ES2245510T3 - Inhibidores de proteasa derivados de tuberculos o raices para prevenir o tratar la inflamacion o el prurito. - Google Patents
Inhibidores de proteasa derivados de tuberculos o raices para prevenir o tratar la inflamacion o el prurito.Info
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Abstract
Uso de un inhibidor derivado de tubérculo o raíz de actividad proteolítica de proteasa pancreática y de granulocitos para preparar una composición farmacéutica para reducir o prevenir la inflamación causada por las heces.
Description
Inhibidores de proteasa derivados de tubérculos o
raíces para prevenir o tratar la inflamación o el prurito.
La invención se refiere a medios para prevenir,
tratar o reducir la inflamación mediante la inhibición de la
actividad proteolítica, más específicamente para prevenir o reducir
inflamaciones de la piel o el intestino.
Las inflamaciones de la piel (dermatitis) o del
intestino (enteritis) tienen son de naturaleza diversa.
Inicialmente, las reacciones alérgicas, infecciones con
microorganismos (patógenos), excoriación por medios químicos o
físicos, y otras causas son instrumentos de una inflamación. Estos
acontecimientos causales se siguen inmediatamente con la reacción
necesaria del organismo, lo que tiene como resultado una interacción
de acciones y acontecimientos dirigidos a la restauración de la
piel o el intestino a su estado original. En esta interacción de
causa y efecto, se observan varias actividades de encimas
proteolíticas. Los granulocitos, los mastocitos, los macrófagos y
otros intermediarios de las respuestas inflamatorias y atraídos por
las citoquinas hacia un punto de inflamación contienen (y secretan)
proteasas, tales como proteasa quimotríptica y elastasa, que actúan
como mediadores o son instrumentos en la escisión y eliminación de
proteínas derivadas de patógenos o del tejido degenerado del
entorno. Las bacterias, bien como agente causal principal o durante
una infección secundaria, y otros microorganismos (patógenos),
secretan proteasas que dañan el tejido adyacente para sus fines. En
este campo de batalla entre el huésped y el invasor, el exceso de
reacciones proteolíticas se mantiene a raya mediante inhibidores de
proteasa, a menudo muy específicos. Son bien conocidos los sistemas
inhibidores proteinasa/proteinasa, tales como el inhibidor
PMN-elastasa/alfa-1-proteinasa
y catepsina
G/alfa-1-antiquimotripsina.
Sin embargo, las propias enzimas proteolíticas
pueden también ser una causa de inflamación. Esto es especialmente
el caso de las enzimas digestivas, que se encuentran en el tracto
intestinal. Con el fin de degradas las proteínas de la dieta, el
estómago, el páncreas y el borde en cepillo del intestino delgado
secretan varias clases de proteasas. La pepsina del estómago
funciona de forma óptima a pH 2, las enzimas pancreáticas y del
borde en cepillo, tales como la tripsina, la quimotripsina y la
elastasa funcionan de forma óptima a pH 7-8. En
adultos, el intestino delgado tiene una longitud de siete metros y
el tiempo de tránsito de sus contenidos es de aproximadamente 3
horas.; esta parte del intestino está colonizada por sólo unas
pocas bacterias, aunque está llena con una mezcla acuosa de
alimentos y una gran matriz de grandes cantidades de enzimas
digestivas, tal como lipasas y proteasas. Sin embargo, en el
intestino grueso (el colon y el ciego), el contenido de agua está
muy reducido y la actividad de las enzimas está neutralizada por,
por ejemplo, bacterias. Por últimos, los residuos neutralizados y
digeridos de los alimentos y las bacterias (heces) salen del
organismo a través del recto. Únicamente cuando el colon no puede
reducir de forma eficaz el contenido de agua y neutralizar las
enzimas, las heces pueden contener todavía actividad proteolítica
que, durante periodos de diarrea o de incontinencia fecal pueden ser
muy irritantes para la piel intraanal y perineal.
La piel, especialmente en seres humanos, es,
aunque está protegida por el estrato córneo compuesto
principalmente por queratina, como cualquier otra sustancia
proteinácea, muy susceptible a la acción proteolítica de las
proteasas, en consecuencia, el fluido como el contenido del
intestino delgado puede producir inflamación grave.
En bebés y lactantes, el intestino está mucho
menos desarrollado, especialmente el colon funciona de forma
diferente a como lo hace en adultos. Esta es la razón por la cual
las enzimas digestivas en las heces de bebés y lactantes no están
neutralizadas; los contenidos de las heces son más similares a los
contenidos del intestino delgado, aunque habiendo pasado el colon.
Por tanto, la dermatitis perineal (perianal) se encuentra con más
frecuencia en bebés o lactantes que en adultos. Asimismo, los
lactantes y niños (hospitalizados) con trastornos
gastrointestinales son susceptibles a tales dermatitis. Tal
dermatitis o prurito, definidos por eritema cutáneo irritante,
vesículas, humedad, edema o alteración (excoriación) de la piel
perianal, también se encuentra con el eritema del pañal, y se puede
manifestar en formas desde bastante leves a muy graves. Con el
eritema del pañal, factores que lo complican son la acumulación de
orina, en la que la urea se convierte en amoniaco por la acción de
las bacterias fecales, lo que aumenta el pH hasta un valor incluso
mejor para la actividad de las enzimas proteolíticas. Dado que la
piel es extremadamente susceptible a las infecciones, se debe tomar
precauciones para prevenir tales inflamaciones relacionadas con la
actividad proteolítica (fecal).
Otros casos más de dermatitis se encuentran con
pacientes que se han sometido a resecciones de colon y/o ileon con
un estoma. La reservoritis, inflamación intestinal, es una
complicación importante de la anastomosis ileoanal con construcción
de una bolsa tras la resección del colon y se caracteriza por
síntomas clínicos e inflamación del depósito (bolsa). La dermatitis
periestomal (circumestomal) se encuentra en los pacientes a los que
se les ha realizado un ileostoma que se abre en la superficie del
abdomen y termina en un depósito artificial que necesita vaciarse
diariamente. En las enfermedades intestinales inflamatorias (III,
tales como la enfermedad de Crohn (EC), la colitis ulcerosa (CU) y
la reservoritis) y la inflamación de etiología desconocida, no se
conoce el papel de la flora intestinal y los patógenos, de las
enzimas proteolíticas derivadas de estos microorganismos y las
enzimas proteolíticas endógenas (p. ej., pancreáticas o de
leucocitos/granulocitos), y su contribución a la degradación de
mucoglicoproteínas protectoras y los tejidos subyacentes.
Especialmente en los casos anteriores, en los que
se elimina el colon o su función está afectada o es inmadura, es
evidente que cuando las heces se excretan la actividad
proteolíticas es todavía muy elevada, lo que conduce a dermatitis
perineal de varios grados.
No es necesario decir que se han desarrollado
muchos medicamentos e instrumentos de atención personal con el fin
de remedia las consecuencias de picor (intensos) y a menudo
doloroso de las inflamaciones comentadas anteriormente. El
tratamiento general con antiinflamatorios a menudo recurre al
tratamiento con corticosteroides, a pesar de los graves efectos
adversos que se suelen observar con estos medicamentos. Otras formas
de tratamiento se basan principalmente en proporcionar una capa
protectora a la piel por ejemplo mediante la aplicación de un
ungüento con base lipídica, que contienen aditivos tales como cinc,
o limpiando frecuentemente una zona de riesgo. Se han desarrollado
instrumentos especiales para la atención personal, que varían desde
toallitas húmedas para el cuidado de la zona perineal, pañales que
permanecen muy secos a pesar de que el niño o el paciente los
ensucia mucho, hasta instrumentos para el cuidado del estoma), tales
como discos adhesivos y absorbentes y fluido para limpiar el
estoma, que están diseñados específicamente para el cuidado del
estoma de pacientes con ileostomía o anastomosis ileoanal.
El documento
JP-A-03176033 describe un extracto
de soja que contiene tripsina para controlar el eritema del
pañal.
Sin embargo, ninguno de estos tratamientos puede
de verdad hacer algo más que aliviar uno o más de los síntomas
clínicos que se han descrito antes y que se describirán a
continuación.
La invención proporciona un procedimiento para
tratar, reducir o prevenir una inflamación o prurito que comprende
someter a un mamífero a un tratamiento con al menos in inhibidor
que sea capaz de inhibir la actividad proteolítica.
Preferentemente, la invención proporciona un procedimiento por el
que se inhibe una proteasa producida o secretada, por ejemplo por
granulocitos, mastocitos, macrófagos y otros productos intermedios
en los procesos inflamatorios. La invención es aplicable a la
medicina y la asistencia humana y veterinaria.
La invención queda definida por las
reivindicaciones 1-12.
Una forma de realización preferida de la
invención es en la que dicho mamífero es un ser humano que padece,
por ejemplo, dermatitis o prurito. Tratar por ejemplo una
dermatitis, con un inhibidor de la proteasa reduce la actividad
proteolítica de las proteasas implicadas en el prurito de la
inflamación. Especialmente en la interacción de causas y efectos
observados durante la inflamación, la actividad de las enzimas
proteolíticas es demasiado elevada, la invención proporciona un
procedimiento para reducir esta actividad (ya sea del huésped o del
invasor) mediante el tratamiento con al menos un inhibidor que sea
capaz de inhibir la actividad proteolítica.
Dicho tratamiento se proporciona mediante la
aplicación de dicho inhibidor en un ungüento, una crema, un gel, un
polvo o cualquier otra forma adecuada a la localización de la
inflamación. Estas sustancias pueden portarse también, por ejemplo,
en toallitas impregnadas con un inhibidor, en atomizadores o en
fluido de lavado.
En una forma de realización preferida de la
invención, el tratamiento se proporciona para una inflamación
intestinal, perineal o periestomal, como se observa, por ejemplo,
con bebés o lactantes con eritema del pañal, con niños o adultos con
diarrea o incontinencia fecal, con pacientes con síndrome
intestinal inflamatorio y con pacientes con estoma, en los que
todos ellos padecen los efectos de la actividad proteolítica que es
principalmente fecal.
El tratamiento de la actividad proteolítica fecal
se puede realizar mediante la aplicación de dicho inhibidor en un
ungüento, una crema, un gel, un polvo o cualquier otra forma
adecuada a la localización perineal o periestomal de la inflamación.
Las inflamaciones intestinales, tales como las que se observan con
las III o la reservoritis, se pueden tratar limpiando la
localización afectada en el tracto digestivo mediante, por ejemplo,
la administración de un enema, o pueden administrarse por vía oral,
preferentemente en una composición farmacéutica, tal como un jarabe
o una píldora mixta, que puede pasar por el esófago y el estómago
sin verse afectadas relativamente.
Estas sustancias inhibidoras pueden portarse
también, por ejemplo, en toallitas impregnadas con un inhibidor, en
atomizadores o en el fluido de lavado. Asimismo, es posible
impregnar un pañal (durante la producción de los pañales o poco
antes de su uso) con un inhibidor, lo que proporciona un
procedimiento y medios contra el eritema o prurito del pañal. En
una forma de realización preferida, tal pañal se trata o impregna
con un inhibidor, según se proporciona mediante la invención en al
menos la zona del pañal (u las partes subyacentes) que tiene,
cuando se está usando, contacto con el perineo del bebé, lactante,
niño o adulto. Con los pañales, dicha zona de contacto normalmente
comprende la superficie del pañal, que está en contacto con el
perineo.
La invención proporciona un procedimiento de
tratamiento que comprende la administración al paciente o mamífero
susceptible a una inflamación, de un inhibidor como se define en la
reivindicación 1. Los inhibidores de la actividad proteolítica son
muy conocidos. Por ejemplo, el ácido tiene un efecto inhibidor sobre
la hidrólisis de proteínas mediante proteasas pancreáticas y, por
tanto, se puede usar una sustancia que disminuya el pH como
inhibidos según la invención.
Asimismo, las sustancias de adsorción, tal como
carbón activado (uno de tales productos se conoce como Norit),
pueden actuar como inhibidor de la proteasa mediante sus
propiedades de adsorción. En la parte experimental se proporcionan
varios ejemplos de un tratamiento proporcionado por la invención en
el que se usa carbón activado, por ejemplo Norit®, para tratar una
inflamación tal como, por ejemplo, reservoritis.
Se conocen muchos inhibidores de la proteasa
(véase, por ejemplo, G. Salvesen y H. Nagase. Proteolytic enzymes,
a practical approach. Eds. R. J. Beynon y J.S. Bond En: The
Practical approach series. 1989.). Aunque se conocen inhibidores
inespecíficos (es decir, \alpha-macroglobulina
plasmática humana), la mayoría discrimina entre clases, o incluso
subclases, de proteasa. Las sustancias tales como aldehídos
peptídicos o péptidos cetonas de clorometilo son muy específicas de
subclases de proteasas (proteinasas), según la secuencia peptídica
a la que imitan. Otras, tales como quelantes metálicos, actúan sólo
contra metaloproteinasas o proteinasas dependientes de calcio. Se
encuentran inhibidores específicos de clase contra la
serinproteinasa, contra la cisteína proteinasa, contra la aspártico
proteinasa y así sucesivamente. Estos inhibidores de la proteasa a
menudo están disponibles en el mercado en forma de sustancias
purificadas para usar en preparaciones bioquímicas y pueden ser
caros.
El procedimientos según la invención es un
procedimiento en el que un inhibidor deriva de una planta que puede
dar lugar a tubérculos o raíces. En la presente memoria
descripitiva derivado, por ejemplo, comprende derivado por
purificación o aislamiento (parcial) o mediante la obtención de la
información genética necesaria y la producción mediante tecnología
recombinante moderna conocida en la técnica.
Las plantas a menudo protegen sus hojas, frutos,
semillas, tubérculos o raíces contra las plagas mediante la
inclusión de potentes inhibidores de proteasa y mezclas de los
mismos en tales hojas, frutos, semillas, tubérculos y raíces. Por
ejemplo, los cereales y las legumbres, tales como el trigo o la
soja, contienen inhibidores de proteasa tales como el inhibidor de
la tripsina de soja (SBTI), que generalmente posee actividad contra
la tripsina o la quimotripsina pero no contra otras clases de
proteinasas. Los tubérculos y las raíces, tales como la patata y la
yuca, aunque también el boniato, la remolacha azucarera y la
batata, y otros, contienen potentes inhibidores de una amplia
variedad de proteasas del tracto digestivo tal como
aminopeptidasas, carboxipeptidasas, quimotripsina, tripsina y
elastasa, y, a causa de esta amplio abanico, se usan los productos
vegetales que derivan de tubérculos o raíces, que comprende
actividad proteolítica según la invención.
Los tubérculos de patata son una fuente
extraordinariamente rica de una variedad de inhibidores de todas
las principales endo y exoproteinasas digestivas intestinales de
animales (Pearce y col., Arch. Biochem. Biophys, 213,
456-462, 1982). Tales inhibidores actúan como
antinutrientes que están presentes como parte de los mecanismos de
defensa químicos naturales de plantas tales como tubérculos y
raíces contra las plagas que la atacan. En las patatas, los
principales inhibidores son el inhibidor polipeptídico de tripsina
(PTI), los inhibidores polipeptídicos de quimotripsina I y II
(PCI-I y PCI-II) y el inhibidor II
contra la quimotripsina y la tripsina, y el inhibidor de la
carboxipeptidasa, todos los cuales tienen análogos en otras
plantas. Estos actúan solos y en conjunto contra las principales
proteinasas digestivas animales.
La invención proporciona el uso de un inhibidor o
un producto o extracto vegetal capaz de inhibir la actividad
proteolítica para preparar una composición farmacéutica o para la
atención personal según las reivindicaciones, para reducir o
prevenir una inflamación o prurito. En la parte experimental, se
proporciona un ejemplo de tal producto, que comprende zumo de
patata o un inhibidor derivado del mismo, por ejemplo mediante
liofilización. Tal composición puede comprender un ungüento, crema,
gel, polvo o cualquier otra forma adecuada por la que un inhibidor
se puede aplicar a un paciente. En una forma de realización
preferida de la invención, la invención proporciona el uso de un
inhibidor o producto vegetal capaz de inhibir la actividad
proteolítica según las reivindicaciones, para preparar una
composición para reducir o prevenir una inflamación o prurito que
sea inflamación o prurito intestinal, perineal o periestomal. Tal
composición puede estar en forma de un fluido de lavado, puede
estar contenida en cápsulas que pasan a través del esófago y el
estómago, puede esta en toallitas o pañales (prefabricados), en los
que el inhibidor (o el producto vegetal) se añade durante la
producción o poco antes de su uso. En una forma de realización
preferida, la invención proporciona el uso de un inhibidor según las
reivindicaciones para preparar una composición de asistencia
personal o médica para el cuidado perineal (perianal) y/o
periestomal, por ejemplo, para contar la actividad proteolítica que
sea fecal.
Por ejemplo, es posible prevenir la dermatitis
perineal mediante el lavado del reservorio y la piel perineal con un
inhibidor de la proteasa que contiene fluido o un ungüento
protector con inhibidores de la proteasa. Asimismo, es posible
tratar previamente los pañales o las composiciones de atención
personal que adsorben la suciedad con un polvo inhibidor.
La invención proporciona el uso de un inhibidor o
un producto vegetal capaz de inhibir la actividad proteolítica para
preparar una composición farmacéutica o de atención personal, en la
que dicho inhibidor o producto deriva de una planta en la que dicha
planta puede dar lugar a tubérculos o raíces, tales como una planta
de patata. Tal inhibidor (producto, composición o mezcla), como se
ha explicado anteriormente, es activa contra una proteasa que se
selecciona del grupo de proteasas pancreáticas y granulocíticas. En
una forma de realización concreta de la invención, dicho inhibidor
(composición o mezcla) es capaz de inhibir la papaína y/o la
pronasa, lo que ilustra su amplio espectro y eficacia.
La invención también proporciona un producto
farmacéutico o de atención personal (por ejemplo, ungüentos, polvo,
fluidos) que comprende inhibidores de la actividad proteasa que
sean capaces de, por ejemplo, prevenir inflamación o prurito causado
por las heces (proteasas fecales mediante la inhibición de las
enzimas proteolíticas de origen pancreático y del borde en cepillo;
de origen bacteriano (flora intestinal); de origen leucocitario
(granulocitos, mastocitos, macrófagos) en caso de inflamación del
intestino; o curar la inflamación o el prurito causado por las
heces mediante la inhibición de las proteasas (tales como elastasa,
catepsinas) producidas por macrófagos, granulocitos, mastocitos
tisulares; o curar la inflamación de la piel, y otras enfermedades
en las que la inflamación y la actividad de la enfermedad está
relacionada con las células inflamatorias infiltrantes (células
efectoras) y la liberación de proteasa; o
curar el prurito en general (el tratamiento a
menudo consiste en antihistamínicos), la aplicación local de
ungüentos con inhibidor de proteasa impide la liberación de
histamina a partir de mastocitos/liberación de proteasa desde los
fagocitos.
La invención también proporciona una composición
para la atención personal, líquidos de lavado, toallitas húmedas,
polvo, ungüentos, para el cuidad perianal y/o periestomal o un
pañal que comprende un inhibidor de actividad proteolítica según las
reivindicaciones. La atención al cuidado de la piel puede comenzar
ya en el momento de la cirugía, por ejemplo un fluido de lavado que
contenga inhibidor. Los inhibidores se pueden incorporar en los
instrumentos del estoma, tales cono discos adhesivos y de adsorción
y en fluidos de lavado del estoma y ungüentos.
La invención se describe además en la parte
experimental, que no limita la invención.
En adultos, el intestino delgado tiene una
longitud de siete metros y el tiempo de tránsito de sus contenidos
es de aproximadamente 3 horas; esta es la razón por la cual esta
parte del intestino, en comparación con el intestino grueso, está
colonizado por sólo unas pocas bacterias. Sin embargo, el colon
está colonizado por un gran número de bacterias
(10^{10}-10^{11}/gramo). El tránsito es lento
(24 horas) y la función principal del colon es la absorción de
agua.
Finalmente, las heces están compuestas por una
parte de sólidos y dos partes de agua. La mitad del material seco
son bacterias; los residuos son, en gran medida, fibra de la dieta
y material derivado del huésped, tal como células epiteliales
desprendidas y mucus. El lugar de fermentación bacteriana más
activo es el sitio en el que los contenidos del íleon alcanzan el
ciego. Existe una gran cantidad de nutrientes disponible, el
porcentaje de agua es elevado y la flora dispone de las condiciones
óptimas para su multiplicación. Se conocen algunos datos acerca de
este parte del intestino (humano), aunque el pH, medido en víctimas
de muerte súbita, es muy bajo (pH 4,5-5,5).
La flora del colon consiste en un 99,9% de
bacterias anaerobias obligadas; las bacterias aerobias anaerobias
facultativas, tales como las coliformes, son una minoría (alrededor
de 104-107 bacterias/gramo de heces). La flora
anaerobia del colon es muy estable y es casi imposible inducir
alteraciones a nivel de especie o de género, incluso mediante
cambios drásticos en la dieta (sin embargo, los antibióticos o la
presencia de infección con enteropatógenos podría alterar la flora
residente). Una de las causas de este fenómeno es que los
nutrientes más importantes derivan de material endógeno, fluidos
digestivos, mucus, etc. Una parte de las proteínas digestivas
(también los ácidos biliares) se reabsorben desde la parte distal
del íleon, el resto se convierte o digiere en el colon. Se piensa
que la flora del colon desempeña un papel importante en la
activación de las enzimas pancreáticas digestivas tales como las
proteasas.
En bebés y lactantes, el intestino está mucho
menos desarrollado, especialmente el colon no funciona tan bien
como en adultos. Esta es la razón por la cual las enzimas
digestivas de las heces de bebés y lactantes no se neutralizan y/o
reabsorben; sus contenidos se asemejan más a los contenidos del
intestino delgado, incluida una actividad proteolítica elevada
aunque haya pasado por el colon.
Las principales fuentes de nutrientes endógenos
son, probablemente, glicoproteínas del mucus gástrico e intestinal
que contienen hasta un 90% de hidratos de carbono. Las glicosidasas
bacterianas degradan las cadenas laterales de los oligosacáridos
que protegen la glicoproteína de la destrucción proteolítica. Cuando
el núcleo proteico carece de la protección de los hidratos de
carbono, ya no es resistente a la proteolisis a través de las
proteasas pancreáticas (y bacterianas). En el colon sano existe un
equilibrio entre la producción y la degradación de mucus.
Se ha prestado mucho atención a las enfermedades
intestinales inflamatorias (III): enfermedad de Crohn (EC), la
colitis ulcerosa (CU) y la reservoritis. La reservoritis es una
complicación importante de la anastomosis ileoanal con construcción
de reservorio, tras la resección de colon por CU, y se caracteriza
por síntomas clínicos e inflamación del reservorio (bolsa). Se
investigó el papel de la flora intestinal en las III e relación con
los patógenos y su contribución a la degradación de las
mucusglicoproteínas protectoras.
Los pacientes con inflamaciones intestinales
muestran una pérdida de integridad de la mucosa. Los inventores han
estudiado el posible papel perjudicial de las glicosidasas
bacterianas y de las proteasa bacterianas y derivadas del huésped
mediante la degradación de las glicoproteínas del mucus. Por tanto,
en pacientes con III, se estimó la composición de la flora
intestinal y la actividad de las glicosidasas y las proteasas.
Asimismo se midió la actividad enzimática en ratas libres de
gérmenes para establecer la influencia de la flora.
Estos estudios mostraron que las heces de
pacientes con EC activa con una ileostomía y de pacientes con una
bolsa tienen una actividad proteolítica elevada. Las proteasas
entran en el duodeno en gran medida en forma de secreciones
procedentes del hígado, del borde en cepillo y del páncreas. Una
parte de la actividad se pierde en el íleon terminal, probablemente
a causa de la absorción y/o acción de los inhibidores endógenos. En
heces de sujetos sanos, únicamente se estimó una actividad
enzimática muy baja, o ninguna, que probablemente sea en su mayoría
de origen bacteriano. sin embargo, animales sin gérmenes, tales
como ratas, muestran una actividad proteolítica elevada en todo el
intestino grueso. Se encontró que los pacientes con III activa,
pacientes con ileostomía y pacientes con una bolsa tenían una
actividad proteolítica fecal elevada. A la luz de estos datos
podemos concluir que es necesaria una flora colónica completa y un
tránsito normal (lento) para inactivar estas enzimas.
La elevada actividad proteolítica en las heces de
pacientes con III puede producir una degradación aumentada de
glicoproteínas de mucus y puede desempeñar un papel en el
mantenimiento de la inflamación de la mucosa. En experimentos in
vitro se confirmó esta hipótesis. La idea nació para tratar
pacientes tales como los que tienen una anastomosis ileoanal (AIA)
con inhibidores de la proteasa para prevenir la dermatitis
perineal. Los pacientes intervenidos por CO o por poliposos
adenomatosa familiar (PAF) se consideran para la construcción de un
reservorio del íleon tras la resección de colon. Este pequeño
reservorio está conectado con el ano. El periodo tras la
intervención resulta muy duro para la mayoría de los pacientes.
Poco después de la intervención, las heces de los pacientes tienen
una consistencia acuosa, a menudo los pacientes (todavía) no
presentan continencia y esto tiene como resultado irritación y
prurito de la piel perineal (dermatitis perineal). La causa
principal de la dermatitis perineal es la degradación de la
epidermis (que consiste en su mayoría en la proteína queratina) por
la acción de las proteasas.
La actividad proteolítica se midió en las heces
de estos pacientes y se encontró que era muy elevada. Además, el
75% de los pacientes desarrollo una dermatitis perineal moderada a
grave; el 25% no presentó ningún signo de irritación.
Se estudiaron muestras fecales de veintisiete
pacientes con enfermedad de Crohn (EC). Doce pacientes, de
27-58 años de edad, se habían sometido a cirugía
intestinal 3-12 años antes; las localizaciones de
las resecciones fueron el íleon terminal, el íleon y el ciego, y el
colon. Un segundo grupo de pacientes no se había operado; los
lugares principales de la inflamación fueron el íleon, el íleon y
el colon, y el colon. El diagnóstico de EC se estableció con los
criterios clínicos, radiológicos e histopatológicos habituales.
Todos los pacientes eran ambulatorios.
Para comparar se estudiaron doce voluntarios
sanos de 23-48 años de edad.
Se obtuvieron los efluentes de ileostomía de
cinco pacientes adultos con una ileostomía convencional (de
38-71 años de edad). Había sufrido una colectomía
total más de cinco años antes para aliviar la EC o la colitis
ulcerosa (CU) y en la actualidad todos tenían buena salud.
Se estudiaron catorce pacientes con una bolsa
(media de edad 27 años). Los pacientes se habían sometido a una
proctocolectomía restauradora por CU o poliposis adenomatosa
familiar. En 12 pacientes se construyó una bolsa en S, mientras que
en dos pacientes se creó una bolsa en W. Este estudio se llevó a
cabo al menos un año después de la colectomía restauradora. El
diagnóstico de reservoritis se basó en síntomas clínicos,
características endoscópicas de inflamación inespecífica aguda y
signos histológicos de un infiltrado celular inflamatorio. Usando
estos criterios, cinco pacientes presentaban reservoritis y nueve
no (controles).
Las muestras fecales de trece pacientes operados
para la construcción de un reservorio con anastomosis ileoanal
(AIA) se recogieron en un plazo máximo de 14 días tras la
intervención. Se midió la actividad proteolítica en las heces de 31
niños sanos de 4 meses a 7 años de edad.
Se estudiaron las heces de 4 ratas convencionales
(Wistar) y 4 ratas sin gérmenes (Wag/Rij). Se estudiaron los
contenidos del tracto intestinal de 2 ratas convencionales y 2
ratas sin gérmenes. Se recogieron las muestras de heces de 20 perros
colectomizados, sabuesos de raza pura (Harlan). Se estudiaron tres
grupos con ileostomía. En diez perros, se construyó una ileostomía
estándar de Brooke mediante colectomía subtotal. En cinco perros, se
creó un reservorio ileal sin válvulas (bolsa) mediante anastomosis
iso-antiperistáltica de un lado a otro. Tras un
periodo de recuperación de 2 semanas, se inició un calendario de
periodos crecientes de oclusión, salvo en 5 perros. El tiempo de
oclusión máximo tolerable fue de 2,5-3 h para el
grupo de ileostomía y de 4-7 h para el grupo con el
reservorio. En cinco perros se construyó una ileostomía de
contención (bolsa de Kock), que se vació 2-5 veces
cada 24 horas mediante cateterización.
Las heces se congelaron y almacenaron a -20ºC
dentro de las 3 h del tránsito. Estudios preliminares mostraron la
ausencia de cambios en la actividad proteolítica durante al menos 4
meses de almacenamiento. Las muestras de 1 g se transfirieron a 24
vol de tampón fosfato 0,1M a pH 7,6 y se homogeneizaron
("Stomacher"; Lab blender 400). Las partículas grandes se
eliminaron de los homogeneizados mediante filtración en gasa
(Utermohlen, replegada en 2 capas); estas muestras se denominan a
continuación "homogeneizados fecales".
Inmediatamente después de sacrificar a las ratas
se retiró el intestino y se preparó. El intestino delgado se
dividió en 4 partes de igual longitud y los contenidos de cada
parte se lavaron cuidadosamente con tampón fosfato 0,1M (pH 7,2).
Las muestras de ciego y colon se trataron del mismo modo que las
heces.
Macrófagos peritoneales de ratón (RAW) se
cultivaron in vitro en 200 ml de DMEM con SBF al 5% y
glutamina 4 mM y se estimularon con 200 U de medio con
TNF\alphamol. Tras 18 horas se recopilaron las células, se
centrifugaron y se resuspendieron en 2 ml de tampón fosfato 0,1M a
pH 7,6. El numero total de células fue de aproximadamente
3.10^{8} por ml. Las células se rompieron mediante congelación
repetida y las muestras se usaron para ensayos con proteasas.
La actividad proteolítica se determinó en los
homogeneizados fecales en las diluciones adecuadas (hasta por 250)
en tampón fosfato 0,1M (pH 7,6). Se añadió penicilina (0,1% p/v)
para impedir el crecimiento bacteriano. En las pruebas de inhibición
más recientes no se usó penicilina. Se incubaron muestras de 0,1 ml
con 0,1 ml de azocaseína al 1% (p/v) (Sigma) en tampón fosfato a
37ºC durante 1 h. La reacción se detuvo mediante la adición de 0,2
ml de ácido tricloroacético (TCA) al 10% (p/v); tras 10 minutos a
temperatura ambiente se eliminaron la azocaseína no hidrolizada,
las bacterias y otras partículas mediante centrifugación a 10.000
rpm durante 10 minutos. A continuación se transfieren 0,1 ml del
sobrenadante limpio a 0,1 ml de NaOH 1N en microplacas de 24
pocillos de fondo plano. A los ensayos en blanco se añadió
azocaseína tras la incubación y adición de TCA. La absorción de las
muestras se midió a 450 nm y se comparó con las curvas estándar
obtenidas a partir de soluciones de azocaseína. La actividad
proteolítica se expresó en miligramos de azocaseína hidrolizada
durante 1 hora por gramo de peso seco o húmedo de muestra, Cada
muestra diluida se probó para otra hidrólisis del sustrato distante
a la enzimática tras calentamiento a 80ºC durante 10 minutos. La
hidrólisis espontánea del sustrato se probó mediante incubación del
sustrato con
tampón.
tampón.
Se usó
N-succinil-L-alanil-L-prolil-L-leucina-p-nitroanilida
(Sigma) como sustrato para estimar la actividad elastasa
leucocitaria humana purificada (Sigma) y elastasa de macrófagos de
ratón. Se incubaron muestras de 0,1 ml con 0,1 ml de sustrato (0,1%
p/v) en tampón fosfato 0,1M a pH 7,6 en una placa de microtitulación
de pocillos de fondo plano. Tras 30 ó 60 minutos, se detuvo la
reacción mediante la adición de 70 \mul de ácido acético al 30% y
se midió la absorción a 400 nm. Se definió una unidad de enzima como
la cantidad que liberó 1 \muml de p-nitroanilida
por minuto a 37ºC.
Para comprobar el efecto del pH sobre la
actividad proteolítica se diluyeron las muestras fecales en ácido
cítrico-tampón fosfato (Na_{2}HPO_{4}
0,1M/2H_{2}O, ácido cítrico 0,1M/H_{2}O) pH 5,2, 5,8, 6,8 y 7,6.
Además, las soluciones del sustrato se prepararon en los tampones
adecuados.
Proteínas de patata crudas o relativamente puras
se diluyeron en PBS. A las proteínas de patata se añadieron
eritrocitos humanos (sin enfermedad) (endoconcentración del 3% de
ery), se mezclaron cuidadosamente durante 1 min, se centrifugaron
durante 2 min a 1500 rpm. Los sobrenadantes se mezclaron de nuevo
con los eritrocitos. Esto se repitió 5 veces hasta que no se
encontró hemaglutinación en una prueba de hemaglutinación. El valor
recíproco de la dilución más elevada de la proteína de patata que
mostró hemaglutinación clara se definió como el título de
hemaglutinación. El título de hemaglutinación disminuyó desde
25.600 a 25-1 por ejemplo. Tras la liofilización, la
actividad inhibidora del producto sin lectinas se comparó con la
fracción proteica original. No se encontró pérdida de actividad
inhibidora cuando se probó en muestras fecales con una actividad
proteolítica elevada y en soluciones de proteasa purificadas
(tripsina, \alpha-quimotripsina y elastasa,
endoconcentración 1%).
Además se obtienen proteínas de patata sin
lectinas mediante el uso de, por ejemplo,
quitooligo-agarosa (Seikagaku).
Las lectinas de proteínas de patata también se
inactiva, no mediante su eliminación de la solución proteica sino
mediante la unión a residuos solubles de hidratos de carbono, tales
como, por ejemplo, N-acetoquitooligosacáridos de
quitina hidrolizada y glicoproteínas del estómago o el intestino.
Las lectinas todavía se encuentran en el producto, pero sí han
perdido su sitio activo.
Se usaron los siguientes inhibidores:
- -
- Trasylol (Aprotinina) (Bayer) no diluido.
- -
- Ovomucoide () 1% (p/v) en tampón fosfato 0,1M pH 7,6
- -
- Suero bovino fetal (SBF) () no diluido
- -
- Inhibidor de tripsina II- de soja (STI) (T-9003; Sigma) 1% (p/v) en tampón fosfato 0,1M pH 7,6
- -
- Norit A (supra USP, 951191), B (prueba EUR, A6910), E (supra USP, 940260), PRSH, Carbomix, comprimidos
- -
- Polvo Premium (Hollister)
- -
- El zumo de patata (ZP) de "Bintjes" se preparó del siguiente modo. Después de pelarlas y lavarlas, las patatas se cortaron en trozos, se filtraron a través de malla cambric con la adición de ácido ascórbico al 0,2%. El zumo se centrifugó a 27.500 rcf durante 30 minutos a 4ºC, se filtró con papel y se centrifugó de nuevo. Los sobrenadantes de color amarillo claro se filtraron a través de un filtro de 0,45 micrómetros y se liofilizaron. Este producto bruto era estéril (controlado con placas de agar sangre) y contenía alrededor de un 25% de proteína. De 200 ml de zumo derivaron diez gramos de polvo de ZP.
En general, los inhibidores de la proteasa que
están presentes en las patatas, por ejemplo, se pueden recuperar
moliendo las patatas, eliminando el almidón y otros sólidos y, por
ejemplo, liofilizando el zumo.
La pureza de la preparación del inhibidor de
proteasa se puede mejorar mediante la eliminación del material no
proteináceo y/o los péptidos de bajo peso molecular y/o los
aminoácidos presentes en el zumo de patata mediante, por ejemplo,
centrifugación, microfiltración, ultrafiltración, diafiltración o
electrodiálisis. Además, la proteína se puede recuperar de forma
selectiva en una forma relativamente cruda de la matriz del zumo de
patata. Esto se puede conseguir mediante, por ejemplo,
ultrafiltración, precipitación isoeléctrica, (co)floculación
con polielectrolitos y cualquier ayuda para la floculación,
coprecipitación con otras proteínas, precipitación de proteínas con
sal (sobresalado) o mediante el cambio de la calidad del
disolvente, por ejemplo, mediante la adición de acetona, metanol,
etanol o alcohol isopropílico, mediante precipitación isoelétrica y
fraccionamiento térmico y otras técnicas conocidas para cualquier
experto en la técnica. Dado que los inhibidores de la proteasa en
el zumo de patata son relativamente termoestables, un tratamiento
térmico moderado conduce a la desnaturalización y coagulación de las
proteínas menos estables. Posteriormente, la proteína coagulada
puede eliminarse mediante técnicas tan sencillas como, por ejemplo,
centrifugación. Aunque se pierde algo de actividad inhibidora de
proteasas, la pureza de los inhibidores de proteasa restantes
aumenta. Más purificación es posible mediante ultrafiltración o
sobresalado de los inhibidores de la proteasa y posterior
eliminación de la sal y otros componentes no deseados mediante
ultra y diafiltración. Como alternativa, el aislamiento de varios
inhibidores de la proteasa es posible mediante cromatografía por
afinidad, bien directamente a partir de la matriz de zumo de patata
bruto o después de la purificación
previa.
previa.
En la mayoría de los experimentos el inhibidor se
añadió a las heces (diluido a 1:25 en tampón), se mezcló durante
5-15 minutos y se añadió al sustrato; se añadió
polvo de ZP a las heces sin diluir (1:1) y después de mezclar se
diluyó (1:25) con tampón. En cada experimento se probaron controles
(heces esterilizadas, inhibidores esterilizados, soluciones
tampón).
En los experimentos de inhibición se analizaron
las siguientes enzimas:
- -
- Tripsina pancreática bovina (Serva)
- -
- \alpha-quimotripsina pancreática bovina (Merck, Sigma)
- -
- Elastasa pancreática bovina (Sigma)
- -
- Papaína (Sigma)
- -
- Pronasa (Sigma)
(también se analizaron la
carboxipeptidasa y la leucinaminopeptidasa, pero no hidrolizaron la
azocaseína)
Todas las enzimas se usaron en una concentración
del 0,2% (p/v) en tampón.
Las pruebas cutáneas se realizaron en la parte
ventral del antebrazo. Se analizaron las siguientes soluciones: 1.
sobrenadante de heces de un paciente con un reservorio ilíaco con
una actividad proteolítica elevada; 2. El mismo sobrenadante, pero
esterilizado; 3. sobrenadante con 0,25% de STI (p/v) y 4. 0,25% de
STI en tampón. Doscientos \mul de cada solución se introdujeron
en cambric plegado en la piel y se cubrieron con plástico y tiritas
adhesivas. El tiempo total de la incubación fue de 7 h, pero después
de 3 y 5 h a cada uno de los parches de prueba de añadieron 100
\mul para impedir la deshidratación.
Euro 1 es polvo de ZP bruto, Euro 2 y Euro 3 son
más puros.
Se usaron heces de 1 paciente con una ileostomía,
1 paciente con una bolsa funcionando bien, 1 paciente 14 días
después de una colectomía y la construcción de una bolsa, 2 bebés
de 4 meses de edad.
Las heces se usaron sin diluir, a excepción de
las de los bebés, que se diluyeron 1:1 en tampón fosfato a pH 7,6 y
se centrifugaron durante 10 minutos a 10.000 g.
Los EURO se usaron en diluciones 1:5, 1:10. 1:25,
1:50 y 1:100 en tampón fosfato a pH 7,6.
Las heces y los EURO se mezclaron a una
proporción 1:1 durante 10 minutos, a continuación la mezcla se
diluyó en tampón fosfato a pH 7,6 a 1:12,5.
En ambas diluciones la actividad proteolítica se
midió con azocaseína como sustrato.
Se colocaron cámaras de pruebas con parches (van
der Bend) de 10 x 10 mm, llenar de 50 \mul de una solución de
prueba en la piel de la parte superior del dorso de 2 sujetos sanos
y se fijaron con esparadrapo adhesivo Fixomull Stretch; la
distancia entre ellos fue de 15 mm. Una serie de 4 cámaras de prueba
se colocó desde la parte craneal a la cauda, una segunda serie se
colocó desde la parte caudal a la craneal.
Las soluciones de prueba tenían la siguiente
composición:
- A.
- elastasa, tripsina y \alpha-quimotripsina, concentración final de cada una de las enzimas 1% (mezcla de enzimas) en solución e sobrenadante fecal esterilizado procedente de un paciente con ileostomía (FS)
- B.
- FS
- C.
- Euro 2 (concentración final 5%) en solución en FS con mezcla de enzimas.
- D.
- Euro 2 en FS.
Después de 24 horas se retiraron las cámaras de
prueba y la piel se lavó con agua corriente. Los puntos se
inspeccionaron en busca de eritema y dermatitis después de 1, 2, 4,
6 y 24 horas.
Se llevó a cabo una prueba cutánea comparable con
la fracción con proteína de patata más purificada (EURO 3),
concentración final 1%. Una quinta cámara cutánea se colocó para
controlar la dermatitis de contacto: E. (proteína de patata en agua
destilada). Se analizaron doce sujetos sanos.
Tipo 4 (dermatitis de contacto): 31 pacientes del
departamento de dermatología (AZR) se analizaron con la proteína de
patata relativamente purificada (Euro 3) según protocolos
estándar.
Tipo 1 (mediada por IgE); pruebas de punción
cutánea: se analizaron 10 pacientes del departamento de alergia
(AZR) con alergia alimentaria y 1 paciente con una alergia grave a
la proteína de patata.
La actividad proteolítica en heces de sujetos
sanos era baja. Sin embargo, la Tabla 1 muestra que los pacientes
con EC, los pacientes con ileostomía y los pacientes con una bolsa
(con y sin reservoritis) poseen una actividad proteolítica
elevada.
\vskip1.000000\baselineskip
| Actividad proteolítica | Peso seco de heces mg/g | |||
| Mediana | (intervalo) | Mediana | (intervalo) | |
| Sujetos sanos | 17,9* | (7,5-44,0) | 313 | (164-403) |
| Pacientes con EC | ||||
| \hskip0,2cm -sin resecciones | 47,9 | (19,1-192,0) | 216 | (128-228) |
| \hskip0,2cm -resecciones | 228,7 | (130,6-356,6) | 134 | (84-175) |
| Pacientes con ileostomía | 336 | (89-972) | 88 | (69-120) |
| Pacientes con una bolsa | ||||
| \hskip0,2cm -sin reservoritis | \hskip0,3cm14** | (5,5-23,5) | 83 | (57-103) |
| \hskip0,2cm -reservoritis | 14 | (7,1-17,3) | 52 | (30-110) |
| Pacientes con AIA | 53 | (18-105) | ND | (<30) |
| \bullet\hskip0,3cm * azocaseína hidrolizada, mg/h/g de heces secas | ||||
| \bullet\hskip0,3cm ** azocaseína hidrolizada, mg/h/g de heces húmedas |
En muestras fecales de animales de laboratorio se
encontraron resultados comparables. Las heces de perros y ratas
normales tenían una actividad proteolítica muy baja. Se encontró
que la actividad proteolítica elevada en la salida de la ileostomía
y en bolsas sin válvulas de perros a pesar de la oclusión; sin
embargo, las bolsas de contención mostraron una normalización
completa en relación con la actividad proteolítica (y varios otros
parámetros que no se comentan en este contexto). En contraste con
las ratas sin gérmenes, en el colon de animales convencionales la
actividad proteolítica está muy disminuida, lo que sugiere un papel
de la flora colónica en la inactivación (y/o degradación) de las
proteasas digestivas. En lactantes, la actividad proteolítica varía
con la edad. Una estimación de la actividad proteolítica en heces
de lactantes y niños sanos muestra en lactantes (n= 10,
4-12 meses) una actividad muy elevada, en niños (n=
9, 1-2 años) menor, aunque todavía una actividad
elevada, y en niños (n= 12, 2-8 años) disminución
de la
actividad.
actividad.
En otro experimento, de nuevo se descubrió que la
actividad proteolítica en heces de 31 niños disminuía con la edad,
en niños de 4 meses (n= 4): 191 mg de azocaseína hidrolizada/h/g de
heces, en niños de 6 meses (n= 2): 109 mg en un niño de 8 meses (n=
1): 118 mg, en niños de 11 meses (n= 3): 105 mg, en niños de 16
meses (n= 3): 73 mg, en niños de 24 meses (n= 6): 34 mg, en niños
de 3 años (n= 5): 24 mg, en niños de 5 años (n= 3): 3 mg, en niños
de 7 años (n= 4): 14 mg.
La Figura 3 muestra que la dependencia del pH de
la actividad proteolítica era similar en cada una de las muestras
analizadas. A pH 6,8 y 7,6, las actividades fueron,
respectivamente, tres y cuatro veces mayores que a pH 5,2 (p<
0,001 para ambas comparaciones). Esto significa que a pH 5,2, la
actividad proteolítica se inhibe en un 75%.
La siguiente tabla (Tabla 2) muestra los
resultados de los primeros experimento de los inventores con
inhibidores de la proteasa. Las condiciones de los ensayos fueron
diferentes, pero Trasylol, ovomucoide y SBF tenían efectos sobre la
actividad proteolítica que eran menos prometedores o (conflictivos)
que el STI. En una concentración de 1% (p/v), la inhibición fue más
del 80%.
| % de inhibición de la actividad proteolítica | ||||||
| Pacientes con EC* | Perro con ileostomía | Perro con bolsa | ||||
| n= 4 | n= 1* | n= 3º | n= 1\dagger | n= 2^{+} | n= 1** | |
| ovomucoide | 68 | 93 | 84 | 52 | ||
| trasylol | 54 | 56 | 16 | |||
| STI 1% (0,25, 0,5, 0,75%) | 93 | 84 (63, 61, 45) | ||||
| SBF | 94 | 0 | ||||
| Ovomucoide + trasylol | 51 | |||||
| ovo+tras+STI | 76 | |||||
| ovo+STI | 70 | |||||
| Norit A | 50 | |||||
| \bullet\hskip0,3cm* inhibidor añadido a las heces diluido a 1:2000; incubado 20 h con sustrato | ||||||
| \bullet\hskip0,3cmº inhibidor añadido a las heces diluido a 1:100; incubado 2 h | ||||||
| \bullet\hskip0,3cm\dagger inhibidor añadido a las heces sin diluir (3+1), mezclado durante 2 h, después diluido a 1:100 | ||||||
| \bullet\hskip0,3cm+ norit heces sin diluir (4 + 1), mezclado durante 2 h (0 13 min), después diluido a 1:100 | ||||||
| \bullet\hskip0,3cm** 2 g de heces + 0,5 ml de trasylol; mezclado durante 15 minutos, después diluido. |
Se analizaron varias clases de norit con heces de
pacientes con bolsas con una actividad proteolítica elevada para
obtener calidades de adsorción óptimas, para usarse como inhibidor
de la proteasa en fluido de lavado de pacientes con AIA tras su
intervención. En este experimento también se analizó polvo Premium.
La tabla 3 muestra que las capacidades de adsorción de norit PRSH y
norit E para las proteasas eran extremadamente fuertes.
| % inhibición de la actividad proteolítica * | |
| Carbomix | 0 |
| Norit A (Serva) | 83 |
| Norit A | 83 |
| Norit B | 0 |
| Norit E | 97 |
| Norit PRSH | 100 |
| Norit en comprimidos | 58 |
| Polvo Premium | 17 |
| \bullet\hskip0,3cm * \begin{minipage}[t]{145mm} heces de 7 pacientes se diluyeron a 1:25 con tampón con norit al 5%; antes de la adición de sustrato, la mezcla se centrifugó (norit puede también adsorber el sustrato); los valores son las medianas.\end{minipage} | |
La inhibición de la actividad proteolítica por
norit se confirmó usando placas con leche desgrasada; la caseína en
el agar se hidroliza mediante proteasas y se observa clarificación
tras el tratamiento con ATA.
Norit PRSH se analizó a concentraciones
diferentes a pH 5,2 y 7,6.
| % inhibición de la actividad proteolítica | ||
| pH 5,2 | pH 7,2 | |
| Norit PRSH 1% | 76 | 36 |
| \hskip1,8cm 2% | 95 | 92 |
| \hskip2cm 3-5% | 100 | 100 |
El ZP de preparó inicialmente y se analizó como
fluido; después se preparó un producto liofilizado. La concentración
final inicial de l polvo ZP en las suspensiones fecales fue del
17%. La tabla 5 muestra la inhibición de la actividad proteolítica
fecal por el ZP y el polvo de ZP.
| % inhibición de la actividad proteolítica | ||||
| Número de pacientes | 4* | 4º | 7\dagger | 7+ |
| ZP | ||||
| \hskip0,2cm- sin diluir | 93 | (50) | ||
| \hskip0,2cm- diluido a 1:5 | 90 | |||
| \hskip0,2cm- diluido a 1:10 | 51 | |||
| \hskip0,2cm- diluido a 1:25 | 23 | |||
| Polvo de ZP | ||||
| \hskip0,2cm- 17% (p/v) | 88 | 97 | ||
| \hskip0,2cm- 10% | 78 | 90 | ||
| \hskip0,2cm- 5% | 53 | 74 | ||
| \hskip0,2cm- 2% | 20 | 44 | ||
| \bullet\hskip0,3cm* heces diluidas a 1:12,5 en tampón, después mezcladas con ZP (1+1) | ||||
| \bullet\hskip0,3cmº heces y ZP a 1:1 mezclados durante 15 min, centrifugados, diluidos a 1:25 | ||||
| \bullet\hskip0,3cm\dagger \begin{minipage}[t]{140mm}heces y polvo ZP (1 g en 2 ml de tampón) a 1:1; esto da una concentración final de 17%; no más diluciones para el ensayo\end{minipage} | ||||
| \bullet\hskip0,3cm+ mismo experimento que en \dagger, pero la mezcla se diluyó a 1:25 para el ensayo |
El calentamiento del polvo ZP en una solución de
1 g en 4 ml de tampón (concentración final en heces del 5%) sí
disminuyó las capacidades inhibidoras del siguiente modo:
ZP si calentar: inhibición del 65% de la
actividad proteolítica
30 min a 55ºC: 64%
30 min a 80ºC: 47%
30 min a 90ºC: 24%
30 min a 100ºC: 14%
El efecto de los inhibidores de la proteasa sobre
la actividad de enzimas puras se muestra en la Tabla 6. El polvo ZP
es un inhibidor muy potente de varias enzimas pancreáticas, papaína
y pronasa.
\vskip1.000000\baselineskip
| % inhibición de la actividad proteolítica | |||||
| Tripsina | Quimotripsina | Elastasa | Pronasa | Papaína | |
| STI (0.125%) | 99 | 99 | 15 | ||
| \hskip0,2cm-STI-A | 100 | 80 | 50 | 0 | 0 |
| \hskip0,2cm- STI-B | 100 | 100 | 60 | 0 | 0 |
| \hskip0,2cm- STI-C | 100 | 100 | 55 | 0 | 0 |
| Trasylol (sin dil.) | 95 | 95 | 10 | ||
| ZP* | 100 | 100 | 100 | 38 | 83 |
| ZP (30 min a 80ºC) | |||||
| \hskip0,2cm- 1:5 | 100 | ||||
| \hskip0,2cm- 1:10 | 100 | 100 | 97 | ||
| \hskip0,2cm- 1:30 | 95 | ||||
| \hskip0,2cm- 1:40 | 94 | ||||
| \hskip0,2cm- 1:50 | 91 | ||||
| \hskip0,2cm- 1:75 | 90 | ||||
| \hskip0,2cm- 1:100 | 99 | ||||
| - 1:1000 | 54 | ||||
| \bullet\hskip0,3cm * 1 g de polvo ZP se mezcló con 2 ml y con 4 ml de tampón. |
ST-A: STI tipo
I-S Sigma T 9003
ST-B: STI tipo
II-S Sigma T 9128
ST-C: Inhibidor
Bowman-Birke Sigma T 9777
La concentración de la enzima fue del 0,02%, la
concentración del inhibidor (concentración final) fue del
0,125%.
Las posibles interacciones del inhibidor ZP con
el sustrato se analizaron mediante el uso de concentraciones
diferentes de azocaseína en el mismo experimento. No se encontraron
interacciones:
\vskip1.000000\baselineskip
| % Inhibición de la elastasa: actividad 80,02%) | ||
| Azocaseína al 1% | Azocaseína al 2% | |
| ZP diluido: | ||
| \hskip0,2cm- 1:50 | 100 | 100 |
| \hskip0,2cm- 1:100 | 97 | 95 |
| \hskip0,2cm- 1:500 | 87 | 75 |
| \hskip0,2cm- 1:1000 | 65 | 66 |
| \hskip0,2cm- 1:2000 | 44 | 51 |
Tras la eliminación de las almohadillas y vendas
cambric, la piel se limpió cuidadosamente con agua corriente y se
determinó inmediatamente y después de 1-18 horas.
No se observó ninguna reacción con heces esterilizadas (2) ni con
STI en tampón (4), aunque sí se pudieron observar enrojecimiento
moderado, pápulas y algunas vesículas en la localización 1
(sobrenadante fecal). La localización 3 (sobrenadante fecal con STI)
mostró un ligero enrojecimiento que desapareció en 0 minutos.
El efecto del zumo de patata o de los inhibidores
derivados del mismo también se analizó in vitro y en una
prueba cutánea. Los resultados se muestran en las figuras
1-6. Es posible inactivar el 90-100%
de la actividad proteolítica total, los extractos de patata, tales
como el zumo de patata o los inhibidores derivados del mismo son
capaces de inactivar las proteasas fecales y esto previene la
inflamación.
En la prueba cutánea, se mostró que el ZP y sus
diversas fracciones purificadas eran muy eficaces cuando se
aplicaron para tratar y prevenir una inflamación. Aunque el
sobrenadante fecal esterilizado de un paciente con ileostomía
provocó una inflamación en la piel y una dermatitis grave
(enrojecimiento, edema, vesículas, dolor) cuando se añadieron
enzimas proteolíticas, no se observó ninguna inflamación cuando se
añadió inhibidor de zumo de patata en ninguno de los casos. Por
ejemplo, ungüentos, tales como cremas o geles, cuando se mezclan
con un inhibidor de ZP son capaces de inhibir o prevenir la
dermatitis loca.
Además, no se observaron reacciones alérgicas ni
adversas contra el producto de zumo de patata.
El TNF-\alpha estimuló la
producción de enzimas proteolíticas por macrófagos de ratón. La
adición de proteínas de patata purificadas (EURO 3) inhibió la
actividad de las proteasas del tipo elastasa en un 70%.
| Macrófagos (6.10^{8} células) | 26,5 |
| Macrófagos (6.10^{8} células) + EURO 3 (1%) | 8,0 |
Estos resultados muestran que la actividad de
elastasa leucocitaria humana (purificada) se reduce por la acción
de los inhibidores de la proteasa de patata.
Además, estos experimentos muestran que los
pacientes con inflamaciones y/p resecciones intestinales del colon o
del íleon, y también en lactantes y en niños de hasta 2 años de
edad presentan una actividad proteolítica fecal elevada. Estas
enzimas son de origen pancreático, del borde en cepillo, microbiano
y/o celular (granulocitos, macrófagos). Estas enzimas alteran la
capa muscular protectora del intestino, Así como la piel de la zona
perineal.
Las proteína de patata tanto crudas como
purificadas (inhibidores de la proteasa) inhiben la actividad de
las proteasas fecales (Azocaseína en hidrólisis) y la actividad de
la elastasa de macrófagos
(N-succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-leucin-p-nitroanilida).
El ZP (crudo o purificado) también inhibe las enzimas pancreáticas
purificadas, tripsina, quimotripsina y elastasa.
En una prueba cutánea, se desarrolló dermatitis
en 24 h usando proteasas pancreáticas purificadas disueltas en
sobrenadantes fecales esterilizados. Esta prueba es
microbiológicamente segura, pero los efectos adicionales de los
compuestos fecales, tales como los ácidos biliares, están intactos.
La dermatitis se impidió por completo mediante la adición de
inhibidores de la proteasa de patata crudos o purificados para
analizar la solución.
Probablemente no sea inteligente usar
sobrenadantes fecales de nuevo (por razones de seguridad), pero una
mezcla de las 3 enzimas purificadas en las concentraciones
adecuadas tiene el mismo efecto. La azocaseína es un sustrato que se
hidroliza por la acción de varias enzimas hidrolíticas, aunque
también se pueden analizar sustratos específicos enzimáticos. El
STI es sólo uno de los inhibidores de la soja, que inhibe la
tripsina y la quimotripsina, pero no la elastasa.
Figura 1: Inhibición de la actividad proteolítica
fecal por los productos del zumo de patata.
Se usaron heces de 1 paciente con una bolsa
funcionando bien.
Las heces se usaron sin diluir.
Se usaron EURO a unas diluciones de 1:5, 1:10,
1:25, 1:50 y 1:100 en tampón fosfato a pH 7,6.
Las heces y el EURO se mezclaron a 1:1 durante 10
minutos, después la mezcla se diluyó en tampón fosfato a pH 7,6 a
1:12,5.
En ambas diluciones la actividad proteolítica se
midió con azocaseína como sustrato.
Figura 2: Inhibición de la actividad proteolítica
fecal por los productos del zumo de patata.
Se usaron heces de 1 paciente con una
ileostomía.
Las heces se usaron sin diluir.
Se usaron EURO a unas diluciones de 1:5, 1:10,
1:25, 1:50 y 1:100 en tampón fosfato a pH 7,6.
Las heces y el EURO se mezclaron a 1:1 durante 10
minutos, después la mezcla se diluyó en tampón fosfato a pH 7,6 a
1:12,5.
En ambas diluciones la actividad proteolítica se
midió con azocaseína como sustrato.
Figura 3: Inhibición de la actividad proteolítica
fecal por los productos del zumo de patata.
Se usaron heces de 1 paciente 14 días después de
una colectomía.
Las heces se usaron sin diluir.
Se usaron EURO a unas diluciones de 1:5, 1:10,
1:25, 1:50 y 1:100 en tampón fosfato a pH 7,6.
Las heces y el EURO se mezclaron a 1:1 durante 10
minutos, después la mezcla se diluyó en tampón fosfato a pH 7,6 a
1:12,5.
En ambas diluciones la actividad proteolítica se
midió con azocaseína como sustrato.
Figura 4 y Figura 5: Inhibición de la actividad
proteolítica fecal por los productos del zumo de patata.
Se usaron heces de 2 bebés de 4 meses de
edad.
Las heces se usaron diluidas a 1:1 en tampón
fosfato a pH 7,6 y se centrifugaron a 10 minutos a 10.000 g.
Se usaron EURO a unas diluciones de 1:5, 1:10,
1:25, 1:50 y 1:100 en tampón fosfato a pH 7,6.
Las heces y el EURO se mezclaron a 1:1 durante 10
minutos, después la mezcla se diluyó en tampón fosfato a pH 7,6 a
1:12,5.
En ambas diluciones la actividad proteolítica se
midió con azocaseína como sustrato.
Figura 6: Se colocaron cámaras de pruebas con
parches (van der Bend) de 10 x 10 mm, llenas de 50 \mul de una
solución de prueba en la piel de la parte superior del dorso de 2
sujetos sanos y se fijaron con esparadrapo adhesivo Fixomull
Stretch; la distancia entre ellos fue de 15 mm. Una serie de 4
cámaras de prueba se colocó desde la parte craneal a la cauda, una
segunda serie se colocó desde la parte caudal a la craneal.
Las soluciones de prueba tenían la siguiente
composición:
- A.
- elastasa, tripsina y \alpha-quimotripsina, concentración final de cada una de las enzimas 1% (mezcla de enzimas) en solución e sobrenadante fecal esterilizado procedente de un paciente con ileostomía (FS)
- B.
- FS
- C.
- Euro 2 (concentración final 5%) en solución en FS con mezcla de enzimas.
- D.
- Euro 2 en FS
Después de 24 horas, se retiraron las cámaras de
prueba y la piel se lavó con agua corriente, Los puntos se
inspeccionaron en busca de dermatitis y eritema después de 1, 2, 4,
6 y 24 horas
Figura 7: La misma prueba en parche que se ha
descrito en la figura 6, pero la fracción de los inhibidores crudos
se reemplazó con la fracción más purificada (EURO 3). E. EURO 3 en
agua destilada.
Claims (12)
1. Uso de un inhibidor derivado de tubérculo o
raíz de actividad proteolítica de proteasa pancreática y de
granulocitos para preparar una composición farmacéutica para
reducir o prevenir la inflamación causada por las heces.
2. Uso de un inhibidor derivado de tubérculo o
raíz de actividad proteolítica de proteasa pancreática y de
granulocitos para preparar una composición farmacéutica para
reducir o prevenir la inflamación, en la que dicha inflamación es
una inflamación intestinal perineal, perianal o periestomal.
3. Uso de un inhibidor derivado de tubérculo o
raíz de actividad proteolítica de proteasa pancreática y de
granulocitos para preparar una composición para la atención
personal para reducir o prevenir una inflamación causada por heces o
una inflamación intestinal perineal, perianal o periestomal.
4. Uso de un inhibidor derivado de tubérculo o
raíz de actividad proteolítica de proteasa pancreática y de
granulocitos para preparar un pañal.
5. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que dicha actividad
proteolítica es fecal.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en el que dicho inhibidor es
un derivado de patata.
7. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que dicho inhibidor es
capaz de inhibir la papaína y/o la pronasa.
8. Zumo de patata para usar como medicamento.
9. Una composición para la atención personal, que
comprende una mezcla concentrada de inhibidores de la proteasa
derivados de tubérculo o raíz de patata.
10. Un pañal que comprende zumo de patata.
11. Una composición para la atención personal
para reducir o prevenir una inflamación causada por heces o una
inflamación intestinal perineal, perianal o periestomal, en la que
dicha composición comprende zumo de patata.
12. Un pañal que comprende un inhibidor derivado
de tubérculo o raíz de actividad proteolítica de proteasa
pancreático o de granulocitos.
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