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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Neohesperidin-Dihydrochalkon
für die
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung einer
durch einen erhöhten
Blutfettspiegel hervorgerufenen Krankheit bei einem Säugetier.
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Hintergrund der Erfindung
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Es
wurde berichtet, dass Blutfette, insbesondere Cholesterin und Triglycerid,
eng mit verschiedenen Arten von Krankheiten verbunden sind, wie
zum Beispiel koronare kardiovaskuläre Krankheiten, beispielsweise
Arteriosklerose und Hypercholosterimenia und Fettleber. Cholesterin,
ein Fettsteoridalkohol, ist ein Blutfett, welches aus gesättigtem
Fett in der Leber produziert wird. Triglyceride sind eine andere
Art von Blutfetten, welche dafür
bekannt sind, dass sie das Risiko verschiedener Krankheiten erhöhen. Es
ist auch berichtet worden, dass ein erhöhter Blut- oder Plasmacholesterinwert
die Ablagerung von Fett, Phagozyten bzw. Fresszellen und Schaumzellen
an der Wand von Blutgefäßen hervorrufen,
wobei solche Ablagerungen zu Plaquebildung und dann zu Arteriosklerose
führen
(siehe Ross, R., Nature, 362, 801–809 (1993)). Eine der Metho den
zum Verringern des Plasmacholesterinwerts ist eine Ernährungstherapie
zur Reduzierung der Aufnahme von Cholesterin und Fetten. Eine weitere
Methode besteht darin, die Absorption von Cholesterin durch Hemmen
der darin enthaltenen Enzyme zu hemmen.
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Die
EC-Süßstoffvorschrift
94/35/EC (Juni 1994) beschreibt die Verwendung von Neohesperidin
als einen Süßstoff im
Lebensmittelsektor. Des weiteren ist aus dem RÖMPP Lexikon Lebensmittelchemie,
Stuttgart: Georg Thieme Verlag, 1995, Seite 218, die hohe Intensität von Neohesperidin-Dihydrochalkon
als ein Süßstoff bekannt.
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Acyl
CoA-Cholesterin-o-Acyltransferase (ACAT) unterstützt die Esterbildung von Cholesterin
im Blut. Schaumzellen werden durch die Einwirkung von ACAT gebildet
und beinhalten eine große
Menge von Cholesterinester, welche von Lipid- bzw. Fettproteinen
mit geringer Dichte getragen werden. Die Bildung von Schaumzellen
an der Wand von Arterien erhöht
sich mit der ACAT-Aktivität
und dementsprechend kann ein ACAT-Hemmer auch ein Mittel zur Verhinderung
von Arteriosklerose sein. Des weiteren ist berichtet worden, dass
der Blutwert von LDL-Cholesterin durch das Hemmen der ACAT-Aktivität verringert
werden kann (siehe Witiak, D. T. und D. R. Feller (Eds.), Anti-Lipidemic
Drugs: Medicinal, Chemical and Biochemical Aspects, Elsevier, Seiten
159–195
(1991)).
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Des
weiteren ist berichtet worden, dass Hypercholesterimenia durch Verringern
des Cholesterin-Biosynthese-Werts
durch Hemmung des Cholesterinestertransferproteins (CETP), welches
den Cholesterintransfer zwischen den Lipoproteinen herstellt, oder
3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Koenzym A (HMG-CoA)-Reduktase, welches
die Synthese von Mevalonsäure,
einem Zwischenprodukt in der Biosynthese von Sterolen oder Isoprenoiden
herstellt, effektiv behandelt werden kann (siehe Cardiovascular
Pharmacology, William W. Parmley und Kanu Chatterjee Ed., Wolfe
Publishing, Seiten 8.6–8.7,
1994).
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Aus
diesem Grunde wurden unzählige
Versuche unternommen, Arzneimittel zu entwickeln, welche HBG-CoA-Reduktase hemmen,
und, als ein Ergebnis, wurden verschiedene aus Penizillin sp. und
Aspergillus sp. gewonnene Verbindungen kommerzialisiert. Insbesondere
wurden kommerzialisiert Lovastatin® und
Simvastatin®,
entwickelt von Merck Co., USA, und Pravastatin®, entwickelt
von Sankyo Co., Japan (siehe C. D. R. Dunn, Stroke: Trends, Treatment
and Markets, SCRIPT Report, PJB Publications Ltd., 1995).
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Diese
Arzneimittel sind jedoch sehr teuer und es ist bekannt, dass eine
Verabreichung derselben über eine
längere
Zeit einen nachteiligen Nebeneffekt auf das zentrale Nervensystem
hat. Des weiteren, obwohl Lovastatin® und
Simvastatin® den
Plasma-LDL-Cholesterinwert durch Verbessern der Aktivität von LDL-Rezeptor in
der Leber verbessern, haben sie Nebenwirkungen, wie zum Beispiel
eine Erhöhung
der Creatinkinase in der Leber und Rhabdomyolyse (siehe Farmer,
J. A., et al., Baillers-clin. Endocrinol. Metal., 9, 825–847 (1995)). Demzufolge
besteht noch immer ein Bedürfnis,
einen kostengünstigen
und nichttoxischen Hemmer von HMG-CoA-Reduktase zu entwickeln.
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Ein
weiteres Beispiel einer mit einem erhöhten Blutfettwert zusammenhängenden
Krankheit ist die Fettleber. Insbesondere führt die exzessive Aufnahme
von fetthaltigen Lebensmitteln und Alkohol zur Fettleber, bei welcher
eine große
Menge von Fetten in dem Lebergewebe abgelagert wird und die Werte
von Serum GOT (Glutamat-Oxaloacetat-Transaminase), GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase)
und γ-GTP
(γ-Glutamyl-Transpeptidase)
erhöht
sind (siehe T. Banciu et al., Med. Interne., 20, 69–71 (1982);
und A. Par et al., Acta. Med. Acad. Sci. Hung., 33, 309–319 (1976)).
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Fett
sammelt sich in der Leber hauptsächlich
in der Form von Triglyceriden und Fettsäuren und auch in einem geringeren
Ausmaß in
der Form von Cholesterin an. Des weiteren ist berichtet worden,
dass eine der Hauptanzeichen von Fettleber ein hoher Blutgehalt
an Cholesterin und/oder Triglycerid ist. Aus diesem Grund ist Fettleber
eng mit den Blutwerten von Cholesterinen und/oder Triglycerid verbunden.
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Bioflavonoide
sind Polyphenol-Antioxidationsmittel, welche in der natürlichen
Welt in großem
Ausmaß existieren,
insbesondere in Gemüse,
Früchten,
Wein und ähnlichem.
Es ist berichtet worden, dass die Bioflavonoide verschiedene nützliche
pharmakologische Aktivitäten
zeigen, wie zum Beispiel entzündungshemmende,
kapillarverstärkende,
antioxidative, Antikrebs-, Antiviren- und Anti-Blutplättchen-Verklumpungsaktivitäten (siehe
O. Benavente-Garcia et al., Uses and properties of citrus flavonoids,
J. Agr. Food Chem., 45, 4506–4515,
1997).
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Repräsentative
Bioflavonoide, welche in Zitrusfrüchten gefunden werden können, sind
in Tabelle 1 aufgelistet.
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Neohesperidin-Dihydrochalkon,
ein Bioflavonoid, welches in einfacher Weise aus einer Grapefruit
gewonnen werden oder aus Naringin synthetisch hergestellt werden
kann, ist dafür
bekannt, eine 1.000 bis 1.500-fach höhere Süßkraft als Saccharose zu haben.
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Die
vorliegenden Erfinder haben versucht, eine neue pharmakologische
Verwendung von Bioflavonoiden zu entwickeln, welche in Kräutern, Nahrungsmitteln,
Gemüse
und Früchten übermäßig vorhanden
sind. Als ein Ergebnis ist entdeckt worden, dass Neohesperidin-Dihydrochalkon
bei der Behandlung oder Verhütung von
mit erhöhten
Blutfettwerten verbundenen Krankheiten effektiv ist. Insbesondere
kann es Plasmacholesterinwerte erheblich verringern; die Aktivitäten von
HMG-CoA-Reduktase
und ACAT verhindern; die Ansammlung eines Phagozyt-Lipidkomplexes
an der Endothelialwand einer Arterie hemmen; und Leberfunktionsstörungen bei
einem Säugetier
verhindern.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Demzufolge
ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von
Neohesperidin-Dihydrochalkon zur Herstellung eines Medikaments gemäß Anspruch
1 zu schaffen.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die
oben genannte und andere Aufgaben und Merkmale der vorliegenden
Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung
deutlicher, wenn sie in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen
gelesen wird, in welchen:
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1A, 1B und 1C das
arterielle Endothelium der Kaninchen zeigen, denen 1% Cholesterin;
1% Cholesterin plus 1 mg/kg Lovastatin®; und
1% Cholesterin plus 0,05% Neohesperidin-Dihydrochalkon jeweils verabreicht
wurden; und
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2A, 2B und 2C die
mikroskopischen Merkmale der Lebern der Kaninchen darstellen, denen
jeweils 1% Cholesterin; 1% Cholesterin plus 1 mg/kg Lovastatin®;
und 1% Cholesterin plus 0,05 Neohesperidin-Dihydrochalkon verabreicht
wurden.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Durch
die gesamte Beschreibung bezeichnet die Angabe "Blutfett" ein in dem Blut vorhandenes Fett. Das
Blutfett wird durch Cholesterine und Triglyceride repräsentiert,
welche in dem Blut enthalten sind.
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Die
Bezeichnung "hoher
oder erhöhter
Wert" eines Blutfettes
bedeutet höher
als der normale Wert, wobei der normale Wert sich mit bestimmten
Bedingungen eines Patienten verändert,
wie zum Beispiel Alter, Geschlecht und Körpergewicht. Ein hoher Blutfettwert
wird im allgemeinen als gesundheitsschädlich angesehen.
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Die
Bezeichnung "mit
einem erhöhten
Blutfettwert in Verbindung stehende Krankheit" meint eine Krankheit, welche durch
einen hohen oder erhöhten
Blutfettwert verursacht wird und/oder eine Krankheit, deren Symptome
einen hohen oder erhöhten
Blutfettwert beinhalten. Beispiele solcher Krankheiten beinhalten Lipidspiegelerhöhung, Arteriosklerose,
Angina Pectoris, Schlaganfall und hepatische Krankheiten, wie zum Beispiel
Leberverfettung.
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Neohesperidin-Dihydrochalkon
(C28H36O15, M. W. 612.60, siehe Merck Index 11. Ausgabe
(1989)) kann in einfacher Weise aus der Schale einer Grapefruit
extrahiert oder gemäß einem
konventionellen Verfahren aus Naringin synthetisch hergestellt werden.
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Neohesperidin-Dihydrochalkon
zeigt sowohl hemmende als auch therapeutische Wirkungen auf mit erhöhten Blutfettwerten
in Verbindung stehenden Krankheiten, zum Beispiel Lipidspiegelerhöhung, Arteriosklerose,
Angina Pectoris, Schlaganfall und hepatische Krankheiten. Des weiteren
zeigt Neohesperidin-Dihydrochalkon trotz seiner hohen Effizienz
keine Toxizität,
wenn sie mit einer Dosis von 1.000 mg/kg einer Maus oral verabreicht
wird. Des weiteren beeinträchtigt
sie die Leberfunktion nicht in nachteiliger Weise.
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Eine
pharmazeutische Formulierung kann gemäß einem bekannten Verfahren
hergestellt werden. Beim Herstellen der Formulierung wird der aktive
Inhaltsstoff vorzugsweise mit einem Trägerstoff vermischt oder verdünnt oder
in einen Trägerstoff
eingeschlossen, welcher in der Form einer Kapsel, eines Kissen oder eines
anderen Behälters
vorliegen kann. Wenn der Trägerstoff
als ein Verdünnungsmittel
dient, kann es sich um einen Feststoff, Semi-Feststoff oder ein
flüssiges
Material handeln, welches als ein Bindemittel, Träger oder
Medium für
den aktiven Inhaltsstoff dient. Somit können die Formulierungen in
Form einer Tablette, Pille, Pulver, Kissen, Elixier, Suspension,
Emulsion, Lösung,
Sirup, Aerosol, weiche und harte Gelatinekapsel, sterile indizierbare
Lösung,
steriles abgepacktes Pulver und ähnliches
vorliegen.
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Beispiele
von geeigneten Trägerstoffen,
Trägern
und Verdünnungsmitteln
sind Laktose, Dextrose, Saccharose, Sorbitol, Mannitol, Stärke, Gummiarabicum,
Alginate, Gelatine, Kalziumphosphat, Kalziumsilikat, Zellulose,
Methylzellulose, mikrokristalline Zellulose, Polyvinylpyrrolidon,
Wasser, Methylhydroxybenzoat, Porpolyhdroxybenzoat, Talg, Magnesiumstearat
und Minearlöl.
Die Formulierungen können
zusätzlich
Füllstoffe, aglutinationshemmende
Mittel, Schmiermittel, Befeuchtungsmittel, Geschmacksverstärker, Emulgatoren,
Konservierungsmittel und ähnliches
beinhalten. Die Zusammensetzungen der Erfindung können so
formuliert werden, dass sie eine schnelle, langanhaltende oder verzögerte Freigabe
des aktiven Inhaltsstoffs nach ihrer Verabreichung an ein Säugetier
unter Verwendung eines beliebigen, aus dem Stand der Technik gut
bekannten Verfahrens aufweist.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann
auf verschiedenen Wegen, einschließlich oraler, transdermaler,
subkutaner, intravenöser
und intramuskulärer
Einführung
verabreicht werden. Im Falle eines Menschen kann eine typische Tagesdosis.
von Neohesperidin-Dihydrochalkon sich in einem Bereich von ungefähr 0,1 bis
500 mg/kg Körpergewicht,
vorzugsweise 1 bis 100 mg/kg Körpergewicht, bewegen,
und kann in einer einzelnen Dosis oder in aufgeteilten Dosen verabreicht
werden.
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Es
sollte jedoch deutlich sein, dass die Menge des aktiven Inhaltsstoffs,
die tatsächlich
verabreicht wird, im Hinblick auf verschiedene relevante Faktoren
festgelegt werden sollte, einschließlich des zu behandelnden körperlichen
Zustands, der ausgewählten
Art der Verabreichung, des Alters, des Geschlechts und des Körpergewichts
des jeweiligen Patienten und der Schwere der Symptome des Patienten.
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Des
weiteren kann Neohesperidin-Dihydrochalkon vorteilhafterweise in
Lebensmitteln oder Getränken beinhaltet
sein, zum Zwecke der Behandlung oder Verhinderung von mit erhöhten Blutfettwerten
in Verbindung stehenden Krankheiten, zum Beispiel Lipidspiegelerhöhung, Arteriosklerose,
Angina Pectoris, Schlaganfall und hepatischen Krankheiten. Die Lebensmittel
oder Getränke
können
Fleisch; Säfte,
wie zum Beispiel Gemüsesäfte (zum
Beispiel Karottensaft und Tomatensaft) und Fruchtsäfte (zum
Beispiel Orangensaft, Traubensaft, Ananassaft, Apfelsaft und Bananensaft);
Schokolade, Snacks, Süßigkeiten;
Pizza, aus Getreidemehl hergestellte Lebensmittel, wie zum Beispiel
Brote, Kuchen, Cracker, Kekse, Biskuits, Nudeln und ähnliches;
Gummi bonbons; Milchprodukte, wie zum Beispiel Milch, Käse, Joghurt
und Eiskrem; Suppen; Fleischbrühen;
Pasten, Ketschups und Soßen;
Tees; alkoholische Getränke;
kohlensäurehaltige
Getränke;
Vitaminkomplexe; und verschiedene Gesundheits-Nahrungsmittel beinhalten.
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Der
Anteil des Neohesperidin-Dihydrochalkons in einem Lebensmittel oder
Getränk
kann sich in einem Bereich von 0,01 bis 20 Gewichts-%, vorzugsweise
von 0,1 bis 5 Gewichts-%, bewegen.
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Wie
oben beschrieben, kann Neohesperidin-Dihydrochalkon als ein effektiver,
nichttoxischer, pharmazeutischer Wirkstoff zum Behandeln oder Verhindern
von mit erhöhten
Blutfettwerten in Verbindung stehenden Krankheiten, zum Beispiel
Lipidspiegelerhöhung,
Arteriosklerose, Angina Pectoris, Schlaganfall und hepatischen Krankheiten
verwendet werden.
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Die
nachfolgenden Beispiele sind dafür
vorgesehen, die vorliegende Erfindung weiter darzustellen.
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Des
weiteren sind die unten angegebenen Prozentsätze für Feststoff in Feststoffmischung,
Flüssigkeit in
Flüssigkeit
und Feststoff in Flüssigkeit
jeweils auf einer Gewichts-/Gewichts-, Volumen-/Volumen- und Gewichts-/Volumenbasis
angegeben, und alle Reaktionen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn
dies nicht speziell anders angegeben ist.
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Beispiel 1: Toxizität von oral
verabreichtem Neohesperidin-Dihydrochalkon
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12
sieben Wochen alte, spezifisch erregerfreie ICR weibliche Mäuse, sechs
weibliche Mäuse,
welche jeweils ungefähr
25 bis 29 g wogen, und sechs männliche
Mäuse,
welche jeweils ungefähr
34 bis 38 g wogen, wurden in einer Umgebung von 22 ± 1°C, 55 ± 5% relative
Luftfeuchtigkeit und 12L/12D Fotoperiode gehalten. Futter (Cheiljedang
Co., Mäuse-
und Rattenfutter) und Wasser wurden sterilisiert und an die Mäuse verfüttert.
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Neohesperidin-Dihydrochalkon,
welches von der Aldrich-Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) gekauft wurde, wurde in 0,5% Tween
80 mit einer Konzentration von 100 mg/ml aufgelöst und die Lösung wurde
den Mäusen
in einer Menge von 0,2 ml pro 20 g des Körpergewichts der Mäuse oral
verabreicht. Die Lösung wurde
einmal verabreicht und die Mäuse
wurden für
10 Tage auf Zeichen von Nebenwirkungen oder Tod gemäß dem folgenden
Schema überwacht:
1, 4, 8 und 12 Stunden nach der Verabreichung und jede 12 Stunden danach.
Die Gewichtsveränderungen
der Mäuse
wurden aufgezeichnet, um den Effekt von Neohesperidin-Dihydrochalkon
zu prüfen.
Des weiteren wurden die Mäuse
am 10. Tag getötet
und die inneren Organe wurden auf Sicht überprüft.
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Am
Tag 10 waren alle Mäuse
am Leben und das Neohesperidin-Dihydrochalkon zeigte bei einer Dosis von
1.000 mg/kg keine Toxizität.
Die Autopsie ergab, dass die Mäuse
keinerlei pathologische Abnormalität entwickel ten und es wurde
während
der zehntägigen
Testperiode kein Gewichtsverlust festgestellt. Daraus folgt, dass
Neohesperidin-Dihydrochalkon nicht toxisch ist, wenn es einem Tier
oral verabreicht wird.
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Beispiel 2: Effekt von
Neohesperidin-Dihydrochalkon auf Plasmacholesterin, HDL-Cholesterin
und neutrale Fettwerte
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(Schritt 1) Verabreichung
von Neohesperidin-Dihydrochalkon an Ratten
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20
drei Wochen alte, weiße
Sprague-Dawley-Ratten (Taihan Zentrum für Labortiere, Korea), welche jeweils
ungefähr
90 bis 110 g wogen, wurden in zwei Diätgruppen durch ein zufälliges Blockmuster
gleich verteilt. Die Ratten der zwei Gruppen wurden mit zwei unterschiedlichen
Hoch-Cholesterin-Diäten
gefüttert,
d. h. AIN-76 Labortierdiät
(ICN Biochemicals, Cleveland, OH, USA), welche 1% Cholesterin (Kontrollgruppe)
enthielt, und 1% Cholesterin plus 0,05% Neohesperidin-Dihydrochalkon
(Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe). Die Zusammensetzungen der
an die zwei Gruppen verfütterten
Diäten
sind in Tabelle II dargestellt.
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Es
wurde den Ratten erlaubt, sechs Wochen lang von der jeweiligen Diät zusammen
mit Wasser zu fressen, wobei die aufgenommene Menge täglich aufgezeichnet
wurde und die Ratten alle sieben Tage gewogen wurden und das Aufgezeichnete
analysiert wurde. Alle Raten zeigten eine normale Wuchsrate und
es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den zwei Gruppen
bezüglich
der Menge der aufgenommenen Nahrung und der Gewichtszunahme festgestellt.
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(Schritt 2) Ermittlung
des gesamten Cholesterin-, HDL-Cholesterin-
und neutralen Fettwertes im Blut
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Die
Wirkungen der Verabreichung von Neohesperidin-Dihydrochalkon an Ratten auf den Plasmacholesterin- und den neutralen
Fettgehalt wurden wie folgt ermittelt.
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Die
Ratten der zwei in Schritt 1 erhaltenen Diätgruppen wurden getötet und
es wurden Blutproben von denselben genommen. Das Blut wurde zwei
Stunden stehen gelassen und mit 3.000 U/min für 15 Minuten zentrifugiert
und das obenauf Schwimmende wurde abgetrennt und vor der Verwendung
in einem Tiefkühlgerät gelagert.
Die chemische Analyse des Blutes wurde durch Anwendung eines chemischen
Blutanalysators (CIBA Corning 550 Express, USA) durchgeführt, um
die Veränderungen
im gesamten Cholesterin-, HDL-Cholesterin- und Triglycerid-Wert zu ermitteln.
Das Ergebnis ist in Tabelle III dargestellt. Tabelle
III
- Total-C
- Gesamtcholesterin
- HDL-C
- HDL-Cholesterin
- TG
- Triglycerid
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Wie
aus Tabelle III ersichtlich ist, verringert sich der gesamte Plasmacholesterinwert
um 15% bei der Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe im Vergleich
mit derjenigen der Kontrollgruppe. Des weiteren wird der neutrale
Fettwert bei der Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe um 9% reduziert
verglichen mit derjenigen der Kontrollgruppe.
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Beispiel 3: Aktivität von Neohesperidin-Dihydrochalkon
in der ACAT-Hemmung
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(Schritt 1) Präparation
von Mikrosomen
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Um
den Effekt des Fütterns
von Neohesperidin-Dihydrochalkon an Ratten bezüglich der Aktivität von ACAT
zu ermitteln, wurden Mikrosome von Lebergewebe abgetrennt, welches
als eine Enzymquelle verwendet wurde.
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Jeweils
1 g der Lebern, die von jeder Gruppe der Ratten von Beispiel 2 entnommen
wurde, wurde in 5 ml Homogenisationsmedium homogenisiert (0,1 M
KH2PO4, pH 7,4,
0,1 mM EDTA und 10 mM β-Mercaptoethanol).
Das Homogenat wurde bei 3.000 xg für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert
und das dabei erlangte oben Schwimmende wurde bei 15.000 xg für 15 Minuten
bei 4°C
zentrifugiert, um ein oben Schwimmendes zu erlangen. Das oben Schwimmende
wurde in eine Ultrazentrifugalröhre
(Beckman) gefüllt
und bei 10.000 xg für 1
Stunde bei 4°C
zentrifugiert, um mikrosomische Kügelchen zu erhalten, welche
dann in 3 ml des Homogenisationsmediums suspendiert und bei 100.000
xg für
eine Stunde bei 4°C zentrifugiert
wurden. Die dabei erhaltenen Kügelchen
wurden in 1 ml des Homogenisationsmediums suspendiert. Die Proteinkonzentration
der sich ergebenden Suspension wurde durch die Lowry's Methode ermittelt
und dann auf 4 bis 8 mg/ml eingestellt. Die resultierende Suspension
wurde in einem Tiefkühlgerät (Biofreezer,
Forma Scientific Inc.) gelagert.
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(Schritt 2) ACAT-Untersuchung
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6,67 μl einer 1
mg/ml Cholesterin-Lösung
in Azeton wurde mit 6 μl
von 10% Triton WR-1339 (Sigma Co.) in Azeton vermischt und dann
wurde das Azeton mittels Evaporation unter einem Stickstoffstrom
entfernt. Zu der resultierenden Mischung wurde destilliertes Wasser
hinzugefügt,
um die Konzentration von Cholesterin auf 30 mg/ml einzustellen.
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Zu
den 10 μl
der resultierenden wässrigen
Cholesterinlösung
wurden 10 μl
von 1 M KH2PO4 (ph
7,4), 5 μl
von 0,6 mM Bovin-Serum-Albumin (BSA), 10 μl der in (Schritt 1) erhaltenen
Mikrosom-Lösung
und 55 μl destilliertes
Wasser (insgesamt 90 μl)
hinzugefügt.
Die Mischung wurde in einem Wasserbad bei 37°C für 30 Minuten vorgebrütet bzw.
gezüchtet.
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10 μl einer (1-14C) Oleyl-CoA-Lösung (0,05 μCi, Endkonzentration: 10 μM) wurde
zu der vorgebrüteten Mischung
zugefügt
und die resultierende Mischung wurde in einem Wasserbad bei 37°C für 30 Minuten
gebrütet
bzw. gezüchtet.
Zu der Mischung wurden 500 μl
einer Isopropyl : Heptan-Mischung (4 : 1 (v/v)), 300 μl Heptan
und 200 μl
0,1 M KH2PO4 (pH
7,4) hinzugefügt,
und die Mischung wurde unter Verwendung eines Wirbelmischers kräftig gemischt
und dann bei Raumtemperatur für
2 Minuten stehen gelassen.
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200 μl des resultierenden
obenauf Schwimmenden wurde in eine Szintillationsflasche gegeben
und 4 ml einer Szintillationsflüssigkeit
(Lumac) wurden hinzugefügt.
Die Mischung wurde auf Radioaktivität mit einem 1450 Microbeta-Flüssigkeits-Szintillationszählers (Wallacoy,
Finnland) untersucht. ACAT-Aktivität wurde als Pikomol des pro
min pro mg Protein (pMol (min/mg Protein) synthetisierten Cholesterin-Oleats
berechnet. Das Ergebnis ist in Tabelle IV dargestellt.
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Wie
aus Tabelle IV deutlich wird, ist die ACAT-Aktivität, die in der Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe festgestellt
wurde, um 20% geringer als diejenige der Kontrollgruppe.
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Beispiel 4: Aktivität von Neohesperidin-Dihydrochalkon
bei der HMG-CoA-Reduktase Hemmung
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Um
die Aktivität
von HMG-CoA-Reduktase zu ermitteln, wurde nach einer gewissen Modifikation
die Hulcher-Methode
verwendet (siehe J. Lipid Res., 14, 625–641 (1973)). Bei dieser Methode
wird die Konzentration des Koenzyms-A (CoA-SH), welches produziert
wird, wenn HMG-CoA durch die Wirkung von HMG-CoA-Reduktase zu einem
Mevalonatsalz reduziert wird, durch Spektroskopie ermittelt und
die Aktivität der
HMG-CoA-Reduktase wird daraus berechnet.
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(Schritt 1) Präperation
von Mikrosomen
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3
g des jeder Gruppe von Ratten aus Beispiel 2 entnommenen Lebergewebes
wurde aufeinanderfolgend mit 100 ml einer kalten Saline (0,15 M
NaCl) und 100 ml einer kalten Pufferlösung A (0,1 M Triethanolamin,
HcL/0,2 M EDTA/2 mM Dithiothreitol (DTT)) gewaschen. Die kalte Pufferlösung A wurde
dem Lebergewebe in einer Menge von 2 ml pro 1 g des Lebergewebes
hinzugefügt
und die Mischung wurde mit einem Homogenisierer homogenisiert. Das
Homogenat wurde bei 15.000 xg für
15 Minuten zentrifugiert und dann wurde das obenauf Schwimmende
mit 100.000 xg für
60 Minuten ultrazentrifugiert, um mikrosomische Abscheidungen zu
erhalten. Der dadurch erhaltenen Niederschlag wurde mit einer kalten
Pufferlösung
A gewaschen und in einer 1,5 ml-Röhre bei 70°C aufbewahrt.
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(Schritt 2) Untersuchung
der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität
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Die
bei der Untersuchung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität verwendeten Reaktionssubstrate
waren wie folgt: i) Pufferlösung
B: 0,1 M Triethanolamin, HCl/0,02 M EDTA (pH 7,4), ii) HMG-CoA-Lösung: 150 μMol/Nährmedium,
und iii) NADPH-Lösung:
2 μMol/Nährmedium.
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Die
Suspension (Mikrosom) wurde mit dem Reaktionssubstrat vermischt
und die Mischung wurde in eine Zentrifugationsröhre eingebracht und bei 37°C für 30 Minuten
zur Reaktion gebracht. Die Reaktionsmischung wurde mit 20 μl von 0,01
M Natriumarsen behandelt und für
1 Minute stehen gelassen und dann wurde es mit 100 μl einer Zitrat-Pufferlösung (2
M Zitrat/3% Natriumtungstat, pH 3,5) bei 37°C für 10 Minuten reagiert, gefolgt
von einer Zentrifugation bei 25.000 xg für 15 Minuten, um Protein zu
entfernen. 1 ml des damit erlangten obenauf Schwimmenden wurde in
einen Schlauch mit einem Deckel gebracht und es wurde 0,1 ml einer
2 M tris-HCl-Lösung
(pH 10,6) und 0,1 ml einer 2 M tris-HCl-Lösung (pH 8,0) zugefügt, um den
pH-Wert der Reaktanz auf 8,0 einzustellen.
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Dann
wurde die Reaktanz mit 20 μl
einer DTNB-Pufferlösung
(3 mM DTNB/0,1 M triethanolamin/0,2 M EDTR, pH 7,4) gemischt und
die Extinktion der Mischung wurde bei 412 nm ermittelt, um die Menge
der CoA-SH (Aktivität
der HMG-CoA-Reduktase) zu berechnen.
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Das
Ausmaß der
Hemmung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität durch Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde
basierend auf dem oben angegebenen Ergebnis berechnet. Das Ergebnis
ist in Tabelle V dargestellt.
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Wie
aus Tabelle V ersichtlich ist, ist die in der Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe
festgestellte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität um 30%
geringer als diejenige in der Kontrollgruppe.
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Beispiel 5: Auswirkung
der Verabreichung von Neohesperidin-Dihydrochalkon an einen Menschen
auf den Plasma-Fettstoffwechsel
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Zwei
Männern
im Alter von Mitte 50 wurde eine tägliche orale Dosis von 10 mg/kg
Neohesperidin-Dihydrochalkon in Form einer Kapsel für 60 Tage
verabreicht. Der Plasmacholesterin- und neutrale Lipid-(Triglycerid)-Wert wurde vor und
nach der Verabreichung ermittelt.
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Der
Plasmacholesterin- und neutrale Lipidwert wurde durch die Verabreichung
von Neohesperidin-Dihydrochalkon jeweils um 20% bzw. 15% verringert.
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Beispiel 6: Hemmung von
Arteriosklerose
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(Schritt 1) Verabreichung
von Neohesperidin-Dihydrochalkon an Kaninchen
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30
drei Monate alte weiße
Neuseeland-Kaninchen (Yeonam Horticulture and Animal Husbandry College,
Korea), welche jeweils ungefähr
2,5 bis 2,6 kg wogen, wurden unter einer Temperaturbedingung von
20 ± 2°C, relativer
Luftfeuchtigkeit von 55 ± 5%
und Fotoperiode 12L/12D gezüchtet.
Die Kaninchen wurden in drei Gruppen aufgeteilt und die drei Gruppen
der Kaninchen wurden mit drei unterschiedlichen Diäten ernährt, d.
h. RC4-Diät
(Oriental Yeast Co., Japan), welche 1% Cholesterin enthielt (Kontrollgruppe);
1% Cholesterin + 1 mg/kg Lovastatin® (Merck,
USA) (Lovastatin-Gruppe); und 1% Cholesterin plus 0,05% Neohesperidin-Dihydrochalkon
(Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe). Die RC4-Diät weist
7,6% Feuchtigkeit, 22,8 rohes Protein, 2,8% rohes Fett, 8,8% rohes
Natriumkarbonat bzw. Asche, 14,4 rohe Zellulose und 43,6 lösbare nitrogenfreie
Substanzen auf. Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde von der Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) gekauft.
-
Die
Kaninchen wurden 6 Wochen lang gefüttert, wobei sie freien Zugang
zu den Diäten
und Wasser hatten.
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(Schritt 2) Chemische
Analyse von Blut
-
Nach
sechs Wochen wurden die Kaninchen mit einer intramuskulären Injektion
von Ketamin (50 mg/kg) in den Oberschenkelbereich betäubt und
getötet.
Eine Blutprobe wurde vom Herzen jedes Kaninchens genommen, für zwei Stunden
stehen gelassen und bei 3.000 U/min für 15 Minuten zentrifugiert
und das obenauf Schwimmende Serum wurde separiert und in einem Tiefkühlgerät vor der
Verwendung gelagert.
-
Die
chemische Analyse des Blutes wurde unter Verwendung eines chemischen
Blutanalysierers (CIBA Corning 550 Express, USA) durchgeführt, um
die Veränderung
in GOT, GPT, γ-GTP
und Gesamtcholesterinwerten zu ermitteln. Die Ergebnisse sind in
Tabelle VI dargestellt.
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(Schritt 3) Analyse nach
Fettstreifen in der Hauptarterie
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Die
Brust von jedem der in Schritt 2 getöteten Kaninchen wurde eingeschnitten.
Der von der 1 cm über der
Aortenklappe liegenden Stelle abwärts gerichtete Bereich der
Hauptarterie wurde in einer Länge
von ungefähr
5 cm ausgeschnitten und das die Hauptarterie umgebende Fett wurde
entfernt. Die Hauptarterie wurde in der Mitte entlang der Längsachse
eingeschnitten und an eine Platte angeheftet. Die feuchte Arterie
wurde fotografiert und dann wurde die Färbung der Fettstreifen gemäß der Methode
von Esper, E., et al. (J. Lab. Clin. Med., 121, 103–110 (1993))
wie folgt durchgeführt.
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Ein
Teil der eingeschnitten Hauptarterie wurde drei Mal mit wasserfreiem
Propylenglykol für
2 Minuten gewaschen und für
30 Minuten mit einer gesättigten
Lö sung
von Oil Red O (ORO, Sigma Co.), die in Propylenglykol aufgelöst war,
gefärbt.
Danach wurde die Arterie zwei Mal mit 85% Propylenglykol für 3 Minuten
gewaschen, um die verbleibende Färbungslösung zu
entfernen und sie wurde dann mit physiologischer Saline gewaschen.
Die Arterie wurde fotografiert und die Fotografie wurde aufgezeichnet.
Der Bereich der gefärbten Region
(Fettstreifenregion) wurde mit einem Bildanalysator (LEICA, Q-600,
Deutschland) ermittelt und sein Verhältnis (%) zu dem gesamten Arterienbereich
wurde berechnet. Das Ergebnis ist in Tabelle VI dargestellt.
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Die 1A, 1B und 1C zeigen
die Arterien der Kaninchen, denen 1% Cholesterin (Kontrollgruppe); 1%
Cholesterin plus 1 mg/kg Lovastatin® (Lovastatin-Gruppe); und 1% Cholesterin
plus 0,05 Neohesperidin-Dihydrochalkon
(Neohesperidin-Dihydrochalkon-Gruppe) verabreicht wurde. Wie in
den 1A, 1B und 1C dargestellt,
wurde an dem arteriellen Endothelium derjenigen Kaninchen, denen
1% Cholesterin verabreicht wurde, eine dicke Schicht eines Phagozyt-Lipidkomplexes
festgestellt, wohingegen keine oder sehr dünne Schichten des Phagozyt-Lipidkomplexes
an den arteriellen Endothelien derjenigen Kaninchen festgestellt wurde,
denen jeweils 1% Cholesterin plus 1 mg/kg Lovastatin® und
1% Cholesterin plus 0,05 Neohesperidin-Dihydrochalkon verabreicht wurde.
-
Demzufolge
wird festgestellt, dass die Neohesperidin-Dihydrochalkon-Zusammensetzung der vorliegenden
Erfin dung die Ablagerung von Phagozyten auf dem arteriellen Endothelium
erheblich hemmt.
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(Schritt 4) Histologische
Beobachtung der Organe
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Teile
der Hauptarterie, des Herzens, der Lunge, der Leber, der Nieren
und der Muskeln wurden von jedem der in Schritt 2 getöteten Kaninchen
entnommen und auf Sicht geprüft,
um zu bestätigen,
dass keine pathogenische Abnormalität gefunden wurde. Eine Hälfte jedes
Teils der Organe wurde tiefgefroren und die andere Hälfte wurde
in 10% neutralem gepuffertem Formalin für mehr als 24 Stunden fixiert.
Das fixierte Organstück
wurde in ausreichender Weise mit Leitungswasser gewaschen, schrittweise
mit 70%, 80%, 90% und 100% Ethanol dehydriert und dann in ein Paraffin
unter Verwendung von SHANDON®, Histocentre 2, USA eingebettet.
Das eingebettete Organstück
wurde in 4 μm
Dicke mit einem Mikrotrom (LSICA, RM2045, Deutschland) geteilt und
mit Hematoxylin und Eosin gefärbt.
Die gefärbte
Organprobe wurde mit Xylen transparent gemacht, mit Permount fixiert
und dann unter einem Mikroskop observiert, um nach dem Vorhandensein von
Schädigungen
zu suchen. In keiner der Organproben wurde eine Schädigung festgestellt.
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Beispiel 7: Prävention
von hepatischen Krankheiten
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Um
die Wirkung des Fütterns
einer stark cholesterinhaltigen Diät mit Neohesperidin-Dihydrochalkon auf
das Lebergewebe zu ermitteln, wurden die von dem in Schritt 2 getöteten Kaninchen
entnommenen Leberproben gemäß dem in
Fogt F. und Nanji A., Toxicology and Applied Pharmacology, 136,
87–93,
1996; und Keegan A., et al., Journal of Hepatology 23: 591–600, 1995
beschriebenen Verfahren behandelt und unter einem Mikroskop observiert,
um in vier Stufen klassifiziert zu werden, d. h. 1 + (0–25%), 2
+ (26–50%),
3 + (51–75%), 4
+ (76–100%),
basierend auf dem Verhältnis
der abnormalen fetthaltigen Zellen, um die zentrale Vene im Leberazinus.
Das Ergebnis ist in Tabelle VI dargestellt.
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Die 2A, 2B und 2C stellen
die mikroskopischen Merkmale der Lebern der Kaninchen dar, denen jeweils
1% Cholesterin; 1% Cholesterin plus 1 mg/kg Lovastatin®; 1%
Cholesterin plus 0,05 Neohesperidin-Dihydrochalkon verabreicht wurde.
In den 2A und 2B wurden um die zentrale
Vene sehr viele Zellen festgestellt, die erhebliche Mengen an Fett
enthielten. Im Gegensatz dazu weisen in 2C annähernd sämtliche Leberzellen eine normale
Form auf, was darauf schließen
lässt,
dass Neohesperidin-Dihydrochalkon die Bildung von Fettleber bzw.
Leberverfettung in erheblichem Maße hemmen kann.
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Wie
aus dem obigen hervorgeht, kann die Verabreichung von Neohesperidin-Dihydrochalkon
den Fettstoffwechsel und die Leberfunktion bei Kaninchen verbessern
und die Plaquebildung in dem Endothelium der Hauptarterie und die
Bildung von Fettleber hemmen, wie in Tabelle VI dargestellt. Die
Ergebnisse wurden durch den Studenten t-test unter Verwendung des
Microsoft Excel (Version 7.0)-Programms getestet. Tabelle
VI
- Total-C
- Gesamt-Cholesterin
- A
- Verhältnis (%)
des Fettstreifenbereichs zu der gesamten Arterienfläche
- B
- Verhältnis von
abnormalen fetthaltigen Zellen.
-
Wie
aus Tabelle VI deutlich wird, verringert die Verabreichung von Neohesperidin-Dihydrochalkon
die Serum GOT- und Serum GPT-Werte jeweils um 31% bzw. 35% im Vergleich
mit der Kontrollgruppe. Insbesondere ist Neohesperidin-Dihydrochalkon
bezüglich
der Verringerung der GOT- und GPT-Werte effektiver als Lovastatin®.
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Formulierung 1: Herstellung
der pharmazeutischen Formulierung
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Hartgelatinekapseln
wurden unter Verwendung der folgenden Inhaltsstoffe hergestellt:
| Menge
(mg/Kapsel) |
Aktiver
Inhaltsstoff (Neohesperidin-Dihydrochalkon) | 200 |
Vitamin
C | 50 |
Laktose
(Trägerstoff) | 150 |
Gesamt | 400 mg |
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Formulierung 2: Neohesperidin-Dihydrochalkon
enthaltende Lebensmittel
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Neohesperidin-Dihydrochalkon
enthaltende Lebensmittel wurden wie folgt hergestellt.
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(1) Herstellung von Tomatenketschup
und Soße
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Neohesperidin-Dihydrochalkon
wurde zu einem Tomatenketschup oder einer Soße in einer sich in einem Bereich
von 0,01 bis 10 Gewichts-% bewegenden Menge hinzugefügt, um ein
gesundheitsverbesserndes Tomatenketschup oder Soße zu erhalten.
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(2) Herstellung von Weizenmehl
enthaltenden Lebensmitteln
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Neohesperidin-Dihydrochalkon
wurde in einer sich in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gewichts-%
bewegenden Menge zu Weizenmehl hinzugefügt und Brote, Kuchen, Kekse,
Cracker und Nudeln wurden unter Verwendung der Mischung hergestellt,
um gesundheitsverbessernde Lebensmittel zu erhalten.
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(3) Herstellung von Suppen
und Bratensoße
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Neohesperidin-Dihydrochalkon
wurde in einer sich in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gewichts-%
bewegenden Menge zu Suppen und Bratensoßen hinzugefügt, um gesundheitsverbessernde
Suppen und Bratensoßen
zu erhalten.
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(4) Herstellung von Hackfleisch
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Neohesperidin-Dihydrochalkon
wurde in einer sich in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gewichts-%
bewegenden Menge zu Fleisch hinzugefügt, um gesundheitsverbesserndes
Hackfleisch zu erhalten.
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(5) Herstellung von Milchprodukten
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Neohesperidin-Dihydrochalkon
wurde in einer sich in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gewichts-%
bewegenden Menge zu Milch hinzugefügt, um gesundheitsverbessernde
Milch zu erhalten, und verschiedene Milchprodukte, wie zum Beispiel
Butter und Eiskrem wurden daraus hergestellt.
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Im
Falle einer Käseherstellung
wurde Neohesperidin-Dihydrochalkon
zu geronnenem Milchprotein hinzugefügt; und, im Falle einer Joghurtherstellung
wurde Neohesperidin-Dihydrochalkon zu nach der Fermentierung erlangtem,
geronnenem Milchpulver hinzugefügt.
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Formulierung 3: Neohesperidin-Dihydrochalkon
enthaltende Getränke
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(1) Herstellung von Gemüsesaft
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100
bis 5.000 mg Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde zu 1.000 ml eines
Gemüsesaftes
hinzugefügt, um
einen gesundheitsverbessernden Gemüsesaft zu erhalten.
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(2) Herstellung von Fruchtsaft
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100
bis 5.000 mg Neohesperidin-Dihydrochalkon wurde zu 1.000 ml eines
Fruchtsaftes hinzugefügt, um
einen gesundheitsverbessernden Fruchtsaft zu erhalten.
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Formulierung 4: Neohesperidin-Dihydrochalkon
enthaltende Gesundheitslebensmittel
-
Ein
Gesundheitslebensmittel wurde durch Mischen der folgenden Inhaltsstoffe
und dem Formen einer Tablette aus der Mischung hergestellt.
| Menge
(Gew./Gew.-%) |
Ginsengpulver
oder -Extrakt | 50 |
Neohesperidin-Dihydrochalkon | 30 |
Süßstoff und
Geschmack | 20 |
Gesamt | 100% |