ES2237945T3 - Combinacion de bisfosfonato y tetraciclina. - Google Patents
Combinacion de bisfosfonato y tetraciclina.Info
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Abstract
Composición para tratar y prevenir la degradación del tejido conjuntivo y la membrana basal en un sistema biológico propenso a una actividad proteinasa en exceso, que comprende una tetraciclina y un compuesto de bisfosfonato.
Description
Combinación de bisfosfonato y tetraciclina.
Esta invención se realizó con el apoyo
gubernamental bajo R37DE03987 concedido por el Instituto Nacional de
Investigación Odontológica (NIH). El Estado tiene ciertos derechos
en la invención.
La invención se refiere a una combinación de
tetraciclinas y bisfosfonatos que actúan sinérgicamente para
inhibir, reducir, regular por disminución y/o prevenir la
degradación del tejido conjuntivo, la membrana basal, así como otros
factores en sujetos propensos a este tipo de degradación
tisular.
La actividad proteolítica es responsable del daño
a los tejidos conjuntivos y las membranas basales como una
complicación de la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria y otros
procesos de enfermedad, tales como la metástasis y la invasión
celular del cáncer. La respuesta inflamatoria contribuye, por
ejemplo, a cambios patológicos en varios procesos agudos y crónicos
que afectan a diversos órganos y tejidos, tales como los pulmones,
hueso, corazón, articulaciones, piel y periodonto, etc.
Las proteinasas que participan en estas
respuestas o procesos de enfermedad incluyen metaloproteinasas de
matriz (MMP), proteinasas similares a las MMP y proteinasas
relacionadas, serín proteinasas y otras proteinasas. Las MMP son
dependientes de zinc y calcio para la escisión hidrolítica de
proteínas sustrato y las secretan o liberan una variedad de células
huésped (por ejemplo, neutrófilos polimorfonucleares (PMN),
macrófagos, osteocitos, epitelio y fibroblastos). Otras ciertas MMP
diferenciadas genéticamente, denominadas MMP de tipo membrana
(MT-MMP), se unen a la membrana celular; otras se
secretan en la matriz extracelular (MEC). Con las serín proteinasas,
el aminoácido serina actúa como un nucleófilo para la escisión
hidrolítica de la proteína sustrato. Las serín proteinasas se
liberan, por ejemplo, por leucocitos activados, más específicamente
por los gránulos azurófilos de los PMN, y otras células incluyendo
células tumorales malignas.
Varios estudios han demostrado que la expresión y
actividades de las MMP se elevan patológicamente sobre la barrera
anti-proteinasa endógena del organismo en una
variedad de enfermedades tales como la metástasis de cáncer,
artritis reumatoide, esclerosis múltiple, periodontitis,
osteoporosis, osteosarcoma, osteomielitis, bronquiectasias,
enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedades cutáneas y
oculares. Se cree que las enzimas proteolíticas, especialmente las
MMP, contribuyen al daño de destrucción tisular asociado con estas
enfermedades.
Algunas metaloproteinasas (MMP) y su asociación
con las enfermedades se tratan por M. E. Ryan, y col., Curr. Op.
Rheum., 1996, 8:238-247. Se han identificado más
de veinte MMP y su número es creciente. Éstas incluyen las
colagenasas intersticiales MMP-1 (tipo fibroblasto),
MMP-8 (tipo leucocito polimorfonuclear (PMNL) o
colagenasa-2), MMP-13
(colagenasa-3); gelatinasas MMP-2
(gelatinasa A de 72 kD) y MMP-9 (gelatinasa B de 92
kD); estromelisinas MMP-3
(estromelisina-1), MMP-10
(estromelisina-2) y MMP-7
(matrilisina o supuesta metaloproteinasa (PUMP) -1); tipo membrana
(MT-MMP), MMP-14
(MT_{1}-MMP), MMP-15
(MT_{2}-MMP), MMP-16
(MT_{3}-MMP); otras son, por ejemplo,
MMP-11 (estromelisina-3),
MMP-12 (metaloelastasa de macrófagos) y
MMP-20. La enamelisina (MMP-20) se
describe por Llano y col., Biochem. 1997,
36:15101-15108 y también puede expresarse por
células cancerígenas humanas tales como las células de carcinoma
epidermoide de lengua humana, lo que indica su potencial
contribución a la progresión y la invasión del cáncer (Salo y col.,
J. Dent. Res. 1998, 77:829, Abstr. Nº 1978). Las proteinasas
relacionadas incluyen TACE y fertilina o meltrina de ADAM
(metaloproteinasa / desintegrina).
Las MMP, proteinasas similares a MMP y
relacionadas tales como TACE, ADAM, etc., participan en el
procesamiento y modificación de fenómenos moleculares tales como la
remodelación tisular (Birkedal-Hansen, Current
Opin. Cell Biol. 1995, 7:728-735; JF Woessner,
Jr., FASEB J., 1991, 5:2145-2154), acciones
de las citocinas (S. Chandler y col., J. Neuroimmunol., 1997,
72:155-161), la fusión intercelular (RH van
Huijsduijen, Gene 1998, 206:273-282; Huovila
y col., Curr. Opin. Cell Biol. 1996,
8:692-699; Yagami-Hiromasa y col.,
Nature 1995, 377:662-656), angiogénesis,
acciones del factor de crecimiento, integrina y otros factores de
adhesión y los procesamientos de sus receptores. Véase también, A.
C. Perry y col., Biochem. Biophys Acta 1994,
1207:134-137. Las enzimas ADAM son proteínas de
membrana con desintegrina A y dominio de metaloproteinasa (Wolfsberg
y col., Dev. Biol. 1995, 169:378-383). TACE
es una enzima de conversión del factor de necrosis tumoral.
Las proteinasas similares a MMP y proteinasas
relacionadas son metaloproteinasas distintas a las MMP clásicas y
que pueden participar en el procesamiento celular de
pro-TNF alfa (factor de necrosis tumoral), la
liberación proteolítica celular de receptores de citocinas,
moléculas de adhesión, etc., tal como se describe por S. Chandler y
col., J. Neuroimmunol., 1997, 72:155-161. Las
MMP, enzimas similares a MMP y relacionadas, por ejemplo, ADAM,
TACE, etc., también median la liberación de TNF alfa (Watanabe y
col., Eur. J. Biochem. 1998, 253:576-582) y
participan en el procesamiento unido a la membrana de TNF alfa por
los monocitos, inducido por factores de virulencia bacteriana. Este
acontecimiento está mediado por las metaloproteinasas unidas a la
membrana. Shapira y col., J. Period. Res. 1997,
32:183-185.
Existen pruebas abundantes de la asociación entre
las proteinasas y un gran número de procesos de enfermedad. Las
proteinasas microbianas pueden actuar conjuntamente con proteinasas
del huésped en el fomento de la destrucción tisular, tal como se
observa en el periodonto (Sorsa y col., Infect. Immun. 1992,
60:4491-4495). Estudios recientes indican que una
serín proteasa, es decir, elastasa, puede desempeñar un papel en la
degradación del tejido conjuntivo y la invasión tisular en el modelo
de rata Dunning de invasión y metástasis de cáncer (cáncer de
próstata) (Lowe e Isaacs, Cancer Res. 1984,
44:744-52). También están implicadas en la
iniciación de la cascada de la proteinasa que media la invasión y la
metástasis tumorales, la actividad tripsina y similar a
quimotripsina (Sorsa y col., J. Biol. Chem. 1997,
272:21067-21074). La serín proteinasa se expresa en
cánceres humanos tales como carcinoma de ovario y colangiosarcoma
(Sorsa y col., J. Biol. Chem. 1997,
272:21067-21074).
El papel de las MMP se ha establecido bien en
muchísimos estados patológicos, por ejemplo, la invasión y
metástasis tumorales (Stetler-Stevenson y col.
Annu. Rev. Cell Biol. 1993, 9:541-73;
Tryggvason y col., Biochem. Biophys. Acta 1987,
907:191-217) y degradación de hueso y cartílago
(Greenwald y col., Bone 1998, 22:33-38; Ryan
y col., Curr. Op. Rheumatol. 1996,
8:238-247). Las células de carcinoma oral
epidermoide expresan la MMP-20 (Salo y col., J.
Dent. Res. 1998, 77:829, Abstr. Nº 1978). Bourguignon y col.
(Mol. Biol. Cell. 1997, Suplemento 8i, Abstract 1603)
describen la asociación de metaloproteinasa con degradación de la
matriz como responsable de la estimulación de la infiltración de
linfocitos que destruye las células de los islotes pancreáticos que
producen la insulina. También se han implicado las citocinas (TNF
alfa) y las MMP en la patogenia de la esclerosis múltiple (Liedtke y
col., Ann. Neurol. 1998, 44:35-46; Chandler y
col., J. Neuroimmunol. 1997, 72:155-171). Se
ha encontrado que MT_{1}-MMP actúa en el
crecimiento y diseminación de las células de cáncer de mama (Li y
col., Mol. Carcinog. 1998, 22:84-89).
Existen muchos otros trastornos en los que la
degradación / destrucción de la proteína extracelular desempeña un
papel prominente. Ejemplos de tales enfermedades incluyen
osteoporosis, artritis, síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA), quemaduras, heridas tales como escaras de decúbito y úlceras
varicosas, fracturas, traumatismos, úlcera gástrica, enfermedades
cutáneas tales como acné y psoriasis, lesiones liquenoides,
epidermólisis ampollosa, aftas (úlcera oral reactiva), enfermedades
dentales tales como enfermedades periodontales, periimplantitis,
quistes mandibulares u otros quistes periapicales, enfermedades
dentales que son el objetivo de un tratamiento del conducto
radicular o un tratamiento endodóntico, enfermedades relacionadas,
resorción radicular externa e intrínseca, caries, etc.
Las serín proteinasas humanas incluyen elastasa
de leucocitos humana (HLE) y catepsina G, y serín proteinasas
adicionales están implicadas en la cascada de rutas involucradas en
la degradación del tejido conjuntivo incluyendo, pero sin limitarse
a, plasmina, activador del plasminógeno, tripsinas asociadas a
tumores, etc.
Las MMP y serín proteinasas pueden funcionar en
combinaciones para producir la destrucción de la mayor parte de los
elementos de la matriz extracelular y membranas basales. Como
ejemplos de la principal interacción entre las MMP y las serín
proteinasas durante la degradación tisular, 1) catepsina G puede
activar MMP-8; 2) la serín proteinasa, elastasa de
leucocitos humana (HLE), puede inactivar los TIMP, los principales
inhibidores tisulares endógenos de las metaloproteinasas de matriz,
3) MMP-8 y MMP-9 pueden inactivar el
inhibidor de la \alpha_{1}-proteinasa
(\alpha_{1}-PI), el principal inhibidor endógeno
de la elastasa de leucocitos humana (S. K. Mallya, y col.,
Annuals of the New York Academy of Science, 1994,
732:303-314) y 4) la tripsina-2
asociada a tumores puede activar eficazmente las
pro-MMP latentes (Sorsa y col., J. Biol.
Chem. 1997, 272:21067-21074).
Las tetraciclinas, incluyendo las tetraciclinas
modificadas químicamente, pueden inhibir la degradación tisular
mediada por MMP in vitro e in vivo, en parte uniendo
iones metálicos (calcio o zinc) a la estructura molecular de la MMP.
Véase, por ejemplo, R. F. Zernicke y col., Journal of
Rheumatology, 1997, 24:1324-31; T. Sorsa y col.,
Journal of Rheumatology, 1998, 25:975-82;
Golub y col., Adv. Dental Research 1998, en la imprenta.
Ciertas tetraciclinas han demostrado inhibir las
metaloproteinasas de matriz, independientemente de la actividad
antibiótica de la tetraciclina. Las patentes de los EE.UU. números
5.459.135 concedida a Golub y col., 5.321.017 concedida a Golub y
col., 5.308.839 concedida a Golub y col., 5.258.371 concedida a
Golub y col., 4.935.412 concedida a McNamara y col., 4.704.383
concedida a McNamara y col., 4.666.897 concedida a Golub y col. y el
documento RE 34.656 concedido a Golub y col. describen el uso de
tetraciclinas que no son antimicrobianas para tratar los estados con
destrucción tisular, la inflamación crónica, la destrucción ósea, el
cáncer y otros estados asociados con la actividad en exceso de las
metaloproteinasas de matriz tales como colagenasas, gelatinasa y
MMP-12 (metaloelastasa de macrófagos).
La patente de los EE.UU. número 5.773.430
concedida a Simon y col., describe el uso de tetraciclinas
hidrófobas para inhibir la actividad en exceso de la serín
proteinasa, elastasa de leucocitos, en un sistema biológico.
Las tetraciclinas son una clase de compuestos que
se conocen particularmente bien por su éxito temprano y espectacular
como antibióticos. Los compuestos tales como la tetraciclina,
esporociclina, etc., son antibióticos de amplio espectro, que tienen
utilidad contra una amplia variedad de bacterias y otros microbios.
El compuesto original, tetraciclina, tiene la siguiente estructura
general:
El sistema de numeración del núcleo de anillos
múltiples es tal como sigue:
La tetraciclina, así como los derivados de
5-OH (oxitetraciclina, por ejemplo,
terramicina^{MR}) y 7-Cl (clorotetraciclina, por
ejemplo, aureomicina^{MR}), existen en la naturaleza y son todos
antibióticos bien conocidos. Las tetraciclinas semisintéticas
incluyen, por ejemplo, doxicilina, minociclina y metaciclina. El uso
de antibióticos de tetraciclina, aunque generalmente eficaces para
tratar la infección, puede conducir a efectos secundarios no
deseados. Por ejemplo, la administración a largo plazo de
tetraciclinas antibióticas puede reducir o eliminar la flora normal,
tal como la flora intestinal y puede conducir a la producción de
microorganismos resistentes a los antibióticos o a la proliferación
excesiva de hongos y levaduras. Estas importantes desventajas
normalmente excluyen las pautas de tratamiento que requieren la
administración crónica de estos compuestos.
Las tetraciclinas naturales pueden modificarse
sin perder sus propiedades antibióticas, aunque deben conservarse
ciertos elementos de la estructura para que ocurra así. Se ha
definido una clase de compuestos que están relacionados
estructuralmente con las tetraciclinas antibióticas, pero en las que
se ha cancelado sustancial o completamente su actividad antibiótica
por modificación química. Las modificaciones que pueden realizarse o
no a la estructura básica de tetraciclina se revisaron por Mitscher,
L. A., The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics, Marcel
Dekker, Nueva York (1978), cap. 6. Según Mitscher, puede realizarse
la modificación en las posiciones 5-9 del sistema de
anillo de la tetraciclina sin producir la pérdida completa de las
propiedades antibióticas. Sin embargo, los cambios en la estructura
básica del sistema de anillo o la sustitución de sustituyentes en
las posiciones 1-4 o 10-12,
generalmente conducen a tetraciclinas sintéticas con actividad
antibacteriana sustancialmente menor o esencialmente sin ella.
Las tetraciclinas modificadas químicamente (CTM)
incluyen, por ejemplo,
4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-1), tetraciclinonitrilo
(CMT-2),
6-desmetil-6-desoxi-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-3),
7-cloro-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-4), tetraciclina-pirazol
(CMT-5),
4-hidroxi-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-6),
4-des(dimetilamino)-12\alpha-desoxitetraciclina
(CMT-7),
6-desoxi-5\alpha-hidroxi-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-8),
4-des(dimetilamino)-12\alpha-desoxianhidrotetraciclina
(CMT-9),
4-des(dimetilamino)minociclina
(CMT-10).
Ejemplos adicionales de tetraciclinas modificadas
para obtener una actividad antimicrobiana reducida incluyen los
epímeros en posición 4 de la oxitetraciclina y la clorotetraciclina
(epi-oxitetraciclina y
epi-clorotetraciclina).
Los bisfosfonatos incluyen una clase de
preparaciones terapéuticas que se ha utilizado como inhibidores de
la resorción ósea. La patente de los EE.UU. número 5.652.227
concedida a Teronen y col., describe el uso de bisfosfonatos para
reducir la degradación de los componentes proteicos de la matriz del
tejido conjuntivo que resulta de la actividad en exceso de la
metaloproteinasa. La patente de los EE.UU. número 5.688.120 describe
la inhibición de la resorción ósea alveolar utilizando la liberación
iontofóretica de bisfosfonatos en el hueso alveolar mediante la
administración de bisfosfonato en un depósito conectado al tejido
gingival y mediante el paso de una corriente eléctrica a través del
mismo.
No ha habido sugerencias para utilizar las
tetraciclinas y los bisfosfonatos juntos en combinación, con el fin
de reducir, inhibir y regular por disminución la actividad en exceso
de la proteinasa endógena y para reducir la destrucción de tejidos,
membrana basal y otros factores.
Es un objeto de la invención proporcionar una
combinación de compuestos para tratar sujetos propensos al daño y la
destrucción tisulares relacionados con proteinasas.
Se proporciona una composición para inhibir,
reducir y regular por disminución las proteinasas en exceso,
tratando o previniendo así la degradación de la membrana basal y el
tejido conjuntivo relacionada con las proteinasas en un sistema
biológico propenso a alteraciones estructurales y funcionales debido
a un exceso de actividad proteinasa. La composición incluye una
tetraciclina y un bisfosfonato. La inhibición supone la reducción de
la cantidad y actividad de proteinasas y la regulación por
disminución de la producción endógena de las proteinasas. La
composición de la invención puede tratar o prevenir enfermedades
relacionadas con el desequilibrio de proteinasas mediante la
regulación por disminución, la prevención o la reducción de la
actividad en exceso de las MMP, serín proteinasas, enzimas similares
a MMP y relacionadas, tales como la enzima de conversión del factor
de necrosis tumoral (TACE) de la que depende la activación del
factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha) y proteínas de
membrana con un dominio de desintegrina y de metaloproteinasa
(ADAM).
La degradación tratada según la invención puede
implicar tejidos duros y blandos, incluyendo el tejido conjuntivo y
las membranas basales. La degradación puede estar asociada con
estados tales como la resorción ósea, la destrucción de cartílago o
la destrucción de tejidos blandos y la invasión y metástasis de
tejido por células malignas. Las alteraciones estructurales y
funcionales incluyen como ejemplos no limitantes, pérdida de dientes
debido a la degradación periodontal y la fractura del esqueleto
debida a una excesiva destrucción ósea, por ejemplo, durante la
osteoporosis. La proteinasa en exceso se inhibe mediante una
reducción en la cantidad y actividad de proteinasas y la regulación
por disminución de la producción de proteinasas. La regulación por
disminución significa el bloqueo de la expresión génica y la
secreción de la proteinasa, es decir, la disminución de la síntesis
y la liberación de la proteína enzimática. El tratamiento también
puede bloquear la actividad o activación de las proteinasas,
independiente de un efecto sobre la síntesis enzimática.
La composición puede estar en forma de una
preparación farmacéutica o cosmética y, por tanto, puede incluirse
en la composición una preparación o vehículo farmacéutico o
cosmético.
La composición comprende preferiblemente una
combinación de tetraciclina y bisfosfonato en cantidades sinérgicas
para inhibir la actividad proteinasa en exceso de modo que la
combinación muestre sinergia en la eficacia de inhibición, reducción
y regulación por disminución de las proteinasas que participan en la
degradación tisular. Esto significa que la combinación es más eficaz
que la tetraciclina sola o el bisfosfonato solo y la eficacia de la
combinación es generalmente superior que la esperada sumando los dos
efectos.
En un método de inhibición y/o reducción de la
actividad de, y regulación por disminución de las proteinasas en
exceso y la degradación relacionada del tejido conjuntivo, las
membranas basales y otros factores que reflejan las alteraciones
estructurales y funcionales en un sistema biológico propenso a esta
degradación tisular, se va a administrar una composición que incluye
una combinación de tetraciclina y bisfosfonato al sistema en
cantidades que inhiben, reduce y/o regulan por disminución las
proteinasas.
La figura 1 es un gráfico de barras que ilustra
los resultados de movilidad de los dientes en el ejemplo 3;
La figura 2 es un gráfico de barras que ilustra
los resultados de pérdida ósea alveolar en el ejemplo 3;
La figura 3 es un gráfico de barras que ilustra
el efecto sobre la actividad colagenasa gingival en el ejemplo
3;
La figura 4 es un gráfico de barras que ilustra
el efecto sobre la actividad gelatinasa gingival en el ejemplo
3;
La figura 5 es un gráfico de barras que ilustra
la inhibición de gelatinasa de osteoclastos en el ejemplo 4;
La figura 6 es un gráfico de barras que ilustra
la inhibición de la migración de células cancerígenas en el ejemplo
5;
La figura 7 es otro gráfico de barras que ilustra
la inhibición de la migración de células cancerígenas por otra
combinación en el ejemplo 5;
La figura 8 es otro gráfico de barras que ilustra
la inhibición de la degradación de caseína por
MT_{1}-MMP (MMP-14) en el ejemplo
6.
La invención incluye una composición para inhibir
los estados con destrucción tisular asociados con la producción en
exceso y la actividad de las proteinasas de degradación del tejido
conjuntivo y la membrana basal, por ejemplo, metaloproteinasas,
enzimas similares a metaloproteinasas y relacionadas, serín
proteinasas y otras proteinasas, así como proteinasas microbianas,
víricas y fúngicas. La aplicación de la composición de la invención
a un sujeto que necesita tratamiento inhibe o previene la
degradación de tejido conjuntivo, membranas basales, y otros
procesos de enfermedad.
Los estados con destrucción tisular que pueden
tratarse y/o prevenirse con la presente invención resultan de una
actividad proteinasa en exceso de metaloproteinasas, proteinasas
similares a metaloproteinasas y proteinasas relacionadas, serín
proteinasas o combinaciones de estas enzimas, así como proteinasas
microbianas, víricas y fúngicas. Estos estados incluyen, por
ejemplo, invasión de tejido por células malignas, resorción ósea,
destrucción de cartílago, destrucción de tejidos blandos (por
ejemplo, piel, tendones, ligamentos, paredes de vasos sanguíneos,
etc.), así como la diseminación tumoral y la metástasis de cáncer a
tejidos tanto blandos como duros, y bronquiectasias, enfermedad
pulmonar destructiva y obstructiva crónica, asma y otras
enfermedades pulmonares. Pueden prevenirse y/o tratarse
ventajosamente enfermedades de los mamíferos tales como
periodontitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reactiva
y otras, invasión y metástasis del cáncer, osteomielitis,
osteoporosis, osteosarcoma y otras enfermedades óseas. Aunque no se
pretende ceñirse a ninguna teoría, el tratamiento puede ser eficaz,
al menos en parte, porque tanto las CMT como los bisfosfonatos son
agentes farmacológicos con tropismo por el hueso. La combinación
también puede utilizarse para tratar enfermedades con destrucción
tisular en mascotas (gatos, perros, etc.) y mamíferos grandes tales
como caballos y otros mamíferos.
Los estados con destrucción tisular y de la
membrana basal particulares tratados según la invención incluyen
como ejemplos no limitantes, enfermedades óseas tales como resorción
ósea mediada por osteoclastos y trastornos que suponen el paso
celular a través de membranas basales, tales como las metástasis de
cáncer y la infiltración de linfocitos, por ejemplo, en los islotes
de Langerhans relacionada con el inicio de la diabetes tipo 1.
La composición de la invención puede unirse con
preparaciones farmacéuticas que contienen moléculas que se dirigen a
sitios tales como tejido, metástasis y/o vasculatura tumorales para
su administración a los mismos. Ejemplos de estas moléculas son
péptidos de direccionamiento (W. Arap y col., Science 1998,
279:377-380).
Puede estimarse una necesidad de tratamiento a
partir de o basándose en varios parámetros clínicos, radiológicos y
bioquímicos de gravedad de la enfermedad. Un ejemplo de enfermedades
artríticas incluye signos clínicos de dolor y debilidad de las
articulaciones, pruebas de rayos X de destrucción de cartílago y
hueso y la detección de niveles elevados de fragmentos de
entrecruzamiento de colágeno (piridolina y desoxipiridolina) en
suero y orina que indican el aumento de la degradación de colágeno
de hueso y cartílago. Un diagnóstico de periodontitis y
periimplantitis incluye, por ejemplo, pruebas clínicas (por ejemplo,
aumento de la profundidad de las bolsas periodontales; pérdida de
unión periodontal y periimplantar) pruebas microbiológicas,
bioquímicas, inmunológicas y/o de biología molecular de degradación
del tejido periodontal.
El tejido conjuntivo forma la matriz extracelular
que conecta y soporta los demás tejidos en todas las partes del
cuerpo. El tejido conjuntivo incluye componentes de colágeno (fibras
blancas en la piel, tendón, hueso, cartílago, etc., compuestas por
fibrillas de proteína enrolladas), elásticos (fibras amarillas de la
escleroproteína albuminoide), de la mucosa, reticulares (similares a
una red), óseos (hueso) y cartilaginosos (condrocitos embebidos en
condrina y que incluyen hialina (claros), elásticos o
fibrocartílago) y a veces de vasos sanguíneos (células endoteliales,
por ejemplo, que proliferan en un sitio de inflamación). El tejido
conjuntivo puede clasificarse adicionalmente como laxo (areolar) y
denso (más fibroso).
La membrana basal es una membrana de tejido
conjuntivo modificado bajo el tejido epitelial, desde una glándula
que contiene acinos o partes secretoras especiales. La membrana
basal es una estructura compleja compuesta por colágeno de tipo IV,
el proteoglucano heparán sulfato y lamininas, que unen el epitelio
al tejido conjuntivo subyacente. Tras la destrucción de la membrana
basal para superar las barreras de la matriz extracelular, se
requiere la escisión específica de la laminina-5 por
gelatinasas (Gianelli y col., Science 1997,
277:225-228) para la migración celular maligna e
inflamatoria. La presente combinación de tetraciclina y bisfosfonato
inhibe esto también.
En una realización, la composición de la
invención se utiliza para tratar estados dependientes de MMP. Los
estados dependientes de MMP incluyen, por ejemplo, heridas,
quemaduras, fracturas, lesiones, traumatismos, úlceras, cáncer y su
progresión como metástasis en tejidos conjuntivos y hueso; otros
estados incluyen periodontitis, gingivitis, periimplantitis, quistes
mandibulares, resorción radicular interna y externa, caries, SIDA,
úlcera corneal, úlcera gástrica, úlceras aftosas, acné, psoriasis,
aflojamiento de una prótesis de cadera, osteomielitis, osteoporosis,
remodelación tisular, angiogénesis, artritis (reumatoide, activa y
osteoartritis), enfermedades pulmonares (bronquiectasias y
enfermedades pulmonares obstructivas crónicas y otras enfermedades
pulmonares).
Se ha encontrado que las tetraciclinas en
combinación con bisfosfonato inhiben la producción y/o la actividad
de las proteinasas endógenas en un sistema biológico.
Las tetraciclinas preferidas son
4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-1),
6-desmetil-6-desoxi-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-3),
6-desoxi-5-alfa-hidroxi-4-des(dimetilamino)tetraciclina
(CMT-8), también, doxiciclina, minociclina,
limeciclina y combinaciones de las tetraciclinas.
Los bisfosfonatos son compuestos relacionados con
el ácido pirofosfónico inorgánico y están disponibles comercialmente
o pueden prepararse según métodos conocidos. Los bisfosfonatos
útiles en el presente documento incluyen como ejemplos no
limitantes, por ejemplo, alendronato (ácido
(4-amino-1-hidroxibutiliden)bisfosfónico),
clodronato (ácido diclorometanodifosfónico), etidronato (ácido
(1-hidroxietiliden)difosfónico) y pamidronato
(ácido
(3-amino-1-hidroxipropiliden)bisfosfónico);
también risedronato (ácido
[-hidroxi-2-(3-piridinil)etiliden]bisfosfónico),
tiludronato, es decir, ácido tiludrónico (ácido
[(4-clorofenil)tio]metilen]bisfosfónico)
y zolendronato.
Otros incluyen
[1-hidroxi-3-(metilpentilamino)propiliden]bisfosfonato
(BM21.0955), [(cicloheptilamino)metilen]bisfosfonato
(YM175),
1-hidroxi-3-(1-pirrolidinil)-propiliden]bisfosfonato
(EB-1053),
[1-hidroxi-2-(1H-imidazol-1-il)etiliden]bisfosfonato
(CGP 42'446) y
(1-hidroxi-2-imidazol-[1,2-a]piridin-3-il-etiliden)-bisfosfonato
(YM 529).
Los bisfosfonatos se describen exhaustivamente
por H. Pleisch, Endocr. Rev., 1998,
19(1):80-100; véase también H. Fleisch,
Bisphosphonates in Bone Disease: From the Laboratory to the
Patient, 1997, 3ª edición, The Parthenon Publishing Group, Nueva
York y Londres.
Los bisfosfonatos preferidos son alendronato,
clodronato (clodrinato), etidronato, pamidronato, medronato,
nedrinato, tiludronato, zolendronato y combinaciones de los
mismos.
La cantidad de cada compuesto en la composición
de la invención que incluye tetraciclina y bisfosfonato, para su uso
en un caso específico, variará dependiendo de la composición
particular formulada, el modo de aplicación, el sujeto, el sitio al
que se administra la composición, el estado degradativo que se esté
tratando o previniendo y el modo de administración. Las dosis se
determinarán utilizando consideraciones convencionales, por ejemplo,
mediante la comparación habitual de las actividades diferenciales de
las formulaciones y de un agente conocido, por ejemplo, por medio de
un protocolo farmacológico convencional apropiado. Las dosis típicas
para uso humano incluyen 10-1000 m/día de
tetraciclina en combinación con 20-2000 mg/día de
bisfosfonato, dependiendo del tipo de bisfosfonato y de la vía de
administración. Las cantidades de la tetraciclina y los
bisfosfonatos útiles en la invención son cantidades que, en
combinación, dan como resultado una inhibición de la actividad y/o
secreción y síntesis de proteinasa en exceso en un sistema o sujeto
propenso a las proteinasas en exceso. Estas cantidades son
ventajosamente como mucho diez veces inferiores a las cantidades que
son óptimas o se necesitan cuando se utiliza cada compuesto solo,
reduciendo así significativamente la posibilidad de efectos
secundarios producidos por las dosis superiores, si los compuestos
tuvieran que tomarse individualmente, por ejemplo, cuando se
utilizan los compuestos individuales se necesita 10 - 30
\muM;
juntos se necesita 2,0 - 10,5 \muM.
juntos se necesita 2,0 - 10,5 \muM.
Para la administración oral, la composición de la
invención puede formularse en la forma de comprimidos, cápsulas,
elixires, suspensiones, disoluciones o similares. Para la
administración parenteral, la composición puede formularse en formas
inyectables tales como disoluciones o suspensiones, por ejemplo,
para la inyección intramuscular. Para la aplicación tópica, la
composición puede aplicarse directamente o incorporarse con un
sistema de administración tal como un vehículo o sustrato, por
ejemplo, un polímero, o una formulación en crema, pomada, aerosol,
membranas, etc.
Se investigó la actividad de combinaciones de
diversas tetraciclinas y bisfosfonatos in vivo. El modelo
animal de enfermedad utilizado se publicó previamente (Ramamurthy y
col., Archs. Oral Biol., 1985, 130:679-683) y
supone la inyección de endotoxina (es decir, lipopolisacárido (LPS)
bacteriano, un componente estructural principal de la membrana
externa de las bacterias gram-negativas y un
mediador principal de la inflamación y la destrucción ósea durante
la periodontitis y otras infecciones) directamente en la encía de
ratas, cada dos días durante un periodo de tiempo de 7 días. Este
procedimiento produce una notable inflamación en los tejidos
periodontales e induce niveles elevados de metaloproteinasas de
matriz (MMP) de destrucción de tejido y serín proteinasas, tales
como elastasa, en la encía que conducen a una grave resorción ósea
alveolar y pérdida ósea alrededor de los dientes afectados, todo
dentro del protocolo experimental de 7 días. Brevemente, las ratas
macho adultas con esta enfermedad inflamatoria inducida de manera
experimental se dejaron sin tratar o se trataron con dosis
subóptimas de (I) una CMT sola; (II) un bisfosfonato solo, o (III)
una combinación de (I) y (II). Al final del protocolo experimental,
se midieron la movilidad dental y pérdida ósea alveolar, y los
niveles de diversas MMP de destrucción de tejido, colagenasas y
gelatinasas y enzimas de serina en la encía. Las dosis subóptimas de
o bien la CMT sola o bien el bisfosfonato solo, produjeron una
pequeña o ninguna reducción en estos parámetros de destrucción de
tejido blando y duro. Por el contrario, la combinación de estos dos
tipos de fármacos redujeron de manera sinérgica los niveles
patológicos de estas rutas de destrucción, reduciendo a menudo estos
niveles en los tejidos a los que se inyectó la endotoxina hasta los
niveles normales de colagenasas, gelatinasas y elastasa observados
en los tejidos a los que se inyectó solución salina (control).
También se probó la combinación in vitro
en osteoclastos (células de resorción ósea) de pollo en cultivo y
mostraron inhibición de la actividad gelatinasa del osteoclasto.
También se probó la combinación in vitro
en células de fibrosarcoma humano y frente a
MT_{1}-MMP (MMP-14) recombinante
humana y MMP-8 de tipo natural pura. Brevemente, se
probaron los efectos de concentraciones inhibitorias de MMP
subóptimas de CMT (3 y 8) y clodronato (clodrinato) sobre la
migración in vitro de células de fibrosarcoma
HT-1080, utilizando un sistema de ensayo Transwell
(de cocultivo celular). Como resultado de diferentes inducciones de
proliferación tumoral, las células de fibrosarcoma humano de la
línea celular HT-1080 expresan y activan tanto las
MMP extracelulares (MMP-2, 9) como las
MT-MMP unidas a la superficie celular, que
participan en una cascada de activación en procesos invasivos y
metastásicos malignos, así como angiogénicos. H.
Birkedal-Hansen, Curr. Op. Cell Biol. 1995,
7:728-735; D. Hanahan y col., Cell 1996,
86:353-364.
También, se probaron dosis inhibitorias
subóptimas de las CMT y el bisfosfonato, solos y en combinación, con
actividades de MMP-9 y MT_{1}-MMP
recombinante humana pura utilizando un ensayo de degradación de
\beta-caseína. El ensayo se describe por Teronen y
col., J. Dent Res. 1997, 76:1529-1537; T.
Sorsa y col., J. Biol. Chem. 1997,
272:21067-21074. Dosis subóptimas de o bien una CMT
sola o bien bisfosfonatos solos produjeron poca o ninguna reducción
en la migración de HT-1080 y sólo inhibieron
ligeramente las actividades de MT_{1}-MMP. Sin
embargo, la combinación de las CMT y los bisfosfonatos redujo de
manera sinérgica la migración in vitro de las células de
fibrosarcoma HT 1080, así como inhibieron las actividades de la
MT_{1}-MMP recombinante humana pura.
Los experimentos in vivo e in vitro
demostraron que una combinación de una tetraciclina no
antibacteriana modificada químicamente más un bisfosfonato inhibe de
manera sinérgica la degradación de tejido conjuntivo (incluyendo el
hueso) y la membrana basal, así como la migración de células
malignas, e inhibe de manera sinérgica las actividades de la
MT_{1}-MMP unida a células humanas pura y las
colagenasas, gelatinasas (MMP extracelulares), así como la elastasa
(serín proteinasa) extracelulares.
Para ejemplos in vivo, se distribuyeron
treinta ratas Sprague-Dawley macho en 5 grupos, tal
como sigue:
Grupo 1: Normal. Inyección de solución salina +
tratamiento placebo (CMC)
Grupo 2: LPS. Inyección de LPS + placebo
(CMC)
Grupo 3: CMT-8. Inyección de LPS
+ CMT-8 (1 mg/día)
Grupo 4: Clodronato. Inyección de LPS +
clodronato (1 mg/semana)
Grupo 5: Combinación. LPS + CMT-8
(1 mg/día)+ clodronato (1 mg/semana)
Los tratamientos se administraron mediante sonda
nasogástrica una vez al día (CMT-8) durante todo el
periodo de 7 días o mediante una única inyección subcutánea
(clodrinato).
Modelo de rata de periodontitis inducida con LPS
(lipopolisacárido): veinticuatro horas antes del tratamiento, se
inyectaron a las ratas en las encías anteriores superiores y en las
papilas palatinas entre los molares superiores 1º y 2º 10 \muL de
LPS (1 mg/ml) o solución salina, para un total de 10 \muL de LPS
inyectados por sitio. Las inyecciones de LPS se repitieron un día sí
y un día no hasta completar las tres inyecciones.
En el día 7, se anestesiaron las ratas, se
recogieron muestras de sangre mediante punción cardiaca y se
sacrificaron las ratas. Se comprobó la movilidad dental y se
diseccionó el tejido gingival y se almacenó a -80ºC para su
posterior análisis enzimático. Se descarnaron las mandíbulas para la
determinación de la pérdida ósea.
El primer experimento se diseñó para seleccionar
las dosis subóptimas de CMT-8 (una tetraciclina no
antibacteriana, modificada químicamente) y clodronato (un
bisfosfonato) en el modelo de pérdida ósea inducida con endotoxina.
Se anestesiaron grupos de ratas (n = 5 - 6 ratas/ grupo) y se les
inyectó directamente en los tejidos gingivales, o bien solución
salina (grupo control) o bien endotoxina LPS un día sí y un día no
durante un periodo de tiempo de 7 días. Veinticuatro horas después
de la primera inyección, se administró a los grupos de ratas
mediante sonda nasogástrica 0, 0,5 mg, 1 mg o 2 mg de
CMT-8, diariamente durante los 6 días siguientes. Al
final del experimento, se anestesiaron las ratas, se extrajo sangre
mediante punción intracardiaca, se sacrificaron las ratas y se
diseccionó el tejido gingival para el análisis enzimático. Además,
se puntuó la movilidad dental y, tras descarnar las mandíbulas, se
puntuó la pérdida ósea alveolar alrededor de los dientes, de manera
morfométrica utilizando un sistema asistido por ordenador. Los
resultados se tratan a continuación.
En un segundo experimento, se utilizó un
protocolo similar para identificar las dosis subóptimas de
clodronato en este modelo, excepto porque las diferentes dosis de
este fármaco (0, 0,5 mg, 1 mg, 2 mg) se administraron mediante una
única inyección subcutánea.
Basándose en los experimentos de los EJEMPLOS 1 y
2, los resultados mostraron que 0,5 mg de CMT-8 o
clodronato no produjeron efectos significativos sobre la movilidad
dental y la pérdida ósea alveolar; por el contrario, 2 mg de
cualquier fármaco devolvió esencialmente la movilidad dental y la
pérdida ósea patológicas, inducidas por la endotoxina bacteriana,
hasta los niveles control. Por tanto, se seleccionó 1 mg de
cualquier fármaco como la dosis subóptima debido a que no produjo
efectos beneficiosos, o apenas detectables.
En un tercer experimento, se distribuyeron 30
ratas macho adultas en los siguientes grupos experimentales: grupo
al que se inyectó solución salina; grupos a los que se inyectó
endotoxina y luego sin administración de fármaco, con
CMT-8 solo (1 mg/día), clodronato solo (1 mg/semana)
o una combinación de las mismas dosis subóptimas de ambos fármacos.
El experimento se terminó el día 7. Tal como se describió
anteriormente, se diseccionaron los tejidos gingivales, se
extrajeron y se analizaron los extractos purificados parcialmente
para determinar las actividades proteinasa neutra (elastasa y
metaloproteinasa de matriz) y se evaluaron tanto la movilidad dental
como la pérdida ósea alveolar.
Los resultados de movilidad dental se muestran en
la figura 1. Los resultados del hueso alveolar se muestran en la
figura 2. El efecto sobre la actividad de la colagenasa gingival se
muestra en la figura 3. El efecto sobre la actividad de la
gelatinasa gingival se muestra en la figura 4.
En la figura 1, la movilidad dental se basa en el
siguiente sistema de puntuación:
0 = sin movimiento
1 = movimiento ligero
(vestíbulo-palatino)
2 = movimiento medio
(vestíbulo-palatino)
3 = movimiento grave
(vestíbulo-palatino)
a frente a b, p < 0,05
a frente a a (N. S.) (No significativo)
b frente a b (N. S.)
Tal como se muestra en la figura 1, la movilidad
dental (un reflejo de la gravedad de la inflamación y pérdida de
colágeno en los tejidos periodontales más la pérdida ósea alveolar)
fue muy grave en las ratas a las que se inyectó LPS no tratadas
(grupo 1) comparado con las ratas a las que se inyectó solución
salina (control; grupo 2). Cuando se trataron las ratas a las que se
inyectó LPS con CMT-8 subóptima sola (grupo 3) o
clodronato subóptimo solo (grupo 4), sólo se observaron reducciones
muy ligeras (no significativas estadísticamente) (18%) en la
movilidad dental y la movilidad dental en estos grupos, grupos 3 y
4, fue todavía más del doble del nivel observado en las ratas
control (grupo 2). Sin embargo, cuando se trataron las ratas a las
que se inyectó LPS mediante la combinación de los dos fármacos
(dosis subóptima de CMT-8 más dosis subóptima de
clodronato), se observó una reducción sinérgica (89,3%; p < 0,05)
en la movilidad dental, de modo que este parámetro fue incluso un
70% inferior a la movilidad dental observada en el grupo de ratas al
que se le inyectó solución salina (control).
Basándose en el análisis morfométrico asistido
por ordenador de las mandíbulas de rata descarnadas y, tal como se
muestra en la figura 2, las ratas en el grupo al que se le inyectó
LPS mostraron una pérdida ósea alveolar significativamente superior
en los diferentes 17 lugares en cada mitad maxilar que la pérdida
ósea observada en los mismos 17 lugares en el grupo control al que
se le inyectó solución salina. Por ejemplo, en el lugar nº 7,
situado interproximalmente entre los molares 1º y 2º (un lugar que
muestra generalmente la pérdida ósea más grave en estos modelos de
rata de enfermedad periodontal), la inyección de LPS en la encía
aumentó la pérdida ósea alveolar, comparado con la inyección de
solución salina, en un 140%. Tratar a las ratas a las que se les
inyectó LPS con CMT-8 sola o con clodronato solo
redujo la pérdida ósea alveolar sólo ligeramente, si lo hizo. En un
marcado contraste, el tratamiento de combinación "normalizó"
esencialmente la pérdida ósea alveolar, inducida por la endotoxina
bacteriana (LPS), de modo que los niveles de pérdida ósea fueron los
mismos que los observados en las ratas control a las que se les
inyectó solución salina.
Se evaluó la actividad colagenasa en extractos
parcialmente purificados de encía procedentes de los diferentes
grupos de ratas, utilizando
[^{3}H-metil]colágeno como sustrato,
separando los componentes de colágeno \alpha_{1} y
\alpha_{2} y los productos de degradación 3/4 generados por
colagenasa (\alpha_{1}^{A} y \alpha_{2}^{A}) mediante
SDS-PAGE, visualizando estos componentes y
fragmentos de colágeno mediante autorradiografía y calculando sus
niveles tras el barrido de los fluorogramas con un densitómetro
láser. Los datos mostrados en la figura 3 representan la actividad
colagenasa total en las muestras de extracto gingival tras activar
cualquier procolagenasa (latente) en las muestras mediante la
adición de acetato aminofenilmercúrico (APMA) 1,2 mM. Tal como se
muestra en la figura 3, la inyección de LPS en la encía aumentó
drásticamente la actividad colagenasa en un 700%, coherente con que
esta MMP es responsable, al menos en parte, de la degradación del
colágeno de tipo I, el principal constituyente de todos los tejidos
periodontales, incluyendo la matriz ósea. El tratamiento de las
ratas a las que se les inyectó LPS con CMT-8 sola o
con clodronato solo (CLOD) redujo la actividad colagenasa
ligeramente en un 22 - 31%. Por el contrario, y como el efecto sobre
la movilidad dental y la pérdida ósea alveolar, el tratamiento de
combinación (COMBINACIÓN) redujo de manera sinérgica la colagenasa
en un 91%, hasta los niveles observados en los tejidos gingivales
del grupo control, al que se le inyectó solución salina.
Se midió la actividad gelatinasa mediante una
modificación del método de McCroskery y col., "Purification and
Characterization of a Collagenase Extracted From Rat Tumors",
Biochem. J., 1975, 182:131-142, incubando
alícuotas de los diferentes extractos gingivales con
[^{3}H-metil]gelatina como sustrato. Tras
la incubación a 37ºC, se midió la liberación de productos de
degradación solubilizados mediante espectrometría de centelleo
líquido. Tal como se demuestra mediante los resultados de la figura
4, la actividad gelatinasa (que como la colagenasa, se midió tras la
activación con APMA de las proformas latentes de esta MMP) mostró el
mismo patrón de cambio que la colagenasa para los diferentes grupos
de ratas; el tratamiento de combinación produjo de nuevo una
reducción sinérgica en los niveles excesivos de esta MMP en los
tejidos gingivales de las ratas a las que se les inyectó LPS.
Se observaron patrones de cambio similares para
estas enzimas de destrucción de tejido para lo siguiente:
- -
- zimografía para evaluar las diferentes especies moleculares de gelatinasa
- -
- la actividad elastasa se midió espectrofotométricamente utilizando un sustrato de péptido sintético específico para la elastasa de los neutrófilos (células inflamatorias).
- -
- MMP-2 (gelatinasa A), MMP-9 (gelatinasa B), MMP-8 (colagenasa-2) y MMP-13 (colagenasa-3) se detectaron todas mediante análisis de inmunotransferencia utilizando antisueros específicos (T. Sorsa y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994, 732:112-131; L. M. Golub y col., Infl. Res. 1997, 36:310-317). Es de interés que todos estos ensayos demostraron una inhibición sinérgica de las actividades de estas proteinasas MMP y elastasa, así como la regulación por disminución del nivel de estas enzimas debido al tratamiento de combinación (CMT más bisfosfonato).
Experimentos de cultivo celular que demuestran
que una combinación de una tetraciclina modificada químicamente y un
bisfosfonato inhibe la gelatinasa producida por las células de
resorción ósea (osteoclastos) en cultivo más que cualquiera de los
fármacos solos.
Se purificaron parcialmente los medios tras la
incubación procedentes de osteoclastos de pollo en cultivo, luego se
incubaron con [^{3}H-metil]gelatina durante
4 horas a 37ºC, en presencia de APMA 1,2 mM para activar cualquier
progelatinasa latente. Las incubaciones se llevaron a cabo en
presencia (o ausencia) de varias concentraciones diferentes (0,001 -
1000 \muM) de un bisfosfonato, Didronel (ácido etidrónico); cuando
fue apropiado, se añadió CMT-1 a una concentración
final de 50 \muM. Tras la incubación de 4 horas, la reacción se
detuvo mediante la adición de ácido tricloroacético al 45% y
gelatina vehículo, la mezcla se centrifugó y alícuotas del
sobrenadante, que contenían los fragmentos de degradación de la
gelatina radiomarcada, se sometieron a recuento en un espectrómetro
de centelleo líquido.
Los resultados se muestran en la figura 5. La
CMT-1 50 \muM inhibió la actividad gelatinasa de
los osteoclastos en aproximadamente un 79%. Didronel, a
concentraciones finales de 0,001, 0,1, 10 y 1000 \muM, no mostró
una inhibición detectable de esta enzima. Sin embargo, cuando se
combinó CMT-1 con 10 \muM de Didronel, la
actividad de los osteoclastos se inhibió en un 92%, más que lo
observado con cualquier fármaco solo.
Se probaron combinaciones de
CMT-3 o CMT-8 y clodronato para
determinar la inhibición de la migración celular in vitro de
células cancerígenas de fibrosarcoma HT-1080 humano.
Se permitió que las células HT-1080 migraran, en
presencia de un medio que contenía 10% de suero, durante 18 h en
cámaras Transwell (Costar, Cambridge, MA). Se estudió la migración
celular aleatoria utilizando insertos Transwell de 8,0 \muM de
tamaño de poro y 6,5 mm de diámetro que se equilibraron en el medio
que contiene el 10% de suero, 2 h antes de su uso. Se añadieron 750
\mul de medios que contenían suero a los compartimentos inferiores
del aparato de migración. Para los ensayos de migración aleatoria,
se preincubaron las células durante 2 h en presencia de las
concentraciones indicadas. Se cultivaron en placa las CMT y
clodronato solos o en combinación y 20.000 células, en un volumen de
100 \mul, en un aparato Transwell. Tras su cultivo durante 18
horas, las células se fijaron con metanol, se lavaron y tiñeron con
azul de toluidina. Se eliminaron las células de la superficie
superior de la membrana con un bastoncillo de algodón y se contaron
microscópicamente las células que migraron en el lado inferior del
pocillo de la membrana o se cuantificaron alternativamente mediante
exploración por ordenador.
Las concentraciones de las combinaciones de
prueba y los resultados se muestran en las figuras 6 y 7. Los
resultados indican que una combinación de cantidades 0,5 \muM de
CMT-3 o CMT-8 junto con clodronato
0,5 \muM inhibió de manera sinérgica la migración celular.
La MT_{1}-MMP (también
denominada MMP-14) (50 mg) humana recombinante
(In Vitro-Tek, Berlín, Alemania) se pretrató con tampón
(nada), CMT-3 2 \muM y bisfosfonato clodronato
(clodrinato) 2 \muM y combinaciones de CMT-3 2
\muM y clodrinato 2 \muM, durante 1 h a 37ºC. Posteriormente, se
añadió \beta-caseína sustrato (52 \muM) a las
mezclas de incubación y las incubaciones se continuaron durante 60
minutos a 37ºC. La incubación se terminó mediante la adición de
tampón de muestra de Laemmli y se llevó a ebullición durante 5
minutos antes del análisis mediante SDS-PAGE y
cuantitativo mediante densitometría láser (Sorsa y col., J. Biol.
Chem. 1997, 272:21067-21074; Teronen y col.,
J. Dent Res. 1997, 76:1529-1537). La
combinación de dosis subóptimas de
CMT-3-clodronato (clodrinato) dio
como resultado una inhibición sinérgica de la degradación de
\beta-caseína por MT-MMP humana
recombinante pura. Los resultados mostrados en la figura 8 indican
que la combinación de cantidades 2 \muM, subóptimas, de CMY y
bisfosfonato (clodrinato) inhibió de manera sinérgica la actividad
de la MT-1-MMP humana, en
comparación con la ligera inhibición relativa por la
CMT-3 o el clodrinato solos.
Claims (18)
1. Composición para tratar y prevenir la
degradación del tejido conjuntivo y la membrana basal en un sistema
biológico propenso a una actividad proteinasa en exceso, que
comprende una tetraciclina y un compuesto de bisfosfonato.
2. Composición según la reivindicación 1, en la
que la degradación está relacionada con actividades proteinasas en
exceso.
3. Composición según la reivindicación 1, en la
que el sistema biológico es un mamífero.
4. Composición según la reivindicación 1, que
comprende además una preparación o vehículo farmacéuticos.
5. Composición según la reivindicación 1, en la
que la proteinasa es una metaloproteinasa de matriz (MMP), una
enzima similar a MMP y/o una serín proteinasa.
6. Composición según la reivindicación 1, en la
que la degradación está asociada con la invasión tisular y la
metástasis de células malignas, resorción ósea, destrucción de
cartílago o destrucción de tejidos blandos.
7. Composición según la reivindicación 1, en la
que la tetraciclina y el bisfosfonato están en cantidades sinérgicas
para inhibir la producción y actividad de las proteinasas de
mamífero.
8. Composición según la reivindicación 1, que
comprende una combinación de una tetraciclina y un compuesto de
bisfosfonato que inhibe de manera sinérgica la producción o
actividad de las proteinasas de mamífero.
9. Composición según la reivindicación 1, en la
que la tetraciclina es CMT-1, CMT-3,
CMT-8, doxiciclina, minociclina, limeciclina o
combinaciones de las mismas, y el compuesto de bisfosfonato es
alendronato, clodronato (clodrinato), etidronato, medronato,
nedrinato, pamidronato, tiludronato, zolendronato o combinaciones de
los mismos.
10. Uso de una tetraciclina en combinación con un
bisfosfonato, para la fabricación de un medicamento para inhibir la
producción o actividad de las proteinasas en un sistema
biológico.
11. Uso según la reivindicación 10, en el que el
sistema biológico es un mamífero.
12. Uso según la reivindicación 10, en el que la
composición comprende además una preparación o vehículo
farmacéuticos.
13. Uso según la reivindicación 10, en el que la
producción y actividad de proteinasa en exceso están asociadas con
la degradación de tejido conjuntivo y/o la membrana basal.
14. Uso según la reivindicación 10, en el que la
proteinasa es una metaloproteinasa de matriz (MMP), una enzima
similar a MMP y/o una serín proteinasa.
15. Uso según la reivindicación 13, en el que la
degradación tisular está asociada con la invasión tisular y la
metástasis de células malignas, pérdida ósea por osteoporosis,
resorción ósea, destrucción de cartílago, angiogénesis o destrucción
de tejidos blandos.
16. Uso según la reivindicación 10, en el que la
tetraciclina que no es antimicrobiana y el bisfosfonato están en
cantidades sinérgicas para inhibir la producción y/o actividad de la
proteinasa en exceso.
17. Uso según la reivindicación 10, en el que la
tetraciclina es CMT-1, CMT-3,
CMT-8, doxiciclina, minociclina, limeciclina o
combinaciones de las mismas, y el bisfosfonato es alendronato,
clodronato (clodrinato), etidronato, pamidronato, medronato,
nedrinato, tiludronato, zolendronato o combinaciones de los
mismos.
18. Uso según la reivindicación 10, que utiliza
una combinación de una tetraciclina y un compuesto de bisfosfonato
que inhibe de manera sinérgica la producción o actividad de
proteinasas de mamífero.
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