DE69917684T2

DE69917684T2 - Betulinsäure-derivate mit antiangiogener wirkung, verfahren zur herstellung solcher derivate und deren verwendung für die behandlung tumorassoziierter angiogenese

Info

Publication number: DE69917684T2
Application number: DE69917684T
Authority: DE
Inventors: Manu Jaggi; Sunder Haus Khas RAMADOSS; Praveen Rajendran; Jamshed Mohammad Patpargunj AHMED SIDDIQUI
Original assignee: Dabur Research Foundation
Current assignee: Dabur Research Foundation
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2019-09-10
Also published as: BR9917495A; WO2001018029A1; DE69917684D1; KR100618100B1; EP1218402B1; CN1373769A; JP2003508543A; AU2000100A; ES2224735T3; CA2384433C; ATE267837T1; AU780148B2; KR20020092908A; EP1218402A1; CN1152046C; CA2384433A1

Description

Diese Erfindung betrifft neue Betulinsäurederivate und eine Zusammensetzung, enthaltend Betulinsäurederivate, Verfahren zur Herstellung von solchen Betulinsäurederivaten. Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung von neuen Betulinsäurederivaten zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zum Inhibieren und/oder Verhindern von Tumor-assoziierter Angiogenese, genauer Angiogenese, die mit Prostata-, Lungen-, Ovarial- und Colon-Krebs assoziiert ist, nützlich ist.
Hintergrund der Erfindung
Betulinsäure ist ein pentazyklisches Triterpen. Sie kann aus mehreren natürlichen (botanischen) Quellen gewonnen werden. Sie kann ebenso aus Betulin chemisch gewonnen werden, einer Substanz, die in großen Mengen in der äußeren Rinde von weißen Birken (Betula alba) gefunden wird. Es ist gefunden worden, daß Betulinsäure selektiv humane Melanomzellen tötet (Nature Medicine, Band 1(10), 1995, WO 96/29068). Das cytotoxische Potential von Betulinsäure wurde unter Verwendung von drei humanen Melanomzellinien getestet, Mel-1, Mel-2 und Mel-4. Das Wachstum aller Zellinien wurde signifikant durch die Behandlung mit Betulinsäure inhibiert. Die Wirksamkeit von Betulinsäure gegen Melanomkrebszellen wurde ebenso unter Verwendung von Mäusen ohne Thymus getestet. Sie scheint durch Induzierung von Apoptose in Krebszellen zu wirken.
Die Anti-Krebsaktivität von Betulinsäure und einiger ihrer Derivate ist ebenso unter Verwendung von Maus-Sarkom-180-Zellen demonstriert worden, die s.c. in nackten Mäusen implantiert waren ( JP 87,301,580 ), die Inhibition des Wachstums von lymphocytischen p388-Leukämiezellen in vitro (Choi.Y-H et al., PLanta Medica Band XL VII,511-513, 1988) und das Inhibieren des Wachstums von Krebszellen, insbesondere durch Inhibieren der Ornithindecarboxylase (Yasukawa, K et al, Oncology 48:72-76, 1991; WO 95/04526).
Vor kurzem haben die Anmelder über eine Anti-Leukämie- und Anti-Lymphom-Aktivität und Anti-Prostata-, Anti-Lungen- und Anti-Ovarial-Krebs-Aktivität von Betulinsäure und ihrer Derivate mit ED₅₀-Werten von weniger als 4,0 μg/ml berichtet. (US-Anmeldung Nr. 09/040,856, eingereicht am 18. März, 1998, und US-Anmeldung Nr. 09/251,309, eingereicht am 17. Februar 1999). Weiterhin wurde über eine anti-angiogene Aktivität von Betulinsäure und ihrer Derivate vor kurzem durch die Anmelder in US-Anmeldung Nr. 09/166,809 berichtet, eingereicht am 6. Oktober 1998, wobei gezeigt wurde, daß Betulinsäure und ihre Derivate die Bildung von Tubus-artigen Struktwen („tube-like-structures") (TLS) von Endothelzellen bei Wachstum auf einer mit Matrigel beschichteten Oberfläche inhibierten. Es wurde gezeigt, daß die anti-proliferative Aktivität auf Endothelzellen zusammen mit der Anti-TLS-Aktivität die anti-angiogene Aktivität von Betulinsäwederivaten nahelegt.
Anderson et al (WO 95/04526) offenbaren, daß für bestimmte Krebse, um sich durch den gesamten Körper eines Patienten auszubreiten, ein als Metastase bezeichneter Prozeß, Zell-Zell-Adhäsion stattfinden muß. Insbesondere müssen Krebszellen von ihrer Ursprungsstelle wandern und Zugang zu Blutgefäßen erhalten, um eine Kolonisierung an entfernten Stellen zu erleichtern. Es ist bekannt, daß bestimmte Krebszellen an E-Selektin über E-Selektin-Liganden auf ihrer Zelloberfläche anhängen, und dieses Ereignis ist ein Bestandteil des Metastasen-Prozesses. Betulinsäure und ihre Derivate stören die Selektin-Bindung. Betulinsäure inhibierte die P-Selektin-Bindung an 2,3, sLex, eine Chemikalie, von der bekannt ist, daß sie an P-Selektin bindet, mit einer IC₅₀ von 125 μM. Ebenso inhibierte sie die P-Selektin-Bindung an HL-60-Zellen in einer Dosis-abhängigen Weise mit einer IC₅₀ von 0,75 mM. Betulinsäure und Derivate stören ebenso signifikant die Bindung an Colon-Krebszellen, LS 174T an E-Selektin.
Dasgupta et al (WO 96/29068) offenbarten ein Verfahren und Zusammensetzung zur Inhibierung von Tumorwachstum unter Verwendung der aktiven Verbindung Betulinsäure. Die Erfindung stellt ein Verfahren und eine Zusammensetzung zum Inhibieren von Tumorwachstum und insbesondere zum Inhibieren des Wachstums von Melanom unter Verwendung einer aus natürlichen Produkten stammenden Verbindung bereit. Die Erfindung stellt ebenso ein Behandlungsverfahren unter Verwendung von Betulinsäure bereit, um das Wachstum oder die Ausbreitung von Krebszellen zu verhindern, wobei Betulinsäure in einer topischen Zubereitung aufgebracht wird.
Pezzuto et al (US-Patent 5,869,535) offenbaren ein Verfahren und Zusammensetzung für Sonden, die das Tumorwachstum inhibieren, unter Verwendung von Betulinsäure oder eines Derivats davon. Betulinsäure ist aus der Stammrinde von Ziziphus mauritiana isoliert worden, indem sie ein selektives cytotoxisches Profil gegen menschliches Melanom in einer Testgruppe von menschlichen Krebszellinien vermittelt, wobei eine Bioassay-gesteuerte Fraktionierung auf der Grundlage des Bioaktivitätsprofils unter Verwendung von kultivierten menschlichen Melanomzellen (MEL-2) zur Überwachung durchgeführt wurde und Betulinsäure davon als die aktive Verbindung erhalten wurde. Die resultierende Betulinsäure kann verwendet werden, um Tumorwachstum zu inhibieren, oder kann in ein Derivat umgewandelt werden, das Tumorwachstum verhindert oder inhibiert. Die Erfindung stellt ebenso ein Behandlungsverfahren unter Verwendung von Betulinsäure bereit, um das Wachstum oder das Ausbreiten von Krebszellen zu verhindern, wobei Betulinsäure oder -Derivate davon in einer topischen Zubereitung aufgetragen werden. Es wurde gefunden, daß Betulinsäure das in-vitro-Waehstum von MEL-2-Zellen inhibiert. Jedoch wurde keine der anderen getesteten Zellinien [A431 (Plattenepithelzellen), BC-1 (Brust), COL-2 (Colon), HT1080 (Sarcom), KB (humanes orales epidermoides Carcinom), LNCaP (Prostata), LU-1 (Lunge), U373 (Gliom) und ZR-75-1 (Brust)] durch Betulinsäure betroffen (d.h. ED₅₀-Werte von größer als 20 μg/ml).
Lee et al (WO 96/39033) offenbaren, daß Betulinsäure und Dihydrobetulinsäureacylderivate eine potente anti-HIV-Aktivität haben. Die C₃-Hydroxy-, C₁₇-Carboxylsäure- und C₂₀-Exomethylengruppen sind modifiziert worden. Anti-HIV-Assays weisen auf eine potente anti-HIV-Aktivität von Betulinsäure und Dihydrobetulinsäurederivaten in akut infizierten H9-Lymphocyten mit EC₅₀-Werten von weniger als 1,7 × 10^–5 μM hin.
WO 98/51294 und WO 98/51293 offenbaren Betulinsäureverbindungen, die in der Behandlung von Krebs verwendet werden sollen.
Aufgaben der Erfindung
Diese Erfindung stellt neue Betulinsäurederivate und Zusammensetzungen bereit, die diese mit pharmazeutisch akzeptablen Zusatzstoffen, Verdünnungsmitteln, Trägern und Bindemitteln mit oder ohne Betulinsäure enthalten.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung betrifft das Bereitstellen von neuen Betulinsäurederivaten, die zum Inhibieren von Angiogenese verwendet werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Verbindung und Zusammensetzungen zum Behandeln, Inhibieren und/oder Verhindern von Angiogenese unter Verwendung einer aus einem natürlichen Produkt gewonnenen Verbindung und ihrer Derivate bereitzustellen.
Weiterhin offenbart die Anmeldung die Verwendung von Derivaten gemäß der Formel von 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung, die bei der Behandlung eines Patienten mit Angiogenese nützlich sind.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, das Problem der mit anti-angiogenen chemotherapeutischen Standard-Agenzien assoziierten hohen Toxizität durch Verwendung einer aus natürlichen Produkten abgeleiteten Verbindung, z.B. Betulinsäure oder ihrer Derivate, zu überwinden.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, das Problem der nicht-ausreichenden Verfügbarkeit, die mit synthetischen anti-angiogenen Anti-Krebs-Mitteln verbunden ist, durch Verwendung von leicht verfügbaren semisynthetischen Derivaten von Betulinsäure zu überwinden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, das Problem hoher Kosten von synthetischen antiangiogenen Mitteln durch Verwendung der leicht verfügbaren, aus einem natürlichen Produkt stammenden Verbindung zu überwinden. Zum Beispiel Betulinsäure und ihre Derivate, von denen erwartet wird, daß sie weniger teuer als andere chemotherapeutische Arzneien sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die obigen Aufgaben und andere sind durch Bereitstellen von neuen Betulinsäurederivaten der Formeln aus 1 erzielt worden, die in der vorliegenden Beschreibung dargestellt werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die nützlich zum Verhindern/Inhibieren von Angiogenese ist. Betulinsäurederivate inhibieren Endothelzellproliferation und weisen eine hohe Endothelzellspezifität auf, wodurch sie spezifisch auf Endothelzellen zielen. Die Derivate inhibieren ebenso die Bildung von Tubus-artigen Strukturen (TLS) von Endothelzellen, wenn diese auf einer mit Matrigel beschichteten Oberfläche wachsen gelassen werden. Die anti-proliferative Aktivität auf Endothelzellen zusammen mit der Ariti-TLS-Aktivität legen in sehr starker Weise die anti-angiogene Aktivität von Betulinsäurederivaten nahe.
Die neuen Derivate der Betulinsäure haben ein Grundskelett von Betulinsäure, wie hierin unten in 1 gezeigt.
, wobei R, R1, R2, R3 und R4 unabhängig oder in Kombination die folgenden Gruppen darstellen.
R = H
R1 = H,Br
R2 = O, OH, NNHC6H5, NHNHC6H5, NHNHC6H4(OCH3)[4], OCOC6H3F2[3,5], OCOC6H3F2[2,4], OCOC6H4(CF3)[3],OCOC6H4(CF3)[2], N=CHC6H3F2[2,4], N=CHC6H3F2[3,4]; NOCH2C6H4NO2[4], OCOC6H4(C5H11)[4], OCOC6H4(C7H15)[4], OCOC6H4(OCH3)2[2,5], OCOCH2C6H3(OCH3)2[3,4], OCOCH2C6H3(OCH3)2[2,4], OCOC6F5, NOH, OCOCClF2, OCOC6H4-C6H5, OCOCH(Cl)C6H5, OCO-(CH2)3COOH, OCOC6H4Cl, OCOC6H4(CHCL2)(3), OSO2CH2CH2CH2Cl, OCOC6H2(COOH)(2)C12[3,6], OCOCH(Cl)-CH3, NNHCOC6H4(OH)(2],
R3 = H, CH2CH2COOCH3, COCH=CH2, 3-Deoxy-dihydrobetulinsäure
R4 =CH2=CCH3, BrCH2-C(Br)CH3, CH(CH3)2
Herstellung von Betulinsäurederivaten.
Die folgenden Prozeduren werden entweder alleine oder in Kombination verwendet, um die Derivate der vorliegenden Erfindung zu erzeugen.
Beispiel 1
Herstellung von 3-o-Acyl-Derivaten
Verfahren 1: Ein Substrat in organischer Base wird mit einem geeigneten Anhydrid bei Zimmertemperatur für näherungsweise 4-16 Stunden behandelt. Beispiele für Anhydride, die in diesem Verfahren verwendet werden können, werden durch die allgemeine Formel (RCH₂CO₂)O dargestellt, wobei R=H, CH₃, C₂H₅, etc. Die Reaktion wurde durch Verdampfung der Reaktionsmischung, Zugabe von Wasser und Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel aufgearbeitet. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft und der Rückstand kristallisiert, um die jeweiligen entsprechenden reinen 3-o-Acylderivate zu ergeben. Beispiele für organische Basen, die in diesem Verfahren verwendet werden können, sind TEA, Pyridin und DMPA.
Verfahren II: Ein Substrat in einem halogenierten organischen Lösungsmittel wurde mit einem geeigneten Acylchlorid wie in Verfahren 1 behandelt. Die Reaktion wurde wie in Verfahren I beschrieben durchgeführt, um die entsprechenden 3-o-Acyl-Derivate in der reinen Form zu ergeben. Beispiele für Acylchloride, die verwendet werden können, sind RCH₂ (CH₂)_nCOCl, wobei R=H, Cl oder F, Br und n=0 bis 9 oder RCH₂ (CH)_n XCOCl, wobei R=H, X=OH, OCOCH₃ und n=1. Das halogenierte Lösungsmittel kann ausgewählt werden aus CCl₄, CH₂Cl₂, C₆H₅CH₃ oder ähnlichem.
Beispiel 2
Herstellung von 3-Oxo-Derivaten.
Das Substrat wurde in einem organischen Lösungsmittel aufgelöst und ein herkömmliches Oxidationsmittel wurde unter normalen Reaktionsbedingungen zugegeben. Die Reaktion wurde, wie in Verfahren I beschrieben, aufgearbeitet, um die entsprechenden 3-Oxo-Derivate in reiner Form zu ergeben.
Beispiele für Oxidationsmittel, die verwendet werden können, sind CrO₃/Py; CrO₃/H₂SO₄; CrO₃/AcOH oder ähnliches. Die normale Reaktionsbedingung ist ein Rühren des Substrats mit einem Oxidationsmittel bei einer Temperatur von 0°C bis Zimmertemperatur für einige Stunden. Das organische Lösungsmittel kann aus Aceton, CH₂Cl₂, AcOH, Mischungen davon oder ähnlichem ausgewählt werden.
Beispiel 3
Herstellung von 2, 20, 29-Tribrom-3-oxo-Derivat
Ein 3-Oxo-Betulinsäurederivat, herstellt gemäß dem Verfahren von Beispiel 3, wurde in halogeniertem organischen Lösungsmittel aufgelöst. Hierzu wurde tropfenweise flüssiges Brom, aufgelöst in demselben Lösungsmittel, zugegeben, und die Temperatur wurde zwischen 0 – 10°C gehalten. Die Reaktionsmischung wurde auf Zimmertemperatur gebracht und für einige Stunden gerührt. Die Reaktion wurde aufgearbeitet, wie in Verfahren I aus Beispiel 2 beschrieben. Die organische Schicht wurde mit 5-10% wäßriger alkalischer Lösung gewaschen und verdampft. Das kristallisierte Produkt ergab reine 2, 20, 29-Tribrom-3-oxo-Derivate. Beispiele für halogenierte Lösungsmittel, die verwendet werden können, sind CCl₄, CH₂Cl₂, CHCl₃ und ähnliche; Beispiele für eine wäßrige alkalische Lösung, die verwendet werden kann, sind das Hydrogencarbonat oder Carbonat eines Alkalimetalls in Wasser und ähnliches.
3-Oxo-Derivate von Betulinsäure, Dihydrobetulinsäure oder ihre Derivate können in den Verfahren aus den Beispielen 4, 5, 8, 10 und 14 verwendet werden.
Beispiel 4
Herstellung von 3-Oximino-Derivat
Ein 3-Oxo-Derivat wird in einem alkoholischen Lösungsmittel, wie etwa Methanol, Ethanol, Propanol und ähnlichem, gemischt. Hierzu wurde Hydroxylamin, Phenylhydroxylamin oder Benzylhydroxylamin oder ihre substituierten Derivate und Natriumacetat zugegeben. Die Mischung wurde für einige Stunden unter Rückfluß gehalten. Die Reaktionsmischung bis zur Trockne verdampft. Die Reaktionsmischung wurde aufgearbeitet, wie in Verfahren I aus Beispiel 2 beschrieben, und ergab rohes 3-Oximino-Derivat, das kristallisierte, um das entsprechende reine 3-Oximino-Derivat zu ergeben.
Beispiel 5
Herstellung des Phenylhydrazons des 3-Oxo-Derivats
Phenylhydrazin oder seine Phenyl-substituierten Analoge oder ein Salz davon und Natriumacetat wurden zu einem 3-Oxo-Derivat, das im alkoholischen Lösungsmittel, wie etwa Methanol, Ethanol, Propanol und ähnlichem, aufgelöst war, zugegeben und wurde für ungefähr vier Stunden unter Rückfluß gehalten. Die Reaktion wurde aufgearbeitet, wie in Verfahren I aus Beispiel 2 beschrieben, um das entsprechende reine Phenylhydrazon-Derivat in reiner Form zu ergeben.
Beispiel 6
Herstellung von 17- und/oder 20-Carboxyalkyl-Carboxylat
Zu dem in trockenem Dimethylformamid aufgelösten Substrat wurde Natriumhydrid zugegeben, und die Mischung wurde bei Zimmertemperatur für ungefähr zwei Stunden gerührt. Ein geeigneter Halogenalkyl-Carboxyester wurde zu den obigen Reaktionsmischungen zugegeben, und die Mischung wurde bei Zimmertemperatur für 16-20 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde aufgearbeitet, wie in Verfahren I aus Beispiel 2 beschrieben, um reines 17- und/oder 20-Carboxyalkyl-Carboxylat-Derivat zu ergeben. Beispiele von Halogenalkyl-Carboxyestern, die verwendet werden können, sind das Chlor- oder Brom-Derivat von Methyl- oder Ethyl-Acetat, oder das Chlor- oder Brom-Derivat von Propionat und ähnlichem.
Beispiel 10
Herstellung von 3-Amino-Derivaten

a] Ein 3-Oximino-Derivat wird in Eisessig aufgelöst und unter Wasserstoffatmosphäre (60-70 psi) in der Anwesenheit eines Platinoxidkatalysators für mehrere Stunden geschüttelt. Die Reaktionsmischung wird gefiltert, die Mutterlauge unter Vakuum verdampft, um den Eisessig zu entfernen, und der Rückstand auf die übliche Weise aufgearbeitet, um das entsprechende 3-Amino-Derivat zu ergeben.
b] Ein 3-Oxo-Derivat wird in Methanol aufgelöst, Ammoniumsulfat und Natriumtetrahydridoborat zugegeben und für 2-4 h unter Rückfluß gehalten. Die Reaktionsmischung wird bis zur Trockne verdampft, Wasser wird zugegeben, der Feststoff wird gefiltert und kristallisiert, um 3-Amino-Derivate zu ergeben.

Beispiel 11
Herstellung von 3-o-Benzoyl-Derivaten
Ein Substrat in organischer Base wird mit einem geeigneten Benzoylchlorid für näherungsweise 6-16 Stunden bei einer Umgebungstemperatur behandelt. Beispiele für Benzoylchlorid, die verwendet werden können, werden durch die allgemeine Formel R_n(Ar)CoCl dargestellt, wobei n=1 bis 3, R=H, Cl, Br, F, CF₃ und Ar=C₆H₅, C₆H₄, C₆H₃ oder C₆H₂. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Wasser und Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel aufgearbeitet. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, verdampft, und der Rückstand wurde kristallisiert, um jeweils reine 3-o-Benzoylderivate zu ergeben. Beispiele für organische Basen, die verwendet werden können, sind Pyridin, Piperidin.
Beispiel 13
Herstellung von 3-Phenyl-Hydrazino oder seines Phenyl-substituierten Derivats
3-Phenylhydrazon oder sein Phenyl-substituiertes Derivat von Betulinsäure oder Dihydrobetulinsäure wird in Eisessig aufgelöst und unter Wasserstoffatmosphäre (50-70 psi) in der Anwesenheit eines Platinschwammkatalysators für 3-5 Stunden geschüttelt. Die Reaktionsmischung wurde gefiltert, die Mutterlauge unter Vakuum verdampft, um den Eisessig zu entfernen, und der Rückstand aus alkoholischem Lösungsmittel kristallisiert, um reines 3-Phenylhydrazino oder sein Phenyl-substituiertes Derivat zu ergeben. Die verwendeten alkoholischen Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol oder Isopropanol.
Beispiel 14
Herstellung von 3-N-Hydroxyethylderivat
3-Oxo-Derivat wird in absolutem alkoholischem Lösungsmittel aufgelöst, wie etwa Methaol/Ethanol, und dazu wurden 15-20% alkoholische Salzsäure und 2-Aminoethanol zugegeben und bei Zimmertemperatur für 30 – 60 Minuten gerührt. Zu diesem wurde Natriumcyanoborhydrid zugegeben und weiter bei Zimmertemperatur für näherungsweise 72 Stunden gerührt. Die Aufarbeitung erfolgte durch Zugabe von Wasser, gefolgt von einer Filtration des Feststoffes, um das Rohprodukt zu ergeben, das aus Alkohol kristallisiert wurde, um reines 3-N-Hydroxyethyl-Derivat zu ergeben.
Beispiel 15
Herstellung von 3-N-Benzyliden-Derivat
3-Amino-Derivat wird in alkoholischem Lösungsmittel, wie etwa Methanol/Ethanol, aufgelöst, und dazu wird Benzaldehyd oder substituiertes Benzaldehyd-Derivat in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Alkalimetallcarbonat, wie etwa Natrium- oder Kaliumcarbonat, zugegeben. Die Mischung wurde für einige Stunden bei Umgebungstemperatur bis näherungsweise 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch Entfernen des Alkohols unter Vakuum und durch Zugabe von Wasser aufgearbeitet. Die wäßrige Schicht wurde entweder gefiltert oder mit einem halogeniertem organischen Lösungsmittel extrahiert, gefolgt von einer Verdampfung, was 3-N-Benzyliden-Derivat ergab.
Beispiel 16
30 μl einer ECV304-Zellsuspension (50 × 10⁴ Zellen/ml in RPMI 1640, enthaltend 10% FBS), gefolgt von 150 μl Medium, wurde zu den Näpfen einer 96-Napf-Gewebekulturplatte (Nunc, Dänemark) zugegeben und über Nacht inkubiert (37°C, 5% CO₂). 20 μl des zu testenden Betulinsäurederivats wurde dann in Konzentrationen im Bereich von 0,5 μg/ml bis 4 μg/ml zugegeben. Jede Konzentration wurde in dreifacher Ausfertigung: ausplattiert. 20 μl Medium alleine wurde zu Kontrollnäpfen zugegeben. Nach 72 Stunden Inkubation wurde ein MTT-Assay (Mosmann 1983) durchgeführt, und die prozentuale Inhibition hinsichtlich der Proliferation von behandelten Zellen wurde in Bezug auf die Kontrollzellen berechnet.
Die Cytotoxizitätsassays für Tumorzellen sind im einzelnen in unserer Anmeldung Nr. 09/040,856 beschrieben worden, die in den USA am 18. März 1998 eingereicht worden ist. Tabelle I zeigt die ED₅₀-Werte gegen ECV304 und vier verschiedene Tumorzellinien und die Endothelzell-Spezifitäten von siebzehn potenten Derivaten.
Tabelle
Wir sagen voraus, daß die Verbindungen mit „hohem" und „mittlerem" ECS spezifisch auf Endothelzellen zielen und unter potenten anti-angiogenen Verbindungen gruppiert werden können, während Verbindungen mit „niedrigem" ECS ihre bereits berichtete cytotoxische Aktivität gegen Tumorzellen ergänzen würden.
Beispiel 17
Mehrere Derivate der Betulinsäure wurden hergestellt durch Durchführen von Substitutionen und/oder strukturellen Veränderungen an den Positionen C₃, C₁₇, C₂₀ und/oder C₂₉ von Betulinsäure, wie in den Beispielen beschrieben. Die Derivate wurden auf der Grundlage von spektralen Daten charakterisiert. Tabelle II bezieht sich auf die Strukturen von 2, wobei R bis R₄, die deutlich gezeigt werden, die Strukturen von vierzig Derivaten auflisten. 2, wobei R bis R₄ unten gezeigt werden:
Beispiel 18
Matrigel (70 μl) wurde in jeden Napf einer 96-Napf-Kulturplatte bei 4°C gebracht, und man ließ es durch Inkubation bei 37°C für 30 min. polymerisieren ECV304 (1 × 10⁴)-Zellen wurden auf dem Matrigel in 200 μl DMEM ausgesät, enthaltend 10% FBS. Die zu testende Betulinsäure und -Derivate wurden zu markierten Näpfen in nicht-cytotoxischen Konzentrationen zugegeben und bei 37°C für 24 – 48 Stunden inkubiert. Die Abwesenheit der Cytotoxizität von Betulinsäure und ihrer Derivate auf ECV304-Zellen zu den obigen Zeitpunkten wurde durch geeignete Kontrollen bestätigt. Fünf verschiedene Phasen-Kontrast-mikroskopische Felder (4X) wurden angesehen und die gesamte Tubus-Fläche der Tubus-artigen Strukturen (TLS) vermessen unter Verwendung eines Video Pro 32 Image Analysis-Systems. Die prozentuale Verringerung in der gesamten Tubus-Fläche wurde als der Mittelwert der Daten aus fünf Feldern angegeben. Die prozentuale Inhibition der TLS wurde unter Bezug auf die Kontrollen berechnet (keine Arznei).
Tabelle III
Beispiel 19
Eine geeignete Formulierung von Betulinsäurederivaten wurde wie folgt hergestellt. Die Derivate wurden in einem minimalen Volumen Methanol löslich gemacht. Die Derivate können ebenso in Isopropylalkohol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel löslich gemacht werden. Substituiertes beta-Cyclodextrin, wie etwa 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, Sulfobutylether-beta-cyclodextrin, wurde separat in Wasser auf eine Konzentration von näherungsweise 50 bis 1000 mg pro ml, bevorzugt 250 bis 750 mg pro ml, aufgelöst. Das solubilisierte Betulinsäurederivat wurde in kleinen Aliquots zu der derivatisierten beta-Cyclodextrinlösung zugegeben und bei niedriger Temperatur beschallt, bis sich eine klare Lösung entwickelte. Das organische Lösungsmittel wurde dann durch Rotationsverdampfung entfernt, und die endgültige Lösung gefiltert, um ein steriles Produkt zu ergeben. Die resultierende Lösung wurde lyophilisiert.
Systemische Verabreichung bezieht sich auf orale, rektale, nasale, transdermale und parenterale (d.h. intramuskulär, intraperitoneal, subkutan oder intravenös). In Übereinstimmung mit guter klinischer Praxis wird bevorzugt, die Zusammensetzung in einer Dosis zu verabreichen, die anti-angiogene Effekte erzeugen wird, ohne übermäßige schädliche Nebenwirkungen zu verursachen. Die Zusammensetzung kann entweder allein oder als eine Mischung mit anderen therapeutischen Mitteln verabreicht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die von ungefähr 10 mg bis 1000 mg der Zusammensetzung pro Einheitsdosis bereitstellen, werden bevorzugt als Tabletten, Pastillen, Kapseln, Pulvern, wäßrigen oder öligen Suspensionen, Sirupen, Elixieren, Implantaten oder wäßrigen Lösungen mittels jeden beliebigen herkömmlichen Verfahrens. Die Natur der verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzung wird natürlich von der gewünschten Verabreichungsroute abhängen. Die Dosierung der Zusammensetzung für den Menschen liegt im Bereich von 1,0 bis 200 mg/kg/Tag, und der bevorzugte Bereich ist 1,0 bis 50 mg/kg/Tag.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verwenden von neuen Betulinsäurederivaten oder eine Kombination davon zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines Patienten mit Tumor-assoziierter Angiogenese durch Verabreichen einer pharmazeutisch effektiven Dosierung von besagtem Betulinsäurederivat oder seiner Kombination, an den Patienten. Der Patient der Erfindung kann ein Mensch, ein Säugetier oder ein anderes Tier sein. Der ED₅₀-Wert von Betulinsäurederivaten gegen menschliche Nabelschnurendothelzellen ist 0,35 bis 4,0 μg/ml. Die Endothelzellspezifität von Betulinsäurederivaten für Prostatakrebs ist 1,04 bis 21,1. Die Endothelzellspezifität von Betulinsäurederivaten für Lungenkrebs ist 0,43 bis > 10. Jedoch ist die Endothelzellspezifität von Betulinsäurederivaten für Ovarialkrebs 0,54 bis 7,0. Die Endothelzellspezifität von Betulinsäurederivaten für Colon-Krebs beträgt 0,87 bis 14,3.
Das Betulinsäurederivat wird an den Patient in einem pharmazeutisch akzeptablen Zusatzstoff Träger, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Füllstoff, Schmiermittel, Bindemittel, Binder oder Stabilisator verabreicht. Bevorzugt wird das Betulinsäurederivat in der Form einer Tablette, Pastille, Kapsel, Pulver, wäßrige oder ölige Suspension, Sirup, Elixier, Implantat oder wäßrige Lösung verabreicht, und das Betulinsäurederivat oder die Derivate oder die Kombination davon wird an den Patienten systemisch verabreicht.

Claims

Ein Betulinsäurederivat, dargestellt durch die folgende Formel:
wobei eine Kombination aus R, R₁, R₂, R₃ und R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend
Verwendung eines Betulinsäurederivats oder einer Kombination mehrerer Betulinsäurederivate nach Anspruch 1 zum Herstellen einer Zusammensetzung, die bei der Behandlung eines Patienten mit Angiogenese nützlich ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Angiogenese Tumor-assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei besagter Patient ein Mensch, ein Säugetier oder ein anderes Tier ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei der ED₅₀-Wert von Betulinsäwederivaten gegen menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen 0,35 bis 4,0 μg/ml ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Endothelzellspezifität von Betulinsäurederivaten für Prostatakrebs 1,04 bis 21,1 ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Endothelzellspezifität von Betulinsäurederivaten für Lungenkrebs 0,43 bis > 10 ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Endothelzellspezifität von Betulinsäurederivaten für Eierstockkrebs 0,54 bis 7,0 ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Endothelzellspezifität von Betulinsäurederivaten für Colonkrebs 0,87 bis 14,3 ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Betulinsäurederivat an den Patienten in einem pharmazeutisch annehmbaren Zusatzstoff, Träger, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Füllstoff, Schmiermittel, Bindemittel, Binder oder Stabilisator verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Betulinsäurederivat in Form einer Tablette, Pastille, Kapsel, Pulver, wäßriger oder öliger Suspension, Sirup, Elixier, Implantat oder wäßriger Lösung verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Dosierung für einen Menschen im Bereich von 1,0 bis 200 mg/kg/Tag beträgt.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Betulinsäurederivat oder Derivate oder eine Kombination davon an den Patienten systemisch verabreicht wird.