DE69924268T2

DE69924268T2 - Kombination von bisphosphonat und tetracyclin

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Publication number: DE69924268T2
Application number: DE69924268T
Authority: DE
Inventors: S. Nungavarm RAMAMURTHY; M. Lorne GOLUB; A. Timo SORSA; P. Olli TERONEN; A. Tuula SALO
Original assignee: Research Foundation of State University of New York
Current assignee: Research Foundation of State University of New York
Priority date: 1998-09-28
Filing date: 1999-09-24
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2019-09-25
Also published as: US6114316A; DE69924268D1; JP2002525294A; CA2343098A1; ATE290782T1; ES2237945T3; AU6162099A; EP1117296A4; WO2000018230A1; PT1117296E; WO2000018230A9; AU755871B2; EP1117296B1; US5998390A; KR20010075220A; EP1117296A1

Description

Die Erfindung wurde vom National Institute of Dental Research (NIH) unter der Nummer R37DE03987 unterstützt. Die Regierung hält bestimmte Rechte an der Erfindung.
Die Erfindung betrifft eine Kombination von Tetracyclinen und Bisphosphonaten, die in synergistischer Weise eine Hemmung, Verringerung, Herunterregulierung und/oder Verhinderung des Abbaus von Bindegeweben, Basalmembranen sowie anderen Faktoren, bei Subjekten, die für diesen Typ von Gewebeabbau empfindlich sind, bewirken.
Hintergrund der Erfindung
Eine proteolytische Aktivität ist für eine Schädigung von Bindegeweben und Basalmembranen als eine Komplikation von entzündlichen und/oder Immunreaktionen und anderer Krankheitsvorgänge, wie Kresbzelleninvasionen und Metastasen, verantwortlich. Die entzündliche Reaktion trägt beispielsweise zu den pathologischen Veränderungen in einer Anzahl von akuten und chronischen Prozessen bei, an denen verschiedene Organe und Gewebe beteiligt sind, wie Lunge, Knochen, Herz, Gelenke, Haut und Periodontium bzw. Parodontium und dergl.
Die bei diesen Reaktionen oder Krankheitsprozessen beteiligten Proteinasen umfassen Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), MMP-artige Proteinasen und verwandte Proteinasen, Serin-proteinasen und andere Proteinasen. Die MMPs für die hydrolytische Spaltung von Substratproteinen sind von Zink und Calcium abhängig und werden von einer Vielzahl von Wirtszellen (z. B. polymorphonukleare Neutrophile (PMNs), Makrophagen, Knochenzellen, Epithel und Fibroblasten) sezerniert oder freigesetzt. Bestimmte andere, genetisch unterschiedliche MMPs mit der Bezeichnung MMPs vom Membrantyp (MT-MMPs) sind an die Zellmembran gebunden. Andere werden in die extrazelluläre Matrix (ECM) sezerniert. Bei Serin-proteinasen wirkt die Aminosäure Serin als nukleophiles Agens für die hydrolytische Spaltung von Substratprotein. Serin-proteinasen werden beispielsweise durch getriggerte Leukozyten, insbesondere durch azurophile Granula von PMNs, und andere Zellen, einschließlich maligne Tumorzellen, freigesetzt.
Mehrere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Expression und die Aktivitäten von MMPs bei einer Vielzahl von Krankheiten, wie Krebsmetastasen, rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Periodontitis, Osteoporose, Osteosarkom, Osteomyelitis, Bronchiektase bzw. Bronchiolenerweiterung, chronische pulmonale obstruktive Krankheit, Haut- und Augenkrankheiten, pahtologisch über die körpereigene Antiproteinase-Abschirmung hinaus erhöht sind. Man nimmt an, dass proteolytische Enzyme, insbesondere MMPs, zu der bei diesen Krankheiten auftretenden Zerstörung von Bindegewebe beitragen.
Einige Metalloproteinasen (MMPs) und ihre Verbindung zu Krankheiten werden von M. E. Ryan et al., Curr. Op. Rheum., Bd. 8 (1996), S. 238-247, erörtert. Mehr als 20 MMPs wurden identifiziert. Ihre Anzahl nimmt noch zu. Hierzu gehören die interstitiellen Collagenasen MMP-1 (Fibroblasten-Typ), MMP-8 (polymorphonuklearer Leukozyten-PMNL-Typ oder Collagenase-2), MMP-13 (Collagenase-3); Gelatinasen MMP-2 (72-kD-Gelatinase A) und MMP-9 (92-kD-Gelatinase B); Stromelysin MMP-3 (Stromelysin-1), MMP-10 (Stromelysin-2) und MMP-7 (Matrilysin oder mutmaßliche Metalloproteinase (PUMP)-1); Membran-Typ (MT-MMPs), MMP-14 (MT₁-MMP), MMP-15 (MT₂-MMP), MMP-16 (MT₃-MMP); ferner beispielsweise MMP-11 (Stromelysin-3), MMP-12 (Makrophagen-Metalloelastase) und MMP-20. Enamelysin (MMP-20) wird von Liano et al., Biochem., Bd. 36 (1997), S. 15101-15108, beschrieben und kann auch von humanen Krebszellen, wie squamösen Karzinomzellen bzw. Plattenepithelkarzinomzellen der menschlichen Zunge exprimiert werden, was auf dessen möglichen Beitrag zur Progression und Invasion von Krebs hindeutet (Salo et al., J. Dent. Res., Bd. 77 (1998), S. 829, Abstr. No. 1978). Zu verwandten Proteinasen gehören die TACEs und ADAMS Fertilin oder Meltrin (Metalloproteinase/Disintegrin).
MMPs und MMP-artige und verwandte Proteinasen wie TACEs, ADAMs und dergl. sind bei der Prozessierung und Modifikation von molekularen Erscheinungen beteiligt, z. B. bei der Geweberemodellierung (Birkedal-Hansen, Current Opin. Cell Biol., Bd. 7 (1995), S. 728-735; J. F. Woessner, Jr., FASEB J., Bd. 5 (1991), S. 2145-2154), Zytokin-Wirkungen (S. Chandler et al., J. Neuroimmunol., Bd. 72 (1997), S. 155-161), Zell-Zell-Fusion (R. H. van Huijsduijen, Gene, Bd. 206 (1998), 5. 273-282; Huovila et al., Curr. Opin. Cell Biol., Bd. 8 (1996), S. 692-699; Yagami-Hiromasa et al., Nature, Bd. 377 (1995), S. 662-656), Angiogenese, Wachstumsfaktorwirkungen, Integrin und andere Adhäsionsfaktoren und deren Rezeptor-Vorgänge; vergl. auch A. C. Perry et al., Biochem. Biophys Acta, Bd. 1207 (1994), S. 134-137. Bei den ADAM-Enzymen handelt es sich um Membranproteine mit einer Disintegrin- und Metalloproteinase-Domäne (Wolfsberg et al., Dev. Biol., Bd. 169 (1995), S. 378-383). Bei TACE handelt es sich um Tumor-Nekrosefaktor-Converting-Enzym.
MMP-artige Proteinasen und verwandte Proteinasen sind Metalloproteinasen, die sich von klassischen MMPs unterscheiden und bei der zellulären Prozessierung von pro-TNF-alpha (Tumor-Nekrosefaktor), bei der zellulären Abgabe (Shedding) von Zytokin-Rezeptoren, Adhäsionsmolekülen und dergl. beteiligt sein können, wie von S. Chandler et al., J. Neuroimmunol., Bd. 72 (1997), S. 155-161, ausgeführt wird. MMPs und MMP-artige und verwandte Enzyme, wie ADAMs, TACEs und dergl. vermitteln auch die Freisetzung von TNF-alpha (Watanabe et al., Eur. J. Biochem., Bd. 253 (1998), S. 576-582) und sind an der membrangebundenen Prozessierung von TNF-alpha durch Monozyten induziert durch bakterielle Virulenzfaktoren beteiligt. Dieses Ereignis wird durch membrangebundene Metalloproteinasen vermittelt; Shapira et al., J. Period. Res., Bd. 32 (1997), S. 183-185.
Es gibt umfassende Beweise für die Assoziation zwischen Proteinasen und einer großen Anzahl an Krankheitsvorgängen. Mikrobielle Proteinasen können zusammen mit Wirtsproteinasen bei der Förderung der Gewebezerstörung, wie sie im Periodontium auftritt, wirken (Sorsa et al., Infect. Immun., Bd. 60 (1992), S. 4491-4495). Neuere Untersuchungen zeigen, dass eine Serin-protease, d. h. Elastase, eine Rolle beim Abbau von Bindegewebe und bei der Gewebeinvasion im Dunning-Rattenmodell der Krebsinvasion und der Metastasen (Prostata-Krebs) spielen kann (Lowe und Isaacs, Cancer Res., Bd. 44 (1984), S. 744-752). Ferner sind an der Einleitung der Proteinase-Kaskade, die die Tumorinvasion und -metastase vermittelt, Trypsin und eine chymotrypsinartige Aktivität beteiligt (Sorsa et al., J. Biol. Chem., Bd. 272 (1997), S. 21067-21074). Serin-proteinase wird bei humanen Krebsarten, wie Ovarialkarzinom und Cholangiosarkom, exprimiert (Sorsa et al., J. Biol. Chem., Bd. 272 (1997), S. 21067-21074).
Die Rolle von MMPs ist bei einer großen Anzahl derartiger Krankheitszustände gut nachgewiesen, z. B. bei Tumorinvasion und Metastasen (Stetler-Stevenson et al., Annu. Rev. Cell Biol., Bd. 9 (1993), S. 541-573; Tryggvason et al., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 907 (1987), S. 191-217) und Knochen- und Knorpelabbau (Greenwald et al., Bone, Bd. 22 (1998), S. 33-38; Ryan et al., Curr. Op. Rheumatol., Bd. 8 (1996), S. 238-247). MMP-20 wird durch orale squamöse Plattenepithelzellkarzinom exprimiert (Salo et al., J. Dent. Res., Bd. 77 (1998), S. 829, Abstr. No. 1978). Bourguignon et al. (Mol. Biol. Cell., (1997), 8i Supplement, Abstract 1603) beschreiben die Assoziation von Metalloproteinase mit dem Matrixabbau als mögliche Ursache der Förderung einer Lymphozyteninfiltration, die insulinbildende Pankreasinselzellen bzw. Langerhansinselzellen pankreatische Inselzellen zerstört. Für Zytokine (TNF-alpha) und MMPs nimmt man auch eine Beteiligung an der Pathogenese von multipler Sklerose an (Liedtke et al., Ann. Neurol., Bd. 44 (1998), S. 35-46; Chandler et al., J. Neuroimmunol., Bd. 72 (1997), S. 155-171). Von MT₁-MMP hat man festgestellt, dass es auf das Wachstum und die Verteilung von Brustkrebszellen einwirkt (Li et al., Mol. Carcinog., Bd. 22 (1998), S. 84-89).
Es gibt zahlreiche andere Störungen, bei denen ein extrazellulärer Proteinabbau/Proteinzerstörung eine wichtige Rolle spielt. Zu Beispielen für derartige Krankheiten gehören Osteoporose, Arthritisarten, erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS), Verbrennungen, Wunden, wie Dekubitus und Ulcus Varicosum, Brüche, Traumata, Magengeschwüre, Hautkrankheiten, wie Akne und Psoriasis, lichenoide Läsionen, Epidermolysis bullosa, Aphthen (reaktive orale Geschwüre), dentale Krankheiten, wie periodontale Krankheiten, Periimplantitis, Kieferzysten und andere periapikale Zysten, dentale Zustände, die das Ziel von Wurzelkanalbehandlungen oder endodontischen Behandlungen sind, verwandte Krankheiten, externe und natürliche bzw. intinsische Wurzelresorption, Karies und dergl.
Die Serin-proteinasen umfassen humane Leukozyten-elastase (HLE) und Cathepsin G. Weitere Serin-proteinasen sind in der Stoffwechselkaskade des Bindegewebeabbaus beteiligt, wozu (ohne Beschränkung hierauf) Plasmin, Plasminogenaktivator, tumorassoziierte Trypsine und dergl. gehören.
MMPs und Serin-proteinasen können zusammenwirken und einen Großteil der Elemente der extrazellulären Matrix und der Basalmembranen zerstören. Nachstehend sind Beispiele für die Hauptwechselwirkungen zwischen MMPs und Serin-proteinasen während des Gewebeabbaus aufgeführt: 1) Cathepsin G kann MMP-8 aktivieren; 2) die Serin-proteinase humane Leukozyten-elastase (HLE) kann TIMPs, die hauptsächlichen endogenen Gewebeinhibitoren von Matrix-Metalloproteinasen, inaktivieren; 3) MMP-8 und MMP-9 können den alpha₁-Proteinase-Inhibitor (alpha₁-PI), den hauptsächlichen endogenen Inhibitor der humanen Leukozyten-elastase, inaktivieren (S. K. Mallya et al., Annuals of the New York Academy of Science, Bd. 732 (1994), S. 303-314); und 4) tumorassoziiertes Trypsin-2 kann in wirksamer Weise latente pro MMPs aktivieren (Sorsa et al., J. Biol. Chem., Bd. 272 (1997), S. 21067-21074).
Tetracycline, einschließlich chemisch modifizierte Tetracycline können den MMP-vermittelten Gewebeabbau in vitro und in vivo modifizieren, teilweise durch Bindung an Metallionen (Calcium oder Zink) in der MMP-Molekülstruktur; vergl. z. B. R. F. Zernicke et al., Journal of Rheumatology, Bd. 24 (1997), S. 1324-1331; T. Sorsa et al., Journal of Rheumatology, Bd. 25 (1998), S. 975-982; Golub et al., Adv. Dental Research, (1998), im Druck.
Von bestimmten Tetracyclinen wurde gezeigt, dass sie Matrix-Metalloproteinasen unabhängig von der antibiotischen Tetracyclin-Aktivität unterdrücken. US-5 459 135 (Golub et al.), US-5 321 017 (Golub et al.), US-5 308 839 (Golub et al.), US-5 258 371 (Golub et al.), US-4 935 412 (McNamara et al.), US-4 704 383 (McNamara et al.), US-4 666 897 (Golub et al.) und US-RE-34 656 (Golub et al.) beschreiben die Verwendung von nicht-antimikrobiellen Tetracyclinen zur Behandlung von gewebezerstörenden Zuständen, chronischen Entzündungen, Knochenzerstörung, Krebs und anderen Zuständen, die mit einer übermäßigen Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen, wie Collagenasen, Gelatinase und MMP-12 (Makrophagen-Metalloelastase), assoziiert sind.
Das US-Patent 5 773 430 (Simon et al.) beschreibt die Verwendung von hydrophoben Tetracyclinen zur Hemmung von überschüssiger Leukozyten-elastase-Serin-proteinase-Aktivität in einem biologischen System.
Tetracycline sind eine Klasse von Verbindungen, die insbesondere aufgrund ihrer frühen und spektakulären Erfolge als Antibiotika bekannt sind. Verbindungen, wie Tetracyclin, Sporocyclin und dergl., sind Breitbandantibiotika mit Eignung gegen eine Vielzahl von Bakterien und anderen Mikroorganismen. Die Ausgangsverbindung, nämlich Tetracyclin, weist die folgende allgemeine Struktur auf:
Die Nummerierung des mehrere Ringe umfassenden Kerns ist nachstehend angegeben:
Tetracyclin, sowie die 5-OH-Derivate (Oxytetracyclin, z. B. Terramycin^TM) als auch die 7-Cl-Derivate (Chlortetracyclin, z. B. Aureomycin^TM) kommen in der Natur vor und stellen gut bekannte Antibiotika dar. Zu halbsynthetischen Tetracyclinen gehören beispielsweise Doxycylin, Minocyclin und Methacyclin. Die Verwendung von Tetracyclin-Antibiotika ist zwar zur Behandlung von Infektionen wirksam, kann aber zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Beispielsweise kann eine Langzeitverabreichung von antibiotischen Tetracyclinen eine gesunde Flora verringern oder beseitigen, z. B. die Darmflora, und kann zur Bildung von Antibiotika-resistenten Organismen oder zu einem übermäßigen Wachstum von Hefen und Pilzen führen. Diese erheblichen Nachteile schließen typischerweise Behandlungsarten aus, die eine chronische Verabreichung dieser Verbindungen erfordern.
Natürliche Tetracycline können ohne Verlust ihrer antibiotischen Eigenschaften modifiziert werden, wobei aber bestimmte Elemente der Struktur erhalten bleiben müssen, um dies zu erreichen. Eine Klasse von Verbindungen wurde definiert, die strukturell mit den antibiotischen Tetracyclinen verwandt sind, deren antibiotische Aktivität aber in erheblichem Maße oder vollständig durch eine chemische Modifikation beseitigt worden ist. Die Modifikationen, die gegebenenfalls an der Tetracyclin-Grundstruktur vorgenommen werden können, werden von L. A. Mitscher, The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics, Marcel Dekker, New York, (1978), Kapital 6, in einem Übersichtsartikel beschrieben. Gemäß Mitscher kann die Modifikation an den Positionen 5–9 des Tetracyclin-Ringsystems vorgenommen werden, ohne den vollständigen Verlust von antibiotischen Eigenschaften zu verursachen. Jedoch führen Veränderungen an der Grundstruktur des Ringsystems oder ein Ersatz von Substituenten an den Positionen 1–4 oder 10–12 im allgemeinen zu synthetischen Tetracyclinen, die eine geringere oder im wesentlichen gar keine antibakterielle Aktivität besitzen.
Zu chemisch modifizierten Tetracyclinen (CMTs) gehören beispielsweise 4-De-(dimethylamino)-tetracyclin (CMT-1), Tetracyclinonitril (CMT-2), 6-Demethyl-6-desoxy-4-de-(dimethylamino)-tetracyclin (CMT-3), 7-Chlor-4-de-(dimethylamino)-tetracyclin (CMT-4), Tetracyclinpyrazol (CMT-5), 4-Hydroxy-4-de-(dimethylamino)-tetracyclin (CMT-6), 4-De-(dimethylamino)-12α-desoxytetracyclin (CMT-7), 6-Desoxy-5α-hydroxy-4-de-(dimethylamino)-tetracyclin (CMT-8), 4-De-(dimethylamino)-12α-desoxyanhydrotetracyclin (CMT-9) und 4-De-(dimethylamino)-minocyclin (CMT-10).
Zu weiteren Beispielen für Tetracycline, die zur Erzielung einer verringerten antimikrobiellen Aktivität modifiziert sind, gehören die 4-Epimeren von Oxytetracyclin und Chlortetracylin (epi-Oxytetracyclin und epi-Chlortetracyclin).
Bisphosphonate umfassen eine Klasse von therapeutischen Präparaten, die als Mittel zur Unterdrückung der Knochenresorption verwendet worden sind. US-5 652 227 (Teronen et al.) beschreibt die Verwendung von Bisphosphonaten zur Verringerung des Abbaus der Bindegewebe-Matrixproteinkomponenten, der sich durch eine übermäßige Metalloproteinase-Aktivität ergibt. US-5 688 120 beschreibt die Hemmung der alveolären Knochenresorption unter Anwendung einer iontophoretischen Abgabe von Bisphosphonaten am Alveolarknochen durch Verabreichung von Bisphosphonat in einem Reservoir, das mit Zahnfleischgewebe verbunden ist, und durch Durchleiten eines elektrischen Stroms hierdurch.
Es gibt keine Hinweise auf die kombinierte Verwendung von Tetracyclinen und Bisphosphonaten mit dem Ziel, eine übermäßige endogene Proteinase-Aktivität zu verringern, zu hemmen oder herunterzuregulieren und die Zerstörung von Geweben, Basalmembranen und anderen Faktoren zu verringern.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, eine Kombination von Verbindungen zur Behandlung von Personen, die gegenüber einer Schädigung und Zerstörung von Gewebe im Zusammenhang mit Proteinase empfindlich sind, bereitzustellen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Es wird eine Zusammensetzung zur Hemmung, Verringerung und Herunterregulierung von überschüssigen Proteinasen bereitgestellt, wodurch ein proteinasebezogener Bindegewebe- und Basalmembran-Abbau in einem biologischen System, das gegenüber strukturellen und funktionellen Störungen aufgrund einer übermäßigen Proteinase-Aktivität empfindlich ist, behandelt oder verhindert wird. Die Zusammensetzung umfasst ein Tetracyclin und ein Bisphosphonat. Die Hemmung beinhaltet die Verringerung der Menge und der Aktivität von Proteinasen und die Herunterregulierung der endogenen Erzeugung der Proteinasen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung eignet sich zur Therapie oder Prophylaxe von Krankheiten, die im Zusammenhang mit einem Proteinase-Ungleichgewicht stehen, indem eine übermäßige Aktivität von MMPs, Serin-proteinasen, MMP-artigen und verwandten Enzymen, wie Tumor-Nekrosefaktor-Converting-Enzym (TACE)-abhängige Tumor-Nekrosefaktor-alpha (TNFα)-Aktivierung, und Membranproteine mit einer Disintegrin- und Metalloproteinase-Domäne (ADAMs) herunterreguliert, verhindert oder verringert wird.
Der erfindungsgemäß behandelte Abbau kann harte Gewebe- und Weichteile bzw. weiche Gewebe, einschließlich Bindegewebe und Basalmembranen, betreffen. Der Abbau kann mit Zuständen, wie einer Knochenresorption, einer Knorpelzerstörung oder einer Zerstörung von Weichteilen und mit einer Gewebeinvasion und Metastasierung durch maligne Zellen im Zusammenhang stehen. Die strukturellen und funktionellen Störungen umfassen (als nicht-beschränkende Beispiele) Verlust von Zähnen aufgrund eines periodontalen Zusammenbruches und Skelettbrüche aufgrund einer übermäßigen Knochenzerstörung, beispielsweise bei Osteoporose. Ein Überschuss an Proteinase wird durch Verringerung der Menge und der Aktivität von Proteinase und durch Herunterregulierung der Proteinase-Erzeugung gehemmt. Unter Herunterregulierung ist eine Blockierung der Genexpression und Sekretion der Proteinase zu verstehen, d. h. eine Verringerung der Synthese und der Freisetzung des Proteinenzyms. Die Therapie kann auch die Aktivität oder die Aktivierung der Proteinasen unabhängig von einem Einfluss auf die Enzymsynthese blockieren.
Die Zusammensetzung kann in Form einer pharmazeutischen oder kosmetischen Präparation vorliegen. Somit kann die Zusammensetzung einem pharmazeutischen oder kosmetischen Präparat oder Träger zugesetzt werden.
Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise eine Kombination von Tetracyclin und Bisphosphonat in synergistischen Mengen, um eine übermäßige Proteinase-Aktivität zu hemmen, so dass die Kombination in synergistischer Weise eine Hemmung, Verringerung oder Herunterregulierung von Proteinasen, die am Gewebezerfall beteiligt sind, bewirkt. Dies bedeutet, dass die Kombination wirksamer ist als Tetracyclin allein oder Bisphosphonat allein und dass die Wirksamkeit der Kombination im allgemeinen größer ist als aufgrund einer Addition der beiden Effekte zu erwarten ist.
Bei einem Verfahren zur Hemmung und/oder Verringerung der Aktivität und Herunterregulierung von überschüssigen Proteinasen und dem damit in Zusammenhang stehenden Zerfall von Bindegewebe, Basalmembranen und anderen Faktoren, die funktionelle und strukturelle Störungen in einem biologischen System, das gegenüber einem Gewebezerfall empfindlich ist, wiederspiegeln, ist eine Zusammensetzung, die eine Kombination aus Tetracyclin und Bisphosphonat umfasst, dem System in Mengen, die Proteinase hemmen, verringern und/oder herunterregulieren, zu verabreichen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Balkendiagramm zur Erläuterung der Ergebnisse der Zahnbeweglichkeit in Beispiel 3.
2 ist ein Balkendiagramm zur Erläuterung der Ergebnisse des alveolären Knochenverlustes in Beispiel 3.
3 ist ein Balkendiagramm zur Erläuterung des Einflusses auf die Aktivität von Zahnfleisch-Collagenase in Beispiel 3.
4 ist ein Balkendiagramm zur Erläuterung des Einflusses der Aktivität von Zahnfleisch-Gelatinase in Beispiel 3.
5 ist ein Balkendiagramm zur Erläuterung der Hemmung der Osteoklasten-Gelatinase in Beispiel 4.
6 ist ein Balkendiagramm zur Erläuterung der Hemmung der Wanderung von Krebszellen in Beispiel 5.
7 ist ein weiteres Balkendiagramm zur Erläuterung der Hemmung der Wanderung von Krebszellen durch eine andere Kombination in Beispiel 5.
8 ist ein Balkendiagramm zur Erläuterung der Hemmung des Abbaus von Casein durch MT₁-MMP (MMP-14) in Beispiel 6.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung umfasst eine Zusammensetzung zur Hemmung von Gewebezerstörungszuständen in Verbindung mit einer übermäßigen Bildung und Aktivität von Bindegewebe und Basalmembranen abbauenden Proteinasen, z. B. Metalloproteinasen, Metalloproteinasen-artige und damit verwandte Enzyme, Serin-proteinasen und andere Proteinasen, sowie mikrobielle, virale und fungale Proteinasen. Die Anwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bei einem behandlungsbedürftigen Subjekt hemmt oder verhindert den Zerfall von Bindegewebe und Basalmembranen und andere Krankheitsvorgänge.
Zustände, die das Bindegewebe zerstören und die erfindungsgemäß behandelt und/oder verhindert werden können, ergeben sich aus einer übermäßigen Proteinase-Aktivität von Metalloproteinasen, Metalloproteinase-artigen Proteinasen und verwandten Proteinasen, Serin- proteinasen oder Kombinationen dieser Enzyme, sowie mikrobieller, viraler und fungaler Proteinasen. Diese Zustände umfassen beispielsweise eine Gewebeinvasion durch maligne Zellen, eine Knochenresorption, eine Knorpelzerstörung, eine Zerstörung von Weichteilen (z. B. Haut, Sehnen, Bänder, Blutgefäßwände und dergl.) sowie die Tumorausbreitung und Krebsmetastasen auf Weichteile und harte Gewebe und eine Bronchiektase, chronische, destruktive und obstruktive Lungenkrankheiten, Asthma und andere Lungenkrankheiten. Säugetierkrankheiten, wie Periodontitis, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, reaktive und andere Arthritisarten, Krebsinvasion und Metastasen, Osteomyelitis, Osteoporose, Osteosarkom und andere Knochenkrankheiten können in vorteilhafter Weise verhindert und/oder behandelt werden. Ohne Festlegung auf eine Theorie ist die Behandlung möglicherweise teilweise aufgrund der Tatsache wirksam, dass sowohl die CMTs als auch die Bisphosphonate pharmakologische Mittel darstellen, die gezielt Knochen aufsuchen. Die Kombination kann auch zur Behandlung von gewebezerstörenden Krankheiten bei Haustieren (Katzen, Hunde und dergl.) und bei großen Säugetieren, wie Pferden und anderen Säugetieren, eingesetzt werden.
Zu speziellen Zuständen, bei denen Gewebe und Basalmembranen zerstört werden und die erfindungsgemäß behandelt werden können, gehören als nicht-beschränkende Beispiele Knochenkrankheiten, wie eine durch Osteoklasten vermittelte Knochenresorption, und Störungen unter Beteiligung einer zellulären Passage durch Basalmembranen, z. B. Krebsmetastasen und Lymphozyteninfiltration, beispielsweise in den Langerhans-Inseln im Zusammenhang mit dem Einsetzen von Typ I-Diabetes.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann mit pharmazeutischen Präparaten verknüpft werden, die Moleküle enthalten, die zielgerichtet auf Stellen, wie Tumorgewebe, Metastasen und/oder Gefäße, ausgerichtet sind, um dort eine Abgabe zu erzielen. Zu Beispielen für derartige Moleküle gehören "homing"-Peptide (W. Arap et al., Science, Bd. 279 (1998), S. 377-380).
Eine Notwendigkeit zur Behandlung kann auf der Grundlage verschiedener klinischer, radiologischer und biochemischer Parameter für die Schwere der Krankheit abgeschätzt oder darauf bezogen werden. Ein Beispiel für Arthritis-Krankheiten umfasst klinische Anzeichen von Gelenkschmerzen und Schwäche, den Röntgennachweis von Knochen- und Knorpelzerstörung und den Nachweis erhöhter Konzentrationen an Kollagen-Vernetzungsfragmenten (Pyridinolin und Desoxypyridinolin) in Serum und Urin, die einen verstärkten Knochen- und Knorpel-Kollagenzerfall anzeigen. Eine Diagnose von Periodontitis und Periimplantitis umfasst beispielsweise klinische Anzeichen (z. B. eine erhöhte Tiefe von periodontalen Taschen; einen Verlust an periodontaler und periimplantärer Haftung), mikrobiologische, biochemische, immunologische und/oder molekularbiologische Anzeichen eines periodontalen Gewebezerfalls.
Bindegewebe bildet die extrazelluläre Matrix, die andere Gewebe in sämtlichen Teilen des Körpers verbindet und stützt. Bindegewebe umfasst kollagenöse (Kollagenfasern bzw. weiße Fasern in der Haut, Sehnen, Knochen, Knorpel und dergl., die aus gewendelten Proteinfibrillen bestehen), elastische (elastische Fasern bzw. gelbe Faser von Albuminoid-Skleroprotein), muköse, retikuläre (netzartige), knochenartige (Knochen) und knorpelartige (Chondrozyten, in Chondrin eingebettet und hyaline (klare), elastische oder bindegewebsartige Knorpel umfassend) und gelegentlich Blutgefäß/Komponenten (endotheliale Zellen, die beispielsweise an der Entzündungsstelle proliferieren. Bindegewebe lässt sich ferner in loses (netzartiges) und dichtes (mehrfaseriges) Bindegewebe einteilen.
Bei der Basalmembran handelt es sich um eine Membran von modifiziertem Bindegewebe unterhalb des epithelialen Gewebes in Form einer Drüse, die azinäre Bereiche bzw. Drüsenbläschen oder spezielle Sekretionsbereiche enthält. Die Basalmembran ist eine komplexe Struktur, die aus Typ IV-Kollagen, Heparansulfat-proteoglykan und Lamininen umfasst, die das Epithel an das darunter liegende Bindegewebe anheftet. Nach einer Zerstörung der Basalmembran zur Überwindung von extrazellulären Matrixbarrieren ist für die Wanderung von entzündlichen und malignen Zellen eine spezifische Spaltung von Laminin-5 durch Gelatinasen erforderlich (Giannelli et al., Science, Bd. 277 (1997), S. 225-228). Die vorliegende Kombination von Tetracyclin und Bisphosphonat hemmt auch diesen Vorgang.
Gemäß einer Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung von MMP-abhängigen Zuständen verwendet. MMP-abhängige Zustände umfassen beispielsweise Wunden, Verbrennungen, Brüche, Läsionen, Traumata, Geschwüre, Krebs- und Metastasenfortschritt in Bindegeweben und Knochen; zu weiteren Zuständen gehören Periodontitis, Gingivitis, Periimplantitis, Kieferzysten, interne und externe Wurzelresorption, Karies, AIDS, Hornhautgeschwüre, Magengeschwüre, Aphthengeschwüre, Akne, Psoriasis, Lockerung von Hüftprothesen, Osteomyelitis, Osteoporose, Bindegeweberemodellierung, Angiogenese, Arthritisarten (rheumatoide, reaktive Arthritis und Osteoarthritis), Lungenkrankheiten (Bronchiektase und chronische obstruktive Lungenkrankheiten und andere Lungenkrankheiten).
Bei Tetracyclinen in Kombination mit Bisphosphonat wurde eine Hemmung der Bildung und/oder Aktivität von endogenen Proteinasen in einem biologischen System festgestellt.
Bei den bevorzugten Tetracyclinen handelt es sich um 4-De-(dimethylamino)-tetracyclin (CMT-1), 6-Demethyl-6-desoxy-4-de-(dimethylamino)-tetracyclin (CMT-3), 6-Desoxy-5-alpha-hydroxy-4-de-(dimethylamino)-tetracyclin (CMT-8) sowie Doxycyclin, Minocyclin, Lymecyclin und Kombinationen der Tetracycline.
Bei Bisphosphonaten handelt es sich um Verbindungen, die mit anorganischer Pyrophosphonsäure verwandt sind. Sie sind im Handel erhältlich oder lassen sich nach bekannten Verfahren herstellen. Zu den hier geeigneten Bisphosphonaten gehören als nicht-beschränkende Beispiele Alendronat ((4-Amino-1-hydroxybutyliden)-bisphosphonsäure), Clodronat (Dichlormethandiphosphonsäure), Etidronat ((1-Hydroxyethyliden)-disphosphansäure) und Pamidronat ((3-Amino-1-hydroxypropyliden)-bisphosphonsäure); ferner Risedronat ([-Hydroxy-2-(3-pyridinyl)-ethyliden]-bisphosphonsäure), Tiludronat, d. h. Tiludronsäure ([(4-Chlorphenyl)-thio]-methylen]-bisphosphonsäure) und Zolendronat.
Zu weiteren Bisphosphonaten gehören [1-Hydroxy-3-(methylpentylamino)-propyliden]-bisphosphonat (BM21.0955), [(Cycloheptylamino)-methylen]-bisphosphonat (YM175), 1-Hydroxy-3-(1-pyrrolidinyl)-propyliden]-bisphosphonat (EB-1053), [1-Hydroxy-2-(1H-imidazol-1-yl)-ethyliden]-bisphosphonat (CGP 42'446) und (1-Hydroxy-2-imidazo-[1,2-a]pyridin-3-yl-ethyliden)-bisphosphonat (YM 529).
Bisphosphonate werden umfassend von H. Fleisch, Endocr. Rev., Bd. 19(1) (1998), S. 80-100, beschrieben. Verwiesen wird auch auf H. Fleisch, Bisphosphonates in Bone Disease: From the Laboratory to the Patient, (1997), 3. Auflg., The Parthenon Publishing Group, New York und London.
Bei den bevorzugten Bisphosphonaten handelt es sich um Alendronat, Clodronat (Clodrinat), Etidronat, Pamidronat, Medronat, Nedrinat, Tiludronat, Zolendronat und Kombinationen davon.
Die Menge der einzelnen Verbindungen in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die Tetracyclin und Bisphosphonat umfasst, variiert zur Verwendung in einem speziellen Fall je nach der speziellen formulierten Zusammensetzung, der Verabreichungsart, dem Subjekt, der Stelle der Verabreichung der Zusammensetzung, dem zu behandelnden oder zu verhindernden Abbauzustand und der Verabreichungsart. Dosierungen werden unter Berücksichtigung herkömmlicher Gesichtspunkte festgelegt, z. B. durch üblichen Vergleich der differenziellen Aktivitäten der Formulierungen und eines bekannten Mittels, z. B. mittels einer entsprechenden herkömmlichen pharmakologischen Vorgehensweise. Typische Dosen für die Anwendung beim Menschen umfassen 10–1000 mg/Tag Tetracyclin in Kombination mit 20–2000 mg/Tag Bisphosphonat, je nach dem Typ des Bisphosphonats und dem Verabreichungsweg. Bei den erfindungsgemäß geeigneten Mengen an Tetracyclin und Bisphosphonaten handelt es sich um Mengen, die in Kombination zu einer Hemmung der Aktivität und/oder der Sekretion und der Synthese von überschüssiger Proteinase in einem System oder einem Subjekt, das gegenüber überschüssigen Proteinasen empfindlich ist, führen. Diese Mengen sind vorzugsweise bis zu 10-fach geringer als die Mengen, die optimal oder erforderlich sind, wenn die einzelnen Verbindungen allein verwendet werden, wodurch in signifikanter Weise die Möglichkeit von Nebenwirkungen verringert wird, die durch höhere Dosen verursacht werden, wenn die Verbindungen einzeln einzunehmen sind, wobei beispielsweise bei Verwendung der Einzelverbindungen 10–30 μM erforderlich sind und bei Verwendung einer Kombination 2,0–10,5 μM erforderlich sind.
Für die orale Verabreichung kann die erfindungsgemäß Zusammensetzung in Form von Tabletten, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Lösungen oder dergl. zubereitet werden. Für die parenterale Verabreichung kann die Zusammensetzung zu injizierbaren Formen, wie Lösungen oder Suspensionen, z. B. für die intramuskulare Injektion, zubereitet werden. Für die topische Anwendung kann die Zusammensetzung direkt aufgetragen oder in ein Abgabesystem, z. B. einen Träger oder ein Substrat, wie ein Polymeres, einverleibt werden oder zu einer Creme, Salbe, Aerosol, Membranen und dergl. zubereitet werden.
Die Aktivität von Kombinationen verschiedener Tetracycline und Bisphosphonate wurde in vivo untersucht. Das für die Krankheit verwendete Tiermodell wurde von Ramamurthy et al., Archs. Oral Biol., Bd. 130 (1985), S. 679-683, veröffentlicht. Es beinhaltet die Injektion von Endotoxin (d. h. bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS), einer Hauptstrukturkomponente der äußeren Membran von gram-negativen Bakterien und einem Hauptmediator bei der Entzündung und Knochenzerstörung im Verlauf von Periodontitis und anderen Infektionen) direkt in das Zahnfleisch von Ratten an jedem zweiten Tag innerhalb einer 7-tägigen Periode. Diese Vorgehensweise erzeugt eine ausgeprägte Entzündung im periodontalen Gewebe und induziert erhöhte Konzentrationen an gewebezerstörenden Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und Serin-proteinasen, wie Elastase, im Zahnfleisch, was zu einer schweren Alveolarknochen-Resorption und einem schweren Knochenverlust um den betroffenen Zahn herum führt, wobei dies alles innerhalb der 7-tägigen Versuchsdauer erfolgt. Kurz zusammengefasst, ausgewachsene männliche Ratten mit dieser experimentell herbeigeführten entzündlichen Erkrankung wurden entweder unbehandelt belassen oder mit suboptimalen Dosen an (I) CMT allein, (II) einem Bisphosphonat allein oder (III) einer Kombination aus (I) und (II) behandelt. Am Ende der Versuchsdauer wurden die Zahnbeweglichkeit und der alveoläre Knochenverlust sowie die Konzentrationen verschiedener gewebezerstörender MMP-Collagenasen und Gelatinasen und Serin-Enzyme im Zahnfleisch gemessen. Suboptimale Dosen entweder von CMT allein oder von Bisphosphonat allein erzeugten nur eine geringe oder gar keine Verringerung dieser Parameter der Zerstörung von Weichteilen und hartem Gewebe. Im Gegensatz dazu verringerte die Kombination dieser beiden Arzneistofftypen in synergistischer Weise die pathologischen Niveaus dieser Zerstörungsvorgänge, wobei häufig die Konzentrationen im Gewebe mit einer Endotoxin-Injektion auf die normalen Konzentrationen von Collagenasen, Gelatinasen und Elastase, die in mit einer Kochsalzlösungsinjektion versehenen Geweben (Kontrolle) auftraten, verringert wurden.
Die Kombination wurde auch in vitro an gezüchteten Hühner-Osteoklasten (knochenresorbierende Zellen) getestet. Sie zeigte eine Hemmung der Osteoklasten-Gelatinase-Aktivität.
Die Kombination wurde ferner in vitro an humanen Fibrosarkomzellen und gegen humanes rekombinantes MT₁-MMP (MMP-14) und reines Wildtyp-MMP-8 getestet. Kurz zusammengefasst, wir testeten die Einflüsse von suboptimalen MMP-Hemmkonzentrationen von CMT (-3 und -8) und Clodronat (Clodrinat) auf die in vitro-Wanderung von HT-1080-Fibrosarkomzellen unter Anwendung eines Transwell-Testsystems. Als Ergebnis von verschiedenen tumorfördernden Induktionen bewirken humane Fibrosarkomzellen der Zelllinie HT-1080 eine Expression und Aktivierung sowohl von extrazellulären MMPs (MMP-2, -9) als auch von an die Zelloberfläche gebundenen MT-MMPs, die an der Aktivierungskaskade in malignen, invasiven und metastatischen sowie in angiogenen Prozessen teilnehmen; H. Birkedal-Hansen, Curr. Op. Cell Biol., Bd. 7 (1995), S. 728-735; D. Hanahan et al., Cell, Bd. 86 (1996), S. 353-364.
Ferner wurden suboptimale Hemmdosen von CMTs und Bisphosphonat allein und in Kombination auf reine humane, rekombinante MT₁-MMP- und MMP-9-Aktivitäten unter Anwendung des β-Casein-Abbautests getested. Dieser Test wird von Teronen et al., J. Dent. Res., Bd. 76 (1997), S. 1529-1537, und von T. Sorsa et al., J. Biol. Chem., Bd. 272 (1997), S. 21067-21074, beschrieben. Suboptimale Dosen entweder von CMTs allein oder von Bisphosphonat allein verursachten nur eine geringe oder gar keine Verringerung der HT-1080-Wanderung und hemmten nur geringfügig die MT₁-MMP-Aktivitäten. Jedoch verringerte die Kombination von CMTs und Bisphosphonaten in synergistischer Weise die in vitro-Wanderung von HT 1080-Fibrosarkomzellen und hemmte die Aktivitäten des reinen humanen, rekombinanten MT-1-MMP.
In vivo- und in vitro-Experimente belegen, dass eine Kombination eines chemisch modifizierten, nicht-antibakteriellen Tetracyclins mit einem Bisphosphonat in synergistischer Weise den Zerfall von Bindegewebe (einschließlich Knochen) und Basalmembranen sowie die Wanderung von malignen Zellen hemmt und in synergistischer Weise die Aktivitäten von reinem, an humane Zellen gebundenem MT₁-MMP und von extrazellulären Collagenasen, Gelatinasen (extrazelluläre MMPs) sowie von Elastase (Serin-proteinase) hemmt.
Für in vivo-Versuche wurden 30 männliche Sprague-Dawley-Ratten folgendermaßen in fünf Gruppen aufgeteilt:

Gruppe 1: Normale Gruppe. Injektion von Kochsalzlösung + Placebo-Therapie (CMC)
Gruppe 2: LPS. Injektion von LPS + Placebo (CMC)
Gruppe 3: CMT-8. Injektion von LPS + CMT-8 (1 mg/Tag)
Gruppe 4: Clodronat. Injektion von LPS + Clodronat (1 mg/Woche)
Gruppe 5: Kombination. LPS + CMT-8 (1 mg/Tag) + Clodronat (1 mg/Woche)

Die Behandlungen erfolgten durch orale Sondenverabreichung 1-mal täglich (CMT-8) während der gesamten 7-tägigen Versuchsdauer oder durch eine einzige subkutane Injektion (Clodrinat).
LPS (Lipopolysaccharid)-induziertes Periodontitis-Rattenmodell: 24 Stunden vor der Behandlung erhielten die Ratten eine Injektion in das obere vordere Zahnfleisch und in die palatalen Papillen zwischen den ersten und zweiten oberen Molaren von 10 μl LPS (1 mg/ml) oder Kochsalzlösung, wobei insgesamt 10 μg LPS pro Stelle injiziert wurden. Die LPS-Injektionen wurden jeden 2. Tag bis zur Beendigung von 3 Injektionen wiederholt.
Am 7. Tag wurden sämtliche Ratten betäubt. Blutproben wurden durch Herzpunktur entnommen und die Ratten wurden getötet. Die Zahnbeweglichkeit wurde geprüft. Das Zahnfleischgewebe wurde herausgeschnitten und für die anschließende Enzymanalyse bei –80 °C aufbewahrt. Die Kiefer wurden zur Bestimmung des Knochenverlustes vom Fleisch befreit.
Beispiel 1
Das erste Experiment diente zur Auswahl von suboptimalen Dosen sowohl von CMT-8 (ein chemisch modifiziertes, nicht-antibakterielles Tetracyclin) und Clodronat (ein Bisphosphonat) im durch Endotoxin induzierten Knochenverlust-Modell. Gruppen von Ratten (n = 5–6 Ratten/Gruppe) wurden betäubt und erhielten eine direkte Injektion in das Zahnfleischgewebe entweder einer Kochsalzlösung (Kontrollgruppe) oder von LPS-Endotoxin jeden 2. Tag während einer 7-tägigen Versuchsdauer. 24 Stunden nach der ersten Injektion erhielten die Gruppen von Ratten eine orale Sondenverabreichung von 0, 0,5 mg, 1 mg oder 2 mg CMT-8 täglich während der nächsten 6 Tage. Am Ende des Experiments wurden die Ratten betäubt. Blut wurde durch intrakardiale Punktur entnommen. Die Ratten wurden getötet. Für die Enzymanalyse wurde Zahnfleischgewebe herausgeschnitten. Ferner wurde die Zahnbeweglichkeit bewertet. Nach Entfernung von Fleisch vom Kiefer wurde der alveoläre Knochenverlust um den Zahn morphometrisch unter Verwendung eines rechnergestützten Systems bewertet. Die Ergebnisse sind nachstehend erörtert.
Beispiel 2
In einem zweiten Experiment wurde eine ähnliche Vorgehensweise herangezogen, um die suboptimale Dosis von Clodronat in diesem Modell festzustellen, mit der Ausnahme, dass verschiedene Dosen dieses Arzneistoffes (0, 0,5 mg, 1 mg, 2 mg) durch eine einzige subkutane Injektion verabreicht wurden.
Auf der Grundlage der vorstehenden Experimente der Beispiele 1 und 2 zeigten die Ergebnisse, dass 0,5 mg entweder an CMT-8 oder an Clodronat keine signifikanten Einflüsse auf die Zahnbeweglichkeit und den alveolären Knochenverlust ausübten. Im Gegensatz dazu führten 2 mg von beiden Arzneistoffen im wesentlichen zu einer Umkehr der pathologischen Zahnbeweglichkeit und des Knochenverlustes, die durch das bakterielle Endotoxin hervorgerufen waren, auf Kontrollniveaus. Daher wurde eine Dosis von 1 mg von jedem Arzneistoff als die suboptimale Dosis ausgewählt, da sie entweder keine oder kaum nachweisbare günstige Effekte hervorrief.
Beispiel 3
In einem dritten Experiment wurden 30 männliche Ratten auf folgende Versuchsgruppen aufgeteilt: Gruppen mit Kochsalzinjektion; Gruppen mit einer Injektion von Endotoxin und anschließend keiner weiteren Arzneistoffverabreichung, bzw. einer Verabreichung von CMT-8 allein (1 mg/Tag), Clodronat allein (1 mg/Woche) oder einer Kombination der gleichen suboptimalen Dosen beider Arzneistoffe. Das Experiment wurde am 7. Tag beendet. Wie vorstehend ausgeführt, wurde Zahnfleischgewebe herausgeschnitten und extrahiert. Die partiell gereinigten Extrakte wurden auf die Aktivitäten von neutraler Proteinase (Elastase und Matrix-Metalloproteinase) analysiert und einer Ermittlung der Zahnbeweglichkeit und des alveolären Knochenverlustes unterzogen.
Die Ergebnisse der Knochenbeweglichkeit sind in 1 dargestellt. Die Ergebnisse bezüglich des alveolären Knochens sind in 2 dargestellt. Der Einfluss auf die Aktivität von Zahnfleisch-Collagenase ist in 3 dargestellt. Der Einfluss auf die Aktivität von Zahnfleisch-Gelatinase ist in 4 dargestellt.
In 1 wird die Zahnbeweglichkeit auf der Grundlage des folgenden Bewertungssystems bewertet:
0 = keine Bewegung
1 = geringfügige Bewegung (vestibulär-palatal)
2 = mittlere Bewegung (vestibulär-palatal)
3 = starke Bewegung (vertikale Beweglichkeit in und aus dem Zahnfach)
a gegen b, p<0,05
a gegen a, (N.S.) (nicht signifikant)
b gegen b, (N.S.)
Wie in 1 dargestellt, war die Zahnbeweglichkeit (die die Schwere der Entzündung und des Kollagenverlustes im periodontalen Gewebe und des alveolären Knochenverlustes wiederspiegelt) bei den unbehandelten Ratten mit LPS-Injektion (Gruppe 1) sehr stark, verglichen mit den Ratten mit einer Injektion von Kochsalzlösung (Kontrolle, Gruppe 2). Wenn die Ratten mit der LPS-Injektion mit der suboptimalen Dosis von CMT-8 allein (Gruppe 3) oder mit der suboptimalen Dosis von Clodronat allein (Gruppe 4) behandelt wurden, ergaben sich nur sehr geringe (statistisch nicht signifikante) Verringerungen (18 %) der Zahnbeweglichkeit. Die Zahnbeweglichkeit in diesen Gruppen (Gruppe 3 und 4) war immer noch mehr als doppelt so groß wie bei den Kontrollratten (Gruppe 2). Wenn jedoch die Ratten mit der LPS-Injektion mit der Kombination der beiden Arzneistoffe (suboptimale Dosis von CMT-8 plus suboptimale Dosis von Clodronat) behandelt wurden, war eine synergistische Verringerung (89,3 %; p<0,05) der Zahnbeweglichkeit ersichtlich, wobei dieser Parameter noch um 70 % unter der Zahnbeweglichkeit, die bei der Gruppe von Ratten mit der Injektion einer Kochsalzlösung (Kontrolle) festgestellt wurde, lag.
Auf der Grundlage einer rechnergestützten morphometrischen Analyse des von Fleisch befreiten Rattenkiefers (Darstellung in 2) zeigten die Ratten in der Gruppe mit LPS-Injektion einen signifikant größeren Verlust von alveolärem Knochen an sämtlichen 17 verschiedenen Stellen jeder halben Maxilla, verglichen mit dem Knochenverlust, der an den gleichen 17 Stellen bei der Kontrollgruppe mit einer Injektion von Kochsalzlösung auftrat. Beispielsweise erhöhte an der Stelle #7, die sich interproximal zwischen dem 1. und 2. molaren Zahn befand (eine Stelle, die im allgemeinen den stärksten Knochenverlust bei diesen Rattenmodellen der periodontalen Erkrankung zeigt) eine LPS-Injektion in das Zahnfleisch den alveolären Knochenverlust, verglichen mit einer Injektion von Kochsalzlösung, um 140 %. Eine Behandlung der Ratten mit LPS-Injektion entweder mit CMT-8 allein oder mit Clodronat allein verringerte den alveolären Knochenverlust nur geringfügig, wenn überhaupt. Im scharfen Gegensatz dazu führte die Kombinationstherapie im wesentlichen zu einer "Normalisierung" des alveolären Knochenverlustes, der durch bakterielles Endotoxin (LPS) hervorgerufen wird, so dass die Niveaus des Knochenverlustes die gleichen waren, wie sie bei den mit einer Injektion von Kochsalzlösung behandelten Kontrollratten auftreten.
Die Collagenase-Aktivität in partiell gereinigten Extrakten von Zahnfleisch der verschiedenen Gruppen von Ratten wurde unter Verwendung von [³H-Methyl]-kollagen als Substrat bestimmt, wobei die intakten α₁- und α₃-Kollagen-Komponenten und die durch Collagenase erzeugten 3/4-Zerfallsprodukte von Kollagen (α₁ ^A und α₂ ^A) durch SDS-PAGE aufgetrennt wurden, diese Kollagen-Komponenten und -Fragmente durch Autoradiographie sichtbar gemacht wurden und ihre Konzentrationen nach Abtasten der Fluorogramme mit einem Laser-Densitometer berechnet wurden. Die in 3 aufgeführten Daten stellen die gesamte Collagenase-Aktivität in Proben von Zahnfleischextrakt nach Aktivierung etwaiger Procollagenase (latent) in den Proben durch Zugabe von 1,2 mM Aminophenylquecksilberacetat (APMA) dar. Wie in 3 gezeigt, erhöhte eine Injektion von LPS in das Zahnfleisch in drastischer Weise die Collagenase-Aktivität um 700 %, was in Übereinstimmung damit steht, dass dieses MMP zumindest teilweise für den Zerfall von Typ I-Kollagen, dem Hauptbestandteil sämtlicher periodontalen Gewebe, einschließlich der Knochenmatrix, verantwortlich ist. Die Behandlung der Ratten mit LPS-Injektion entweder mit CMT-8 allein oder Clodronat allein (CLOD) verringerte die Collagenase-Aktivität geringfügig um 22–31 %. Im Gegensatz dazu und in ähnlicher Weise wie beim Einfluss auf die Zahnbeweglichkeit und den alveolären Knochenverlust verringerte eine Kombinationstherapie (COMBO) in synergistischer Weise die Collagenase um 91 % herunter auf Konzentrationen, die in den Zahnfleischgeweben der Kontrollgruppe mit einer Injektion von Kochsalzlösung auftreten.
Die Gelatinase-Aktivität wurde nach einem modifizierten Verfahren von McCroskery et al., "Purification and Characterization of a Collagenase Extracted From Rat Tumors", Biochem. J., Bd. 182 (1975), S. 131-142, gemessen, wobei Aliquotanteile der verschiedenen Zahnfleischextrakte mit [³H-Methyl]-gelatine als Substrat inkubiert wurden. Nach der Inkubation bei 37 °C wurde die Freisetzung der in Lösung gegangenen Abbauprodukte durch Flüssigszintillations-Spektrometrie gemessen. Wie durch die Ergebnisse in 4 dargelegt, zeigte die Gelatinase-Aktivität (die ähnlich wie Collagenase nach APMA-Aktivierung von latenten Vorformen dieser MMP gemessen wurde) das gleiche Muster der Veränderung wie Collagenase für die verschiedenen Gruppen von Ratten. Eine Kombinationstherapie erzeugte erneut eine synergistische Verringerung überschüssiger Konzentrationen dieser MMP im Zanfleischgewebe von Ratten mit einer LPS-Injektion.
Ähnliche Muster der Veränderung für diese gewebezerstörenden Enzyme ergaben sich aus dem Folgenden:

– Zymographie zur Bestimmung verschiedener Molekülspezies von Gelatinase;
– die Elastase-Aktivität wurde spektrophotometrisch unter Verwendung eines für Neutrophilen-Elastase (entzündliche Zellen) spezifischen synthetischen Peptidsubstrats gemessen;
– MMP-2 (Gelatinase A), MMP-9 (Gelatinase B), MMP-8 (Collagenase-2) und MMP-13 (Collagenase-3) wurden alle durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von spezifischen Antiseren nachgewiesen (T. Sorsa et al., Ann. N. Y. Acad Sci., Bd. 732 (1994), S. 112-131; L. M. Golub et al., Infl. Res., Bd. 36 (1997), S. 310-317). Bemerkenswert ist, dass alle diese Tests eine synergistische Hemmung der Aktivität in diesen MMP-Proteinasen und der Elastase sowie eine Herunterregulierung der Konzentration dieser Enzyme aufgrund der Kombinationstherapie (CMT plus Bisphosphonat) belegten.

Beispiel 4
Zellkulturexperimente zum Nachweis, dass eine Kombination von chemisch modifiziertem Tetracyclin und einem Bisphosphonat die durch Knochenresorptionszellen (Osteoklasten) in Kultur erzeugte Gelatinase stärker als einer der Arzneistoffe allein hemmt.
Nach der Inkubation von gezüchteten Hühner-Osteoklasten erhaltene Medien wurden partiell gereinigt und sodann 4 Stunden bei 37 °C in Gegenwart von 1,2 mM APMA zur Aktivierung von etwaiger latenter Progelatinase mit [³H-Methyl]-gelatine inkubiert. Die Inkubationen wurden in Gegenwart (oder Abwesenheit) mehrerer verschiedener Konzentrationen (0,001–1000 μM) eines Bisphosphonats, Didronel (Etidronsäure) durchgeführt. Gegebenenfalls wurde CMT-1 in einer Endkonzentration von 50 μM zugegeben. Nach 4-stündiger Inkubation wurde die Umsetzung durch Zugabe von 45%iger Trichloressigsäure und Trägergelatine gestoppt. Das Gemisch wurde zentrifugiert. Aliquotanteile des Überstands, die die radioaktiv markierten Gelatine-Abbaufragmente enthielten, wurden in einem Flüssigszintillationsspektrometer gezählt.
Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. 50 μM CMT-1 hemmte die Osteoklasten-Gelatinase-Aktivität um etwa 79 %. Didronel rief in Endkonzentrationen von 0,001, 0,1, 10 und 1000 μM keine nachweisbare Hemmung dieses Enzyms hervor. Wenn jedoch CMT-1 mit 10 μM Didronel kombiniert wurde, wurde die Osteoklasten-Aktivität um 92 % mehr als mit jedem der Arzneistoffe allein gehemmt.
Beispiel 5
Kombinationen von CMT-3 oder CMT-8 und Clodronat wurden bezüglich ihrer Hemmung der in vitro-Zellwanderung von humanen HT-1080-Fibrosarkom-Krebszellen getestet. Man ließ HT-1080-Zellen in Gegenwart von Medium mit einem Gehalt an 10 % Serum 18 Stunden in Transwell-Kammern (Costar, Cambridge, MA) wandern. Die willkürliche Zellwanderung wurde unter Verwendung von Transwell-Einsätzen mit einer Porengröße von 8,0 μm und 6,5 mm Durchmesser untersucht, wobei die Einsätze vor der Verwendung 2 Stunden im Medium mit einem Gehalt an 10 % Serum äquilibriert worden waren. 750 μl Serum mit einem Gehalt an Medium wurden in die unteren Abteile der Wanderungsvorrichtung gegeben. Für willkürliche Wanderungstests wurden Zellen 2 Stunden in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen vorinkubiert. CMTs und Clodronat allein oder in Kombination und 20 000 Zellen wurden in einem Volumen von 100 μl in einer Transwell-Vorrichtung ausgestrichen. Nach 18-stündiger Züchtung wurden die Zellen in Methanol fixiert, gewaschen und in Toluidinblau gefärbt. Sodann wurden die Zellen von der oberen Oberfläche der Membran mit einem Wattebausch entfernt. Die Zellen, die an der Unterseite der Membranvertiefung gewandert waren, wurden mikroskopisch gezählt oder alternativ durch Computerabtastung quantitativ bestimmt.
Die Konzentrationen der Testkombinationen und die Ergebnisse sind in den 6 und 7 aufgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Kombination von 0,5 μM-Mengen entweder von CMT-3 oder CMT-8 zusammen mit 0,5 μM Clodronat in synergistischer Weise die Zellwanderung hemmte.
Beispiel 6
Rekombinantes, humanes (50 mg) MT₁-MMP (auch als MMP-14 bezeichnet) (In Vitro-Tek, Berlin, Deutschland) wurde mit Puffer (ohne), 2 μM CMT-3 und 2 μM Bisphosphonat-Clodronat (Clodrinat) und Kombinationen von 2 μM CMT-3 und 2 μM Clodrinat 1 Stunde bei 37 °C vorbehandelt. Anschließend wurde β-Casein (52 μM) als Substrat zu den Inkubationsgemischen gegeben. Die Inkubation wurde 60 Minuten bei 37 °C fortgesetzt. Sodann wurde die Inkubation durch Zugabe von Laemmli-Probenpuffer und 5-minütige Siedebehandlung beendet, wonach eine SDS-PAGE-Analyse und eine quantitative Analyse durch Laser-Densitometrie durchgeführt wurden (Sorsa et al., J. Biol. Chem., Bd. 272 (1997), S. 21067-21074; Teronen et al., J. Dent. Res., Bd. 76 (1997), S. 1529-1537. Eine Kombination von suboptimalen Dosen von CMT-3 und Clodronat (Clodrinat) führte zu einer synergistischen Hemmung des β-Casein-Abbaus durch reines rekombinantes, humanes MT-MMP. Die in 8 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine Kombination von suboptimalen 2 μM-Mengen von CMT und Bisphosphonat (Clodrinat) in synergistischer Weise die Aktivität von humanem MT-1-MMP hemmen, verglichen mit der geringfügigen Hemmung durch CMT-3 oder Clodrinat allein.

Claims

Zusammensetzung zum Behandeln und Vermeiden von Bindegewebe- und Basalmembran-Abbau in einem biologischen System, das gegen überschüssige Proteaseaktivität empfindlich ist, umfassend ein Tetracyclin und eine Bisphosphonatverbindung.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Abbau im Zusammenhang mit überschüssigen Proteaseaktivitäten steht.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem biologischen System um eines vom Säuger handelt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die ferner ein pharmazeutisches Präparat oder einen pharmazeutischen Träger umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der Protease um eine Matrixmetalloprotease (MMP), ein MMP-artiges Enzym und/oder eine Serinprotease handelt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Abbau mit Gewebeinvasion und Metastasierung durch maligne Zellen, Knochenresorption, Knorpelzerstörung oder Zerstörung von weichen Geweben verbunden ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Tetracyclin und das Bisphosphonat in synergistischen Mengen zum Hemmen der Produktion und Aktivität von Säugerproteasen vorliegen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die eine Kombination eines Tetracyclins und einer Bisphosphonatverbindung, die die Produktion oder Aktivität von Säugerproteasen synergistisch hemmt, umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Tetracyclin um CMT-1, CMT-3, CMT-8, Doxycyclin, Minocyclin, Lymecyclin oder Kombinationen davon handelt und wobei es sich bei der Bisphosphonatverbindung um Alendronat, Clodronat (Clodrinat), Etidronat, Medronat, Nedrinat, Pamidronat, Tiludronat, Zolendronat oder Kombinationen davon handelt.
Verwendung eines Tetracyclins in Kombination mit einem Bisphosphonat zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der Produktion oder Aktivität von Proteasen in einem biologischen System.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei dem biologischen System um eines vom Säuger handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die Zusammensetzung ferner ein pharmazeutisches Präparat oder einen pharmazeutischen Träger umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die überschüssige Proteaseproduktion und -aktivität mit Bindegewebe- und/oder Basalmembran-Abbau verbunden ist.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei der Protease um eine Matrixmetalloprotease (MMP), ein MMP-artiges Enzym und/oder eine Serinprotease handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei der Gewebeabbau mit Gewebeinvasion und Metastasierung durch maligne Zellen, osteoporotischem Knochenschwund, Knochenresorption, Knorpelzerstörung, Angiogenese oder Zerstörung von weichen Geweben verbunden ist.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei das nicht-antimikrobielle Tetracyclin und das Bisphosphonat in synergistischen Mengen zum Hemmen der Produktion und/oder Aktivität der überschüssigen Protease vorliegen.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei dem Tetracyclin um CMT-1, CMT-3, CMT-8, Doxycyclin, Minocyclin, Lymecyclin oder Kombinationen davon handelt und wobei es sich bei dem Bisphosphonat um Alendronat, Clodronat (Clodrinat), Etidronat, Pamidronat, Medronat, Nedrinat, Tiludronat, Zolendronat oder Kombinationen davon handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 10 unter Verwendung einer Kombination eines Tetracyclins und einer Bisphosphonatverbindung, die die Produktion oder Aktivität von Säugerproteasen synergistisch hemmt.