DE69924842T2

DE69924842T2 - Knollen- oder wurzel-gewonnene proteaseinhibitoren zur vorbeugung oder behandlung von entzündung oder pruritus

Info

Publication number: DE69924842T2
Application number: DE69924842T
Authority: DE
Inventors: Geertruida Johanna RUSELER-VAN EMBDEN; Maria Leonarda VAN LIESHOUT; Daniel Jon LAMAN
Original assignee: SKINTEC BV
Current assignee: SKINTEC B.V., LELYSTAD, NL
Priority date: 1998-05-20
Filing date: 1999-05-20
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2019-05-21
Also published as: CA2332370C; EP0958833A1; NZ508406A; CA2332370A1; AU768615B2; ATE293455T1; JP2002515454A; US6723354B1; ES2245510T3; DK1079853T3; JP4633926B2; WO1999059623A1; EP1079853A1; EP1079853B1; AU4064299A; DE69924842D1

Description

Die Erfindung betrifft Mittel zur Abwendung, zur Behandlung oder zur Reduktion von Entzündungen durch Hemmung der proteolytischen Aktivität, insbesondere zur Abwendung oder Reduktion von Entzündungen von Haut oder Darm.
Entzündungen von Haut (Dermatitis) oder Darm (Enteritis) sind unterschiedlichen Ursprungs. Anfänglich sind allergische Reaktionen, Infektionen mit pathogenen Mikroorganismen, Abschürfungen aufgrund von chemischen oder physikalischen Mitteln sowie andere Ursachen maßgeblich an der Verursachung von Entzündungen beteiligt. Auf diese kausalen Ereignisse folgt sofort die zugehörige Reaktion des Körpers, was zu einem Zusammenspiel von Aktionen und Ereignissen führt, die auf Wiederherstellung von Haut oder Darm in den Originalzustand abzielen. In diesem Zusammenspiel von Ursache und Wirkung lassen sich unterschiedliche Aktivitäten von proteolytischen Enzymen erkennen. Granulozyten, Mastzellen, Makrophagen und andere unmittelbare Aktoren bei Entzündungsreaktionen, von Cytokinen zu der Stelle einer Entzündung herbeigerufen, enthalten und sondern Proteasen wie chymotryptische Protease und Elastase ab, die als Vermittler agieren oder dazu dienlich sind, Proteine von Krankheitserregern oder vom umliegenden degenerierten Gewebe aufzuspalten und zu entfernen. Bakterien und andere pathogene Mikroorganismen sondern entweder als Hauptverursacher oder während einer sekundären Infektion Proteasen ab, mit denen sie zu ihren Zwecken das umliegende Gewebe beschädigen. In diesem Schlachtfeld zwischen Wirt und Invasor werden überschüssige proteolytische Reaktionen durch oft sehr spezifische Protease-Hemmstoffe in Schach gehalten. Gut bekannt sind Proteinase/Proteinase Hemmstoffsysteme wie PMN-Elastase/alpha-1-Proteinase-Hemmstoff und Cathepsin G/alpha-1-Antichymotrypsin.
Proteolytische Enzyme können jedoch für sich selbst genommen auch Ursache für Entzündung sein. Insbesondere ist dies der Fall für Verdauungsenzyme, die im Darmtrakt aufgefunden werden. Um Ernährungsproteine abzubauen, sondern Magen, Bauchspeicheldrüse und der Dünndarmbürstensaum mehrere Arten Proteasen ab. Pepsin aus dem Magen arbeitet optimal bei pH-Wert 2, Bauchspeicheldrüsen- und Bürstensaumenzyme wie Trypsin, Chymotrypsin und Elastase arbeiten optimal bei einem pH-Wert von 7–8. Bei Erwachsenen hat der Dünndarm eine Länge von sieben Meter, und die Transitzeit seines Inhalts beträgt etwa 3 Stunden; dieser Teil des Darms wird von nur einigen Bakterien kolonisiert, aber ist mit einer wässerigen Mischung aus Nahrung und einem breiten Aufgebot und großen Mengen von Verdauungsenzymen wie Lipasen und Proteasen angefüllt. In Dickdarm (Dickdarm und Blinddarm) wird jedoch der Wassergehalt stark reduziert, und die Aktivität der Enzyme wird von Bakterien neutralisiert. Neutralisierte und verdaute Reste von Nahrung und Bakterien (Kot) verlassen den Körper zuletzt über das Rektum. Wenn allerdings der Dickdarm den Wassergehalt nicht wirksam reduzieren und die Enzyme nicht neutralisieren kann, kann der Kot immer noch proteolytische Aktivität aufweisen, die während Zeiten der Diarrhöe oder fäkaler Inkontinenz für die intra-anale oder perineale Haut äußerst irritierend sein kann.
Die Haut insbesondere von Menschen ist, obwohl sie durch das stratum corneum geschützt wird, das hauptsächlich aus Keratin besteht, wie jede andere proteineöse Substanz sehr anfällig gegenüber der proteolytischen Aktion von Proteasen, folglich kann Flüssigkeit wie der Dünndarminhalt schwerwiegende Entzündungen hervorrufen.
Bei Babys und Säuglingen ist der Darm sehr viel weniger weit entwickelt, besonders der Dickdarm funktioniert gegenüber Erwachsenen unterschiedlich. Dies ist der Grund, warum Verdauungsenzyme in Kot von Babys und Säuglingen nicht neutralisiert werden; die Inhalte des Kots ähneln mehr denjenigen des Dünndarms, obwohl sie den Dickdarm passiert haben. Deshalb wird perineale (perianale) Dermatitis häufiger bei Babys oder Säuglingen gefunden als bei Erwachsenen. Auch ins Krankenhaus eingewiesene Säuglinge und Kinder mit Magen-Darm-Erkrankungen sind anfällig für solch eine Dermatitis. Eine solche Dermatitis oder Prunitis, definiert durch Jucken, Hautrötung, Bläschen, Nässe, Ödeme oder Risse (wunde Stellen) der perinealen Haut lässt sich auch beim Windelausschlag finden, und kann sich in milden wie auch in sehr schwerwiegenden Ausprägungen zeigen. Beim Windelausschlag sind verkomplizierende Faktoren die Ansammlung des Urins, wobei Ureum von fäkalen Bakterien in Ammoniak umgewandelt wird und dadurch den pH-Wert zu einem für die Aktivität von proteolytischen Enzymen noch besser geeigneten Wert anhebt. Da die Haut für Infektionen äußerst anfällig ist, sollte Sorgfalt darauf verwandt werden, Entzündungen zu verhindern, die mit (fäkaler) proteolytischer Aktivität verbunden sind.
Wieder andere Fälle von Dermatitis lassen sich bei Patienten feststellen, die Resektionen von Dickdarm und/oder Ileum Stoma erfahren haben. Pouchitis, eine Darmentzündung, ist eine erhebliche Komplikation der ileoanalen Anastomose mit Reservoirerstellung nach Dickdarmresektion und ist charakterisiert durch klinische Symptome und durch Entzündung des Reservoirs (Beutel). Peristomale (circumstomale) Dermatitis lässt sich bei denjenigen Patienten feststellen, die ein Ileostoma erhalten haben, das sich an der Oberfläche des Unterleibs öffnet und in einem künstlichen Reservoir endet, das täglich geleert werden muss. Bei entzündlichen Darmkrankheiten (IBD wie Morbus Crohn, CD; ulcerativer Kolitis, UC; und Pouchitis) und bei Entzündungen mit einer unbekannten Ätiologie ist die Rolle der Darmflora und der Krankheitserreger, der von diesen Mikroorganismen stammenden proteolytischen Enzyme und der endogenen proteolytischen Enzyme (z.B. der Bauchspeicheldrüse oder der Leukozyten/Granulozyten) sowie deren Beitrag zur Verschlechterung des Schutzes der Mucoglycoproteine und der darunterliegenden Gewebe noch nicht verstanden.
Insbesondere bei den obengenannten Fällen, bei denen der Dickdarm entfernt wurde, oder bei denen seine Funktion beeinträchtigt oder unreif ist, ist es offensichtlich, dass die proteolytische Aktivität immer noch sehr hoch ist, wenn der Kot ausgeschieden wird, was zu verschiedenen Graden perinealer Dermatitis führt.
Es ist selbstverständlich, dass zahlreiche Behandlungen und Körperpflegeprodukte entwickelt worden sind, um die (schwerwiegend) juckenden und oft schmerzhaften Folgen der oben erörterten Entzündungen zu beheben. Die allgemeine Anti-Entzündungs-Therapie greift trotz der schwerwiegenden Nebenwirkungen, die oft mit diesen Medikamenten verbunden sind, häufig zu Behandlung mit Corticosteroiden. Andere Behandlungsmethoden stützen sich hauptsächlich darauf, entweder eine Schutzschicht auf der Haut zu bilden, beispielsweise durch Applikation einer lipidbasierten Salbe, die Zuschlagstoffe wie Zink enthält, oder auf das häufige Reinigen eines Risikobereichs. Spezielle Körperpflegeprodukte wurden entwickelt, ausgehend von speziellen Nasswischtüchern für die perineale Pflege, über Windeln, die trotz starker Verschmutzung durch das Kind oder durch den Patienten sehr trocken bleiben, bis hin zu Produkten (Stomapflegeprodukten) wie Haftmittel, absorbierende Scheiben und Flüssigkeiten zur Stomaspülung, die speziell für Stomapflegepa tienten mit Ileostomie oder ileoanaler Anastomose entworfen worden sind.
JP-A-09176033 offenbart einen Sojabohnenextrakt, der Trypsin zur Begrenzung von Windelausschlag enthält.
Jedoch vermag keine dieser Behandlungen wirklich mehr als eines oder mehrere der oben- und untenstehend beschriebenen klinische Symptome zu lindern.
Die Erfindung liefert eine Methode zur Behandlung, Reduktion oder Vermeidung einer Entzündung oder einer Pruritis, umfassend eine Behandlung eines Säugetiers mit mindestens einem Hemmstoff, der dazu imstande ist, proteolytische Aktivität zu hemmen. Vorzugsweise liefert die Erfindung eine Methode, bei der eine Protease, produziert oder abgesondert zum Beispiel durch Granulozyten, Mastzellen, Makrophagen und anderen Aktoren von Entzündungsprozessen, gehemmt wird. Die Erfindung ist auf Menschen, Veterinärmedizin und Pflege anwendbar.
Die Erfindung wird definiert durch die Ansprüche 1 bis 12.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung liegt darin, dass das Säugetier ein Mensch ist, der zum Beispiel an Dermatitis oder Pruritis leidet. Die Behandlung beispielsweise einer Dermatitis mit einem Proteasehemmstoff reduziert die proteolytische Aktivität der mit der Pruritis-Entzündung verbundenen Proteasen. Insbesondere für den Fall, bei dem im Zusammenspiel von Ursachen und Wirkungen, die bei Entzündungen vorkommen, die Aktivität von proteolytischen Enzymen zu hoch ist, liefert die Erfindung eine Methode, um diese Aktivität (mag sie vom Wirt oder vom Invasor stammen) mittels Behandlung mit mindestens einem Hemmstoff zu reduzieren, der dazu imstande ist, proteolytische Aktivität zu hemmen.
Die genannte Behandlung wird bereitgestellt durch Anwendung des Hemmstoffs in einer Salbe, Creme, einem Gel, einem Pulver, oder jeder anderen geeigneten Form an der Stelle der Entzündung. Diese Substanzen können zum Beispiel auch mittels eines mit Hemmstoff imprägnierten Wischtuchs, mittels Spray oder durch Spülen mit Flüssigkeit aufgetragen werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Behandlung für eine Entzündung des Darmes bereitgestellt, für eine perineale oder peristomale Entzündung, wie zum Beispiel bei Babys oder Kleinkindern mit Windelausschlag, bei Kindern oder Erwachsenen mit Diarrhöe oder fäkaler Inkontinenz, bei Patienten mit entzündetem Darmsyndrom und bei Stomapatienten, die alle an den Wirkungen der proteolytischen Aktivität leiden, die hauptsächlich fäkal ist.
Behandlung fäkaler proteolytischer Aktivität kann durch Aufbringen des Hemmstoffs in einer Salbe, Creme, einem Gel, einem Pulver oder in jeder anderen geeigneten Form auf die perineale oder peristomale Stelle der Entzündung stattfinden. Darmentzündungen, wie man sie von IBD oder Pouchitis kennt, können durch Spülen der betroffenen Stelle im Verdauungstrakt durch Verwendung beispielsweise eines Klistiers behandelt werden, oder es kann oral, am besten in einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie einer Schluck – oder Mischungstablette verabreicht werden, die die Speiseröhre und den Magen relativ unbeeinflusst passieren kann.
Diese Hemmstoffsubstanzen können zum Beispiel auch mittels eines mit Hemmstoff imprägnierten Wischtuchs, mittels Spray oder durch Spülen mit Flüssigkeit aufgetragen werden. Auch ist es möglich, eine Windel (während der Windelproduktion oder kurz vor dem Gebrauch) mit einem Hemmstoff zu imprägnieren, wodurch eine Methode und ein Mittel gegen Windelausschlag oder Pruritis erhalten werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird solch eine Windel mit einem Hemmstoff gemäß der Erfindung in wenigstens demjenigen Windelbereich (und darunter liegenden Teilen) behandelt oder imprägniert, der sich bei der Verwendung in Kontakt mit dem Perineum des Babys, Säuglings, Kindes oder Erwachsenen befindet. Bei Windeln umfasst der Kontaktbereich normalerweise die Windeloberfläche, die in Kontakt mit dem Perineum ist.
Die Erfindung liefert eine Methode zur Behandlung, die die Verabreichung eines Hemmstoffs gemäß Patentanspruch 1 an den Patienten oder an das Säugetier umfasst, der bzw. das für eine Entzündung anfällig ist. Hemmstoffe für proteolytische Aktivität sind weithin bekannt. Zum Beispiel hat Säure eine hemmende Wirkung auf die Hydrolyse von Proteinen von Bauchspeicheldrüsenproteasen, und eine pH-Wert-vermindernde Substanz kann auf diese Weise als Hemmstoff verwendet werden, wie er durch die Erfindung bereitgestellt wird.
Ferner können Substanzen wie Aktivkohle (ein solches Produkt ist als Norit bekannt) aufgrund ihrer adsorbierenden Eigenschaften als Proteasehemmstoff wirken. Im experimentellen Teil werden mehrere Beispiele für eine durch die Erfindung gelieferte Behandlung gegeben, bei der Aktivkohle, zum Beispiel Norit^® verwendet wird, um eine Entzündung wie zum Beispiel Pouchitis zu behandeln.
Viele Protease-Hemmstoffe sind bekannt (siehe zum Beispiel G. Salvesen and H. Nagase. Proteolytic enzymes, a practical approach. Eds R. J. Beynon and J. S Bond In: The practical approach series. 1989). Obwohl nicht-spezifische Hemmstoffe bekannt sind (z.B. menschliches α-Macroglobulin-Plasma), wird zumeist zwischen Proteaseklassen oder sogar Unterklassen unterschieden. Substanzen wie Peptidaldehyde oder peptidische Chloromethylketone sind sehr spezifisch auf Unterklassen von Proteasen (Proteinasen) beschränkt, je nach der Peptidsequenz, die sie nachahmen. Andere, wie Metallchelatoren, wirken nur gegen Metalloproteinasen oder kalziumabhängige Proteinasen. Klassenspezifische Hemmstoffe lassen sich finden gegen Serinprotease, Cysteinprotease, aspartische Protease usw. Derartige Protease-Hemmstoffe sind oftmals in Form gereinigter Substanzen zum Einsatz in biochemischen Präparaten handelsüblich und können teuer sein.
Die Methode gemäß der Erfindung ist eine Methode, bei der ein Hemmstoff aus einer Pflanze abgeleitet wird, die zu Knollen oder Wurzeln führen kann. Hierin umfasst "abgeleitet" zum Beispiel Ableitung mittels (teilweiser) Reinigung oder Isolation, oder mittels Erhalt der notwendigen genetischen Information sowie Produktion mittels moderner, aus dem Stand der Technik bekannter Rekombinanztechnologie.
Pflanzen schützen ihre Blätter, Früchte, Samen, Knollen oder Wurzeln oft gegen Schädlinge mittels Einschluss von starken Proteasehemmstoffen und Mischungen davon in ihre Blätter, Früchte, Samen, Knollen oder Wurzeln. Zum Beispiel enthalten Getreide und Hülsenfrüchte wie Weizen- oder Sojabohnen Protease-Hemmstoffe wie Sojabohnen-Trypsinhemmstoff (SBTI), der im Allgemeinen gegen Trypsin oder Chymotrypsin wirkt, nicht aber gegen andere Klassen von Proteinasen. Knollen und Wurzeln wie Kartoffel und Cassave, ebenso Süßkartoffel, Rüben, Sweetroot und andere, enthalten starke Hemmstoffe gegen eine breite Vielfalt von Verdauungstraktproteasen wie Aminopeptidasen, Carboxypeptidasen, Chymotrypsin, Trypsin und Elastase, und wegen dieses breiten Bereichs werden von Knollen oder Wurzeln abgeleitete Pflanzenprodukte benutzt, die eine proteolytische Wirkung gemäß der Erfindung aufweisen.
Kartoffelknollen sind eine außerordentlich reichhaltige Quelle einer Vielfalt von Hemmstoffen gegenüber allen wesentlichen Darmverdauungs-Endo- und Exo-Proteinasen von Tieren (Pearce et al., Arch. Biochem. Biophys, 213, 456–462, 1982). Solche Hemmstoffe wirken als Antinährstoffe, die Teil der natürlichen chemischen Verteidigungsmechanismen von Pflanzen, wie Knollen und Wurzeln, gegen angreifende Schädlinge sind. Bei Kartoffeln umfassen die wesentlichen Hemmstoffe polypeptiden Trypsinhemmstoff (PTI), polypeptide Chymotrypsinhemmstoffe I und II (PCI-I und PCI-II), Hemmstoff II gegen Chymotrypsin und Trypsin und Carboxypeptidasehemmstoff, von denen allen es bei anderen Pflanzen Analogien gibt. Diese wirken für sich genommen sowie gemeinsam gegen die wesentlichen tierischen Verdauungsproteinasen.
Die Erfindung liefert die Verwendung eines Hemmstoffs oder eines Pflanzenprodukts oder eines Auszugs, der dazu fähig ist, proteolytische Aktivität zu hemmen, zur Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einer Körperpflege-Zusammensetzung gemäß der Patentansprüche, zur Reduzierung oder Vermeidung einer Entzündung oder einer Pruritis. Im experimentellen Teil wird ein Beispiel für solch ein Produkt angegeben, das Kartoffelsaft oder einen daraus beispielsweise durch Gefriertrocknung abgeleiteten Hemmstoff aufweist. Eine solche Zusammensetzung kann eine Salbe, Creme, ein Gel, ein Pulver oder jede andere geeignete Form umfassen, mit der ein Hemmstoff auf einen Patienten angewandt werden kann. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung eines Hemmstoff- oder Pflanzenprodukts gemäß der Patentansprüche, das dazu fähig ist, proteolytische Aktivität zu hemmen, zur Zubereitung einer Rezeptur für die Reduktion oder Vermeidung einer Entzündung oder einer Pruritis, die eine Darm-, eine perineale oder eine peristomale Entzündung oder Pruritis ist, angegeben. Ein solches Präparat kann in Form einer Spülflüssigkeit vorliegen, es kann in Kapseln enthalten sein, die die Speiseröhre und den Magen passieren, oder es kann in (vorgefertigten) Wischtüchern oder Windeln enthalten sein, denen der Hemmstoff (oder das Pflanzenprodukt) während der Produktion oder kurz vor der Benutzung hinzugefügt wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liefert die Erfindung die Verwendung eines Hemmstoffs gemäß der Patentansprüche, zur Zubereitung einer Körperpflege-Zusammensetzung oder eines medizinischen Pflegepräparats zur perinealen, perianalen und/oder peristomalen Pflege, beispielsweise zur Behandlung fäkaler proteolytischer Aktivität.
Beispielsweise ist es möglich, perineale Dermatitis durch Spülen des Reservoirs und der perinealen Haut mit einer Proteasehemmstoff enthal tenden Flüssigkeit oder mit einer schützenden Salbe mit Proteasehemmstoffen zu verhindern. Auch ist es möglich, Windeln oder Körperpflegeprodukte mit Hemmstoffpulver vorzubehandeln, die Verschmutzung adsorbieren.
Die Erfindung liefert die Verwendung eines Hemmstoff- oder Pflanzenprodukts, das dazu fähig ist, proteolytische Aktivität zu hemmen, zur Zubereitung einer pharmazeutischen oder einer Körperpflege-Zusammensetzung, wobei der Hemmstoff oder das Produkt von einer Pflanze abgeleitet ist, die Knollen oder Wurzeln bilden kann, wie zum Beispiel eine Kartoffelpflanze. Solch ein Hemmstoff (Produkt, Präparat oder Mischung) wirkt, wie weiter oben dargestellt, gegen Protease, die aus der Gruppe von Bauchspeicheldrüsen- und Granulozytenproteasen ausgewählt ist. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist der Hemmstoff (Präparat oder Mischung) dazu fähig, Papain und/oder Pronase zu hemmen, wodurch er sein breites Spektrum und seine Wirksamkeit zeigt.
Die Erfindung liefert auch eine pharmazeutische Zusammensetzung oder eine Körperpflege-Zusammensetzung (zum Beispiel Salben, Pulver, Flüssigkeiten), die Hemmstoffe für Proteaseaktivität umfasst, und die beispielsweise dazu fähig ist, eine durch Kot verursachte Entzündung oder Pruritis zu verhindern, (fäkale Proteasen durch Hemmung proteolytischer Enzyme mit Bauchspeicheldrüsen- und Bürstensaumursprung; mit bakteriellem [Gutflora] Ursprung, mit Leukozyten-Ursprung [Granulozyten, Mastzellen, Makrophagen] im Falle von Entzündung des Darms); oder eine von Kot verursachte Entzündung oder Pruritis durch Hemmung von Proteasen zu heilen (wie Elastase, Cathepsin), die von Gewebe-Makrophagen, Granulozyten, Mastzellen produziert werden; oder Hautentzündung und andere Krankheiten zu heilen, bei denen die Entzündung und die Krankheitsaktivität mit eindringenden Entzündungszellen (Effektorzellen) und der Freisetzung von Proteasen in Beziehung steht; oder Pruritis im Allgemeinen zu heilen (Behandlung findet oft mit Antihistaminica statt), wobei lokales Aufbringen von Salben mit Proteasehemmstoff die Histaminabgabe durch Mastzellen/die Proteaseabgabe durch Fagocyten verhindert.
Die Erfindung liefert auch eine Körperpflege-Zusammensetzung, Spülflüssigkeiten, Wetties, Pulver oder Salben, für die perianale und/oder peristomale Pflege, oder eine Windel, die einen Hemmstoff gegen proteolytische Aktivität gemäß der Patentansprüche umfasst. Die Beachtung der Hautpflege kann bereits zum Zeitpunkt einer Operation beginnen, zum Beispiel mittels Hemmstoff enthaltender Spülungsflüssigkeit. Hemmstoffe können in Stomavorrichtungen, wie in selbstklebende und absorbierende Scheiben, und in Stomaspülflüssigkeiten und Salben integriert werden.
Die Erfindung wird im Folgenden im experimentellen Teil beschrieben, der nicht dazu bestimmt ist, die Erfindung einzuschränken.
Experimenteller Teil
Bei Erwachsenen hat der Dünndarm eine Länge von sieben Metern, und die Transitzeit seines Inhalts beträgt etwa 3 Stunden; dies ist der Grund, warum dieser Teil des Darms im Vergleich zum Dickdarm nur von einigen Bakterien kolonisiert wird. Der Dickdarm ist jedoch von einer großen Anzahl von Bakterien (10¹⁰–10¹¹/Gramm) kolonisiert. Der Transit ist langsam (24 Stunden), und Hauptfunktion des Dickdarms ist die Absorption des Wassers.
Kot besteht schließlich aus einem Teil Feststoffe und zwei Teilen Wasser. Die Hälfte des trockenen Materials sind Bakterien; der Rest sind im Wesentlichen die Ballaststoffe sowie vom Wirt stammendes Material wie abgefallene Epithelzellen und Schleim. Die bezüglich bakterieller Gärung aktivste Stelle ist der Punkt, an dem der Inhalt des Ileums den Blinddarm erreicht. Nährstoffe sind rechtlich verfügbar, der Prozentsatz an Wasser ist hoch, und die Flora findet optimale Bedingungen zur Reproduktion vor. Über diesen Teil des (menschlichen) Darms sind nur wenige Daten bekannt, aber der pH-Wert, gemessen bei plötzlichen Todesopfern, ist sehr niedrig (pH-Wert 4,5–5,5).
Die Dickdarmflora besteht aus 99,9% obligat-anaeroben Bakterien; anaerob/fakultativ-aerobe Bakterien wie Coliformen sind eine Minderheit (etwa 10⁴–10⁷ Bakterien/Gramm Kot). Die anaerobe Dickdarmflora ist sehr stabil, und es ist fast unmöglich, bezüglich Art oder Gattung Veränderungen an ihr herbeizuführen, auch nicht mittels drastischer Änderungen in der Ernährung (Antibiotika oder Infektion mit Enteropathogenen können die ansässige Flora allerdings stören). Eine der Ursachen für dieses Phänomen ist, dass die wichtigsten Nährstoffe von endogenen Materialien, Verdauungsflüssigkeiten, Schleim usw. abgeleitet werden. Ein Teil der Verdauungsproteine (auch der Gallensäuren) wird vom distalen Teil des Ileums wieder absorbiert; der Rest wird im Dickdarm umgewandelt oder verdaut. Es wird angenommen, dass die Dickdarmflora eine wichtige Rolle bei der Deaktivierung von Bauchspeicheldrüsen-Verdauungsenzymen wie der Protease spielt.
Bei Babys und Kleinkindern ist der Darm viel weniger weit entwickelt, und insbesondere der Dickdarm funktioniert nicht so gut wie bei Erwachsenen. Dies ist der Grund, warum Verdauungsenzyme im Kot von Babys und Kleinkindern nicht neutralisiert und/oder wieder absorbiert werden; seine Inhalte ähneln mehr dem Inhalt des Dünndarms, der eine hohe proteolytische Aktivität aufweist, obwohl sie auch den Dickdarm bereits durchlaufen haben.
Die wesentlichen endogenen Nährstoffquellen sind vermutlich Glycoproteine aus dem Magen- und Darmschleim, der bis zu 90% Kohlehydrate enthält. Bakterielle Glycosidasen bauen die oligosacchariden Seitenketten ab, die das Glycoprotein vor proteolytischer Zerstörung schützen. Wenn dem Proteinkern der Schutz der Kohlehydrate fehlt, ist er nicht mehr widerstandsfähig gegen Proteolyse durch Bauchspeicheldrüsen- (und bakterielle) Proteasen. Im gesunden Dickdarm existiert ein Gleichgewicht zwischen der Produktion und dem Abbau von Schleim.
Viel Aufmerksamkeit ist den entzündlichen Darmkrankheiten (IBD) gewidmet worden: Morbus Crohn (CD), ulcerative Kolitis (UC) und Pouchitis. Pouchitis ist eine wesentliche Komplikation von ileoanaler Anastomose mit Reservoiraufbau, nach Dickdarmresektion bei UC und ist durch klinische Symptome und Entzündung des Reservoirs (Beutel) charakterisiert. Die Rolle der Darmflora bei IBD wurde betreffend die Krankheitserreger und deren Beitrag beim Abbau der schützenden Schleimglycoproteine untersucht.
Patienten mit Darmentzündungen zeigen einen Verlust an Integrität der Mukosa. Wir haben die wegen des Abbaus der Schleimglycoproteine potentiell schädliche Rolle von bakteriellen Glycosidasen sowie bakteriellen und wirtsabgeleiteten Proteasen untersucht. Hierzu wurden die Zusammensetzung der Darmflora und die Aktivität von Glycosidasen und Proteasen bei Patienten mit IBD bestimmt. Auch wurde die enzymatische Aktivität bei keimfreien Ratten gemessen, um den Einfluss der Flora zu bestimmen.
Diese Studien zeigten, dass Kot von Patienten mit aktiver CD, von Patienten mit Ileostomie und von Patienten mit einem Beutel eine hohe proteolytische Aktivität aufweist. Proteasen treten in das Duodenum im Wesentlichen als Sekretionen von Leber, Bürstensaum und Bauchspeicheldrüse ein. Ein Teil der Aktivität geht in dem letzten Ileum verloren, wahrscheinlich aufgrund von Absorption und/oder Wirkung von endogenen Hemmstoffen. In Kot von gesunden Subjekten war nur eine sehr geringe oder überhaupt keine enzymatische Aktivität festzustellen, die wahrscheinlich im Wesentlichen bakteriellen Ursprungs ist. Jedoch zeigen keimfreie Tiere wie Ratten eine hohe proteolytische Aktivität überall im ganzen Dickdarm. Es zeigte sich, dass Patienten mit aktivem IBD, Ileostomie-Patienten und Patienten mit einem Beutel eine hohe fäkale proteolytische Aktivität aufwiesen. Hieraus können wir schließen, dass eine vollständige Dickdarmflora, und ein normaler (langsamer) Transit notwendig sind, um diese Enzyme zu deaktivieren.
Die hohe proteolytische Aktivität im Kot von Patienten mit IBD kann zu einem fortschreitenden Abbau von Schleimglycoproteinen führen, und könnte eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Entzündung der Mukosa spielen. In-Vitro-Versuche bestätigten diese Hypothese. So entstand die Idee, Patienten wie diejenigen mit einer ileoanalen Anastomose (IAA) mit Proteasehemmstoffen zu behandeln, um die perineale Dermatitis zu verhindern. Patienten, die wegen UC oder Familiärer Adenomatöser Polypose (FAP) operiert wurden, kommen für den Einbau eines ilealen Reservoirs nach Dickdarmresektion in Frage. Dieses kleine Reservoir ist mit dem Anus verbunden. Die Periode nach der Operation ist eine schwere Zeit für die meisten Patienten. Kurz nach der Operation hat der Kot des Patienten eine wässerige Konsistenz, die Patienten sind oft (noch) nicht kontinent, und dies führt zu Irritationen und Pruritis der perinealen Haut (perineale Dermatitis). Der Hauptgrund für die perineale Dermatitis ist der Abbau der Epidermis (die im Wesentlichen aus dem Protein Keratin besteht) durch Proteasen.
Die proteolytische Aktivität wurde im Kot dieser Patienten gemessen, und es wurde festgestellt, dass sie sehr hoch war. Weiterhin entwickelten 75% der Patienten eine gemäßigte bis schwer wiegende perineale Dermatitis; 25% hatte keine Anzeichen von Irritation.
Materialien und Methoden
Proteolytische Aktivität/Subjekte
Fäkale Proben von siebenundzwanzig Patienten mit Morbus Chron (CD) wurden untersucht. Zwölf Patienten im Alter zwischen 27–58 Jahren hatten 3–12 Jahre zuvor eine Darmoperation; Orte der Resektionen waren terminales Ileum, Ileum und Blinddarm, sowie Dickdarm. Eine zweite Gruppe von Patienten war nicht operiert; die hauptsächlichen Orte der Entzündung waren Ileum, Ileum und Dickdarm, sowie Dickdarm. Die Diagnose "CD" wurde mit den üblichen klinischen, radiologischen und histopathologischen Kriterien durchgeführt. Alle Patienten waren ambulante Patienten.
Zwölf gesunde Freiwillige, im Alter von 23–48 Jahren wurden zum Vergleich untersucht.
Ileostomie-Ausflüsse wurden von fünf erwachsenen Patienten mit konventioneller Ileostomie (im Alter von 38–71 Jahren) erhalten. Sie hatten sich mehr als fünf Jahre zuvor einer totalen Kolektomie unterzogen, um von CD oder ulcerativer Kolitis (UC) befreit zu werden, und waren alle gegenwärtig bei guter Gesundheit.
Vierzehn Patienten mit einem Beutel (mittleres Alter 27 Jahre) wurden untersucht. Die Patienten hatten eine restorative Proktokolektomie wegen UC oder Familiärer Adenomatöser Polypose. Ein S-Beutel wurde bei 12 Patienten eingesetzt, während zwei Patienten einen W-Beutel erhielten. Diese Studie wurde mindestens ein Jahr nach der restorativen Kolektomie durchgeführt. Die Diagnose Pouchitis basierte auf klinischen Symptomen, auf endoskopischen Merkmalen akuter nicht-spezifischer Entzündung und auf histologischen Befunden eines entzündlichen Zellinfiltrats. Anhand dieser Kriterien wiesen fünf Patienten Pouchitis auf, während neun dies nicht taten (Kontrollen).
Fäkale Proben von dreizehn zum Aufbau eines Reservoirs bei ileoanaler Anastomose (IAA) operierten Patienten wurden innerhalb von 14 Tagen nach der Operation gesammelt. Proteolytische Aktivität wurde im Kot von 31 gesunden Kindern im Alter von 4 Monaten bis 7 Jahren gemessen.
Proteolytische Aktivität/Labortiere
Kot von 4 konventionellen (Wistar) und 4 keimfreien Ratten (Wag/Rij) wurden untersucht. Von 2 konventionellen und 2 keimfreien Ratten wurde der Inhalt des Darmtrakts untersucht.
Fäkale Proben von 20 kolektomisierten Hunden, reinrassigen Beagles (Harlan), wurden gesammelt. Drei Ileostomiegruppen wurden untersucht. Bei zehn Hunden wurde eine Standard-Brooke-Ileostomie in Form einer subtotalen Kolektomie vorgenommen. Bei fünf Hunden wurde ein ventilfreies ileales Reservoir (Beutel) mittels einer iso-antiperistaltischen Seite-an-Seite-Anastomose geformt. Nach einer Erholungszeit von 2 Wochen wurde ein Zeitplan von zunehmenden Verschlussperioden, außer bei 5 Hunden, begonnen. Die maximal erträgliche Okklusionszeit war 2,5–3 h für die Ileostomiegruppe und 4–7 h für die Reservoirgruppe. Bei fünf Hunden wurde eine kontinente Ileostomie (Kock'sche Tasche) installiert, die 2–5 Mal pro 24 Stunden mittels Katheterisierung geleert wurde.
Proteolytische Aktivität-/fäkale Proben und Darminhalte
Kot wurde eingefroren und innerhalb von 3 h nach der Passage bei –20°C aufbewahrt. Vorläufige Studien zeigten keine Änderungen in der proteolytischen Aktivität während mindestens 4 Monaten der Lagerung. Proben von 1 g wurden zu 24 vol von 0,1 M Phosphatpuffer pH-Wert 7,6 überführt und homogenisiert ('Stomacher', Lab Blender 400). Grobe Partikel wurden aus dem Homogenat mittels Gazenfilterung entfernt (Utermohlen, wieder gefaltet zu 2 Schichten); diese Proben werden im Folgenden als 'fäkale Homogenate' bezeichnet.
Sofort nach der Tötung der Ratten wurde der ganze Darm entfernt und präpariert. Der Dünndarm wurde in 4 Teile gleicher Länge aufgeteilt, und der Inhalt jedes Teilstücks wurde sorgfältig mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2) gewaschen. Proben von coecum und Dickdarm wurden auf dieselbe Weise wie der Kot behandelt.
Proteolytische Aktivität/Makrophagen
Peritoneale Maus-Makrophagen (roh) wurden in 200 ml DMEM mit 5% FCS und 4 mM Glutamin in vitro kultiviert und mit 200 U TNFαmol- Mittel stimuliert. Nach 18 Stunden wurden die Zellen geerntet, zentrifugiert und in 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH-Wert 7,6 resuspendiert. Die Gesamtzahl an Zellen war etwa 3,10⁸ pro ml. Die Zellen wurden durch wiederholtes Einfrieren aufgebrochen und es wurden Proben für Protease-Prüfungen verwendet.
Proteolytische Aktivitäts-/Enzymprüfung
Proteolytische Aktivität wurde im fäkalen Homogenat in entsprechenden Verdünnungen (bis zu 250-fach) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,6) bestimmt. Penizillin (0,1% w/v) wurde hinzugefügt, um bakterielles Wachstum zu verhindern. In den neueren Hemmungstests wurde kein Penizillin verwendet. Proben von 0,1 ml wurden mit 0,1 ml 1% (w/v) Azocasein (Sigma) in Phosphatpuffer während 1 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Addition von 0,2 ml 10% (w/v) Trichloroacetatsäure (TCA) beendet; nach 10 min bei Raumtemperatur wurden unhydrolysiertes Azocasein, Bakterien und andere Partikel durch Zentrifugieren bei 10.000 U/min über 10 min entfernt. Dann wurden 0,1 ml des klaren Supernatants in flachbödigen 24-Schacht-Mikroplatten zu 0,1 ml von 1 N NaOH überführt. Zu den Blindproben wurde Azocasein nach Inkubation und Addition von TCA hinzugefügt. Die Absorption der Proben wurde bei 450 nm gemessen und mit aus Lösungen von Azocasein erhaltenen Standardkurven verglichen. Proteolytische Aktivität wurde ausgedrückt als Milligramm Azocasein hydrolysiert während 1 h pro Gramm Trocken- oder Nassgewicht der Probe. Jede verdünnte Probe wurde nach dem Erhitzen auf 80°C für 10 min auf andere außer enzymatische Substratshydrolyse getestet. Spontane Substratshydrolyse wurde durch Inkubation des Substrats mit Puffer getestet.
N-Succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Prolyl-L-Leucin-p-Nitroanilid (Sigma) wurde als Substrat zur Bestimmung gereinigter menschlicher Leukozytenelastase (Sigma) und Elastase-Aktivität von Mausmakrophagen verwendet. Proben von 0,1 ml wurden mit 0,1 ml Substrat (0,1% w/v) in 0,1 M Phosphatpuffer pH-Wert 7,6 in einer Flachschacht-Mikrotiterplatte inku biert. Nach 30 oder 60 min wurde die Reaktion durch Addition von 70 μl 30% Essigsäure gestoppt, und die Absorption wurde bei 400 nm gemessen. Eine Einheit des Enzyms wurde als diejenige Menge definiert, die bei 37°C 1 μmol P-Nitroanilid pro Minute freigab.
Proteolytische Aktivität/Wirkung des pH-Werts
Um die Wirkung des pH-Werts auf die proteolytische Aktivität zu testen, wurden die fäkalen Proben in Zitronensäure-Phosphatpuffer verdünnt (0,1 M Na₂HPO₄/2H₂O; 0,1 M Zitronensäure/H₂O) pH-Werte 5,2, 5,8, 6,8 und 7,6. Außerdem wurden die Substratlösungen in entsprechenden Puffern gemacht.
Vorbereitung von lektinfreien Kartoffelproteinen
Rohe oder relativ reine Kartoffelproteine wurden in PBS verdünnt. Menschliche Erythrozyten (krankheitsfrei) wurden zu Kartoffelproteinen hinzugefügt (Endkonzentration der ery's 3%), sorgfältig gemischt für 1 min, zentrifugiert für 2 min bei 1500 U/min. Das Supernatant wurde wieder mit den Erythrozyten gemischt. Dies wurde 5 Mal wiederholt, bis bei einem Hämagglutinationstest keine Hämagglutination mehr gefunden wurde. Der reziproke Wert der höchsten Verdünnung des Kartoffelproteins, das definitiv Hämagglutination zeigte, wurde als das Hämagglutinationstiter definiert. Das Hämagglutinationstiter nahm zum Beispiel von 25.600 auf 25–1 ab. Nach Lyophilisierung wurde die Hemmstoffaktivität des lektinfreien Produkts mit der Original-Proteinfraktion verglichen. Es wurde kein Verlust an Hemmstoffaktivität gefunden, wenn in Proben mit einer hohen proteolytischen Aktivität und in gereinigten Proteaselösungen getestet wurde, (Trypsin, α-Chymotrypsin und Elastase, Endkonzentration 1%).
Ferner werden lektinfreie Kartoffelproteine durch Einsatz zum Beispiel von Chitooligo-Agarose (Seikagaku) erhalten.
Lektine von Kartoffelproteinen werden auch deaktiviert, aber nicht dadurch, dass sie aus der Proteinlösung entfernt werden, sondern dadurch, dass sie an lösliche Kohlehydratgruppen gebunden werden, zum Beispiel N-Aceto-Chitooligosaccaride von hydrolisiertem Chitin und Glycoproteine von Magen oder Darm. Die Lektine sind immer noch im Produkt, aber haben ihre aktive Stelle verloren.
Proteolytische Aktivität/Protease-Hemmstoffe
Die folgenden Hemmstoffe wurden verwendet:

– Trasylol (Aprotinin) (Bayer) nicht verdünnt
– Ovomucoid () 1% (w/v) in 0,1 M Phosphatpuffer pH-Wert 7,6
– fötales Kalbsserum (FCS) () nicht verdünnt
– Trypsinhemmstoff II- von Sojabohne (STI) (T -9003; Sigma) 1% (w/v) in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6
– Norit A (supra USP, 951191), B (Test EUR, A6910), E (Supra USP, 940260), PRSH, Carbomix, Tabletten
– Premium Powder (Hollister)
– Kartoffelsaft (PJ) von "Bintjes" wurde wie folgt zubereitet. Nach dem Schälen und dem Waschen wurden die Kartoffeln zu Stücken zerdrückt, unter Addition von 0,2% Ascorbinsäure durch Kambrik gefiltert. Der Saft wurde bei 4°C 30 min bei 27.500 RCF zentrifugiert, durch Papier gefiltert und wieder zentrifugiert. Das klare gelbe Supernatant wurde durch einen 0,45-Mikron-Filter gefiltert und gefriergetrocknet. Dieses rohe Produkt war steril (kontrolliert mit Blutagarplatten) und enthielt etwa 25% Protein. Zehn Gramm PJ-Pulver wurde aus 200 ml Saft erhalten.

Im Allgemeinen lassen sich Protease-Hemmstoffe, die in Kartoffeln enthalten sind, beispielsweise durch Mahlen von Kartoffeln, Entfernen von Stärke und anderen Feststoffen und zum Beispiel Gefriertrocknen des Safts erhalten.
Die Reinheit der Proteasehemmstoffzubereitung kann durch Entfernen im Kartoffelsaft vorhandenen nicht-proteineösen Materials und/oder Peptiden mit niedrigem molekularen Gewicht und/oder Aminosäuren, z.B. mittels Zentrifugation, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Diafiltration oder Elektrodialyse verbessert werden. Weiterhin kann Protein selektiv in einer relativ rohen Form aus der Kartoffelsaftgrundmasse hergestellt werden. Dies kann z.B. durch Ultrafiltration, iso-elektrische Abscheidung, (Co-)Flockulation mit Polyelektrolyten oder mit jedem anderen Flockulationshilfsmittel, Koabscheidung mit anderen Proteinen, Proteinabscheidung mit Salz (Aussalzen) oder durch Änderungen der Beschaffenheit des Lösungsmittels mittels Hinzufügen z.B. von Aceton, Methanol, Äthanol oder Isopropylalkohol, durch iso-elektrische Abscheidung und thermische Fraktionierung sowie durch andere Techniken, die jedem Fachmann bekannt sind, erreicht werden. Da Protease-Hemmstoffe in Kartoffelsaft relativ hitzebeständig sind, führt eine gemäßigte thermische Behandlung zu Denaturierung und Koagulation weniger stabiler Proteine. Koaguliertes Protein kann anschließend mittels beispielsweise so einfacher Techniken wie Zentrifugation entfernt werden. Obwohl etwas von der proteasehemmenden Aktivität verloren geht, wird die Reinheit der übrigen Protease-Hemmstoffe gesteigert. Es ist sogar eine noch weitergehende Reinigung durch Ultrafiltration möglich, oder durch Aussalzen der Protease-Hemmstoffe und anschließender Entfernung von Salz und anderen unerwünschten Bestandteilen mittels Ultra- und Diafiltration. Alternativ kann die Isolierung unterschiedlicher Protease-Hemmstoffe durch Affinitätschromatographie, entweder direkt aus der rohen Kartoffelsaftgrundmasse, oder nach Vorreinigung erfolgen.
Bei den meisten Experimenten wurde der Hemmstoff dem Kot hinzugefügt (verdünnt 1:25 in Puffer), 5–15 min gemischt und dem Substrat hinzugefügt; Kartoffelsaft-Pulver wurde unverdünntem Kot (1:1) hinzugefügt und nach dem Mischen (1:25) mit Puffer verdünnt. Bei jedem Experiment wurden Kontrollen untersucht (sterilisierter Kot, sterilisierte Hemmstoffe, Pufferlösungen).
Proteolytische Aktivität/gereinigte Enzyme
Die folgenden Enzyme wurden in den Hemmungsversuchen getestet:

– Rinderbauchspeicheldrüsentrypsin (Serva)
– Rinderbauchspeicheldrüsen-α-Chymotrypsin (Merck, Sigma)
– Rinderbauchspeicheldrüsenelastase (Sigma)
– Papain (Sigma)
– Pronase (Sigma) (Carboxypeptidase und Leuzinaminopeptidase wurden getestet, aber hydrolysiertes Azocasein nicht).

Alle Enzyme wurden bei einer Konzentration von 0,2% (w/v) in Puffer verwendet.
Proteolytische Aktivität/Hauttests
Hauttests wurden auf dem ventralen Teil des Unterarms ausgeführt. Die folgenden Lösungen wurden getestet: 1. Supernatant von Kot von einem Patienten mit einem Ileumreservoir mit hoher proteolytischer Aktivität; 2. dasselbe Supernatant, aber sterilisiert; 3. Supernatant mit 0,25% STI (w/v); und 4. 0,25% STI in Puffer. Zweihundert μl jeder Lösung wurden auf gefalteten Kambrik auf die Haut platziert und mit Plastik und selbstklebendem Wundpolster bedeckt. Gesamtinkubationszeit war 7 h, aber nach 3 h und 5 h wurde jedem der Testflicken 100 μl Puffer hinzugefügt, um Austrocknung zu verhindern.
Hemmung fäkaler proteolytischer Aktivität durch Produkte aus Kartoffelsaft EURO 1, EURO 2, EURO 3
EURO 1 ist rohes Kartoffelsaft-Pulver, EURO 2 und 3 sind stärker gereinigt.
Materialien und Methoden
Fäkale Proben
Kot von 1 Patienten mit Ileostomie, von 1 Patienten mit einem gut funktionierenden Beutel, von 1 Patienten 14 Tage nach Kolektomie und Anfertigung eines Beutels, von 2 vierjährigen Babys wurden verwendet.
Kot wurde außer bei den Babys unverdünnt verwendet, bei denen er 1:1 in Phosphatpuffer mit pH-Wert 7,6 verdünnt und 10 min bei 10.000 g zentrifugiert wurde.
EURO's
EURO's wurden verwendet als 1:5, 1:10, 1:25, 1:50 und 1:100-Verdünnung in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6.
Kot und EURO wurden 1:1 für 10 Minuten gemischt, dann wurde die Mischung in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6 1:12,5 verdünnt.
In beiden Verdünnungen wurde die proteolytische Aktivität mit Azocasein als Substrat gemessen.
Hauttests
Patchtestkammesrn (van der Bend) von 10 × 10 mm, gefüllt mit 50 μl einer Testlösung wurde auf die Haut des oberen Teils des Rückens von 2 gesunden Subjekten platziert und mit Fixomull Stretch-Selbstklebeband fixiert; die Entfernung zwischen ihnen war 15 mm. Eine Serie von 4 Testkammern wurde von kranial zu kaudal platziert, eine zweite Serie von kaudal zu kranial.
Die Testlösungen hatten die folgende der Zusammensetzung:

A. Elastase, Trypsin und α-Chymotrypsin, Endkonzentration jedes der Enzyme 1% (Enzymmischung) gelöst in sterilisiertem Fäkal-Supernatant von einem Ileostomie-Patienten (FS)
B. FS
C. EURO 2 (Endkonzentration 5%) gelöst in FS mit Enzymmischung
D. EURO 2 in FS Nach 24 Stunden wurden die Testkammern entfernt, und die Haut wurde mit Leitungswasser gespült. Die Stellen wurden nach 1, 2, 4, 6 und 24 Stunden auf Erythema und Dermatitis untersucht. Ein vergleichbarer Hauttest wurde mit der stärker gereinigten Kartoffelproteinfraktion (EURO 3) durchgeführt, Endkonzentration 1%. Eine fünfte Testkammer wurde zur Kontrolle von Kontaktdermatitis aufgebracht:
E. Kartoffelprotein in destilliertem Wasser.

12 gesunde Subjekte wurden getestet.
Allergietests
Typ 4 (Kontaktdermatitis): 31 Patienten der Dermatologieabteilung (AZR) wurden mit dem verhältnismäßig gereinigten (EURO 3) Kartoffelprotein gemäß Standardprotokollen getestet. Typ 1 (IgE-vermittelt): Pricktest: Zehn Patienten der Allergieabteilung (AZR) mit Nahrungsallergie und ein Patient mit einer schwerwiegenden Allergie gegenüber Kartoffelprotein wurden getestet.
Ergebnisse
1 Proteolytische Aktivität im Kot
Proteolytische Aktivität in Kot bei gesunden Subjekten war niedrig. Jedoch zeigt Tabelle 1, dass Patienten mit CD, Ileostomiepatienten und Patienten mit einem Beutel (mit und ohne Pouchitis) eine hohe proteolytische Aktivität aufweisen.
Tabelle 1: Proteolytische Aktivität im Kot gesunder Subjekte und Patienten
Vergleichbare Ergebnisse wurden bei fäkalen Proben von Labortieren gefunden. Kot von normalen Hunden und Ratten hatte eine sehr niedrige proteolytische Aktivität. Es wurde festgestellt, dass die proteolytische Aktivität hoch war beim Ileostomieausstoß sowie trotz Okklusion bei ventilfreien Beuteln von Hunden; allerdings zeigten Kontinenzbeutel eine vollständige Normalisierung betreffend die proteolytische Aktivität (sowie mehrerer anderer Parameter, die in diesem Kontext nicht erörtert werden). Im Unterschied zu keimfreien Ratten ist die proteolytische Aktivität im Dickdarm von konventionellen Tieren stark vermindert, was auf eine Rolle für die Dickdarmflora bezüglich der Deaktivierung (und/oder den Abbau) von Verdauungsproteasen hindeutet. Bei Säuglingen variiert die proteolytische Aktivität mit dem Alter. Eine Einschätzung der proteolytischen Aktivität im Kot von gesunden Säuglingen und Kindern zeigen bei Säuglingen (n = 10, 4–12 Monate) sehr hohe Aktivität, bei Kindern (n = 9, 1–2 Jahre) geringere, aber immer noch hohe Aktivität und bei Kindern (n = 12, 2–8 Jahre), abnehmende Aktivität.
In einem weiteren Experiment wurde wieder festgestellt, dass die proteolytische Aktivität im Kot von 31 Kindern mit dem Alter abnahm: im Alter von 4 Monaten (n = 4) wurden 191 mg hydrolysiertes Azocasein/h/g Kot, bei Kindern von 6 Monaten (n = 2): 109 mg, bei einem Kind von 8 Monaten (n = 1): 118 mg, bei Kindern von 11 Monaten (n = 3): 105 mg, bei Kindern von 16 Monaten (n = 3): 73 mg, bei Kindern von 24 Monaten (n = 6): 34 mg, bei Kindern von 3 Jahren (n = 5): 24 mg, bei Kindern von 5 Jahren (n = 3): 3 mg, bei Kindern von 7 Jahren (n = 4): 14 mg gefunden.
2 Hemmung der proteolytischen Aktivität
pH-Wert
3 zeigt, dass die pH-Abhängigkeit von der proteolytischen Aktivität bei jeder der getesteten Proben ähnlich war. Bei pH-Wert 6,8 und 7,6 waren die Aktivitäten drei- bzw. viermal höher als bei pH-Wert 5,2 (P < 0,001 für beide Vergleiche). Dies bedeutet, dass bei pH-Wert von 5,2 die proteolytische Aktivität um 75% gehemmt ist.
STI
Die nächste Tabelle (Tabelle 2) zeigt die Ergebnisse unserer ersten Versuche mit Proteasehemmstoffen. Die Bedingungen der Experimente waren anders, aber Trasylol, Ovomucoid und FCS hatten Wirkungen auf die proteolytische Aktivität, die weniger vielversprechend oder (widerstreitend) war als STI. Bei einer Konzentration von 1% (w/v) war die Hemmung mehr als 80%.
Tabelle 2: Hemmung der proteolytischen Aktivität bei Patienten und Hunden

* Hemmstoff zum Kot hinzugefügt 1:2000 verdünnt; 20 h inkubiert mit Substrat
° Hemmstoff zum Kot hinzugefügt 1:100 verdünnt, 2 h inkubiert
✝ Unverdünnter Kot + Hemmstoff (3 + 1), Mischen für 2 h, dann 1:100 verdünnt
⁺ Unverdünnter Kot + Norit (4 + 1), Mischen für 2h (oder 13 min), dann 1:100 verdünnt
** 2 g Kot + 0,5 ml Trasylol; Mischen für 15 min, dann verdünnt

Norit
Mehrere Arten Norit wurden mit Kot von Beutelpatienten mit einer hohen proteolytischen Aktivität auf optimale Absorptionsqualitäten getestet, um als Protease-Hemmstoff in Flüssigkeit verwendet zu werden, um IAA-Patienten nach ihrer Operation zu spülen. In diesem Experiment wurde auch Premium Powder getestet. Tabelle 3 zeigt, dass die adsorbierenden Kapazitäten von Norit PRSH und Norit E für Proteasen äußerst stark waren.
Tabelle 3: Effekt von Norit auf die proteolytische Aktivität in Kot
Die Hemmung der proteolytischen Aktivität von Norit wurde durch Verwenden von Magermilchplatten bestätigt; das Kasein im Nährboden wird durch Proteasen hydrolysiert, und nach Behandlung mit TCA lässt sich Klärung feststellen.
Norit PRSH wurde in verschiedenen Konzentrationen bei pH-Wert 5,2 und 7,6 getestet.
Tabelle 4: Effekt von Norit PRSH auf die proteolytische Aktivität in Kot
Kartoffelsaft (PJ)
PJ wurde anfangs flüssig vorbereitet und getestet; später wurde ein gefriertrocknetes Produkt hergestellt. Die anfängliche Endkonzentration des PJ-Pulvers in den fäkalen Suspensionen war 17%. Tabelle 5 zeigt die Hemmung der fäkalen proteolytischen Aktivität durch PJ und PJ-Pulver.
Tabelle 5: Effekt von Kartoffelsaft (PJ) auf die proteolytische Aktivität in Kot

* Kot 1:12,5 verdünnt in Puffer, dann gemischt mit PJ (1 + 1)
° Kot und PJ 1:1 gemischt für 15 min, zentrifugiert, 1:25 verdünnt
✝ Kot und PJ-Pulver (1 g in 2 ml Puffer) 1:1, dies ergibt eine Endkonzentration von 17%; keine weiteren Verdünnungen für den Versuch
⁺ Dasselbe Experiment wie ✝, aber die Mischung wurde für den Versuch 1:25 verdünnt

Erwärmung des PJ-Pulvers in einer Lösung von 1 g in 4 ml Puffer (Endkonzentration im Kot 5%) verminderte die Hemmstoffkapazität wie folgt:

Nicht erhitztes PJ: 65% Hemmung der proteolytischen Aktivität

30 Minuten bei 55°C: 64%

30 Minuten bei 80°C: 47%

30 Minuten bei 90°C: 24%

30 Minuten bei 100°C: 14%

Wirkung von Proteasehemmstoffen auf die Aktivität von reinen Enzymen ist in Tabelle 6 dargestellt. PJ-Pulver ist ein sehr starker Hemmstoff mehrerer Bauchspeicheldrüsenenzyme, Papain und Pronase. Tabelle 6: Effekt der Hemmstoffe auf gereinigte Enzyme

Testen von Trypsinhemmstoffen von Sojabohnen

STI-A:	STI-Typ I-S Sigma T 9003
STI-B:	STI-Typ II-S Sigma T 9128
STI-C:	Bowman-Birke Hemmstoff Sigma T 9777, Enzymkonzentra tion war 0,02%, Hemmstoffkonzentration (Endkonzentration) war 0,125%.

Mögliche Interaktionen des PJ-Hemmstoffs mit dem Substrat wurden durch Verwenden von verschiedenen Konzentrationen von Azocasein bei demselben Versuch getestet. Keine Interaktionen wurden gefunden:
Tabelle 7:
Hauttests
Nach dem Entfernen der Pads und des Kambrik wurde die Haut sorgfältig mit Leitungswasser gereinigt und sofort sowie nach 1–18 h beurteilt. Keine Reaktion wurde bei sterilisiertem Kot (2) und bei STI in Puffer (4) festgestellt, jedoch gemäßigte Röte, Papula und einige Vesicula konnten an der Stelle 1 (fäkales Supernatant) beobachtet werden. Stelle 3 (fäkales Supernatant mit STI) zeigte eine leichte Röte, die innerhalb von 60 min verschwand.
Die Wirkung von Kartoffelsaft oder davon abgeleiteten Hemmstoffen wurde ebenfalls in vitro und in einem Hauttest überprüft. Die Ergebnisse sind in 1–6 dargestellt. Es ist möglich, 90–100% der gesamten proteolytischen Aktivität zu deaktivieren; Auszüge aus Kartoffeln, wie Kartoffelsaft oder davon abgeleitete Hemmstoffe sind in der Lage, fäkale Proteasen zu deaktivieren, was Entzündungen verhindert.
In den Hauttests erwiesen sich PJ sowie seine verschiedenen gereinigten Fraktionen als sehr wirksam, wenn zur Behandlung und Verhinderung einer Entzündung aufgebracht. Während sterilisiertes fäkales Supernatant von einem Ileostomiepatienten eine Entzündung der Haut und eine schwerwiegende Dermatitis (Röte, Ödem, Vesicula, Schmerzen) verursachte, wurde in beiden Fällen keine Entzündung festgestellt, wenn proteolytische Enzyme, oder wenn Kartoffelsafthemmstoff hinzugefügt wurde. So sind zum Beispiel Salben wie Cremes oder Gele imstande, wenn mit PJ-Hemmstoff gemischt, lokale Dermatitis zu hemmen oder zu verhindern.
Weiterhin wurden keine allergischen oder anderen ungünstigen Reaktionen gegen beide Kartoffelsaftprodukte festgestellt.
Hemmung von Makrophagen-Proteasen
Die Produktion von proteolytischen Enzymen durch Mausmakrophagen wurde durch TNFα stimuliert. Das Hinzufügen gereinigter Kartoffelproteine (EURO 3) hemmte die Aktivität von Elastase-ähnlichen Proteasen um 70%. Elastase-Aktivität in mU

Makrophagen (6.10⁸ Zellen) 26,5

Makrophagen (6.10⁸ Zellen) + EURO 3 (1%) 8,0
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivität (gereinigter) menschlicher Leukozytenelastase durch Kartoffelproteasenhemmstoffe reduziert wird.
Diskussion
Ferner zeigen diese Versuche, dass Patienten mit Darmentzündungen und/oder Resektionen des Ileums oder Dickdarms, ebenso wie Säuglinge und Kinder bis zu 2 Jahren, eine gesteigerte fäkale proteolytische Aktivität aufweisen. Diese Enzyme stammen vom Magen, vom Bürstensaum oder sind mikrobiellen und/oder zellulären (Granulozyten, Makrophagen) Ursprungs. Diese Enzyme beeinträchtigen die schützende Schleimschicht des Darmes wie auch die Haut in der perinealen Zone.
Sowohl rohe als auch gereinigte Kartoffelproteine (Protease-Hemmstoffe) hemmen die Aktivität von fäkalen Proteasen (hydrolysierendes Azocasein) und die Aktivität von Makrophagenelastase (hydrolysierendes N-Succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Prolyl-L-Leucin-p-Nitroanilid). Gereinigte Bauchspeicheldrüsenenzyme, Trypsin, Chymotrypsin und Elastase werden ebenso von PJ (roh oder gereinigt) gehemmt.
Bei einem Hauttest entwickelte sich Dermatitis innerhalb von 24 Stunden bei Verwendung gereinigter Bauchspeicheldrüsenproteasen, aufgelöst in sterilisiertem fäkalem Supernatant. Dieser Test ist mikrobiologisch sicher, aber die zusätzlichen Effekte der fäkalen Verbindungen, wie Gallensäure, bleiben erhalten. Die Dermatitis wurde durch die Hinzufügung von rohen oder gereinigten Kartoffelproteaseinhibitoren zur Testlösung vollständig unterbunden.
Es ist wahrscheinlich nicht ratsam, fäkales Supernatant (aus Gründen der Sicherheit) nochmals zu verwenden, aber eine Mischung aus den 3 gereinigten Enzymen in entsprechenden Konzentrationen hat dieselbe Wirkung. Azocasein ist ein Substrat, das durch mehrere hydrolytische Enzyme hydrolysiert wird, aber es können auch enzymspezifische Substrate getestet werden. STI ist nur einer der Hemmstoffe aus Sojabohnen, die Trypsin und Chymotrypsin, nicht aber Elastase hemmen.
Figuren
1: Hemmung der fäkal proteolytischen Aktivität durch Produkte aus Kartoffelsaft.
Kot von einem Patienten mit einem gut funktionierenden Beutel wurde verwendet.
Kot wurde unverdünnt verwendet.
EURO's wurden verwendet als 1:5, 1:10, 1:25, 1:50 und 1:100 Verdünnungen in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6.
Kot und EURO wurden 1:1 gemischt für 10 Minuten, dann wurde die Mischung in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6 1:12,5 verdünnt.
Bei beiden Verdünnungen wurde die proteolytische Aktivität mit Azocasein als Substrat gemessen.
2: Hemmung der fäkalen proteolytischen Aktivität durch Produkte aus Kartoffelsaft Kot von einem Patienten mit Ileostomie wurde verwendet.
Kot wurde unverdünnt verwendet.
EURO's wurden verwendet als 1:5, 1:10, 1:25, 1:50 und 1:100 Verdünnungen in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6.
Kot und EURO wurden 1:1 gemischt für 10 Minuten, dann wurde die Mischung in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6 1:12,5 verdünnt.
Bei beiden Verdünnungen wurde die proteolytische Aktivität mit Azocasein als Substrat gemessen.
3: Hemmung der fäkalen proteolytischen Aktivität durch Produkte aus Kartoffelsaft Kot von einem Patienten 14 Tage nach Kolektomie wurde verwendet.
Kot wurde unverdünnt verwendet.
EURO's wurden verwendet als 1:5, 1:10, 1:25, 1:50 und 1:100 Verdünnungen in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6.
Kot und EURO wurden 1:1 gemischt für 10 Minuten, dann wurde die Mischung in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6 1:12,5 verdünnt.
Bei beiden Verdünnungen wurde die proteolytische Aktivität mit Azocasein als Substrat gemessen.
4 und 5: Hemmung der fäkalen proteolytischen Aktivität durch Produkte aus Kartoffelsaft Kot von zwei 4 Monate alten Babys wurde verwendet.
Kot wurde 1:1 in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6 verdünnt und 10 Minuten bei 10.000 g zentrifugiert.
EURO's wurden verwendet als 1:5, 1:10, 1:25, 1:50 und 1:100 Verdünnungen in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6.
Kot und EURO wurden 1:1 gemischt für 10 Minuten, dann wurde die Mischung in Phosphatpuffer pH-Wert 7,6 1:12,5 verdünnt.
Bei beiden Verdünnungen wurde die proteolytische Aktivität mit Azocasein als Substrat gemessen.
6: Patch-Testkammern (van der Bend) von 10 × 10 mm, gefüllt mit 50 μl einer Testlösung wurden auf der Haut des oberen Teils des Rückens von 2 gesunden Subjekten platziert und mit Fixomull Stretch-Selbstklebeband fixiert; die Entfernung zwischen ihnen war 15 mm. Eine Serie von 4 Testkammern wurde von kranial zu kaudal platziert, eine zweite Serie von kaudal zu kranial.
Die Testlösungen hatten die folgende Zusammensetzung:

A. Elastase, Trypsin und α-Chymotrypsin, Endkonzentration jedes der Enzyme 1% (Enzymmischung) gelöst in sterilisiertem fäkalem Supernatant von einem Ileostomiepatienten (FS)
B. FS
C. EURO 2 (Endkonzentration 5%) gelöst in FS mit Enzymmischung
D. EURO 2 in FS

Nach 24 Stunden wurden die Testkammern entfernt, und die Haut wurde mit Leitungswasser gespült. Die Stellen wurden nach 1, 2, 4, 6 und 24 Stunden auf Erythema und Dermatitis untersucht.
7: Derselbe Patchtest wie bei 6 beschrieben, aber die rohe Hemmstofffraktion wurde ersetzt durch die stärker gereinigte Fraktion (EURO 3).

E. EURO 3 in destilliertem Wasser.

Claims

Verwendung eines aus Knollen oder Wurzeln gewonnenen Inhibitors der proteolytischen Aktivität der Bauchspeicheldrüsen- und Granulozytenprotease zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Verminderung oder Verhütung einer durch Exkremente verursachten Entzündung.
Verwendung eines aus Knollen oder Wurzeln gewonnenen Inhibitors der proteolytischen Aktivität der Hauchspeicheldrüsen- und Granulozytenprotease zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Verminderung oder Verhütung einer Entzündung, wobei die Entzündung eine intestinale, perineale, perianale oder peristomale Entzündung ist.
Verwendung eines aus Knollen oder Wurzeln gewonnenen Inhibitors der proteolytischen Aktivität der Bauchspeicheldrüsen- und Granulozytenprotease zur Herstellung einer Körperflege-Zusammensetzuag für die Verminderung oder Verhütung einer durch Fäkalien verursachten Entzündung oder einer intestinalen, perinealen, perianalen oder peristomalen Entzündung.
Verwendung eines aus Knollen oder Wurzeln gewonnenen Inhibitors der proteolytischen Aktivität der Bauchspeicheldrüsen- und Granulozytenprotease zur Herstellung einer Windel.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die proteolytische Aktivität eine fäkale ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Inhibitor aus Kartoffeln gewonnen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Inhitibor in der Lage ist, Papain und/oder Pronase zu inhibieren.
Kartoffelsaft zur Verwendung als Medikament.
Körperpflege-Zusammensetzung, welche eine konzentrierte Mischung von aus Kartoffelknollen oder wurzeln gewonnenen Proteaseinhibitoren enthält.
Windel die Kartoffelsaft enthält.
Körperpflege-Zusammensetzung zur Verminderung oder Verhütung einer durch Fäkalien verursachten Entzündung oder einer intestinalen, perinealen, perianalen oder peristomalen Entzündung, wobei die Zusammensetzung Kartoffelsaft enthält.
Windel, die einen aus Knollen oder Wurzeln gewonnenen Inhibitor der proteolytischen Aktivität der Bauchspeicheldrüsen- und Granulozytenprotease enthält.