CZ294848B6

CZ294848B6 - Glukagonu podobný peptid-1 zlepšuje odpověď ß-buněk na glukózu u subjektů se zhoršenou tolerancí glukózy

Info

Publication number: CZ294848B6
Application number: CZ20004614A
Authority: CZ
Inventors: Burkhard Goke; Maria Byrne; Thomas R. Coolidge
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2005-03-16
Also published as: AU2003212050A1; IL140223A0; DE69918691T2; TR200100079T2; US7265087B1; CN1209166C; EA004538B1; EP1083924B1; OA11694A; CA2334872C; JP2002517469A; NO20006336D0; UA69412C2; BG105079A; AP2001002027A0; PL345212A1; CZ20004614A3; NZ508823A; ES2224659T3; PL195662B1

Abstract

Kompozice pro léčení zhoršené tolerance ke glukóze (IGT) obsahující sloučeninu, která se váže na receptor pro glukagonu podobný peptid-1, a farmaceutický nosič. Množství přítomné sloučeniny je efektivní množství pro zlepšení citlivosti pankreatických .beta.-buněk ke hladinám krevní glukózy u lidí s IGT. Metoda slouží také pro zlepšení modelu odpovědí vylučováním inzulinu u lidí s IGT podáváním lidem kompozice obsahující sloučeninu, která se váže na receptor pro glukagonu podobný peptid-1 a farmaceutický nosič.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká přípravku obsahujícího sloučeninu vážící se na receptor „GLP-1“ a způsobu léčby zhoršené tolerance glukózy.

Dosavadní stav techniky

Zhoršená tolerance ke glukóze (IGT-impaired glucose tolerance) je běžná v americké populaci. Zatímco v běžné populaci ve věku 20 až 74 let je zhoršená tolerance ke glukóze 11 %, zvyšuje se na 24 % v populaci věku 40 až 75 roků s rodinným výskytem diabetes a tělesnou hmotností větší než 120 % normálu. U osob se zhoršenou tolerancí glukózy existuje vysoké riziko vzniku kardiovaskulárních onemocnění a rovněž vzniku diabetes mellitus nezávislé na inzulínu (NIDDMtj., non-insulin dependent diabetes mellitus), známé také jako diabetes typu 2.

Zhoršená tolerance glukózy je charakterizována prvotními nepatrnými defekty funkce β-buněk doprovázené inzulínovou rezistencí. Tyto prvotní defekty zahrnují zhoršenou schopnost β-buněk vnímat malé změny koncentrace glukózy v plazmě a odpovídat na ně vylučováním vhodných množství inzulínu a mírný posun doprava u křivky vyjadřující odpověď sekrecí inzulínu v závislosti na dávce glukózy. Citlivost ke glukóze a schopnost β-buněk rychle odpovědět sekrecí inzulínu se ztrácí velmi časně v průběhu IGT, kdy jsou 2hodinové hladiny glukózy minimálně zvýšeny. Zhoršení kontroly glukózy při IGT s časem je způsobeno zejména pokračováním zhoršování funkce β-buněk. To vede v mnoha případech ke zhoršování stavů hyperinsulinémie, obezity a kardiovaskulárního onemocnění označovaného někdy jako syndrom X. V mnoha případech vedou pokročilé stavy IGT k definitivní ztrátě kontroly glukózy a k nástupu NIDDM.

Z uvedeného vyplývá, že stav IGT přináší závažná zdravotní rizika. Pacienti trpící IGT jsou často obézní a mají vysoké hladiny inzulínu v plazmě, které jsou často toxické. Tyto vysoké hladiny inzulínu způsobuje obecně neustále se zvyšující neschopnost svalů, jiných tkání a tukových buněk využívat inzulín k tomu, aby byla spotřebovávána glukóza z krevní plazmy. Stav IGT zvyšuje rizika vzniku celé řady kardiovaskulárních nemocí.

Glukagonu podobný peptid-1 (GLP-1 tj. glucagon-like peptide-1), přirozený střevní peptid, je vylučován střevními L-buňkami a působí jako hormon inkretin, který stimuluje vylučování inzulínu pankreatickými β-buňkami v závislosti na glukóze. Terapeutický potenciál tohoto peptidů při NIDDM byl již dříve demonstrován tak, že exogenní infuze farmakologických dávek GLP-1 obecně snižovaly hladiny glukózy v plazmě. Nicméně GLP-1 nezlepšil významně funkci β-buněk při NIDDM. Nathan DM, Schreiber E, Fogel H, Mojsov S, Habener JF: Insulinotropic action of glucagon-like peptide-1 (7-37) in diabetic and nondiabetic subjects, Diabetes Care 15:270-276, 1992; Gutniak M, Orskov C, Holst JJ, Ahrén B, Efendrik S: Antidiabetogenic effects of glukagon like peptide-1 (7-36) amide in normál subjects and patients with diabetes mellitus, N. Engl. J. Med. 326:1316-132, 1992; Nauck MA, Kleine N., Orskov C, Hlst JJ, WilmsB, Creutzfeldt W.: Normalization of fasting hyperglycemia by exogenus glukagon like peptide-1 (7-36 amide) in type II (non-insulin-dependent) diabetic patients, Diabetologia 36: 741-744, 1993; Gutniak MK, Lindě B, Holst JJ, Efendie S: Subcutaneous injection of the incretin hormon glukagon-loke peptide-1 abolishes postprandial glycemia NIDDM, Diabetes Care 17:1039-1044, 1994; Rachman J, Gribble FM, Barrow BA, Levý JC, Buchanan KD, Turner RC: Normalization of insulin responses to glukose by ovemight infusion of glukagon-like peptide-1 (7-36) amide in patients with NIDDM, Diabetes 45:1524-1530, 1996; Rachman J, Barrow BA, Levý JC, Turner RC: Nearnormalization of diumal glucose concentrations by continuous

-1 CZ 294848 B6 adminístration of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) in subjects with NIDDM, Diabetologia 40: 205-211, 1997.

Stav IGT není v současné době vyléčitelný. Nicméně je rozpoznatelným onemocněním, které je spojeno s vážnými zdravotními riziky. Obecně se stav IGT postupně zhoršuje z hlediska jeho symptomů a často vede ke ztrátě kontroly glukózy vyskytující se v plazmě což vytváří diabetes typu 2. Zde je potřebná terapie.

Rada studií během posledních několika let ukázala, že aplikace GLP-1 v případech NIDDM snižuje hladiny glukózy a inzulínu v krvi, a tak by měla být slibnou terapií pro tuto nemoc. Nicméně žádné studie zatím neukázaly, že GLP-1 má potenciál napravit ztrátu schopnosti β-buněk vnímat a rychle reagovat vylučováním inzulínu, když se zvýší hladina krevní glukózy. Je to právě toto zhoršení schopnosti odpovídat a úzce spojit vnímání zvýšení hladiny krevní glukózy s vylučováním inzulínu β-buňkami, které je hlavní příčinou stavu IGT. V předchozích studiích ukázala aplikace GLP-1 na subjekty s NIDDM schopnost normalizovat hladinu glukózy v plazmě na lačno a stimulovat kumulativní vylučování inzulínu β-buňkami. Nicméně infuze GLP-1 prováděné přes noc nezlepšily glukózové odpovědi na jídla podávaná následující den. Když byla infuze GLP-1 prováděna u osob s NIDDM po dobu 19 hodin, přes noc a během tří běžných jídel zredukovala se hladina glukózy v plazmě, ale zhoršená postprandiální funkce β-buněk se zlepšila pouze nepatrně.

Odpovědi β-buněk na prodlouženou infuzi GLP-1 nebyly dříve studovány u subjektů s IGT a protože nebyly žádné náznaky, že by výsledky mohly být odlišné než u infuzi GLP-1 v případě NIDDM, nebyly dosud prováděny podrobné studie vlivu GLP-1 na odpovědi β-buněk na malé zvyšování a snižování koncentrací glukózy v plazmě.

Z uvedeného vyplývá potřeba metody, která by zastavila postup IGT a obnovila normální stav metabolizmu glukózy.

Proto je cílem předkládaného vynálezu zajistit metodu umožňující obnovit nebo zlepšit funkci β-buněk a jejich citlivost a tím vylučování inzulínu v odpovědi na hladiny glukózy v plazmě u osob majících zhoršenou toleranci ke glukóze.

Dalším cílem vynálezu je zajistit způsob, který zpozdí nebo zabrání zhoršování funkce β-buněk, která je zodpovědná za progresi zhoršené tolerance ke glukóze až ve ztrátu regulace glukózy v plazmě což charakterizuje nástup NIDDM.

Dalším cílem vynálezu je zmírnit vlivy IGT vedoucí ke kardiovaskulárním nemocem, a tak snížit rizika těchto nemocí a mrtvic.

Způsob splňující tyto a další cíle bude zřejmý z následujícího detailního popisu.

Podstata vynálezu

Bylo objeveno, že aplikace GLP-1 subjektům se sníženou tolerancí ke glukóze obnoví úzce koordinovanou odpověď vylučováním inzulínu na zvýšení hladin glukózy v plazmě, a tak znovu nastaví průběh inzulínové odpovědi β-buněk na vzrůst hladiny glukózy v plazmě, který je charakteristický pro normální subjekty, které netrpí IGT.

Předkládaný vynález je zaměřen na způsob léčby osob trpících zhoršenou tolerancí ke glukóze a inzulínovou rezistencí s použitím GLP-1 v množství účinném k obnovení, zlepšení nebo normalizaci citlivosti a funkce β-buněk a vylučování inzulínu. Vynález je také zaměřen na

-2CZ 294848 B6 způsob snižování hladiny inzulínu v plazmě u osob s IGT a souběžně redukci stavu inzulínové rezistence a ji provázejících kardiovaskulárních onemocnění.

Při provádění zde popsaných příkladů bylo překvapivě pozorováno, že aplikace GLP-1 u subjektů s IGT, v kontrastu k náhodné a nekoordinované inzulínové odpovědi charakteristicky se vyskytující u subjektů s IGT, dramaticky obnovuje citlivé, rychlé a koordinované vylučování inzulínu β-buňkami v odpovědi na jednotlivé pulzační zvyšování koncentrace glukózy v plazmě, podobně modelu vylučování inzulínu u normálních pacientů.

Bylo objeveno, že podávání GLP-1 subjektům se zhoršenou tolerancí ke glukóze (IGT) obnovuje nebo zlepšuje funkci pankreatických β-buněk a schopnost β-buněk rychle odpovídat vylučováním inzulínu koordinovaným způsobem v odpovědi na malá zvýšení nebo změny koncentrace glukózy v plazmě tj. pulzačním vylučováním inzulínu podobným způsobem, jako probíhá vylučování inzulínu u subjektů bez IGT. Tento způsob vylučování inzulínu není obnoven u subjektů, u nichž je již rozvinut stav NIDDM, který je charakterizován ztrátou regulace glukózy vplazmě.

Funkce β-buněk je kvantifikována normalizovanou spektrální silou. Spektrální síla měří funkci β-buněk, která nezávisí na nastavení citlivosti pro inzulín. Bylo zjištěno, že u subjektů s IGT zlepšuje GLP-1 spektrální sílu na normální rozsah. Profily spektrálních sil indikují, že úzká koordinace glukózy v plazmě a oscilací vylučování inzulínu byla u subjektů s IGT po podávání GLP-1 obnovena na normální úroveň. Toto zlepšení oscilačního modelu vylučování inzulínu je důležité pro udržení normální homeostéze glukózy. Například bylo ukázáno, že inzulínové infuze, které napodobují ultradiální oscilace s periodou 120 minut, jsou efektivnější pro redukci koncentrací glukózy v plazmě, než konstantní infuze inzulínu (27).

Předkládaný vynález zajišťuje kompozici zahrnující sloučeninu, která se váže na receptor pro glukagonu podobný peptid-1 a je účinná pro zlepšení schopnosti β-buněk vnímat a odpovídat na malé změny v koncentracích glukózy v plazmě u subjektů s IGT. V jednom provedení je sloučeninou vážící se na receptor glukagonu podobný peptid-1. V jiném provedení je sloučeninou vážící se na receptor variantní peptid, ve kterém se kombinace substitucí, delecí a variant neliší o více než 10 aminokyselin od glukagonu podobného peptidu-1. Sloučenina vážící se na receptor může dále zahrnovat polynukleotid nebo látku, která aktivuje uvolňování GLP-1, molekulu, která aktivuje receptor pro GLP-1, nebo sloučeninu vážící se na receptor pro GLP-1, zahrnující chemicky konstruovanou molekulu, analogy peptidů nebo agonisty GLP-1.

Bylo objeveno, že podávání lidského GLP-1 zlepšuje nebo obnovuje odpověď vylučováním inzulínu na malé změny nebo zvýšení glukózy v plazmě. V souladu s tím je kompozice podle předkládaného vynálezu užitečná pro terapii vedoucí k normalizaci zhoršené tolerance ke glukóze.

Je zde demonstrováno, že infuze nízkých dávek GLP-1 může zlepšit funkci β-buněk, aby vylučovaly inzulín v odpovědi na zvýšené hladiny glukózy v plazmě. GLP-1 může být rovněž použit ke zlepšení zachování funkce β-buněk u subjektů s IGT. Podávání GLP-1 také reguluje nebo normalizuje modely vylučování inzulinu, což způsobí celkové snížení inzulínu v plazmě při IGT. Tato normalizace snížením způsobí omezení stavu rezistence k inzulinu (inzulínové rezistence).

Termín „GLP-1“ označuje glukagonu podobný peptid a zahrnuje mimetika GLP-1 a tak, jak je používán v kontextu předkládaného vynálezu, může zahrnovat glukagonu podobné peptidy a příbuzné peptidy a analogy glukagonu podobného peptidu-1, které se váží receptorový protein pro glukagonu podobný peptid-1 (GLP-1), takové jako je GLP-1 (7-36) amid receptorový protein, a mají odpovídající biologický efekt na sekreci inzulinu, jako GLP-1 (7-36) amid, který je nativní, biologicky aktivní formou GLP-1. Viz Goke, B and Byme, M, Diabetic Medicine, 1996, 13:854-860. Receptory pro GLP-1 jsou bílkoviny na povrchu buněk nalézající se

-3 CZ 294848 B6 například na pankreatických β-buňkách produkujících inzulín. Glukagonu podobné peptidy a analogy budou zahrnovat druhy mající inzulinotropní aktivitu a které jsou agonisty, tj. aktivují receptorovou molekulu pro GLP-1 a její druhou mediátorovou (messenger) aktivitu mimo jiné na β-buňky produkující inzulín. Agonisté, kteří vykazují aktivitu skrze tento receptor byli popsáni v: EP0708179A2; Hjorth, S. A. et al., J. Biol. Chem. 269 (48):30121-30124 (1999); Siegel, E. G. et al. Amer. Diabetes Assoc. 57^th Scientific Sessions, Boston (1997); Adelhorst, K. et al. J. Biol. Chem. 269(9):6275-6278 (1994); Deacon, C. F. et al. 16^th Intemational Diabetes Congres Abstracts, Diabetologia Supplement (1997); Irvin, D. M. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94:7915-7920 (1997); Mosjov, S. Int. J. Peptide Protein Res., 40:333-343 (1992). Glukagonu podobné molekuly zahrnují polynukleotidy jejichž expresí vznikají agonisté GLP-1, tj. aktivátory receptorové molekuly pro GLP-1 a její sekundární mediátorové aktivity nacházející se mimo jiné na β-buňkách produkujících inzulín. Látky napodobující (mimetika) GLP-1, které jsou také agonisty β-buněk, zahrnují například chemické sloučeniny specificky navržené k aktivaci receptorů pro GLP-1. Antagonisté glukagonu podobného peptidu-1 jsou také známi, viz například Watanabe, Y. et al., J. Endocrinol. 140(1):45-52 (1994), a zahrnují exendin (9-39) amin, analog exendinu, který je účinným antagonistou receptorů pro GLP-1 (viz např. WO97/46584). Nedávné publikace popisují GLP-1 z černé vdovy (Black Widow GLP-1) a Ser²GLP-1, víz Holz, J. F. iAaknvdComparative Biochemistry andPhysiology, Part B 121(1998)177— 184 a Ritzel et al., A synthetic glucagon-like peptide-1 analog with improvedplasma stability, J. Endocrinol 1998 Oct.; 159(1): 93-102.

Následující provedení zahrnují chemicky syntetizované glukagonu podobné polypeptidy a rovněž tak jakékoliv polypeptidy nebo jejich fragmenty, které jsou podstatně homologní. „Podstatně homologní“, což se může vztahovat na nukleové kyseliny i sekvence aminokyselin, znamená, že sekvence určitého subjektu, například sekvence mutantu, se liší od referenční sekvence jednou nebo více substitucemi, delecemi (vynecháními) nebo adicemi (přidáními) a tyto odlišnosti nezpůsobí nepříznivou změnu funkce dané sekvence vzhledem k sekvenci referenční. Pro účely tohoto vynálezu jsou za podstatně homologní považovány sekvence mající větší než 50% homologii a přednostně větší než 90% homologii, ekvivalentní biologickou aktivitu v β-buňkách se zlepšenými odezvami na hladiny glukózy v plazmě a ekvivalentní expresní charakteristiky. Pro účely určování homologie by mělo být ignorováno zkrácení přirozené sekvence. Sekvence, které mají menší stupně homologie, srovnatelnou bioaktivitu a ekvivalentní expresní charakteristiky jsou považovány za ekvivalentní.

Savčí GLP peptidy a glukagon jsou kódovány stejným genem. V ileu je fenotyp zpracováván na dvě hlavní třídy GLP peptidových hormonů, jmenovitě GLP-1 a GLP-2. Jsou známy čtyři proteiny příbuzné GLP-1, které jsou tvořeny z fenotypových peptidů. GLP-1 (1-37) má sekvenci His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NO:1). GLP-1 (1-37) je amidován v posttranslačním procesu a vzniká GLP-1 (1-36) NH₂, který má sekvenci His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Tyr Leu Val Lys Gly Arg (NH₂) (SEQ. ID NO:2); nebo je měněn enzymaticky a tvoří se GLP-1 (7-37), který má sekvenci His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NO:3). GLP-1 (7-37) může být také amidován a vzniká GLP-1 (7-36) amid, který je přirozeně se vyskytující formou molekuly GLP-1 a který má sekvenci His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH₂) (SEQ. ID NO:4) a v přirozené formě je molekulou GLP-1.

Střevní L-buňky vylučují GLP-1 (7-37) (SEQ. ID NO:3) a GLP-1 (7-36) NH₂ (SEQ. ID NO:4) v poměru 1 ku 5 v uvedeném pořadí. Tyto zkrácené formy GLP-1 mají krátký poločas životnosti in šitu, tj. méně než 10 minut a jsou inaktivovány aminodipeptidázou IV za vzniku Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NO: 5), resp. Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH₂) (SEQ. ID NO: 6). Bylo

-4CZ 294848 B6 spekulováno, že peptidy Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NO: 5) a Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH₂) (SEQ. ID NO: 6) ovlivňují produkci jaterní glukózy, ale nestimulují produkci nebo uvolňování inzulínu ze slinivky (pankreatu).

V jedech z ještěrky korovce se nachází 6 peptidů, které jsou homologní s GLP-1. Jejich sekvence jsou v tabulce 1 porovnány se sekvencí GLP-1.

Tabulka 1

a. H A E G T

F T

S D V

s

Y

L

E

G Q A A

K

E

F

I

A

W

L

v

K

G

R NH₂

b.

. H S D G T

F T

S D L

S

K

Q

M

E

A

V

R

L

F

I

E

w

L

K

N

G

G P S S G A

P P

P S nh₂

c.

D

L S

K Q M

E

A

V

R

L

F

I

E

W

L

K

N

G

P

S

G A P P P S

nh₂

d.

H G E G T

F T

S D L

S

K

Q

M

E

A

V

R

L

F

I

E

W

L

K

N

G

G P S S G A

P P

P S nh₂

e.

H S D A T

F T

A E Y

S

K

L

A

K

L

A

L

Q

K

Y

L

E

s

I

L

G

S

S T S P R P

P S

S

f.

H S D A T

F T

A E Y

s

K

L

A

K

L

A

L

Q

K

Y

L

E

s

I

L

G

S

S T S P R P

P s

g.

H S D A I

F T

E E Y

s

K

L

A

K

L

A

L

Q

K

Y

L

A

s

I

L

G

s

R T S P P P

nh₂

h.

H S D A I

F T

Q Q Y

s

K

L

A

K

L

A

L

Q

K

Y

L

A

s

I

L

G

S R T S P P P NH₂ a=GLP-l (SEQ. IDNO:4) b=Exendin 3(SEQ. ID NO:7) c=Exendin 4(9-39)NH₂(SEQ. ID NO:8) d=Exendin 4(SEQ. ID NO:9) e=Helospectin I(SEQ. ID NO: 10) f=Helospectin II(SEQ. ID NO: 11) g=Helodermin (SEQ. ID NO: 12) h=Q⁸, Q⁹ Helodermin (SEQ. ID NO: 13)

Hlavní homologie, které ukazuje tabulka 1 jsou: peptid c, resp. h je odvozen od peptidu b, resp. g. Všech 6 přirozeně se vyskytujících peptidů (a, b, c, d, e, g) je homologních v pozici 1, 7, 11 a 17. GLP-1 a exendiny 3 a 4 (a, b, d) jsou dále homologní v pozicích 4, 5, 6, 8, 9, 15, 22, 23, 25, 26 a 29. V pozici 2 jsou A, S a G strukturně podobné. V pozici 3 jsou zbytky D a E (Asp a Glu) strukturně podobné. V pozicích 22 a 23 jsou F (Phe) a I (Ile) strukturně podobné s Y (Tyr), resp. L (Leu), v uvedeném pořadí. Podobně v pozici 26 L a I jsou strukturně ekvivalentní.

Tak z 30 zbytků GLP-1 jsou exendiny 3 a 4 identické v 15 pozicích a ekvivalentní v 5 dalších pozicích. Jediné pozice, kde jsou evidentní radikální strukturní změny, jsou na zbytcích 16, 17, 19, 21, 24, 27, 28 a 30. Exendiny mají také 9 dalších zbytků na karboxylovém konci.

Peptidy podobné GLP-1 mohou být vyrobeny chemickou syntézou peptidů na pevné fázi. GLP-1 může být také vyroben konvenčními rekombinantními technikami, které používají standardních metod, které popsali například Sambrook a Maniatis. „Rekombinantní“, tak jak je zde používáno, znamená, že protein pochází z rekombinantních (například mikrobiálních nebo savčích) expresních systémů, které byly geneticky modifikovány, aby obsahovaly expresní gen pro GLP-1 nebo jeho biologicky aktivní analogy.

Peptidy podobné GLP-1 mohou být izolovány a purifikovány z kultur rekombinantních buněk metodami, které zahrnují, ale nejsou omezeny na srážení síranem amonným nebo ethanolem, kyselou extrakci, chromatografii na měničích aniontů nebo kationtů, chromatografíi na fosfocelulóze, chromatografíi s hydrofobní interakcí, afínitní chromatografii, hydroxylapatitovou chromatografíi a lektinovou chromatografíi. Pro finální purifikační kroky může být využita vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC).

Polypeptidy předkládaného vynálezu mohou být přírodní purifikované produkty, nebo produkty postupů chemické syntézy, nebo mohou být produkovány rekombinantními technikami z prokaryotických i eukaryotických hostitelských buněk (například buňky bakterií, kvasinek, vyšších rostlin, hmyzí a savčí buňky v kultuře nebo in vivo). V závislosti na hostitelských buňkách používaných při postupu využívajícím rekombinantní produkci, polypeptidy předkládaného vynálezu nejsou obecně glykosylované, ale mohou být glykosylované.

Aktivita GLP-1 může být určována standardními metodami, obecně postupy vyšetřujícími vazebnou aktivitu vzhledem k receptoru, což zahrnuje zajištění vhodných buněk, které exprimují receptor pro GLP-1 na svém povrchu, například buněčné linie inzulinomu jako buňky RINmSF nebo buňky INS-1. Viz také Mojsov, S. (1992) a EP 0 708 170. Kromě měření specifické vazby molekuly s radioaktivní značkou na membránu s použitím metod radioimunoanalýzy, může být také měřena aktivita cAMP nebo produkce inzulínu závislá na glukóze. V jedné metodě je polynukleotid kódující receptor předkládaného vynálezu použit k transfekci buněk, aby produkovaly receptorový protein pro GLP-1. Tak například mohou být tyto metody použity pro vyhledávání agonisty k receptoru (látka vážící se specificky na daný receptor) kontaktováním takových buněk látkami z nichž se vyhledává a určením zda takové látky generují signál, tj. aktivují receptor.

Pro použití v zde popsaných metodách mohou být použity pro detekci čistoty a identifikaci peptidů podobných GLP-1 polyklonální a monoklonální protilátky. Protilátky takové jako ABGA1178 detekují intaktní neštěpený GLP-1 (1-37) nebo na N konci zkrácený GLP-1 (1-37) nebo (7-36) amid. Jiné protilátky jsou schopny detekce na úplném C-konci molekuly prekurzoru postupem, který umožňuje odečtením vypočítat množství biologicky aktivního zkráceného peptidu, tj. GLP-1 (7-37) nebo (7-36) amidu (Orskov et al. Diabetes, 1993, 42:658-661; Orskov etal. J. Clin. Invest. 1991, 87:415-423).

Další vyhledávací techniky zahrnují použití buněk, které exprimují receptor pro GLP-1, například CHO buňky po transfekci, v systému, který měří extracelulámí pH (vně buňky) nebo iontové změny způsobené aktivací receptoru. Potenciální agonista může být například kontaktován s buňkami, které exprimují receptorový protein pro GLP-1 a může být měřena druhotná odezva, jako například transdukce signálu nebo změny iontové síly nebo změny pH, aby se určilo zdaje potenciální agonista efektivní.

Receptorové proteiny vážící glukagonu podobný peptid-1 používané v předkládaném vynálezu mohou být použity v kombinaci s vhodným farmaceutickým nosičem. Taková kompozice zahrnuje terapeuticky efektivní množství polypeptidu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient. Takové nosiče zahrnují, ale nejsou omezeny na salinický roztok, pufrovaný salinický roztok,

-6CZ 294848 B6 dextrózu, vodu, glycerol, ethanol, laktózu, fosfát, manitol, arginin, trehalózu a jejich kombinace. Tyto přípravky by měly být vhodné pro podávání a rychle zjistitelné těmi, kteří mají potřebné dovednosti v tomto oboru. Peptid GLP-1 může být také používán v kombinaci s činidly, o kterých je známo, že zvyšují poločas životnosti peptidů in vivo, aby se zvýšila nebo prodloužila biologická aktivita peptidů. Například může být na kompozici podle vynálezu před vlastním podáváním kovalentně vázána molekula nebo chemická skupina. Alternativou je podávání činidla zvyšujícího poločas životnosti souběžně s kompozicí. Další možností je, že činidlo které může obsahovat molekulu o níž je známo, že inhibuje enzymovou degradaci peptidů jako GLP-1, může být podáváno souběžně nebo až po podávání kompozice obsahující peptid GLP-1. Taková molekula může být podána například ústy nebo injekčně.

GLP-1 může být podáván intravenózně nebo injekčně a může být podáván kontinuálně nebo jednorázovou injekcí. Totální podávání může být současně s infuzí nebo injekcí glukózy i po ní a před ní. Mohou být použity následující dávky: pro kontinuální infuzí (I.V.) 0,1 pmol/kg/min až 10 pmol/kg/min a pro podkožní (S.C.) 0,1 pmol/kg/min až 75 pmol/kg/min a pro jednorázovou nitrožilní injekci (I.V.) 0,005 nmol/kg až 20 nmol/kg a pro jednorázovou podkožní injekci (S.C.) 0,1 nmol/kg až 100 nmol/kg.

Kontinuální aplikace peptidů GLP-1 je upřednostňovanou metodou podávání. Nicméně GLP-1 může být podáno podkožně, nitrosvalově, interperitoneálně, injekční dávkou s postupným uvolňováním, hlubokým vdechnutím do plic s prodlouženým uvolňováním a rovněž nitrožilní a ústní cestou nebo jinými metodami.

Účinné léčení IGT také snižuje riziko kardiovaskulárních a mozkových cévních příhod. To může být tedy prevencí zajišťovanou pacientům kde je známo vysoké riziko takových příhod.

Popis obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje glukózu, inzulín a GLP-1 v odezvě na podání 75 mg glukózy ústy u pěti subjektů se zhoršenou tolerancí ke glukóze (IGT ·) a u pěti subjektů s neinzulin dependentní diabetes mellitus (NIDDM). Obrázek 1A ukazuje významnou glukózovou odezvu. Obrázek 1B ukazuje inzulínovou odpověď. Obrázek 1C ukazuje odezvu GLP-1.

Obrázek 2 ukazuje srovnání významných vylučovacích rychlostí inzulínu (ISR) a významných koncentrací glukózy v každém subjektu během infuze glukózy s infuzí salinického roztoku (O) nebo infuzi GLP-1 (·). Obrázek 2A ukazuje srovnání subjektů sIGT. Obrázek 2B ukazuje srovnání subjektů s NIDDM.

Obrázek 3 ukazuje profil sekrece glukózy, rychlosti sekrece inzulínu (ISR) a koncentrace inzulínu u dvou subjektů s IGT, subjektů D01 a D02. Obrázky 3A a 3C ukazují odpovědi na infuzi salinického roztoku. Obrázky 3B a 3D znázorňují odpovědi na infuzi s GLP-1.

Obrázek 4 znázorňuje srovnání hladin glukózy, rychlosti vylučování inzulínu (ISR) a hladin inzulínu u dvou subjektů s NIDDM, subjektů D07 a D09. Obrázky 4A až 4C ukazují profily během infuze salinického roztoku. Obrázky 4B a 4D znázorňují profily během infuze obsahující GLP-1.

Obrázek 5 znázorňuje srovnání spektrálních analýz vylučování inzulínu u subjektů během infuzí salinického roztoku a GLP-1. Výsledky znázorněné na levé straně spektrální analýzy jsou subjekty s IGT. Výsledky ukázané na pravé straně spektrální analýzy jsou subjekty s NIDDM.

Obrázek 6 poskytuje srovnání normalizované síly spekter během infuze salinického roztoku a během infuze GLP. Obrázky 6A a 6B ukazují srovnání normalizované spektrální síly během infuze salinického roztoku (6A) a během infuze GLP-1 (6B) u subjektů s IGT (D02). Obráz

-7CZ 294848 B6 ky 6C a 6D ukazují srovnání normalizované spektrální síly během infuze salinického roztoku (6C) a infuze obsahující GLP-1 (6D) u subjektů s NIDDM (D07).

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady dále ilustrují aspekty předloženého vynálezu. Nicméně tyto příklady nemají být v žádném případě brány jako omezení myšlenek a zjištění předkládaného vynálezu na omezení daná příklady, pokud jde o rozsah.

Studie zde popsané byly prováděny na 10 subjektech, které byly rozděleny do dvou skupin na základě odezvy jejich plazmatické glukózy na test tolerance ke glukóze podané ústy (oral glucose tolerance test) při použití kritérií Světové zdravotnické organizace (21) pro definování stupně intolerance ke glukóze. Pět subjektů mělo IGT a pět NIDDM. Pohlaví, věk, index tělesné hmotnosti (BMI), základní (bazální) hladiny glukózy na lačno, dvouhodinová glukóza, inzulín na laěno a HBAlc pro každý subjekt jsou uvedeny v tabulce 2. Subjekty s diabetes byly starší než subjekty s IGT, ale skupiny byly vyrovnané co se týče BMI. Průměrné hladiny glukózy na lačno a koncentrace glykosylovaného hemoglobinu byly ve skupině s IGT nižší ve srovnání se skupinou s NIDDM. Hladiny inzulínu na lačno se mezi oběma skupinami nelišily.

Tabulka 2

Základní klinické parametry subjektů s IGT a NIDDM

id. ozn.	pohlaví	věk	BMI	gluk. na lačno (mM)	2h gluk. (mM)	inz. na lačno (pmol/1)	glyko hemoglob.
IGT
D01	M	50	25,7	5,78	8,99	54,84	5,8
D02	Ž	52	26,8	5,94	10,52	79,80	5,7
D03	M	49	32,2	5,73	9,45	73,68	6,3
D04	M	42	30,6	5,99	9,89	35,53	5,9
D05	M	46	38,2	6,14	11,06	92,88	6,5
prům. ±s.o.		47,8 ±1,7	30,7 ± 2,2	5,92 ±0,07	9,98 ±0,37	67,3 ±10,0	6,04 ±0,15
NIDDM
D06	M	53	26,4	8,81	16,27	30,78	6,7
D07	M	61	27,9	6,87	11,28	81,60	7,2
D08	M	60	34,2	7,66	15,05	37,44	5,9
D09	M	53	27,8	6,86	18,66	47,88	7,7
D10	M	66	23,9	8,34	12,9	24,84	8,1
prům. ± s.o.		58,6 ±2,5	28,1 ±1,7	7,71 ±0,39	14,83 ±1,29	44,5 ±10,0	7,12 ±0,39
hodn. P		P< 0,009	P= 0,36	P< 0,002	P< 0,007	P = 0,15	P< 0,04
		0,009		0,002	0,007		0,04

Hladiny glukózy v plazmě byly měřeny metodou využívající glukóza oxidázu (YSI, 1500 G, Schlag Company, Bergish-Gladbach, Německo). Koeficient variace této metody byl <2%. Inzulín v plazmě byl měřen s použitím Abbottovy mikročásticové enzymové imunoanalýzy. Průměrný koeficient variace uvnitř hodnocení byl 5 %. C-peptid v plazmě byl měřen jak již bylo popsáno v (22), Faber OK, Binder C, Markussen J, Heding Lg, Naithani VK, Kuzuya H, Blix P, Horwitz DL, Rubenstein AH: Characterization of seven c-peptide antisera, Diabetes 27, Suppl.

-8CZ 294848 B6

1:170-177, 1978. Dolní limit citlivosti stanovení byl 0,02 pmol/ml a koeficient variace uvnitř stanovení v průměru 6 %. Glukagon byl měřen pomocí komerčně dostupného kitu pro radioimunoanalýzu (Biermann, Bad Nauheim, Německo) a koeficient variace uvnitř stanovení byl v průměru 8 %. IR-GLP-1 byl měřen s pomocí specifické polyklonální protilátky GA 1178 (Affinity Research, Nottingham, UK) (23). Ta vykazovala 100% reaktivitu s GLP-1 (1-36) amid a se zkráceným GLP-1 (7-36) amid. Imunoreaktivní materiál podobný GLP-1 byl odstraněn ze vzorků plazmy na náplních C-18 s využitím acetonitrilu pro eluci vzorků. Detekční limit stanovení byl 2 fmol/tuba. Antisérum nevykazovalo křížové reakce s GIP, pankreatickým glukagonem, glicentinem, oxyntomodulinem nebo GLP-2. Koeficienty variace uvnitř a mezi stanoveními činily 3,4 %, resp. 10,4 %.

Všechny výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM (směrodatná odchylka, s.o.). Analýza dat byla prováděna s použitím statistického analytického systému (SAS Version 6 Edition, for Personál Computers, SAS Institute, lne., Cary, NC). Význam rozdílů uvnitř jednotlivých indukcí pomocí infuze GLP-1 byl stanoven s použitím párových t testů. Rozdíly byly považovány za významné pokud bylo P<0,.05.

Byly použity standardní kinetické parametry pro odstranění (clearance) C-peptidu upravené pro věk, pohlaví a povrch těla (24), Van Cauter E, Mestrez F, Sturis J, Polonsky KS. Odhad rychlosti vylučování inzulínu z hladin C-peptidu: srovnání individuálních a standardních kinetických parametrů pro odstranění C-peptidu: Diabetes 41:368-377, 1992. Tyto parametry byly použity pro odvození ISR z koncentrací C-peptidu v plazmě pomocí dekonvoluce, jak již bylo popsáno v (25,26), v 15 minutových intervalech, což odpovídalo intervalům mezi odběry vzorků krve.

Subjekty s diabetes byly léčeny pouze dietou s výjimkou subjektu D07, který byl dříve léčen ústně podávaným hypoglykemickým přípravkem, jehož podávání bylo přerušeno 4 týdny před studií. Žádnému z diabetických pacientů nebyl nikdy podán inzulín. U všech subjektů byla dva týdny před studií zahájena dieta na udržení hmotnosti obsahující přinejmenším 200 g karbohydrátů denně.

Každý subjekt byl sledován ve třech oddělených případech. Všechny studie byly prováděny po 12 hodin trvajícím hladovění přes noc začínajícím v 0700, pokud není uvedeno jinak, v případě ležících subjektů. Na každé předloktí byl umístěn intravenózní katetr, jeden pro odebírání vzorků krve a druhý pro podávání glukózy a GLP-1 podle potřeby. Při všech experimentech byla ruka se vzorkovacím katetrem udržována ve vyhřívané přikrývce, aby se zajistila arterializace žilní krve. V následujících příkladech byl GLP-1 podáván subjektům ve formě GLP-1 (7-36) amid.

Příklad 2 (Test na toleranci k ústně podávané glukóze)

Byly odebírány vzorky krve pro měření glukózy, C-peptidu, inzulínu, glukagonu a GLP-1 v 30 minutových intervalech po dobu 120 minut, potom co bylo podáno 75 mg glukózy (Boehringer Mannheim, Mannheim, Německo). Byly vypočteny změny ploch pod křivkou (AUC) od 0 do 120 minut glukózu, C-peptid, glukagon a GLP-1. Koncentrace glukózy byly použity pro definování stupně intolerance ke glukóze podle kritérií světové zdravotnické organizace (WHO).

Odezva skupiny s IGT a s NIDDM na ústně podanou glukózu je shrnuta v tabulce 3.

Odezvy glukózy, inzulínu a GLP-1 u subjektů po podání 75 mg glukózy ukazuje obrázek 1. Hodnota AUC pro glukózu od 0 do 120 minut byla nižší ve skupině s IGT, ale AUC pro inzulín, C-peptid, glukagon a GLP-1 se nelišily.

-9CZ 294848 B6

Tabulka 3

Odezva na glukózu podanou ústy

2hAUC	IGT n=5	NIDDM n=5
glukóza (mM. min/1)	1290 ±41	1628 ±76*
inzulin (pmol.min/1)	53.750 ± 10.648	26.083 ± 10.047
C-peptid (pmol. min/1)	293 ± 40	180 ±48
glukagon (ng. min/1)	8130±1324	6858 ± 920
GLP-1 (pmol. min/1)	805 ± 141	983±111

p<0,05 pro IGT vs NIDDM

Když byly průměry ISR vyneseny proti průměrným hladinám glukózy, bylo pozorováno, že GLP-1 způsobuje významné snížení hladin glukózy bez významnějších změn průměrů rychlostí vylučování inzulínu (obrázek 2).

Příklad 3 (podávání oscilující glukózové infuze)

Periferální podávání glukózy v oscilujícím módu způsobilo pravidelné oscilace glukózy v plazmě. V normálních subjektech jsou β-buňky schopné detekovat a odpovídat na opakované zvyšování a snižování koncentrace glukózy souběžnými změnami vylučování inzulínu. Toto upravení oscilací vylučování inzulínu v závislosti na oscilacích glukózy se nazývá „vyškolení“ (entrainment). Nedostatek vyškolení na glukózu je projevem dysfunkce β-buněk u osob s IGT a mírným NIDDM.

Použili jsme protokol nízko dávkové oscilující glukózové infuze, protože je to velmi citlivý test schopnosti β-buněk vnímat a odpovídat na malé změny koncentrací plazmatické glukózy. Tento test zkouší integritu zpětnovazebně smyčky spojující glukózu a vylučování inzulínu. Normální odpověď vyžaduje neporušenou schopnost vnímat glukózu.

Aby se určilo, zda byly β-buňky schopné detekovat oscilace glukózy a odpovídat na ně, byla infuze glukózy prováděna v oscilačním módu s malým objemem salinického roztoku po dobu 12 hodin. Amplituda podávaných oscilací byla 33 % nad a pod průměrnou hodnotu 4 mg/kg/min a jejich periodicita činila 144 minut.

Aby se stanovil účinek GLP-1 na schopnost β-buněk odpovídat na oscilace glukózy, byla infuze glukózy prováděna stejným způsobem a GLP-1 bylo infuzováno konstantní rychlostí 0,4 pmol/kg/min po celých 12 hodin. Každá studie se skládala z počáteční dvouhodinové periody (0700-0900), aby mohlo být dosaženo ustáleného stavu. Potom bylo pokračováno následnou periodou trvající 10 hodin (0900-1900), během které byly v 15 minutových intervalech odebírány vzorky krve pro stanovení glukózy, inzulínu, C-peptidu a glukagonu a v 60 minutovým intervalech pro stanovení GLP-1.

Průměrné hladiny glukózy byly významně nižší v obou skupinách při infuzi GLP-1 ve srovnání s infuzi soli, s průměrným poklesem 2,4 ± 0,6 mM u subjektů s IGT (P<0,02) a 5,2 ± 0,5 mM u diabetiků (P<0,0005). Navzdory významnému snížení koncentrace plazmatické glukózy, nebyly u obou skupin průměry ISR významně odlišné během infuze GLP-1 ve srovnání s infuzi salinického roztoku (tabulka 4).

-10CZ 294848 B6

Tabulka 4

Průměrné odezvy glukózy a ISR na 12 hodinovou infuzi soli nebo GLP-1

id. označ.	prům. gluk. 12 h inf. šalin.	prům. gluk. 12 h inf. GLP-1	prům. ISR 12 h inf. šalin.	prům. ISR 12 h inf. GLP-1
IGT
D01	7,49	6,48	376,1	390,9
D02	8,34	6,06	457,9	465,9
D03	10,16	6,46	900,2	1042,7
D04	7,90	6,36	328,5	365,0
D05	10,06	6,37	798,0	1005,8
průměr	8,79	6,35	572,1	654,2
±s.o.	±0,56	±0,08	±116,1	±152,1
NIDDM
D06	16,73	11,53	232,3	477,7
D07	17,28	10,51	640,3	715,4
D08	9,94	6,24	615,6	487,7
D09	13,95	8,84	366,5	412,5
D10	15,05	9,90	346,2	448,9
průměr	14,59	9,40	440,2	508
±s.o.	±1,3	±0,9*	±80,1	±53,4

*P<0,05, podle párového t testu, odkazuje ke srovnání mezi infuzi salinického roztoku a GLP-1.

Průměrné hladiny inzulínu během infuze GLP-1 ve srovnání s infuzi salinického roztoku byly také zachovány; zvýšily se o 102 ± 90pmol/l sP=0,32 u subjektů sIGT a o 7± 12pmol/L s P=0,56 u subjektů s NIDDM. Průměrné hladiny glukagonu se také nelišily během infuze GLP-1 ve srovnání s infuzi salinického roztoku (39,3 ± 5,4 pg/ml proti 39,4 ±5,9 pg/ml; P=0,94) u subjektů s IGT (46,4 ± 3,2 pg/ml proti 42,8 ± 5,4 pg/ml; P=0,4) u subjektů s NIDDM. Hladiny GLP-1 dosažené během infuze GLP-1 byly 15,46 ± 4,6 pmol/1 ve srovnání s 2,0 ± 0,8 pmol/1 během infuze salinického roztoku. (P<0,001). Tyto úrovně odpovídají postprandiálním fyziologickým hladinám.

Příklad 4 (vztah mezi glukózou a ISR u jednotlivých subjektů sIGT)

V normálních subjektech je každý pulz (náhlá změna koncentrace) glukózy úzce spojen s pulzem ISR (odpověď sekrecí inzulínu). Jak již bylo ukázáno, je toto spojení u subjektů s IGT poškozeno. Profily glukózy a ISR během oscilující glukózové infuze salinického roztoku jsou od jednoho reprezentativního subjektu s IGT, D02 ukázány v obrázku 3A a 3C. Tyto výsledky demonstrují, že u subjektů s IGT se během infuze salinického roztoku ztrácí úzké spojení mezi glukózou a ISR a dochází k mnoha oscilacím v ISR, které nezávisí na glukóze. V přítomnosti fyziologických postprandiálních hladin GLP-1 (obrázky 3B a 3D) je model odpovědí vylučováním inzulínu na glukózu zlepšen u subjektů s IGT tak, že každý pulz glukózy je následován pulzem v ISR. Tak GLP-1 zlepšuje schopnost β-buněk reagovat na exogenní infuzi glukózy u subjektů s IGT.

Příklad 5 (Vztah mezi glukózou a ISR u jednotlivých subjektů sNIDDM)

Obrázek 4 ukazuje profily glukózy i ISR jednoho subjektu s NIDDM, D07. Ve znatelném protikladu k subjektům s IGT, navzdory snížení koncentrací plazmatické glukózy a zachování ISR nebyl během infuze GLP-1 zlepšen model odpovědí sekrecí inzulínu na glukózu (obráz

-11 CZ 294848 B6 ky 4B a 4D) s mnoha přetrvávajícími oscilacemi ISR nezávislými na glukóze. Profily glukózy a ISR během oscilující glukózové infuze salinického roztoku ukazují obrázky 4Aa 4C.

Příklad 6 (efekt GLP-1 na spektrální sílu v IGT a NIDDM)

Aby se zjistilo, zda byla u jednotlivých subjektů pomocí glukózy „nacvičena“ sekrece inzulínu, byly aktuální profily sekrece inzulínu analyzovány spektrální analýzou. Analýza spektrální síly byla použita k hodnocení přítomnosti úzké vazby mezi oscilacemi koncentrací glukózy a oscilacemi v ISR. Tato metoda hodnotí pravidelnost oscilací sekrece inzulínu při předem stanovené frekvenci. Spektrální píky odpovídají dominantní periodicitě a výšky píků odpovídají spektrální síle. Každé spektrum bylo normalizováno s předpokladem, že totální variance každé série je 100 % a bylo vyjádřeno jako normalizovaná spektrální síla.

Průměrná normalizovaná spektrální síla pro glukózu u subjektů s IGR činidla 11,2±1,5 během infuze salinického roztoku a 13,2±1,6 během infuze s GLP-1 (P=0,19) a u subjektů s NIDDM 6,5±1,8 během infuze salinického roztoku a 9,8±0,7 během infuze s GLP-1 (P=0,18). Obr. 5 jasně demonstruje, že infuze GLP-1 u subjektů s IGT zlepšila odpovědi sekrecí inzulínu na oscilace plazmatické glukózy, což vedlo k většímu stupni „nacvičení“ sekrece inzulínu v odpovědi na glukózu. Tento účinek byl kvantifikován srovnáním normalizované spektrální síly profilů vylučování inzulínu. Spektrální síla pro ISR se zvýšila z 2,9±1,4 během solné infuze na 8,9±1,7 během infuze GLP-1; (P<0,006) a nezměnila u subjektů s NIDDM (l,l±0,5 na l,5±0,8; P=0,6).

Spektrální analýza oscilujících glukózových profilů potvrdila existenci píků v spektru plazmatické glukózy ve 144 minutách odpovídajících periodě exogenní glukózové infuze. Jednotlivé spektrální síly pro glukózu a ISR u jednoho subjektu sIGT (obrázky 6A a 6B) au jednoho subjektu s NIDDM (obrázky 6C a 6D) během solné infuze a během infuze GLP-1 jsou ukázány na obrázcích 6A až 6D. Tato data odpovídají datům, která ukazují obrázky 3C až 3D a obrázky 4A a 4B. Spektrální síla se zvýšila z 0,6 na 8,9 u subjektu s IGT a byla minimálně změněna z 0,28 na 1,51 u subjektu s NIDDM. Píky se ve spektru plazmatické glukózy objevily ve 144 minutách. Během solné infuze se dominantní spektrální pík pro ISR nevyskytoval ve 144 minutách, ale spíše byl v 0,2. spektrální síla s infuzí GLP-1 činidla 1,5.

Během infuze salinického roztoku bylo špatné „vycvičení“ (obr. 3A), čemuž odpovídá, že spektrální síla pro ISR ve 144 činila 0,6. Během infuze GLP-1 (obr. 3B) se periodicita dominantního spektrálního píku v ISR vyskytovala ve 144 minutách, což demonstruje, že GLP-1 způsobilo vycvičení β-buněk v tomto subjektu.

Průměrná hodnota normalizované spektrální síly v kontrolních subjektech (index tělesné hmotnosti tj. BMI 28,3) s normální tolerancí ke glukóze činila 7,2 ± 0,6(9).

Výsledky této studie ukázaly, že kontinuální infuze fyziologických postprandiálních hladin GLP-1 redukovaly koncentrace plazmatické glukózy a stimulovaly sekreci inzulínu u subjektů s IGT a NIDDM. Nejdůležitější je, že GLP-1 obnovil schopnost β-buněk vnímat a odpovídat na plazmatickou glukózu ve všech subjektech s IGT (kvantifikováno normalizovanou spektrální silou), s měnící se odpovědí u subjektů s již rozvinutým stavem NIDDM.

Možný mechanizmus, kterým je u β-buněk zlepšena funkce pomocí GLP-1 zahrnuje regulaci prvků citlivých ke glukóze, eliminace glukotoxicity a zlepšení inzulínové rezistence. GLP-1 a glukóza uplatňují synergickou inzulinotropní akci na β-buňkách zahrnující stimulaci tvorby cyklického AMP, vylučování inzulínu, biosyntézu inzulínu a expresi genu kódujícího proinzulin.

Tyto příklady ukazují, že kontinuální infuze fyziologických hladin GLP-1 snižují koncentrace plazmatické glukózy a stimulují vylučování inzulínu u subjektů s IGT a NIDDM. Nejdůležitější

- 12CZ 294848 B6 je, že GLP-1 obnovuje schopnost β-buněk vnímat a odpovídat na malé změny koncentrací plazmatické glukózy u subjektů s IGT a jen s proměnlivou odezvou u subjektů s NIDDM. U subjektů s IGT jsme pozorovali významné zvýšení spektrální síly měření funkce β-buněk, které nezáviselo na nastavení pro změny citlivosti k inzulínu.

SEZNAM SEKVENCÍ

<110>	Goke, Burkhard Byrne, Maria
<120>	Glucagon-Like Peptide-1 Improves the Ability of the B-Cell to Sense and Respond to Glucose in Subjects with Impaired Glucose Tolerance
<130>	P03986WO0
<140>	PCT/US99/10040
<141>	1999-05-07
<160>	13
<170>	Patentln Ver. 2.0
<210>	1
<211>	37
<212>	PRT
<213>	savčí
<400>	1

His

Asp

Glu

Phe

Glu Arg His

Ala

Glu

Gly Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

1

5

10

15

Ser

Tyr

beu

Glu Gly Gin

Ala

Lys Glu

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

20

25

30

Val Lys Gly Arg Gly 35
<210>	2
<211>	36
<212>	PRT
<213>	savčí

-13 CZ 294848 B6 <400> 2

His

Ser

Val

Asp

Ser

Lys

<210>	3
<211>	31
<212>	PRT
<213>	savčí
<400>	3

His Ala

Gin Ala

<210>	4
<211>	30
<212>	PRT
<213>	savčí
<400>	4

His Ala

Gin Ala

Glu

Tyr

Gly

Glu

Ala

Glu

Ala

Phe

Leu

Arg

Gly

Lys

Glý

Lys

Glu

Thr

Glu

Thr

Glu

Arg

Gly

Phe

His

Gin

Thr

Ile

Thr

Ile

Ala

Ser

Ala

Ser

Ala

Glu

Ala

Asp

Trp

Asp

Trp

Gly

Lys

Val

Leu

Val

Leu

Thr

Glu

Ser

Val

Ser

Val

Phe

Ser

Lys

Ser

Lys

Thr

Ile

Tyr

Gly

Tyr

Ser

Ala

Leu

Arg

Leu

Gly Arg

ASp

Trp

Glu

Gly

Glu

Val

Leu

Gly

- 14CZ 294848 B6

<210>	5
<211>	29
<212>	PRT
<213>	savčí
<400>	5

Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala
1	5	10	15

Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu

20
<210>	6
<211>	28
<212>	PRT
<213>	savčí
<400>	6
Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
	1 5

val Lys Gly Arg Gly

Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu

Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala

15

Val Lys Gly Arg

<210>	7
<211>	39
<212>	PRT
<213>	savčí
<400>	7

His Ser Asp Gly Thr Phe

Thr Ser Asp Leu Ser Lys

Gin Met Glu Glu

Glu Ala Val Arg Leu Phe

Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

- 15CZ 294848 B6

<210>	8
<211>	31
<212>	PRT
<213>	Heloderma suspectum

<400> 8

Asp Leu Ser Lys Gin Met

Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe

Ile Glu

Trp Leu Lys Asn. Gly Gly

Pro Ser Ser Gly Ala

Pro Pro Pro

Ser

ío <210>	9
<211>	39
<212>	PRT
<213>	Heloderma suspectum

<400> 9

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr	Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu
1	5	10	15

Glu Ala Val Arg Leu Phe

Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

<210>	10
<211>	38
<212>	PRT
<213>	Heloderma suspectum

- 16CZ 294848 B6 <400> 10

His Ser Asp Ala Thr Phe Thr Ala Glu Tyr Ser Lys	Leu Leu Ala Lys
1	s	10	15

Leu Ala	Leu Gin Lys Tyr 20	Leu Glu Ser Ile Leu Gly Ser Ser Thr Ser
25	30
Pro	Arg	Pro	Pro	Ser	Ser

	35
<210>	11
<211>	37
<212>	PRT
<213>	Heloderma suspectum
<400>	11

His Ser Asp Ala Thr Phe Thr Ala Glu Tyr Ser Lys Leu Leu Ala Lys
1	5	10	15

Leu Ala Leu Gin Lys Tyr	Leu Glu Ser Ile Leu Gly Ser Ser Thr Ser
20	25	30

Pro Arg Pro Pro Ser
	35
<210>	12
<211>	35
15 <212>	PRT
<213>	Heloderma suspectum

- 17CZ 294848 B6 <400> 12

His

Ser Asp Ala Ile Phe

Thr Glu Glu Tyr Ser Lys

Leu Leu Ala Lys

Leu Ala

Leu Gin Lys Tyr Leu Ala Ser Ile

Leu Gly Ser Arg

Thr Ser

Pro Pro Pro

	35
<210>	13
<211>	35
<212>	PRT
<213>	Heloderma suspectum
<400>	13

His Ser Asp Ala Ile Phe	Thr Gin Gin Tyr Ser Lys	Leu Leu Ala Lys
1	5	10	15

Leu Ala Leu Gin Lys Tyr Leu Ala Ser Ile Leu Gly	Ser Arg Thr Ser
20	25	30

Přo Pro Pro

- 18CZ 294848 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití kompozice, zahrnující sloučeninu, která se váže na receptor pro glukagonu podobný peptid-1, a farmaceutický nosič pro výrobu léčiva pro léčbu zhoršené tolerance glukózy u subjektu, u něhož nebyl diagnostikován diabetes mellitus se závislostí na inzulínu.
2. Použití podle nároku 1, kde kompozice obsahuje sloučeninu v množství, účinném pro zvýšení citlivosti a odpovědi pankreatických β-buněk na změny plazmatické glukózy, měřeno načasováním a množstvím sekrecí inzulínu v odpověď na zvýšení plazmatické glukózy u člověka se zhoršenou tolerancí glukózy.
3. Použití podle nároku 1, kde kompozice obsahuje sloučeninu v množství, účinném pro zvýšení pravidelnosti inzulínových odpovědí a jejich amplitudy v reakci na změny plazmatické glukózy.
4. Použití podle nároku 1, kde kompozice obsahuje sloučeninu v množství, účinném pro upoždění nebo zastavení ztráty kontroly plazmatické glukózy a vývoje diabetů mellitus nezávislého na inzulínu.
5. Použití podle nároku 1, kde kompozice obsahuje sloučeninu v množství, účinném pro zlepšení nácviku sekrece inzulínu β-buňkami v odpověď na oscilace exogenní glukózy.
6. Použití podle nároku 1, kde kompozice obsahuje sloučeninu v množství, účinném pro zvýšení normalizace sekrečních modelů inzulínu při zhoršené toleranci glukózy.
7. Použití podle nároku 1, kde kompozice obsahuje sloučeninu v množství, účinném pro snížení hladin inzulínu v plazmě u jedince se zhoršenou tolerancí glukózy.
8. Použití podle nároku 1, kde kompozice obsahuje sloučeninu v množství, účinném pro snížení rezistence k inzulínu u jedince se zhoršenou tolerancí glukózy.
9. Použití kompozice podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, kde sloučenina vážící se na receptor je zvolena z (a) peptidu, který zahrnuje aminokyselinovou sekvenci glukagonu podobného peptidu-1, a (b) variantního peptidu zahrnujícího aminokyselinovou sekvenci, která se liší od sekvence glukagonu podobného peptidu-1 jednou nebo více substitucemi, delecemi nebo inzercemi.
10. Použití kompozice podle nároku 9, kde receptor vážící sloučeninou je glukagonu podobný peptid-1.
11. Použití kompozice podle nároku 10, kde receptor vážící sloučeninou je glukagonu podobný peptid-1 (7-37), který má sekvenci His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (SEQ. ID NO:3).
12. Použití kompozice podle nároku 10, kde receptor vážící sloučeninou je amid glukagonu podobného peptidu-1 (7-36), který má sekvenci His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg (NH₂) (SEQ. IDNO:4).
13. Použití kompozice podle nároku 10, kde receptor vážící sloučeninou je variantní peptid, ve kterém se kombinace substitucí, delecí a inzercí v sekvenci aminokyselin neliší více než 10 aminokyselinami od aminokyselinové sekvence glukagonu podobného peptidu-1.

-19CZ 294848 B6
14. Použití kompozice podle nároku 9, kde receptor vážící sloučenina je exprimována polynukleotidem.
15. Použití kompozice podle nároku 9, kde receptor vážící sloučeninou je organická molekula s molekulovou hmotností ne větší než asi 5000.
16. Použití kompozice podle kteréhokoli z nároků 9 až 15, kde podávání při uvedené léčbě je vybráno ze skupiny sestávající z podávání intravenózního, subkutánního, intramuskulárního, interperitoneálního, depotního injekčního s postupným uvolňováním, hluboké plicní insuflace s postupným uvolňováním, podávání bukálního a náplastí.
17. Použití kompozice podle kteréhokoli z nároků 9 až 16, kde léčba dále zahrnuje podávání činidla, které zvyšuje poločas životnosti uvedené receptor vážící sloučeniny in vivo.
18. Použití kompozice podle nároku 17, kde činidlo je určeno k podávání současně s kompozicí.
19. Použití kompozice podle nároku 17 nebo 18, kde činidlo je kovalentně navázáno na receptor vážící sloučeninu.
20. Použití kompozice podle nároku 3, kde uvedená léčba dále zahrnuje intravenózní podávání činidla, které zvyšuje poločas životnosti uvedené receptor vážící sloučeniny in vivo, přičemž rozmezí dávky je 0,3 až 2,0 pmol/kg za minutu.
21. Použití kompozice podle nároku 3, kde uvedená léčba dále zahrnuje subkutánní podávání činidla, které zvyšuje poločas životnosti uvedené receptor vážící sloučeniny in vivo, přičemž rozmezí dávky je 1,0 až 20,0 pmol/kg za minutu.
22. Použití kompozice podle nároku 4, kde uvedená léčba dále zahrnuje intravenózní podávání v rozmezí dávky 0,1 až 10,0 pmol/kg za minutu.
23. Použití kompozice podle nároku 4, kde uvedená léčba dále zahrnuje intravenózní podávání v rozmezí dávky 0,1 až 75,0 pmol/kg za minutu.
24. Použití kompozice, zahrnující sloučeninu vážící se na receptor pro glukagonu podobný peptid-1 a farmaceutický nosič, pro výrobu léčiva pro léčbu jedince, jehož symptomy indikují zvýšené riziko kardiovaskulární příhody před nástupem diabetů mellitus nezávislého na inzulínu, kde kompozice obsahuje sloučeninu v množství účinném pro zvýšení pravidelnosti inzulínových odpovědí a jejich amplitudy v reakci na změny v plazmatické glukóze a pro snížení hladin inzulínu v plazmě.
25. Použití kompozice, zahrnující sloučeninu vážící se na receptor pro glukagonu podobný peptid-1 a farmaceutický nosič, pro výrobu léčiva pro léčbu jedince, jehož symptomy indikují zvýšené riziko cerebrovaskulární příhody před nástupem diabetů mellitus nezávislého na inzulínu, kde kompozice obsahuje sloučeninu v množství účinném pro zvýšení pravidelnosti inzulínových odpovědi a jejich amplitudy v reakci na změny v plazmatické glukóze a pro snížení hladin inzulínu v plazmě.
26. Použití kompozice, zahrnující exendin nebo sloučeninu od něj odvozenou a farmaceutický nosič, pro výrobu léčiva pro léčbu zhoršené tolerance glukózy u jedinců, u kterých nebyl diagnostikován diabetes mellitus.
27. Použití kompozice, zahrnující exendin nebo sloučeninu od něj odvozenou a farmaceutický nosič, pro výrobu léčiva pro snížení rizika cerebrovaskulární příhody související se zhoršenou tolerancí glukózy.

-20CZ 294848 B6
28. Použití podle nároku 26 nebo 27, kde kompozice obsahuje exendin nebo sloučeninu od něj odvozenou v množství pro

a) zvýšení citlivosti a odpovědi pankreatických β-buněk na změny plazmatické glukózy,

b) zvýšení pravidelnosti inzulínových odpovědí a jejich amplitudy v reakcí na změny plazmatické glukózy,

c) zpoždění nebo zastavení ztráty kontroly a vývoje diabetů mellitus nezávislého na inzulínu,

d) zlepšení nácviku sekrece inzulínu β-buňkami v odpověď na oscilace exogenní glukózy,

e) zvýšení normalizace sekrečních modelů inzulínu,

f) snížení hladin inzulínu v plazmě nebo

g) snížení rezistence k inzulínu.
29. Použití kompozice podle kteréhokoli z nároků 26 až 28, kde exendinem je exendin-4, exendin-3 nebo od nich odvozený variantní period.
30. Použití kompozice podle kteréhokoli z nároků 26 až 29, kde exendin nebo sloučenina od něj odvozená je exprimována polynukleotidem.
31. Použití kompozice podle kteréhokoli z nároků 26 až 30, kde léčivo dále zahrnuje činidlo, které zvyšuje poločas exendinu nebo sloučeniny od něj odvozené in vivo.
32. Použití kompozice podle nároku 31, kde činidlo je kovalentně vázáno na exendin nebo sloučeninu od něj odvozenou.
33. Použití kompozice podle kteréhokoli z nároků 26 až 30, kde léčby dále zahrnuje podávání činidla, které zvyšuje poločas exendinu nebo sloučeniny od něj odvozené in vivo.
34. Použití kompozice podle kteréhokoli z nároků 26 až 33, kde léčivo je ve formě pro intravenózní, subkutánní, intramuskulární, interperitoneální, podávání, depotní injekční podávání s postupným uvolňováním, hlubokou plicní insuflaci s postupným uvolňováním, podávání bukální nebo náplastí.
35. Použití kompozice podle kteréhokoli z nároků 26 až 34, kde exendin nebo sloučenina od něj odvozená je podávána v rozmezí dávek 0,005 mmol/kg až 20mmol/kg.