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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Gestörte Glucosetoleranz
(impaired glucose tolerance, IGT) kommt in der US-Bevölkerung
häufig
vor. Die Prävalenz
der gestörten
Glucosetoleranz steigt von 11% in der allgemeinen Bevölkerung
im Alter von 20 bis 74 Jahren auf 24% bei denjenigen im Alter von
40 bis 75 Jahren, deren Familiengeschichte Diabetes aufweist und
deren Körpergewicht
mehr als 120% des normalen beträgt.
Personen mit gestörter
Glucosetoleranz haben ein hohes Risiko, kardiovaskuläre Erkrankungen
sowie nichtinsulinabhängigen
Diabetes mellitus (NIDDM), auch als Typ 2 Diabetes bekannt, zu entwickeln.
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Eine
gestörte
Glucosetoleranz ist durch frühe
subtile Defekte der pankreatischen β-Zellfunktion, begleitet von
Insulinresistenz, gekennzeichnet. Diese frühen Defekte umfassen eine gestörte Fähigkeit
der β-Zellen,
geringe Änderungen
der Plasmaglucosekonzentrationen zu erkennen und auf diese mit geeigneten
Konzentrationen an Insulinsekretion und einer sanften Verschiebung
der Glucoseinsulinsekretions-Dosis-Antwort-Kurve nach rechts zu antworten.
Die Fähigkeiten
der β-Zellen
zur Glucoseerkennung und raschen Insulinsekretionsantwort werden
im Verlauf von IGT sehr früh
verloren, wenn zwei 2-Stunden-Glucosespiegel minimal erhöht sind.
Die Schädigung
der Glucosekontrolle bei IGT mit der Zeit ist vorherrschend aufgrund
der fortschreitenden Störung
der β-Zellfunktion.
Dies führt
in vielen Fällen
zu verschlechterten Zuständen
von Hyperinsulinämie,
Fettleibigkeit und kardiovaskulären
Erkrankungen, die manchmal als Syndrom X bekannt sind. In vielen
Fällen
führt ein
fortgeschrittenes IGT-Leiden zu einem definitiven Verlust der Glucosekontrolle
und dem schädlichen
Beginn von NIDDM.
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Wie
bereits erwähnt,
birgt die Erkrankung an IGT ernsthafte Gesundheitsrisiken. Der IGT-Patient
ist häufig
fettleibig und weist hohe Plasmainsulinspiegel auf, die häufig toxisch
sind. Diese hohen Insulinspiegel rühren im allgemeinen von der
kontinuierlich zunehmenden Fähigkeit
von Muskel-, anderen Gewebe- und Fettzellen her, Insulin zu verwenden,
um die Aufnahme von Glucose aus Blutplasma zu bewirken. Die IGT-Erkrankung führt zu einem
erhöhten
Risiko für
den gesamten Bereich kardiovaskulärer Erkrankungen.
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Glucagon-like
Peptid 1 (GLP-1), ein natürliches
enterisches Peptid, wird von den L-Zellen des Darms sekretiert und agiert
als ein Inkretinhormon, das pankreatische β-Zellen dazu stimuliert, Insulin auf
glucoseabhängige
Weise zu sekretieren. Sein therapeutisches Potenzial in NIDDM ist
bereits dadurch gezeigt worden, dass eine exogene Infusion von pharmakologischen
Dosen von GLP-1 den Plasmaglucosespiegel im allgemeinen senkt. GLP-1
verbesserte jedoch die β-Zellfunktion
bei NIDDM nicht signifikant. Nathan DM, Schreiber E, Fogel H, Mojsov
S, Habener JF. Insulinotropic action of glucagon-like peptide-1
(7-37) in diabetic and nondiabetic subjects. Diabetes Care 15: 270–276, 1992;
Gutniak M, ∅rskov C, Holst JJ, Ahrén B, Efendric S. Antidiabetogenic
effects of glucagon-like peptide-1 (7-36) amide in normal subjects
and patients with diabetes mellitus. N Engl J Med 326: 1316–1322, 1992;
Nauck MA, Kleine N, Orskov C, Holst JJ, Willms B, Creutzfeldt W.
Normalization of fasting hyperglycemia by exogenous glucagon-like
peptide-1 (7-36 amide) in type II (non-insulindependent) diabetic
patients. Diabetologia 36: 741–744,
1993; Gutniak MK, Linde B, Holst JJ, Efendie S. Subcutaneous injection
of the incretin hormone glucagon-like peptide-1 abolishes postprandial
glycemia NIDDM. Diabetes Care 17: 1039–1044, 1994; Rachman J, Gribble
FM, Barrow BA, Levy JC, Buchanan KD, Turner RC. Normalization of
insulin responses to glucose by overnight infusion of glucagon -like
peptide 1 (7-36) amide in patients with NIDDM. Diabetes 45: 1524–1530, 1996;
Rachman J, Barrow BA, Levy JC, Turner RC. Near-normalization of
diurnal glucose concentrations by continuous administration of glucagon-like
peptide-1 (GLP-1) in subjects with NIDDM, Diabetologia 40: 205–211, 1997.
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IGT
ist derzeit nicht behandelbar. Es ist jedoch ein erkennbarer Krankheitszustand,
der mit ernsthaften Gesundheitsrisiken verbunden ist. Im Allgemeinen
geht mit IGT eine progressive Verschlechterung des Zustands einher,
was seine Symptome betrifft und führt häufig zu einem Verlust der Plasmaglucosekontrolle,
die einen Typ 2 Diabetes begründet.
Es besteht daher ein Bedürfnis
nach einer Therapie.
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Zahlreiche
Untersuchungen in den vergangenen letzten Jahren haben gezeigt,
dass die Anwendung von GLP-1 in Fällen von NIDDM den Glucose-
und Insulinspiegel im Blut senkt und daher eine vielversprechende
Therapie für
diese Erkrankung sein sollte. Bislang hat jedoch keine Studie gezeigt,
dass GLP-1 ein Potenzial aufweist, um den Verlust der Fähigkeit
von β-Zellen
zu korrigieren, einen Anstieg der Blutglucose zu erkennen und mit
der Sekretion von Insulin rasch zu antworten. Diese Verschlechterung
der Fähigkeit,
auf das Erkennen einer Zunahme an Blutglucose zu antworten und mit
Insulinsekretion aus den β-Zellen
eng zu verknüpfen,
ist die Hauptursache des IGT-Leidens. In früheren Untersuchungen zeigte
die Applikation von GLP-1 bei NIDDM-Probanden die Fähigkeit,
Fastenplasmaglucose zu normalisieren und eine kumulative β-Zell-Insulinsekretion
zu stimulieren. Eine Infusion von GLP-1 in NIDDM-Probanden über Nacht
verbesserte jedoch die Glucoseantworten auf Mahlzeiten am nächsten Tag
nicht. Wenn GLP-1 19 Stunden lang, über Nacht und während dreier
Standardmahlzeiten in Probanden mit NIDDM infusioniert wurde, wurden
die Plasmaglucosespiegel gesenkt, die gestörte postprandiale β-Zellfunktion
war jedoch nur geringfügig
verbessert.
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β-Zellantworten
auf eine verlängerte
Infusion von GLP-1 sind in Testpersonen mit IGT bislang nicht untersucht
worden und da es keine Anzeichen gab, dass das Ergebnis von GLP-1
Infusionen in NIDDMs verschieden sein würde, wurden bislang keine detaillierten
Untersuchungen der Auswirkung von GLP-1 auf β-Zellantworten auf geringfügige Zunahmen
und Abnahmen der Plasmaglucosekonzentrationen durchgeführt.
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Demgemäß besteht
ein Bedürfnis
nach einem Verfahren, um ein Fortschreiten der IGT aufzuhalten und
normale Glucosestoffwechselbedingungen wiederherzustellen.
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Es
ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum
Wiederherstellen oder Verbessern der β-Zellfunktion und Empfindlichkeit
und somit der Insulinsekretionsmuster als Antwort auf Plasmaglucosespiegel
in einem Wirt mit gestörter
Glucosetoleranz bereitzustellen. Ein weiteres Ziel der Erfindung
ist es, ein Verfahren bereitzustellen, um die Verschlechterung der β-Zellfunktion
zu verzögern
oder zu verhindern, welche für
das Fortschreiten einer gestörten
Glucosetoleranz bis zum Kontrollverlust über die Plasmaglucose, welche den
Beginn von NIDDM charakterisiert, verantwortlich ist.
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Noch
ein anderes Ziel der Erfindung ist es, Auswirkungen von IGT auf
kardiovaskuläre
Erkrankungen zu mildern und dadurch Herzgefäß- und Schlaganfallrisiken
zu vermindern.
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Das
Verfahren, mit dem diese und andere Ziele erreicht werden, wird
aus der folgenden ausführlichen Beschreibung
ersichtlich.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Das
Ziel der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.
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Die
Erfinder haben nun gefunden, dass die Applikation von GLP-1 bei
Testpersonen mit gestörter
Glucosetoleranz die fest abgestimmte Antwort der Insulinsekretion
auf einen Anstieg der Plasmaglucosespiegel wiederherstellt, wodurch
die Insulinsekretionsantwortsmuster der β-Zelle auf einen Anstieg des
Plasmaglucosespiegels wiederhergestellt werden, die für normale
Testpersonen ohne IGT charakteristisch sind.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von GLP-1
zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten
mit gestörter
Glucosetoleranz und Insulinresistenz in einer wirksamen Menge, um
die β-Zellempfindlichkeit
und Funktion und die Insulinssekretionsmuster in diesem Patienten wiederherzustellen,
zu verbessern oder zu normalisieren. Die Erfindung ist auch darauf
gerichtet, den Plasmainsulinspiegel in Personen mit IGT zu senken
und gleichzeitig den Zustand der Insulinresistenz und das damit
einhergehende Leiden der kardiovaskulären Erkrankung zu vermindern.
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Bei
der Durchführung
der hier beschriebenen Beispiele haben die Erfinder überraschenderweise
gefunden, dass die Applikation von GLP-1 in Testpersonen mit IGT,
im Gegensatz zur zufälligen
und unkoordinierten Insulinantwort, die charakteristischerweise
bei IGT Testpersonen aufgefunden wird, empfindliche, rasche und
koordinierte Insulinsekretionen aus den β-Zellen in Antwort auf diskrete
pulsierende Anstiege der Plasmaglucose ähnlich der Insulinsekretionsmuster,
die in normalen Patienten gefunden werden, in tiefgreifender Weise
wiederherstellt.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt die Glucose-, Insulin- und GLP-1-Antworten
auf eine orale Verabreichung von 75 mg Glucose in fünf Testpersonen
mit gestörter
Glucosetoleranz (IGT•) und
fünf Testpersonen
mit insulinabhängigem Diabetes
mellitus (NIDDM ☐). 1A zeigt
eine mittlere Glucoseantwort. 1B zeigt
eine Insulinantwort. 1C zeigt eine GLP-1 Antwort.
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2 stellt einen Vergleich bereit zwischen
mittleren Insulinsekretionsraten (ISR) und mittleren Glucosekonzentrationen
in jeder Testperson während
Glucoseinfusion mit Kochsalzinfusion (O) oder GLP-1 Infusion (•). 2A zeigt
den Vergleich in Testpersonen mit IGT. 2B zeigt
den Vergleich in Testpersonen mit NIDDM.
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3 stellt Profile der Glucose-, Insulinsekretionsraten
(ISR) und Insulinkonzentrationen in zwei Testpersonen mit IGT, Testpersonen
D01 und D02, bereit. 3A und 3C zeigen
die Antworten auf eine Kochsalzinfusion. 3B und 3D zeigen
die Antworten auf eine GLP-1 Infusion.
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4 stellt einen Vergleich von Glucosespiegeln,
Insulinsekretionsraten (ISR) und Insulinspiegeln in zwei Testpersonen
mit NIDDM, Testpersonen D07 und D09, bereit. 4A und 4C zeigen
die Profile während
Kochsalzinfusion. 4B und 4D zeigen
die Profile während
GLP-1 Infusion.
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5 stellt einen Vergleich der Spektralanalysen
der Insulinsekretion in Testpersonen während Kochsalz- und GLP-1-Infusionen
bereit. Die auf der linken Seite der Spektralanalyse gezeigten Ergebnisse
stammen von Testpersonen mit IGT. Die auf der rechten Seite der
Spektralanalyse gezeigten Ergebnisse stammen von Testpersonen mit
NIDDM.
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6 stellt einen Vergleich von normierter
Stärke
des Spektrums während
Kochsalzinfusion und während
GLP-1 Infusion bereit. 6A zeigt einen Vergleich der
normierten Stärke
des Spektrums während
Kochsalzinfusion und GLP-1 Infusion in einer Testperson mit IGT
(D02). 6B zeigt einen Vergleich von
normierter Stärke
des Spektrums während
Kochsalzinfusion und GLP-1 Infusion in einer Testperson mit NIDDM
(D07).
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder haben gefunden, dass die Verabreichung von GLP-1 in Testpersonen
mit gestörter
Glucosetoleranz (IGT) die pankreatische β-Zellfunktion und die Fähigkeit
von β-Zellen,
in Antwort auf geringe Erhöhungen
oder Veränderungen
der Plasmaglucosekonzentration rasch zu antworten, indem Insulin
in koordinierter Weise ausgeschüttet
wird, d. h. pulsierende Sekretionen von Insulin, ähnlich den
Insulinsekretionsmustern, die in Testpersonen ohne IGT gefunden
werden, wiederherstellte oder verbesserte. Dieses Muster der Insulinsekretion
wird nicht wiederhergestellt in Testpersonen, die bereits NIDDM
entwickelt haben, welches durch den Verlust der Plasmaglucosekontrolle
charakterisiert ist.
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Die β-Zellfunktion
wird durch die normierte Stärke
des Spektrums quantifiziert. Die Stärke des Spektrums misst die β-Zellfunktion,
die nicht auf einer Anpassung an die Insulinempfindlichkeit beruht.
Die Erfinder haben gefunden, dass GLP-1 in Testpersonen mit IGT
die Stärke
des Spektrums zu einem normalen Bereich hin verbessert. Die Profile
der Stärke
des Spektrums zeigten, dass das Entrainment oder die enge Koordination
von Plasmaglucose und Insulinsekretionsoszillationen bei IGT-Testpersonen
nach Verabreichung von GLP-1 auf normale Spiegel wiederhergestellt
wurde. Diese Verbesserung des oszillatorischen Musters der Insulinsekretion
ist für
die Aufrechterhaltung der normalen Glucosehomöostase von Bedeutung. Beispielsweise ist
gezeigt worden, dass Insulininfusionen, die die ultradianen Oszillationen
innerhalb eines Zeitraums von 120 Minuten nachahmen, bei der Reduktion
von Plasmaglucosekonzentrationen wirksamer sind als konstante Insulininfusionen
(27).
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine
Verbindung umfasst, die an einen Rezeptor für Glucagon-like Peptid-1 bindet
und eine Verbesserung der Fähigkeit
von β-Zellen
bewirkt, geringfügige
Veränderungen
in Plasmaglucosekonzentrationen in Testpersonen mit IGT wahrzunehmen
und darauf zu antworten. In einer Ausführungsform ist die Rezeptor-bindende
Verbindung Glucagon-like Peptid-1. In einer anderen Ausführungsform
ist die Rezeptor-bindende Verbindung eine Peptidvariante, bei der
sich die Kombination der Substitutionen, Deletionen und Varianten
von Glucagon-like Peptid-1 um nicht mehr als zehn Aminosäuren unterscheidet.
Die Rezeptor-bindende Verbindung kann darüber hinaus ein Polynukleotid
oder ein Agens umfassen, das die Freisetzung von GLP-1 aktiviert,
ein Molekül,
das den GLP-1 Rezeptor
aktiviert oder eine GLP-1 Rezeptor-bindende Verbindung, die ein
chemisch konstruiertes Molekül,
Peptid-Analoge oder GLP-1-Agonisten umfasst.
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Die
Erfinder haben gefunden, dass die Verabreichung von humanem GLP-1
das Entrainment der Insulinsekretionsantworten auf geringe Veränderungen
oder Zunahmen der Plasmaglucose verbesserten oder wiederherstellten.
Demgemäß ist die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
bei der therapeutischen Behandlung zur Normalisierung gestörter Glucosetoleranz
brauchbar.
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Die
Erfinder haben hier gezeigt, dass eine niedrig dosierte Infusion
von GLP-1 die Funktion der β-Zellen
Insulin in Antwort auf eine Zunahme im Plasmaglucosespiegel zu sekretieren,
verbessern kann. GLP-1 kann daher also dazu verwendet werden, die
Erhaltung der β-Zellfunktion
in Testpersonen mit IGT zu verbessern. Die Verabreichung von GLP-1
reguliert oder normalisiert auch Insulinsekretionsmuster, was zu
einer Gesamtreduktion von Plasmainsulin bei IGT führt. Diese
Normalisierung wiederum reduziert den Zustand der Insulinresistenz.
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Der
Begriff „GLP-1" oder Glucagon-like
Peptid schließt
GLP-1 Mimetika mit ein, und kann, so wie es im Kontext der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, aus Glucagon-like peptides und verwandten
Peptiden und Analogen von Glucagon-like Peptid-1, die an ein Glucagon-like Peptid-1
(GLP-1)-Rezeptorprotein binden, wie beispielsweise das GLP-1 (7-36)
Amidrezeptorprotein, zusammengesetzt sein und weist einen entsprechenden
biologischen Effekt auf die Insulinsekretion auf, wie GLP-1 (7-36)
Amid, das eine native biologisch aktive Form von GLP-1 ist. Siehe
Göke, B
und Byrne, M, Diabetic Medicine. 1996, 13: 854–860. Die GLP-1-Rezeptoren
sind Zelloberflächenproteine,
die beispielsweise auf insulinproduzierenden pankreatischen β-Zellen gefunden werden.
Glucagon-like Peptide und Analoge umfassen Spezies, die eine insulinotrope
Aktivität
aufweisen und Agonisten des GLP-1 Rezeptormoleküls sind, d. h. dieses aktivieren,
und dessen zweite Messengeraktivität auf u. a. insulinproduzierende β-Zellen.
Agonisten von Glucagon-like Peptid, die Aktivität durch diesen Rezeptor zeigen,
sind bereits beschrieben worden: EP 0708179A2; Hjorth, S. A. et
al., J. Biol. Chem. 269 (48): 30121–30124 (1994); Siegel, E. G.
et al. Amer. Diabetes Assoc. 57th Scientific
Sessions, Boston (1997); Hareter, A. et al. Amer. Diabetes As soc.
57th Scientific Sessions, Boston (1997);
Adelhorst, K. et al. J. Biol. Chem. 269(9): 6275–6278 (1994); Deacon C. F.
et al. 16th International Diabetes Federation
Congress Abstracts, Diabetologia Supplement (1997); Irwin, D. M.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 7915–7920 (1997); Mosjov, S. Int.
J. Peptide Protein Res. 40: 333–343
(1992). Glucagon-ähnliche
Moleküle
umfassen Polynukleotide, die GLP-1-Agonisten exprimieren, d. h. Aktivatoren
des GLP-1-Rezeptormoleküls
und seiner zweiten Messengeraktivität, die u. a. auf insulinproduzierenden β-Zellen gefunden
wird. GLP-1-Mimetika, die ebenfalls β-Zellagonisten sind, umfassen
beispielsweise chemische Verbindungen, die spezifisch zum Aktivieren
des GLP-1 Rezeptors entworfen worden sind. Glucagon-like Peptid-1-Antagonisten
sind ebenfalls bekannt, sie beispielsweise Watanabe, Y. et al.,
J. Endocrinol. 140(1): 45–52
(1994) und umfassen Exendin (9-39) Amin, ein Exendinanaloges, das
ein potenter Antagonist für
GLP-1-Rezeptoren
ist (siehe z. B. WO97/46584). Kürzliche Veröffentlichungen
beschreiben Black Widow GLP-1 und Ser2 GLP-1,
siehe G. G. Holz, J. F. Hakner/Comparative Biochemistry and Physiology,
Part B 121(1998) 177–184
und Ritzel, et al. A synthetic glucagon-like peptide-1 analog with
improved plasma stability, J. Endocrinol 1998 Oct.; 159(1): 93–102.
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Weitere
Ausführungsformen
umfassen chemische und synthetisierte Glucagon-like Polypeptide,
sowie beliebige Polypeptide oder Fragmente davon, die im Wesentlichen
homolog sind. „Im
Wesentlichen homolog",
das sich sowohl auf Nukleinsäure-
als auch Aminosäuresequenzen
beziehen kann, bedeutet dass eine spezielle Sequenz, z. B. eine
Mutantensequenz, von einer Referenzsequenz durch eine oder mehrere
Substitutionen, Deletionen oder Additionen variiert, deren Nettoauswirkungen
nicht zu einer gegenteiligen funktionellen Unähnlichkeit zwischen Referenz
und betreffender Sequenz führt.
Für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Sequenzen, die eine Homologie
von größer als
50 Prozent, und vorzugsweise eine Homologie von größer als
90 Prozent, äquivalente
biologische Aktivität
bei der Verbesserung von β-Zellantworten auf Plasmaglucosespiegel
und äquivalente
Expressionscharakteristika aufweisen, als im Wesentlichen homolog angesehen.
Für die
Zwecke zur Bestimmung der Homologie sollte die Trunkierung der reifen
Sequenz außer Acht
gelassen werden. Sequenzen, die einen niedrigeren Homologiegrad
aufweisen, eine vergleichbare Bioaktivität und äquivalente Expressionscharakteristika
werden als äquivalent
angesehen.
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GLP-Peptide
von Säugern
und Glucagon werden durch das selbe Gen kodiert. Im Ileum wird der
Phänotyp
zu zwei Hauptklassen von GLP-Peptidhormonen, nämlich GLP-1 und GLP-2 verarbeitet.
Es sind vier mit GLP-1 verwandte Peptide bekannt, die von den phänotypischen
Peptiden abstammen. GLP-1 (1-37) weist die Sequenz His Asp Glu Phe
Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
Gly (SEQ. ID NR: 1) auf. GLP-1 (1-37) wird amidiert durch posttranslationale
Verarbeitung und ergibt GLP-1 (1-36)
NH2 das die Sequenz His Asp Glu Phe Glu
Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2) (SEQ. ID NR: 2) aufweist; oder es wird
enzymatisch verarbeitet und ergibt GLP-1 (7-37), das die Sequenz
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ.
ID NR: 3) aufweist. GLP-1 (7-37) kann ebenfalls amidiert werden,
wobei GLP-1 (7-36) Amid erhalten wird, welches die natürliche Form
des GLP-1-Moleküls
ist und das die Sequenz His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
Val Lys Gly Arg (NH2) (SEQ. ID NR: 4) aufweist
und die natürliche
Form des GLP-1-Moleküls
ist.
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Intestinale
L-Zellen sekretieren GLP-1 (7-37) (SEQ. ID NO: 3) und GLP-1 (7-36)
NH2 (SEQ. ID NR: 4) in einem Verhältnis von
1 zu 5, respektive. Diese trunkierten Formen von GLP-1 weisen in
situ kurze Halbwertszeiten auf, d. h. weniger als 10 Minuten und
werden durch eine Aminodipeptidase IV inaktiviert, wobei Glu Gly
Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys
Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NO: 5); bzw.
Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2)
(SEQ. ID NR: 6) erhalten wird. Es ist spekuliert worden, dass die Peptide
Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NO:
5) und Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln
Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH2)
(SEQ. ID NO: 6), die hepatische Glucoseproduktion beeinträchtigen,
die Produktion oder Freisetzung von Insulin aus dem Pankreas jedoch
nicht stimulieren.
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Es
gibt sechs Peptide in Gila-Monster-Gift, die zu GLP-1 homolog sind.
Ihre Sequenzen werden mit der Sequenz von GLP-1 in Tabelle 1 verglichen. Tabelle
1
- a
- GLP-1 (SEQ. ID NR:
4)
- b
- Exendin 3 (SEQ. ID
NR: 7)
- c
- Exendin 4 (9-39NH2(SEQ. ID NR: 8)
- d
- Exendin 4 (SEQ. ID
NR: 9)
- e
- Helospectin I (SEQ.
ID NR: 10)
- f
- Helospectin II (SEQ.
ID NR: 11)
- g
- Helodermin (SEQ. ID
NR: 12)
- h
- Q8,
Q9 Helodermin (SEQ. ID NR: 13)
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Die
Haupthomologien, die durch die in Tabelle 1 umrissenen Bereiche
angegeben werden, sind:
Peptide c und h sind abgeleitet von
b bwz. g. Alle 6 natürlich
vorkommenden Peptide (a, b, d, e, f und g) sind homolog in den Positionen
1, 7, 11 und 18. GLP-1 und Exendine 3 und 4 (a, b und d) sind darüber hinaus
in den Positionen 4, 5, 6, 8, 9, 15, 22, 23, 25, 26 und 29 homolog.
In Position 2 sind A, S und G strukturell ähnlich. In Position 3 sind
die Reste D Amid E (Asp und Glu) strukturell ähnlich. In Positionen 22 und
23 sind F (Phe) und I (Ile) strukturell ähnlich mit Y (Tyr) bzw. L (Leu).
In Position 26 sind L und I ebenfalls strukturell äquivalent.
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Somit
sind von den 30 Resten von GLP-1 die Exendine 3 und 4 in 15 Positionen
identisch und 5 weiteren Positionen äquivalent. Die einzigen Positionen,
in denen radikale, strukturelle Veränderungen offensichtlich sind,
sind bei den Resten 16, 17, 19, 21, 24, 27, 28 und 30. Exendine
weisen auch 9 Extrareste am Carboxylterminus auf.
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Die
GLP-1-artigen Peptide können
durch chemische Festkörperpeptidsynthese
hergestellt werden. GLP-1 kann auch durch herkömmliche rekombinante Techniken
unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden, wie sie
beispielsweise bei Sambrook und Maniatis beschrieben sind. Der hierfür verwendete
Begriff „rekombinant" bedeutet, dass ein
Protein von rekombinanten (z. B. mikrobiellen oder Säugetier) Expressionssystemen
stammt, die genetisch modifiziert worden sind, so dass sie ein Expressionsgen
für GLP-1
oder seine biologisch aktiven Analogen enthalten.
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Die
GLP-1-artigen Peptide können
aus rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren gewonnen und gereinigt
werden, die Ammoniumsulfat- oder Ethanolausfällung, Säureextraktion, Anionen- oder
Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie,
hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie
und Lectinchromatographie umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC) kann für
endgültige
Reinigungsschritte ebenfalls eingesetzt werden.
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Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
ein natürlich
gereinigtes Produkt sein oder ein Produkt chemischer Syntheseverfahren
oder durch rekombinante Techniken aus prokaryotischen oder eukaryotischen Wirten
(beispielsweise durch Bakterien, Hefen, höheren Pflanzen, Insekten und
Säugerzellen
in Kultur oder in vivo) hergestellt werden. Je nach dem Wirt, der
in einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendet wird, sind
die erfindungsgemäßen Polypeptide
im Allgemeinen nicht glykosiliert, können jedoch glykosiliert sein.
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Die
GLP-1-Aktivität
kann mittels Standardverfahren bestimmt werden, im Allgemeinen durch
Screeningverfahren zur Rezeptor-bindenden Aktivität, wozu
das Bereitstellen von geeigneten Zellen gehört, die den GLP-1-Rezeptor
auf ihrer Oberfläche
exprimieren, beispielsweise Insulinomazelllinien wie RINmSF-Zellen oder
INS-1-Zellen. Siehe auch Mosjov, S. (1992) und EP0708170A2. Zusätzlich zum
Messen der spezifischen Bindung von Tracern an Membran unter Verwendung
von Radioimmunoassayverfahren kann auch die cAMP-Aktivität oder glucoseabhängige Insulinproduktion
gemessen werden. In einem Verfahren wird ein Polynukleotid, das
für den
erfindungsgemäßen Rezeptor
kodiert, zur Zelltransfektion eingesetzt, um dadurch das GLP-1-Rezeptorprotein
zu exprimieren. Daher können
diese Verfahren beispielsweise zum Screenen für einen Rezeptoragonisten eingesetzt
werden, in dem solche Zellen mit zu screenenden Verbindungen in
Kontakt gebracht werden und bestimmt wird, ob solche Verbindungen
ein Signal erzeugen, d. h. den Rezeptor aktivieren.
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Es
können
polyklonale und monoklonale Antikörper verwendet werden, um GLP-1-artige Peptide zur Verwendung
in den hier beschriebenen Verfahren nachzuweisen, zu reinigen und
zu identifizieren. Antikörper wie
ABGA1178 erkennen intaktes, ungespleißtes GLP-1 (1-37) oder N-terminaltrunkiertes
GLP-1 (7-37) oder- (7-36) Amid. Andere Antikörper detektieren das genaue
Ende des C-Terminus des Vorläufermoleküls, ein
Verfahren, das es durch Subtraktion erlaubt, die Menge an biologisch
aktivem trunkierten Peptid zu berechnen, d. h. GLP-1 (7-37) oder-
(7-36) Amid (Orskov et al. Diabetes, 1993, 42: 658–661; Orskov
et al. J. Clin. Invest. 1991, 87: 415–423).
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Andere
Screeningtechniken umfassen die Verwendung von Zellen, die den GLP-1-Rezeptor exprimieren,
z. B. transfizierte CHO-Zellen, in einem System das den extrazellulären pH oder
ionische Veränderungen die
durch Rezeptoraktivierung verursacht werden, misst. Beispielsweise
können
potentielle Agonisten mit einer Zelle in Kontakt gebracht werden,
die den GLP-1 Proteinrezeptor exprimiert und eine zweite Messengerantwort,
z. B. Signaltransduktion oder ionische oder pH-Veränderungen
kann gemessen werden um zu bestimmen ob der potentielle Agonist
wirksam ist.
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Die
erfindungsgemäßen Glucagon-like
Peptid-1 Rezeptor-bindenden Proteine können in Kombination mit einem
geeigneten pharmazeutischen Träger
verwendet werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch
wirksame Menge des Polypeptids und eines pharmazeutisch verträglichen
Trägers
oder Exzipients. Derartige Träger
umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Kochsalzlösung, gepufferte
Kochsalzlösung,
Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol, Laktose, Phosphat, Mannit,
Arginin, Trehalose und Kombinationen davon. Die Formulierungen sollten
zum Verabreichungsmodus passen und vom Fachmann ohne weiteres bestimmt
werden können.
Das GLP-1-Peptid kann auch in Kombination mit aus dem Stand der
Technik bekannten Agentien verwendet werden, die die Halbwertszeit
des Peptids in vivo ver bessern, um die biologische Aktivität des Peptids
zu verbessern oder zu verlängern.
Beispielsweise kann ein Molekül
oder eine chemische Gruppe mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kovalent
verknüpft
werden bevor sie verabreicht wird. Alternativ kann das Verbesserungsagens
gleichzeitig mit der Zusammensetzung verabreicht werden. Darüber hinaus
kann das Agens ein Molekül
umfassen, von dem bekannt ist, dass es den enzymatischen Abbau von
GLP-1-artigen Peptiden inhibiert und kann gleichzeitig mit oder
nach Verabreichung der GLP-1-Peptidzusammensetzung verabreicht werden.
Ein solches Molekül
kann beispielsweise oral oder mittels Injektion verabreicht werden.
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GLP-1
kann intravenös
oder subkutan verabreicht werden und kann kontinuierlich oder mittels
Bolusinjektion verabreicht werden. Die gesamte Verabreichung kann
zusammen mit, vor oder nach Glucoseinjektion oder -infusion erfolgen.
Es können
folgende Dosen verwendet werden: Für kontinuierliche Infusion
mittels intravenöser
Injektion (i. V.) 0,1 pmol/kg/min bis 10 pmol/kg/min und mittels
subkutaner Injektion (S. C.) 0,1 pmol/kg/min bis 75 pmol/kg/min
und für
eine Einzelinjektion (Bolus) mittels I. V: 0,005 nmol/kg bis 20
nmol/kg und S. C. 0,1 nmol/kg bis 100 nmol/kg.
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Das
bevorzugte Verfahren zur Verabreichung des GLP-1-Peptids ist eine
kontinuierliche Applikation. GLP-1 kann jedoch auch durch subkutanes,
intramuskuläres,
interperitoneales, injiziertes Depot mit verzögerter Freisetzung, tiefe Insufflation
der Lunge mit verzögerter
Freisetzung sowie mittels intravenöser, buccaler, Pflaster oder
anderer Freisetzungsmethoden verabreicht werden.
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Die
wirksame Behandlung von IGT vermindert auch das Risiko kardiovaskulärer oder
cerebrovaskulärer
Ereignisse. Es kann daher als ein Präventativ bereitgestellt werden
für Patienten,
bei denen ein hohes Risiko für
derartige Ereignisse bekannt ist.
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Darüber hinaus
veranschaulichen die folgenden Beispiele einen Aspekt der vorliegenden
Erfindung. Diese Beispiele sollten jedoch keinesfalls eine Einschränkung des
Umfangs der Lehren oder der Beschreibung der vorliegenden Erfindung
auf die in den Beispielen angegebenen Grenzen sein.
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BEISPIELE
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Die
hier beschriebenen Untersuchungen wurden an zehn Testpersonen durchgeführt, die
auf Grund ihrer Plasmaglucoseantwort auf einen oralen Glucosetoleranztest
in zwei Gruppen aufgeteilt wurden, wobei die Kriterien der Weltgesundheitsorganisation
(21) zur Definition des Grades für
Glucoseintoleranz verwendet wurden. Fünf Testpersonen hatten IGT
und fünf
Testpersonen hatten NIDDM. Geschlecht, Alter, Bodymassindex (BMK),
Basalspiegel von Nüchternglucose,
2 Stundenglucose, Nüchterninsulin
und HBA1c für
jede Testperson sind in Tabelle 2 angegeben. Diabetische Testpersonen
waren älter
als diejenigen mit IGT, die Gruppen passten jedoch beim BMI zusammen.
Mittlere Nüchternglucosespiegel
und glykosilierte Hämoglobinkonzentrationen
waren bei der IGT-Gruppe im Vergleich zu den Testpersonen mit NIDDM
geringer. Nüchterninsulinspiegel
zwischen den Gruppen unterschieden sich nicht.
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Tabelle
2 Klinische
Basislinienparameter von IGT- und NIDDM-Testpersonen
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Plasmaglucosespiegel
wurden gemessen durch Glucoseoxidasetechniken (YSI, 1500 G, Schlag Company,
Bergisch-Gladbach, Deutschland). Der Variationskoeffizient dieses
Verfahren betrug < 2%.
Plasmainsulin wurde mittels Abbott IMx Microparticle Enzyme Immunoassay
gemessen. Der durchschnittliche Intraassayvariationskoeffizient
betrug 5%. Plasma C-Peptid wurde wie zuvor in (22) beschrieben gemessen,
Faber OK, Binder C, Markussen, J, Heding LG, Naithani VK, Kuzuya
H, Blix P, Horwitz DL, Rubenstein AH. Characterization of seven
c-peptide antisera. Diabetes 27, Suppl 1: 170–177, 1978. Die untere Grenze
der Empfindlichkeit des Assays betrug 0,02 pmol/ml und der Intraassayvariationskoeffizient
betrug durchschnittlich 6%. Glucagon wurde unter Verwendung eines
im Handel erhältlichen
Radioimmunoassaykits (Biermann, Bad Nauheim, Deutschland) gemessen
und der Intraassayvariationskoeffizient betrug durchschnittlich
8%. IR-GLP-1 wurde unter Verwendung des spezifischen polyklonalen
Antikörpers
GA 1178 (Affinity Research, Nottingham, UK) (23) gemessen. Er weist
mit GLP-1 (1-36) Amid und dem trunkierten GLP-1 (7-36) Amid eine
Reaktivität von
100% auf. Immunoreaktives GLP-1-artiges Material wurde aus Plasmaproben
auf C-18 Patronen extrahiert, wobei Acetonitril zur Elution der
Proben verwendet wurde. Die Nachweisgrenze des Tests betrug 2 fmol/Röhrchen.
Das Antiserum kreuzreagierte nicht mit GIP, pankreatischem Glucagon,
Glicentin, Oxyntomodulin oder GLP-2. Die Intra- und Interassayvariationskoeffizienten
betrugen 3,4% bzw. 10,4%.
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Sämtliche
Ergebnisse sind als Mittel ± SEM
(mittlere Standardabweichung) angegeben. Die Datenanalyse wurde
unter Verwendung des statistischen Analysesystems (SAS Version 6.
Ausgabe für
Personal Computers, SAS Institute, Inc., Cary, NC) durchgeführt. Die
Bedeutung von Abweichungen im Individuum, die durch GLP-1-Infusion induziert
werden, wurden unter Verwendung von paarweisen T-Tests bestimmt.
Die Abweichungen wurden als signifikant angesehen, wenn P < 0,05.
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Kinetische
Standardparameter für
C-Peptid-Clearance, die auf Alter, Geschlecht und Körperoberfläche abgestimmt
waren, wurden verwendet (24), Van Cauter E, Mestrez, F, Sturis J,
Polonsky KS. Estimation of insulin secretion rates from C-peptide
levels: comparison of individual and standard kinetic parameters
for C-peptide clearance. Diabetes 41: 368–377, 1992. Diese Parameter
wurden dazu verwendet, in jedem 15-Minuten Intervall zwischen Blutprobenentnahmen
den ISR aus den Plasma C- Peptidkonzentrationen
durch Dekonvolution, wie zuvor beschrieben (25, 26) abzuleiten.
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Die
diabetischen Testpersonen wurden alleine mit Diät behandelt, mit Ausnahme der
Testperson D07, die zuvor mit einem oralen hypoglykämischen
Agens behandelt wurde, was 4 Wochen vor der Untersuchung unterbrochen
wurde. Keine der diabetischen Patienten hatte jemals Insulin erhalten.
Sämtliche
Testpersonen wurden zwei Wochen lang vor der Untersuchung auf eine
gewichtserhaltende Diät
gesetzt, die mindestens 200 g Kohlenhydrate pro Tag enthielt.
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Jede
Testperson wurde bei drei getrennten Gelegenheiten untersucht. Sämtliche
Untersuchungen wurden nach einem 12-stündigen Fasten über Nacht
durchgeführt
und begannen um 07.00 Uhr, wenn nichts anderes angegeben ist, wobei
die Testpersonen in Ruhestellung waren. Ein intravenöser Katheter
wurde in jeden Vorderarm plaziert, einer für die Blutprobe, und einer
für die
Verabreichung von Glucose und GLP-1 nach Bedarf. Bei sämtlichen
Experimenten wurde der den Probekatheter enthaltende Arm in einer
Heizdecke gehalten um eine Arterialisation der venösen Probe
zu gewährleisten.
In den folgenden Beispielen wurde das GLP-1 den Testpersonen in
der GLP-1 (7-36) Amidform verabreicht.
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Beispiel 2 (Oraler Glucosetoleranztest)
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120
Minuten nach Einnahme von 75 g Glucose (Boehringer, Mannheim, Mannheim,
Deutschland) wurden in 30 Minuten Intervallen Blutproben zur Messung
von Glucose, C-Peptid, Insulin, Glucagon und GLP-1 entnommen. Inkrementflächen unter
der Kurve (AUC, areas under the curve) von 0 bis 120 Minuten wurden für Glucose,
Insulin, C-Peptid, Glucagon und GLP-1 berechnet. Die Glucosekonzentrationen
wurden dazu verwendet, den Grad der Glucoseintoleranz gemäß den Kriterien
der Weltgesundheitsorganisation zu definieren. Die Antwort der IGT-
und NIDDM-Gruppen auf orale Glucose ist in Tabelle 3 dargestellt.
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Die
Glucose-, Insulin- und GLP-1-Antworten von Testpersonen auf 75 mg
Glucose sind in
1 gezeigt. Die AUC
für Glucose
von 0–120
Minuten war bei der IGT- Gruppe
geringer, die AUC für
Insulin, C-Peptid, Glukagon und GLP-1 unterschied sich jedoch nicht. Tabelle
3 Antwort
auf orale Glucose
P < 0.05
für IGT
vs. NIDDM
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Wenn
mittlere ISR's gegen
mittlere Glucosespiegel aufgetragen wurden, wurde beobachtet, dass GLP-1
eine signifikante Reduktion der Glucosespiegel verursachte, ohne
die mittleren Insulinsekretionsraten signifikant zu ändern. (2).
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Beispiel 3 (Verabreichung
einer oszillatorischen Glucoseinfusion)
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Die
periphere Verabreichung von Glucose in einem oszillatorischen Muster
führt zu
regulären
Oszillationen in der Plasmaglucose. In normalen Testpersonen sind
die β-Zellen
in der Lage, wiederholte Zunahmen und Abnahmen der Glucose wahrzunehmen
und darauf mit parallelen Veränderungen
der Insulinsekretionen zu antworten. Diese Anpassung der insulinsekretorischen
Oszillationen auf die Glucoseoszillationen bzw. -schwankungen wird
als Entrainment bezeichnet. Ein Mangel an Entrainment auf Glucose
ist eine frühe
Manifestierung einer β-Zelldisfunktion
in Personen mit IGT oder leichtem NIDDM.
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Wir
verwendeten ein niedrig dosiertes oszillatorisches Glucoseinfusionsprotokoll,
da es ein sehr empfindlicher Test auf die Fähigkeit der β-Zellen ist,
geringe Veränderun gen
in Plasmaglucosekonzentrationen wahrzunehmen und auf diese zu antworten.
Es prüft
die Integrität
der Rückkopplung,
die Glucose und Insulinsekretion verknüpft. Für eine normale Antwort ist
eine intakte Glucosewahrnehmungsfähigkeit erforderlich.
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Um
zu bestimmen, ob die β-Zellen
in der Lage sind, Oszillationen von Glucose zu erkennen und auf diese
zu antworten, wurde Glucose in einem oszillatorischen Muster mit
einem geringen Volumen Kochsalzlösung
12 Stunden lang infusioniert. Die Amplitude der verabreichten Oszillationen
betrug 33% über
und unter der mittleren Rate von 4 mg/kg/Min. und ihre Periodizität betrug
144 Minuten.
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Um
die Wirkung von GLP-1 auf die Fähigkeit
der β-Zellen,
auf Oszillationen von Glucose zu antworten, zu ermitteln, wurde
Glucose auf die selbe Weise infusioniert und GLP-1 wurde mit einer
konstanten Rate von 0,4 pmol/kg/Min. für die gesamten 12 Stunden infusioniert.
Jede Untersuchung bestand auf einer anfänglichen 2 Stunden Periode
(0700-0900), um die Erreichung eines stabilen Zustands zu ermöglichen.
Daran schloss sich eine nachfolgende Zeitspanne von 10 Stunden (0900-1900)
an, während
der in 15 Minutenintervallen Blutproben für Glucose, Insulin, C-Peptid
und Glucagon und in 60 Minutenintervallen für GLP-1 Blutproben entnommen
wurden.
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Die
mittleren Glucosespiegel waren in beiden Gruppen während der
GLP-1-Infusion verglichen mit Kochsalzlösung signifikant niedriger,
wobei der durchschnittliche Abfall bei IGT-Testpersonen (P < 0,02) 2,4 ± 0,6 mM
betrug und bei den Diabetikern (P < 0,0005)
5,2 ± 0,5
mM betrug. Trotz dieser signifikanten Abnahme der Plasmaglucosekonzentration
waren die mittleren ISRs während
der GLP-1-Infusion im Vergleich zur Kochsalzinfusion in beiden Gruppen
nicht signifikant verschieden (Tabelle 4).
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Tabelle
4 Mittlere Glucose- und ISR-Antworten auf 12 stündige Kochsalz- oder GLP-1-Infusion
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Die
mittleren Insulinspiegel wurden während der GPL-1-Infusion im
Vergleich zu Kochsalzlösung ebenfalls
aufrechterhalten, Anstieg um 102 ± 90 pmol/L; P = 0,32 in Testpersonen
mit IGT und Anstieg 7 ± 12 pmol/L;
P = 0,56 in Testpersonen mit NIDDM. Mittlere Glucagonspiegel waren
während
der GLP-1-Infusion im Vergleich zu Kochsalzlösung ebenfalls nicht unterschiedlich
(39,3 ± 5,4
pg/ml vs. 39,4 ± 5,9
pg/ml; P = 0,94) in Testpersonen mit IGT und (46,4 ± 3,2 pg/ml
vs. 42,8 ± 4,5
pg/ml; P = 0,4) in Testpersonen mit NIDDM. Während der GLP-1-Infusion erreichte
GLP-1-Spiegel betrugen 15,6 ± 4,6
pmol/L im Vergleich zu 2,0 ± 0,8
pmol/L während
Kochsalzinfusion (P < 0,001).
Diese Spiegel entsprechen postprandialen physiologischen Spiegeln.
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Beispiel 4 (Beziehung
zwischen Glucose und ISR in einzelnen Testpersonen mit IGT).
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In
normalen Testpersonen ist jeder Glucosepuls eng gekoppelt an einen
Puls in der ISR. Es ist bereits gezeigt worden, dass diese Kopplung
in Testpersonen mit IGT gestört
ist. Glucose- und ISR-Profile während der
oszillatorischen Glucoseinfusion mit Kochsalzlösung von einer repräsentativen
Testperson mit IGT, D02, sind in den 3A und 3C gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass in Testpersonen mit IGT während Kochsalzinfusion
ein Verlust der engen Kopplung zwischen Glucose und ISR, mit vielen
glucoseunabhängigen Oszillationen
in der ISR auftritt. In Gegenwart physiologischer postprandialer
Spiegel von GLP-1 (3B und 3D) ist
das Muster insulinsekretorischer Antworten auf Glucose in der Testperson
mit IGT verbessert, wobei auf jeden Glucosepuls ein ISR-Puls folgt.
GLP-1 verbessert in Folge dessen die Fähigkeit der β-Zellen,
sich an eine exogene Glucoseinfusion in der Testperson mit IGT anzupassen.
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Beispiel 5 (Beziehung
zwischen Glucose und ISR in einzelnen Testpersonen mit NIDDM)
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4 zeigt die Glucose- und ISR-Profile einer
Testperson mit NIDDM, D07. In merklichem Kontrast zu Testpersonen
mit IGT war das Muster von insulinsekretorischer Antworten auf Glucose
während
der GLP-1-Infusion, trotz der Absenkung von Plasmaglucosekonzentrationen
und der Aufrechterhaltung von ISR, nicht verbessert (4B und 4D),
wobei in ISR viele glucoseunabhängige
Oszillationen bestehen blieben. Glucose- und ISR-Profile während der
oszillatorischen Glucoseinfusion mit Kochsalzlösung sind in 4A und 4C angegeben.
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Beispiel 6 (Auswirkung
von GLP-1 auf die Stärke
des Spektrums bei IGT und bei NIDDM)
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Um
festzustellen, ob die Insulinsekretion in einzelnen Testpersonen
durch Glucose hervorgerufen wurde, wurden die temporalen Profile
der Insulinsekretion mittels Spektralanalyse analysiert. Die Analyse
der Stärke
des Spektrums wurde dazu verwendet, das Vorliegen einer engen Kopplung
zwischen Oszillationen in Glucose und Oszillationen in ISR zu bewerten.
Dieses Verfahren bewertete die Regelmäßigkeit insulinsekretorischer
Oszillationen bei einer vorherbestimmten Frequenz. Spektralpeaks
entsprechen der vorherrschenden Periodizität und die Höhe der Peaks entspricht der
Stärke
des Spektrums. Jedes Spektrum wurde normiert, wobei die totale Varianz
einer jeden Serie als 100% angenommen wurde und als die normierte
Stärke
des Spektrums angegeben wurde.
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Die
mittlere normierte Stärke
des Spektrums für
Glucose bei Testpersonen mit IGT betrug 11,2 ± 1,5 während Kochsalzinfusion und
13,2 ± 1,6
während
GLP-1-Infusion (P = 0,19) und in Testpersonen mit NIDDM 6,5 ± 1,8 während Kochsalzinfusion
und 9,8 ± 0,7
während
GLP-1-Infusion (P = 0,18). 5 zeigt
eindeutig, dass eine Infusion von GLP-1 in Testpersonen mit IGT
die insulinsekretorischen Antworten auf die Oszillationen der Plasmaglucose
verbesserte, was zu einem höheren
Grad an Entrainment der Insulinsekretion auf Glucose führte. Die
Wirkung wurde durch Vergleichen der normierten Stärke des
Spektrums auf die insulinsekretorischen Profile quantitativ bestimmt.
Die Stärke
des Spektrums für
ISR stieg von 2,9 ± 1,4
während
Kochsalzinfusion, auf 8,9 ± 1,7
während
GLP-1-Infusion; (P < 0,006)
und war in Testpersonen mit NIDDM (1,1 ± 0,5 bis 1,5 ± 0,8;
P = 0,6) unverändert.
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Die
Spektralanalyse der oszillatorischen Glucoseprofile bestätigte das
Vorliegen von Peaks in den Plasmaglucosespektren bei 144 Minuten
entsprechend der Periode exogener Glucoseinfusion. Individuelle Spektren
für Glucose
und ISR in einer Testperson mit IGT (6A) und
einer Testperson mit NIDDM (6B) während Kochsalzinfusion
und während
GLP-1-Infusion sind in 6 gezeigt.
Diese entsprechen den in 3C und 3D und
den in 4A und 4B gezeigten
Daten. Die Stärke
des Spektrums stieg von 0,6 auf 8,9 in der IGT-Testperson und war
in der Testperson mit NIDDM minimal verändert von 0,28 auf 1,51. Peaks in
Plasmaglucosespektren traten bei 144 Minuten auf. Während Kochsalzinfusion
trat der dominate spektrale Peak für ISR bei 144 Minuten nicht
auf, sondern trat bei 0,2 auf. Die Stärke des Spektrums bei GLP-1-Infusion betrug
1,5.
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Während der
Kochsalzinfusion war das Entrainment gering (3A), da
die Stärke
des Spektrums für ISR
bei 144 0,6 betrug. Während
GLP-1 Infusion (3B) trat die Periodizität des dominanten
Spektralpeaks bei ISR bei 144 Minuten auf, was zeigte, dass GLP-1
das Entrainment der β-Zellen
in dieser Testperson verursacht hatte.
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Der
mittlere Wert für
die normierte Stärke
des Spektrums in historischen Kontrolltestpersonen mit entsprechend
passendem Gewicht (BMI 28,3) mit normaler Glucosetoleranz betrug
7,2 ± 0,6
(9).
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Die
Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass eine kontinuierliche
Infusion von physiologischen postprandialen Konzentrationen an GLP-1
die Plasmaglucosekonzentrationen senkte und die Insulinsekretion in
Testpersonen mit IGT und NIDDM stimulierte. Am wichtigsten ist,
dass GLP-1 bei sämtlichen
IGT-Testpersonen die Fähigkeit
der β-Zellen
wiederherstellte, Plasmaglucose wahrzunehmen und auf diese zu reagieren (quantifiziert
durch normierte Stärke
des Spektrums), wobei die Antwort in Testpersonen, die bereits NIDDM entwickelt
hatten, variabel war.
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Die
möglichen
Mechanismen, über
die die β-Zellfunktion
durch GLP-1 verbessert wird, umfassen eine Aufregulierung glucosewahrnehmender
Elemente, Eliminierung von Glukotoxizität und Verbesserung der Insulinresistenz.
GLP-1 und Glucose üben
auf β-Zellen
synergistische, insulinotrope Aktionen aus, einschließlich Stimulierung
der zyklischen AMP-Bildung, Insulinsekretion, Insulinbiosythese
und Proinsulingenexpression.
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Diese
Beispiele zeigen, dass eine kontinuierliche Infusion von physiologischen
Konzentrationen von GLP-1 die Plasmaglucosekonzentration absenkte
und die Insulinsekretion in IGT- und NIDDM-Testpersonen stimulierte.
Am wichtigsten ist, dass GLP-1 die Fähigkeit der β-Zelle, geringe Änderungen
in der Plasmaglucosekonzentration in IGT-Testpersonen wahrzunehmen
und auf diese zu reagieren, wiederherstellte, wobei lediglich in
NIDDM-Testpersonen eine variable Antwort erhalten wurde. In IGT-Testpersonen wurde
ein signifikanter Anstieg der Stärke
des Spektrums beobachtet, eine Messung der β-Zellfunktion, die nicht auf
der Einstellung für
Veränderungen
in der Insulinsensitivät
beruht.