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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine gesundheitsfördernde
Gewürzmittelzusammensetzung
und insbesondere betrifft sie eine Gewürzmittelzusammensetzung, welche
1 bis 30 Gew.-% Knoblauch, 10 bis 50 Gew.-% Zwiebel, 0,2 bis 10
Gew.-% Ingwer, 5 bis 40 Gew.-% Jujube und 10 bis 50 Gew.-% Zitrusfrüchteschale oder
ein Extrakt derselben oder 1 bis 20 Gew.-% Naringin oder Hesperidin
umfaßt.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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In den letzten Jahren hat eine zunehmende
Anzahl der erwachsenen Bevölkerung
unter solchen Krankheiten wie Krebs und Herz-Kreislaufstörungen gelitten,
und es ist berichtet worden, daß solche
Erkrankungen verhindert werden können,
indem die Nahrung verbessert wird.
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Zwiebel, Knoblauch und Ingwer sind
gewöhnliche
Rohmaterialien zur Herstellung von Gewürzmitteln in Korea. Für Knoblauch
ist es bekannt, daß er
eine Antikrebsaktivität
zusammen mit Aktivitäten
zum Vermeiden von Herz-Kreislauferkrankungen aufweist, unter Förderung
der Zirkulation des Bluts und der Stärkung des Immunsystems (L.
D. Lawson, "Bioactive
Organosulfur Compounds of Garlic and Garlic Products: Role in Reducing
Blood Lipids", in
Human Medicinal Agents, 306–330,
D. Kinghorn und M. F. Balaandrin Herausgeber., ACS symposium Series,
534, 1993). Für
Zwiebel ist berichtet worden, daß sie geeignet ist zur Vermeidung
von Herz-Kreislauferkrankungen; sie erniedrigt den Blutcholesteringehalt,
steigert den Blutgehalt an hochdichtem Lipoprotein (HDL) und inhibiert
die Blutplättchenaggregation
(J. Carper, Food Pharmacy, Batam Books (1989)).
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Bislang sind Zitrusfrüchteschalen
verworfen worden oder lediglich verwendet worden für die Herstellung
von Tierfutter oder organischem Dünger. Getrocknete Zitrusfrüchteschale
umfaßt
50 bis 60 Gew.-% in Alkohol unlösliche
Polymere, wie Pectin, Hemicellulose und Cellulose; 30 bis 50 Gew.-%
in Alkohol lösliche
feste Materialien (80 Gew.-% derselben bestehen aus Glucose, Fructose
und Sucrose); und eine kleine oder Spurenmenge an Bioflavonoiden,
Vitaminen, Limonoiden, phenolischen Verbindungen und Ölen. Insbesondere sind
zahlreiche Bioflavonoide, die in Tabelle I aufgeführt sind,
in der Zitrusfrüchteschale
vorhanden (Horowitz, R. M., et. al., J. Org. Chem., 25, 2183–2187 (1960)).
Unter den Bioflavonoiden ist Hesperidin eine Hauptkomponente von
Apfelsinen, Zitronen und Mandarinen; Naringin ist eine Hauptkomponente
von Grapefruits; und nahezu die gleichen Mengen an Naringin und
Hesperidin sind in Zitrone vorhanden.
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Es ist berichtet worden, daß die Bioflavonoide,
die aus einer Zitrusfrüchteschale
isoliert worden sind, antioxidative, Antikrebs-, antivirale und
blutdrucksenkende Aktivitäten
aufweisen (Saija, A., et. al., Free Radical Biol. Med., 19, 481–486 (1995);
Matsubara, Y., et. al., Japan Organic Synthesis Chem. Association
Journal, 52, 318–327
(1994, Mar.); Galati, E. M., et. al., Farmaco., 51(3), 219–221 (1996,
Mar.); Felicia, V., et. al., Nutr. Cancer, 26, 167– 181 (1996);
EP 0352147 A2 (1990,
Z. 24); und Kaul, T. N., et. al., J. Med. Viol., 15, 71–75 (1985)).
Ferner ist von Limonoiden in der Zitrusfrüchteschale berichtet worden,
eine Antikrebsaktivität
aufzuweisen. (Lam, L. K. T., et. al. Inhibition of Chemically Induced
Carcinogenesis by Citrus Limonoids, In Food Phytochemicals for Cancer
Prevention, Band I, ACS Symposium series No. 546 M. T. Huang, 0.
Osawa, C. T. Ho, R. Rosen (Herausgeber), 1993.
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Jedoch sind bislang keine Gewürzmittelzusammensetzungen,
die Zitrusfrüchteschale
oder ein Extrakt derselben enthalten, berichtet worden. Die vorliegenden
Erfinder haben sich bemüht,
eine gesundheitsfördernde
Gewürzmittelzusammensetzung
zu entwickeln und haben entdeckt, daß eine Gewürzmittelzusammensetzung, welche
Zwiebel, Knoblauch, Ingwer, Jujube und Zitrusfrüchteschale oder ein Extrakt
derselben umfaßt, sehr
nützlich
ist zur Vermeidung von Erwachsenenerkrankungen, wie Krebs, Bluthochdruck
und Herz-Kreislauferkrankungen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es ist demzufolge eine Aufgabe der
vorliegenden Erfindung, eine neue gesundheitsfördernde Gewürzmittelzusammensetzung bereitzustellen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß einer Erscheinung der vorliegenden
Erfindung wird eine Gewürzmittelzusammensetzung
bereitgestellt, welche 1 bis 30 Gew.-% Knoblauch, 10 bis 50 Gew.-%
Zwiebel, 0,2 bis 10 Gew.-% Ingwer, 5 bis 40 Gew.-% Jujube und 10
bis 50 Gew.-% Zitrusfrüchteschale
oder ein Extrakt derselben umfaßt.
Die Gewürzmittelzusammensetzung
kann ferner 20 bis 50 Gew.-% Hafermehlpulver umfassen, wobei die
resultierende Gewürzmittelzusammensetzung
bevorzugt verwendet wird bei der Herstellung einer Hamburgersoße oder
einer Steaksoße.
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Bevorzugt kann die erfindungsgemäße Gewürzmittelzusammensetzung
5 bis 25 Gew.-% Knoblauch, 15 bis 40 Gew.-% Zwiebel, 0,5 bis 5 Gew.-%
Ingwer, 10 bis 35 Gew.-% Jujube und 15 bis 40 Gew.-% Zitrusfrüchteschale
oder ein Extrakt derselben umfassen. 20 bis 50 Gew.-% Hafermehlpulver
können
ebenfalls zugefügt
werden.
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Auf der anderen Seite kann die Gewürzmittelzusammensetzung
1 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 15 Gew.-% Naringin oder Hesperidin
anstelle der Zitrusfrüchteschale
oder eines Extrakts derselben umfassen.
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Ferner kann die Gewürzmittelzusammensetzung
weiter zusätzliche
Inhaltsstoffe, wie Pfeffer, roten Pfeffer, grüne Zwiebel, Frühlingszwiebel
und Sesam, falls erforderlich, umfassen.
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Die Zitrusfrucht kann Mandarine,
Apfelsine, Zitrone, Grapefruit, Zitrone, Poncirus trifoliata und
dgl. sein. Es ist bevorzugt, die Schale von Zitrusfrüchten zu
verwenden, die durch organische Landwirtschaftsmethoden ohne die
Verwendung von chemischen Pestiziden hergestellt worden sind.
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Das Zitrusfrüchteschalenextrakt der vorliegenden
Erfindung kann hergestellt werden durch irgendeines der herkömmlichen
Verfahren unter Verwendung von Wasser oder einem geeigneten Lösungsmittel,
wie wässrigen
Alkoholen, Ca(OH)2 und NaOH. Beispielsweise
werden 3 bis 30 l von 20- bis 95%-igem Ethanol zu 1 kg getrockneter
Zitrusfrüchteschale
zugefügt,
und es wird der Mischung ermöglicht,
bei einer Temperatur in einem Bereich von 25 bis 80°C für eine Dauer
in einem Bereich von 1 bis 12 Std. zu stehen. Der resultierende Extrakt
wird filtriert und das Filtrat wird konzentriert, z. B. mittels
Vakuum, um einen konzentrierten Schalenextrakt zu erhalten. Alternativ
können
5 bis 30 l an 0,1- bis 2 %-igem Ca(OH)2 oder
NaOH zu 1 kg getrockneter Zitrusfrüchteschale zugefügt werden,
und es wird der Mischung ermöglicht,
bei einer Temperatur in einem Bereich von 25 bis 60°C für eine Dauer
in einem Bereich von 1 bis 5 Std. zu stehen. Der resultierende Extrakt wird
filtriert, und das Filtrat wird auf einen pH-Wert in einem Bereich
von 4,0 bis 7,0 durch Zufügen
von 1 N HCl dazu eingestellt. Dem resultierenden Filtrat wird es
ermöglicht,
bei einer Temperatur in einem Bereich von 1 bis 10°C für eine Dauer
in einem Bereich von 10 bis 48 Std. zu stehen. Der resultierende
Niederschlag wird gewonnen und dann getrocknet, um einen Zitrusfrüchteschalenextrakt
zu erhalten.
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Die Gewürzmittelzusammensetzung der
vorliegenden Erfindung ist gesundheitsfördernd, da die Zitrusfrüchteschale
oder ein Extrakt derselben inhibitorische Wirkungen auf die 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-(HMG-CoA)-Reduktaseaktivität und Acyl-CoA-Cholesterin-o-acyltransferase-(ACAT)-Aktivität zeigt, wodurch
verschiedene Herz-Kreislauferkrankungen vermieden werden, die durch
einen hohen Plasmacholesteringehalt verursacht werden. Ferner zeigt
die Zitrusfrüchteschale
oder ein Extrakt derselben ebenfalls verschiedene gesundheitsfördernde
Aktivitäten,
wie eine Antikrebs-, antivirale und blutdrucksenkende Aktivität. Ferner
weisen Zwiebel, Knoblauch, Ingwer und Jujube, die darin enthalten
sind, ebenfalls präventive
Aktivitäten
gegenüber
Herz-KreislauferJcrankungen auf.
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Trotz ihrer starken Wirksamkeiten
zeigt die erfindungsgemäße Gewürzmittelzusammensetzung
eine geringe Toxizität
oder Mitogenizität
in Tierversuchen. Insbesondere zeigt die Gewürzmittelzusammensetzung keine
Toxizität,
wenn sie oral an Mäuse
mit einer Dosierung von 1.000 mg/kg verabreicht wird, was einer
oralen Verabreichungsdosis von 50 bis 100 g/kg Körpergewicht an Zitrusfrüchteschalenextrakt
für eine
Person mit einem Gewicht von 50 kg entspricht. Ferner zeigt der
Zitrusfrüchteschalenextrakt
keine nachteiligen Effekte für die
Leberfunktion.
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Die Gewürzmittelzusammensetzung der
vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden durch Mischen von
Knoblauch, Zwiebel, Ingwer, Jujube und Zitrusfrüchteschale oder eines Extrakts
derselben, Zufügen von
Wasser zu der resultierenden Mischung und Vermischen der Mischung.
Eine gepulverte Gewürzmittelzusammensetzung
kann hergestellt werden durch Trocknen und Pulverisieren der vermischten
Gewürzmittelzusammensetzung.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Gewürzmittelzusammensetzung werden
Knoblauch, Zwiebel und Ingwer nach Schälen und Waschen mit Wasser
verwendet, und Jujube nach Waschen mit Wasser und Entfernen der
Samen. Die erfindungsgemäße Gewürzmittelzusammensetzung
weist ein gutes Aroma und Geschmack auf, hauptsächlich aufgrund der Zugabe
von Jujube.
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Für
die gesundheitsfördernden
und erkrankungspräventiven
Zwecke kann die Gewürzmittelzusammensetzung
der vorliegenden Erfindung verwendet werden in einer Menge in einem
Bereich von 10 bis 100 g pro 1 kg Nahrungsmittel. Beispielsweise
kann die Gewürzmittelzusammensetzung
zugefügt
werden zu Hamburgersteaks, während
sie geröstet
werden, oder Fisch, Fleisch oder Geflügel, beispielsweise Hühnchen,
Ente und Truthahn, können
mit der erfindungsgemäßen Gewürzmittelzusammensetzung
gegart werden, um gesundheitsfördernde
Nahrungsmittel herzustellen. Ferner kann die Gewürzmittelzusammensetzung zu
gegartem Nahrungsmittel zugefügt
werden und kann ebenfalls wie ein herkömmliches Gewürzmittel
verwendet werden.
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Die folgenden Beispiele sind beabsichtigt,
um die vorliegende Erfindung ohne Begrenzung ihres Umfangs weiter
zu veranschaulichen.
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Ferner sind Prozentangaben, die unten
für Feststoff-in-Feststoff-Mischung,
Flüssigkeit-in-Flüssigkeit und
Feststoff-in-Flüssigkeit
gegeben sind, auf einer Gewicht/Gewicht-, Volumen/Volumen- bzw.
Gewicht/Volumen-Basis, und alle Reaktionen wurden bei Raumtemperatur
durchgeführt,
sofern es nicht anderweitig speziell angegeben ist.
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Beispiel 1: Herstellung
von Zitrusfrüchteschalenextrakt
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(1) Verfahren unter Verwendung
von Ethanol
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Die Schale von Mandarine (Cheju-Insel,
Korea) wurde bei Raumtemperatur getrocknet und 5 l von 30%igem Ethanol
wurden zu 500 g der getrockneten Schale zugefügt. Die Schale wurde bei 60°C für 5 Std. extrahiert.
Der Extrakt, der so erhalten wurde, wurde durch Baumwollstoffe filtriert,
und das Filtrat wurde unter einem Vakuum konzentriert, um 190 g
eines sirupartigen Extrakts zu ergeben.
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Um die Zusammensetzung des oben erhaltenen
Zitrusfrüchteschalenextrakts
zu analysieren, wurden 5,0 μl
des resultierenden Extrakts einer Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) unter Verwendung einer Lichrosorb RP-8-Säule (5 μm, 4 × 250 mm) unterzogen, welche
mit 37%igem Methanol vorequilibriert worden war und bei 30°C gehalten
wurde. Der Extrakt wurde mit 37%igem Methanol bei einer Fließgeschwindigkeit von
1,0 ml/min. eluiert. Standardlösungen
wurden hergestellt durch Lösen
von Hesperidin und Naringin (Sigma Chemical Co., USA) in Methanol
zu fertigen Konzentrationen von 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 bzw. 0,5 mg/ml,
und einer HPLC unter den gleichen Bedingungen wie oben unterzogert.
Die Eluate wurden bei 280 nm mit einem UV-VIS-Spektrophotometer
detektiert, und die Gehalte von Hesperidin und Naringin wurden berechnet
durch Vergleichen der HPLC-Scans des Zitrusfrüchteschalenextrakts und der
Standardlösungen.
Es wurde gefunden, daß der
Zitrusfrüchteschalenextrakt
5,1 g Hesperidin enthielt.
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Ferner wurde die Zusammensetzung
des Zitrusfrüchteschalenextrakts
analysiert, um 65% Feuchtigkeit, 28% Zucker (11% Fructose, 11% Glucose
und 6% Sucrose), 2,7% Hesperidin und andere Spurenbestandteile,
wie Aschen, zu enthalten.
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(2) Verfahren unter Verwendung
von Ca(OH)2
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Die Schale von Mandarine (Cheju-Insel,
Korea) wurde bei Raumtemperatur getrocknet, und 5 l von 0,5 %-igen
Ca(OH)2-Lösung wurden zu 500 g der getrockneten
Schale zugefügt.
Die Schale wurde bei Raumtemperatur für 1 Std. extrahiert, während gerührt wurde,
und der Extrakt, der so erhalten wurde, wurde durch Baumwollstoffe
filtriert. 1 N HCl wurde zu dem Filtrat zugefügt, um seinen pH-Wert auf 4,5
einzustellen. Diese Vorgehensweise wurde wiederholt, um ein zweites
Filtrat zu erhalten, welches auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt
wurde. Die zwei Filtrate, die so erhalten wurden, konnten bei 5°C für 24 Std.
stehen, um Niederschläge zu
bilden. Die Niederschläge,
die so erhalten wurden, wurden gewonnen und getrocknet, um 5 g bzw.
10 g Pulver zu erhalten. HPLC-Analysen der Pulver zeigten, daß die Zitrusfrüchteschalenextrakte
3,2 g bzw. 6,55 g Hesperidin (Reinheit: 64% bzw. 65%) enthielten.
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(3) Verfahren unter Verwendung
von NaOH
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Die Schale von Mandarine (Cheju-Insel,
Korea) wurde bei Raumtemperatur getrocknet, und 5 l von 0,5 %-igem
NaOH wurden zu 500 g der getrockneten Schale zugefügt. Die
Schale wurde bei Raumtemperatur für 1 Std. extrahiert, während gerührt wurde,
und der so erhaltene Extrakt wurde durch Baumwollstoffe filtriert.
1N HCl wurde zu dem Filtrat zugefügt, um seinen pH-Wert auf 4,5
einzustellen. Diese Vorgehensweise wurde wiederholt, um ein zweites
Filtrat zu erhalten, welches auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt
wurde. Die zwei Filtrate, die so erhalten wurden, konnten bei 5°C für 24 Std.
stehen, um Niederschläge
zu bilden. Die so erhaltenen Niederschläge wurden gewonnen und getrocknet,
um 44 g bzw. 49 g Pulver zu erhalten. HPLC-Analysen der Pulver zeigten,
daß die
Zitrusfrüchteschalenextrakte
13,6 g bzw.9,8 g Hesperidin (Reinheit: 31% bzw. 20%) enthielten.
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Beispiel 2: Herstellung
einer Gewürzmittelzusammensetzung
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Zwiebeln, Knoblauche und Ingwer,
die in Korea erzeugt wurden, wurden geschält und mit Wasser gewaschen,
Jujube wurde mit Wasser gewaschen und die Samen wurden entfernt.
Die Schale von Zitrusfrüchten,
erzeugt durch organische Landwirtschaftsmethoden ohne Verwendung
von chemischen Pestiziden, wurde mit Wasser gewaschen. Diese Materialien
wurden dann im Schatten getrocknet oder ofengetrocknet. Getrocknetes
Jujube und Zitrusfrüchteschale
wurden mit einem Pulverisierer pulverisiert.
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200 g getrocknete Zwiebel, 50 g getrockneter
Knoblauch, 10 g getrockneter Ingwer, 80 g Jujubepulver und 200 g
Zitrusfrüchteschalenpulver
wurden zusammengemischt, 1000 ml Wasser wurden dazu zugefügt, und
die Mischung wurde mit einem Vermischer homogenisiert.
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Für
eine langfristige Lagerung wurde die so hergestellte Gewürzmittelzusammensetzung
bei 121°C sterilisiert
oder wurde getrocknet und pulverisiert.
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Beispiel 3: Herstellung
einer Steaksoße
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Getrocknete Zwiebel, Knoblauch und
Ingwer, Jujubepulver und Zitrusfrüchteschalenpulver wurden wie in
Beispiel 2 hergestellt. 200 g getrocknete Zwiebel, 50 g getrockneter
Knoblauch, 10 g getrockneter Ingwer, 80 g Jujubepulver, 200 g Zitrusfrüchteschalenpulver
und 260 g Hafermehlpulver wurden zusammengemischt, 1000 ml Wasser
wurden zugefügt,
und die Mischung wurde mit einem Vermischer homogenisiert.
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Für
eine langfristige Lagerung wurde die so erhaltene Gewürzmittelzusammensetzung
bei 121°C
sterilisiert oder wurde getrocknet und pulverisiert.
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Beispiele 4 bis 8: Herstellung
von Gewürzmittelzusammensetzungen
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Verschiedene Gewürzmittelzusammensetzungen wurden
gemäß der Vorgehensweise
der Beispiele 2 oder 3 durch Verwendung der Inhaltsstoffe, die in
Tabelle II aufgeführt
sind, hergestellt.
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Beispiel 9: Vorteilhafte
Wirkungen der Aufnahme der erfindungsgemäßen Gewürzmittelzusammensetzung: Ein
Tierversuch
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20 vier Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten
(Taihan-Labortierzenter, Korea), jeweils mit einem Gewicht von etwa
90 bis 110 g, wurden gleichmäßig in zwei
Ernährungsgruppen
durch ein Zufallsblockdesign aufgeteilt. Die Ratten der zwei Gruppen
wurden mit zwei unterschiedlichen Hochcholesterinnahrungen gefüttert, d.
h. AIN-76-Labortiernahrung (ICN Biochemicals, Cleveland, OH, U.S.A.),
enthaltend 1% Cholesterin (Kontrollgruppe) bzw. 1 % Cholesterin
plus 12,2% Gewürzmittelzusammensetzung
(4,5% Zitrusfrüchteschalenpulver,
2% Jujubepulver, 4,5% Zwiebelpulver, 0,2% Ingwerpulver und 1% Knoblauchpulver).
Die Zusammensetzungen der Nahrungen, die den zwei Gruppen gefüttert wurden,
sind in Tabelle III gezeigt.
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Die Ratten konnten sich mit der spezifizierten
Nahrung zusammen mit Wasser für
8 Wochen ernähren, die
Aufnahmemenge wurde täglich
aufgezeichnet, und die Ratten wurden alle 7 Tage gewogen, und dann
wurde die Aufzeichnung analysiert. Alle Ratten zeigten eine normale
Wachstumsgeschwindigkeit und es wurde kein signifikanter Unterschied
unter den zwei Gruppen bezüglich
der Nahrungsaufnahmemenge und des Gewichtsgewinns beobachtet.
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Anschließend wurde der Effekt der Verabreichung
der Gewürzmittelzusammensetzung
an Ratten bezüglich
des Plasmacholesterins- und Neutrallipidgehalts wie folgt bestimmt.
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Jede der Blutproben, die von den
Ratten der zwei Ernährungsgruppen
genommen wurden, konnte bei Raumtemperatur für 2 Std. stehen und wurde bei
3.000 rpm für
15 Minuten zentrifugiert, um Überstehendes (Serum)
zu erhalten, welches in einem Gefrierschrank bis zur Analyse gelagert
wurde.
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Der Gesamtcholesteringehalt (TC)
jeder Blutprobe wurde unmittelbar mit einem Blutchemieanalysator (CIBA
Corning 550 Express, U.S.A.) bestimmt. Um den HDL-Cholesteringehalt
zu bestimmen, wurde ein HDL-Bestimmungsreagenz (Chiron Diagnostics
Co., U.S.A.), welches hergestellt wurde durch Anwendung des HDL-Quantifizierungsverfahrens
unter Verwendung von Dextransulfat und Magnesiumsulfat (Warnick,
G. R. et. al., Clin. Chem., 28, 1379–1388 (1982)), mit jeder Serumprobe
in einem Verhältnis
von 1 : 10 (v/v) gemischt, und die Mischung wurde bei 20 bis 25°C für 5 Minuten
in einem Inkubator umgesetzt. Das Resultierende wurde bei 2.500
rpm für
10 Minuten zentrifugiert, um Überstehendes
zu erhalten, welches dann mit einem Blutchemieanalysator analysiert
wurde.
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Bedeutsamkeitstests (Studenten-t-Test)
der analysierten Werte von jeder Maus wurden durchgeführt durch
Verwendung einer Computersoftware (Microsoft Excel, Ver. 7.0). Die
Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt.
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Wie in Tabelle IV gezeigt, nahm der
Gesamtcholesteringehalt der Ratten, die mit der erfindungsgemäßen Gewürzmittelzusammensetzung
gefüttert
worden waren, um 10% ab, verglichen mit demjenigen der Kontrollgruppe.
Insbesondere nahm der Plasma-HDL-Gehalt um etwa 50% in der Gruppe
mit Gewürzmittelzusammensetzung
zu, verglichen mit demjenigen der Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis
demonstriert, daß eine
Aufnahme der erfindungsgemäßen Gewürzmittelzusammensetzung
den Plasma-HDL-Gehalt steigert, während der Plasmacholesteringehalt
abgesenkt wird, wodurch sie zu der Verhinderung von Herz-Kreislauferkrankungen
beiträgt.
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Beispiel 10: Toxizität einer
oral verabreichten Gewürzmittelzusammensetzung
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7 bis 8 Wochen alte, spezifische,
pathogenfreie, weibliche ICR-Mäuse
(6 Stück),
jeweils mit einem Gewicht von etwa 25 bis 29 g, und männliche
Mäuse (6
Stück),
jeweils mit einem Gewicht von etwa 34 bis 38 g, wurden unter einer
Bedingung von 22 ± 1°C, 55 ± 5% Feuchtigkeit
und 12L/12D-Fotoperiode gezüchtet.
Futter (Mäuse-
und Rattenfutter, Cheiljedang Co., Korea) und Wasser wurden sterilisiert
und den Mäusen
gefüttert.
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Die Gewürzmittelzusammensetzung, die
in Beispiel 2 hergestellt wurde, wurde in 0,5% Tween® 80
in einer Konzentration von 100 mg/ml gelöst, und die Lösung wurde
oral den Mäusen
in einer Menge von 0,2 ml pro 20 g Mäusekörpergewicht verabreicht. Die
Lösung
wurde einmal verabreicht, und die Mäuse wurden für 10 Tage
hinsichtlich von Zeichen von nachteiligen Effekten oder Tod gemäß des folgenden
Zeitplans beobachtet: 1, 4, 8 und 12 Stunden nach Verabreichung
und alle 12 Stunden anschließend.
Die Gewichtsveränderungen
der Mäuse
wurden jeden Tag aufgezeichnet, um die Wirkung der Gewürzmittelzusammensetzung
zu untersuchen. Ferner wurden am zehnten Tag die Mäuse geopfert
und die inneren Organe visuell untersucht.
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Alle Mäuse waren am Tag 10 lebend
und die Gewürzmittelzusammensetzung
zeigte keine Toxizität
bei einer Dosis von 1.000 mg/kg. Die Autopsie zeigte, daß die Mäuse keine
pathologischen Abnormalitäten
entwickelt hatten, und kein Gewichtsverlust wurde während der
10-tägigen
Testperiode beobachtet. Demzufolge wurde geschlossen, daß die Gewürzmittelzusammensetzung
nicht toxisch ist, wenn sie oral einem Tier verabreicht wird.
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Beispiel 11: Wirkung der
Aufnahme von Zitrusfrüchteschalenextrakt
in der ACAT-Inhibierung
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(Schritt 1) Fütterung
von Zitrusfrüchteschalenextrakt
an Testtieren
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20 vier Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten
(Taihan-Labortiercenter, Korea), jeweils mit einem Gewicht von etwa
90 bis 110 g, wurden gleichmäßig in zwei
Ernährungsgruppen
durch ein Zufallsblockmuster aufgeteilt. Die Ratten der zwei Gruppen
wurden mit zwei unterschiedlichen Hochcholesterinnahrungen gefüttert, d.
h. AIN-76-Labortiernahrung (ICN Biochemicals, Cleveland, OH, U.S.A.),
enthaltend 1% Cholesterin (Kontrollgruppe) bzw. 1 % Cholesterin
plus 16,7% Zitrusfrüchteschalenextrakt,
der in Beispiel 1 (1) erhalten wurde. Die Zusammensetzungen der
Nahrungen, die zu den zwei Gruppen zugefüttert wurde, sind in Tabelle
V gezeigt.
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Die Ratten konnten sich frei mit
der spezifizierten Nahrung zusammen mit Wasser für 6 Wochen ernähren, die
Aufnahmemenge wurde täglich
aufgezeichnet, und die Ratten wurden alle 7 Tage gewogen, und dann
wurde die Aufzeichnung analysiert. Alle Ratten zeigten eine normale
Wachstumsgeschwindigkeit, und es wurde kein signifikanter Unterschied
unter den zwei Gruppen bezüglich
der Nahrungsaufnahmemenge und des Gewichtsgewinns beobachtet.
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(Schritt 2) Herstellung
von Mikrosomen
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Um die Wirkung der Fütterung
des Zitrusfrüchteschalenextrakts
an Ratten auf die Aktivität
von ACAT zu bestimmen, wurden Mikrosomen aus dem Lebergewebe separiert,
um als eine Enzymquelle verwendet zu werden.
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Zunächst wurden die Ratten der
zwei Gruppen durch Enthaupten geopfert, und die Leber wurde jeweils
herausgeschnitten. 1 g jeder der Lebern wurde in 5 ml Homogenisierungsmedium
(0,1 M KHP2O4, pH-Wert
7,4, 0,1 mM EDTA und 10 mM β-Mercaptoethanol)
homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 3.000xg für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert
und das Überstehende,
das so erhalten wurde, wurde bei 15.000xg für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert,
um ein Überstehendes
zu erhalten. Das Überstehende
wurde in ein Ultrazentrifugenröhrchen
(Beckman) eingesetzt und bei 100.000xg für 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert,
um Mikrosomalpellets zu erhalten, welche dann in 3 ml des Homogenisierungsmediums
suspendiert wurden und bei 100.000xg für 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert
wurden. Die Pellets, die so erhalten wurden, wurden in 1 ml des
Homogenisierungsmediums suspendiert. Die Konzentration der Proteine
in der resultierenden Suspension wurde durch das Lowry-Verfahren
bestimmt und dann auf 4 bis 8 mg/ml eingestellt. Die resultierende
Suspension wurde in einem Tiefkühler
(Biofreezer, Forma Scientific Inc.) gelagert.
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(Schritt 3) ACAT-Prüfung
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6,67 μl einer l mg/ml Cholesterinlösung in
Aceton wurden mit 6 μl
von 10% Triton WR-1339
(Sigma Co.) in Aceton gemischt und dann wurde Aceton aus der Mischung
durch Verdampfung unter einem Stickstoffluß entfernt. Destilliertes Wasser
wurde zu der resultierenden Mischung zu einer Cholesterinkonzentration von
30 mg/ml zugefügt.
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Zu 10 μl der resultierenden. wässrigen
Cholesterinlösung
wurden 10 μl
1 M KHP2O4(pH-Wert
7,4), 5 μl
0,6 mM Rinderserumalbumin (BSA), 10 μl Mikrosomlösung, erhalten in (Schritt
2) und 55 μl
destilliertes Wasser (Gesamt 90 μl)
zugefügt.
Die Mischung wurde in einem Wasserbad bei 37°C für 30 Minuten vorinkubiert.
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10 μl einer (1-14C)-Oleoyl-CoA-Lösung (0,05 μCi, Endkonzentration:
10 μM) wurden
zu der vorinkubierten Mischung zugefügt, und die resultierende Mischung
wurde in einem Wasserbad bei 37°C
für 30
Minuten inkubiert. Zugefügt
zu der Mischung wurden 500 μl
Isopropanol: Heptan-Mischung (4 : 1 (v/v)), 300 μl Heptan und 200 μl 0,1 M KHP2O4 (pH 7,4), und
die Mischung wurde gründlich
mit einem Wirbelmischer vermischt und konnte bei Raumtemperatur
für 2 Minuten
stehen.
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200 μl des resultierenden Überstehenden
wurden in eine Scintillationsflasche eingeführt, und 4 ml Scintillationsflüssigkeit
(Lumac) wurden zugefügt.
Die Mischung wurde hinsichtlich der Radioaktivität mit einem 1450 Microbeta-Flüssigkeitscintillationszähler (Wallacoy,
Finnland) geprüft.
ACAT-Aktivität
wurde als Picomol Cholesteryloleat, synthetisiert pro Minute pro
mg Protein (pmol/min/mg Protein), berechnet. Das Ergebnis ist in
Tabelle VI gezeigt.
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Wie in Tabelle VI erkannt werden
kann, ist die ACAT-Aktivität,
die für
die Ratten in der Gruppe mit Zitrusfrüchteschalenextrakt beobachtet
wird, um 32% geringer als diejenige der Kontrollgruppe.
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Beispiel 12: Wirkung der
Aufnahme von Zitrusfrüchteschalenextrakt
auf eine HMG-CoA-Reduktaseinhibierung
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(Schritt 1) Herstellung
von Mikrosomen
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Um die Wirkung einer Fütterung
von Zitrusfrüchteschalenextrakt
an Ratten auf die Aktivität
von HMG-CoA-Reduktase, einem Regulationsenzym der Cholesterinsynthese
in der Leber, zu bestimmen, wurden Mikrosomen aus dem Lebergewebe
separiert, um als eine Enzymquelle verwendet zu werden.
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Zunächst wurden die Ratten der
zwei Gruppen, die wie in (Schritt 1) von Beispiel 11 hergestellt
wurden, durch Enthauptung geopfert, und die Leber wurde jeweils
herausgeschnitten und unmittelbar in einem eiskalten Homogenisierungsmedium
(50 mM KHP2O4(pH-Wert
7,0), 0,2M Sucrose, 2, mM Dithiothreitol (DTT)) angeordnet. Die
Lebern wurden in dem Homogenisierungsmedium (2 ml Medium/g der Leber)
mit einem Waring-Vermischer
für 15
Sekunden (drei Hübe
mit einem motorgetriebenen Teflon-Pistill in einem Potter-Elvehjem-artigen
Glashomogenisierer) homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 15.000 × g für 10 Minuten
zentrifugiert und das Überstehende,
das so erhalten wurde, wurde bei 100.000 × g für 75 Minuten zentrifugiert,
um Mikrosomalpellets zu erhalten, welche dann resuspendiert wurden
in dem Homogenisierungsmedium, enthaltend 50 mM EDTA, und bei 100.000 × g für 60 Minuten
zentrifugiert wurden. Das Überstehende,
das das Mikrosom enthielt, wurde als eine Enzymquelle verwendet.
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(Schritt 2) HMG-CoA-Reduktaseprüfung
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Die Aktivität der HMG-CoA-Reduktase wurde
durch Verwendung von [14C]HMG-CoA gemäß dem Verfahren
von Shapiro et. al. (Biochemica et Biophysica Acta, 370, 369– 377(1974))
wie folgt bestimmt.
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Das Enzym in dem Überstehenden, das das Mikrosom
enthält,
erhalten in (Schritt 1), wurde bei 37°C für 30 Minuten aktiviert. Zugefügt zu einem
Reaktionsröhrchen
wurden 20 μl
HMG-CoA-Reduktase-Prüfpuffer (0,25
M KHP2O4(pH 7,0),
8,75 mM EDTA, 25 mM DTT, 0,45 M KCl und 0,25 mg/ml/BSA), 5 μl 50 mM NADPH, 5 μl [14C] HMG-CoA (0,05 μCi/Röhrchen, Endkonzentration 120 μM) und 10 μl aktiviertes
Mikrosomalenzym (0,03–0,04
mg), und die Mischung wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die
Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl 6 M HCl zu der Mischung beendet,
und die Mischung wurde bei 37°C
für 15
Minuten inkubiert, um eine vollständige Lactonisierung des Produkts
(Mevalonat) zu ermöglichen.
Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation bei 10.000xg für 1 Minute
entfernt, und das Überstehende
wurde auf eine Silicagel 60G TLC-Platte (Altech, Inc., Newark, U.S.A.)
aufgetragen und dann mit Benzol : Aceton (1 : 1, v/v) entwickelt.
Ein Bereich mit einem Rf-Wert
in einem Bereich von 0,65 bis 0,75 wurde entfernt durch Kratzen
mit einem wegwerfbaren Deckschieber und bezüglich der Radioaktivität mit einem
1450 Microbeta-Flüssigkeitsscintillationszähler (Wallacoy,
Finnland), geprüft.
Enzymaktivitäten
wurden als Picomol Mevalonsäure,
synthetisiert pro Minute pro mg Protein (pmol/min/mg Protein), berechnet.
Das Ergebnis ist in Tabelle VII gezeigt.
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Wie aus dem Ergebnis in Tabelle VII
erkannt werden kann, zeigten Ratten in der Kontrollgruppe eine verhältnismäßig hohe
HMG-CoA-Reduktaseaktivität,
während
die HMG-CoA-Aktivität,
die mit Ratten in der Gruppe mit Zitrusfrüchteschalenextrakt beobachtet
wurde, um 34% geringer war als diejenige der Kontrollgruppe.
