JP2002525294A - ビスホスホネート及びテトラサイクリンの組合せ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物系における過剰プロテイナーゼ活性に関連する組織破壊状態は、相乗的プロテイナーゼ阻害量のテトラサイクリン及びビスホスホネートを組み合わせた組成物を、その系に投薬することによって、治療及び予防される。このような組成物の有効性は、標準的なテスト、例えば歯の移動度を測定することによって示すことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、国立歯科研究所（ＮＩＨ）によって授与されたＲ３７ＤＥ０３９８
７の下、政府援助でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

【０００２】 本発明は、結合性組織の分解、基底膜の分解、そしてこのタイプの組織分解に
感受性の患者における他の要因を阻害、減少、下方制御及び／又は防止するのに
相乗的に作用するテトラサイクリン及びビスホスホネートの組合せに関する。

【０００３】 発明の背景 タンパク質分解活性は、炎症及び／又は免疫反応の合併症として、例えばガン
細胞侵入と転移のような他の病気の過程として、結合組織及び基底膜への損傷の
原因となる。炎症反応は、肺や、骨、心臓、関節、皮膚、歯周組織等といった、
異なる器官及び組織を含む多くの急性及び慢性過程における病理学的変化の一因
となる。

【０００４】 これらの応答又は病気の進行に関与するタンパク質分解酵素（プロテイナーゼ
）は、基質メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ様プロテイナーゼ及び関連
プロテイナーゼ、セリンプロテイナーゼ並びに他のプロテイナーゼを含む。ＭＭ
Ｐは、基質タンパク質の加水分解切断に対して亜鉛及びカルシウム依存性であり
、種々の宿主細胞（例えば、多形核好中球（ＰＭＮ）、マクロファージ、骨細胞
、上皮及び線維芽細胞）によって、分泌又は放出される。メンブレンタイプＭＭ
Ｐ（ＭＴ−ＭＭＰ）と呼ばれる一定の他の遺伝学的に性質が異なるＭＭＰは、細
胞膜結合性であり、他のものは、細胞外基質（ＥＣＭ）中に分泌される。セリン
プロテイナーゼによって、アミノ酸セリンは、基質タンパク質の加水分解切断の
ための求核試薬として作用する。セリンプロテイナーゼは、例えば、誘発された
白血球によって、更に具体的には、即ちＰＭＮのアズール親和性顆粒によって及
び悪性腫瘍細胞を含む他の細胞によって放出される。

【０００５】 いくつかの研究では、例えばガン転移、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、歯
周病、骨粗鬆症、骨肉腫、骨髄炎、気管支拡張症、慢性肺閉塞病、皮膚病及び眼
病といった様々な病気において、身体の内因性抗プロテイナーゼシールドを超え
て、ＭＭＰの発現及び活性が病理学的に上昇することが明らかにされた。タンパ
ク質分解酵素、特にＭＭＰは、これらの病気と関連した組織破壊損傷の一因とな
ると考えられている。

【０００６】 いくつかのメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びそれらの病気との関連性は、
Ｍ．Ｅ．Ｒｙａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｒｈｅｕｍ．，１９９６，８：２３８−
２４７によって論じられている。２０種より多いＭＭＰが確認され、その数は増
えている。これらのＭＭＰには、間質性コラゲナーゼＭＭＰ−１（線維芽細胞タ
イプ）、ＭＭＰ−８（多形核白血球−ＰＭＮＬタイプ又はコラゲナーゼ−２）、
ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ−３）；ゼラチナーゼＭＭＰ−２（７２−ｋＤゼラ
チナーゼＡ）及びＭＭＰ−９（９２−ｋＤゼラチナーゼＢ）；ストロメライシン
ＭＭＰ−３（ストロメライシン−１）、ＭＭＰ−１０（ストロメライシン−２）
、及びＭＭＰ−７（マトリライシン又は推定上のメタロプロテイナーゼ（ＰＵＭ
Ｐ）−１）；メンブレンタイプ（ＭＴ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１４（ＭＴ₁−ＭＭ
Ｐ）、ＭＭＰ−１５（ＭＴ₂−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１６（ＭＴ₃−ＭＭＰ）を含む
。；他に、例えば、ＭＭＰ−１１（ストロメライシン−３）、ＭＭＰ−１２（マ
クロファージメタロエラスターゼ）及びＭＭＰ−２０がある。エナメライシン（
ＭＭＰ−２０）は、Ｌｌａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９７，３６：１５１０
１−１５１０８によって述べられており、またヒトの舌の扁平上皮ガン細胞のよ
うなガンの進行及び侵入にエナメライシンの潜在的な寄与を表すヒトガン細胞に
よって発現され得る（Ｓａｌｏら、Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．１９９８，７７：８
２９、Ａｂｓｔｒ．Ｎｏ．１９７８）。関連プロテイナーゼには、ＴＡＣＥ及び
ＡＤＡＭフェルチリン又はメルトリン（メタロプロテイナーゼ／ディスインテグ
リン）が含まれる。

【０００７】 ＭＭＰ、ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ等のような、ＭＭＰ様プロテイナーゼ及び関連プ
ロテイナーゼは、例えば、組織再構築（Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９５、7：７２８−７３５；
ＪＦ Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊｒ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９１，５：２１４５−
２１５４）、サイトカイン作用（Ｓ．Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１９９７，７２：１５５−１６１）、細胞−細胞融合（ＲＨ ｖａ
ｎ Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｅｎ，Ｇｅｎｅ １９９８、２０６：２７３−２８２；
Ｈｕｏｖｉｌａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９６、８：
６９２−６９９；Ｙａｇａｍｉ−Ｈｉｒｏｍａｓａら、Ｎａｔｕｒｅ １９９５
、３７７：６６２−６５６）、血管形成、成長因子作用、インテグリン、及び他
の接着因子とそれらの受容体プロセシングのような分子現象の処理及び改良に必
要とされる。Ａ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔ
ａ １９９４、１２０７：１３４−１３７も参照されたい。ＡＤＡＭ酵素は、デ
ィスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインを持つ膜タンパク質である
（Ｗｏｌｓｂｅｒｇら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９５，１６９：３７８−３８３
）。ＴＡＣＥは、酵素転換する腫瘍壊死因子である。

【０００８】 ＭＭＰ様プロテイナーゼ及び関連プロテイナーゼは、典型的なＭＭＰと区別さ
れるメタロプロテイナーゼであり、Ｓ．Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１９９７，７２：１５５−１６１によって述べられている、プロ
ＴＮＦα（腫瘍壊死因子）の細胞プロセシングやサイトカイン受容体の細胞脱粒
、接着分子等に必要とされ得る。また、ＭＭＰと、例えばＡＤＡＭ、ＴＡＣＥ等
の、ＭＭＰ様酵素及び関連酵素は、ＴＮＦα（Ｗａｔａｎａｂｅら、ＥＵＲ．Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，２５３：５７６−５８２）の放出を媒介し、細菌
性−病原性因子によって誘発される単球によるＴＮＦαの膜結合プロセシングに
必要とされる。この現象は、膜結合メタロプロテイナーゼによって媒介される。
Ｓｈａｐｉｒａら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄ．Ｒｅｓ．１９９７，３２：１８３−１８
５。

【０００９】 プロテイナーゼと多くの病気の進行との関連性に対する、大量の証拠がある。
微生物プロテイナーゼは、宿主プロテイナーゼと協調して、歯周組織に見られる
組織破壊の助長に作用しうる（Ｓｏｒｓａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９
９２，６０：４４９１−４４９５）。最近の研究では、ガンの侵入と転移（前立
腺ガン）のダニングラットモデルにおいて、結合組織の崩壊及び組織侵入に役割
を果たしていることが指摘されている（Ｌｏｗｅ ａｎｄ Ｉｓａａｃｓ，Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８４、４４：７４４−５２）。また、腫瘍侵入及び転移
を媒介するプロテイナーゼカスケードの開始に必要とされるのは、トリプシン活
性及びキモトリプシン様活性である（Ｓｏｒｓａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
１９９７，２７２：２１０６７−２１０７４）。セリンプロテイナーゼは、卵巣
ガンや胆道肉腫のようなヒトのガンで発現される（Ｓｏｒｓａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２：２１０６７−２１０７４）。

【００１０】 ＭＭＰの役割は、非常に多くの病状、例えば腫瘍侵入及び転移（Ｓｔｅｔｌｅ
ｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９３
、９：５４１−７３；Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ １９８７、９０７：１９１−２１７）、骨及び軟骨の崩壊（Ｇｒ
ｅｅｎｗａｌｄら、Ｂｏｎｅ １９９８、２２：３３−３８；Ｒｙａｎら、Ｃｕ
ｒｒ．Ｏｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９６，８；２３８−２４７）でよく立証
されている。ＭＭＰ−２０は、口の扁平上皮細胞のガン細胞によって発現される
（Ｓａｌｏら、Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．１９９８、７７：８２９，Ａｂｓｔｒ．
Ｎｏ．１９７８）。Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．
１９９７，８ｉ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ａｂｓｔｒａｃｔ １６０３）は、基
質破壊でのメタロプロテイナーゼの結合を、インシュリンを生産する膵臓島細胞
を破壊するリンパ球の侵入を促進する原因であると述べている。サイトカイン（
ＴＮＦα）及びＭＭＰは、多発性硬化症の病原にも関係している（Ｌｉｅｄｔｋ
ｅら、Ａｎｎ．Nｅｕｒｏｌ．１９９８，４４：３５−４６；Ｃｈａｎｄｌｅｒ
ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７，７２：１５５−７１）。ＭＴ₁
−ＭＭＰは、乳がん細胞の成長及び拡散に作用することが見出された。

【００１１】 細胞外タンパク質の分解／破壊が顕著な役割を果たす、多くの他の疾患がある
。このような病気の例は、骨粗鬆症、関節炎、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ
）、火傷、褥傷や静脈瘤潰瘍といった創傷、骨折、外傷、胃潰瘍、ざ瘡や乾癬と
いった皮膚病、苔癬状の病変、表皮溶解水泡（ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ Ｂ
ｕｌｌｏｓａ）、アフタ（反応性口潰瘍）、歯周病のような歯の病気、ペリイン
プランティティス、顎のシスト及び他の周囲のシスト、歯根管治療や歯内治療学
上の治療のターゲットである歯の状態、関連した病気、外部及び内因性の歯根再
吸収、う蝕等を含む。

【００１２】 セリンプロテイナーゼは、ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）及びカテプシン
Ｇを含み、別のセリンプロテイナーゼは、結合組織の崩壊に必須なカスケード経
路に必要とされ、プラスミン、プラスミノーゲン活性体、腫瘍結合トリプシン等
を含むが、これらに限定されない。

【００１３】 ＭＭＰ及びセリンプロテイナーゼは、組み合わさって、細胞外基質及び基底膜の
大部分の分子の破壊を引き起こすように働くことができる。組織崩壊における、
ＭＭＰ及びセリンプロテイナーゼ間の主要な相互作用の例として、１）カテプシ
ンＧはＭＭＰ−８を活性化できる；２）セリンプロテイナーゼヒト白血球エラス
ターゼ（ＨＬＥ）はＴＭＰ、即ち基質メタロプロテイナーゼの主要な内因性組織
阻害剤を不活性化できる、３）ＭＭＰ−８及びＭＭＰ−９はα₁−プロテイナー
ゼ阻害剤（α₁−ＰＩ）、即ちヒト白血球エラスターゼの主要な内因性阻害剤を
不活性化できる（Ｓ．Ｋ．Ｍａｌｌｙａら、Ａｎｎｕａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４、７３２：
３０３−３１４）及び４）腫瘍結合トリプシン−２は潜在性プロＭＭＰを有効に
活性化できる（Ｓｏｒｓａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２：２
１０６７−２１０７４）。

【００１４】 テトラサイクリンは、化学的に修飾されたテトラサイクリンを含み、ＭＭＰ分
子構造中の金属イオン（カルシウム又は亜鉛）に結合する部分において、インビ
トロ及びインビボでのＭＭＰ媒介の組織崩壊を阻害することができる。例えば、
Ｒ．Ｆ．Ｚｅｒｎｉｃｋｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇ
ｙ，１９９７、２４：１３２４−３１；Ｔ．Ｓｏｒｓａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９８，２５：９７５−８２；Ｇｏｌｕｂら
、Ａｄｖ．Ｄｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９８、印刷中）を参照された
い。

【００１５】 一定のテトラサイクリンは、テトラサイクリン抗菌活性と無関係に基質メタロ
プロテイナーゼを阻害することが明らかにされた。Ｇｏｌｕｂらの米国特許第５
４５９１３５号明細書、第５３２１０１７号明細書、第５３０８８３９号明細書
及び第５２５８３７１号明細書、ＭｃＮａｍａｒａらの第４９３５４１２号明細
書及び第４７０４３８３号明細書、Ｇｏｌｕｂらの第４６６６８９７号明細書及
びＲＥ３４６５６号明細書には、組織−破壊的状態、慢性的炎症、骨破壊、ガン
、及びコラゲナーゼや、ゼラチナーゼ及びＭＭＰ−１２（マクロファージメタロ
エラスターゼ）といった基質メタロプロテイナーゼの過剰活性と関連している他
の状態を治療する非抗菌性テトラサイクリンの使用が述べられている。

【００１６】 Ｓｉｍｏｎらの米国特許第５７７３４３０号明細書には、生物系において、過
剰な白血球エラスターゼセリンプロテイナーゼ活性を阻害する疎水性のテトラサ
イクリンを使用することが述べられている。

【００１７】 テトラサイクリンは、抗生物質として早くから目覚ましい成功によって特に周
知の一群の化合物である。テトラサイクリンやスポロサイクリン等のような化合
物は広スペクトルの抗生物質であり、広範囲の細菌や他の微生物に対して有用性
を持っている。親化合物、即ち、テトラサイクリンは、次の一般的構造を有して
いる。

【００１８】

【化１】

【００１９】 多重環核の番号規則は、以下の通りである。

【００２０】

【化２】

【００２１】 テトラサイクリンは、５−ＯＨ（オキシテトラサイクリン、例えばテラマイシ
ン^TM）及び７−Ｃｌ（クロロテトラサイクリン、例えばオーレオマイシン^TM）誘
導体と同様、自然界に存在し、全て周知の抗生物質である。半合成テトラサイク
リンには、例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン及びメタサイクリンが含
まれる。テトラサイクリン抗生物質の使用は、感染の治療に対して一般的に有効
であるが、望ましくない副作用を誘引することがある。例えば、抗生物質のテト
ラサイクリンの長期間投与は、腸内細菌叢のような、健康によい細菌叢を減少さ
せるか排除することがあり、抗生物質に耐性のある微生物の産生又は酵母と真菌
の過成長を導くことがある。これらの重大な不利益のために、これらの化合物の
慢性的な投与を要求する治療療法は一般に排除される。

【００２２】 天然のテトラサイクリンを、それらの抗生物質の性質を失うことなく修飾しても
よいが、その構造の一定元素は、同じように働くように保持されるべきである。
一群の化合物は、抗生物質のテトラサイクリンに構造的に関連しているが、化学
的修飾によって実質的又は完全にそれらの抗生物質活性が失われていることが明
らかにされている。基本的なテトラサイクリンの構造になされてもよいし、なさ
れなくてもよい修飾については、Ｍｉｔｓｃｈｅｒ，Ｌ．Ａ．Ｔｈｅ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７８），Ｃｈ．６に
よって検討された。Ｍｉｔｓｃｈｅｒによれば、テトラサイクリン環系の５−９
位での修飾は、抗生物質の性質の完全な喪失を起こすことなくできる。しかしな
がら、環系の基本的構造を変えると、又は１−４位若しくは１０−１２位での置
換基の置換すると、合成テトラサイクリンは一般的に抗菌活性が実質的に減少又
は基本的に失われる。

【００２３】 化学的に修飾されたテトラサイクリン（ＣＭＴ）には、例えば、４−デ（ジメチ
ルアミノ）テトラサイクリン（ＣＭＴ−１）や、テトラサイクリノニトリル（Ｃ
ＭＴ−２）、６−デメチル−６−デオキシ−４−デ（ジメチルアミノ）テトラサ
イクリン（ＣＭＴ−３）、７−クロロ−４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイク
リン（ＣＭＴ−４）、テトラサイクリンピラゾール（ＣＭＴ−５）、４−ヒドロ
キシ−４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（ＣＭＴ−６）、４−デ（ジ
メチルアミノ）−１２α−デオキシテトラサイクリン（ＣＭＴ−７）、６−デオ
キシ−５α−ヒドロキシ−４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（ＣＭＴ
−８）、４−デ（ジメチルアミノ）−１２α−デオキシアンヒドロテトラサイク
リン（ＣＭＴ−９）、４−デ（ジメチルアミノ）ミノサイクリン（ＣＭＴ−１０
）が含まれる。

【００２４】 更にまた、抗菌活性を弱めるために修飾したテトラサイクリンの例には、オキシ
テトラサイクリンの４−エピマー及びクロロテトラサイクリン（エピ−オキシテ
トラサイクリン及びエピ−クロロテトラサイクリン）が含まれる。

【００２５】 ビスホスホネートには、骨再吸収抑制剤として使われている治療製剤の一群を
含む。Ｔｅｒｏｎｅｎらの米国特許第５６５２２２７号明細書には、過剰なメタ
ロプロテイナーゼ活性の結果として生ずる結合組織基質タンパク質成分の分解を
弱めるために、ビスホスホネートを使用することが述べられている。米国特許第
５６８８１２０号明細書には、歯肉組織につながれたリザーバーにビスホスホネ
ートを投与すること及びそれを通じて電流を通すことによる、歯槽骨へのビスホ
スホネートのイオン泳動的送達を用いて、歯槽骨の再吸収を阻害することが述べ
られている。

【００２６】 過剰な内因性プロテイナーゼ活性を弱め、阻害し、下方調節する目的及び組織
、基底膜及び他の要因の破壊を減少するために、テトラサイクリン及びビスホス
ホネートを組合せで一緒に用いる提案は今まで示唆されていない。

【００２７】 本発明の目的は、組織損傷及び破壊に関連プロテイナーゼに感受性の患者を治
療するための化合物の組合せを提供することにある。

【００２８】

【本発明の概要】

過剰なプロテイナーゼを阻害し、減少し、及び下方調節して、例えば、プロテ
イナーゼ活性過剰のために構造的及び機能的障害に感受性の生物系における、プ
ロテイナーゼに関連する結合組織及び基底膜の分解を治療し又は予防するための
組成物が提供される。この組成物には、テトラサイクリン及びビスホスホネート
を含む。この阻害には、プロテイナーゼの量と活性を減少すること及びプロテイ
ナーゼの内因性生産を下方調節することが含まれる。本発明の組成物は、ＭＭＰ
、セリンプロテイナーゼ、例えば酵素（ＴＡＣＥ）−腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα
）活性化依存に転化させる腫瘍壊死因子のような、ＭＭＰ様酵素及び関連酵素、
及びディスインテグリンとメタロプロテイナーゼドメイン（ＡＤＡＭ）とを有す
る膜タンパク質の下方調節、予防又は過剰活性の減少により、プロテイナーゼ不
均衡に関連した病気の治療又は予防ができる。

【００２９】 本発明によって治療される分解には、結合組織及び基底膜を含む硬組織及び柔組
織を含むことができる。この分解は、骨再吸収、軟骨破壊又は柔組織の破壊、及
び悪性細胞による組織侵入及び転移といったような状態と関連する。構造的及び
機能的障害は、例えば骨粗鬆症における、歯周崩壊による歯の損失及び過剰な骨
破壊による骨格の破砕を含むが、これらの例に限定されない。過剰なプロテイナ
ーゼは、プロテイナーゼの量と活性の減少及びプロテイナーゼ生産の下方調節に
よって阻害される。下方調節とは、遺伝子発現を遮断すること及びプロテイナー
ゼの分泌を遮断すること、例えば、酵素タンパク質の合成と放出を減少させるこ
とを意味する。この治療は、酵素合成における効果とは無関係に、プロテイナー
ゼの活性又は活性化を遮断することもできる。

【００３０】 本発明の組成物は、製薬又は化粧用の薬剤の形を採ることができ、従って、本発
明の組成物を、製薬又は化粧用の薬剤又は担体と一緒に含めることができる。

【００３１】 この組成物は、好ましくは、過剰プロテイナーゼ活性を阻害する相乗的な量でテ
トラサイクリン及びビスホスホネートの組合せを含み、その結果、前記組合せが
組織崩壊に必要なプロテイナーゼの阻害、減少及び下方調節の有効性に相乗作用
を示す。これは、この組合せが、テトラサイクリンのみ又はビスホスホネートの
みのいずれかよりもより有効であることを意味し、この組合せの有効性は、２つ
の効力を足すことによって予想される有効性よりも一般的に大きいことを意味す
る。

【００３２】 活性を阻害及び／又は減少する方法において、並びに過剰プロテイナーゼの下方
調節及び関連した結合組織の崩壊と、関連した基底膜の崩壊と、この組織崩壊に
感受性の生物系における機能的及び構造的障害を反映する他の要因の関連した崩
壊とを下方調節する方法において、テトラサイクリンとビスホスホネートの組合
せを含む組成物は、プロテイナーゼ阻害、減少及び/又は下方調節する量の内で
前記系に投与される。

【００３３】 ［発明の詳細な説明］ 本発明は、結合組織及び基底膜を分解するプロテイナーゼ、例えば、メタロプ
ロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ様酵素及び関連酵素、セリンプロテイナー
ゼ及び他のプロテイナーゼ、細菌プロテイナーゼ、ウイルスプロテイナーゼ及び
真菌プロテイナーゼの過剰な生産及び活性に関連した組織破壊的な状態を阻害す
るための組成物及び方法を含む。治療の必要がある患者に対する本発明の組成物
の適用としては、結合組織、基底膜及び他の病気進行の崩壊を阻害し、又は予防
する。

【００３４】 本発明を用いて治療及び／又は予防できる組織破壊的な状態は、メタロプロテ
イナーゼ、メタロプロテイナーゼ様プロテイナーゼ及び関連プロテイナーゼ、セ
リンプロテイナーゼ又はこれらの酵素の組合せ、細菌プロテイナーゼ、ウイルス
プロテイナーゼ及び真菌プロテイナーゼの過剰なプロテイナーゼ活性の結果とし
て生じる。これらの状態は、例えば、悪性細胞による組織侵入、骨再吸収、軟骨
破壊、柔組織の破壊（例えば、皮膚や腱、靭帯、血管壁等）、柔組織と硬組織の
両方への腫瘍の拡散及びガン転移、及び気管支拡張症、慢性の破壊的で閉塞的な
肺病、喘息及び他の肺病を含む。歯周病、骨関節炎、リウマチ様関節炎、反応性
及び他の関節炎、ガン侵入及び転移、骨髄炎、骨粗鬆症、骨肉腫及び他の骨の病
気といった哺乳動物の病気を、好都合に予防及び／又は治療できる。理論によっ
て拘束されるものではないが、この治療は、ＣＭＴ及びビスホスホネートの両方
が骨−探索性の薬理学的薬剤であるので、少なくとも部分的に有効なのであろう
。またこの組合せは、ペット（猫や犬等）及び馬や他の哺乳動物のような大型哺
乳動物の組織−破壊的病気の治療にも使える。

【００３５】 本発明に従って治療された特定の組織及び基底膜の破壊的状態には、破骨細胞
−媒介骨再吸収のような骨の病気、及びガン転移とリンパ球侵入のような基底膜
を通る細胞性移動を伴う疾患、例えばタイプ−１糖尿病の開始に関連したランゲ
ルハンス島における疾患が含まれるが、これらの例に限定されない。

【００３６】 本発明の組成物は、腫瘍組織、転移層及び／又はそれらに送達するための脈管
構造等の部位を標的とする分子を含む製薬製剤と関連させることができる。これ
らの分子の例として、ホーミングペプチドがある（Ｗ．Ａｒａｐら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ １９９８、２７９：３７７−３８０）。

【００３７】 治療の必要性は、様々な臨床的、放射線の及び生化学の病気重症度のパラメー
タから、又はこれらのパラメータに基づいて評価することができる。関節炎病に
対するひとつの例として、関節の痛みと弱さの臨床的兆候、骨と軟骨破壊のＸ線
の形跡、及び骨と軟骨コラーゲン崩壊の増加によって示される血漿中及び尿中の
コラーゲンクロスリンク（ピリジノリン及びデオキシピリジノリン）フラグメン
トの上昇レベルの検出が含まれる。歯周炎及びペリインプラティティスの診断に
は、例えば、臨床的形跡（例えば、増加した歯周ポケットの深さ；歯周接着及び
ペリインプラント接着の損失）、微生物学、生化学、免疫学及び／又は分子生物
学上の歯周組織崩壊の評価が含まれる。

【００３８】 結合組織は、身体の全器官において、他組織を結合し維持する細胞外基質を構
成する。結合組織は、コラーゲン（コイルドプロテインフィブリルで作られてい
る、皮膚の白色繊維や、腱、骨、軟骨等）の、弾力性（アルブミノイド硬タンパ
ク質の黄色繊維）の、粘液性の、網状（網様）の、骨に似た（骨）及び軟骨性（
軟骨の中に埋まっている軟骨細胞、及びガラス質（透明）の、弾力性のもの又は
繊維軟骨に含まれる軟骨細胞）のものを含み、時々、血管／血液成分（内皮細胞
、例えば炎症部位に増殖する細胞）を含む。更に、結合組織は、遊離した（小隙
の）ものと密集した（より繊維質の）ものに分類できる。

【００３９】 基底膜は、ぶどう状腺や特殊な分泌部分を含む腺の膜のように、上皮組織のす
ぐ下にある修飾結合組織の膜である。基底膜は、タイプＩＶコラーゲン、ヘパラ
ン硫酸プロテオグリカン及びラミニンを含む複雑な構造を有し、下にある結合組
織に上皮を接着させる。細胞外基質のバリアを打ち破る基底膜破壊後は、ゼラチ
ナーゼによるラミニン−５の特異的切断（Ｇｉａｎｎｅｌｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ １９９７，２７７：２２５−２２８）が、炎症性細胞及び悪性細胞の移動に
必要とされる。また本発明のテトラサイクリン及びビスホスホネートの組合せは
、これを阻害する。

【００４０】 一態様において、本発明の組成物は、ＭＭＰ依存状態の治療に使用される。Ｍ
ＭＰ依存状態には、例えば、創傷、火傷、骨折、傷害、外傷、潰瘍、ガン及び結
合組織及び骨における転移の進行が含まれ、他の状態には、歯周病、歯肉炎、ペ
リインプランティティス、顎嚢腫、内部と外部の歯根再吸収、う蝕、ＡＩＤＳ、
角膜潰瘍、胃潰瘍、アフタ潰瘍、ざ瘡、乾癬、臀部人工関節の弛緩、骨髄炎、骨
粗鬆症、組織再生、血管形成、関節炎（リウマチ様、反応性及び骨の関節炎）、
肺病（気管支拡張症及び慢性の閉塞性肺病と他の肺病）が含まれる。

【００４１】 ビスホスホネートと組み合わされるテトラサイクリンが、生物系における内因
性プロテイナーゼの生産及び／又は活性を阻害することが見出されている。

【００４２】 好ましいテトラサイクリンは、４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（
ＣＭＴ−１）、６−デメチル−６−デオキシ−４−デ（ジメチルアミノ）テトラ
サイクリン（ＣＭＴ−３）、６−デオキシ−５−アルファ−ヒドロキシ−４−デ
（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（ＣＭＴ−８）、また、デオキシサイクリ
ン、ミノサイクリン、ライムサイクリン及びこれらテトラサイクリンの組合せで
ある。

【００４３】 ビスホスホネートは、無機ピロホスホン酸に関連した化合物であり、大量生産
により入手可能であるか、又は公知の方法に従って準備できる。ここで有用なビ
スホスホネートは、例えば、アレンドロネート（（４−アミノ−１−ヒドロキシ
ブチリデン）ビスホスホン酸）、クロドロネート（ジクロロメタンジホスホン酸
）、エチドロネート（（１−ヒドロキシエチリデン）ジスホスホン酸）及びパミ
ドロネート（（３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン）ビスホスホン酸）；
またリセドロネート（［−ヒドロキシ−２−（３−ピリジニル）エチリデン］ビ
スホスホン酸）、チルドロネート、即ち、チルドロン酸（［（４−クロロフェニ
ル）チオ］メチレン）ビスホスホン酸）、及びゾレンドロネートを含むが、これ
らの例に限定されない。

【００４４】 他には、［１−ヒドロキシ−３−（メチルペンチルアミノ）プロピリデン］ビ
ス−ホスホネート（ＢＭ２１．０９５５）、［（シクロヘプチルアミノ）メチレ
ン］ビスホスホネート（ＹＭ１７５）、１−ヒドロキシ−３−（１−ピロリジニ
ル）−プロピリデン］ビスホスホネート（ＥＢ−１０５３）、［１−ヒドロキシ
−２−（１Ｈ−イミドゾル−１−イル）エチリデン］ビスホスホネート（ＣＧＰ
４２′４４６）及び（１−ヒドロキシ−２−イミダゾ−［１，２−ａ］ピリジン
−３−イル−エチリデン）ビスホスホネート（ＹＭ５２９）が含まれる。

【００４５】 ビスホスホネートは、Ｈ．Ｆｌｅｉｓｃｈ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１９９
８，１９（１）：８０−１００に包括的に述べられている。Ｈ．Ｆｌｅｉｓｃｈ
、Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ｉｎ Ｂｏｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｆｒｏ
ｍ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｐａｔｅｉｅｎｔ，１９９
７，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｐａｒｔｈｅｎｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎも参照されたい。

【００４６】 好ましいビスホスホネートは、アレンドロネート、クロドロネート（クロドリ
ネート）、エチドロネート、パミドロネート、メドロネート、ネドリネート、チ
ルドロネート、ゾレンドロネート及びこれらの組合せである。

【００４７】 特定の症例に用いるためのテトラサイクリン及びビスホスホネートを含む本発
明の組成物のそれぞれの化合物量は、調剤する特定の組成や、適用方法、患者、
組成物が投与される部位、治療及び予防中の衰弱状態及び投与の方法によって変
わる。投与量は、例えば、製剤と既知の薬剤との活性差の通常の比較によって、
例えば、適切な通常の薬理学プロトコルを使って、通常の考慮に基づいて決定さ
れる。ヒトに用いる代表的な投与量は、ビスホスホネートのタイプ及び投薬経路
によるが、２０−２０００ｍｇ／日のビスホスホネートとの組合せでは、１０−
１０００ｍｇ／日のテトラサイクリンを含む。本発明で有用なテトラサイクリン
及びビスホスホネートの量は、その組合せが、過剰プロテイナーゼ感受性の系又
は患者における、活性及び/又は分泌並びに過剰プロテイナーゼの合成の阻害を
もたらす量である。これらの量は、それぞれの化合物が単独で使用されるときの
最適量又は必要量よりも１０倍ほど少なく有利であり、それによって、より高い
投与量によって引き起こされる副作用の可能性を有意に減少でき、もし個々に服
用されるならば、例えば、個々に化合物を用いるときには、１０−３０μＭが必
要であり、一緒に用いると２．０−１０．５μＭが必要である。

【００４８】 経口投与に対し、本発明の組成物は、錠剤や、カプセル、エリキシル、懸濁液
、液剤又はそのようなものに調剤してもよい。非経口投与に対し、組成物は、例
えば、筋内注射用に、液剤や懸濁液といったような注射可能な形に調剤してもよ
い。局所用の使用に対し、組成物を直接適用してもよいし、担体又は基体といっ
た、例えばポリマーやクリーム、軟膏、エアゾール、膜等に調剤した送達システ
ムに組み込んでもよい。

【００４９】 様々なテトラサイクリンとビスホスホネートとの組合せの活性について、イン
ビボで研究された。使用される動物モデルは、以前に公表されており（Ｒａｍａ
ｍｕｒｔｈｙら、Ａｒｃｈｓ．Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ．，１９８５，１３０：６７
９−６８３）、７日間にわたって２日おきにラットの歯肉の中への、エンドトキ
シン（即ち、細菌性リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、グラム陰性菌の外膜の主
要構成成分、及び歯周病と他の感染症中とでの炎症及び骨破壊の主要メディエー
ター）の直接の注射を含む。この手順は、すべて７日の実験プロトコルにおいて
、歯周組織に顕著な炎症を生じさせ、発症した歯の周りで歯槽骨の再吸収と骨の
損失を重症に導く歯肉のエラスターゼのような、組織破壊基質メタロプロテイナ
ーゼ（ＭＭＰ）及びセリンプロテイナーゼのレベルの上昇を誘発する。簡潔に述
べれば、この実験的に引き起こされた炎症の病気を持つ成体オスラットを、治療
をしないでおくか、又は（Ｉ）ＣＭＴ単独の；（ＩＩ）ビスホスホネート単独の
、又は（ＩＩＩ）（Ｉ）と（ＩＩ）の組合せの、最適以下の投与量で治療した。
実験プロトコルの終わりには、歯の移動度と歯槽骨損失、及び様々な組織破壊的
ＭＭＰコラゲナーゼとゼラチナーゼのレベル及び歯肉のセリン酵素のレベルを測
定した。ＣＭＴ単独又はビスホスホネート単独の最適以下の投与量では、柔組織
及び硬組織破壊のこれらのパラメータにおいて、ほとんど又は全く減少を生じな
かった。対照的に、これら薬剤の２つのタイプの組合せでは、これらの破壊的経
路の病理学的レベルが、相乗的に減少し、しばしば、エンドトキシンを注射した
組織におけるこれらのレベルが、生理食塩水注射（コントロール）された組織に
おいて見られるコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びエラスターゼの通常レベルに減
少した。

【００５０】 また、この組合せを、養鶏の破骨細胞（骨再吸収細胞）でインビトロテストを
行ったところ、破骨細胞ゼラチナーゼ活性の阻害が示された。

【００５１】 また、この組合せについて、ヒト繊維肉腫細胞を用いて、ヒト組換え型ＭＴ₁
−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）と純粋な野生型ＭＭＰ−８とを対照してインビトロテ
ストを行った。簡潔に述べれば、トランスウエル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）−アッ
セイシステムを用いて、ＨＴ−１０８０繊維肉腫のインビトロ移動におけるＣＭ
Ｔ（−３と−８）及びクロドロネート（クロドリネート）の最適以下のＭＭＰ−
阻害濃度の効果をテストした。様々な腫瘍増進誘導の結果、株細胞ＨＴ−１０８
０のヒト繊維肉腫細胞が、細胞外ＭＭＰ（ＭＭＰ−２、−９）及び細胞表面結合
ＭＴ−ＭＭＰの両方を発現及び活性化した。これらのＭＭＰは、血管形成誘導の
過程と同様、悪性侵襲性及び転移性の過程における活性化カスケードに関係する
。Ｈ．Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
．１９９５，７：７２８−７３５；Ｄ．Ｈａｎａｈａｎら、Ｃｅｌｌ １９９６
、８６：３５３−３６４。

【００５２】 また、単独及び組合せの、ＣＭＴ及びビスホスホネートの最適以下の阻害投与
量を、β−カゼイン−分解アッセイを用いて純粋ヒト組換え型ＭＴ₁−ＭＭＰ及
びＭＭＰ−９の活性でテストした。このアッセイはＴｅｒｏｎｅｎら、Ｊ．Ｄｅ
ｎｔ Ｒｅｓ．１９９７、７６：１５２９−１５３７；Ｔ．Ｓｏｒｓａら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７、２７２：２１０６７−２１０７４に記載されて
いる。ＣＭＴのみ又はビスホスホネートのみのいずれかの最適以下の投薬量では
、ＨＴ−１０８０移動の減少をほとんど又は全く引き起こさず、ＭＴ₁−ＭＭＰ
の活性をわずかに阻害しただけであった。しかしながら、ＣＭＴ及びビスホスホ
ネートの組合せでは、ＨＴ１０８０繊維肉腫のインビトロ移動が相乗的に減少し
、純粋ヒト組換え型ＭＴ−１−ＭＭＰの活性が阻害された。

【００５３】 インビボ及びインビトロでの実験では、ビスホスホネートを加えた化学的修飾
非抗菌テトラサイクリンの組合せが、結合組織（骨を含む）及び基底膜の崩壊を
相乗的に阻害し、悪性細胞の転移を相乗的に阻害し、純粋ヒト細胞に結合してい
るＭＴ₁−ＭＭＰや、細胞外コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ（細胞外ＭＭＰ）、エ
ラスターゼ（セリンプロテイナーゼ）を相乗的に阻害することを立証する。

【００５４】 インビボ実施例において、３０匹のオスのＳＤラットを以下の５つのグループ
に分類した： グループ１：正常。生理食塩水注射＋プラセボ治療（ＣＭＣ） グループ２：ＬＰＳ。ＬＰＳ注射＋プラセボ（ＣＭＣ） グループ３：ＣＭＴ−８。ＬＰＳ注射＋ＣＭＴ−８（１ｍｇ／日） グループ４：クロドロネート。ＬＰＳ注射＋クロドロネート（１ｍｇ／週） グループ５：組合せ。ＬＰＳ＋ＣＭＴ−８（１ｍｇ／日）＋クロドロネート（
１ｍｇ／週）

【００５５】 治療では、全７日間中、１日に１回の経口胃管栄養（ＣＭＴ−８）によって投
薬するか、又は１回の皮下注射（クロドリネート）によって投薬を行った。

【００５６】 ＬＰＳ（リポポリサッカライド）誘導歯周炎ラットモデル：治療２４時間前、
ラットに、第１上臼歯と第２上臼歯の間の、上部前方の歯肉及び口蓋の乳頭状突
起の中へ、１０μＬのＬＰＳ（１ｍｇ／ｍｌ）又は生理食塩液を、注射部位毎に
総量１０μｇのＬＰＳを、注射した。ＬＰＳの注射は、３回の注射を完了するよ
う、一日おきに繰り返した。

【００５７】 ７日目に、すべてのラットに麻酔をかけ、心臓穿刺によって血液サンプルを集
め、ラットを犠牲にした。歯の移動度を確認し、歯肉組織を切り裂いて、その後
の酵素分析のために−８０℃で保存した。顎は、骨損失測定のために肉を削ぎと
った。

【００５８】

【実施例１】 第１の実験では、エンドトキシン誘導骨損失モデルにおいて、ＣＭＴ−８（化
学的修飾された、非抗菌テトラサイクリン）及びクロドロネート（ビスホスホネ
ート）の両方の最適以下の投与量を選択することを計画した。ラットのグループ
（ｎ＝５−６ラット／グループ）に麻酔をかけ、７日間にわたって１日おきに、
生理食塩水（コントロールグループ）又はＬＰＳエンドトキシンを、歯肉組織の
中へ直接注射した。最初の注射の２４時間後、ラットのグループに、次の６日間
の毎日、０、０．５ｍｇ、１ｍｇ、又は２ｍｇのいずれかのＣＭＴ−８を経口胃
管栄養法によって投薬した。この実験の最後に、ラットに麻酔をかけ、心臓内穿
刺によって血液を抜き取り、ラットを安楽死させ、歯肉組織を酵素分析用に切り
裂いた。加えて、歯の移動度を記録し、顎を削ぎ取った後、コンピューター補助
システムを用いて、歯の周りの歯槽骨損失を形態計測的に記録した。その結果は
後に論議する。

【００５９】

【実施例２】 第２の実験では、この薬剤の様々な投与量（０、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ
）を１回の皮下注射によって投薬した以外は、同様のプロトコルを、このモデル
におけるクロドロネートの最適以下の投与量を確認するのに使用した。

【００６０】 実施例１及び２の実験に基づいて、０．５ｍｇのＣＭＴ−８又はクロドロネー
トのどちらも、歯の移動度及び歯槽骨損失に有意な効果を生じなかったという結
果が示され、対照的に、２ｍｇの各薬剤は、細菌エンドトキシンによって誘導さ
れる、病理学上の歯の移動度及び骨の損失を、コントロールレベルまで本質的に
回復させた。従って、各薬剤は、全く又はほとんど有益な効果を提供しないので
、最適以下の投与量として各薬剤の１ｍｇを選択した。

【００６１】

【実施例３】 第３の実験では、３０匹の成体オスラットを、次の実験グループに分けた：生
理食塩水注射グループ；エンドトキシンを注射し、次いで薬剤を投薬しないグル
ープ；ＣＭＴ−８のみ（１ｍｇ／日）を投薬するグループ；クロドロネートのみ
（１ｍｇ／週）を投薬するグループ；又は同じ最適以下の投与量の両薬剤の組合
せ投薬するグループであった。この実験は７日目で終わった。前述のように、歯
肉組織を切り裂き、抽出し、部分的に精製した抽出物は、中性プロテイナーゼ（
エラスターゼ及び基質メタロプロテイナーゼ）活性について分析し、歯の移動度
及び歯槽骨損失の両方を評価した。

【００６２】 歯の移動度の結果を図１に示す。歯槽骨の結果を図２に示す。歯肉のコラゲナ
ーゼ活性に対する効果を図３に示す。歯肉のゼラチナーゼ活性に対する効果を図
４に示す。

【００６３】 図１において、歯の移動度は次の評価システムに基づく： ０＝移動なし １＝わずかに移動（前庭−口蓋） ２＝中程度の移動（前庭−口蓋） ３＝重症な移動（歯槽での垂直移動又は歯槽から外れる） ａ対ｂ、ｐ＜０．０５ ａ対ａ、（Ｎ．Ｓ．）（有意でない（Ｎｏｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）） ｂ対ｂ、（Ｎ．Ｓ．）

【００６４】 図１に示したように、生理食塩水注射のラット（コントロール；クループ２）
と比較して、未処置ＬＰＳ注射ラット（グループ１）では、歯の移動度（炎症の
重症度の反映及び歯槽骨損失を加えた歯周組織のコラーゲン損失）が非常に重症
だった。ＬＰＳ注射ラットを、最適以下の量のＣＭＴ−８単独（グループ３）又
は最適以下の量のクロドロネート単独（グループ４）で治療すると、歯の移動度
において、ごくわずかな（統計学上の有意差はない）減少（１８％）がみられ、
グループ３及び４における歯の移動度は、コントロールラット（グループ２）に
みられたレベルのなお２倍を超えていた。しかしながら、ＬＰＳ注射ラットを２
つの薬剤（最適以下のクロドロネート投与量を加えた最適以下のＣＭＴ−８投与
量）の組合せで治療すると、歯の移動度において相乗的な減少（８９．３％；ｐ
＜０．０５）が見られ、このパラメータは、生理食塩水注射（コントロール）グ
ループのラットにみられた歯の移動度よりも、更に７０％くらい低いようなもの
であった。

【００６５】 肉を削ぎ落としたラットの顎のコンピューター補助形態計測的分析に基づき、
そして図２に示したように、ＬＰＳ注射グループのラットは、それぞれの半上顎
における異なる１７部位すべてに、生理食塩水注射コントロールグループの同じ
１７部位に見られた骨損失よりも、有意でより顕著な歯槽骨損失を示した。例え
ば、＃７部位は、第１臼歯と第２臼歯間に隣接するように位置しており（これの
歯周病ラットモデルにおいて最も重症な骨損失が通常表れる部位）、歯肉中への
ＬＰＳ注射では、生理食塩水注射と比べると、１４０％まで歯槽骨損失が増加し
た。ＣＭＴ−８のみ又はクロドリネートのみのいずれかで治療したＬＰＳ注射ラ
ットは、あったとしても、わずかだけ歯槽骨損失が減少した。これとは非常に対
照的に、この組合せ治療は、細菌エンドトキシン（ＬＰＳ）によって引き起こさ
れた、歯槽骨損失を本質的に「正常化」し、その結果、骨損失レベルが生理食塩
水注射コントロールラットに見られた骨損失レベルと同じであった。

【００６６】 異なるラットのグループからの歯肉の部分的精製抽出物中のコラゲナーゼ活性
を、基質として［³Ｈ−メチル］コラーゲンを用いて評価し、無傷のα₁とα₂コ
ラーゲン成分及びコラーゲンのコラゲナーゼで生じた３／４分解物（α₁ ^Aとα₂ ^A ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、これらのコラーゲン構成部分及び断片をオート
ラジオグラフィーで視認化し、レーザー濃度計を用いたフルオログラムをスキャ
ンした後にそれらのレベルを計算した。図３に示したデータは、１．２ｍＭのア
ミノ酢酸フェニル水銀（ＡＰＭＡ）を添加したサンプル中の何らかのプロコラゲ
ナーゼ（潜在性）を活性化した後の、歯肉抽出サンプルの総コラゲナーゼ活性を
示す。図３に示したように、ＬＰＳを歯肉に注射すると、コラゲナーゼ活性が７
００％まで劇的に増加し、少なくとも一部分では、タイプＩコラーゲンの分解、
即ち骨基質を増加させる歯周組織のすべての主要成分の分解に対して、このＭＭ
Ｐが原因であることに矛盾がない。ＣＭＴ−８のみ又はクロドロネートのみ（Ｃ
ＬＯＤ）を用いたＬＰＳ注射ラットの治療では、わずかに２２−３１％までコラ
ゲナーゼ活性が減少した。対照的に、歯の移動度及び歯槽骨損失での効果のよう
に、組合せ治療（ＣＯＭＢＯ）では、コラゲナーゼが９１％まで相乗的に減少し
、生理食塩水注射コントロールグループの歯肉組織で見られたレベルに下がった
。

【００６７】 ゼラチナーゼ活性を、ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｏｌｌａｇｅｎａ
ｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｒａｔ Ｔｕｍｏｒｓ」、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．，１９７５，１８２：１３１−１４２の方法を改良して測定し、基質と
して［³Ｈ−メチル］ゼラチンを用いて、異なる歯肉抽出物のアリコートをイン
キュベートした。３７℃でのインキュベートの後、可溶化された分解生成物の放
出を液体シンチレーション分光測定法によって測定した。図４に示した結果のよ
うに、ゼラチナーゼ活性（コラゲナーゼのように、このＭＭＰの潜在的代用物の
ＡＰＭＡ活性化後に測定した）は、異なるラットグループにおけるコラゲナーゼ
と同じパターン変化を示し、組合わせ治療は、ＬＰＳ注射ラットの歯肉組織にお
いて、過剰なこのＭＭＰのレベルを相乗的に減少することを再び示した。

【００６８】 これらの組織破壊酵素における同様のパターン変化を以下に示す。 −ゼラチナーゼの異なる分子種を評価する酵素電気泳動法 −エラスターゼ活性を、好中球（炎症細胞）エラスターゼに特異的な合成ペプ
チド基質を用いて分光測定法的に測定した。 −ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ＭＭＰ−
８（コラゲナーゼ−２）及びＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ−３）を、特異的抗血
清を用いたウエスタンブロット分析（Ｔ．Ｓｏｒｓａら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．１９９４，７３２：１１２−１３１；Ｌ．Ｍ．Ｇｏｌｕｂら、Ｉ
ｎｆｌ．Ｒｅｓ．１９９７，３６：３１０−３１７）によってすべて検出した。
これらのすべてのアッセイは、これらのＭＭＰプロテイナーゼ及びエラスターゼ
活性の相乗的阻害を示し、そして組合せ（ビスホスホネートを加えたＣＭＴ）治
療によるこれらの酵素レベルの下方調節を示したことは注目すべきことである。

【００６９】

【実施例４】 化学的修飾テトラサイクリン及びビスホスホネートの組合せは、どちらかの薬
剤のみよりも、培養物中の骨再吸収細胞（破骨細胞）によって生産されるゼラチ
ナーゼを阻害することを示す細胞培養実験

【００７０】 培養された鶏破骨細胞からのポストインキュベーション培地を、部分的に精製
し、次に、潜在性プロゼラチナーゼを活性化する１．２ｍＭＡＰＭＡの存在下で
、４時間３７℃で、［３Ｈ−メチル］ゼラチンと一緒にインキュベートした。こ
れらのインキュベーションを、数種の異なる濃度（０．００１−１０００μＭ）
のビスホスホネート、ジドロネル（エチドロン酸）の存在下（又は不在下）で実
施し、適切な量としてＣＭＴ−１を最終濃度５０μＭになるように加えた。４時
間のインキュベーション後、４５％トリクロロ酢酸及びキャリヤーゼラチンを加
えて反応を止め、この混合物を遠心分離し、上清のアリコートを、即ち放射線標
識されたゼラチン分解フラグメントを含むアリコートを、液体シンチレーション
分光光度計で測定した。

【００７１】 その結果を図５に示す。５０μＭ ＣＭＴ−１は、約７９％まで破骨細胞ゼラ
チナーゼ活性を阻害した。ジドロネルは、最終濃度０．００１、０．１、１０及
び１０００μＭで、この酵素の検出可能な阻害を示さなかった。しかしながら、
ＣＭＴ−１は、１０μＭのジドロネルと結合すると、どちらかの薬剤のみで見ら
れるよりも、破骨細胞活性を９２％まで阻害した。

【００７２】

【実施例５】 ＣＭＴ−３又はＣＭＴ−８とクロドロネートとの組合せを、ヒトＨＴ−１０８
０線維肉腫ガン細胞のインビトロ細胞移動の阻害でテストした。ＨＴ−１０８０
細胞は、トランスウエルチャンバー（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ
）で１８時間、１０％の血清を含む培地の存在下で、移動すると考えられる。ラ
ンダムセルの移動は、使用２時間前に１０％血清含有培地で平衡化した８．０μ
Ｍポアサイズ及び６．５ｍｍ直径のトランスウエルインサートを用いて研究し、
培地を含む血清７５０μｌを、移動装置のより低いコンパートメントに加えた。
ランダム移動アッセイに対して、細胞を、指示された濃度の存在下で、２時間プ
レインキュベーションした。ＣＭＴ及びクロドロネート単独又はこれらの組合せ
と、１００μｌ中の２００００細胞とを、トランスウエルで培養した。１８時間
の培養後、メタノールで固定し、洗浄してトルイジンブルーで染色した。細胞を
綿スワブで上側の膜表面から取り去り、膜下側に移動した細胞を顕微鏡観察で数
えるか、又はコンピュータースキャニングで見積もった。

【００７３】 本テストの組合せの濃度及び結果を図６及び図７に示す。ＣＭＴ−３又はＣＭ
Ｔ−８のどちらかの０．５μＭ総量と、０．５μＭクロドロネートとの組合せは
、細胞移動を相乗的に阻害することが結果に示された。

【００７４】

【実施例６】 組替えヒト（５０ｍｇ）ＭＴ₁−ＭＭＰ（又、ＭＭＰ−１４と呼ばれる）（Ｉ
ｎ Ｖｉｔｒｏ−Ｔｅｋ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、緩衝液（何も入
っていない）、２μＭ ＣＭＴ−３及び２μＭ ビスホスホネートクロドロネー
ト（クロドリネート）の組合せと、２μＭ ＣＭＴ−３及び２μＭ クロドリネ
ートの組合せとで１時間３７℃で前処理した。続いて、β−カゼイン基質（５２
μＭ）をインキュベーション混合物に加え、６０分３７℃でインキュベーション
を続けた。Ｌａｅｍｌｉサンプル緩衝液を加えて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと定量可能
なレーザー濃度分析（Ｓｏｒｓａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７、２７
２：２１０６７−２１０７４；Ｔｅｒｏｎｅｎら、Ｊ．Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ．１９
９７、７６；１５２９−１５３７）前に５分間沸騰させることによって、インキ
ュベーションを終らせた。最適以下のＣＭＴ−３ クロドロネート（クロドリネ
ート）投与量の組合せでは、純粋組換えヒトＭＴ−ＭＭＰによって、β−カゼイ
ン分解の相乗的阻害の結果が得られた。この結果を図８に示し、最適以下の２μ
Ｍ総量のＣＭＴ及びビスホスホネート（クロドリネート）投与量の組合せは、Ｃ
ＭＴ−３又はクロドリネートのみによる相対的なわずかな阻害と比較して、ヒト
ＭＴ−１−ＭＭＰの活性を相乗的に阻害したことを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例３における歯の移動度の結果を説明する棒グラフである。

【図２】 実施例３における歯槽骨損失の結果を説明する棒グラフである。

【図３】 実施例３における歯肉のコラゲナーゼ活性における効果を説明する棒グラフで
ある。

【図４】 実施例３における歯肉のゼラチナーゼ活性における効果を説明する棒グラフで
ある。

【図５】 実施例４における破骨細胞ゼラチナーゼの阻害を説明する棒グラフである。

【図６】 実施例５におけるガン細胞移動の阻害を説明する棒グラフである。

【図７】 実施例５における別の組合せによるガン細胞移動の阻害を説明する別の棒グラ
フである。

【図８】 実施例６におけるＭＴ₁−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）によるカゼイン分解の阻害
を説明する棒グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 11/00 11/06 11/06 17/02 17/02 17/06 17/06 19/00 19/00 19/02 19/02 19/10 19/10 27/02 27/02 29/00 １０１ 29/00 １０１ 31/18 31/18 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 9/99 9/99 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ソルサ ティモ アー フィンランド エフイーエン−00200 ヘ ルシンキ ロウナイスヴァイラ 17 (72)発明者 テロネン オリリ ピー フィンランド エフイーエン−00640 ヘ ルシンキ キランヴァンヒマンクヤ ９ベ ー (72)発明者 サロ テュウラ アー フィンランド エフイーエン−90570 ア ウル フィシコンティ ８ Ｆターム(参考） 4B050 DD11 EE02 LL01 LL03 4C086 AA01 DA29 DA34 DA38 MA03 MA05 MA66 NA14 ZA33 ZA36 ZA59 ZA67 ZA68 ZA89 ZA96 ZA97 ZB15 ZB26 ZC55 ZC61 ZC80

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 過剰なプロテイナーゼ活性に感受性の生物系における結合組
   織及び基底膜の治療及び予防のための組成物であって、テトラサイクリン及びビ
   スホスホネート化合物の相乗的な組合せを含むことを特徴とする組成物。
2. 【請求項２】 前記分解が過剰なプロテイナーゼ活性に関連する、請求項１
   記載の組成物。
3. 【請求項３】 前記生物系が哺乳類である、請求項１記載の組成物。
4. 【請求項４】 更に製薬製剤又は担体を含む、請求項１記載の組成物。
5. 【請求項５】 前記プロテイナーゼが、基質メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ
   ）、ＭＭＰ様酵素、及び／又はセリンプロテイナーゼである、請求項１記載の組
   成物。
6. 【請求項６】 前記分解が、悪性細胞による組織侵入及び転移、骨再吸収、
   軟骨破壊又は柔組織の破壊と関連する、請求項１記載の組成物。
7. 【請求項７】 前記テトラサイクリン及び前記ビスホスホネートが、哺乳動
   物プロテイナーゼの生産及び活性を阻害する相乗的な量である、請求項１記載の
   組成物。
8. 【請求項８】 前記テトラサイクリンが、ＣＭＴ−１、ＣＭＴ−３、ＣＭＴ
   −８、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、ライムサイクリン又はそれらの組合
   せであり、及びビスホスホネート化合物が、アレンドロネート、クロドロネート
   （クロドリネート）、エチドロネート、メドロネート、ネドリネート、パミドロ
   ネート、チルドロネート、ゾレンドロネート又はこれらの組合せである、請求項
   １記載の組成物。
9. 【請求項９】 生物系におけるプロテイナーゼの生産及び活性を阻害する方
   法であって、テトラサイクリン及びビスホスホネートの相乗的な組合せを含む組
   成物のプロテイナーゼ阻害量を投与することを特徴とする方法。
10. 【請求項１０】 前記生物系が哺乳類である、請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記組成物が、更に製薬製剤又は担体を含む、請求項９記
    載の方法。
12. 【請求項１２】 前記過剰なプロテイナーゼ生産及び活性が、結合組織及び
    ／又は基底膜分解に関連する、請求項９記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記プロテイナーゼが、基質メタロプロテイナーゼ（ＭＭ
    Ｐ）、ＭＭＰ様酵素及び／又はセリンプロテイナーゼである、請求項９記載の方
    法。
14. 【請求項１４】 前記組織分解が、悪性細胞による組織侵入及び転移、骨粗
    鬆症の骨減少、骨再吸収、軟骨破壊、血管形成又は柔組織の破壊と関連する、請
    求項１２記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記非抗菌テトラサイクリン及びビスホスホネートが、過
    剰なプロテイナーゼの生産及び／又は活性を阻害する相乗的な量である、請求項
    ９記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記テトラサイクリンが、ＣＭＴ−１、ＣＭＴ−３、ＣＭ
    Ｔ−８、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、ライムサイクリン又はそれらの組
    合せであり、及びビスホスホネート化合物が、アレンドロネート、クロドロネー
    ト（クロドリネート）、エチドロネート、パミドロネート、メドロネート、ネド
    リネート、チルドロネート、ゾレンドロネート又はこれらの組合せである、請求
    項９記載の方法。