-Matrix (1:1:0,1) mit einer Quellentemperatur von 180°C erhalten. Optische Drehungen an der Na-D-Linie wurden bei Umgebungstemperatur unter Einsatz eines Polarimeters ADP-220-Automatic-Polarimeter (Bellingham & Stanley) erhalten. Eine Flashchromatographie wurde unter Einsatz der Aldrich-Flashchromatographie- „Silica Gel-60" durchgeführt (E. Merck, 230–400 Mesh). Eine Dünnschichtchromatographie (DC) wurde unter Einsatz von GF₂₅₄-Kieselgel (mit einem Fluoreszenz-Indikator) auf Glasplatten durchgeführt. Alle Lösungsmittel und Reagenzien wurden, sofern nicht anders angegeben, von Aldrich Chemical Company Ltd. bezogen und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Wasserfreie Lösungsmittel wurden durch Destillation unter trockener Stickstoffatmosphäre in Gegenwart eines geeigneten Trocknungsmittels hergestellt und über 4 Å-Molekularsieben oder Natriumdraht gelagert. Petrolether bezieht sich auf die Fraktion mit einem Siedepunkt von 40 bis 60°C.
Beispiel 1: Synthese von PBDs der Formel I (1)
Gesamtsynthese
Die Verbindungen mit einer in einer Säure endenden Seitenkette, 7a–c (R₁₀=Nvoc, Fmoc, Teoc), wurden durch Palladium-vermittelte Esterabspaltung der geeigneten Allylester hergestellt. Die Ester wurden wiederum mittels Swern-Oxidation (Oxidation des primären Alkohols zu einem Aldehyd, der den spontanen B-Ringschluss provoziert) der Nvoc-, Fmoc- und Teoc-geschützten Aminoalkohole hergestellt. Die Carbamat-geschützten Aminoalkohole wurden durch Behandeln des herkömmlichen Aminoalkoholzwischenprodukts 4 mit dem geeigneten Chlorformiat in Gegenwart von Pyridin hergestellt. Der Aminoalkohol wurde durch Reduktion der Nitroverbindung 3 erhalten, die wiederum durch Binden von Pyrrolidinmethanol an die o-Nitrobenzoesäure 2 zusammengesetzt wurde. Verbindung 2 wurde durch selektive Veresterung der Disäure 1 an der aliphatischen Säure hergestellt. Schließlich wurde die Disäure durch gleichzeitige Nitrierung und Oxidation des bekannten Hydroxypropyloxy-Vanillinsäurederivats 0 erhalten.
Die Troc-geschützte Verbindung 7d wurde durch eine alternative Synthesestrategie, die den Einsatz von Acetalen umfasst, hergestellt. Der ringgeschlossene Allylester 6d wurde durch Demaskierung des Acetat-geschützten Aldehyds in Gegenwart von Troc-geschütztem Amin hergestellt. Das Troc-geschützte Amin wurde durch Aussetzen des freien Amins 9 gegenüber Troc-C1 in Gegenwart von Pyridin erhalten. Die Reduktion mit Zinnchlorid ergab das Amin 9 aus dem Nitroacetal 8, das wiederum durch Binden von 2 an das geeignete Acetat-geschützte Prolinal erhalten wurde.
Allylaminoalkohol-Zwischenprodukt (4)
3-(4-Carboxy-2-methoxy-5-nitrophenoxy)propansäure (1)
Der Alkohol 0 (50 g, 0,22 mol) wurde über einen Zeitraum von 1 h portionsweise zu Salpetersäure (70%, 400 ml), die auf 0°C abgekühlt wurde, zugesetzt. Nach beendeter Zugabe wurde die Lösung 1 h lang bei 0°C gerührt und anschließend auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen. Der gebildete halbfeste Stoff wurde abfiltriert und mit einer minimalen Menge Eis/Wasser gewaschen. Der resultierende blassgelbe Feststoff wurde in EtOAc wieder gelöst, die Lösung getrocknet (MgSO₄) und anschließend eingeengt, was die Disäure 1 (31 g, 49%) ergab.
¹H-NMR (270 MHZ): δ 2.83-2.79 (t, J = 6, 12.5 HZ, 2H), 3.94 (s, 3H), 4.37-4.33 (t, J = 6, 12.5 MHZ, 2H), 7.18 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 10.38 (br.s, 2H).
2-Propen-3-(4-carboxy-2-methoxy-5-nitrophenoxy)propanoat (2)
Ein Gemisch aus 3-(4-Carboxy-2-methoxy-5-nitrophenoxy)propansäure 1 (20 g, 74,3 mmol) und p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (2,3 g, 7,4 mmol) in Allylalkohol (240 ml, 3,5 mol) wurde 7 h lang unter Rückfluss erhitzt und anschließend abkühlen gelassen. Der Allylalkohol wurde dann im Vakuum entfernt und der Rückstand mit verdünnter HCl-Säure (3 × 75 ml) trituriert und abfiltriert. Dieser Feststoff wurde in EtOAc aufgenommen und die resultierende Lösung mit Wasser (3 × 50 ml) und Kochsalzlösung (3 × 50 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Einengen im Vakuum ergab 2 als einen weißen Feststoff (19,27 g, 84%): Fp 128–130°C; ¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃) δ 2.92 (t, 2H, J = 6.35 Hz); 3.94 (s, 3H); 4.38 (t, 2H, J = 6.41 Hz); 4.65 (d, 2H, J = 5.61 Hz); 5.27 (dd, 1H, J₁ = 1.28 Hz, J₂= 19.42 Hz); 5.33 (dd, 1H, J₁= 1.28 Hz, J₂ = 17.04 Hz); 5.92 (m, 1H); 7.15 (s, 1H); 7.45 (s, 1H); ¹³C-NMR (67.8 MHZ, CDCl₃): δ 34.1, 56.5, 65.0, 65.4, 108.5, 111.3, 118.3, 122.9, 131.8, 141.1, 149.1, 152.6, 167.1, 170.0; IR (Nujol); ν 1730, 1630, 1550, 1430, 1390, 1290, 1230, 1190, 1170, 1070, 1030, 1010 cm^–1; MS (EI) m/z (relative Intensität): 325 (M⁺, 19), 251 (3), 213 (2), 196 (3), 211 (3), 113 (19), 91 (4), 71 (9), 55 (6); HRMS: ber, für C₁₄H₁₅NO₈ 325.0798, gef. 232.0773.
2-Propen-3-(4-[2'-hydroxymethylpyrrolidincarboxy]-2-methoxy-5-nitrophenoxy)propanoat (3)
Oxalylchlorid (2,7 ml, 31,0 mmol) wurde zu einer Suspension der Nitrosäure 2 (9 g, 28,0 mmol) und DMF (0,05 ml) in CH₂Cl₂ (150 ml) zugesetzt, gefolgt von 16-stündigem Rühren bei Raumtemperatur. Die resultierende Lösung wurde zu einer gerührten Lösung von Pyrrolidinmethanol (3 ml, 31,0 mmol) und Triethylamin (8,5 ml, 61,0 mmol) in CH₂Cl₂ (80 ml) bei –20°C (flüssiger N₂/Aceton) zugetropft, gefolgt von 16-stündigem Rühren bei Raumtemperatur unter N₂. Nach Quenchen mit wässriger HCl (1,0 N, 50 ml) wurde die abgetrennte organische Phase mit H₂O (3 × 25 ml) und Kochsalzlösung (3 × 10 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, was ein orangefarbenes Rohöl ergab. Die Reinigung mittels Flashsäulenchromatographie (5% MeOH/EtOAc) ergab 3 als blassgelbes Öl (7,9 g, 70%):
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃): δ 2.22-1.71 (m, 6H); 2.94 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 3.15 (d × d, J = 6.5 Hz, 2H); 3.92-3.76 (m, 1H); 3.96 (s, 3H); 4.4 (t, J = 6.2 Hz, 2H); 4.67-4.64 (m, 2H); 5.39-5.23 (m, 2H); 6.0-5.86 (m, 1H); 6.81 (s, 1H); 7.75 (s, 1H); ¹³C-NMR (67.8 MHz, CDCl₃): δ 24.4, 28.5, 34.1, 49.5, 56.7, 61.6, 64.9, 65.6, 108.9, 109.3, 118.6, 128.2, 131.8, 148.2, 154.9, 170.1; IR (Film): ν 3394, 2947, 2882, 1735, 1689, 1618, 1577, 1521, 1454, 1431, 1386, 1334, 1276, 1221, 1178, 1059, 1002 cm^–1; MS (EI) M/Z (relative Intensität): 408 (M⁺, 1), 390 (4), 377 (20), 308 (86), 296 (3), 278 (9), 265 (35), 252 (3), 118 (74), 111 (3), 108 (8), 98(4), 83 (14). HRMS: ber. für C₁₉H₂₅O₆N₂ 377.416, gef. 377.1711
2-Propen-3-(5-amino-4-[2'-hydroxymethylpyrrolidincarboxy]-2-methoxyphenoxy)propanoat (4)
SnCl₂·2H₂O in fester Form (21,3 g, 0,095 mol) wurde zu einer gerührten Lösung des Nitroalkohols 3 (7,7 g, 0,02 mol) in MeOH (100 ml) zugesetzt und das Gemisch 45 min unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wurde anschließend im Vakuum abgedampft und das restliche Öl zwischen EtOAc (50 ml) und wässrigem gesättigtem NaHCO₃ (50 ml) aufgetrennt, gefolgt von starkem 16-stündigem starkem Rühren zur Unterstützung der Auftrennung. Die vereinigten Phasen wurden durch Celite filtriert und mit EtOAc (25 ml) gewaschen. Die Phasen wurden abgetrennt, und die resultierende organische Phase wurde mit H₂O (3 × 25 ml) und Kochsalzlösung (3 × 10 ml) gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Einengen im Vakuum ergab das Amin 4 als dunkelorangefarbenes Öl (5,6 g, 78%):
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃) δ 2.17-1.65 (m, 6H); 2.9 (t, J = 6.6 Hz, 2H); 3.72-3.46 (m, 3H); 3.75 (s, 3H); 4.2 (t, J 6.8 Hz, 2H); 4.4 (br. d × d, J = 9.7 Hz, 2H); 4.65-4.62 (m, 2H); 5.37-5.22 (m, 2H); 6.0-5.85 (m, 1H); 6.3 (s, 1H); 6.76 (s, 1H). ¹³C-NMR (67.8 MHZ, CDCl₃): δ 24.9, 28.7, 34.3, 57.3, 61.2, 64.2, 65.5, 67.4, 102.6, 113.5, 118.5, 131.9, 141.1, 150.9, 170.5. IR (Film): ν 3354, 2940, 2880, 1734, 1621, 1589, 1514, 1453, 1429, 1407, 1265, 1230, 1173, 1110, 1023. MS(EI) M/Z (relative Intensität): 378 (M⁺, 60), 278 (100), 266 (5), 252 (9), 238 (3), 220 (4), 206 (6), 194 (4), 178 (3), 166 (40), 150 (5), 137 (20), 123 (4), 113 (4), 107 (4), 100 (8), 94 (12), 64 (9). HRMS: ber. für C₁₉H₂₅O₆N₂ 378.424, gef. 378.1760.
Beispiel 1(a): Nvoc-PBD-Säure (7a)
Nvoc-Chlorformiat
4,5-Dimethoxynitrobenzylalkohol (2 g, 9,4 mmol) und Triphosgen (0,93 g, 3,13 mmol) wurden in CH₂Cl₂ (50 ml) gelöst und die resultierende rote Suspension stark gerührt und auf 0°C abgekühlt. Pyridin (260 μl, 3,13 mmol) wurde zugetropft und die resultierende grüne Lösung 16 h lang bei Raumtemperatur gerührt, was eine Lösung des Chlorformiats ergab, die im nächsten Schritt direkt eingesetzt wurde.
Allyl-Nvoc-Alkohol (5a)
Eine Lösung frisch hergestelltes (siehe oben) Nvoc-Chlorformiat (9,4 mmol) und Pyridin (1,3 ml, 9,5 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung des Aminoalkohols 4 (3 g, 7,9 mmol) in CH₂Cl₂ (60 ml) bei 0°C zugetropft. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und 3 weitere Stunden gerührt. Einengen im Vakuum ergab ein Öl, das in CH₂Cl₂ (50 ml) wiederaufgelöst wurde. Die resultierende Lösung wurde mit HCl (1,0 N, 3 × 25 ml), H₂O (3 × 25 ml) und Kochsalzlösung (3 × 10 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, was einen dunkelgelben Schaum ergab. Dieser wurde mittels Flashsäulenchromatographie (EtOAc) gereinigt, um das Carbamat 5a als blassgelben Schaum (3,7 g, 76%) zu ergeben: ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): δ 1.6-2.2 (m, 6H); 2.9 (t, J = 6.2, 2H); 3.4-3.9 (m, 3H); 3.81 (s, 3H); 3.97 und 4.01 (2 × s, 6H); 4.3 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 4.63 (d, J = 5.9 Hz, 2H); 5.22-5.36 (m, 2H); 5.5-5.67 (m, 2H); 5.85-6.0 (m, 1H); 6.84 (s, 1H); 7.09 (s, 1H); 7.74 (s, 1H); 8.93 (br. s, 1H). ¹³C-NMR (67.8 MHz, CDCl₃): δ 25.1, 28.3, 34.3, 51.5, 56.4, 56.6, 56.8, 61.0, 63.8, 64.4, 65.4, 66.4, 106.3, 108.2, 110.0, 111.9, 118.5, 127.8, 131.5, 131.9, 139.6, 144.4, 148.1, 150.3, 153.2, 153.7, 170.3, 170.7. IR (Reflexion): ν 3329, 3110, 2937, 1728, 1581, 1523, 1453, 1323, 1270, 1175, 1129, 1070, 1031, 1011. MS (FAB) M/Z (relative Intensität): 618 (M⁺ + 1 (3)), 473 (2), 439 (1), 405 (1), 378 (3), 304 (7), 278 (16), 196 (100), 166 (28), 151 (15), 102 (27), 70 (9).
Allyl-Nvoc-PBD (6a)
Eine Lösung von DMSO (1,45 ml, 0,02 mol) in CH₂Cl₂ (40 ml) wurde über einen Zeitraum von 45 min zu einer gerührten Lösung von Oxalylchlorid (5,1 ml, 0,01 mol) in CH₂Cl₂ (20 ml), die auf –40°C abgekühlt war (flüssiger N₂/Chlorbenzol), zugesetzt. Es wurde weitere 15 min bei –40°C gerührt und dann eine Lösung des NVOC-Alkohols 5a (3,5 g, 5,7 mmol) in CH₂Cl₂ (45 ml) über einen Zeitraum von 1 h zugetropft. Es wurde weitere 45 min bei –40°C gerührt, und dann wurde eine Lösung von Et₃N (3,4 ml, 0,024 mol) in CH₂Cl₂ (20 ml) über einen Zeitraum von 30 min zugetropft und 1 weitere h gerührt. Das Gemisch wurde anschließend auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen, bevor es mit CH₂Cl₂ (20 ml) verdünnt wurde. Die organische Phase wurde mit HCl (1,0 N) (3 × 50 ml), H₂O (3 × 50 ml) und Kochsalzlösung (3 × 25 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend im Vakuum abgedampft, was einen gelben Schaum ergab. Dieser wurde mittels Flashsäulenchromatographie (1% MeOH/CHCl₃) gereinigt, was 6a als blassgelben Schaum (3,2 g, 91%) ergab:
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃): δ 1.9-2.2 (m, 6H); 2.86 (t, J = 6.9 Hz, 2H); 3.45-3.6 (m, 3H); 3.81 (s, 3H); 3.88 und 3.91 (2 × s, 6H); 4.2-4.4 (m, 3H); 4.61 (m, 2H); 5.19-5.35 (m, 2H); 5.49 (s, 2H); 5.7 (br d, J = 9.9 Hz, 1H); 5.82-5.97 (m, 1H); 6.51 (s, 1H); 6.86 (s, 1H); 7.25 (s, 1H); 7.66 (s, 1H); ¹³C-NMR (67.8 MHZ, CDCl₃): δ 23.1, 28.7, 30.6, 34.1, 46.5, 56.2, 60.1, 64.6, 65.3, 65.5, 86.1, 107.9, 109.2, 110.8, 114.3, 118.4, 126.7, 127.0, 128.1, 131.8, 138.9, 147.9, 148.9, 149.9, 153.8, 155.4, 166.8, 170.3. IR (Reflexion): ν 3329, 3084, 2940, 1713, 1633, 1519, 1454, 1276, 1105, 1067. MS (EI) M/Z (relative Intensität) 615 (M⁺, 12), 503 (100), 358 (4), 261 (3), 246 (37), 231 (4), 196 (32), 180 (24), 166 (4), 150 (4), 136 (6), 70 (31).
Säure-Nvoc-PBD (7a)
Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0,583 g, 0,504 mmol) und Morpholin (4,4 ml, 50,4 mmol) wurden zu einer Lösung des Allylcarbinolamins 6a (3,1 g, 5,04 mmol) in THF (30 ml) zugesetzt und das Gemisch 16 h lang gerührt. Nach Einengen im Vakuum wurde das resultierende Öl in CH₂Cl₂ wiederaufgelöst und die Lösung mit HCl (1,0 N) (3 × 25 ml), H₂O (3 × 25 ml) und Kochsalzlösung (3 × 10 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum eingeengt, was einen orangefarbenen Schaum ergab. Dieser wurde mittels Flashsäulenchromatographie (1% MeOH/CHCl₃) gereinigt, was 7a als blassgelben Schaum (2,25 g, 78%) ergab:
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃): δ 1.9-2.3 (m, 4H); 2.85 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 3.4-3.6 (m, 3H); 3.68 (s, 3H); 3.87 und 3.9 (2 × s, 6H); 4.2-4.4 (m, 3H); 5.4-5.48 (m, 2H); 5.7 (br d, J = 9.9 Hz, 1H); 6.5 (s, 1H); 6.89 (s, 1H); 7.26 (s, 1H); 7.64 (s, 1H); ¹³C-NMR (67.8 MHZ, CDCl₃): δ 23.0, 28.5, 33.9, 46.6, 56.2, 60.4, 64.6, 65.4, 86.1, 107.9, 109.3, 110.8, 114.7, 126.5, 126.9, 128.2, 138.9, 147.9, 148.9, 149.9, 153.8, 155.5, 167.1, 174.5. IR (Reflexion): ν 2939, 2252, 1712, 1599, 1522, 1459, 1277, 1221, 1137, 1105, 1066, MS (FAB) M/Z (relative Intensität): 576 (M⁺ + 1, 15), 514 (3), 381 (3), 363 (3), 336 (3), 319 (9), 303 (2), 293 (3), 289 (2), 279 (4), 266 (6), 264 (14), 253 (3), 245 (4), 238 (10), 215 (4), 206 (4), 196 (100), 192 (16), 180 (23), 166 (32), 151 (18), 136 (10), 123 (7), 117 (14), 93 (28), 73 (15), 70 (20).
Beispiel 1(b): Fmoc-PBD-Säure (7b)
Allyl-Fmoc-Alkohol (5b)
9-Fluorenylmethylchlorformiat (5,65 g, 0,022 mol) wurde portionsweise zu einer gerührten Lösung des Aminoalkohols 4 (7,5 g, 0,02 mol) und Na₂CO₃ (5,26 g, 0,05 mol) in einem Gemisch aus THF (150 ml) und Wasser H₂O (150 ml) bei 0°C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, weitere 2 h gerührt und anschließend mit EtOAc (3 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit H₂O (3 × 50 ml) und Kochsalzlösung (3 × 25 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, was ein dunkelrotes Öl ergab. Dieses wurde mittels Flashsäulenchromatographie (Petrolether 40-60/EtOAc, 1:1) gereinigt, was 5b als blassgelbes Öl (8,11 g, 68%) ergab: ¹H-(270 MHZ, CDCl₃): δ 1.72-2.18 (m, 6H); 2.9 (t, J = 6.4, 2H); 3.43-3.91 (m, 3H); 3.81 (s, 3H); 4.25-4.54 (m, 5H); 4.61-4.65 (m, 2H); 5.21-5.37 (m, 2H); 5.85-6.0 (m, 1H); 6.85 (s, 1H); 7.31-7.79 (m, 9H); 8.77 (br s, 1H); ¹³C-NMR (67.8 MHZ, CDCl₃): δ 25.1, 28.4, 35.3, 47.0, 56.7, 60.9, 64.3, 65.4, 66.3, 67.1, 106.4, 111.7, 118.3, 120.0, 125.2, 127.1, 127.2, 127.8, 131.5, 131.9, 141.3, 143.7, 144.4, 150.2, 153.8, 170.3; MS (FAB): 601 (M⁺ + 1); HRMS: ber. für C₃₄H₃₅N₂O₈ 600.667, gef. 600.2175. IR (:Film): ν 3315, 2952, 1727, 1597, 1522, 1452, 1392, 1322, 1174, 1117, 1017.
Zyklisiertes Fmoc-Allyl-Carbinolamin (6b)
Eine Lösung von DMSO (3,4 ml, 0,048 mol) in CH₂Cl₂ (100 ml) wurde über einen Zeitraum von 45 min zu einer gerührten Lösung von Oxalylchlorid (12 ml, 0,024 mol) in CH₂Cl₂ (50 ml) bei –40°C (flüssiger N₂/Chlorbenzol) zugetropft. Das Gemisch wurde weitere 15 min bei –40°C gerührt, und anschließend wurde über einen Zeitraum von 1 h eine Lösung des FMOC-Alkohols 5b (8 g, 0,013 mol) in CH₂Cl₂ (135 ml) zugesetzt. Nach weiterem 45-minütigem Rühren bei –40°C wurde eine Lösung von DIPEA (10 ml, 0,057 mol) in CH₂Cl₂ (55 ml) über einen Zeitraum von 30 min zugesetzt und eine weitere Stunde gerührt. Die Lösung wurde anschließend auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen, mit CH₂Cl₂ (100 ml) verdünnt und die organische Phase mit HCl (1,0 N) (3 × 50 ml), H₂O (3 × 50 ml) und Kochsalzlösung (3 × 25 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, was 6b als blasscremefarbenen Schaum (6,4 g, 80%) ergab:
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃): δ 1.99-2.1 (m, 4H); 2.83-2.87 (m, 2H); 3.51-3.6 (m, 2H); 3.6-3.8 (m, 1H); 3.95 (s, 3H); 4.0-4.58 (m, 7H); 5.17-5.31 (m, 2H); 5.68 (d, J = 9.7 Hz, 1H); 5.84-5.87 (m, 1H); 6.75 (s, 1H); 7.02-7.75 (m, 9H); ¹³C-NMR (67.8 MHZ, CDCl₃) δ 23.0, 28.7, 34.2, 46.5, 53.5, 56.2, 59.5, 60.1, 64.4, 65.4, 68.4, 86.0, 111.2, 114.7, 118.4, 119.9, 124.9, 125.4, 126.8, 127.1, 127.8, 128.3, 131.8, 131.9, 141.1, 141.2, 143.1, 143.5, 148.9, 149.9, 156.1, 166.9, 170.3; MS (FAB) 599 (M⁺ + 1). IR (Reflexion): ν 3318, 2950, 1713, 1603, 1517, 1386, 1290, 1177, 1037.
Fmoc-Säure-Carbinolamin (7b)
Phenylsilan (2,5 ml, 0,02 mol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0,232 g, 0,2 mmol) wurden zu einer Lösung des FMOC-Carbinolamins 6b (6 g, 0,01 mol) in CH₂Cl₂ (80 ml) zugesetzt, gefolgt von 16-stündigem Rühren bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde mit H₂O (50 ml) gequencht und mit CH₂Cl₂ (3 × 30 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit Wasser (3 × 30 ml), Kochsalzlösung (3 × 25 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, was einen dunkelbraunen Schaum ergab. Dieser wurde mittels Flashsäulenchromatographie (MeOH/CHCl₃, 1:99) gereinigt, was 7b als blassbeigefarbenen Schaum (4,3 g, 77%) ergab:
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃): δ 1.9-2.2 (m, 4H); 2.65-2.85 (m, 2H); 3.4-3.6 (m, 2H); 3.6-3.8 (m, 1H); 3.91 (s, 3H); 4.0-4.25 (m, 4H); 4.45-4.5 (m, 1H); 5.68 (d, J = 9.5 Hz, 1H); 6.75 (s, 1H); 6.9-7.7 (m, 9H); ¹³C-NMR (67.8 MHZ, CDCl₃) δ 23.0, 28.6, 33.9, 46.5, 56.2, 60.3, 64.6, 68.5, 86.0, 111.2, 115.2, 119.8, 124.9, 126.8, 127.1, 127.7, 128.2, 140.9, 141.1, 142.9,143.4, 149.1, 149.9, 156.3, 167.0, 174.6. IR (Reflexion); ν 3316, 2955, 2609, 2249, 1713, 1601, 1514, 1453, 1279, 1036. MS (FAB) M/Z (relative Intensität) 560 (M⁺ + 1).
Beispiel 1(c): Teoc-PBD-Säure (7c)
Allyl-Teoc-Alkohol (5c)
Pyridin (0,165 ml, 2,04 mmol) wurde zu einer Lösung von Triphosgen (0,605 g, 2,04 mmol) und 2-Trimethylsilylethanol (1,082 g, 9,15 mol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (100 ml) zugetropft und das Gemisch 16 h bei Raumtemperatur rühren gelassen. Diese Lösung wurde zu einer gerührten Lösung des Aminoalkohols 4 (2,30 g, 6,10 mmol) und Pyridin (0,987 ml, 0,0122 mol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (50 ml) bei 0°C (Eisbad) unter Stickstoffatmosphäre zugetropft. Nach wie mittels DC (Petrolether/Ethylacetat, 1:1) angezeigter vollständig abgelaufener Reaktion wurde das Gemisch mit Kupfer(II)-sulfat (2 × 100 ml) und Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt, was ein braunes Öl ergab. Dieses wurde mittels Flashsäulenchromatographie (Chloroform/Methanol, 99:1) gereinigt, was 5c als einen braunen Feststoff (2,5 g, 78%) ergab:
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): δ -0.06 (s, 9H), 1.01 (m, 2H), 1.82-2.30 (m, 4H), 2.86 (m, 2H), 3.40-3.75 (m, 7H), 4.15-4.31 (m, 4H), 4.6 (m, 2H), 5.15-5.31 (m, 2H), 5.80-5.94 (m, 1H), 6.76 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 8.52 (s, 1H); ¹³C-NMR (67.8 MHz, CDCl₃) δ -1.47, 17.7, 25.1, 28.4, 34.3, 51.6, 56.8, 61.2, 63.5, 64.3, 65.4, 66.8, 106.2, 112.1, 113.8, 118.3, 132.0, 132.2, 144.0, 154.1, 170.3; MS (EI): 522 (M⁺, 12.8), 435 (7), 350 (13), 319 (77), 262 (27), 206 (13), 149 (88), 83 (32), 70 (100); HRMS: ber. für 522.2397, gef. 522.2351.
Allyl-Teoc-Carbinolamin-PBD (6c)
Eine Lösung von DMSO (1,02 ml, 0,014 mol) in trockenem CH₂Cl₂ (30 ml) wurde zu einer Lösung von Oxalylchlorid (3,59 ml, 7,185 mmol) in CH₂Cl₂ (25 ml) bei –43°C (Chlorbenzol/flüssiger N₂) unter Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Nach 45-minütigem Rühren bei –43°C wurde eine Lösung des TEOC-Alkohols 5c (2,50 g, 4,79 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (30 ml) zum Reaktionsgemisch zugetropft und weitere 45 min bei –43°C gerührt. Eine Lösung von Triethylamin (3,34 ml, 0,024 mol) in trockenem DCM (25 ml) wurde anschließend zugetropft und das Gefäß auf 0°C aufwärmen gelassen.
Das Reaktionsgemisch wurde mit CH₂Cl₂ (150 ml) verdünnt, mit 1 N HCl (100 ml), Wasser (100 ml) und Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und anschließend im Vakuum eingeengt, was das rohe 6c ergab. Dieses wurde mittels Flashsäulenchromatographie (Kieselgel, Chloroform) gereinigt, was 6c als gelbes Öl (1,72 g, 69%) ergab: ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): δ -0.08 (s, 9H), 0.92 (m, 2H), 2.04-2.33 (m, 4H), 3.14 (m, 2H), 3.50-3.75 (m, 4H), 3.93 (s, 3H), 4.00-4.40 (m, 4H), 4.67 (m, 2H), 5.26-5.40 (m, 2H), 5.65 (d, 1H, J = 9.52 Hz), 5.89-5.99 (m, 1H), 6.72 (bs, 1H), 7.23 (s, 1H); ¹³C-NMR (67.8 MHz, CDCl₃) δ -1.47, 17.6, 23.0, 28.7, 34.2, 46.4, 56.2, 59.9, 64.3, 65.4, 65.5, 85.9, 111.0, 114.7, 118.3, 126.4, 131.8, 132.0, 148.7, 149.7, 154.2, 170.0, 170.4; MS (FAB): 629 (0.8), 593 (0.91), 536 (1.5), 493 (4.6), 465 (1.0), 449 (1.7), 431 (6.8), 394 (8.1), 368 (1.3), 338 (1.5), 304 (5.8), 264 (3.6), 238 (2.2), 204 (1.6), 192 (9.1), 166 (2.5), 149 (6.8), 98 (4.3), 73 (100).
Säure-Teoc-PBD-Carbinolamin (7c)
Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (190 mg, 0,165 mmol) wurde zu einer Lösung des Teoc-geschützten Carbinolamins 6c (1,72 g, 3,30 mmol) in Ethanol (50 ml) zugesetzt und das Gemisch 60 min unter Rückfluss erhitzt, wonach die DC (AcOH/MeOH/Chloroform, 1:10:100) anzeigte, dass die Reaktion vollständig abgelaufen war. Das Reaktionsgemisch wurde abkühlen gelassen und anschließend durch Celite filtriert. Abdampfung des Lösungsmittels im Vakuum ergab 7c als gelben Feststoff (1,08 g, 68%):
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): δ -0.06 (s, 9H), 0.86 (m, 2H), 1.98-2.20 (m, 4H), 2.8-3.0 (m, 2H), 3.40-3.70 (m, 3H), 3.75 (s, 3H), 4.00-4.40 (m, 2H), 5.65 (d, J = 8.63 Hz, 1H), 6.78 (bs, 1H), 7.21 (s, 1H): ¹³C-NMR (67.8 MHz, CDCl₃) δ, -1.5, 18.3, 23.1, 28.7, 34.5, 46.4, 56.1, 58.4, 64.8, 64.9, 85.9, 110.8, 115.0, 126.3, 128.7, 148.6, 149.6, 167.2.
Beispiel 1(d): Synthese der Troc-PBD-Säure 7d
Prop-2-enyl-4-(N-2S-diethylthiomethylpyrrolidincarboxy)-2-methoxy-5-nitrophenyl)propanoat (8)
2-Propen-3-(4-carboxy-2-methoxy-5-nitrophenyloxy)propanoat 2 (5 g, 15,34 mmol), Oxalylchlorid (2 ml, 23 mmol) und 5 Tropfen DMF wurden in trockenem THF (100 ml) 18 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde anschließend im Vakuum abgedampft und der Rückstand in trockenem THF (50 ml) gelöst. Dies wurde zu einem stark gerührten Gemisch aus (2S)-Pyrrolidin-2-carboxaldehyddiethylthioacetal (3,15 g, 15,34 mmol) und Triethylamin (1,86 g, 18,41 mmol) zugetropft. Es wurde 18 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde anschließend im Vakuum abgedampft und das Produkt mittels Flashsäulenchromatographie (Ethylacetat) gereinigt, was 8 (7,48 g, 95%) als gelbes Öl ergab. ¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃): δ 7.74 (s, 1H, OCCHC), 6.83 (s, 1H, MeOCCHC), 5.98-5.86 (m, 1H, CH₂CHCH₂, 5.33 (d, 1H, J = 26.56 Hz, OCH₂CHCH₂), 5.28 (d, 1H, J = 20.24 Hz, OCH₂CHCH₂), 4.88 (d, 1H, J = 3.85 Hz, NCHCH), 4.74-4.65 (m, 2H, OCH₂CHCH₂) 4.42 (t, 2H, J = 7.69 Hz, CH₂CH₂OC), 3.94 (s, 3H, OCH₃), 3.29-3.21 (m, 2H, NCH₂), 2.96 (p, 2H, J = 3.12 Hz, CH₂CH₂O), 2.87-2.67 (m, 4H, SCH₂CH₃), 2.32-1.78 (m, 4H, NCH₂CH₂CH₂) 1.38-1.31 (m, 6H, SCH₂CH₃). ¹³C-NMR (CDCl₃): δ 15.00, 15.13 (SCH₂CH₃), 24.63 (NCH₂CH₂CH₂), 26.28, 26.59, 27.22 (NCH₂CH₂CH₂), 34.13 (CH₂CH₂O), 50.19 (NCH₂), 52.80 (NCHCH), 56.60 (OCH₃), 61.08 (NCH), 65.13 (CH₂CH₂O), 65.64 (OCH₂CHCH₂), 108.70 (arom. CH), 109.47 (arom. CH), 118.55 (OCH₂CHCH₂), 128.58 (CCON), 131.73 (OCH₂CHCH₂), 137.17 (CNO₂), 147.98 (CH₂CH₂OC), 154.57 (COCH₃), 166.61 (CON), 170.14 (COO). IR (Nujol) ν = 3550-2720, 3000, 2630, 2200, 1740, 1640, 1580, 1530, 1340, 1280, 1220, 1180, 1050 cm^–1. MS (EI): m/e (relative Intensität): 527 (M⁺, 1), 377 (10), 310 (12), 309 (72), 308 (94), 268 (20), 142 (4). HRMS ber. für C₂₄H₃₅O₇N₂S₂ = 527.1875, gef. = 527.1885.
5-Amino-3-(4-(2-diethylthiomethyl-(2S)-perhydro-1-pyrroloylcarbonyl)-2-methoxyphenyloxy)-2-propenylpropanoat (9)
Eine Lösung von 8 (7,21 g, 14,05 mmol) und Zinn(II)-chlorid (15,85 g, 76 mmol) wurde 40 min in Ethylacetat (100 ml) unter Rückfluss erhitzt und anschließend abkühlen gelassen. Das Lösungsmittel wurde dann im Vakuum abgedampft und der Rückstand mit gesättigter Bicarbonatlösung bei 0°C trituriert. EtOAc (50 ml) wurde zugesetzt und die Reaktion über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend durch Celite filtriert und der Filterkuchen mit Ethylacetat gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden anschließend mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
Das Produkt wurde mittels Flashsäulenchromatographie (5% MeOH/Dichlormethan) gereinigt, was ein gelbes Öl (5,87 g, 86%) ergab.
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃): δ 6.82 (s, 1H, arom. CH), 6.28 (s, 1H, arom.CH), 5.99-5.85 (m, 1H, OCH₂CHCH₂), 5.31 (dd, 1H, J = 1.28 Hz, 27.66 Hz, OCH₂CHCH₂), 5.26 (dd, 1H, J = 1.28 Hz, 20.70 Hz, OCH₂CHCH₂), 4.71-4.62 (m, 5H, einschließlich Dublett bei 4.62, 2H, J = 5.49 Hz, NH₂ + NCHCH, OCH₂CHCH₂), 4.27 (t, 2H, J = 6.59 Hz, CH₂CH₂O), 3.92, (m, 1H, NCH), 3.74 (s, 3H, OCH₃), 3.66-3.57 (m, 2H, NCH₂) 2.89 (t, 2H, J = 6.6 Hz, CH₂CH₂O), 2.83-2.64 (m, 4H, SCH₂CH₃), 2.28-1.80 (m, 4H, NCH₂CH₂CH₂), 1.25 (m, 6H, SCH₂CH₃);¹³C-NMR (CDCl₃) δ 14.20 (SCH₂CH₃), 26.55, 27.23 (NCH₂CH₂CH₂), 34.27 (CH₂CH₂O), 53.20 (NCHCH), 56.08 (OCH₃), 60.10 (NCH), 60.39 (NCH₂), 64.20 (CH₂CH₂O), 64.41 (OCH₂CHCH₂), 102.26 (arom. CH), 113.71 (arom. CH), 118.40 (OCH₂CHCH₂), 131.93 (OCH₂CHCH₃), 141.03 (CNH₂), 141.74 (CH₂CH₂OC), 154.56 (COCH₃), 169.69 (CON), 170.53 (COO). IR (unverdünnter flüssiger Film) 3500-3000, 3460, 3400, 2970, 1740, 1650, 1535, 1470, 1345, 1290, 1225, 1190 cm^–1; MS (EI): m/e (relative Intensität): 482 (M⁺, 4), 347 (2), 278 (31), 137 (1), 70 (3); HRMS ber. für C₂₃H₃₄O₅N₂S₂ = 482.1909, gef. = 482.1925.
3-(4-(2-Diethylthiomethyl-(2S)-perhydro-1-pyrrolylcarbonyl)-2-methoxy-5-(2,2,2-trichlorethyloxycarbonylamino)phenyloxy)-2-propenylpropanoat (10)
Zu einer Lösung von 9 (5,67 g, 11,74 mmol) in Dichlormethan (200 ml) wurde Pyridin (2,02 ml, 23,48 mmol) zugesetzt. Dazu wurde bei 0°C eine Lösung von Trichlorethylchlorformiat (1,616 ml, 11,74 mmol) zugetropft. Die Lösung wurde eine weitere Stunde bei 0°C gerührt. Die organischen Phasen wurden mit 1 N HCl (3 × 100 ml), Wasser (3 × 100 ml), Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, was ein braunes Öl (6,8 g, 88%) ergab.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): δ 9.14 (bs, 1H, NH), 7.88 (bs, 1H, CHCNH), 6.93 (s, 1H, MeOCCHC), 5.99-5.86 (m, 1H, OCH₂CHCH₂), 5.31 (dt, 1H, J = 1.47 Hz, 27.84 Hz OCH₂CHCH₂), 5.25 (dt, 1H, J = 1.29 Hz, 21.61 Hz, CH₂CHCH₂)‚ 4.89-4.77 (m, 4H, einschließlich Dublett 1H, J = 1.28 Hz, CHCHSEt, NH, CH₂-TrOC), 4.62 (d, 2H, J = 1.28 Hz, OCH₂CHCH₂), 3.81 (s, 3H, OCH₃), 3.60 (m, 2H, NCH₂), 2.91 (d, 2H, J = 6.42 Hz, CH₂CH₂O), 2.84-2.61 (m, 4H, SCH₂CH₃), 1.37-1.23 (m, 6H, SCH₂CH₃); ¹³C-NMR (CDCl₃): δ 170.33 (Ester-CO), 168.50 (CON), 151.94 (OCO), 150.29 (COCH₃), 144.52 (COCH₂CH₂), 131.93 (OCH₂CHCH₂), 131.35 (CNH), 118.29 (OCH₂CHCH₂), 112.21 (arom. CH), 105.51 (arom. CH), 95.27 (CCl₃), 76.24 (CH₂TrOC), 74.39 (CH₂TrOC), 65.42 (CH₂CH₂O), 61.14 (NCH), 56.30 (OCH₃), 53.00 (NCHCHSEt), 34.27 (CH₂CH₂O), 27.30, 26.71, 26.43, 25.24 (NCH₂CH₂CH₂), 15.27, 14.87, 14.18 (SCH₂CH₃). MS (EI): m/e (relative Intensität): 658, 656 (M⁺, 1), 508 (1), 373 (6), 305 (5), 304 (27), 192 (5), 70 (12).
3-(11-Hydroxy-5-oxo-10-(2,2,2-trichlorethyloxocarbonylamino)-(11aS)-2,3,5,10,11,11a-hexahydro-1H-benzo[e]pyrrolo[2,1-a][1,4]diazepin-8-yloxy-2-propenylpropanoat (6d)
Eine Lösung von 10 (6,8 g, 10,34 mmol) in Acetonitril/Wasser (4:1, 200 ml) wurde mit Calciumcarbonat (2,585 g, 25,85 mmol) und Quecksilber(II)-chlorid (7,00 g, 25,85 mmol) behandelt und die Lösung 18 h lang gerührt. Die Reaktion wurde anschließend durch Celite filtriert und das Filterkissen mit Ethylacetat gewaschen. Die organischen Phasen wurden vereinigt und mit Wasser (3 × 50 ml) und Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft und das resultierende Produkt mittels Flashsäulenchromatographie (Ethylacetat) gereinigt, was das Produkt als gelbes Öl (3,67 g, 64%) ergab. ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): δ 7.25 (arom. CH), 6.86 (s, 1H, arom. CH), 6.00-5.85 (m, 1H, CH₂CHCH₂), 5.67 (d, 1H, J = 9.71 Hz, TrOC-CH₂) 5.37-5.20 (m, 3H, TrOC-CH₂ + OCH₂CHCH₂), 4.65 (d, 2H, J = 5.67 Hz, CH₂CHCH₂O), 4.36-4.22 (m, 3H, CH₂CH₂O + NCHOH), 3.90 (s, 3H, OCH₃), 3.72-3.47 (m, 3H, NCH + NCH₂), 2.91 (t, J = 6.41 Hz, CH₂CH₂O) 2.29-2.00 (m, 4H, NCH₂CH₂CH₂) ¹³C-NMR (67.8 MHZ, CDCl₃): δ 170.33 (Estercarbonyl – CO), 166.17 (CON), 154.4 (OCO), 149.88 (COCH₃), 148.93 (COCH₂CH₂), 131.86 (CH₂CHCH₂), 127.48 (arom. CN), 126.24 (CCON), 118.42 (OCH₂CHCH₂), 114.48 (arom. CH), 110.82 (arom. CH), 95.09 (CCl₃), 86.42 (NCHOH), 74.96 (TrOC-CH₂), 65.47 (OCH₂CHCH₂), 64.43 (CH₂CH₂O), 60.13 (NCH), 56.14 (OCH₃), 46.44 (NCH₂), 34.26 (CH₂CH₂O), 28.64 (NCH₂CH₂CH₂), MS (EI) m/z (relative Intensität): = 552 (M⁺ 10), 550 (10), 374 (2), 368 (5), 304 (15), 192 (8), 70 (24), 55 (24). HRMS ber. für C₂₂H₂₅N₂O₈Cl₃ = 552.0651, gef. 3 Peaks aufgrund von Chlor 552.0646, 550.676, 554.0617.
3-(11-Hydroxy-5-oxo-7-methoxy-10-(2,2,2-trichlorethyloxocarbonylamino)(11aS)-2,3,5,10,11,11a-hexahydro-1H-benzo[e]pyrrolo[2,1-a][1,4]diazepin-8-yloxypropansäure (7d)
Eine Lösung von 6d (3,5 g, 6,35 mmol) wurde in Ethanol (100 ml) gelöst. Dazu wurde Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (350 g, 0,303 mmol) zugesetzt und die Lösung 30 min unter Rückfluss erhitzt, bis die Reaktion, wie mittels DC überprüft, vollständig abgelaufen war. Das EtOH wurde anschließend im Vakuum abgedampft, was das Rohmaterial als gelben Feststoff ergab, der in den nächsten Schritt direkt eingesetzt wurde.
¹H-NMR (220 MHZ, CDCl₃): δ 7.22 (s, 1H, OCCHCN), 7.01 (s, 1H, MeOCCHC), 6.27 (bs, COOH), 5.67 (d, 1H, J = 9.5 Hz, TrOC-CH₂), 5.06 (d, 1H, J = 12.09 Hz, TrOC-CH₂), 4.29-4.11 (m, 2H, CHOH), 3.85 (s, 3H, OCH₃), 3.71 (t, 2H, J = 6.97 Hz, CH₂CH₂O), 3.51 (m, 1H, NCH), 2.80 (m, 2H, NCH₂), 2.12-1.99 (m, 4H, NCH₂CH₂CH₂), 1.21 (t, 2H, J = 6.96 Hz, CH₂CH₂O); ¹³C-NMR (67.8 MHZ, CDCl₃): δ = 174.27 (Säure-CH), 167.34 (CON), 154.20 (OCO), 149.78 (COCH₃), 148.74 (COCH₂CH₂), 133.79 (arom. CH), 132.16 (arom. CH), 128.66 (arom. CN), 125.87 (CCON), 95.06 (CCl₃), 86.53 (NCHCHOH), 74.95 (CH₂-TrOC), 60.67 (NCH), 58.24 (CH₂CH₂O), 56.04 (OCH₃), 46.44 (NCH₂), 35.24 (NCH₂CH₂CH₂), 28.59 (NCH₂CH₂CH₂), 23.08 (CH₂CH₂O).
Beispiel 1(e): Synthese von harzgebundenem geschütztem PBD (JGB-285)
JGB-285
DMF (500 μl) wurde zu Amino-Tentagel-Harz (0,056 g, 0,26 mmol/g Beladung) in einem Alltech-Röhrchen (8 ml) zugesetzt und die resultierende Suspension 30 min lang geschüttelt. Eine Lösung der Fmoc-PBD-Säure 7b (66,6 mg, 0,12 mmol), TBTU (0,038 g, 0,012 mmol) und DIPEA (21 μl, 0,012 mmol) in DMF (1 ml) wurde zugesetzt und weitere 16 h lang geschüttelt. Das Harz wurde filtriert und mit DMF (5 ml), CH₂Cl₂ (5 ml) und MeOH (5 ml) gespült. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt, um sicherzustellen, dass die Reaktion vollständig abgelaufen ist, und das Harz wurde anschließend vakuumgetrocknet, was JGB-285 ergab. Beispiel 1(f): Synthese von harzgebundenem ungeschütztem PBD (JGB-286)
JGB-286
Eine Lösung von Piperidin in DMF (20%, 500 μl) wurde zu dem Harz JGB-285 zugesetzt und die Suspension 16 h lang geschüttelt. Das Harz wurde filtriert und mit DMF (5 ml), CH₂Cl₂ (5 ml) und MeOH (5 ml) gespült. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet, was JGB-286 ergab.
Beispiel 2: Synthese von 8-Aminopropyl-PBD der Formel I (siehe 2)
Gesamtsynthese
Die Verbindung 19 wurde durch Entfernen von Fmoc von 18 unter Standardbedingungen (Piperidin/DMF) hergestellt. Das Fmoc-Carbamat wurde mittels Swern-Oxidation des Alkohols 17 erhalten, was zum spontanen Ringschluss des Pyrrolobenzodiazepin-B-Rings führte. Eine Reihe anderer Oxidationsverfahren sollte sich ebenfalls zur Beschleunigung der Oxidations-/Zyklisierungsreaktion eignen, wie z. B. das Dess-Martin-Reagens, das TPAP/NMO-System oder Pyridinschwefeltrioxid in DMSO. Der Alkohol 17 wurde durch Behandlung des Aminoalkohols 16 mit Nvoc-Cl in Gegenwart von Pyridin erhalten. Wie bereits zuvor ist dies ein allgemeines Verfahren, das auf ein beliebiges Chlorformiat anwendbar ist, wobei die Wahl lediglich durch die Verträglichkeit mit PBD und Fmoc-Abspaltungsbedingungen eingeschränkt ist. Die Amingruppe kann auch mit zahlreichen anderen Carbamat-Schutzgruppen geschützt werden, wobei die geeignetsten davon aufgrund ihrer Verträglichkeit mit Fmoc-Abspaltungsbedingungen Alloc, Teoc und Noc sind. Es gilt anzumerken, dass Fmoc selbst zum N-10-Schutz eingesetzt werden könnte, wobei es in einem solchen Fall offensichtlich erforderlich wäre, eine andere Schutzgruppe für den aliphatischen Stickstoff anzuwenden (siehe unten). Der Aminoalkohol wurde mittels Zinnchloridreduktion des Nitroalkohols hergestellt, der wiederum durch Binden von Pyrrolidinmethanol an die o-Nitrobenzoesäure 14 unter Standardbedingungen hergestellt wurde. Die o-Nitrobenzoesäure wurde durch Fmoc-Schutz der Aminosäure 13 hergestellt. Es wäre erneut möglich, Fmoc mit einer Reihe anderer Schutzgruppen, wie z. B. Boc, Alloc, Noc etc., aufgrund ihrer Verträglichkeit mit der N10-Nvoc-Gruppe zu ersetzen. Es gilt anzumerken, dass, wenn Fmoc zum Schutz der aromatischen N10-Gruppe eingesetzt werden würde, Boc, Alloc, Teoc und Nvoc eingesetzt werden könnten, um den aliphatischen Stickstoff zu schützen. Die Aminosäure 13 wurde durch Hydrolyse des Esters 12 hergestellt, der seinerseits durch gleichzeitige Nitrierung und Entschützung des Boc-geschützten Amins 11 erhalten wurde, das mittels Mitsunobu-Veretherung von Methylvanillat mit Boc-Aminopropanol erhalten wurde.
Boc-Aminoester (11)
Eine Lösung von Diethylazidodicarboxylat (3,38 g, 19,4 mmol) in THF (50 ml) wurde zu einer Lösung von Methylvanillat (3,53 g, 19,4 mmol), N-Boc-Propanolamin (3,4 g, 19,4 mmol) und Triphenylphosphin (5,09 g, 19,4 mmol) in THF (50 ml) bei 0°C zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und über Nacht gerührt. Überschüssiges Lösungsmittel wurde mittels Rotationsverdampfung bei reduziertem Druck abgedampft und der Rückstand mit Toluol trituriert. Ausgefälltes Triphenylphosphinoxid wurde mittels Vakuumfiltration entfernt und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde einer Flashsäulenchromatographie (Kieselgel, Petrolether 40-60/Ethylacetat, 80:20) unterzogen, und die Entfernung des überschüssigen Eluenten ergab das reine Produkt 11 (4,8 g, 73% Ausbeute).
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃) δ 7.65 (dd, J = 8.43, 2.02 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 2.02 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 8.43 Hz, 1H), 5.55 (bs, 1H), 4.15 (t, J = 5.87 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.41-3.35 (m, 2H), 2.09-2.00 (m, 2H) und 1.46 (s, 9H). ¹³C-NMR (68.7 MHZ, CDCl₃) δ 166.9, 156.1, 152.1, 148.8, 123.5, 122.8, 112.0, 111.2, 79.0, 68.2, 55.9, 52.0, 38.9, 29.2 und 28.5.
Aminonitroester (12)
Das Boc-geschützte Amin 11 (10 g) wurde portionsweise zu kalter Salpetersäure (30 ml, 70%, Eisbad) zugesetzt, das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf zerstoßenes Eis (100 g) gegossen und die resultierende wässrige Lösung mittels Rotationsverdampfung bei reduziertem Druck auf die Hälfte ihres Originalvolumens eingeengt. Der resultierende Niederschlag wurde mittels Vakuumfiltration filtriert und aus absolutem Ethanol umkristallisiert, was das Produkt als gelben kristallinen Feststoff 12 (8,9 g, 87%) ergab.
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃) δ 7.47 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 4.24 (t, J = 5.86 Hz, 2H), 3.96, (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.24 (t, J = 6.78 Hz, 2H) Und 2.32-2.23 (m, 2H).
Aminonitrosäure (13)
Eine Lösung von Kaliumhydroxid (0,5 g, 8,7 mmol) und der Nitrobenzoesäure 12 (1 g, 2,9 mmol) in wässrigem Methanol (H₂O, 10 ml; Methanol, 20 ml) wurde 1 h bei Raumtemperatur rühren gelassen und anschließend unter Rückfluss erhitzt, bis die DC (AcOEt, MeOH, TEA, 1:10:100) ergab, dass das Ausgangsmaterial vollständig aufgebraucht war. Überschüssiges Methanol wurde mittels Rotationsverdampfen entfernt und die restliche Lösung mit Wasser verdünnt und mit 1 N HCl neutralisiert. Die neutralisierte wässrige Lösung wurde ohne weitere Reinigung direkt in dem nächsten Syntheseschritt eingesetzt.
Fmoc-Nitrosäure (14)
Fluorenylmethylchlorformiat (0,78 g, 3 mmol) wurde portionsweise zu der wässrigen Lösung aus der vorigen Reaktion zugesetzt, die mit THF (50 ml) verdünnt und wässrigem Natriumcarbonat (2,15 g, 50 ml Wasser) verdünnt worden war. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend über Nacht rühren gelassen. Überschüssiges organisches Lösungsmittel wurde bei reduziertem Druck mittels Rotationsverdampfung aus dem Reaktionsgemisch entfernt, wonach die restliche wässrige Lösung mit Ethylacetat (3 × 20 ml) (zur Entfernung von überschüssigem Fmoc-Cl) gewaschen wurde. Die wässrige Phase wurde mit konz. HCl angesäuert und mit Ethylacetat (2 × 50 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum abgedampft, was das Produkt 14 (1 g, 70% Ausbeute) ergab.
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃) δ (Rotamere) 8.21 (bs, 2H), 7.73 (d, J = 7.14 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 7.33 Hz, 2H) 7.40-7.13 (m, 5H), 6.47 und 5.70 (2 × bs, 1H), 4.54-3.88 (m, 5H), 3.77 (s, 3H), 3.44-3.42 (m, 2H) und 2.04-1.90 (m, 2H). ¹³C-NMR (68.7 MHZ, CDCl₃) δ 168.7, 156.9, 152.1, 149.8, 143.7, 141.9, 141.3, 127.7, 127.0, 124.9, 120.6, 120.0, 111.1, 107.8, 68.5, 66.4, 56.4, 47.3, 39.1 und 28.4.
Fmoc-Nitroalkohol (15)
Eine katalytische Menge DMF (2 Tropfen) wurden zu einer Lösung der Säure 14 (1,16 g, 2,36 mmol) und Oxalylchlorid (0,33 g, 2,6 mmol) in trockenem Dichlormethan (20 ml) zugesetzt und das Reaktionsgemisch über Nacht rühren gelassen. Die resultierende Säurechloridlösung wurde auf 0°C abgekühlt und mit einer Lösung von Pyrrolidinmethanol (0,26 g, 2,57 mmol) und Triethylamin (0,52 g, 5,14 mmol) in trockenem Dichlormethan (15 ml) zugetropft. Die kurz nach Ende der Aminzugabe durchgeführte Dünnschichtchromatographie ergab, dass die Reaktion vollständig abgelaufen war. Das Reaktionsgemisch wurde mit HCl (1 N, 1 × 50 ml) und Wasser (2 × 20 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Entfernung des überschüssigen Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, welches einer Flashsäulenchromatographie (Kieselgel, Gradienteneluierung, 1% Methanol in Chloroform bis 2% Methanol in Chloroform) unterzogen wurde, was das erforderliche Amid 15 (1,1 g, 81%) ergab. ¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃) δ 7.75 (d, J = 7.33 Hz, 2H), 7.67 (s, 1H), 7.60 (d, J = 6.96 Hz, 2H), 7.41-7.26 (m, 4H), 6.78 (s, 1H), 5.66 (bs, 1H), 4.48-4.39 (m, 3H), 4.23-4.13 (m, 3H), 3.91-3.79 (m, 5H), 3.45-3.42 (m, 2H), 3.18-3.13 (m, 2H) und 2.08-1.70 (m, 6H). ¹³C-NMR (68.7 MHZ, CDCl₃) δ 168.5, 156.5, 154.7, 148.2, 143.9, 141.3, 137.0, 128.0, 127.7, 127.0, 124.9, 120, 108.9, 108.0, 68.4, 66.2, 66.0, 61.5, 56.6, 53.5, 47.3, 39.0, 28.9, 28.4 und 24.4.
Fmoc-Aminoalkohol (16)
Eine Lösung des Nitroamids 15 (3 g, 5,22 mmol) und SnCl₂·2H₂O (6,15 g, 27,15 mmol) in Methanol (60 ml) wurde 2 h unter Rückfluss erhitzt. Das (Reaktionsgemisch wurde auf 1/3 seines Originalvolumens eingeengt und vorsichtig mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung (starkes Sprudeln!) behandelt, bis ein pH von 8 erhalten wurde. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat (100 ml) über Nacht stark rühren gelassen und anschließend durch Celite filtriert, um die ausgefällten Zinnsalze zu entfernen. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (50 ml) extrahiert und die ver einigte organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Entfernung des überschüssigen Lösungsmittels ergab das gewünschte Amin als dunkelgelbes Öl 16 (1,93 g, 68%). ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ 7.75 (d, J = 7.51 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 7.33 Hz, 2H), 7.40-7.26 (m, 4H), 6.72 (s, 1H), 6.25 (s, 1H), 5.95 (bs, 1H), 4.43-4.04 (m, 6H), 3.67-3.42 (m, 9H) und 2.11-1.7 (m, 6H). ¹³C-NMR (68.7 MHZ, CDCl₃) δ 171.7, 156.6, 150.8, 144.0, 141.3, 140.6, 127.6, 127.0, 125.0, 119.9, 112.0, 102.2, 68.0, 66.6, 66.4, 61.0, 56.6, 51.0, 47.3, 39.5, 29.1, 28.5 Und 24.9.
Fmoc-Nvoc-Alkohol (17)
Eine Lösung von 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzylchlorformiat (1,44 g, 5,23 mmol) in Dichlormethan (40 ml) wurde zu einer Lösung des Amins 16 (2,59 g, 4,75 mmol) und Pyridin (0,41 g, 5,23 mmol) in Dichlormethan (60 ml) bei 0°C zugetropft. Nach 3 h wurde das Reaktionsgemisch mit HCl (1 N, 2 × 100 ml), Wasser (2 × 100 ml) und Kochsalzlösung (1 × 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, und die Entfernung des überschüssigen Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, welches einer Flashsäulenchromatographie (Kieselgel, Ethylacetat, gefolgt von 1% Methanol in Ethylacetat) unterzogen wurde, was das reine Carbamat 17 (3,2 g, 86%) ergab.
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃) δ 8.94 (br,s 1H) 7.74 (d, J = 7.51 Hz, 2H), 7.71 (s, 1H), 7.61 (d J = 7.33 Hz, 2H), 7.40-7.25 (m, 4H), 7.08 (s, 1H), 6.80 (s, 1H), 5.62 (d, J = 15.02 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 15.02, 1H), 4.44-4.41 (m, 3H), 4.24-4.13 (m, 3H), 3.99 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.70-3.44 (m, 9H), und 2.17-1.72 (m, 6H). ¹³C-NMR (68.7 MHZ, CDCl₃) δ 171.7, 164.0, 156.6, 153.7, 153.3, 150.1, 148.1, 144.3, 144.0, 141.3, 139.6, 131.3, 127.6, 127.0, 125.0, 119.9, 110.7, 110 1, 108.2, 105.5, 68.1, 66.4, 66.1, 63.9, 60.9, 56.6, 56.4, 56.2, 47.3, 39.5, 28.9, 28.3 und 25.1.
Fmoc-Nvoc-Carbinolamin (18)
Eine Lösung von DMSO (0,8 ml, 11,4 mmol) in trockenem Dichlormethan (15 ml) wurde über einen Zeitraum von 30 min zu einer Lösung von Oxalylchlorid (0,72 g, 5,71 mmol) in trockenem Dichlormethan (15 ml) bei –45°C unter Stickstoffatmosphäre zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde vor der 50-minütigen Zugabe des Substrats 17 (3,2 g, 4,08 mmol) in trockenem Dichlormethan (35 ml) 30 min rühren gelassen, während die Temperatur der Reaktion bei –45°C gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann weitere 45 min bei –45°C rühren gelassen. Eine Lösung von Triethylamin (2,15 ml, 16,2 mmol) in trockenem Dichlormethan (10 ml) wurde über einen Zeitraum von 25 min bei –45°C zugetropft und das Reaktionsgemisch weitere 30 min bei –45°C rühren gelassen, bevor es auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 N HCl (1 × 75 ml), Wasser (1 × 75 ml), Kochsalzlösung (1 × 75 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Entfernung des überschüssigen Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, welches einer Flashsäulenchromatographie (Kieselgel, Ethylacetat) unterzogen wurde, was das zyklisierte Produkt 18 (1,92 g, 60% Ausbeute) ergab.
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃) δ 7.74 (d, J = 7.51 Hz, 2H), 7.60-7.59 (m, 3H), 7.40-7.23 (m, 4H), 7.22 (s, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.88 (bs, 1H), 5.72 (d, J = 9.34 Hz, 1H), 5.45-5.38 (m, 2H), 4.59 (bs, 1H), 4.42 (d, J = 7.14 Hz, 2H), 4.22-4.08 (m, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.68 (s, 3H), 3.59-3.44 (m, 4H) und 2.12-2.02 (m, 6H). ¹³C-NMR (68.7 MHZ, CDCl₃) δ 166.9, 156.6, 155.4, 153.8, 150.1, 148.8, 148.1,144.0, 141.3, 139, 128.2, 127.7, 127.0, 126.7,126.5, 125.0, 120.0, 113.7, 110.5, 109.7,108.1, 86.2, 68.4, 66.3, 65.4, 60.3, 56.3, 56.2, 56.0, 47.3, 46.5, 39.4, 29.7, 28.7 und 23.1.
Amino-Nvoc-Carbinolamin (19)
Das Fmoc-geschützte Amin 18 (0,5 g, 0,64 mmol) wurde zu einer Lösung von Piperidin (1 g, 11,7 mmol) in Dichlormethan (10 ml) zugesetzt. Nach 2 h ergab die DC die anhaltende Gegenwart von Ausgangsmaterial, DMF wurde als Co-Lösungsmittel zugesetzt, und die Reaktion lief über den Zeitraum der darauf folgenden 30 min vollständig ab. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat (50 ml) verdünnt, mit Wasser (25 ml), Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Entfernung des überschüssigen Lösungsmittels ergab ein gelbes kristallines Produkt, das aus Ethylacetat und Petrolether 40-60 umkristallisiert wurde (0,123 g, 34% Ausbeute).
¹H-NMR (270 MHZ, CDCl₃) δ 7.61 (s, 1H), 7.21 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.70 (d, J = 9.70 Hz, 1H), 5.44 (bs, 2H), 4.13-4.11 (m, 1H), 3.96-3.40 (m, 13H), und 2.18-1.90 (m, 6H). ¹³C-NMR (68.7 MHZ, CDCl₃) δ 167.1, 155.1, 153.8, 150.0, 148.7, 147.9, 138.8, 128.5, 127.3, 126.5, 114.3, 110.4, 109.5, 107.9, 86.0, 67.1, 65.1, 60.7, 56.3, 56.1, 53.3, 38.7, 28.7, 28.0 und 23.1.
Beispiel 3a: Synthese von PBD-Triglycin 30 (3a & 3b)
Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um das allgemeine Syntheseverfahren zu bestätigen.
Harzentschützung
Fmoc-Aminoethyl-Photolinker-NovaSyn-TG-Harz 20 (0,35 g, 0,23 mmol/g Beladung) wurde in ein mit einem Sinterglas-Filterröhrchen ausgestattetes Peptidgefäß platziert. Nach der Zugabe von 20% Piperidin in DMF (3 ml) wurde das Gefäß 3 h lang geschüttelt. Das entschützte Harz 21 wurde anschließend mittels Filtration abgetrennt und mit NMP (3 ml), MeOH (3 ml) und CH₂Cl₂ (3 ml) gespült. Der gesamte Vorgang wurde zweimal wiederholt, bevor das Harz vakuumgetrocknet wurde.
Bindungsbedingungen
DMF (2 ml) wurde zu dem Harz 21 zugesetzt und die Suspension 30 min lang geschüttelt. Eine Lösung von Fmoc-Glycin (0,24 g, 0,805 mmol), TBTU (0,26 g, 0,805 mmol) und DIPEA (140 μl, 0,805 mmol) in DMF (2 ml) wurden zugesetzt, und es wurde weitere 20 h lang geschüttelt. Das gebundene Harz 22 wurde anschließend filtriert und mit NMP (5 ml), MeOH (5 ml) und CH₂Cl₂ (5 ml) gespült. Der gesamte Vorgang wurde einmal wiederholt, bevor das Harz vakuumgetrocknet wurde. Die Bindungswirksamkeit wurde durch die Zugabe von Bromphenolblau in DMF (0,2 ml) überprüft.
Acetylierungs-(Endverkappungs-)Bedingungen
Ac₂O (20%) und Pyridin (30%) in CH₂Cl₂ (5 ml) wurden zu dem Harz 22 zugesetzt, und die Suspension wurde 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (5 ml), EtOH (5 ml) und einer weiteren Aliquote von CH₂Cl₂ (2 ml) gewaschen. Der gesamte Vorgang wurde einmal wiederholt, bevor das Harz vakuumgetrocknet wurde. Die Wirksamkeit der Acetylierung wurde durch die Zugabe von Bromphenolblau in DMF (0,5 ml) überprüft.
Entschützungsbedingungen
Piperidin (20%) in DMF (2 ml) wurde zu dem acetylierten Harz 22 zugesetzt und die Suspension 12 h lang geschüttelt. Das entschützte Harz 23 wurde abfiltriert und mit NMP (5 ml), MeOH (5 ml) und CH₂Cl₂ (5 ml) gespült. Der gesamte Vorgang wurde zweimal wiederholt, bevor das Harz vakuumgetrocknet wurde.
Hinzufügung von zwei weiteren Glycineinheiten
Die zuvorigen Schritte des Bindens (21-22), Acetylierens und Entschützens (22-23) wurden zweimal wiederholt (23-27), bis das harzgebundene Tripeptid 27 erhalten wurde.
Binden an die PBD-Einheit (Fmoc-PBD)
Triglycinharz 27 (0,12 g, 0,235 mmol/g Beladung) wurde in ein mit einem Sinterglas-Filterröhrchen ausgestattetes Peptidsynthesegefäß platziert. DMF (3 ml) wurde zugesetzt und das Gefäß 30 min geschüttelt. Eine Lösung der Fmoc-PBD-Säure 7b (0,15 g, 0,28 mmol), TBTU (0,09 g, 0,28 mmol) und DIPEA (50 μl, 0,28 mmol) in DMF (3 ml) wurde zugesetzt und weitere 20 h lang geschüttelt. Bromphenolblauindikator (30 μl) wurde zugesetzt, um den Ablauf der Reaktion zu beobachten. Das gebundene Harz 28b wurde abfiltriert und mit DMF (5 ml), NMP (5 ml) und CH₂Cl₂ (5 ml) gespült. Der gesamte Vorgang wurde zweimal wiederholt, bevor das Harz vakuumgetrocknet wurde.
Acetylierungs-(Endverkappungs-)Bedingungen
Ac₂O (20%) und Pyridin (30%) in CH₂Cl₂ (5 ml) wurden zu dem Harz 28b zugesetzt, und das Gefäß wurde 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (5 ml), EtOH (5 ml) und zusätzlichem CH₂Cl₂ (2 ml) gewaschen. Der gesamte Vorgang wurde einmal wiederholt, bevor das Harz 29 vakuumgetrocknet wurde. Die Wirksamkeit der Acetylierung wurde durch die Zugabe von Bromphenolblau in DMF (0,5 ml) überprüft.
Entschützung zu freiem PBD
Piperidin (20%) in DMF (2 ml) wurde zu dem acetylierten Harz 28a zugesetzt und das Gefäß 12 h lang geschüttelt. Das Harz 29 wurde abfiltriert und mit NMP (5 ml), MeOH (5 ml) und CH₂Cl₂ (5 ml) gespült. Der gesamte Vorgang wurde zweimal wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet.
Synthese von Nvoc-PBD-Triglycin 28a (3b)
Triglycinharz 27 (0,16 g, 0,235 mmol/g Beladung) wurde in ein mit einem Sinterglas-Filterröhrchen ausgestattetes Peptidgefäß platziert. DMF (3 ml) wurde zugesetzt und das Gefäß 30 min lang geschüttelt. Eine Lösung der Nvoc-PBD-Säure 7a (0,22 g, 0,38 mmol), TBTU (0,12 g, 0,38 mmol) und DIPEA (65 μl, 0,38 mmol) in DMF (3 ml) wurde zugesetzt und weitere 20 h lang geschüttelt. Bromphenolblauindikator (30 μl) wurde zugesetzt, um den Ablauf der Reaktion zu beobachten. Das Harz 28a wurde abfiltriert und mit DMF (5 ml), NMP (5 ml) und CH₂Cl₂ (5 ml) gespült. Der gesamte Vorgang wurde zweimal wiederholt, bevor das Harz vakuumgetrocknet wurde.
Acetylierungs-(Endverkappungs-)Bedingungen
Ac₂O (20%) und Pyridin (30%) in CH₂Cl₂ (5 ml) wurden zu dem Harz 28a zugesetzt, und das Gefäß wurde 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde abfiltriert und mit CH₂Cl₂ (5 ml), EtOH (5 ml) und zusätzlichem CH₂Cl₂ (2 ml) gewaschen. Der gesamte Vorgang wurde einmal wiederholt, bevor das Harz 29 vakuumgetrocknet wurde. Die Wirksamkeit der Acetylierung wurde durch die Zugabe von Bromphenolblau in DMF (0,5 ml) überprüft.
Photolyse
Eine Suspension aus das Nvoc-PBD enthaltenden Kügelchen in DMF wurde gleichzeitig N10-entschützt und durch 2-stündige Bestrahlung bei 365 nm (Spectrolinker XI 1000 UV Crosslinker, Spectronics Corporation) aus dem Harz abgespalten, was eine 1-mmol-Stammlösung von 30 ergab, die in dem MTT-Test (Beispiel 3b) direkt eingesetzt wurde.
Beispiel 3(b): Allgemeines MTT-Testverfahren
Die Fähigkeit von Mitteln, das Wachstum von chronischen menschlichen U937-Monozytenleukämiezellen oder chronischen menschlichen K562-Myeloidleukämiezellen in Kultur zu hemmen, wurde mittels MTT-Test gemessen (Mosmann (1983)). Dieser basiert auf der Fähigkeit von lebensfähigen Zellen, ein gelbes lösliches Tetrazoliumsalz, 3-(4,5-Dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT; Sigma Chemical Co.), zu einem unlöslichen purpurnen Formazanniederschlag zu reduzieren. Nach der medikamentösen Behandlung wurden die Zellen auf 96-Well-Mikrotiterplatten mit 10⁴ Zellen pro Well und 8 Wells pro Probe übertragen. Die Platten wurden bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt, inkubiert. Nach der 4-tägigen Inkubation der Platten (um zu ermöglichen, dass die Anzahl der Kontrollzellen um das 10fache ansteigt) wurden 20 μl einer 5-mg/ml-Lösung von MTT in phosphatgepufferter Salzlösung zu jedem Well zugesetzt und die Platten weitere 5 h lang inkubiert. Die Platten wurden anschließend 5 min bei 300 g zentrifugiert, und die Hauptmasse des Mediums wurde aus dem Zellpellet entfernt, wodurch 10–20 μl pro Well übrig blieben. DMSO (200 μl) wurde zu jedem Well zugesetzt und die Proben gerührt, um eine vollständige Vermischung zu erzielen. Die optische Dichte wurde anschließend bei einer Wellenlänge von 550 nm auf einem Titertek-Multiscan-ELISA-Plattenleser gelesen und die Dosis-Wirkungs-Kurve erstellt. Der IC₅₀-Wert wurde als jene Dosis gelesen, die erforderlich ist, um die endgültige optische Dichte auf 50% des Kontrollwerts zu reduzieren.
MTT-Test von PBD-Triglycin
Der MTT-Test wurde eingesetzt, um die Zytotoxizität des zuvor hergestellten PBD-Triglycins (Verbindung 30) aus Beispiel 3a zu bewerten. Der Test ergab einen 1050 von 0,59 μM.
Beispiel 4(a): Synthese der harzgebundenen Tripeptid-Bibliothek (4a und 4b)
Nach Beispiel 3 wurde dieser Vorgang angewandt, um eine Tripeptid-Bibliothek zu synthetisieren.
Harzentschützung
Fmoc-Aminoethyl-Photolinker-NovaSyn-TG-Harz 20 (1,35 g, 0,23 mmol/g Beladung) wurde in 27 Alltech-Röhrchen in 50-mg-Portionen eingewogen. Zu jedem Röhrchen wurde Piperidin (20%) in DMF (0,5 ml) zugesetzt, und die Röhrchen wurden anschließend 3 h auf einen Rundschüttler platziert. Das entschützte Harz 21 wurde unter Einsatz des Vacuum Manifold von Supelco filtriert und mit DMF (2 ml) und CH₂Cl₂ (2 ml) gespült. Der gesamte Vorgang wurde zweimal wiederholt, bevor das Harz Vakuumgetrocknet wurde.
Bindungsbedingungen
DMF (0,5 ml) wurde zu jedem der Alltech-Röhrchen, die das Harz 21 enthielten, zugesetzt, und die Röhrchen wurden 30 min lang geschüttelt. Fmoc-Glycin (0,306 g, 1,03 mmol) in DMF (3,4 ml) wurde zu den ersten 9 Röhrchen zugesetzt; Fmoc-Valin (0,36 g, 1,06 mmol) in DMF (3,54 ml) wurde zu den nächsten 9 Röhrchen und Fmoc-Phenylalanin (0,396 g, 1,03 mmol) in DMF (3,4 ml) zu den letzten 9 Röhrchen zugesetzt. TBTU (0,972 g, 3,03 mmol) in DMF (10 ml) und DIPEA (540 μl, 3,1 mmol) wurden zu allen 27 Röhrchen zugesetzt und 20 h lang geschüttelt. Das gebundene Harz 31 wurde abfiltriert und mit DMF (5 ml), CH₂Cl₂ (5 ml) und EtOH (5 ml) gespült. Der gesamte Vorgang wurde zweimal wiederholt, bevor das Harz vakuumgetrocknet wurde. Die Bindungswirksamkeit wurde durch die Zugabe einiger Tropfen von 10% DIPEA/DMF und 1% TNBS/DMF überprüft. Nach beendigter Bindung blieb das Harz farblos.
Acetylierungs-(Endverkappungs-)Bedingungen
Ac₂O (20%) und Pyridin (30%) in CH₂Cl₂ (1 ml) wurden zu jedem der Alltech-Röhrchen, die da Harz 31 enthielten, zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (5 ml), EtOH (5 ml) und weiterem CH₂Cl₂ (2 ml) gewaschen. Der gesamte Vorgang wurde einmal wiederholt, bevor das Harz vakuumgetrocknet wurde.
Entschützungsbedingungen
Piperidin (20%) in DMF (0,5 ml) wurde zu jedem der Röhrchen mit dem acetylierten Harz 31 zugesetzt, und die Röhrchen wurden 12 h lang geschüttelt. Das entschützte Harz 32 wurde abfiltriert und mit DMF (5 ml) und CH₂Cl₂ (5 ml) gespült. Der gesamte Vorgang wurde zweimal wiederholt, bevor das Harz vakuumgetrocknet wurde.
Binden zweier weiterer Aminosäureeinheiten
Die zuvorigen Schritte des Bindens (21-31), Acetylierens und Entschützens (31-32) wurden unter Einsatz der geeigneten Fmoc-geschützten Aminosäuren in jedem der Alltech-Röhrchen (32-36) zweimal wiederholt, um sämtliche mögliche Kombinationen zu erzielen. Dies ergab die harzgebundene Tripeptid-Bibliothek 36.
Bindung an die Fmoc-PBD-Einheit (4b)
DMF (0,5 ml) wurde zu jedem der Alltech-Röhrchen, die das Harz 36 enthielten, zugesetzt, und die Röhrchen wurden 30 min lang geschüttelt. Fmoc-PBD-Säure 7b (0,866 g, 1,55 mmol) in DMF (5,2 ml), TBTU (0,486 g, 1,55 mmol) in DMF (5 ml) und DIPEA (270 μl, 1,55 mmol) wurden zugesetzt und weitere 20 h lang geschüttelt. Das gebundene Harz 37 wurde aus jedem der Röhrchen abfiltriert und mit CH₂Cl₂ (5 ml), EtOH (5 ml) und weiterem CH₂Cl₂ (2 ml) gespült. Der gesamte Vorgang wurde zweimal wiederholt, bis die Harz-Chargen vakuumgetrocknet wurden.
Acetylierungs-(Endverkappungs-)Bedingungen
Ac₂O (20%) und Pyridin (30%) in CH₂Cl₂ (1 ml) wurden zu jedem der Röhrchen des Harzes 37 zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz aus jedem der Alltech-Röhrchen wurde abfiltriert und mit CH₂Cl₂ (5 ml), EtOH (5 ml) und weiterem CH₂Cl₂ (2 ml) gewaschen. Der gesamte Vorgang wurde einmal wiederholt, bevor das Harz vakuumgetrocknet wurde. Die Wirksamkeit der Acetylierung wurde durch die Zugabe einiger Tropfen 10%igem DIPEA/DMF und 1%igem TNBS/DMF überwacht.
Entschützungsbedingungen
Piperidin (20%) in DMF (0,5 ml) wurde zu jedem der Röhrchen mit dem acetylierten Harz 37 zugesetzt, und die Röhrchen wurden 12 h lang geschüttelt. Die Chargen des entschützten Harzes 38 wurden abfiltriert und mit DMF (5 ml), CH₂Cl₂ (5 ml) und MeOH (5 ml) gespült. Der gesamte Vorgang wurde zweimal wiederholt, bevor der Rückstand vakuumgetrocknet wurde, was die Chargen des Harzes 38 ergab.
Photolyse

Eine Suspension aus Kügelchen, die das entschützte Harz 38 enthielten, wurde durch 2-stündige Bestrahlung bei 365 nm (Spectrolinker XL 1000 UV Crosslinker, Spectronics Corporation) von dem Harz abgespalten, was eine 1-mmol-Stammlösung ergab, die in dem MTT-Test (Beispiel 4b) direkt eingesetzt wurde. Beispiel 4(b): Screening einer auf Kügelchen hergestellten kombinatorischen Bibliothek mit 27 Mitgliedern

Verbindung	Aminosäuresequenz kombinatorischer Einheiten	1050 (μM)
1	GGG	0,59
2	GGV	0,63
3	GGF	0,56
4	GVG	0,55
5	GVV	0,52
6	GVF	0,64
7	GFG	0,63
8	GFV	0,78
9	GFF	0,63
10	VGG	0,59
11	VGV	0,33
12	VGF	0,58
13	VVG	0,58
14	VVV	0,58
15	VVF	0,53
16	VFG	0,46
17	VFV	0,56
18	VFF	0,56
19	FGG	0,54
20	FGV	0,54
21	FGF	0,57
22	FVG	0,58
23	FVV	0,54
24	FVF	0,69
25	FFG	0,54
26	FFV	0,40
27	FFF	0,59
GW/613	-	0,33

G: = GLYCIN
V: = VALIN
F: = PHENYLALANIN

Diese Ergebnisse zeigen, dass sich eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf die Zytotoxizität der PBDs auswirkt. Beispiel 5(a): Herstellung einer aus 27 Mitgliedern bestehenden Tripeptid-PBD-Bibliothek auf Kronen zum Lösungsphasentesten
38: n = 3; R = H, CH₂CH(CH₃)₂ oder CH₂Ph
Eine aus 27 Mitgliedern bestehende Bibliothek wurde auf Chiron-Technology-Kronen aus Fmoc-geschützten Glycin-, Leucin- und Phenylalanin-Bausteinen und einer NVOC-geschützten PBD-Einheit unter Anwendung des Multipin^TM-Synthesesets und des gleichen wie in Beispiel 4(a) dargestellten allgemeinen Reaktionsschemas hergestellt.
Kronen-Entschützung
27 Fmoc-Rink-Amid-Kronen der O-Reihe (Beladung: 2,2 μM pro Krone) wurden an die ersten 27 Stifte eines 98-Stift-Blocks angebracht. Der Block wurde umgekehrt und in ein Gefäß platziert, das eine Lösung von Piperidin (20%) in DMF (50 ml, wasserfrei) auf einer Schüttelvorrichtung (Heidolph, Titramax 100) enthielt. Nach 30 min wurde der Block aus dem Gefäß entnommen und überschüssiges Piperidin/DMF ableiten gelassen. Der Block wurde anschließend umgekehrt, in ein frisches DMF (50 ml) enthaltendes Gefäß platziert, und die gesamte Anordnung wurde 5 min lang geschüttelt. Schließlich wurden die Kronen zweimal 2 min mit Methanol gewaschen, bevor sie 20 min luftgetrocknet wurden.
Herstellung von aktivierten Aminoestern

Eine Lösung von N-Fmoc-Glycin (128,4 mg, 0,43 mmol), DIC (55 mg, 0,43 mmol) und HOBt (70 mg, 0,52 mmol) in DMF (2.160 μl) wurde 20 min gerührt, und zu den ersten neun Wells (H1-H9) einer 98-Tiefwelt-Mikrotiterplatte wurden Aliquoten (200 μl) zugesetzt. Ähnliche Lösungen von aktiven Estern wurden aus N-Fmoc-Leucin (152,7 mg) und N-Fmoc-Phenylalanin (167,4 mg) hergestellt, und Aliquoten (200 μl) wurden in Wells H10-G6 bzw. G7-F3 eingefüllt (siehe nachstehende Tabelle 1).

	H	G	F
1	Glycin	Leucin	Phenylalanin
2	Glycin	Leucin	Phenylalanin
3	Glycin	Leucin	Phenylalanin
4	Glycin	Leucin
5	Glycin	Leucin
6	Glycin	Leucin
7	Glycin	Phenylalanin
8	Glycin	Phenylalanin
9	Glycin	Phenylalanin
10	Leucin	Phenylalanin
11	Leucin	Phenylalanin
12	Leucin	Phenylalanin

Tabelle 1: Verteilung von N-Fmoc-geschützten Aminosäuren in Wells H1 bis F3.

Bindungsreaktion
Jeder Well wurde mit einer geringen Menge Bromphenolblauindikator (25 μl von 6,6 mg in 10 ml DMF) dotiert und die Kronenanordnung in die Wells eingetaucht. Die Kronen (zuvor farblos) wurden sofort blau, was auf die Gegenwart von freien Aminen hinwies. Die Block/Tiefwellplatten-Anordnung wurde auf einer Schüttelvorrichtung 18 h gerührt, wonach sämtliche Kronen praktisch farblos wurden, was darauf hinwies, dass die Bindungsreaktionen vollständig abgelaufen waren. Die Kronenanordnung wurde anschließend aus der Mikrotiterplatte entnommen, das überschüssige Bindungsreagens ableiten gelassen und die Kronenanordnung einmal mit DMF (50 ml, 5 min) und zweimal mit Methanol (100 ml, 2 min) gewaschen. Schließlich wurde die Kronenanordnung 20 min luftgetrocknet.
Entschützung
Die Kronenanordnung wurde umgekehrt und in ein Gefäß auf einer Schüttelvorrichtung (Heidolph, Titramax 100) platziert, das eine Lösung von Piperidin (20%) in DMF (50 ml, wasserfrei) enthielt. Nach 30 min wurde der Block aus dem Gefäß entnommen und überschüssiges Piperidin/DMF ableiten gelassen. Der Block wurde anschließend umgekehrt, in ein frisches DMF (50 ml) enthaltendes Gefäß platziert, und die gesamte Anordnung wurde 5 min lang geschüttelt. Schließlich wurden die Kronen zweimal 2 min mit Methanol gewaschen, bevor sie 20 min luftgetrocknet wurden.
Binden an die zweite Aminosäure
Die entschützte Kronenanordnung wurde in einer mit frisch hergestellten Lösungen der aktivierten Ester von N-Fmoc-Glycin, N-Fmoc-Leucin und Fmoc-Phenylalanin gemäß dem in nachstehender Tabelle 2 angeführten Muster befüllten Tiefwell-Mikrotiterplatte eingetaucht. Die Block/Tiefwell-Plattenanordnung wurde auf einem Rundschüttler 18 h lang geschüttelt, wonach sämtliche Kronen praktisch farblos wurden, was darauf hinwies, dass die Bindungsreaktionen vollständig abgelaufen waren.
Die Kronenanordnung wurde anschließend aus der Mikrotiterplatte entnommen, das überschüssige Bindungsreagens ableiten gelassen und die Kronenanordnung einmal mit DMF (50 ml, 5 min) und zweimal mit Methanol (100 ml, 2 min) gewaschen.

Schließlich wurde die Kronenanordnung 20 min luftgetrocknet.

	H	G	F
1	Glycin	Leucin	Phenylalanin
2	Glycin	Leucin	Phenylalanin
3	Glycin	Leucin	Phenylalanin
4	Leucin	Phenylalanin
5	Leucin	Phenylalanin
6	Leucin	Phenylalanin
7	Phenylalanin	Glycin
8	Phenylalanin	Glycin
9	Phenylalanin	Glycin
10	Glycin	Leucin
11	Glycin	Leucin
12	Glycin	Leucin

Tabelle 2: Verteilung von N-Fmoc-geschützten Aminosäuren in Wells H1 bis F3.

Entschützung
Die Kronenanordnung wurde umgekehrt und in ein Gefäß auf einer Schüttelvorrichtung (Heidolph, Titramax 100) platziert, das mit einer Lösung von Piperidin (20%) in DMF (50 ml, wasserfrei) befüllt war. Nach 30 min wurde der Block aus dem Gefäß entnommen und überschüssiges Piperidin/DMF ableiten gelassen. Der Block wurde anschließend umgekehrt, in ein frisches DMF (50 ml) enthaltendes Gefäß platziert, und die gesamte Anordnung wurde 5 min lang geschüttelt. Schließlich wurden die Kronen zweimal 2 min mit Methanol gewaschen, bevor sie 20 min luftgetrocknet wurden.
Binden an die dritte Aminosäureeinheit
Die entschützte Kronenanordnung wurde in einer mit frisch hergestellten Lösungen der aktivierten Ester von N-Fmoc-Glycin, N-Fmoc-Leucin und Fmoc-Phenylalanin gemäß dem in nachstehender Tabelle 3 angeführten Muster befüllten Tiefwell-Mikrotiterplatte eingetaucht. Die Block/Tiefwell-Plattenanordnung wurde auf einem Rundschüttler 18 h lang geschüttelt, wonach sämtliche Kronen praktisch farblos wurden, was darauf hinwies, dass die Bindungsreaktionen vollständig abgelaufen waren.
Die Kronenanordnung wurde anschließend aus der Mikrotiterplatte entnommen, das überschüssige Bindungsreagens ableiten gelassen, und die Kronenanordnung wurde einmal mit DMF (50 ml, 5 min) und zweimal mit Methanol (100 ml, 2 min) gewaschen.

Schließlich wurde die Kronenanordnung 20 min luftgetrocknet.

	H	G	F
1	Glycin	Glycin	Glycin
2	Leucin	Leucin	Leucin
3	Phenylalanin	Phenylalanin	Phenylalanin
4	Glycin	Glycin
5	Leucin	Leucin
6	Phenylalanin	Phenylalanin
7	Glycin	Glycin
8	Leucin	Leucin
9	Phenylalanin	Phenylalanin
10	Glycin	Glycin
11	Leucin	Leucin
12	Phenylalanin	Phenylalanin

Tabelle 3: Verteilung von N-Fmoc-geschützten Aminosäuren in Wells H1 bis F3.

Entschützung
Die Kronenanordnung wurde umgekehrt und in ein Gefäß auf einer Schüttelvorrichtung (Heidolph, Titramax 100) platziert, das mit einer Lösung von Piperidin (20%) in DMF (50 ml, wasserfrei) befüllt war. Nach 30 min wurde der Block aus dem Gefäß entnommen und überschüssiges Piperidin/DMF ableiten gelassen. Der Block wurde anschließend umgekehrt, in ein frisches DMF (50 ml) enthaltendes Gefäß platziert, und die gesamte Anordnung wurde 5 min lang geschüttelt. Schließlich wurden die Kronen zweimal 2 min mit Methanol gewaschen, bevor sie 20 min lang luftgetrocknet wurden.
Bindung der PBD-Verkappungseinheit
Eine Lösung von Nvoc-PBD-Säure (745 mg, 1,29 mmol), DIC (16 mg, 1,29 mmol) und HOBt (209 mg, 1,55 mmol) in DMF (6,48 ml) wurde 20 min geschüttelt und dann in alle 27 Wells befüllt. Die Block/Tiefwell-Mikrotiterplattenanordnung wurde 48 h lang auf einer Schüttelvorrichtung geschüttelt. Die Kronenanordnung wurde dann aus der Mikrotiterplatte entfernt, überschüssiges Bindungsreagens ableiten gelassen und die Kronenanordnung einmal mit DMF (50 ml, 5 min) und zweimal mit Methanol (100 ml, 2 min) gewaschen. Schließlich wurde die Kronenanordnung 20 min lang luftgetrocknet.
Abspaltung
Vor der Abspaltung wurden die Kronen nacheinander mit DMF, Toluol, Methanol und Dichlormethan gewaschen, um jegliche nicht-kovalente Verunreinigungen zu entfernen. Die Kronenanordnung wurde anschließend in 27 aufeinander gestapelte (jedoch einzelne) 1-ml-Polypropylenröhrchen eingetaucht, die jeweils TFA/H₂O (300 μl, 95:5, Vol./Vol.) enthielten, und die Block/Stapel-Anordnung wurde 2 h bei Raumtemperatur auf einem Rundschüttler geschüttelt. Überschüssige TFA wurde mittels paralleler Eindampfung unter Stickstoffatmosphäre (von einem 8 Leitungen aufweisenden Verteilerstück aus Glas zugeführt) entfernt, gefolgt von einem 48-stündigen Endtrocknungsvorgang im Vakuum, was die freien N10-Nvoc-geschützten PBD-Tripeptide ergab.
Beispiel 5(b): Photolytische Abspaltung und MTT-Testverfahren
Es wurde das gleiche Testverfahren wie in Beispiel 3(b) angewandt. Zellen wurden bei einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/ml mit jedem Mitglied der 27 Mitglieder umfassenden Bibliothek bei einer Endkonzentration von 0,3 μM (6,6 μmol/Röhrchen/ml) kontinuierlich inkubiert. Aliquoten jeder der Verbindungen der 27 Mitglieder umfassenden Bibliothek wurden entweder ohne UVA-Bestrahlung (bei 365 nm) so belassen oder vor ihrer Zugabe zu der Zellsuspension 2 h lang UVA-Strahlen (bei 365 nm) ausgesetzt. Nach erfolgter Zugabe der Verbindungen wurden die Zellen auf 96-Well-Mikrotiterplatten übergeführt, und zwar 10⁴ Zellen pro Well, 8 Wells pro Probe. Platten wurden bei 37°C in angefeuchteter Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt, inkubiert. Nach erfolgter Inkubation der Platten über einen Zeitraum von 4 Tagen (damit ermöglicht wird, dass sich die Anzahl der Kontrollzellen um ein 10faches erhöht) wurden 20 μl einer 5-mg/ml-Lösung von MTT in phosphatgepufferter Salzlösung zu jedem Well zugesetzt und die Platten weitere 5 h inkubiert. Die Platten wurden anschließend über einen Zeitraum von 5 min bei 300 g zentrifugiert, und die Hauptmasse des Mediums wurde aus dem Zellpellet entfernt, womit 10 bis 20 μl pro Well zurückblieben. DMSO (200 μl) wurde zu jedem Well zugesetzt, und die Proben wurden geschüttelt, um eine vollständige Vermischung zu erzielen. Die optische Dichte wurde anschließend bei einer Wellenlänge von 550 nm auf einem Titertek-Multiscan-ELISA-Plattenleser gelesen und die Dosis-Wirkungs-Kurve erstellt.

Ergebnisse der In-vitro-Zytotoxizitäts-Bewertung der auf „Kronen" synthetisierten PBD-Bibliothek mit 27 Mitgliedern

Verbindung	Aminosäuresequenz	% Kontrolle bei 0,3 μM
1	AAA	104
2	AAB	106
3	AAC	93,8
4	ABA	86,2
5	ABB	89,6
6	ABC	91,7
7	ACA	87,8
8	ACB	100,6
9	ACC	107
10	BAA	112
11	BAB	88,2
12	BAC	99,3
13	BBA	93,9
14	BBB	79,2
15	BBC	95
16	BCA	69,6
17	BCB	109
18	BCC	107,6
19	CAA	91,4
20	CAB	99,4
21	CAC	98,3
22	CBA	85,6
23	CBB	86,1
24	CBC	90,6
25	CCA	119
26	CCB	114
27	CCC	112
Benzyl-DC-81	-	47,4

Tabelle 4: In-vitro-Zytotoxizität einer auf „Kronen" synthetisierten PBD-Bibliothek mit 27 Mitgliedern.

A: = Glycin
B: = Leucin
C: = Phenylalanin

Wie bereits zuvor zeigen diese Ergebnisse, dass sich die Veränderung der Aminosäuresequenz auf die Zytotoxizität der PBDs auswirkt.
Beispiel 6: DNA-Bindungs-Tests
Markieren von doppelsträngigen Oligonucleotiden
Doppelsträngige Oligonucleotide (10 pmol/μl) wurden mit [³²P]-ATP mittels T4-Polynucleotidkinase am 5'-Ende markiert und 30 min bei 37°C inkubiert. Die markierten Oligonucleotide wurden mit einer Biorad^TM-Minipräparations-Spin-Säule, die P6 Bio-gel^TM (40–90 μm) enthielt, gereinigt.
Auf Kügelchen durchgeführter Screening-Test
Die Kügelchen wurden über einen Zeitraum von etwa 1 h vor dem Bindungsversuch in DMF quellen gelassen. Markierte doppelsträngige Oligonucleotide wurden über einen Zeitraum von 24 h bei 37°C mit den Kügelchen inkubiert, an welche die Verbindung gebunden war. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Proben in TE-Puffer (10 mM tris, 1 mM EDTA) drei- bis viermal erneut suspendiert, zentrifugiert und der Überstand entfernt. Beim letzten Waschvorgang wurde das Pellet in 1 ml Szintillationsflüssigkeit EcoScint (Nat. Diagnostics, UK) resuspendiert und eine Zählung auf einem Wallac-1400-Szintillationsmesser durchgeführt. Markierte Oligonucleotide
Oligonucleotid 1 enthält die AGA-Sequenz (fettgedruckt), die die bevorzugteste Bindungsstelle für ein PBD ist. Oligonucleotid 2 enthält die TGT-Sequenz, die die am wenigsten bevorzugte Bindungsstelle für ein PBD ist. Oligonucleotid 3 enthält die AIA-Sequenz, an die ein PBD aufgrund einer fehlenden NH₂-Gruppe auf der Inosingruppierung nicht binden sollte.
Verbindung JGB-285 ist N10-geschützt und sollte nicht kovalent an DNA binden:
Verbindung JGB-286 ist eine freie C10-N11-Imingruppierung und ist in der Lage, mit DNA wechselzuwirken:

Verbindungen Counts pro Minute (CPM)

JGB-285 0

JGB-286 50.394

Tabelle 5: Bindung der Verbindungen JGB-285 und JGB-286 an Oligonucleotid 1 (Counts bezüglich des Hintergrunds korrigiert)

doppelsträngiges Oligonucleotid Counts pro Minute (CPM)

- 59,7

1 50.394

2 3.321

3 1.820

Tabelle 6: Bindung von JGB-286 an die doppelsträngigen Oligonucleotide 1, 2 und 3 (Counts bezüglich des Hintergrunds korrigiert).
Diese Tests wurden ebenfalls unter Verwendung von mit Rhodamin oder Fluorescin anstelle von [³²P]-ATP markiertem Oligonucleotid 1 (die markierten Oligonucleotide sind von Genesis, Cambridge, erhältlich) durchgeführt. Die Fluoreszenz wurde mittels Tecan Spectrafluor Plus gemessen.

Verbindungen relative Fluoreszenzeinheiten (RFU)

JGB-285 1.122

JGB-286 16.539

Tabelle 7: Bindung der Verbindungen JGB-285 und JGB-286 an das mit Rhodamin markierte Oligonucleotid 1 (Counts bezüglich des Hintergrunds korrigiert).

Verbindungen relative Fluoreszenzeinheiten (RFU)

JGB-285 1.217

JGB-286 42.355

Tabelle 8: Bindung der Verbindungen JGB-285 und JGB-286 an das mit Fluorescin markierte Oligonucleotid 1 (Counts bezüglich des Hintergrunds korrigiert).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die auf Kügelchen vorliegende PBD-Verbindung ihre Fähigkeit, an DNA kovalent zu binden, beibehält, das geschützte PBD (JGB-285) wurde gar nicht gebunden, während das ungeschützte PBD (JGB-286) eine starke Bindung aufwies. Viel wichtiger ist jedoch, dass das ungeschützte PBD seine Selek tivität für eine PuGPu-Sequenz, was auf geringe Bindungsaktivität gegenüber der am wenigsten bevorzugten wies, und gegenüber Nichtbindungsstellen beibehielt.
Beispiel 7: Synthese und Screening von Irori^TM-Glycin-PBD-Teilbibliothek (5)
Synthese
Aminomethyliertes Polystyrolharz 39 (5 g, 1,1 mmol/g Beladung) wurde in DCE:CH₂Cl₂ (2:1, 102 ml) suspendiert und gleichmäßig auf 289 Irori^TM-MicroKan-Reaktoren aufgeteilt. Das Harz wurde filtriert, und die Kan-Reaktoren wurden in einen Kolben mit DMF (70 ml) platziert und 30 min lang geschüttelt.
Eine Lösung von Fmoc-Glycin (4,91 g, 16,5 mmol), TBTU (5,3 g, 16,5 mmol) und DIPEA (2,9 ml, 16,5 mmol) in DMF (100 ml) wurde zu den vereinigten Kan-Reaktoren zugesetzt und weitere 20 h lang geschüttelt. Harz 40 wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (3 × 10 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Ac₂O, 30% Pyridin in CH₂Cl₂ (200 ml) wurde zu den Kan-Reaktoren zugesetzt, die 16 h lang geschüttelt wurden. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (3 × 10 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (200 ml) wurde zu dem acetylierten Harz 40 zugesetzt und der Reaktionskolben 16 h lang geschüttelt. Harz 41 wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (3 × 10 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Die Kan-Reaktoren wurden vereinigt und unter Anwendung der Irori^TM-Software in 17 Kolben sortiert. Jeder Kolben enthielt eine Lösung einer Fmoc-Aminosäure (0,97 mmol), TBTU (312 mg, 0,97 mmol) und DIPEA (170 ml, 0,97 mmol) in DMF (10 ml). [Fmoc-Alanin (306 mg); Fmoc-Asparagin (340 mg); Fmoc-Asparagin-(O^tBu-)Säure (391 mg); Fmoc-Glutamin (357 mg); Fmoc-Glutamin-(O^tBu-)Säure (408 mg); Fmoc-Glycin (289 mg); Fmoc-Isoleucin (340 mg); Fmoc-Leucin (340 mg); Fmoc(Boc)-Lysin (357 mg); Fmoc-Methionin (459 mg); Fmoc-Phenylalanin (374 mg); Fmoc-Prolin (323 mg); Fmoc-Serin (^tBu) (374 mg); Fmoc-Threonin (^tBu) (391 mg); Fmoc(Boc)-Tryptophan (510 mg); Fmoc-Tyrosin (^tBu) (442 mg); Fmoc-Valin (323 mg)].
Die Kolben wurden 16 h lang geschüttelt, und jede Charge der 17 Kan-Reaktoren wurde filtriert und mit DMF (3 × 10 ml), CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (3 × 10 ml) gespült und vakuumgetrocknet, was 42 ergab.
Eine Lösung von 20% Ac₂O, 30% Pyridin in CH₂Cl₂ (200 ml) wurde zu sämtlichen 289 Kan-Reaktoren zugesetzt und der Reaktionskolben 16 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (3 × 10 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (200 ml) wurde zu dem acetylierten Harz zugesetzt und das Gefäß 16 h lang geschüttelt. Harz 43 wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (3 × 10 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Dieser Vorgang wurde erneut wiederholt, was eine Bibliothek aus Trimeren 45 ergab, und der letzte Schritt wurde auf allen 289 Kan-Reaktoren gleichzeitig durchgeführt.
Die Kan-Reaktoren wurden in einen Kolben mit DMF (70 ml) platziert und 30 min lang geschüttelt. Eine Lösung von Fmoc-PBD-Säure 7b (Beispiel 1(b)) (9,2 g, 16,5 mmol), TBTU (5,3 g, 16,5 mmol) und DIPEA (2,9 ml, 16,5 mmol) in DMF (100 ml) wurde zu den Kan-Reaktoren zugesetzt und weitere 20 h lang geschüttelt. Harz 46 wurde filtriert und mit DMF (3 × 10 ml), CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (3 × 10 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 2% Triisopropylsilan in TFA (100 ml) wurde zu den in CH₂Cl₂ (100 ml) suspendierten Kan-Reaktoren zugesetzt und die Kan-Reaktoren 16 h lang ge schüttelt. Die Kan-Reaktoren wurden filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (3 × 10 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Screening
Die resultierende Bibliothek wurde gegen eine doppelsträngige DNA-Sequenz gescreent, um zu ermitteln, welche Mitglieder der Bibliothek am stärksten an die DNA-Testsequenz binden.
Die verwendete DNA-Sequenz war anelliert und mit Fluorescein markiert:
Markierung-5'-ACACCTAIAGATIAAITCTI-3'.
Etwa 10 mg jedes der Bibliotheksmitglieder wurden in einen Well einer 96-Well-Platte platziert und mit 5 pmol/μl anellierter, mit Fluorescin markierter, doppelsträngiger DNA 24 h lang bei 37°C inkubiert. Nach 24-stündiger Inkubation wurde jeder Well 4-mal mit TE-Puffer gewaschen, und die Kügelchen wurden in 50 ml TE oder PBS resuspendiert.
Die Fluoreszenz jedes Wells wurde mittels Tecan Spectrafluor gemessen, um zu ermitteln, welche Wells die meisten markierten DNAs enthielten und folglich welche Verbindungen am stärksten an die Test-DNA-Sequenz banden.
Als aktivste Verbindungen der Bibliothek, die mittels Irori^TM-Software identifiziert wurden, wurden jene mit den nachstehenden kombinatorischen Ketten befunden: Gly-Gly-Gln-PBD; Gly-Pro-Iso-PBD; Gly-Thr-Asp-PBD; Gly-Leu-Val-PBD; Gly-Val-Asp-PBD; Gly-Val-Phen-PBD; Gly-Try-Asp-PBD; Gly-Lys-Ala-PBD; Gly-Gly-Asp-PBD; Gly-Gly-Pro-PBD.
Beispiel 8: Synthese der PBD-Glycin-Teilbibliothek (6a, 6b, 6c)
Synthese des Lysin-Glycin-Dimers 54 (6a)
Tentagel-M-NH₂-Harz 48 (58 mg, 0,3 mmol/g Beladung) wurde in 17 Alltech-Röhrchen (4 ml Fassungsvermögen) eingewogen und DMF (250 μl) zu jedem Röhrchen zugesetzt, die anschließend 30 min lang geschüttelt wurden. Eine Lösung von Boc(Fmoc)-Lysin (416 mg, 0,88 mmol) in DMF (1,7 μl) und eine Lösung von TBTU (285 mg, 0,88 mmol) und DIPEA (155 μl, 0,88 mmol) in DMF (3,4 ml) wurden gleichmäßig auf die Röhrchen aufgeteilt und 20 h geschüttelt. Harz 49 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Ac₂O, 30% Pyridin in CH₂Cl₂ (500 μl) wurde zu jedem Röhrchen zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 2% Triisopropylsilan in TFA (250 μl) in CH₂Cl₂ (250 μl) wurde zu jedem Röhrchen zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Harz 50 wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Harz 50 wurde in CH₂Cl₂ (250 μl) suspendiert und 30 min lang geschüttelt. Eine eiskalte Lösung von Allylchlorformiat (100 μl, 0,88 mmol) und 4-Methylmorpholin (90 mg, 0,88 mmol) in CH₂Cl₂ (1,7 ml) wurde gleichmäßig auf jedes Röhrchen aufgeteilt und 16 h lang geschüttelt. Harz 51 wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (500 μl) wurde zu Harz 51 zugesetzt und die Röhrchen 12 h lang geschüttelt. Harz 52 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Das Harz 52 wurde in DMF (250 ml) suspendiert und 30 min lang geschüttelt.
Eine Lösung von Fmoc-Glycin (264 mg, 0,88 mmol) in DMF (1,7 ml) und eine Lösung von TBTU (285 mg, 0,88 mmol) und DIPEA (155 μl, 0,88 mmol) in DMF (3,4 ml) wurde gleichmäßig auf die Röhrchen aufgeteilt und 20 h lang weiter geschüttelt. Harz 53 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Ac₂O, 30% Pyridin in CH₂Cl₂ (500 μl) wurde zu dem Harz 53 zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (500 μl) wurde zu dem acetylierten Harz zugesetzt, und die Röhrchen wurden 12 h lang geschüttelt. Harz 54 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Synthese der Glycin-Teilbibliothek 61 (6b)
Bindungsbedingungen
Eine Lösung von Fmoc-Aminosäure (0,052 mmol) in DMF (100 μl) wurde zu jedem das Harz 54 enthaltenden Röhrchen zugesetzt. [Fmoc-Alanin (16 mg); Fmoc-Asparagin (18 mg); Fmoc-Asparagin-(O^tBu-)Säure (21 mg); Fmoc-Glutamin (19 mg); Fmoc-Glutamin-(O^tBu-)Säure (22 mg); Fmoc-Glycin (16 mg); Fmoc-Isoleucin (18 mg); Fmoc-Leucin (18 mg); Fmoc(Boc)-Lysin (24 mg); Fmoc-Methionin (19 mg); Fmoc-Phenylalanin (20 mg); Fmoc-Prolin (18 mg); Fmoc-Serin (^tBu) (20 mg); Fmoc-Threonin (^tBu) (21 mg); Fmoc(Boc)-Tryptophan (27 mg); Fmoc-Tyrosin (^tBu) (24 mg); Fmoc-Valin (18 mg)].
Eine Lösung von TBTU (285 mg, 0,88 mmol) und DIPEA (155 μl, 0,88 mmol) in DMF (3,4 ml) wurde gleichmäßig auf die 17 Röhrchen aufgeteilt und weitere 20 h lang geschüttelt. Harz 55 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Acetylierungsbedingungen
Eine Lösung von 20% Ac₂O, 30% Pyridin in CH₂Cl₂ (500 μl) wurde zu dem Harz 55 zugesetzt, und die Röhrchen wurden weitere 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Entschützungsbedingungen
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (500 μl) wurde zu dem acetylierten Harz zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Harz 56 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Pool-and-Split-Verfahren
Das vereinigte Harz 56 wurde in einem mit einem Sinterglas-Filterröhrchen ausgestatteten Rundkolben in DCE:CH₂Cl₂ (2:1, 68 ml) suspendiert und mit Stickstoffgas durchperlt, um eine vollständige Vermischung zu erzielen. Das Harz wurde erneut in die 17 Alltech-Röhrchen befüllt, filtriert, und zu jedem Röhrchen wurde DMF (250 μl) zugesetzt, gefolgt von 30-minütigem Schütteln.
Dieser Zyklus bestehend aus Binden, Acetylieren, Entschützen und Poolen/Splitten wurde weitere 3-mal wiederholt, bis eine Bibliothek aus 6-mer-Peptiden 61 synthetisiert wurde.
Synthese der PBD-Glycin-Teilbibliothek 64 (6c)
Das Harz 61 wurde in CH₂Cl₂ (250 μl) suspendiert, und die Röhrchen wurden 30 min lang geschüttelt. Eine Lösung von Phenylsilan (876 μl, 7,1 mmol) in CH₂Cl₂ (1,7 ml) wurde gleichmäßig auf jedes Röhrchen aufgeteilt, und die Röhrchen wurden 10 min lang geschüttelt. Eine Lösung von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (34 mg, 0,03 mmol) in CH₂Cl₂ (1,7 ml) wurde gleichmäßig auf jedes Röhrchen aufgeteilt, und die Röhrchen wurden weitere 10 min lang geschüttelt. Das Harz 65 wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt.
Eine Lösung von Fmoc-PBD-Säure 7b (Beispiel 1b) (495 mg, 0,88 mmol) in DMF (3,4 ml) und eine Lösung von TBTU (285 mg, 0,88 mmol) und DIPEA (155 μl, 0,88 mmol) in DMF (3,4 ml) wurde gleichmäßig in der Suspension des 6-mer-Peptidharzes 62 in DMF (250 μl) verteilt, und die Röhrchen wurden 20 h lang geschüttelt. Das Harz 63 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 2% Triisopropylsilan in TFA (250 μl) in CH₂Cl₂ (250 μl) wurde zu dem Harz 63 zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (500 μl) wurde zu dem Harz zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das Harz 64 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Die resultierende Teilbibliothek wurde gegen eine mit Rhodamin markierte, anellierte, doppelsträngige DNA mit nachstehender Sequenz gescreent:
Markierung -5'-ACACCTAIAGATIAAITCTI-3'
Die Teilbibliothek wurde mit der DNA-Sequenz (5 pmol/ml) vermischt und unter gelegentlichem Durchmischen 24 h lang bei 37°C inkubiert. Nach 24 h wurde die Teilbibliothek 4-mal mit TE-Puffer mit einem pH von 7,6 oder PBS gewaschen. Zur Identifi zierung der Kügelchen, an welche der Großteil der markierten DNA gebunden war, wurden Agarosegel-Objektträger wie nachstehend erläutert hergestellt. Etwa 500 ml von 0,25% Sea-Plaque-Agarose wurden schichtweise auf einen sauberen transparenten Objektträger aufgetragen und abkühlen sowie fest werden gelassen. Die inkubierten Kügelchen wurden anschließend mit weiteren ca. 500 ml einer 0,25% Sea-Plaque-Agaroselösung vermischt und auf vorbeschichtete Objektträger schichtweise aufgetragen und abkühlen sowie fest werden gelassen.
Die rötesten Kügelchen wurden unter einem Präparierlichtmikroskop visuell identifiziert und anschließend durch Zugabe von etwa 1 ml Wasser zum getrockneten Agarose-Objektträger wiedergewonnen, um deren Entfernung unter Einsatz einer p10-Gilson-Pipette mit feiner Spitze zu ermöglichen. Die entfernten Kügelchen wurden dann bereit zur Identifizierung in ein 1-ml-Eppendorf-PCR-Röhrchen platziert.
Identifizierung
Die Identifizierung der Sequenzen der aktivsten Verbindungen wurde unter Anwendung des automatisierten Edman-Abbaus und der Umkehrphasen-HPLC durchgeführt.
Unter Einsatz eines automatischen Proteinsequenzanalysators von Applied Biosystems (ABI)477A wurde eine pulsierte Flüssigphasen-N-Terminus-Sequenzierung durchgeführt. Die gewählten markierten Kügelchen wurden auf eine bereits einmal vorzyklierte Glasfaserscheibe gegeben. Die Scheibe wurde in den Sequenzanalysator platziert und einmal vorzykliert, wonach 6 Zyklen des Edman-Abbaus ausgeführt wurden (Edman, P., und Begg, G., Eur. J. Biochem. 1, 80 (1967)). Die freigesetzten Phenylthiohydantoin-(PTH-)Aminosäurederivate wurden mittels Umkehrphasen-HPLC identifiziert.
Die 8 aktivsten Verbindungen waren jene mit den nachstehenden Sequenzen:
PBD-KGNNNN; PBD-KGTESF; PBD-KGMPMA; PBD-KGGGMM; PBD-KGKGAS; PBD-KGANIA; PBD-KGMMGG; PBD-KGWYSP
Beispiel 9: Synthese der Split-and-Mix-PBD-Peptid-Bibliothek 80 (7)
Aminomethyliertes Polystyrolharz VHL 65 (3 g, 1,3 mmol/g Beladung) wurde in DCE:CH₂Cl₂ (2:1, 102 ml) suspendiert und gleichmäßig auf 17 Alltech-Röhrchen (8 ml Fassungsvermögen) aufgeteilt. Das Harz wurde filtriert und DMF (1,5 ml) zu jedem Röhrchen zugesetzt und 30 min geschüttelt.
Bindungsbedingungen: (→ 66) gleich wie in Beispiel 8, wobei eine Lösung einer Fmoc-Aminosäure (0,69 mmol) in DMF (250 μl) in jedem Röhrchen eingesetzt wurde (Fmoc-Aminosäuren wie in Beispiel 8). Die Menge von TBTU und DIPEA wurde im Verhältnis zur Menge der Fmoc-Aminosäure erhöht und lagen in 34 ml DMF vor.
Acetylierungsbedingungen: gleich wie in Beispiel 8, wobei 1,5 ml CH₂Cl₂ eingesetzt wurden, das das Ac₂O-Pyridin enthielt.
Entschützungsbedingungen: (→ 67) gleich wie in Beispiel 8, wobei 1,5 ml Lösung von 20% Piperidin in DMF eingesetzt wurde.
Pool-and-Split-Verfahren: gleich wie in Beispiel 8, wobei das Harz in 102 ml DCE/CH₂Cl₂ suspendiert war.
Der Zyklus wurde weitere 4-mal wiederholt, bis eine Bibliothek aus 5-mer-Peptiden synthetisiert wurde.
Eine Lösung von Boc(Fmoc)-Lysin (5,5 g, 11,7 mmol) in DMF (34 ml) und eine Lösung von TBTU (3,76 g, 11,7 mmol) und DIPEA (2,04 ml, 11,7 mmol) in DMF (34 ml) wurden zu der Suspension des 5-mer-Peptidharzes 75 in DMF (17 ml) zugesetzt, und das Gefäß wurde 20 h lang geschüttelt. Das Harz 76 wurde filtriert und mit DMF (3 × 5 ml), CH₂Cl₂ (3 × 5 ml), MeOH (3 × 5 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Ac₂O, 30% Pyridin in CH₂Cl₂ (17 ml) wurde zu dem Harz zugesetzt und das Gefäß 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 5 ml), MeOH (3 × 5 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (17 ml) wurde zu dem acetylierten Harz 76 zugesetzt und das Gefäß 12 h lang geschüttelt. Das Harz 77 wurde filtriert und mit DMF (3 × 5 ml), CH₂Cl₂ (3 × 5 ml), MeOH (3 × 5 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von Fmoc-PBD-Säure 7b (Beispiel 1b) (6,55 g, 11,7 mmol) in DMF (34 ml) und eine Lösung von TBTU (3,76 g, 11,7 mmol) und DIPEA (2,04 ml, 11,7 mmol) in DMF (34 ml) wurden zu der Suspension des 6-mer-Peptidharzes 77 in DMF (17 ml) zugesetzt, und das Gefäß wurde 20 h lang geschüttelt. Das Harz 78 wurde filtriert und mit DMF (3 × 5 ml), CH₂Cl₂ (3 × 5 ml), MeOH (3 × 5 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 2% Triisopropylsilan in TFA (17 ml) in CH₂Cl₂ (17 ml) wurde zu dem Harz zugesetzt und das Gefäß 2 h lang geschüttelt. Das Harz 79 wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 5 ml), MeOH (3 × 5 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (17 ml) wurde zu dem Harz 79 zugesetzt und das Gefäß 2 h lang geschüttelt. Das Harz 80 wurde filtriert und mit DMF (3 × 5 ml), CH₂Cl₂ (3 × 5 ml), MeOH (3 × 5 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Beispiel 10: Synthese der Glycin-Teilbibliothek 87 (8)
Fmoc-Aminoethyl-Photolinker-NovaSyn-TG-Harz 20 (30 mg, 0,23 mmol/g Beladung) wurde in 17 Alltech-Röhrchen (4 ml Fassungsvermögen) eingewogen, und eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (250 ml) wurde zu jedem Röhrchen zugesetzt, die 16 h lang geschüttelt wurden. Das Harz 21 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet. DMF (250 μl) wurde zu jedem Röhrchen zugesetzt und die Röhrchen 30 min lang geschüttelt.
Bindungsbedingungen: gleich wie in Beispiel 8, wobei eine Lösung einer Fmoc-Aminosäure (0,021 mmol) in DMF (150 μl) in jedem Röhrchen eingesetzt wurde. Die Menge von TBTU und DIPEA wurde im Verhältnis zur Menge der Fmoc-Aminosäure erhöht und lag in 1,7 ml DMF vor.
Acetylierungsbedingungen: gleich wie in Beispiel 8
Entschützungsbedingungen: gleich wie in Beispiel 8
Pool-and-Split-Verfahren: gleich wie in Beispiel 8
Dieser Zyklus bestehend aus Binden, Acetylieren, Entschützen und Poolen/Splitten wurde 2-mal wiederholt, bis eine Bibliothek aus Trimerpeptiden 83 synthetisiert wurde, wobei das Harz nach der zweiten Wiederholung nicht gepoolt wurde, sondern in Form von 17 einzelnen Teilbibliotheken gehalten wurde, was ermöglichte, dass die letzte Aminosäure bekannt wurde.
Bindung an Fmoc-Glycin
Das Harz 83 wurde in DMF (250 μl) suspendiert und 30 min lang geschüttelt. Eine Lösung von Fmoc-Glycin (105 mg, 0,35 mmol) in DMF (1,7 ml) und eine Lösung von TBTU (112 mg, 0,35 mmol) und DIPEA (68 μl, 0,35 mmol) in DMF (1,7 ml) wurden gleichmäßig auf die Röhrchen aufgeteilt und 20 h lang weiter geschüttelt. Das Harz wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Ac₂O, 30% Pyridin in CH₂Cl₂ (500 μl) wurde zu den Röhrchen zugesetzt und 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (500 μl) wurde zu dem acetylierten Harz zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das Harz 84 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Bindung an Boc(Fmoc)-Lysin
Eine Lösung von Boc(Fmoc)-Lysin (165 mg, 0,35 mmol) in DMF (1,7 ml) und eine Lösung von TBTU (112 mg, 0,35 mmol) und DIPEA (68 μl, 0,35 mmol) in DMF (1,7 ml) wurden gleichmäßig auf die Röhrchen aufgeteilt und 20 h lang kontinuierlich geschüttelt. Das Harz wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Ac₂O, 30% Pyridin in CH₂Cl₂ (500 μl) wurde zu den Röhrchen zugesetzt und 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gewaschen und Vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (500 μl) wurde zu dem acetylierten Harz zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das Harz 85 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Bindung an die PBD-Verkappungseinheit
Das Harz 85 wurde in DMF (250 μl) suspendiert und 30 min lang geschüttelt. Eine Lösung von Fmoc-PBD-Säure 7b (196 mg, 0,35 mmol) in DMF (1,7 ml) und eine Lösung von TBTU (112 mg, 0,35 mmol) und DIPEA (68 μl, 0,35 mmol) in DMF (1,7 ml) wurden gleichmäßig auf die Röhrchen aufgeteilt und weitere 20 h lang geschüttelt.
Das Harz 86 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 2% Triisopropylsilan in TFA (250 μl) und CH₂Cl₂ (250 ml) wurde zu den Röhrchen zugesetzt, die 2 h lang geschüttelt wurden. Das Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (500 μl) wurde zu den Röhrchen zugesetzt, die 2 h lang geschüttelt wurden. Das Harz 87 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Beispiel 11: Synthese der Glycin-Teilbibliothek 103 (9)
Aminomethyliertes Harz 88 (30 mg, 0,97 mmol/g Beladung) wurde in 17 Alltech-Röhrchen (4 ml Fassungsvermögen) eingewogen. DMF (250 μl) wurde zu jedem Röhrchen zugesetzt, und die Röhrchen wurden 30 min lang geschüttelt.
Bindungsprotokoll: gleich wie in Beispiel 8, wobei eine Lösung einer Fmoc-Aminosäure (0,087 mmol) in DMF (250 μl) in jedem Röhrchen eingesetzt wurde. Die Menge von TBTU und DIPEA wurden im Verhältnis zu der Menge der Fmoc-Aminosäure erhöht.
Acetylierungsbedingung: gleich wie in Beispiel 8
Entschützungsbedingung: gleich wie in Beispiel 8
Pool-and-Split-Verfahren: gleich wie in Beispiel 8
Dieser Zyklus bestehend aus Binden, Acetylieren, Entschützen und Poolen/Splitten wurde weitere 3-mal wiederholt, bis eine Bibliothek aus Tetramerpeptiden 96 synthe tisiert wurde, wobei das Harz nach der dritten Wiederholung nicht gepoolt wurde, sondern in Form von 17 einzelnen Teilbibliotheken gehalten wurde, was ermöglichte, dass die letzte Aminosäure bekannt wurde.
Bindung an Fmoc-Glvcin: (96-98) gleich wie in Beispiel 10, wobei 441 mg Fmoc-Glycin in 3,4 ml DMF eingesetzt wurde, wobei die Menge der anderen Verbindungen im Verhältnis erhöht wurde.
Bindung an Boc(Fmoc)-Lysin: (98-100) gleich wie in Beispiel 10, wobei 695 mg TBTU und DIPEA eingesetzt wurden, wobei die Menge von Boc(Fmoc)-Lysin in 3,4 ml DMF vorlag.
Bindung an die PBD-Verkappungseinheit: (100-103) gleich wie in Beispiel 10, wobei eine Lösung von 828 mg Fmoc-PBD-Säure 7b in 3,4 ml DMF eingesetzt wurde.
Beispiel 12: Synthese einer Bis-PBD-Pentapeptid-Bibliothek
Synthese von Lysin-Glycin-Dimer 109 (10a)
Das aminomethylierte Harz 88 (510 mg, 0,97 mmol/g Beladung) wurde in einen Rundkolben eingewogen, der mit einem Sinterglas-Filterröhrchen ausgestattet war. DMF (20 ml) wurde dazu zugesetzt und das Gefäß 30 min lang geschüttelt.
Eine Lösung von Boc(Fmoc)-Lysin (695 mg, 1,48 mmol) in DMF (10 ml) und eine Lösung von TBTU (480 mg, 1,48 mmol) und DIPEA (260 μl, 1,48 mmol) ebenfalls in DMF (10 ml) wurde zu dem Gefäß zugesetzt und weitere 20 h lang geschüttelt. Das Harz 104 wurde filtriert und mit DMF (3 × 10 ml), CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (2 × 10 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Ac₂O, 30% Pyridin in CH₂Cl₂ (20 ml) wurde zu dem Harz 104 zugesetzt, und das Gefäß wurde 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (2 × 10 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 2% Triisopropylsilan in TFA (10 ml) und CH₂Cl₂ (10 ml) wurde zu dem Gefäß zugesetzt, das 2 h lang geschüttelt wurde.
Das Harz 105 wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (2 × 10 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Das Harz 105 wurde in CH₂Cl₂ (5 ml) zugesetzt und 30 min lang geschüttelt. Eine eiskalte Lösung von Allylchlorformiat (157 μl, 1,48 mmol) und 4-Methylmorpholin (150 mg, 1,48 mmol) in CH₂Cl₂ (10 ml) wurden zugesetzt, und das Gefäß wurde 16 h lang geschüttelt. Das Harz 106 wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (2 × 10 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (20 ml) wurde zu dem Harz 106 zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das Harz 107 wurde filtriert und mit DMF (3 × 10 ml), CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (2 × 10 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Das Harz 107 wurde in DMF (20 ml) suspendiert und 30 min lang geschüttelt. Eine Lösung von Fmoc-Glycin (441 mg, 1,48 mmol) in DMF (10 ml) und eine Lösung von TBTU (480 mg, 1,48 mmol) und DIPEA (260 μl, 1,48 mmol) in DMF (10 ml) wurden zu dem Gefäß zugesetzt und dieses weitere 20 h lang geschüttelt. Das Harz 108 wurde filtriert und mit DMF (3 × 10 ml), CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (2 × 10 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Ac₂O, 30% Pyridin in CH₂Cl₂ (20 ml) wurde zu dem Harz 108 zugesetzt, und das Gefäß wurde 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (2 × 10 ml) gespült und Vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (20 ml) wurde zu dem acetylierten Harz zugesetzt, und das Gefäß wurde 2 h lang geschüttelt. Das Harz 109 wurde filtriert und mit DMF (3 × 10 ml), CH₂Cl₂ (3 × 10 ml), MeOH (3 × 10 ml), Et₂O (2 × 10 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Synthese der Glycin-Teilbibliothek 117 (10b)
Pool-and-Split-Verfahren: gleich wie in Beispiel 8, wobei mit dem Harz 109 gestartet wird.
Bindungsbedingungen: gleich wie in Beispiel 8, wobei eine Lösung einer Fmoc-Aminosäure (0,087 mmol) in DMF (250 μl) in jedem Röhrchen eingesetzt wurde.
Anstelle von TBTU und DIPEA wurde eine Lösung von Diisopropylcarbodiimid (232 μl, 1,48 mmol) und HOBt (200 mg, 1,48 mmol) in DMF (3,4 ml) gleichmäßig auf alle 17 Röhrchen verteilt und 20 h lang geschüttelt.
Acetylierungsprotokoll: gleich wie in Beispiel 8
Entschützungsprotokoll: gleich wie in Beispiel 8
Dieser Zyklus bestehend aus Poolen/Splitten, Binden, Acetylieren und Entschützen wurde weitere 3-mal wiederholt, bis eine Bibliothek aus 6-mer-Peptiden 117 synthetisiert wurde, wobei das Harz nach der dritten Wiederholung nicht gepoolt wurde, sondern in Form von 17 einzelnen Teilbibliotheken gehalten wurde, was ermöglichte, dass die letzte Aminosäure bekannt wurde.
Synthese der Bis-PBD-Glycin-Teilbibliothek 123 (10C)
Eine Lösung von Boc(Fmoc)-Lysin (695 mg, 1,48 mmol) in DMF (3,4 ml) und eine Lösung von TBTU (480 mg, 1,48 mmol) und DIPEA (260 μl, 1,48 mmol) in DMF (3,4 ml) wurden gleichmäßig auf das Harz 117 verteilt, und es wurde weitere 20 h lang geschüttelt. Das Harz 118 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Ac₂O, 30% Pyridin in CH₂Cl₂ (500 μl) wurde zu dem Harz 118 zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das acetylierte Harz wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gewaschen und vakuumgetrocknet.
Das Harz 118 wurde in CH₂Cl₂ (250 μl) suspendiert, und die Röhrchen wurden 30 min lang geschüttelt. Eine Lösung von Phenylsilan (1,5 ml, 11,9 mmol) in CH₂Cl₂ (3,4 ml) wurde gleichmäßig auf alle Röhrchen verteilt und 10 min lang geschüttelt.
Eine Lösung von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (57 mg, 0,05 mmol) in CH₂Cl₂ (3,4 ml) wurde gleichmäßig auf jedes Röhrchen aufgeteilt und weitere 10 min geschüttelt. Das Harz 119 wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (500 μl) wurde zu dem Harz 119 zugesetzt und die Röhrchen 2 h lang geschüttelt. Das Harz 120 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Das Harz 120 wurde in DMF (250 μl) suspendiert und 30 min lang geschüttelt. Eine Lösung von Fmoc-PBD-Säure 7b (1,66 g, 2 × 1,48 mmol) in DMF (3,4 ml) und eine Lösung von TBTU (960 mg, 2 × 1,48 mmol) und DIPEA (520 μl, 2 × 1,48 mmol) in DMF (3,4 ml) wurden gleichmäßig auf die Röhrchen aufgeteilt und weitere 20 h lang geschüttelt. Das Harz 121 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 2% Triisopropylsilan in TFA (250 μl) und CH₂Cl₂ (250 μl) wurde zu dem Harz 122 zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das Harz 122 wurde filtriert und mit CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml), weiterem CH₂Cl₂ (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Eine Lösung von 20% Piperidin in DMF (500 ml) wurde zu dem Harz 122 zugesetzt, und die Röhrchen wurden 2 h lang geschüttelt. Das Harz 123 wurde filtriert und mit DMF (3 × 2 ml), CH₂Cl₂ (3 × 2 ml), MeOH (3 × 2 ml) gespült und vakuumgetrocknet.
Beispiel 13: Synthese des Fmoc-Glu-OAll-Aminoharzes (171) (11)
Das TentaGel-Aminharz 169 (3,0 g, 0,8 mmol) in Form von Kügelchen wurde 2 h lang in trockenem DMF (12 ml) quellen gelassen und in einem siliconisierten Rundkolben zur Randomisierung, der mit einem Sinterglas-Filterröhrchen ausgestattet war, geschüttelt. Die Suspension wurde durch Absaugen von unten filtriert. Die Kügelchen wurden zweimal wie folgt mit trockenem DMF gewaschen: DMF (20 ml) wurde dem Gefäß von oben zugesetzt (um jegliches an den Seitenwänden des Gefäßes anhaftendes Harz hinunterzuspülen), Stickstoffgas wurde vorsichtig von unten durch das Sinterglas 2 min lang durchperlen gelassen, und das überschüssige DMF wurde durch Absaugen entfernt. Ein dreifacher molarer Überschuss von HOBt (7,7 ml, 0,3 M in DMF, 2,32 mmol) („Bindungsreagens") wurde zu einem dreifachen molaren Überschuss von Fmoc-Glu-OAll (0,95 g, 2,32 mmol) zugesetzt, und die resultierende Lösung wurde zu dem Harz zugesetzt. Ein dreifacher molarer Überschuss von PyBOP (1,2 g, 2,32 mmol) und ein dreifacher molarer Überschuss von DIPEA (0,4 ml, 0,3 g, 2,32 mmol) in einem Mindestvolumen von DMF (1,2 ml) wurden zu dem Reaktionskolben zugesetzt, um die Bindungsreaktion zu initiieren. Der Reaktionskolben wurde fest verkappt und vorsichtig 1 h lang bei Raumtemperatur schütteln gelassen, und überschüssiges Bindungsreagens wurde durch Absaugen entfernt. Der Bindungsvorgang wurde von der Zugabe des Bindungsreagens weg einmal wiederholt, um sicherzustellen, dass die Reaktion vollständig abgelaufen ist. Das resultierende Harz 171 wurde 6-mal mit DMF (4 × 20 ml), DCM (1 × 20 ml) und MeOH (1 × 20 ml) gewaschen, wobei das Harz jedes Mal 2 min geschüttelt wurde, und danach filtriert. Der Waschzyklus wurde anschließend wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet.
Synthese der Pentapeptid-Bibliothek (172)
Damit jegliche restliche freie Aminogruppen verkappt werden, wurde das Harz (in dem Kolben zur Randomisierung) in einem Gemisch aus Ac₂O/Pyridin/DMF (0,2:0,3:0,5, 10 ml) suspendiert und 2 h lang schütteln gelassen. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt, die Perlen wurden mit DCM (1 × 10 ml), MeOH (1 × 10 ml) und erneut mit DCM (1 × 10 ml) gewaschen. Der Waschzyklus wurde anschließend wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet.
Die Fmoc-Schutzgruppen wurden durch Behandlung des Harzes mit 50% Piperidin in DMF (10,7 ml) unter Schütteln entfernt. Nach 10 min wurde der Überstand durch Absaugen entfernt und frisches 50% Piperidin in DMF (10,7 ml) zugesetzt und weiter geschüttelt. Nach weiteren 10 min wurden die Kügelchen 6-mal mit DMF (4 × 20 ml), DCM (1 × 20 ml) und MeOH (1 × 20 ml) gewaschen, wobei das Harz jedes Mal 2 min geschüttelt und danach filtriert wurde. Der Waschzyklus wurde anschließend wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet.
Die Kügelchen wurden in einem isopyknischen Gemisch aus DCE/DMF (2:1, 32 ml) suspendiert, und Stickstoffgas wurde vorsichtig von unten durchperlen gelassen. Gleiche Aliquoten (470 μl) der Suspension wurden nacheinander zu jedem der 17-Alltech-Röhrchen zugesetzt, die zuvor mit einem einer spezifischen Aminosäure entsprechenden Buchstaben markiert wurden. Dieser Vorgang wurde 4-mal wiederholt. Die in dem Kolben zur Randomisierung zurückbleibenden Kügelchen wurden in dem isopyknischen Gemisch (32 ml) resuspendiert, und der Aufteilungsvorgang wurde anschließend zweimal wiederholt.
Das Glu-OAll-Harz M1 (45,6 mmol) in jedem Alltech-Röhrchen wurde in trockenem DMF (710 μl) quellen gelassen und gleichzeitig 2 h lang vorsichtig geschüttelt. Überschüssiges DMF wurde durch Absaugen auf einem Vakuum-Verteilerstück entfernt.
Das Harz wurde mit trockenem DMF (1,18 ml) gewaschen, das von oben zugesetzt wurde, um jegliches an den Seitenwänden der Alltech-Röhrchen anhaftendes Harz hinunterzuspülen. Die Röhrchen wurden 2 min schütteln gelassen, und überschüssiges DMF wurde durch Absaugen auf einem Vakuum-Verteilerstück entfernt.

Ein dreifacher molarer Überschuss von HOBt (460 μl, 0,3 M in DMF, 0,317 mmol) wurde zu einem dreifachen molaren Überschuss jeder Fmoc-Aminosäure (0,137 mmol) zugesetzt, und das resultierende Gemisch wurde 10 min lang geschüttelt und anschließend dem passenden Alltech-Röhrchen zugesetzt.

Substanz	Mengen		RÖHRCHEN
Substanz	mg	mmol	RÖHRCHEN
Fmoc-Ala-OH	42,56	0,137	1
Fmoc-Asn-OH	48,5	0,137	2
Fmoc-Asp(O^tBu)-OH	56,3	0,137	3
Fmoc-Glu(O^tBu)-OH	58,2	0,137	4
Fmoc-Gln-OH	50,4	0,137	5
Fmoc-Gly-OH	40,7	0,137	6
Fmoc-Ile-OH	48,3	0,137	7
Fmoc-Leu-OH	48,3	0,137	8
Fmoc-Lys(Boc)-OH	64,1	0,137	9
Fmoc-Met-OH	50,8	0,137	10
Fmoc-Phe-OH	51,8	0,137	11
Fmoc-Pro-OH	46,2	0,137	12
Fmoc-Ser(^tBu)-OH	52,4	0,137	13
Fmoc-Thr(^tBu)-OH	54,4	0,137	14
Fmoc-Trp(Boc)-OH	72,0	0,137	15
Fmoc-Tyr(^tBu)-OH	62,8	0,137	16
Fmoc-Val-OH	46,4	0,137	16

Ein dreifacher molarer Überschuss von PyBOP (71 mg, 0,137 mmol) und ein dreifacher molarer Überschuss von DIPEA (24 μl, 18 mg, 0,137 mmol) in einem Mindestvolumen von DMF (70 μl) wurden zu jedem der Alltech-Röhrchen zugesetzt, um die Bindungsreaktion zu initiieren.
Die Alltech-Röhrchen wurden fest verkappt und 1 h bei Raumtemperatur vorsichtig schütteln gelassen. Danach wurde das überschüssige Bindungsreagens durch Absaugen auf einem Vakuum-Verteilerstück entfernt. Der Bindungsvorgang wurde einmal wiederholt, um sicherzustellen, dass die Reaktion vollständig abgelaufen ist.
Das Harz wurde 6-mal mit DMF (4 × 2 ml), DCM (1 × 2 ml) und MeOH (1 × 2 ml) gewaschen, wobei das Harz jedes Mal 2 min geschüttelt, und danach auf einem Vakuum-Verteilerstück filtriert. Der Waschzyklus wurde anschließend wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet.
Damit jegliche restliche freie Aminogruppen in dem Peptidharz verkappt werden, wurde das Harz in jedem Alltech-Röhrchen in einem Gemisch aus Ac₂O/Pyridin/DMF (0,2:0,3:0,5, 460 μl) suspendiert und 2 h lang schütteln gelassen. Der Überstand wurde durch Absaugen auf einem Vakuum-Verteilerstück entfernt, und die Perlen wurden 3-mal mit DCM (1 × 2 ml), MeOH (1 × 2 ml) und erneut mit DCM (1 × 2 ml) gewaschen, wobei das Harz jeweils 2 min lang geschüttelt wurde, und dann auf einem Vakuum-Verteilerstück filtriert. Der Waschzyklus wurde anschließend wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet.
Die Fmoc-Schutzgruppen wurden durch Behandlung des Harzes mit 50% Piperidin in DMF (0,62 ml) über einen Zeitraum von 10 min auf einer Schüttelvorrichtung entfernt. Der Überstand wurde entfernt und frisches 50% Piperidin in DMF (620 μl) zugesetzt. Nach weiteren 10 min wurden die Kügelchen 3-mal mit DMF (4 × 2 ml), DCM (1 × 2 ml) und MeOH (1 × 2 ml) gewaschen, wobei das Harz jedes Mal 2 min geschüttelt wurde, und danach auf einem Vakuum-Verteilerstück filtriert. Der Waschzyklus wurde anschließend wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet.
Die Kügelchen in jedem der 17 Alltech-Röhrchen wurden in DCE/DMF (2:1, 1,9 ml) suspendiert, mittels Pipette zu dem siliconisierten Kolben zur Randomisierung übergeführt und die überschüssige isopyknische Lösung durch Absaugen entfernt. Der Vorgang wurde zweimal wiederholt, um zu gewährleisten, dass das gesamte Harz in den Kolben zur Randomisierung zurückgeführt wurde.
War das Harz zu dem Gefäß zur Randomisierung zurückgeführt, wurde es wie oben beschrieben unter die 17 Alltech-Reaktionsröhrchen wiederaufgeteilt.
Das Bindungsprotokoll wurde noch 4-mal wiederholt, um eine Pentapeptid-Bibliothek 172 zu erstellen. Am Ende des letzten Bindungszyklus wurde das Harz nicht rekombiniert, wodurch 17 Teilbibliotheken erhalten wurden, in welchen die Identität der N-Terminus-Aminosäure bekannt war.
Bindung von Bibliotheks-Mitgliedern an die PBD-Verkappungseinheit (172-174)
Das Peptidharz 172 (45,6 mmol) in jedem Alltech-Röhrchen wurde mit DCM (2 × 2 ml) gewaschen; das Harz wurde bei jedem Mal 2 min geschüttelt und dann auf einem Vakuum-Verteilerstück filtriert. Das Harz wurde anschließend vakuumgetrocknet.
Ein Gemisch aus CHCl₃/HOAc/NMM (37:2:1, 650 μl) wurde zu den Reaktionsröhrchen zugesetzt und 30 min lang gewaschen. Das entschützte Peptidharz wurde mit DCM (4 × 2 ml) gewaschen, wobei das Harz jedes Mal 2 min geschüttelt wurde, und dann auf einem Vakuum-Verteilerstück filtriert. Das Harz wurde anschließend vakuumgetrocknet.
Das Peptidharz (45,6 μmol) in jedem Alltech-Röhrchen wurde in trockenem DMF (0,8 ml) quellen gelassen, 2 h lang vorsichtig geschüttelt und dann unter Einsatz eines Vakuum-Verteilerstücks filtriert.
Die Kügelchen wurden wie folgt zweimal mit trockenem DMF gewaschen: DMF (1,18 ml) wurde von oben zugesetzt, gefolgt von vorsichtigem 2-minütigem Schütteln, und überschüssiges DMF wurde auf einem Vakuum-Verteilerstück abfiltriert.
Ein dreifacher molarer Überschuss von HOBt (18 mg, 0,137 mmol) in einem Mindestvolumen von DMF (0,3 molar, 700 μl) und ein dreifacher molarer Überschuss von Alloc-PBD 173, der in analoger Weise zu Beispiel 2 synthetisiert wurde (55 mg, 0,137 mmol), in DMF wurde zu dem Harz zugesetzt.
Ein dreifacher molarer Überschuss von PyBOP (71 mg, 0,137 mmol) und ein dreifacher molarer Überschuss von DIPEA (24 μl, 18 mg, 0,137 mmol) in einem Mindest volumen von DMF (150 μl) wurden zu dem Reaktionsröhrchen zugesetzt, um die Bindungsreaktion zu initiieren.
Das Reaktionsröhrchen wurde fest verkappt und 16 h lang bei Raumtemperatur vorsichtig schütteln gelassen. Überschüssige Reagenzien wurden auf einem Vakuum-Verteilerstück abfiltriert.
Die Kügelchen wurden 4-mal mit DMF (4 × 2 ml), DCM (1 × 2 ml) und MeOH (1 × 2 ml) gewaschen, wobei das Harz 174 jedes Mal 2 min geschüttelt wurde, und dann auf einem Vakuum-Verteilerstück filtriert. Der Waschzyklus wurde anschließend wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet.
Entfernung der Seitenkette, Fmoc- und Alloc-Schutzgruppen (174-175)
Die Boc- und tBu-Schutzgruppen wurden durch Behandlung des PBD-Peptidharzes 174 (45,6 μmol) in jedem der Alltech-Röhrchen mit einer Lösung von TFA/Triisopropylsilan/DCM (48:2:50, 800 μl) entfernt. Die Reaktionsröhrchen wurden 30 min lang schütteln gelassen, und überschüssige Reagenzien wurden auf einem Vakuum-Verteilerstück abfiltriert. Der Vorgang wurde einmal wiederholt, und die Kügelchen wurden 3-mal mit DCM (1 × 2 ml), MeOH (1 × 2 ml) und erneut mit DMC (1 × 2 ml) gewaschen, wobei das Harz jedes Mal 2 min geschüttelt wurde, und dann auf einem Vakuum-Verteilerstück filtriert. Der Waschzyklus wurde anschließend wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet.
Das Harz wurde mit DCM (5 × 2 ml) gewaschen, wobei das Harz jedes Mal 30 s lang geschüttelt wurde, und dann auf einem Vakuum-Verteilerstück filtriert.
Alloc-Schutzgruppen wurden durch Behandlung des Harzes (45,6 μmol) mit einer Lösung von Phenylsilan (PhSiH₃, 130 μl, 0,118 g, 1,09 mmol) in DCM (300 μl) entfernt und das Harz manuell gerührt. Eine Lösung von Pd(PPh₃)₄ (5,3 mg, 4,56 μmol) in DCM (500 μl) wurde zugesetzt, und die Alltech-Röhrchen wurden 10 min mecha nisch gerührt. Überschüssige Reagenzien wurden auf einem Vakuum-Verteilerstück abfiltriert und der Vorgang einmal wiederholt.
Das Peptidharz wurde mit DCM (8 × 2 ml) gewaschen, wobei das Harz jedes Mal 30 s geschüttelt wurde, und dann auf einem Vakuum-Verteilerstück filtriert. Der Waschzyklus wurde wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet.
Die Fmoc-Gruppen wurden durch Behandlung des Harzes (45,6 μmol) mit 50% Piperidin/DMF (800 μl) über einen Zeitraum von 2 h auf einer Schüttelvorrichtung entfernt. Der Überstand wurde auf einem Vakuum-Verteilerstück abfiltriert.
Die Kügelchen 175 wurden 6-mal mit DMF (4 × 2 ml), DCM (1 × 2 ml) und MeOH (1 × 2 ml) gewaschen, wobei das Harz jedes Mal 2 min geschüttelt wurde, und dann auf einem Vakuum-Verteilerstück filtriert. Der Waschzyklus wurde zweimal wiederholt und das Harz vakuumgetrocknet und vakuumgelagert.
Beispiel 14 – Cellulosepapier als laminarer Träger A. Bindung eines Fmoc-PBD (7b) an Cellulosepapier
Modifizierung des Cellulosepapiers – (Allgemeines Verfahren)
Die erforderliche Anzahl an Punkten wurde auf einem Quadrat auf dem Cellulosepapier mittels Bleistift markiert, bevor das trockene Papier mit aktivierter β-Alaninlösung (12 ml, [0,2 M Fmoc-β-Alanin aktiviert mit 0,24 M DIC und 0,4 M N-Methylimidazol]) 3 h in einem versiegelten Gefäß inkubiert wurde. Die Membran wurde mit DMF (3 × 50 ml über einen Zeitraum von 3 min) gewaschen und anschließend mit Piperidinlösung (20% Piperidin in DMF, 50 ml) 20 min lang behandelt.
Die Membran wurde mit DMF (5 × 50 ml über einen Zeitraum von 3 min) und MeOH (2 × 50 ml über einen Zeitraum von 3 min) gewaschen und getrocknet.
Fmoc-β-Alanin-OPfp-Lösung (0,3 M Fmoc-βAla-OPfp in DMSO, 1 ml) wurde an die vordefinierten Positionen auf der Membran gebunden. Nach 15 min wurde der Bindungsvorgang noch einmal wiederholt.
Die Membran wurde anschließend unter Schütteln acetyliert (2 min, mit der Vorderseite nach unten in Essigsäureanhydridlösung A, 20 ml [2% Essigsäureanhydrid in DMF], gefolgt von 30 min mit der Vorderseite nach oben in Essigsäureanhydridlösung B, 50 ml [2% Essigsäureanhydrid, 1% DIPEA in DMF]). Nach dem Waschen mit DMF (3 × 50 ml über einen Zeitraum von 3 min) wurde die Membran 20 min mit Piperidinlösung (20% Piperidin in DMF, 50 ml) behandelt, mit DMF (5 × 50 ml über einen Zeitraum von 3 min) und MeOH (2 × 50 ml über einen Zeitraum von 3 min) gewaschen.
Die Membran wurde mit Bromphenolblau-Lösung (0,01% (Gew./Vol.) Bromphenolblau in Methanol, 50 ml) angefärbt, 3 min mit Methanol gewaschen und getrocknet.
Bindung des Fmoc-PBD
Eine Lösung von Fmoc-PBD 7b, HOBt und DIC (0,3 M, 1,5 ml) in NMP wurde an den markierten Punkten auf der Membran in Form von Punkten aufgebracht. Dies wurde 1 h lang binden gelassen und wiederholt (6 ×), bis die blaue Farbe des Punktes verschwunden war. Die Membran wurde einmal mit DMF (50 ml) gewaschen und mit Essigsäureanhydridlösung B, 50 ml [2% Essigsäureanhydrid, 1% DIPEA in DMF], über einen Zeitraum von 30 min inkubiert.
Die Membran wurde 3 min lang mit DMF (5 × 50 ml), gefolgt von Methanol (2 × 50 ml) gewaschen und getrocknet.
N-Fmoc-Entschützung
Die Fmoc-Schutzgruppe wurde durch 20-minütiges Behandeln der Membran mit Piperidinlösung (20% in DMF, 20 ml) abgespalten.
Die Membran wurde anschließend 3 min lang mit DMF (5 × 50 ml) und 3 min lang mit MeOH (2 × 50 ml) gewaschen, mit Bromphenolblaulösung (50 ml) angefärbt, 3 min lang mit MeOH (50 ml) gewaschen und getrocknet.
[Die Bromphenolblaufärbung wurde durch Entfärben mit Piperidinlösung, Waschen mit DMF und MeOH und Trocknen entfernt.]
B. Bindung von Nvoc-PBD an Cellulosepapier
Bindung an das Nvoc-PBD (7a) (Beispiel 1a)
Es wurde das allgemeine Verfahren zur Modifizierung und Bindung des Fmoc-PBD 7b angewandt. Das Nvoc-PBD (7a) wurde als 0,3-M-Lösung 30 min lang gebunden und wiederholt (4 ×), bis die Bromphenolblaufärbung verschwunden war. Die Membran wurde wie zuvor beschrieben gewaschen und getrocknet.
Entschützung der Nvoc-Schutzgruppe
Die Membran wurde mehrere Stunden in einer Lösung von DMSO, das 1% Ethanolamin enthielt, bei einer Wellenlänge von 365 nm inkubiert. Nach 3-minütigem Waschen mit DMF (3 × 50 ml) und 3-minütigem Waschen mit MeOH (2 × 50 ml) wurde die Membran trocknen gelassen.
Beispiel 15 – Synphase-Kronen als feste Träger A. Bindung von Fmoc-PBD an Synphase-Kronen
Entschützung der Fmoc-Schutzgruppe
Zwei Fmoc-geschützte Rink-Amid-Kronen (Beladung 7,7 mM/g) wurden in eine Szintillationsphiole platziert und 20 min in Piperidinlösung (20% in DMF, 2 ml) unter Schütteln eingetaucht. Nach Abspülen mit DMF (3 × 2 ml) und DCM (3 × 2 ml) wur den die Kronen in einer Lösung von Bromphenolblau (0,01% (Gew./Vol.) Bromphenolblau in MeOH, 5 ml) eingetaucht, bis eine gleichmäßige Färbung erzielt wurde, und die Kronen wurden anschließend in MeOH gespült und getrocknet.
Bindung an das Fmoc-PBD
Eine Lösung von Fmoc-PBD 7b (17,18 mg, 3,08 × 10^–5 mol), HOBt (8,32 mg, 6,16 × 10^–5 mol) und Diisopropylcarbodiimid (10,62 ml, 6,16 × 10^–5 mol) in NMP (500 ml) wurde zu der Szintillationsphiole mit den Kronen zugesetzt.
Die Bindungsreaktion wurde durch den Verlust der Bromphenolblaufärbung auf den Kronen beobachtet. Die Reaktion wurde über Nacht ablaufen gelassen und wiederholt, bis es zu einem vollständigen Farbverlust kam. Die Kronen wurden anschließend mit DMF (3 × 2 ml), DCM (3 × 2 ml), MeOH (1 × 2 ml) gewaschen und lufttrocknen gelassen.
N-Fmoc-Entschützung
Eine einzelne Krone wurde in der Piperidinlösung (20% in DMF, 1 ml) 20 min lang unter Schütteln eingetaucht. Nach dem Abspülen mit DMF (3 × 1 ml) und DCM (3 × 1 ml) wurde die Krone in MeOH (1 × 1 ml) abgespült und lufttrocknen gelassen.
B. Bindung von Nvoc-PBD (7a) an Synphase-Kronen
Bindung des Nvoc-PBD (7a)
Es wurde das allgemeine Verfahren zur Modifizierung und Bindung des Fmoc-PBD 7b angewandt. Das Nvoc-PBD 7a wurde als 0,62-M-Lösung über Nacht gebunden.
Entschützung der Nvoc-Schutzgruppe
Eine einzelne Krone wurde in DMSO, das 1% Ethanolamin enthielt, (2 ml) eingetaucht und bei λ = 365 nm 2 h lang unter Schütteln bestrahlt. Nach dem Abspülen mit DMF (3 × 1 ml) und DCM (3 × 1 ml) wurde die Krone in MeOH (1 × 1 ml) abgespült und lufttrocknen gelassen.
Beispiel 16: Synthese einer Bibliothek mit 175 Mitgliedern unter Einsatz von Synphase-Kronen als festem Träger (12)
Herstellung der Kronen – N-Fmoc-Entschützung
175 Rink-Amid-Henkel-Polystyrol-Kronen der O-Reihe 124 wurden in zwei Mehrfachstiftblocks platziert, die in einem 8 × 12 großen Format angeordnet waren.

Die Kronen wurden in der Piperidinlösung (20% in DMF, 50 ml) 20 min lang unter Schütteln eingetaucht. Nach dem Abspülen mit DMF (3 × 50 ml) und DCM (3 × 50 ml) wurden die Kronen in einer Bromphenolblaulösung (0,01% (Gew./Vol.) Bromphenolblau in Methanol, 50 ml) eingetaucht, bis eine gleichmäßige Färbung erzielt wurde, und die entschützten Kronen 125 wurden anschließend in MeOH abgespült und getrocknet. Bindung des ersten Aminosäurerückstands

Aminosäure	Molekulargewicht	Reagens-Masse (mg)	Lösungsmittelvolumen (ml)
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	648,8	545,0	8,40
Fmoc-Gly-OH	297,3	254,8	8,40
Fmoc-Lys(Boc)-OH	468,5	393,5	8,40
Fmoc-Met-OH	371,5	312,1	8,40
Fmoc-Val-OH	339,4	285,1	8,40

Bindungsreagens (für sämtliche Bindungen in Beispiel 16 eingesetzt)

Reagens	Molekulargewicht	Reagens-Masse	Lösungsmittelvolumen
DIC	126,2	0,530 g	42,0
HOBt	135,1	567,4 mg	42,0

Lösungen der oben detailliert angeführten Aminosäuren und Bindungsreagenzien in NMP (200 ml) wurden auf Tiefwelt-Mikrotiterplatten aufgeteilt. Bindungsreaktionen wurden durch den Verlust der Bromphenolblaufärbung auf den Kronen beobachtet und im Allgemeinen über Nacht ablaufen gelassen. Die Kronen 126 wurden an schließend in DMF (3 × 50 ml), DCM (3 × 50 ml) gewaschen und lufttrocknen gelassen.
N-Fmoc-Entschützung

Die Kronen 126 wurden in Piperidinlösung (20% in DMF, 50 ml) 20 min lang unter Schütteln eingetaucht. Nach dem Abspülen mit DMF (3 × 50 ml) und DCM (3 × 50 ml) wurden die entschützten Kronen 127 in einer Bromphenolblaulösung (0,01% (Gew./Vol.) Bromphenolblau in Methanol, 50 ml) eingetaucht, bis eine gleichmäßige Färbung erzielt wurde, und anschließend in MeOH abgespült und getrocknet. Bindung an den zweiten Aminosäurerückstand

Aminosäure	Molekulargewicht	Reagensmasse (mg)	Lösungsmittelvolumen (ml)
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	648,8	389,3	6,0
Fmoc-Gly-OH	297,3	182,0	6,0
Fmoc-Lys(Boc)-OH	468,5	281,1	6,0
Fmoc-Gln-OH	368,4	221,0	6,0
Fmoc-His(Trt)-OH	619,7	379,4	6,0
Fmoc-Leu-OH	353,4	212,0	6,0
Fmoc-Tyr(2-CITrt)-OH	680,2	408,1	6,0

Lösungen der oben detailliert angeführten Aminosäuren und Bindungsreagenzien (in NMP, 200 ml) wurden auf Tiefwell-Mikrotiterplatten aufgeteilt. Bindungsreaktionen wurden durch den Verlust der Bromphenolblaufärbung auf den Kronen 127 beobachtet und im Allgemeinen über Nacht ablaufen gelassen. Die gebundenen Kronen 128 wurden anschließend in DMF (3 × 50 ml), DCM (3 × 50 ml) gewaschen und lufttrocknen gelassen.

N-Fmoc-Entschützung wurde wie oben durchgeführt, was die Kronen 129 ergab. Bindung an den dritten Aminosäurerückstand

Aminosäure	Molekulargewicht	Reagensmasse (mg)	Lösungsmittelvolumen (ml)
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	648,8	545,0	8,40
Fmoc-Lys(Boc)-OH	468,5	393,5	8,40
Fmoc-Gly-OH	297,3	254,8	8,40
Fmoc-Gln-OH	368,4	309,5	8,40
Fmoc-Trp-OH	426,5	358,3	8,40

Lösungen der oben detailliert angeführten Aminosäuren und Bindungsreagenzien (in NMP, 200 ml) wurden auf Tiefwell-Mikrotiterplatten aufgeteilt. Bindungsreaktionen wurden durch den Verlust der Bromphenolblaufärbung auf den Kronen beobachtet und im Allgemeinen über Nacht ablaufen gelassen. Die gebundenen Kronen 130 wurden anschließend in DMF (3 × 50 ml), DCM (3 × 50 ml) gewaschen und lufttrocknen gelassen.
N-Fmoc-Entschützung wurde wie oben durchgeführt, was die Kronen 131 ergab. Bindung des Fmoc-PBD

Reagens Molekulargewicht Reagensmasse (mg) Lösungsmittelvolumen (ml)

Fmoc-PBD 7b 558 2,346 42,0
Fmoc-PBD 7b (2,346 g in 42 ml NHP) und die oben detailliert angeführten Bindungsreagenzien (in NMP, 200 ml) wurden auf Tiefwell-Miktrotiterplatten aufgeteilt. Die Verbindungsreaktionen wurden durch den Verlust der Bromphenolblaufärbung auf den Kronen 132 beobachtet und wiederholt, bis es zu einem vollständigen Farbverlust kam. Die Kronen wurden in DMF (3 × 50 ml), DCM (3 × 50 ml) gewaschen und lufttrocknen gelassen.
N-Fmoc-Entschützung
Die Kronen 132 wurden in Piperidinlösung (20% in DMF, 50 ml) 20 min unter Schütteln eingetaucht. Nach dem Abspülen mit DMF (3 × 50 ml) und DCM (3 × 50 ml) wurden die Kronen 133 lufttrocknen gelassen.
Beispiel 17: Einsatz des Rink-Amid-Harzes als fester Träger
A. Bindung von Fmoc-PBD (7b) an das Rink-Amid-Harz Herstellung des Harzes – N-Fmoc-Entschützung
Das Fmoc-Rink-Amid-Harz 200 (50 mg, Beladung 0,63 mmol/g) wurde in DMC/DMF (1:1, 1 ml) suspendiert und 2 min lang geschüttelt. Die resultierende Lösung wurde im Vakuum entfernt und das Harz in DMF (1 ml) resuspendiert und 5 min lang geschüttelt.
Das DMF wurde aus dem Harz abgelassen und die Fmoc-Gruppe durch 20-minütige Behandlung mit Piperidinlösung (20% in DMF, 1 ml) abgelassen. Die überschüssige Piperidinlösung wurde durch Absaugen entfernt und das entschützte Harz 201 mit DMF und DCM gewaschen und trocknen gelassen.
Bindung des Fmoc-PBD
Eine Lösung von Fmoc-PBD-Propansäure 7b (70,3 mg, 1,26 × 10^–4 mol), Diisopropylcarbodiimid (20,1 ml, 1,26 × 10^–4 mol) und HOBt (17,02 mg, 1,26 × 10^–4 mol) in DMF (0,5 ml) wurde zu dem Harz 201 zugesetzt und die resultierende Aufschlämmung über Nacht geschüttelt.
Die Lösung wurde abgelassen und das gebundene Harz 202 mit DMF und DCM gewaschen. Das Harz wurde in DMF/DCM (DCM) (1 ml) resuspendiert und in zwei Portionen aufgeteilt. Die Lösungen wurden aus beiden Röhrchen entfernt, und das Harz in dem ersten Röhrchen wurde mit DCM, Methanol gewaschen und über Nacht Vakuumgetrocknet.
N-Fmoc-Entschützung
Das Harz 202 in dem zweiten Röhrchen wurde in Piperidinlösung (20% in DMF, 0,5 ml) suspendiert und 20 min lang gewaschen. Die überschüssige Piperidinlösung wurde abgelassen und das entschützte Harz 203 mit DMF, DMC und Methanol gewaschen und über Nacht vakuumgetrocknet.
B. Bindung des Nvoc-PBD (7a)
Herstellung des Harzes – N-Fmoc-Entschützung
Bindung des Nvoc-PBD (7a)
Es wurde das allgemeine Verfahren zur Modifizierung und Bindung des Fmoc-PBD 7b angewandt. Das Nvoc-PBD 7a wurde als 0,25-M-Lösung in DMF gebunden.
Beispiel 18: Bindung des Fmoc-PBD (7b) an das Aminoethyl-Photolinker-AM-Harz (210)
Herstellung des Harzes – N-Fmoc-Entschützung
Aminoethyl-Photolinker-AM-Harz 210 (50 mg, 0,21 mmol/g) wurde in zwei Alltech-Röhrchen platziert. Das Harz wurde in NMP (2 ml) suspendiert und 2 h lang quellen gelassen.
Nach Ablassen des überschüssigen Lösungsmittels wurde das entschützte Harz 211 in Piperidinlösung (20% in DMF, 0,5 ml) suspendiert und 20 min lang geschüttelt. Überschüssiges Lösungsmittel wurde abgelassen und das Harz mit DMF, DCM und NMP gewaschen.
Bindungsprotokoll des Fmoc-PBD (7b)
Eine Lösung von Fmoc-PBD-Propansäure 7b (32,22 mg, 5,78 × 10^–5 mol, 5,5 Äquivalente), PyBop (11,4 mg, 2,2 × 10^–5 mol) und DIPEA (0,05 ml) in NMP (0,5 ml) wurde zu dem Harz 211 zugesetzt, das 1 h lang geschüttelt wurde. Nach dem Ablassvorgang wurde das gebundene Harz 212 mit DCM (5 × 1 ml), Methanol (5 × 1 ml) und NMP (5 × 1 ml) gewaschen. Die Bindungsreaktion wurde 3-mal wiederholt. Das Harz in dem ersten Röhrchen wurde anschließend mit DCM (3 × 1 ml), Methanol (3 × 1 ml) und Wasser (3 × 1 ml) gewaschen und über Nacht vakuumgetrocknet.
N-Fmoc-Entschützung
Das Fmoc-PBD-Harz 212 in dem zweiten Alltech-Röhrchen wurde in Piperidinlösung (20% in DMF, 1 ml) resuspendiert und 20 min lang geschüttelt. Nach dem Ablassvorgang wurde das entschützte Harz 213 mit NMP (3 × 1 ml), DCM (3 × 1 ml), Methanol (3 × 1 ml) und schließlich Wasser (3 × 1 ml) gewaschen und über Nacht vakuumgetrocknet. Beispiel 19: Tentagel-Aminoharz A. Bindung von Fmoc-PBD (7b) an Novasyn-Tentagel-Aminoharz (220)
Herstellung des Harzes
Novasyn-Tentagel-Aminoharz 220 (50 mg, Beladung 0,28 mmol/g) wurde in zwei Alltech-Röhrchen platziert und in DCM/DMF (1:1, 1 ml) suspendiert und 2 min lang geschüttelt. Überschüssiges Lösungsmittel wurde durch Absaugen entfernt und das Harz in DMF (1 ml) resuspendiert, 5 min geschüttelt und anschließend abgelassen.
Binden des Fmoc-PBD (7b)
Eine Lösung von Fmoc-PBD-Propansäure 7b (23,44 mg, 4,2 × 10^–5 mol, 3 × Überschuss), TBTU (13,4 mg, 4,2 × 10^–5 mol) und DIPEA (7,3 ml, 4,2 × 10^–5 mol) in DMF (500 ml) wurde zu dem Harz 220 zugesetzt und die resultierende Aufschlämmung über Nacht geschüttelt.
Die Lösung wurde abgelassen und das Harz mit DMF und DCM gewaschen. Der Bindungsvorgang wurde ein zweites Mal wiederholt und das gebundene Harz 221 wie zuvor gewaschen. Das Harz in dem ersten Röhrchen wurde zusätzlich mit Methanol gewaschen und über Nacht vakuumgetrocknet.
Fmoc-Entschützung
Das Harz 221 in dem zweiten Röhrchen wurde in Piperidinlösung (20% in DMF, 0,5 ml) suspendiert und 20 min lang geschüttelt. Diese Lösung wurde abgelassen und das entschützte Harz 222 mit DMF, DMC und Methanol gewaschen und über Nacht vakuumgetrocknet.
B. Bindung des Nvoc-PBD (7a) an das Tentagelharz
Bindung des Nvoc-PBD (7a)
Es wurde das allgemeine Verfahren zur Modifizierung und Bindung des Fmoc-PBD 7b angewandt. Das Nvoc-PBD 7a wurde als eine 0,085-M-Lösung gebunden.
Entschützung der Nvoc-Schutzgruppe
Das Harz wurde mehrere Stunden in einer Lösung von DMSO, die 1% Ethanolamin enthielt, bei einer Wellenlänge von 365 nm inkubiert. Nach 3-minütigem Waschen mit DMF (3 × 50 ml) und 3-minütigem Waschen mit MeOH (2 × 50 ml) wurde die Membran trocknen gelassen.
Beispiel 20: Synthese einer PBD-Oligocarbamat-Sequenz (13)
Herstellung des Harzes (N-Fmoc-Entschützung)
Fmoc-Rink-Amid-Harz 134 (53,43 mg, Beladung 0,63 mmol/g, 3,37 × 10^–5 mol) wurde in DCM:DMF (1:1, 1 ml) suspendiert und für 2 min geschüttelt. Überschüssiges Lösungsmittel wurde durch Absaugen entfernt, das Harz in DMF (1 ml) resuspendiert und 5 min lang geschüttelt.

Überschüssiges DMF wurde durch Absaugen entfernt und die Fmoc-Gruppe durch 20-minütige Behandlung mit Piperidinlösung (20% in DMF, 1 ml) entfernt. Das Harz 135 wurde anschließend mit DMF und DCM gewaschen. Bindungsprotokoll

	Fmoc-Aminoalkyl-Carbonat	Molekulargewicht	Molanzahl 4 × Überschuss	erforderliche Masse mg
1	Fmoc-Lys(Boc)^c	619	1,35 × 10^–4	83,6
2	Fmoc-Phe^c	539	1,35 × 10^–4	72,8
3	Fmoc-Ser(^tBu)^c	535	1,35 × 10^–4	72,2
4	Fmoc-Gly^c	448	1,35 × 10^–4	60,5
5	Fmoc-Tyr(^tBu)^c	610	1,35 × 10^–4	82,4
6	Fmoc-Ile^c	504	1,35 × 10^–4	68,0
7	Fmoc-Tyr(^tBu)^c	610	1,35 × 10^–4	82,4

Eine Lösung des erforderlichen 4-Nitrophenyl-Fmoc-Aminoalkylcarbonats, HOBt (36,3 mg) und DIPEA (11 ml) in NMP (200 ml) wurden zu dem freien Aminoharz 135 zugesetzt und 4 h lang binden gelassen. Nach dem Ablassvorgang wurde das Harz 136 mit NMP und DCM gewaschen und vakuumgetrocknet.
Entschützung und Bindungszyklen wurden wiederholt, bis die Aminoalkylsequenz vollständig war (137-148).
Fmoc-geschütztes PBD (7b) (75,3 mg), HOBt (36,3 mg) und Diisopropylcarbodiimid (21,5 ml) wurden in NMP (300 ml) gelöst und zu dem freien Aminoharz 148 zugesetzt. Die Aufschlämmung wurde 24 h lang geschüttelt, abgelassen und mit NMP, DCM gewaschen und über Nacht vakuumgetrocknet, was das PBD-Harz 149 ergab.
Dieses wurde wie oben entschützt, was das ungeschützte PBD-Harz 150 ergab.
Abspaltung von dem Harz
Die Harze (149 und 150) wurden mit einer Lösung bestehend aus 95% TFA, 2,5% Wasser, 2,5% Triisopropylsilan (1 ml) 2 h bei Raumtemperatur behandelt. Die Harze wurden abfiltriert und mit einer geringen Menge TFA und DCM gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand in Acetonitril/Wasser 1:2 gelöst und zweimal lyophilisiert.
Beispiel 21: Synthese einer Bibliothek mit 289 Mitgliedern unter Einsatz von 4-Nitrophenyl-N-Fmoc-Aminoalkylcarbonaten (14)
Bildung von N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)aminoalkoholen. (Allgemeines Verfahren nach Cho et al.: Synthesis and Screening of Linear and Cyclic Oligocarbamate Libraries. Discovery of High Affinity Ligands for GPIIb/IIIa, J. Am. Chem. Soc. 120, 7706-7718 (1998), C. Y. Cho, R. S. Youngquist, S. J. Paikoff, M. H. Beresini, A. R. Herbert, L. T. Berleau, C. W. Liu, D. E. Wemmer, T. Keough und P. G. Schultz.)
Die geeignete N-Fmoc-geschützte Aminosäure (10 mmol) und Dimethoxyethan wurden unter Stickstoff in einem Eis/Salz-Bad gerührt. N-Methylmorpholin (1,11 ml, 10 mmol) und Isobutylchlorformiat (1,36 ml, 10 mmol) wurden zu der Lösung zugesetzt.
Nach 1-minütigem Rühren unter Stickstoff wurde der Feststoff abfiltriert und Natriumborhydrid (570 mg, 15 mmol) in Wasser (20 ml) zu dem Filtrat zugesetzt. Eine zusätzliche Menge Wasser (150 ml) wurde nach 20 min zugesetzt und die Lösung 1 h bei Raumtemperatur rühren gelassen.
Das ausgefällte Produkt wurde filtriert und mit einer geringen Menge Wasser, gefolgt von Hexan gewaschen. Der Feststoff wurde in Ethylacetat wiedergelöst, unter Einsatz von MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
Für jene Aminoalkoholderivate, die nicht aus der Lösung ausfielen, wurde die Lösung mit Etyhlacetat (5 × 300 ml) extrahiert. Der organische Extrakt wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
Fmoc-Aminoalkohole wurden ohne weitere Reinigung eingesetzt, wobei die Daten für die Aminoalkohole in Anhang 1 angeführt sind.
Bildung von 4-Nitrophenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminoalkylcarbonaten (Allgemeines Verfahren nach Cho et al.)
Zu dem geeigneten N-Fmoc-Aminoalkohol (10 mmol) wurden Pyridin (11 mmol) und DCM (50 ml) zugesetzt. Eine Lösung von 4-Nitrophenylchlorformiat (11 mmol) in DCM (10 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch zugetropft. Das Gemisch wurde zumindest 24 h lang gerührt.
Das Gemisch wurde mit DCM (100 ml) verdünnt und mit 1,0 M Natriumbisulfat (3 × 75 ml) und 1,0 M Natriumbicarbonat (10 × 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde unter Einsatz von MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
Das Rohprodukt wurde mittels Kieselgelchromatographie (9:1 DCM/Hexan DCM) gereinigt. Die Daten für das Aminoalkylnitrophenylcarbonat sind in Anhang 2 angeführt.
Bibliothekssynthese
Herstellung des Harzes
Rink-Amid-MBHA-Harz 151 (8,67 g, Beladung 0,54 mmol/g) wurde in einer Lösung von DCM/DMF (3:1) suspendiert und zwischen 289 Irori^TM-MicroKan-Reaktoren, die RF-Markierungen enthielten, aufgeteilt.
Die Kan-Reaktoren wurden in einer Lösung von DCM/DMF (1:1, 300 ml) eingetaucht und 1 min lang stark geschüttelt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und die Kan-Reaktoren wurden wieder in DMF eingetaucht und 10 min lang stark geschüttelt.
Das DMF wurde abgelassen und die Fmoc-Gruppe durch Zugabe einer Piperidinlösung (20% in DMF, 300 ml) zu den Kan-Reaktoren, gefolgt von 5-minütigem Schütteln und Ablassen entfernt. Es wurde eine zusätzliche Piperidinlösung zugesetzt (20% in DMF), und die Kan-Reaktoren wurden 1 h lang geschüttelt. Die Kan-Reaktoren mit dem entschützten Harz 152 wurden abgelassen und mit DMF (6 × 300 ml) und DCM (3 × 300 ml) gewaschen.
Bindung des ersten 4-Nitrophenylfluorenylmethoxyaminoalkylcarbonats
Eine Lösung von Fmoc-Valin^c (6,88 g, 4,86 × 10^–5 mol, 3 × Überschuss), HOBt (3,795 g, 9,72 × 10^–5 mol) und DIPEA (1,22 ml, 2,43 × 10^–5 mol) in NMP (300 ml) wurden zu den Kan-Reaktoren zugesetzt und 4 h lang binden gelassen.
Nach Ablassen wurden die Kan-Reaktoren mit dem gebundenen Harz 153 mit NMP (3 × 300 ml) und DMC (3 × 300 ml) gewaschen.
Fmoc-Entschützung

Die Fmoc-Schutzgruppe wurde durch die Zugabe von Piperidinlösung zu den Kan-Reaktoren (20% in DMF, 300 ml), gefolgt von 1-stündigem Schütteln entfernt. Die Kan-Reaktoren mit dem entschützten Harz 154 wurden abgelassen und mit DMF (3 × 300 ml) und DCM (3 × 300 ml) gewaschen. Bindung des zweiten 4-Nitrophenylfluorenylmethoxyaminoalkylcarbonats

Fmoc-Aminoalkylnitrophenylcarbonat	Masse (mg)
Ala	382
Asn	417
Asp(O^tBu)	467
Arg(Pbf)	673
Gin	428
Glu(O^tBu)	449
Gly	370
Ile	416
Leu	416
Lys(Boc)	511
Met	430
Phe	445
Pro	477
Ser(^tBu)	442
Thr(^tBu)	453
Tr	477
Tyr(^tBu)	504

Die Kan-Reaktoren mit dem Harz 154 wurden mittels ihrer Rf-Markierungen in 17 Kolben aufgeteilt, die die Lösungen des geeigneten 4-Nitrophenyl-Fmoc-Aminoalkylcarbonats (8,262 × 10^–4 mol), HOBt (223 mg, 1,6524 × 10^–3 mol) und DIPEA (71,4 ml, 4,131 × 10^–4 mol) in NMP (15 ml) enthielten. Die Kan-Reaktoren wurden 4 h lang geschüttelt, abgelassen und mit NMP (3 × 100 ml) und DCM (3 × 100 ml) gewaschen und enthielten anschließend das gebundene Harz 155.
N-Fmoc-Entschützung

Die 289 Kan-Reaktoren mit dem gebundenen Harz 155 wurden in einem Kolben gesammelt und die Fmoc-Schutzgruppe durch 1-stündige Behandlung mit Piperidinlösung (20% in DMF, 300 ml) entfernt. Die Kan-Reaktoren mit dem entschützten Harz 156 wurden abgelassen und mit DMF (3 × 300 ml) und DCM (3 × 300 ml) gewaschen. Bindung des dritten 4-Nitrophenylfluorenylmethoxyaminoalkylcarbonats

Fmoc-Aminoalkylnitrophenylcarbonat	Masse (mg)
Ala	382
Asn	417
Asp(O^tBu)	467
Arg(Pbf)	673
Gln	428
Glu(O^tBu)	449
Gly	370
Ile	416
Leu	416
Lys(Boc)	511
Met	430
Phe	445
Pro	477
Ser(^tBu)	442
Thr(^tBu)	453
Trp	477
Tyr(^tBu)	504

Die Kan-Reaktoren mit dem Harz 156 wurden mittels ihrer Rf-Markierungen in 17 Kolben aufgeteilt, die die Lösungen des geeigneten 4-Nitrophenyl-Fmoc-Aminoalkyl carbonats (8,262 × 10^–4 mol), HOBt (223 mg, 1,6524 × 10^–3 mol) und DIPEA (71,4 ml, 4,131 × 10^–4 mol) in NMP (15 ml) enthielten. Das Harz in den Kan-Reaktoren wurde 4 h lang binden gelassen, wodurch das gebundene Harz 157 gebildet wurde. Nach Ablassen wurden die Kan-Reaktoren wurden mit NMP (3 × 100 ml) und DCM (3 × 100 ml) gewaschen.
N-Fmoc-Entschützung wurde wie oben durchgeführt, was das Harz 158 in den Kan-Reaktoren ergab.
Bindung des Fmoc-PBD (7b)
Eine Lösung von Fmoc-PBD (7b) (7,84 g, 1,40 × 10^–2 mol, 3 × Überschuss), HOBt (1,896 g, 1,40 × 10^–2 mol) und Diisopropylcarbodiimid (2,18 ml, 1,40 × 10^–2 mol) in NMP (300 ml) wurde zu den 289 Kan-Reaktoren mit dem Harz 158 zugesetzt. Die Kan-Reaktoren, die anschließend das gebundene Harz 159 enthielten, wurden mit NMP (3 × 300 ml) und DCM (3 × 300 ml) gewaschen.
N-Fmoc-Entschützung wurde wie zuvor durchgeführt, was das Harz 160 in den Kan-Reaktoren ergab.
Beispiel 22: Synthese einer Bibliothek mit 27 Mitgliedern unter Einsatz von Peptoiden (Irori-Verfahren) (15)
Herstellung des Harzes
Rink-Amid-MBHA-Harz 151 (810 mg, Beladung 0,54 mmol/g) wurde in einer Lösung von DCM/DMF (3:1, 5,4 ml) suspendiert und auf 27 Irori-MikroKan-Reaktoren, die RF-Markierungen enthielten, aufgeteilt.
Die Kan-Reaktoren wurden in einer Lösung von DCM/DMF (1:1, 50 ml) eingetaucht und 1 min lang stark geschüttelt. Diese Lösung wurde im Vakuum entfernt, und die Kan-Reaktoren wurden wieder in DMF eingetaucht und 10 min lang stark geschüttelt.
Das DMF wurde abgelassen, und die Fmoc-Gruppe des Harzes 151 wurde durch Zugabe von Piperidinlösung (20% in DMF, 50 ml) zu den Kan-Reaktoren entfernt. Diese wurden 5 min lang geschüttelt und abgelassen. Es wurde zusätzliche Piperidinlösung zugesetzt (20% in DMF, 50 ml), und die Kan-Reaktoren wurden 1 h lang geschüttelt. Die Kan-Reaktoren mit dem entschützten Harz 152 wurden abgelassen und mit DMF (6 × 50 ml) gewaschen.
Acylierungsschritt
Bromessigsäurelösung (0,6 M in DMF, 60 ml) wurde zu den Kan-Reaktoren mit dem Harz 152 zugesetzt, gefolgt von Diisopropylcarbodiimidlösung (3,2 M in DMF, 14,1 ml). Diese wurden 2 h lang bei Raumtemperatur geschüttelt, abgelassen und der Vorgang wiederholt. Die Kan-Reaktoren mit dem Bromacetamidharz 161 wurden anschließend mit DMF (2 × 50 ml) und DMSO (1 × 50 ml) gewaschen.
Ersetzungsschritt
Die 27 Kan-Reaktoren wurden mittels ihrer RF-Markierungen auf 3 Kolben aufgeteilt. Der erste Satz wurde in wässriger Methylaminlösung (40% (Gew./Vol.), 20 ml), der zweite Satz in Piperonylaminlösung (2 M in DMSO, 20 ml) und der dritte Satz in 2-Methoxyethylamin (2 M in DMSO, 20 ml) suspendiert. Diese wurden 4 h lang stark geschüttelt und anschließend abgelassen. Die Kan-Reaktoren mit dem aminogebundenen Harz 162 wurden mit DMSO (2 × 20 ml) und DMF (1 × 20 ml) gewaschen.
Die Acylierungs- und Ersetzungsschritte wurden zweimal wiederholt, was das Harz 166 ergab (das eine Bibliothek aus 27 Harzen ist, wobei sämtliche Kombinationen der 3 Werte für R₁, R₂ und R₃ vorhanden sind).
Bindung des Fmoc-PBD (7b)
Die 27 Kan-Reaktoren mit dem peptoidhältigen Harz 166 wurden rekombiniert, und es wurde eine Lösung von Fmoc-PBD (7b) (976,3 mg, 1,75 mmol, 4 × Überschuss), HOBt (236,4 mg, 1,75 mmol) und Diisopropylcarbodiimid (22,08 mg, 1,75 mmol) in DMF (20 ml) zugesetzt. Diese Lösung wurde 24 h lang stark gerührt und abgelassen. Die Kan-Reaktoren mit dem Fmoc-PBD-gebundenen Harz 167 wurden mit DMF (3 × 50 ml) und DCM (3 × 50 ml) gewaschen.
N-Fmoc-Entschützung
Die Fmoc-Schutzgruppe wurde aus dem PBD-Harz 167 durch Zugabe von Piperidinlösung (20% in DMF, 50 ml) zu den Kan-Reaktoren entfernt. Dies wurde 5 min lang geschüttelt und abgelassen. Es wurde zusätzliche Piperidinlösung zugesetzt (20% in DMF, 50 ml), und die Kan-Reaktoren wurden 1 h lang geschüttelt. Die Kan-Reaktoren mit dem entschützten Harz 168 wurden abgelassen und mit DMF (3 × 50 ml), DCM (3 × 50 ml), Methanol (2 × 50 ml) gewaschen und über Nacht vakuumgetrocknet. In der Bibliothek eingesetzte Amine
ANHANG
Daten für Aminoalkohole einschließlich Ausbeute (%) und NMR

Ala: –74% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ 7.88 (d, 2, J = 7.1 Hz), 7.71 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.31-7.42 (dt, 4), 7.09 (d, 1, J = 8.1 Hz), 4.28 (m, 4), 3.54 (m, 1), 3.36 (m, 1), 3.26 (m, 1), 1.04 (d, 3, J = 6.6 Hz). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ 155.5, 143.9 140.7 127.5, 127.0, .1, 120.0, 65.1 64.4, 48.4 46.7 17.3
Arg(Pbf): ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.81 (d, 2, J = 7.7 Hz), 7.66 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.29-7.38 (dt, 4), 6.54 (s, br, 1), 4.31 (m, 2), 4.18 (t, 1, J = 6.95 Hz), 4.06 (q, 2, J = 6.95 Hz), 3.63 (m, 1), 3.53 (m, 2), 3.21 (m, 2), 2.94 (m, 2), 2.60 (s, 4), 2.51 (s, 3), 1.96 (s, 2), 1.38 (m, 10), 1.19 (t, 2, J = 7 Hz), 0.89 (m, 1). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 158.9, 157.3, 145,1 145.0, 138.7, 135.3, 132.8, 128.4, 127.9, 126.1, 125.3, 120.7, 117.5, 86.9, 66.8, 62.3, 60.5, 53.7, 48.1, 43.6, 41.6, 20.8, 19.5, 18.2, 14.5, 12.5.
Asp(OtBu): –84% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.88 (d, 2, J = 7.5 Hz), 7.69 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.30-7.45 (dt, 4), 7.16 (d, 1, J = 8.8 Hz), 4.84 (m, 1), 4.31 (m, 3), 3.87 (m, 1), 3.39 (m, 2), 2.26 (m, 1), 1.37 (s, 9). 13C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 170.4, 155.5, 143.8, 140.7, 127.5, 127.0, 125.1,120.0, 79.6,65.2, 62.9, 50.2, 46.7, 27.6.
Asn: –56% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.96, 7.88 (s, d, 2, J = 7.5 Hz), 7.70, (m, 2), 7.31-7.43 (dt, 4), 4.34 (m, 4), 3.74 (m, 3), 3.62 (t, 1, J = 4.6 Hz), 3.44 (m, 1), 2.52 (m, 2). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 162.3, 155.6, 143.7, 140.6, 127.6, 125.2, 125.0, 120.0, 65.2, 54.1, 46.6, 46.5.
Gln: –86% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.96, 7.87 (s, d, 3, J = 7.3 Hz), 7.70 (d, 2, J = 7.1 Hz), 7.30-7.42 (dt, 4), 7.13 (d, 1, J = 8.6 Hz), 4.74 (s, br, 1), 4.24 (m, 3), 3.43 (m, 5), 2.89 (s, 2), 2.73 (s, 2), 2.45 (m, 3), 2.03 (s, 3), 1.80 (m, 1), 1.59 (m, 1). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 162.2, 155.9, 143.9, 143.8, 140.7, 127.5, 126.9, 125.1, 124.7, 120.0, 65.1, 63.2, 52.0, 46.7, 35.7, 30.5, 29.9, 14.6.
Glu(OtBu): –71% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.88 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.71 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.31-7.45 (dt, 4), 7.05 (d, 1, J = 8.6 Hz), 4.24 (m, 3), 4.02 (q, 1, J = 7.1 Hz), 3.37 (m, 2), 2.20 (m, 2), 1.40 (s, 9). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 172.1, 155.9, 143.9, 143.8, 140.7, 127.5, 126.7, 125.2, 120.0, 79.3, 65.1, 63.3, 52.1, 46.8, 31.5, 27.7, 26.3
Gly: –79% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.88 (d, 2, J = 7.1 Hz), 7.69 (d, 2, J = 7.1 Hz), 7.24-7.42 (m, 5), 4.66 (t, 1, J = 5.5 Hz), 4.29 (m, 3), 3.38 (m, 2), 3.09 (q, 2, J = 6 Hz). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 156.2, 143.9, 140.7, 127.5, 127.0, 125.1, 120.0, 65.2, 59.8, 46.7, 43.0.
Ile: –72% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.88 (d, 2, J = 7.1 Hz), 7.73 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.29-7.42 (m, 4), 7.03 (d, 1, J = 8.4 Hz), 4.51 (m, 1), 4.23 (m, 3), 3.42 (m, 3), 0.84 (m, 6). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 156.1, 144.0, 143.8, 140.7, 127.5, 126.9, 125.2, 120.0, 65.1, 61.1, 57.0, 46.8, 35.3, 24.6, 15.4, 11.3.
Leu: –88% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.88 (d, 2, J = 7.5 Hz), 7.71 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.30-7.44 (dt, 4), 6.99 (d, 1, J = 8.8 Hz), 4.24 (m, 3), 3.54 (m, 1), 3.35 (m, 2), 1.62 (m, 1), 1.30 (m, 2), 0.87 (m, 6). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 155.9, 144.0, 143.8, 140.7, 127.5, 126.9, 125.2, 125.2, 120.0, 65.0, 64.1, 50.9, 46.8, 24.2, 23.4, 21.7.
Lys(Boc): –95% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.88 (d, 2, J = 7.7 Hz), 7.72 (d, 2, J = 7.0 Hz), 7.30-7.42 (dt, 4), 4.23 (m, 3), 4.01 (q, 1, J = 7.0 Hz), 2.89 (m, 2), 1.37 (m, 12), 1.17 (t, 2, J = 7.1 Hz), 0.89 (d, 1, J = 6.6 Hz). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 155.9, 155.5, 143.9, 143.9, 143.3, 140.7, 127.7, 127.5, 127.0, 125.1, 120.0, 77.2, 65.1, 63.5, 597, 52.8, 46.7, 46.6, 29.5, 28.2, 22.8, 20.7, 18.7, 14.0.
Met: –52% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.91, 7.72 (m, d, 4, J = 6.6 Hz), 7.34 (m, 4), 7.08 (d, 1, J = 8,1 Hz), 6.75 (m, 1), 4.28 (m, 3), 3.42 (m, 3), 2.89 (s, 2), 2.74 (s, 2), 2.11 (m, 2), 1.81 (m, 1), 1.56 (m, 1). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 162.2, 155.9, 143.9, 140.7, 127.6, 127.0, 125.2, 120.0, 119.9, 65.2, 63.3, 52.6, 46.7, 26.8.
Phe: –94% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.87 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.65 (m, 2), 7.24-7.41 (m, 10), 4.81 (t, 1, J = 5.5 Hz), 4.16 (m, 3), 3.67 (m, 1), 3.39 (m, 2), 2.87 (dd, 1, J = 4.9, 8.6 Hz), 2.67 (m, 1). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 155.6, 143.8, 140.6, 139.2, 1291, 128.0, 127.5, 127.0, 125.8, 125.2, 125.1, 120.0, 65.1, 62.9, 54.6, 46.6.
Pro: –73% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.88 (d, 2, J = 6.7 Hz), 7.65 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.31-7.43 (dt, 4), 4.74 (m, 1), 4.30 (m, 3,), 3.73 (m, 1), 3.27 (m, 3,), 1.86 (m, 4), 1.17 (t, 1, J = 7.1). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 154.1, 143.9, 140.8, 127.6, 127.0, 125.0, 120.0, 66.4, 66.2, 61.8, 61.1, 59.7, 58.9, 58.3, 46.8, 46.3, 27.7, 26.9, 23.2, 22.4, 20.7, 14.0.
Ser(tBu): –76% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.88 (d, 2, J = 7.5 Hz), 7.11 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.30-7.45 (dt, 4), 6.99 (d, 1, J = 8.1 Hz), 4.24, 3.74, 3.30-3.56 (m, m, m, 11), 1.12 (s, 9). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 155.9, 144.0, 143.9, 140.8, 127.6, 127.1, 125.3, 125.3, 120.1, 72.4, 65.3, 60.7, 53.6, 46.8, 27.4, 18.9.
Thr(tBu): ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.90 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.70 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.28-7.44 (dt, 4), 6.89 (d, 1, J = 8.1 Hz), 4.23 (m, 3), 3.68 (m, 1), 3.29 (m, 1), 2.73 (m, 1), 1,15 (m, 12). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 155.6, 143.9, 143.7, 140.8, 127.5, 127.1, 125.2, 125.2, 120.2, 72.3, 65.3, 60.7, 53.6, 46.8, 27.3, 18.6, 17.9.
Trp: –89% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 10.81 (s, 1), 7.86 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.67 (m, 3), 7.34 (m, 5), 6.96-7.14 (m, 4), 4.76 (t, 1, J = 5.3 Hz), 4.24 (m, 3), 3.77 (m, 1), 3.41 (m, 2), 2.94, 2.5 (m, 2). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 155.8, 143.9, 140.6, 136.1, 127.5, 127.5, 127.0, 125.2, 125.2, 123.1, 120.7, 112.0, 118.4, 118.1, 111.4, 111.2, 65.2, 62.8, 53.8, 46.7, 26.7.
Tyr(tBu): –88% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.87 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.66 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.31-7.41 (m, 4), 7.11 (m, 3), 6.82 (d, 2, J = 8.2 Hz), 4.79, (t, 1, J = 5.5 Hz), 4.13 (m, 3), 3.64 (m, 1), 3.38 (m, 1), 2.82 (dd, 1, J = 4.8, 9.0 Hz), 1.19 (s, 9). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 155.6, 153.0, 143.9, 143.8, 140.6, 133.8, 129.5, 127.5, 126.9, 125.2, 125.1, 123.3, 112.0, 77.4, 65.2, 63.0, 54.6, 46.6, 28.4.
Val: –96% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 7.88 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.73 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.32-7.41 (dt, 4), 4.24 (m, 3), 3.89 9d, 1, J = 6.2 Hz), 3.39 (m, 2), 0.86 (m, 6), 0.54 (t, 1, J = 7.1 Hz). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 156.3, 152.7, 143.9, 143.9, 140.7, 127.5, 126.9, 125.2, 120.0, 65.2, 61.4, 57.9, 46.8, 46.2, 28.4, 19.5, 18.6, 17.9.

ANHANG 2
Daten für Aminoalkylnitrophenylcarbonate einschließlich Ausbeute (%), NMR (δ/ppm, d₆-Aceton)

Ala: ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.32 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.85 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.71 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.56 (d, 2, J = 9.3 Hz), 7.30-7.41 (m, 7), 4.07-4.44 (m, 6), 1.24 (d, 3, J = 6.6 Hz). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.4, 156.7, 156.5, 153.1, 146.1, 145.0, 144.9, 141.9, 128.3, 127.8, 126.0, 125.9, 123.1, 120.7, 72.1, 66.5, 47.7, 46.3, 17.1.
Arg(Pbf): ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.13 (d, 2, J = 4.9 Hz), 7.68 (d, 4, 7.7 Hz), 7.52 (d, 4, J = 7.8 Hz), 7.24-7.37 (d, 10, J = 9.3 Hz), 4.07-4.22 (m, 6), 3.87 (m, 9, 1), 3.37 (m, 2), 2.47 (d, 6, J = 3.1 Hz), 1.26 (m, 12). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 207.3, 160, 158.3, 157.7, 154.3, 147.4, 146.2, 146.1, 145.9, 143.1, 139.8, 136.5, 133.9, 129.5, 129.5, 128.9, 127.0, 124.1, 121.8, 121.8, 88.0, 80.2, 72.5, 67.9, 67.8, 66.1, 49.2, 49.1, 44.6, 29.7, 27.8, 20.5, 19.3, 19.2, 13.6.
Asp (OtBu): –74% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.31 (d, 2, J = 9.5 Hz), 7.86 (d, 2, J = 7.7 Hz), 7.54 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.39 (m, 6), 4.37 (m, 4), 4.24 (m, 1), 4.06 (q, 1, J = 6.9 Hz), 2.66 (m, 1), 1.46 (s, 9). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.1, 170.3, 156.7, 153.2, 146.4, 145.0, 142.1, 128.5, 126.8, 126.0, 123.1, 120.8, 81.3, 70.7, 67.1, 48.2, 37.9, 28.2.
Asn: 10% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.31 (d, 1, J = 9.5 Hz), 8.14 (m, 2), 7.98 (m, 1), 7.83 (d, 1, J = 7.3 Hz), 7.67 (t, 1, J = 8.1 Hz), 7.53 (d, 1, J = 9.2 Hz), 73.0-7.39 (dt, 3), 6.99 (m, 2), 4.41 (m, 2), 4.24 (m, 1), 2.94 (m, 2), 2.79 (s, 2). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.3, 164.4, 163.1, 156.8, 156.6, 153.1, 144.9, 142.1, 141.6, 128.5, 127.9, 127.8, 126.1, 123.1, 120.8, 116.5, 79.2, 73.8, 69.6, 67.3, 48.0, 36.3, 20.6.
Gln: –17% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.31 (dd, 2, J = 2.7 Hz, 5.5 Hz), 8.16 9dd, 1, J = 2.2 Hz, 4.8 Hz), 7.83 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.68 (m, 2), 7.27-7.54 (dt, m, 6), 7.03 (dd, 1, J = 2.2 Hz, 4.8 Hz), 6.65 (d, 1, J = 8.4 Hz), 4.21-4.46 (m, 5), 2.59 (m, 2), 1.92 (m, 2). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.2, 157.1, 156.7, 153.3, 145.1, 144.9, 142.1, 128.5, 127.9, 126.8, 126.3, 123.1, 120.8, 116.6, 71.3, 66.9, 50.2, 48.1, 15.3.
Glu(OtBu): –76% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.30 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.83 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.69 (m, 2), 7.50 (d, 1, J = 6.9 Hz), 7.39 (m, 4), 4.39 (m, 2), 4.26 (m, 2), 4.06 (m, 1), 2.38 (m, 1), 1.44 (s, 9). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.2, 172.6, 157.1, 156.7, 153.2, 146.3, 145.1, 144.9, 142.1, 128.5, 127.9, 126.0, 123.1, 120.8, 80.5, 71.4, 66.9, 50.4, 49.0, 32.3, 27.0.
Gly: –30% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.29 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.84 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.68, (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.54, (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.31-7.4, (dt, 4), 4.39 (m, 4), 4.24, (t, 1, J = 6.9 Hz), 3.56, (q, 2, J = 5.1 Hz). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.1, 157.4, 156.7, 153.3, 146.4, 145.1, 142.1, 128.5, 127.9, 126.3, 126.0, 123.1, 120.8, 68.8, 67.1, 48.1, 40.4.
Ile: –91% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.26 (d, 2, J = 9.2 Hz), 7.82 (d, 2, J = 7.5 Hz), 7.68 (m, 2), 7.50 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.26-7.47 (dt, 3), 4.20-4.51 (m, 3), 3.92 (m, 1), 1.60 (m, 1), 1.19 (m, 1), 1.01, 0.92 (d, t, 3, J = 6.8 Hz, 7.3 Hz). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.3, 156.7, 153.3, 145.4, 144.1, 142.1, 128.5, 127.9, 127.8, 126.1, 126.0, 123.1, 120.8, 70.2, 66.9, 54.9, 54.8, 48.1, 36.7, 15.7, 11.4.
Leu: –88% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.27 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.83 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.67 (t, 2, J = 5.8 Hz), 7.51 (m, 2,), 7.29-7.49 (dt, 4), 4.38 (m, 3), 4.22 (m, 3), 1.77 (m, 1), 1.55 (m, 1), 1.37 (m, 1), 0.94 (m, 6). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 205.4, 156.4, 155.9, 152.5, 145.6, 144.4, 144.2, 141.3, 127.7, 127.1, 127.1, 125.2, 122.3, 112.0, 71.3, 66.1, 48.2, 47.3, 24.5, 22.7, 21.3.
Lys(Boc): –64% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.30 (m, 1), 7.86 (m, 2), 7.52 (m, 2), 7.31-7.40 (m, 5), 4.23-4.37 (m, 3), 3.08 (m, 2), 1.39 (m, 14). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.2, 157.2, 156.7, 146.4, 145.1, 145.0, 142.1, 128.5, 127.9, 126.8, 126.0, 123.7, 123.1, 120.8, 116.5, 78.4, 71.6, 67.3, 66.9, 50.9, 48.1, 48.0, 40.8, 40.7, 23.8.
Met: –13% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.29 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.83 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.69 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.39 (m, 4), 4.17-4.42 (m, 3), 3.60-3.71 (m, 2). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 205.5, 156.4, 144.4, 144.2, 141.3, 127.7, 127.7, 125.3,125.3, 122.3, 120.0, 70.6, 66.0, 50.8, 47.4, 29.3, 29.1, 13.5.
Phe: –36.% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.28 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.82 (d, 2, J = 7.5 Hz), 7.62 (m, 2), 7.51, 7.38-7.18 (d, m, m, 10, J = 9.1 Hz), 6.75 (d, 1, J = 7.9 Hz), 4.46 (d, 1, J = 6.59), 4.31 (m, 3), 4.18 (m, 1), 2.97 (m, 2). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.2, 156.9, 156.7, 153.2, 146.4, 145.0, 142.0, 138.8, 130.1, 129.2, 128.4, 127.9, 127.3, 126.8, 126.0, 123.1, 120.7, 70.9, 66.9, 52.4, 48.0, 37.7.
Pro: –50.% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.30 (d, 2, J = 8.8 Hz), 7.84, (d, 2, J = 7.7 Hz), 7.67 (d, 2, J = 7.7 Hz), 7.54 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.31-7.40 (m, 4), 4.37, 4.29, 404 (m, 6), 3.45 (m, 2), 2.05 (m, 1), 1.96 (m, 3). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 205.4, 155.9, 154.8, 152.5, 145.6, 144.4, 141.4, 127.7, 127.2,125.2, 125.0, 122.4, 120.0, 69.0, 66.8, 55.9, 47.4, 27.4, 23.7, 20.0.
Ser(tBu): –53% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.31 (m, 1), 7.84 (d, 2, J = 7.7 Hz), 7.69 (d, 2, J = 7.5 Hz), 7.53 (d, 1, J = 9.4 Hz), 7.42-7.31 (m, 5), 4.35 (m, 4), 3.65 (m, 4), 2.93 (d, 1, J = 3.3 Hz), 1.17 (m, 11), 0.92 (d, 1, J = 6.6 Hz). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.1, 156.9, 156.7, 153.2, 145.1, 142.1, 128.5, 128.4, 127.9, 126.1, 126.0, 120.7, 116.5, 79.2, 73.7, 73.4, 69.2, 67.0, 66.9, 62.4, 61.7, 54.2, 51.3, 48.1, 48.0, 47.9, 27.2, 19.2.
Thr(tBu): –45% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.30 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.84 (d, 2, J = 7.7 Hz), 7.68 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.51 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.28-7.49 (dt, 4), 6.4 (d, 1, J = 9.2 Hz), 4.46, 4.39, 4.24 (dd, d, m, 5, J = 4.8 Hz, 10.9 Hz, 7.3 Hz), 3.96-4.03 (m, 2), 1.21 (m, 12). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 205.4, 156.6, 155.9, 152.5, 145.6, 144.4, 144.2, 141.3, 127.7, 127.1, 125.2, 122.3, 120.0, 73.7, 68.3, 66.3, 65.9, 60.6, 55.4, 54.9, 54.1, 47.3, 18.7.
Trp: –64% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.30 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.85 (d, 2, J = 7.7 Hz), 7.69 (m, 3), 7.52 (d, 2, J = 8.8 Hz), 7.24-7.42 (m, 2), 4.35 9m, 6), 3.08 (d, 2, J = 4.0 Hz). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.4, 156.9, 156.4, 153.0, 146.1, 144.1, 144.8, 141.8, 137.4, 128.3, 127.7, 126.0, 125.7, 124.2, 123.1, 121.7, 120.6, 119.2, 119.0, 112.2, 70.8, 66.5, 51.5, 47.8, 27.5.
Tyr(tBu): –50% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.30 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.84 (d, 2, J = 7.7 Hz), 7.64 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.52 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.29-7.38 9m, 6), 6.90 (d, 2, J = 8.42 Hz), 4.14-4.45 (m, 7), 2.89 (m, 4), 1.24 (s, 10). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ, 206.2, 156.9, 156.7, 155.1, 153.2, 146.3, 145.0, 142.0, 133.3, 130.8, 130.5, 128.4, 127.9, 126.0, 124.7, 123.1, 120.7, 78.4, 70.9, 66.9, 52.5, 52.4, 48.0, 37.0.
Val: –62% ¹H-NMR (270 MHz, d₆-Aceton): δ, 8.30 (d, 2, J = 9.1 Hz), 7.83 (d, 2, J = 7.3 Hz), 7.70 (d, 2, J = 7.1 Hz), 7.54 (d, 2, J = 9.2 Hz), 7.30-7.44 (m, 4), 4.10-4.44 (m, 6), 3.89 (d, 1, J = 6.2 Hz), 0.86 (m, 6). ¹³C-NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): δ NMR (67.8 MHz, d₆-Aceton): d, 206.2, 156.4, 155.8, 152.3, 146.1, 145.3, 141.9, 128.5, 127.9, 127.1, 125.9, 123.1, 119.9, 71.2, 66.2, 48.1, 47.5, 24.3, 22.7.

Claims

Sammlung von Verbindungen, die alle dargestellt sind durch entweder: (1) Formel II:
worin: A O, S, NH oder eine Einfachbindung ist; R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus: H, R, OH, OR, =O, =CH-R, =CH₂, CH₂-CO₂R, CH₂-CO₂H, CH₂-SO₂R, O-SO₂R, CO₂R, COR, CN, und gegebenenfalls liegt eine Doppelbindung zwischen C1 und C2 oder C2 und C3 vor; R₆, R₇ und R₉ unabhängig voneinander aus H, R, OH, OR, Halogen, Nitro, Amino, Me₃Sn ausgewählt sind; worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, wovon die Alkylgruppe gegebenenfalls eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen oder -Dreifachbindungen enthält, die Teil eines konjugierten Systems bilden können, oder eine Arylgruppe mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist; und gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- oder Nitrogruppen substituiert ist; Y eine zweiwertige Gruppe ist, sodass HY = R ist; X' CO, NH, S oder O ist; T ein Aminosäurerest; und n eine positive ganze Zahl ist; (2) Formel VIII:
worin X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T wie oben definiert sind; n und m positive ganze Zahlen sind oder eines davon gegebenenfalls Null ist; T' ein Aminosäurerest ist, worin jedes T' unterschiedlich sein kann, wenn m größer als 1 ist; T'' ein Aminosäurerest ist, der eine Bindungsstelle für X' bereitstellt; und p eine positive ganze Zahl ist, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'' für jede Grundeinheit und die Werte von n und m unabhängig voneinander gewählt sind;
worin X', Y, A, R₇, R₂, R₃, R₆, R₉, T, T', T'', n, m und p wie oben in Teil (2) definiert sind; und X'', Y', A', R'₇, R'₂, R'₃, R'₆, R'₉ aus den gleichen Möglichkeiten wie X', Y, A, R₇, R₂, R₃, R₆ bzw. R₉ gewählt sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T' und T'' für jede Grundeinheit und die Werte von n und m unabhängig voneinander gewählt sein können; oder (4) Formel XVI:
worin X', Y, A, R₇, R₂, R₃, R₆, R₉, T, T', T'', n, m und p wie oben in Teil (2) definiert sind; und T''' und q aus den gleichen Möglichkeiten wie T bzw. n ausgewählt sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von T, T', T'', T''' für jede Grundeinheit und die Werte von n, m und q unabhängig voneinander gewählt sein können.
Sammlung von Verbindungen nach Anspruch 1, worin R und HY unabhängig voneinander aus Niederalkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen aufgewählt sind, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- oder Nitrogruppen substituiert sind.
Sammlung von Verbindungen nach Anspruch 2, worin R oder HY unabhängig voneinander aus unsubstituierten, unverzweigten oder verzweigten Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind.
Sammlung von Verbindungen nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin R₇ aus einer oder mehrerer der Formeln II, VIII, XII und XVI eine elektronenspendende Gruppe ist.
Sammlung von Verbindungen nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin R₆ und R₉ aus einer oder mehrerer der Formeln II, VIII, XII und XVI H sind.
Sammlung von Verbindungen nach Anspruch 4, worin R₇ aus einer oder mehrerer der Formeln II, VIII, XII und XVI eine Alkoxygruppe ist.
Sammlung von Verbindungen nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin R₂ und R₃ aus einer oder mehrerer der Formeln II, VIII, XII und XVI H sind.
Sammlung von Verbindungen nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin keine Doppelbindung zwischen C2 und C3 in einer oder mehreren der Formeln II, VIII, XII und XVI vorliegt.
Sammlung von Verbindungen nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin -Y-A- aus einer oder mehreren der Formeln II, VIII, XII und XVI eine Alkoxykette ist.
Sammlung von Verbindungen nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin X' aus einer oder mehreren der Formeln II, VIII, XII und XVI entweder CO oder NH ist.
Sammlung von Verbindungen nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin n in Formel II 1 bis 16 ist.
Sammlung von Verbindungen, die alle dargestellt sind durch entweder: (1) Formel III:
worin: X', Y, A, R₇, R₂, R₃, R₆, R₉, T und n wie nach einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert sind; L eine Bindungsgruppe oder eine Einfachbindung ist; und O ein fester Träger ist;
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉ und T wie oben definiert sind; n und m positive ganze Zahlen sind oder eines davon gegebenenfalls Null ist; T' ein Aminosäurerest ist, worin jedes T' unterschiedlich sein kann, wenn m größer als 1 ist; T'' ein Aminosäurerest ist, der eine Bindungsstelle für X' bereitstellt; und p eine positive ganze Zahl ist, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'' für jede Grundeinheit und die Werte von n und m unabhängig voneinander gewählt sind;
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', n, m und p wie in Teil (2) definiert sind; und X'', Y', A', R'₂, R'₃, R'₆, R'₇ und R'₉ aus den gleichen Möglichkeiten wie X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇ bzw. R₉ gewählt sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T' und T'' für jede Grundeinheit und die Werte von n und m unabhängig voneinander gewählt sein können; oder (4) Formel XIV:
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', n, m und p wie in Teil (2) definiert sind; und T''' und q aus den gleichen Möglichkeiten wie T bzw. n ausgewählt sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von T, T', T'', T''' für jede Grundeinheit und die Werte von n, m und q unabhängig voneinander gewählt sein können.
Sammlung von Verbindungen, die alle dargestellt sind durch entweder: (1) Formel IV:
worin X', Y, A, R₇, R₂, R₃, R₆, R₉, T, n, L und O wie in Anspruch 12 für Formel III definiert sind; R₁₁ entweder H oder R ist; Q S, O oder NH ist; und R₁₀ eine Stickstoffschutzgruppe ist;
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', n, m und p wie in Anspruch 12 für Formel VI definiert sind; und Q, R₁₀ und R₁₁ wie oben definiert sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', Q, R₁₀, R₁₁ für jede Grundeinheit und die Werte von n und m unabhängig voneinander gewählt sind;
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, X'', Y', A', R'₂, R'₃, R'₆, R'₇, R'₉, T, T', T'', n, m und p wie in Anspruch 12 für Formel X definiert sind; Q, R₁₀ und R₁₁ wie oben definiert sind; und Q', R'₁₀ und R'₁₁ die gleichen Definitionen wie Q, R₁₀, bzw. R₁₁ aufweisen, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', Q, R₁₀, R₁₁ für jede Grundeinheit und die Werte von n und m unabhängig voneinander gewählt sind; (4) eine Verbindung der Formel XV:
worin O, L, X', Y, A, R₂, R₃, R₆, R₇, R₉, T, T', T'', T''', n, m, p und q wie in Anspruch 12 für Formel XIV sind; und Q, R₁₀, R₁₁ wie oben definiert sind, worin, wenn p größer als 1 ist, die Bedeutung von T, T', T'', T''' für jede Grundeinheit und die Werte von n, m und q unabhängig voneinander gewählt sein können.
Sammlung von Verbindungen nach Anspruch 13, worin R₁₀ aus einer oder mehreren der Formeln IV, VII, XI und XV eine Carbamatfunktionalität aufweist, wodurch an Position 10 der PBD-Ringstruktur eine Bindung an das Stickstoffatom erfolgt.
Sammlung von Verbindungen nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, worin Q aus einer oder mehreren der Formeln IV, VII, XI und XY O ist und/oder R₁₁ H ist.
Verbindung der Formel I:
worin X aus COOH, NHZ, SH oder OH ausgewählt ist, worin Z entweder H oder eine Aminschutzgruppe ist; A O, S, NH oder eine Einfachbindung ist; R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus: H, R, OH, OR, =O, =CH-R, =CH₂, CH₂-CO₂R, CH₂-CO₂H, CH₂-SO₂R, O-SO₂R, CO₂R, COR, CN, und gegebenenfalls liegt eine Doppelbindung zwischen C1 und C2 oder C2 und C3 vor; R₆, R₇ und R₉ unabhängig voneinander aus H, R, OH, OR, Halogen, Nitro, Amino, Me₃Sn ausgewählt sind; R₁₁ entweder H oder R ist; Q S, O oder NH ist; R₁₀ eine Stickstoffschutzgruppe ist; worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, wovon die Alkylgruppe gegebenenfalls eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen oder -Dreifachbindungen enthält, die Teil eines konjugierten Systems bilden können, oder eine Arylgruppe mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist; und gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- oder Nitrogruppen substituiert ist; und Y eine zweiwertige Gruppe ist, sodass HY = R ist;
Verbindung nach Anspruch 16, worin R und HY unabhängig voneinander aus Niederalkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- oder Nitrogruppen substituiert sind.
Verbindung nach Anspruch 17, worin R oder HY unabhängig voneinander aus unsubstituierten, unverzweigten oder verzweigten Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind.
Verbindung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, worin R₁₀ eine Carbamatfunktionalität aufweist, wodurch an Position 10 der PBD-Ringstruktur eine Bindung an das Stickstoffatom erfolgt.
Verbindung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, worin R₇ eine elektronenspendende Gruppe ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, worin Q O ist und/oder R₁₁ H ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 16 bis 21, worin R₆ und R₉ H sind.
Verbindung nach Anspruch 22, worin R₇ eine Alkoxygruppe ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 16 bis 23, worin R₂ und R₃ H sind.
Verbindung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, worin keine Doppelbindung zwischen C2 und C3 vorliegt.
Verbindung nach einem der Ansprüche 19 bis 25, worin -Y-A- eine Alkoxykette ist.