DE69915848T2 - Verwendung von neohesperidin dc zur herstellung eines medikaments zur vorbeugung bzw. behandlung von krankheiten aufgrund erhoehter blutfettwerte - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Neohesperidin-Dihydrochalkon für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung einer durch einen erhöhten Blutfettspiegel hervorgerufenen Krankheit bei einem Säugetier.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es wurde berichtet, dass Blutfette, insbesondere Cholesterin und Triglycerid, eng mit verschiedenen Arten von Krankheiten verbunden sind, wie zum Beispiel koronare kardiovaskuläre Krankheiten, beispielsweise Arteriosklerose und Hypercholosterimenia und Fettleber. Cholesterin, ein Fettsteoridalkohol, ist ein Blutfett, welches aus gesättigtem Fett in der Leber produziert wird. Triglyceride sind eine andere Art von Blutfetten, welche dafür bekannt sind, dass sie das Risiko verschiedener Krankheiten erhöhen. Es ist auch berichtet worden, dass ein erhöhter Blut- oder Plasmacholesterinwert die Ablagerung von Fett, Phagozyten bzw. Fresszellen und Schaumzellen an der Wand von Blutgefäßen hervorrufen, wobei solche Ablagerungen zu Plaquebildung und dann zu Arteriosklerose führen (siehe Ross, R., Nature, 362, 801–809 (1993)). Eine der Metho den zum Verringern des Plasmacholesterinwerts ist eine Ernährungstherapie zur Reduzierung der Aufnahme von Cholesterin und Fetten. Eine weitere Methode besteht darin, die Absorption von Cholesterin durch Hemmen der darin enthaltenen Enzyme zu hemmen.
  • Die EC-Süßstoffvorschrift 94/35/EC (Juni 1994) beschreibt die Verwendung von Neohesperidin als einen Süßstoff im Lebensmittelsektor. Des weiteren ist aus dem RÖMPP Lexikon Lebensmittelchemie, Stuttgart: Georg Thieme Verlag, 1995, Seite 218, die hohe Intensität von Neohesperidin-Dihydrochalkon als ein Süßstoff bekannt.
  • Acyl CoA-Cholesterin-o-Acyltransferase (ACAT) unterstützt die Esterbildung von Cholesterin im Blut. Schaumzellen werden durch die Einwirkung von ACAT gebildet und beinhalten eine große Menge von Cholesterinester, welche von Lipid- bzw. Fettproteinen mit geringer Dichte getragen werden. Die Bildung von Schaumzellen an der Wand von Arterien erhöht sich mit der ACAT-Aktivität und dementsprechend kann ein ACAT-Hemmer auch ein Mittel zur Verhinderung von Arteriosklerose sein. Des weiteren ist berichtet worden, dass der Blutwert von LDL-Cholesterin durch das Hemmen der ACAT-Aktivität verringert werden kann (siehe Witiak, D. T. und D. R. Feller (Eds.), Anti-Lipidemic Drugs: Medicinal, Chemical and Biochemical Aspects, Elsevier, Seiten 159–195 (1991)).
  • Des weiteren ist berichtet worden, dass Hypercholesterimenia durch Verringern des Cholesterin-Biosynthese-Werts durch Hemmung des Cholesterinestertransferproteins (CETP), welches den Cholesterintransfer zwischen den Lipoproteinen herstellt, oder 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Koenzym A (HMG-CoA)-Reduktase, welches die Synthese von Mevalonsäure, einem Zwischenprodukt in der Biosynthese von Sterolen oder Isoprenoiden herstellt, effektiv behandelt werden kann (siehe Cardiovascular Pharmacology, William W. Parmley und Kanu Chatterjee Ed., Wolfe Publishing, Seiten 8.6–8.7, 1994).
  • Aus diesem Grunde wurden unzählige Versuche unternommen, Arzneimittel zu entwickeln, welche HBG-CoA-Reduktase hemmen, und, als ein Ergebnis, wurden verschiedene aus Penizillin sp. und Aspergillus sp. gewonnene Verbindungen kommerzialisiert. Insbesondere wurden kommerzialisiert Lovastatin® und Simvastatin®, entwickelt von Merck Co., USA, und Pravastatin®, entwickelt von Sankyo Co., Japan (siehe C. D. R. Dunn, Stroke: Trends, Treatment and Markets, SCRIPT Report, PJB Publications Ltd., 1995).
  • Diese Arzneimittel sind jedoch sehr teuer und es ist bekannt, dass eine Verabreichung derselben über eine längere Zeit einen nachteiligen Nebeneffekt auf das zentrale Nervensystem hat. Des weiteren, obwohl Lovastatin® und Simvastatin® den Plasma-LDL-Cholesterinwert durch Verbessern der Aktivität von LDL-Rezeptor in der Leber verbessern, haben sie Nebenwirkungen, wie zum Beispiel eine Erhöhung der Creatinkinase in der Leber und Rhabdomyolyse (siehe Farmer, J. A., et al., Baillers-clin. Endocrinol. Metal., 9, 825–847 (1995)). Demzufolge besteht noch immer ein Bedürfnis, einen kostengünstigen und nichttoxischen Hemmer von HMG-CoA-Reduktase zu entwickeln.
  • Ein weiteres Beispiel einer mit einem erhöhten Blutfettwert zusammenhängenden Krankheit ist die Fettleber. Insbesondere führt die exzessive Aufnahme von fetthaltigen Lebensmitteln und Alkohol zur Fettleber, bei welcher eine große Menge von Fetten in dem Lebergewebe abgelagert wird und die Werte von Serum GOT (Glutamat-Oxaloacetat-Transaminase), GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase) und γ-GTP (γ-Glutamyl-Transpeptidase) erhöht sind (siehe T. Banciu et al., Med. Interne., 20, 69–71 (1982); und A. Par et al., Acta. Med. Acad. Sci. Hung., 33, 309–319 (1976)).
  • Fett sammelt sich in der Leber hauptsächlich in der Form von Triglyceriden und Fettsäuren und auch in einem geringeren Ausmaß in der Form von Cholesterin an. Des weiteren ist berichtet worden, dass eine der Hauptanzeichen von Fettleber ein hoher Blutgehalt an Cholesterin und/oder Triglycerid ist. Aus diesem Grund ist Fettleber eng mit den Blutwerten von Cholesterinen und/oder Triglycerid verbunden.
  • Bioflavonoide sind Polyphenol-Antioxidationsmittel, welche in der natürlichen Welt in großem Ausmaß existieren, insbesondere in Gemüse, Früchten, Wein und ähnlichem. Es ist berichtet worden, dass die Bioflavonoide verschiedene nützliche pharmakologische Aktivitäten zeigen, wie zum Beispiel entzündungshemmende, kapillarverstärkende, antioxidative, Antikrebs-, Antiviren- und Anti-Blutplättchen-Verklumpungsaktivitäten (siehe O. Benavente-Garcia et al., Uses and properties of citrus flavonoids, J. Agr. Food Chem., 45, 4506–4515, 1997).
  • Repräsentative Bioflavonoide, welche in Zitrusfrüchten gefunden werden können, sind in Tabelle 1 aufgelistet.
  • Tabelle 1
    Figure 00050001
  • Neohesperidin-Dihydrochalkon, ein Bioflavonoid, welches in einfacher Weise aus einer Grapefruit gewonnen werden oder aus Naringin synthetisch hergestellt werden kann, ist dafür bekannt, eine 1.000 bis 1.500-fach höhere Süßkraft als Saccharose zu haben.
  • Die vorliegenden Erfinder haben versucht, eine neue pharmakologische Verwendung von Bioflavonoiden zu entwickeln, welche in Kräutern, Nahrungsmitteln, Gemüse und Früchten übermäßig vorhanden sind. Als ein Ergebnis ist entdeckt worden, dass Neohesperidin-Dihydrochalkon bei der Behandlung oder Verhütung von mit erhöhten Blutfettwerten verbundenen Krankheiten effektiv ist. Insbesondere kann es Plasmacholesterinwerte erheblich verringern; die Aktivitäten von HMG-CoA-Reduktase und ACAT verhindern; die Ansammlung eines Phagozyt-Lipidkomplexes an der Endothelialwand einer Arterie hemmen; und Leberfunktionsstörungen bei einem Säugetier verhindern.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Demzufolge ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von Neohesperidin-Dihydrochalkon zur Herstellung eines Medikaments gemäß Anspruch 1 zu schaffen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die oben genannte und andere Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung deutlicher, wenn sie in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen gelesen wird, in welchen:
  • 1A, 1B und 1C das arterielle Endothelium der Kaninchen zeigen, denen 1% Cholesterin; 1% Cholesterin plus 1 mg/kg Lovastatin®; und 1% Cholesterin plus 0,05% Neohesperidin-Dihydrochalkon jeweils verabreicht wurden; und
  • 2A, 2B und 2C die mikroskopischen Merkmale der Lebern der Kaninchen darstellen, denen jeweils 1% Cholesterin; 1% Cholesterin plus 1 mg/kg Lovastatin®; und 1% Cholesterin plus 0,05 Neohesperidin-Dihydrochalkon verabreicht wurden.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Durch die gesamte Beschreibung bezeichnet die Angabe "Blutfett" ein in dem Blut vorhandenes Fett. Das Blutfett wird durch Cholesterine und Triglyceride repräsentiert, welche in dem Blut enthalten sind.
  • Die Bezeichnung "hoher oder erhöhter Wert" eines Blutfettes bedeutet höher als der normale Wert, wobei der normale Wert sich mit bestimmten Bedingungen eines Patienten verändert, wie zum Beispiel Alter, Geschlecht und Körpergewicht. Ein hoher Blutfettwert wird im allgemeinen als gesundheitsschädlich angesehen.
  • Die Bezeichnung "mit einem erhöhten Blutfettwert in Verbindung stehende Krankheit" meint eine Krankheit, welche durch einen hohen oder erhöhten Blutfettwert verursacht wird und/oder eine Krankheit, deren Symptome einen hohen oder erhöhten Blutfettwert beinhalten. Beispiele solcher Krankheiten beinhalten Lipidspiegelerhöhung, Arteriosklerose, Angina Pectoris, Schlaganfall und hepatische Krankheiten, wie zum Beispiel Leberverfettung.
  • Neohesperidin-Dihydrochalkon (C28H36O15, M. W. 612.60, siehe Merck Index 11. Ausgabe (1989)) kann in einfacher Weise aus der Schale einer Grapefruit extrahiert oder gemäß einem konventionellen Verfahren aus Naringin synthetisch hergestellt werden.
  • Neohesperidin-Dihydrochalkon zeigt sowohl hemmende als auch therapeutische Wirkungen auf mit erhöhten Blutfettwerten in Verbindung stehenden Krankheiten, zum Beispiel Lipidspiegelerhöhung, Arteriosklerose, Angina Pectoris, Schlaganfall und hepatische Krankheiten. Des weiteren zeigt Neohesperidin-Dihydrochalkon trotz seiner hohen Effizienz keine Toxizität, wenn sie mit einer Dosis von 1.000 mg/kg einer Maus oral verabreicht wird. Des weiteren beeinträchtigt sie die Leberfunktion nicht in nachteiliger Weise.
  • Eine pharmazeutische Formulierung kann gemäß einem bekannten Verfahren hergestellt werden. Beim Herstellen der Formulierung wird der aktive Inhaltsstoff vorzugsweise mit einem Trägerstoff vermischt oder verdünnt oder in einen Trägerstoff eingeschlossen, welcher in der Form einer Kapsel, eines Kissen oder eines anderen Behälters vorliegen kann. Wenn der Trägerstoff als ein Verdünnungsmittel dient, kann es sich um einen Feststoff, Semi-Feststoff oder ein flüssiges Material handeln, welches als ein Bindemittel, Träger oder Medium für den aktiven Inhaltsstoff dient. Somit können die Formulierungen in Form einer Tablette, Pille, Pulver, Kissen, Elixier, Suspension, Emulsion, Lösung, Sirup, Aerosol, weiche und harte Gelatinekapsel, sterile indizierbare Lösung, steriles abgepacktes Pulver und ähnliches vorliegen.
  • Beispiele von geeigneten Trägerstoffen, Trägern und Verdünnungsmitteln sind Laktose, Dextrose, Saccharose, Sorbitol, Mannitol, Stärke, Gummiarabicum, Alginate, Gelatine, Kalziumphosphat, Kalziumsilikat, Zellulose, Methylzellulose, mikrokristalline Zellulose, Polyvinylpyrrolidon, Wasser, Methylhydroxybenzoat, Porpolyhdroxybenzoat, Talg, Magnesiumstearat und Minearlöl. Die Formulierungen können zusätzlich Füllstoffe, aglutinationshemmende Mittel, Schmiermittel, Befeuchtungsmittel, Geschmacksverstärker, Emulgatoren, Konservierungsmittel und ähnliches beinhalten. Die Zusammensetzungen der Erfindung können so formuliert werden, dass sie eine schnelle, langanhaltende oder verzögerte Freigabe des aktiven Inhaltsstoffs nach ihrer Verabreichung an ein Säugetier unter Verwendung eines beliebigen, aus dem Stand der Technik gut bekannten Verfahrens aufweist.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedenen Wegen, einschließlich oraler, transdermaler, subkutaner, intravenöser und intramuskulärer Einführung verabreicht werden. Im Falle eines Menschen kann eine typische Tagesdosis. von Neohesperidin-Dihydrochalkon sich in einem Bereich von ungefähr 0,1 bis 500 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 1 bis 100 mg/kg Körpergewicht, bewegen, und kann in einer einzelnen Dosis oder in aufgeteilten Dosen verabreicht werden.
  • Es sollte jedoch deutlich sein, dass die Menge des aktiven Inhaltsstoffs, die tatsächlich verabreicht wird, im Hinblick auf verschiedene relevante Faktoren festgelegt werden sollte, einschließlich des zu behandelnden körperlichen Zustands, der ausgewählten Art der Verabreichung, des Alters, des Geschlechts und des Körpergewichts des jeweiligen Patienten und der Schwere der Symptome des Patienten.
  • Des weiteren kann Neohesperidin-Dihydrochalkon vorteilhafterweise in Lebensmitteln oder Getränken beinhaltet sein, zum Zwecke der Behandlung oder Verhinderung von mit erhöhten Blutfettwerten in Verbindung stehenden Krankheiten, zum Beispiel Lipidspiegelerhöhung, Arteriosklerose, Angina Pectoris, Schlaganfall und hepatischen Krankheiten. Die Lebensmittel oder Getränke können Fleisch; Säfte, wie zum Beispiel Gemüsesäfte (zum Beispiel Karottensaft und Tomatensaft) und Fruchtsäfte (zum Beispiel Orangensaft, Traubensaft, Ananassaft, Apfelsaft und Bananensaft); Schokolade, Snacks, Süßigkeiten; Pizza, aus Getreidemehl hergestellte Lebensmittel, wie zum Beispiel Brote, Kuchen, Cracker, Kekse, Biskuits, Nudeln und ähnliches; Gummi bonbons; Milchprodukte, wie zum Beispiel Milch, Käse, Joghurt und Eiskrem; Suppen; Fleischbrühen; Pasten, Ketschups und Soßen; Tees; alkoholische Getränke; kohlensäurehaltige Getränke; Vitaminkomplexe; und verschiedene Gesundheits-Nahrungsmittel beinhalten.
  • Der Anteil des Neohesperidin-Dihydrochalkons in einem Lebensmittel oder Getränk kann sich in einem Bereich von 0,01 bis 20 Gewichts-%, vorzugsweise von 0,1 bis 5 Gewichts-%, bewegen.
  • Wie oben beschrieben, kann Neohesperidin-Dihydrochalkon als ein effektiver, nichttoxischer, pharmazeutischer Wirkstoff zum Behandeln oder Verhindern von mit erhöhten Blutfettwerten in Verbindung stehenden Krankheiten, zum Beispiel Lipidspiegelerhöhung, Arteriosklerose, Angina Pectoris, Schlaganfall und hepatischen Krankheiten verwendet werden.
  • Die nachfolgenden Beispiele sind dafür vorgesehen, die vorliegende Erfindung weiter darzustellen.
  • Des weiteren sind die unten angegebenen Prozentsätze für Feststoff in Feststoffmischung, Flüssigkeit in Flüssigkeit und Feststoff in Flüssigkeit jeweils auf einer Gewichts-/Gewichts-, Volumen-/Volumen- und Gewichts-/Volumenbasis angegeben, und alle Reaktionen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn dies nicht speziell anders angegeben ist.
  • Beispiel 1: Toxizität von oral verabreichtem Neohesperidin-Dihydrochalkon
  • 12 sieben Wochen alte, spezifisch erregerfreie ICR weibliche Mäuse, sechs weibliche Mäuse, welche jeweils ungefähr 25 bis 29 g wogen, und sechs männliche Mäuse, welche jeweils ungefähr 34 bis 38 g wogen, wurden in einer Umgebung von 22 ± 1°C, 55 ± 5% relative Luftfeuchtigkeit und 12L/12D Fotoperiode gehalten. Futter (Cheiljedang Co., Mäuse- und Rattenfutter) und Wasser wurden sterilisiert und an die Mäuse verfüttert.
  • Neohesperidin-Dihydrochalkon, welches von der Aldrich-Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) gekauft wurde, wurde in 0,5% Tween 80 mit einer Konzentration von 100 mg/ml aufgelöst und die Lösung wurde den Mäusen in einer Menge von 0,2 ml pro 20 g des Körpergewichts der Mäuse oral verabreicht. Die Lösung wurde einmal verabreicht und die Mäuse wurden für 10 Tage auf Zeichen von Nebenwirkungen oder Tod gemäß dem folgenden Schema überwacht: 1, 4, 8 und 12 Stunden nach der Verabreichung und jede 12 Stunden danach. Die Gewichtsveränderungen der Mäuse wurden aufgezeichnet, um den Effekt von Neohesperidin-Dihydrochalkon zu prüfen. Des weiteren wurden die Mäuse am 10. Tag getötet und die inneren Organe wurden auf Sicht überprüft.
  • Am Tag 10 waren alle Mäuse am Leben und das Neohesperidin-Dihydrochalkon zeigte bei einer Dosis von 1.000 mg/kg keine Toxizität. Die Autopsie ergab, dass die Mäuse keinerlei pathologische Abnormalität entwickel ten und es wurde während der zehntägigen Testperiode kein Gewichtsverlust festgestellt. Daraus folgt, dass Neohesperidin-Dihydrochalkon nicht toxisch ist, wenn es einem Tier oral verabreicht wird.
  • Beispiel 2: Effekt von Neohesperidin-Dihydrochalkon auf Plasmacholesterin, HDL-Cholesterin und neutrale Fettwerte
  • (Schritt 1) Verabreichung von Neohesperidin-Dihydrochalkon an Ratten
  • 20 drei Wochen alte, weiße Sprague-Dawley-Ratten (Taihan Zentrum für Labortiere, Korea), welche jeweils ungefähr 90 bis 110 g wogen, wurden in zwei Diätgruppen durch ein zufälliges Blockmuster gleich verteilt. Die Ratten der zwei Gruppen wurden mit zwei unterschiedlichen Hoch-Cholesterin-Diäten gefüttert, d. h. AIN-76 Labortierdiät (ICN Biochemicals, Cleveland, OH, USA), welche 1% Cholesterin (Kontrollgruppe) enthielt, und 1% Cholesterin plus 0,05% Neohesperidin-Dihydrochalkon (Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe). Die Zusammensetzungen der an die zwei Gruppen verfütterten Diäten sind in Tabelle II dargestellt.
  • Tabelle II
    Figure 00130001
  • Figure 00140001
  • Es wurde den Ratten erlaubt, sechs Wochen lang von der jeweiligen Diät zusammen mit Wasser zu fressen, wobei die aufgenommene Menge täglich aufgezeichnet wurde und die Ratten alle sieben Tage gewogen wurden und das Aufgezeichnete analysiert wurde. Alle Raten zeigten eine normale Wuchsrate und es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den zwei Gruppen bezüglich der Menge der aufgenommenen Nahrung und der Gewichtszunahme festgestellt.
  • (Schritt 2) Ermittlung des gesamten Cholesterin-, HDL-Cholesterin- und neutralen Fettwertes im Blut
  • Die Wirkungen der Verabreichung von Neohesperidin-Dihydrochalkon an Ratten auf den Plasmacholesterin- und den neutralen Fettgehalt wurden wie folgt ermittelt.
  • Die Ratten der zwei in Schritt 1 erhaltenen Diätgruppen wurden getötet und es wurden Blutproben von denselben genommen. Das Blut wurde zwei Stunden stehen gelassen und mit 3.000 U/min für 15 Minuten zentrifugiert und das obenauf Schwimmende wurde abgetrennt und vor der Verwendung in einem Tiefkühlgerät gelagert. Die chemische Analyse des Blutes wurde durch Anwendung eines chemischen Blutanalysators (CIBA Corning 550 Express, USA) durchgeführt, um die Veränderungen im gesamten Cholesterin-, HDL-Cholesterin- und Triglycerid-Wert zu ermitteln. Das Ergebnis ist in Tabelle III dargestellt. Tabelle III
    Figure 00150001
  • Total-C
    Gesamtcholesterin
    HDL-C
    HDL-Cholesterin
    TG
    Triglycerid
  • Wie aus Tabelle III ersichtlich ist, verringert sich der gesamte Plasmacholesterinwert um 15% bei der Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe im Vergleich mit derjenigen der Kontrollgruppe. Des weiteren wird der neutrale Fettwert bei der Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe um 9% reduziert verglichen mit derjenigen der Kontrollgruppe.
  • Beispiel 3: Aktivität von Neohesperidin-Dihydrochalkon in der ACAT-Hemmung
  • (Schritt 1) Präparation von Mikrosomen
  • Um den Effekt des Fütterns von Neohesperidin-Dihydrochalkon an Ratten bezüglich der Aktivität von ACAT zu ermitteln, wurden Mikrosome von Lebergewebe abgetrennt, welches als eine Enzymquelle verwendet wurde.
  • Jeweils 1 g der Lebern, die von jeder Gruppe der Ratten von Beispiel 2 entnommen wurde, wurde in 5 ml Homogenisationsmedium homogenisiert (0,1 M KH2PO4, pH 7,4, 0,1 mM EDTA und 10 mM β-Mercaptoethanol). Das Homogenat wurde bei 3.000 xg für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert und das dabei erlangte oben Schwimmende wurde bei 15.000 xg für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um ein oben Schwimmendes zu erlangen. Das oben Schwimmende wurde in eine Ultrazentrifugalröhre (Beckman) gefüllt und bei 10.000 xg für 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert, um mikrosomische Kügelchen zu erhalten, welche dann in 3 ml des Homogenisationsmediums suspendiert und bei 100.000 xg für eine Stunde bei 4°C zentrifugiert wurden. Die dabei erhaltenen Kügelchen wurden in 1 ml des Homogenisationsmediums suspendiert. Die Proteinkonzentration der sich ergebenden Suspension wurde durch die Lowry's Methode ermittelt und dann auf 4 bis 8 mg/ml eingestellt. Die resultierende Suspension wurde in einem Tiefkühlgerät (Biofreezer, Forma Scientific Inc.) gelagert.
  • (Schritt 2) ACAT-Untersuchung
  • 6,67 μl einer 1 mg/ml Cholesterin-Lösung in Azeton wurde mit 6 μl von 10% Triton WR-1339 (Sigma Co.) in Azeton vermischt und dann wurde das Azeton mittels Evaporation unter einem Stickstoffstrom entfernt. Zu der resultierenden Mischung wurde destilliertes Wasser hinzugefügt, um die Konzentration von Cholesterin auf 30 mg/ml einzustellen.
  • Zu den 10 μl der resultierenden wässrigen Cholesterinlösung wurden 10 μl von 1 M KH2PO4 (ph 7,4), 5 μl von 0,6 mM Bovin-Serum-Albumin (BSA), 10 μl der in (Schritt 1) erhaltenen Mikrosom-Lösung und 55 μl destilliertes Wasser (insgesamt 90 μl) hinzugefügt. Die Mischung wurde in einem Wasserbad bei 37°C für 30 Minuten vorgebrütet bzw. gezüchtet.
  • 10 μl einer (1-14C) Oleyl-CoA-Lösung (0,05 μCi, Endkonzentration: 10 μM) wurde zu der vorgebrüteten Mischung zugefügt und die resultierende Mischung wurde in einem Wasserbad bei 37°C für 30 Minuten gebrütet bzw. gezüchtet. Zu der Mischung wurden 500 μl einer Isopropyl : Heptan-Mischung (4 : 1 (v/v)), 300 μl Heptan und 200 μl 0,1 M KH2PO4 (pH 7,4) hinzugefügt, und die Mischung wurde unter Verwendung eines Wirbelmischers kräftig gemischt und dann bei Raumtemperatur für 2 Minuten stehen gelassen.
  • 200 μl des resultierenden obenauf Schwimmenden wurde in eine Szintillationsflasche gegeben und 4 ml einer Szintillationsflüssigkeit (Lumac) wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde auf Radioaktivität mit einem 1450 Microbeta-Flüssigkeits-Szintillationszählers (Wallacoy, Finnland) untersucht. ACAT-Aktivität wurde als Pikomol des pro min pro mg Protein (pMol (min/mg Protein) synthetisierten Cholesterin-Oleats berechnet. Das Ergebnis ist in Tabelle IV dargestellt.
  • Tabelle IV
    Figure 00180001
  • Wie aus Tabelle IV deutlich wird, ist die ACAT-Aktivität, die in der Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe festgestellt wurde, um 20% geringer als diejenige der Kontrollgruppe.
  • Beispiel 4: Aktivität von Neohesperidin-Dihydrochalkon bei der HMG-CoA-Reduktase Hemmung
  • Um die Aktivität von HMG-CoA-Reduktase zu ermitteln, wurde nach einer gewissen Modifikation die Hulcher-Methode verwendet (siehe J. Lipid Res., 14, 625–641 (1973)). Bei dieser Methode wird die Konzentration des Koenzyms-A (CoA-SH), welches produziert wird, wenn HMG-CoA durch die Wirkung von HMG-CoA-Reduktase zu einem Mevalonatsalz reduziert wird, durch Spektroskopie ermittelt und die Aktivität der HMG-CoA-Reduktase wird daraus berechnet.
  • (Schritt 1) Präperation von Mikrosomen
  • 3 g des jeder Gruppe von Ratten aus Beispiel 2 entnommenen Lebergewebes wurde aufeinanderfolgend mit 100 ml einer kalten Saline (0,15 M NaCl) und 100 ml einer kalten Pufferlösung A (0,1 M Triethanolamin, HcL/0,2 M EDTA/2 mM Dithiothreitol (DTT)) gewaschen. Die kalte Pufferlösung A wurde dem Lebergewebe in einer Menge von 2 ml pro 1 g des Lebergewebes hinzugefügt und die Mischung wurde mit einem Homogenisierer homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 15.000 xg für 15 Minuten zentrifugiert und dann wurde das obenauf Schwimmende mit 100.000 xg für 60 Minuten ultrazentrifugiert, um mikrosomische Abscheidungen zu erhalten. Der dadurch erhaltenen Niederschlag wurde mit einer kalten Pufferlösung A gewaschen und in einer 1,5 ml-Röhre bei 70°C aufbewahrt.
  • (Schritt 2) Untersuchung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität
  • Die bei der Untersuchung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität verwendeten Reaktionssubstrate waren wie folgt: i) Pufferlösung B: 0,1 M Triethanolamin, HCl/0,02 M EDTA (pH 7,4), ii) HMG-CoA-Lösung: 150 μMol/Nährmedium, und iii) NADPH-Lösung: 2 μMol/Nährmedium.
  • Die Suspension (Mikrosom) wurde mit dem Reaktionssubstrat vermischt und die Mischung wurde in eine Zentrifugationsröhre eingebracht und bei 37°C für 30 Minuten zur Reaktion gebracht. Die Reaktionsmischung wurde mit 20 μl von 0,01 M Natriumarsen behandelt und für 1 Minute stehen gelassen und dann wurde es mit 100 μl einer Zitrat-Pufferlösung (2 M Zitrat/3% Natriumtungstat, pH 3,5) bei 37°C für 10 Minuten reagiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 25.000 xg für 15 Minuten, um Protein zu entfernen. 1 ml des damit erlangten obenauf Schwimmenden wurde in einen Schlauch mit einem Deckel gebracht und es wurde 0,1 ml einer 2 M tris-HCl-Lösung (pH 10,6) und 0,1 ml einer 2 M tris-HCl-Lösung (pH 8,0) zugefügt, um den pH-Wert der Reaktanz auf 8,0 einzustellen.
  • Dann wurde die Reaktanz mit 20 μl einer DTNB-Pufferlösung (3 mM DTNB/0,1 M triethanolamin/0,2 M EDTR, pH 7,4) gemischt und die Extinktion der Mischung wurde bei 412 nm ermittelt, um die Menge der CoA-SH (Aktivität der HMG-CoA-Reduktase) zu berechnen.
  • Das Ausmaß der Hemmung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität durch Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde basierend auf dem oben angegebenen Ergebnis berechnet. Das Ergebnis ist in Tabelle V dargestellt.
  • Tabelle V
    Figure 00210001
  • Wie aus Tabelle V ersichtlich ist, ist die in der Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe festgestellte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität um 30% geringer als diejenige in der Kontrollgruppe.
  • Beispiel 5: Auswirkung der Verabreichung von Neohesperidin-Dihydrochalkon an einen Menschen auf den Plasma-Fettstoffwechsel
  • Zwei Männern im Alter von Mitte 50 wurde eine tägliche orale Dosis von 10 mg/kg Neohesperidin-Dihydrochalkon in Form einer Kapsel für 60 Tage verabreicht. Der Plasmacholesterin- und neutrale Lipid-(Triglycerid)-Wert wurde vor und nach der Verabreichung ermittelt.
  • Der Plasmacholesterin- und neutrale Lipidwert wurde durch die Verabreichung von Neohesperidin-Dihydrochalkon jeweils um 20% bzw. 15% verringert.
  • Beispiel 6: Hemmung von Arteriosklerose
  • (Schritt 1) Verabreichung von Neohesperidin-Dihydrochalkon an Kaninchen
  • 30 drei Monate alte weiße Neuseeland-Kaninchen (Yeonam Horticulture and Animal Husbandry College, Korea), welche jeweils ungefähr 2,5 bis 2,6 kg wogen, wurden unter einer Temperaturbedingung von 20 ± 2°C, relativer Luftfeuchtigkeit von 55 ± 5% und Fotoperiode 12L/12D gezüchtet. Die Kaninchen wurden in drei Gruppen aufgeteilt und die drei Gruppen der Kaninchen wurden mit drei unterschiedlichen Diäten ernährt, d. h. RC4-Diät (Oriental Yeast Co., Japan), welche 1% Cholesterin enthielt (Kontrollgruppe); 1% Cholesterin + 1 mg/kg Lovastatin® (Merck, USA) (Lovastatin-Gruppe); und 1% Cholesterin plus 0,05% Neohesperidin-Dihydrochalkon (Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe). Die RC4-Diät weist 7,6% Feuchtigkeit, 22,8 rohes Protein, 2,8% rohes Fett, 8,8% rohes Natriumkarbonat bzw. Asche, 14,4 rohe Zellulose und 43,6 lösbare nitrogenfreie Substanzen auf. Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde von der Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) gekauft.
  • Die Kaninchen wurden 6 Wochen lang gefüttert, wobei sie freien Zugang zu den Diäten und Wasser hatten.
  • (Schritt 2) Chemische Analyse von Blut
  • Nach sechs Wochen wurden die Kaninchen mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin (50 mg/kg) in den Oberschenkelbereich betäubt und getötet. Eine Blutprobe wurde vom Herzen jedes Kaninchens genommen, für zwei Stunden stehen gelassen und bei 3.000 U/min für 15 Minuten zentrifugiert und das obenauf Schwimmende Serum wurde separiert und in einem Tiefkühlgerät vor der Verwendung gelagert.
  • Die chemische Analyse des Blutes wurde unter Verwendung eines chemischen Blutanalysierers (CIBA Corning 550 Express, USA) durchgeführt, um die Veränderung in GOT, GPT, γ-GTP und Gesamtcholesterinwerten zu ermitteln. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI dargestellt.
  • (Schritt 3) Analyse nach Fettstreifen in der Hauptarterie
  • Die Brust von jedem der in Schritt 2 getöteten Kaninchen wurde eingeschnitten. Der von der 1 cm über der Aortenklappe liegenden Stelle abwärts gerichtete Bereich der Hauptarterie wurde in einer Länge von ungefähr 5 cm ausgeschnitten und das die Hauptarterie umgebende Fett wurde entfernt. Die Hauptarterie wurde in der Mitte entlang der Längsachse eingeschnitten und an eine Platte angeheftet. Die feuchte Arterie wurde fotografiert und dann wurde die Färbung der Fettstreifen gemäß der Methode von Esper, E., et al. (J. Lab. Clin. Med., 121, 103–110 (1993)) wie folgt durchgeführt.
  • Ein Teil der eingeschnitten Hauptarterie wurde drei Mal mit wasserfreiem Propylenglykol für 2 Minuten gewaschen und für 30 Minuten mit einer gesättigten Lö sung von Oil Red O (ORO, Sigma Co.), die in Propylenglykol aufgelöst war, gefärbt. Danach wurde die Arterie zwei Mal mit 85% Propylenglykol für 3 Minuten gewaschen, um die verbleibende Färbungslösung zu entfernen und sie wurde dann mit physiologischer Saline gewaschen. Die Arterie wurde fotografiert und die Fotografie wurde aufgezeichnet. Der Bereich der gefärbten Region (Fettstreifenregion) wurde mit einem Bildanalysator (LEICA, Q-600, Deutschland) ermittelt und sein Verhältnis (%) zu dem gesamten Arterienbereich wurde berechnet. Das Ergebnis ist in Tabelle VI dargestellt.
  • Die 1A, 1B und 1C zeigen die Arterien der Kaninchen, denen 1% Cholesterin (Kontrollgruppe); 1% Cholesterin plus 1 mg/kg Lovastatin® (Lovastatin-Gruppe); und 1% Cholesterin plus 0,05 Neohesperidin-Dihydrochalkon (Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe) verabreicht wurde. Wie in den 1A, 1B und 1C dargestellt, wurde an dem arteriellen Endothelium derjenigen Kaninchen, denen 1% Cholesterin verabreicht wurde, eine dicke Schicht eines Phagozyt-Lipidkomplexes festgestellt, wohingegen keine oder sehr dünne Schichten des Phagozyt-Lipidkomplexes an den arteriellen Endothelien derjenigen Kaninchen festgestellt wurde, denen jeweils 1% Cholesterin plus 1 mg/kg Lovastatin® und 1% Cholesterin plus 0,05 Neohesperidin-Dihydrochalkon verabreicht wurde.
  • Demzufolge wird festgestellt, dass die Neohesperidin-Dihydrochalkon-Zusammensetzung der vorliegenden Erfin dung die Ablagerung von Phagozyten auf dem arteriellen Endothelium erheblich hemmt.
  • (Schritt 4) Histologische Beobachtung der Organe
  • Teile der Hauptarterie, des Herzens, der Lunge, der Leber, der Nieren und der Muskeln wurden von jedem der in Schritt 2 getöteten Kaninchen entnommen und auf Sicht geprüft, um zu bestätigen, dass keine pathogenische Abnormalität gefunden wurde. Eine Hälfte jedes Teils der Organe wurde tiefgefroren und die andere Hälfte wurde in 10% neutralem gepuffertem Formalin für mehr als 24 Stunden fixiert. Das fixierte Organstück wurde in ausreichender Weise mit Leitungswasser gewaschen, schrittweise mit 70%, 80%, 90% und 100% Ethanol dehydriert und dann in ein Paraffin unter Verwendung von SHANDON®, Histocentre 2, USA eingebettet. Das eingebettete Organstück wurde in 4 μm Dicke mit einem Mikrotrom (LSICA, RM2045, Deutschland) geteilt und mit Hematoxylin und Eosin gefärbt. Die gefärbte Organprobe wurde mit Xylen transparent gemacht, mit Permount fixiert und dann unter einem Mikroskop observiert, um nach dem Vorhandensein von Schädigungen zu suchen. In keiner der Organproben wurde eine Schädigung festgestellt.
  • Beispiel 7: Prävention von hepatischen Krankheiten
  • Um die Wirkung des Fütterns einer stark cholesterinhaltigen Diät mit Neohesperidin-Dihydrochalkon auf das Lebergewebe zu ermitteln, wurden die von dem in Schritt 2 getöteten Kaninchen entnommenen Leberproben gemäß dem in Fogt F. und Nanji A., Toxicology and Applied Pharmacology, 136, 87–93, 1996; und Keegan A., et al., Journal of Hepatology 23: 591–600, 1995 beschriebenen Verfahren behandelt und unter einem Mikroskop observiert, um in vier Stufen klassifiziert zu werden, d. h. 1 + (0–25%), 2 + (26–50%), 3 + (51–75%), 4 + (76–100%), basierend auf dem Verhältnis der abnormalen fetthaltigen Zellen, um die zentrale Vene im Leberazinus. Das Ergebnis ist in Tabelle VI dargestellt.
  • Die 2A, 2B und 2C stellen die mikroskopischen Merkmale der Lebern der Kaninchen dar, denen jeweils 1% Cholesterin; 1% Cholesterin plus 1 mg/kg Lovastatin®; 1% Cholesterin plus 0,05 Neohesperidin-Dihydrochalkon verabreicht wurde. In den 2A und 2B wurden um die zentrale Vene sehr viele Zellen festgestellt, die erhebliche Mengen an Fett enthielten. Im Gegensatz dazu weisen in 2C annähernd sämtliche Leberzellen eine normale Form auf, was darauf schließen lässt, dass Neohesperidin-Dihydrochalkon die Bildung von Fettleber bzw. Leberverfettung in erheblichem Maße hemmen kann.
  • Wie aus dem obigen hervorgeht, kann die Verabreichung von Neohesperidin-Dihydrochalkon den Fettstoffwechsel und die Leberfunktion bei Kaninchen verbessern und die Plaquebildung in dem Endothelium der Hauptarterie und die Bildung von Fettleber hemmen, wie in Tabelle VI dargestellt. Die Ergebnisse wurden durch den Studenten t-test unter Verwendung des Microsoft Excel (Version 7.0)-Programms getestet. Tabelle VI
    Figure 00270001
  • Total-C
    Gesamt-Cholesterin
    A
    Verhältnis (%) des Fettstreifenbereichs zu der gesamten Arterienfläche
    B
    Verhältnis von abnormalen fetthaltigen Zellen.
  • Wie aus Tabelle VI deutlich wird, verringert die Verabreichung von Neohesperidin-Dihydrochalkon die Serum GOT- und Serum GPT-Werte jeweils um 31% bzw. 35% im Vergleich mit der Kontrollgruppe. Insbesondere ist Neohesperidin-Dihydrochalkon bezüglich der Verringerung der GOT- und GPT-Werte effektiver als Lovastatin®.
  • Formulierung 1: Herstellung der pharmazeutischen Formulierung
  • Hartgelatinekapseln wurden unter Verwendung der folgenden Inhaltsstoffe hergestellt:
    Menge (mg/Kapsel)
    Aktiver Inhaltsstoff (Neohesperidin-Dihydrochalkon) 200
    Vitamin C 50
    Laktose (Trägerstoff) 150
    Gesamt 400 mg
  • Formulierung 2: Neohesperidin-Dihydrochalkon enthaltende Lebensmittel
  • Neohesperidin-Dihydrochalkon enthaltende Lebensmittel wurden wie folgt hergestellt.
  • (1) Herstellung von Tomatenketschup und Soße
  • Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde zu einem Tomatenketschup oder einer Soße in einer sich in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gewichts-% bewegenden Menge hinzugefügt, um ein gesundheitsverbesserndes Tomatenketschup oder Soße zu erhalten.
  • (2) Herstellung von Weizenmehl enthaltenden Lebensmitteln
  • Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde in einer sich in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gewichts-% bewegenden Menge zu Weizenmehl hinzugefügt und Brote, Kuchen, Kekse, Cracker und Nudeln wurden unter Verwendung der Mischung hergestellt, um gesundheitsverbessernde Lebensmittel zu erhalten.
  • (3) Herstellung von Suppen und Bratensoße
  • Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde in einer sich in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gewichts-% bewegenden Menge zu Suppen und Bratensoßen hinzugefügt, um gesundheitsverbessernde Suppen und Bratensoßen zu erhalten.
  • (4) Herstellung von Hackfleisch
  • Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde in einer sich in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gewichts-% bewegenden Menge zu Fleisch hinzugefügt, um gesundheitsverbesserndes Hackfleisch zu erhalten.
  • (5) Herstellung von Milchprodukten
  • Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde in einer sich in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gewichts-% bewegenden Menge zu Milch hinzugefügt, um gesundheitsverbessernde Milch zu erhalten, und verschiedene Milchprodukte, wie zum Beispiel Butter und Eiskrem wurden daraus hergestellt.
  • Im Falle einer Käseherstellung wurde Neohesperidin-Dihydrochalkon zu geronnenem Milchprotein hinzugefügt; und, im Falle einer Joghurtherstellung wurde Neohesperidin-Dihydrochalkon zu nach der Fermentierung erlangtem, geronnenem Milchpulver hinzugefügt.
  • Formulierung 3: Neohesperidin-Dihydrochalkon enthaltende Getränke
  • (1) Herstellung von Gemüsesaft
  • 100 bis 5.000 mg Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde zu 1.000 ml eines Gemüsesaftes hinzugefügt, um einen gesundheitsverbessernden Gemüsesaft zu erhalten.
  • (2) Herstellung von Fruchtsaft
  • 100 bis 5.000 mg Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde zu 1.000 ml eines Fruchtsaftes hinzugefügt, um einen gesundheitsverbessernden Fruchtsaft zu erhalten.
  • Formulierung 4: Neohesperidin-Dihydrochalkon enthaltende Gesundheitslebensmittel
  • Ein Gesundheitslebensmittel wurde durch Mischen der folgenden Inhaltsstoffe und dem Formen einer Tablette aus der Mischung hergestellt.
    Menge (Gew./Gew.-%)
    Ginsengpulver oder -Extrakt 50
    Neohesperidin-Dihydrochalkon 30
    Süßstoff und Geschmack 20
    Gesamt 100%

Claims (4)

  1. Verwendung von Neohesperidin-Dihydrochalkon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhinderung einer mit einem erhöhten Blutfettwert zusammenhängenden Krankheit bei einem Säugetier.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Krankheit Lipidspiegelerhöhung, Arteriosklerose, Angina Pectoris, Schlaganfall oder Leberverfettung ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine effektive Menge von Neohesperidindihydroalcon in einem Bereich von 0,1 bis 500 mg/kg des Körpergewichts/Tag beträgt.
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