KR20010007625A - 디오스민을 포함하는 동맥경화증 및 고지혈증의 예방 및치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 디오스민(diosmin)을 포함하는 동맥경화증 및 고지혈증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 디오스민은 동물에게 투여되었을 때 동맥내피에 대식세포-지질 복합체가 침착되는 것을 강력히 억제할 뿐만 아니라, ACAT 및 HMG-CoA 환원효소의 활성을 억제하고, 혈중 콜레스테롤 및 중성지질의 농도를 감소시키므로, 동맥경화증 및 고지혈증의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

디오스민을 포함하는 동맥경화증 및 고지혈증의 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING ATHEROSCLEROSIS AND HYPERLIPIDEMIA, COMPRISING DIOSMIN}

본 발명은 디오스민을 포함하는 동맥경화증 및 고지혈증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

관상동맥성 심혈관 질환은 현재 모든 사망원인의 30% 이상을 차지하고 있어 미국, 유럽 등 선진국에서 심각한 문제가 되고 있으며, 개발도상국에서도 식생활의 서구화, 운동부족 등의 영향으로 심장병이 증가하고 있는 추세이다. 이러한 관상동맥성 심혈관 질환은 일반적으로 과다한 혈중 콜레스테롤 농도에 의해 유발되는데, 혈중 콜레스테롤의 양이 높을 경우 혈관벽에 지방과 더불어 대식세포 (macrophage), 포말세포(foam cell) 등이 생성 침착되고 플라크(plaque)를 형성하여 혈액순환을 저해하는 동맥경화증세가 오기 쉬운 것으로 알려져 있다(Ross, R., Nature, 362, 801-809(1993)).

혈중 콜레스테롤의 양을 줄이기 위하여, 간 속의 아실 코에이: 콜레스테롤-o-아실트랜스퍼레이즈(acyl CoA:cholesterol-o-acyltransferase, ACAT)의 활성을 저해하거나, 또는 지단백질간에 콜레스테롤 전이를 매개하는 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질(cholesterol ester transfer protein, CETP)의 작용을 억제하거나, 또는 간에서 콜레스테롤 생합성에 관여하는 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A(HMG-CoA) 환원효소의 작용을 억제할 수 있다.

ACAT는 인체조직 속에서 콜레스테롤을 콜레스테릴 에스테르로 전환시켜주는 효소로서, 동맥경화시 혈관벽에 침착되는 포말세포들은 ACAT 작용에 의해 형성되며 이 포말세포는 혈액 속의 LDL에 의해 운반되는 콜레스테롤 에스테르를 많이 함유하고 있다. 즉, 동맥 혈관벽의 포말세포들은 ACAT 활성의 증가와 더불어 발견되는 경우가 많으며, 간 속의 ACAT 활성을 저해하면 혈액속에 유통되는 LDL-콜레스테롤 수준을 낮출 수 있다(Witiak, D. T. and D. R. Feller(eds), Anti lipidemic Drugs: Medicinal, Chemical, and Biochemical Aspects, Elsevier, pp159-195(1991)).

또한, HMG-CoA 환원효소는 스테롤이나 이소프레노이드계 화합물의 생합성 경로의 중간단계인 메발론산(mevalonic acid)의 합성을 매개하는 효소로서, 이 효소의 활성을 저하시킬 경우 콜레스테롤의 생합성 속도를 늦출 수 있어 이 효소의 활성 저해제는 콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 치료에 효과적으로 이용될 수 있다(William, W. P., Cardiovascular Pharmacology, Kanu Chatterjee(ed), Wolfe Pullishing, 8.6-8.7(1994)). 현재 사용되고 있는 HMG-CoA 환원효소의 활성 저해제로는, 페니실리움 속 또는 아스퍼질러스 속에서 유래되고 미국 메르크사가 개발한 로바스타틴(lovastatin)과 심바스타틴(simbastatin) 및 일본 산쿄사가 개발한 프라바스타틴(pravastatin) 등이 있다. 그러나, 스타틴(statin)류는 중추신경계에 부작용을 불러올 수 있고(Saheki, A. T. et al., Pharm. Res., 11, 304-311(1994)), 로바스타틴과 심바스타틴은 간의 LDL 수용체의 활성을 증가시켜 혈중 LDL 콜레스테롤의 양을 낮추기는 하지만, 다른 효소의 증가, 크레아틴 키나제(creatine kinase)의 증가, 횡문근변성(rhabdomyolysis) 등의 부작용을 가져오는 것으로 보고되고 있다(Farmer, J.A. et al., Baillers-clin. Endocrinol. Metab., 9, 825-847(1995)). 따라서, 저렴하면서도 부작용이 없는 새로운 HMG-CoA 환원효소 활성 저해제의 개발이 절실한 실정이다.

한편, 감귤류 과피 속에 있는 바이오플라보노이드(bioflavonoids)는 각종 약리활성작용, 예를 들어, 심장순환기계 질환과 관련된 지질대사 개선, 항산화, 혈압강하, 항암 및 항바이러스 작용을 한다고 알려져 있다(Saija, A., et al., Matsubara, Y., et al., 및 Galati E. M., et al., Free Radical Biol. Med., 19, 481-486(1995); Felicia V., et al., Nutr. Cancer, 26, 167-181(1996); 유럽특허공개공보 0352147 A2(1990.1.24); 및 Kaul, T. N., et al., J. Med. Virol., 15, 71-79(1985)). 예를 들어, 헤스페리딘 또는 헤스페레틴은 모세혈관 강화, 투과성(permeability) 감소, 혈압 강하, 혈중 콜레스테롤 강하, 항혈소판 응집(antiplatelet aggregation), 항염증 및 항바이러스 작용을 한다고 알려져 있다(Meyer, O. C., Angiology, 45, 579-584(1994); Struckmann J. R., et al., Angiol., 45, 419-428(1994); Matsubara, Y., et al., Japan Organic Synthesis Chem. Association Journal., 52, 318-327(1994. Mar.); Galati E. M., et al., Farmaco., 51(3), 219-221(1996, Mar.); Monforte MT., et al., Farmaco., 50(9), 595-599(1995, Sep.); 일본특허공개공보 제 95-86929 호 및 제 95-86930 호; Chung, M. I., et al., Chin. Pharm. J.(Taipei)., 46, 429-437(1994, Nov.); Galati, E. M., et al., Farmaco., 40(11), 709-712(1994, Nov.); 및 Emim J. A., et al., J. Pharm. Pharmacol., 46(2), 118-122(1994)). 또한, 나린제닌 및 나린진은 콜레스테롤 강하, 항암 및 항위궤양(알콜로부터 보호) 작용을 한다고 알려져 있다(Monforte MT., et al., Farmaco., 50(9), 595-599(1995, Sep.); 일본특허공개공보 제 95-86929 호 및 제 95-86930 호; Felicia V., et al., Nutr. Cancer, 26, 167-181(1996); 유럽특허공개공보 0352147 A2(1990.1.24); 및 Martin M. J., et al., Pharmacol., 49, 144-150(1994)).

또한, 감귤의 과피와 씨 속에는 리모노이드계 물질이 존재하는데 이들이 항암활성을 갖고 있다는 사실도 밝혀져 있다(Lam, L. K. T., et al., Inhibition of chemically induced carcinogenesis by citrus limonoids. In Food Phytochemicals for Cancer Prevention, Vol. I, ACS Symposium series No. 546, Huang, M. T., O. Osawa, C. T. Ho, R. Rosen(ed). 1993).

본 발명자들은 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진과 나린제닌 및 이들을 함유하는 감귤류 과피 추출물이 혈중 콜레스테롤을 현저하게 감소시키며, ACAT 및 HMG-CoA 환원효소의 활성을 저해하고, 대식세포-지질 복합체가 동맥 내피 표면에 형성되거나 부착하는 것을 강력히 억제할 뿐만 아니라, 동물의 간질환이나 고혈당증 등과 같은 성인병 예방 치료에 효과가 있다는 사실을 발견한 바 있다.

한편, 디오스민(C₂₈H₃₂O₁₅, M.W 608.55)은 감귤류 과피 및 각종 식물 조직에서 흔히 발견되는 바이오플라보노이드의 일종으로서, 오래전부터 모세혈관 보호제(capillary blood vessel protectant)로서 연구되었으며 현재 임상실험 완료 단계에 있다. 이 디오스민은 하루에 1000mg 정도까지 섭취하여도 인체에 아무 해가 없으며, 혈관 보호제(vasoprotector) 및 혈관 강화제(venotonic agent)로서 효능이 우수한 것으로 보고된 바 있다. 특히, 90% 디오스민과 10% 헤스페리딘 복합제는 다플론(Daflon 500mg)이란 상품으로 알려져 있으며, 동물실험에서 3g/kg/day 투여해도 아무 부작용이 없는 것으로 밝혀졌다.(O. C. Meyer. Safety and security of Daflon 500mg in venous insufficiency and in hemorrhoidal disease, Angiology 45:579-584, 1994).

이에 본 발명자들은 인체에 유익한 활성을 갖는 바이오플라보노이드의 일종인 디오스민에 대한 연구를 계속한 결과, 디오스민이 동맥내피에 대식세포-지질 복합체가 침착되는 것을 강력히 억제하고, ACAT 및 HMG-CoA 환원효소의 활성을 억제하며, 혈중 콜레스테롤 및 중성지질의 농도를 감소시킴을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 디오스민을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 디오스민을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 기능성 건강식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 디오스민을 포함하는 고지혈증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 디오스민을 포함하는 고지혈증 예방 및 치료용 기능성 건강식품을 제공하는 것이다.

도 1은 토끼의 동맥내피를 보여주는 사진으로서, 도 1a, 1b 및 1c는 각각 대조군, 로바스타틴 투여군 및 디오스민 투여군에 해당하는 사진이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 활성 성분으로서 디오스민(diosmin) 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 디오스민을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 기능성 건강식품을 제공한다.

또 다른 목적에 따라, 활성 성분으로서 디오스민 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 고지혈증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 디오스민을 포함하는 고지혈증 예방 및 치료용 기능성 건강식품을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 사용되는 디오스민은 채소류, 감귤류로부터 추출하거나 공지된 합성 방법에 의해서도 합성할 수 있으며, 감귤류란 하귤, 당유자, 오렌지, 레몬, 감귤, 자몽 또는 유자 등을 지칭한다.

이 디오스민은 동물에 투여시 동맥내피에 대식세포-지질 복합체가 침착되는 것을 강력히 억제하고, ACAT 및 HMG-CoA 환원효소의 활성을 억제하며, 혈중 콜레스테롤 및 중성지질의 농도를 감소시킨다. 현재까지 연구된 독성시험 결과, 본 발명의 디오스민은 1000 mg/kg의 용량으로 쥐에게 경구 투여하였을 때 독성이 거의 없는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이들 물질은 간을 비롯한 장기의 기능에 어떠한 부작용도 나타내지 않는다.

본 발명에 따르면, 동맥경화증 및 고지혈증의 예방 및 치료를 위하여, 디오스민을 유효성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 이들 질병의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제조할 수 있다. 이 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 및 현탁제, 유제 또는 시럽제와 같은 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 디오스민을 유효성분으로 함유하는 동맥경화증 및 고지혈증 예방 및 치료용 조성물을 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1 내지 500 mg, 바람직하게는 1 내지 100 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물과 동일한 목적으로 디오스민은 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 경우, 탄닌, 갈산 또는 엘라그산은 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 건강보조식품용 개발을 위하여 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 육류, 음료수, 초코렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 토마토 페이스트, 차, 알콜음료류, 비타민 복합제 등이 있다.

이하 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들 만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 디오스민의 경구 급성 독성 실험

7-8 주령의 특정 병원체 부재(specific pathogens free) ICR 마우스로서 체중 25-29 g의 암컷 6 마리와 체중 34-38 g의 숫컷 6 마리를 온도 22±1℃, 습도 55±5%, 조명 12L/12D의 동물실 내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 1주일 정도 순화시켰다. 실험동물용 사료((주)제일제당, 마우스 및 랫드용) 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유 섭취시켰다.

미국의 시그마사(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo)로부터 구입한 디오스민을 0.5% 트윈 80을 용매로 하여 100 mg/ml 농도로 조제한 후, 마우스 체중 20g 당 0.2 ml씩 경구투여하였다. 시료는 1회 경구 투여하였으며 투여 후 10일 동안 다음과 같이 부작용 또는 치사 여부를 관찰하였다. 즉, 투여 당일은 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간 뒤에 그리고 투여 익일부터 10일째까지는 매일 오전, 오후 1회 이상씩 일반 증상의 변화 및 사망 동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 투여 10일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부 장기를 검사하였다. 투여 당일부터 1일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 디오스민에 의한 동물의 체중 감소 현상을 관찰하였다.

본 실험은 디오스민의 경구 투여시 급성 독성의 정도를 파악함으로써 일반 약리 및 약효 시험에서의 가용 약용량에 대한 정보를 제공하고 독성에 대한 기초 자료를 도출함을 목적으로 실시하여 아래와 같은 결과를 얻었다.

급성 경구 독성의 경우는 디오스민 1000 mg/kg의 용량에서 10일 동안 치사 동물이 관찰되지 않았다. 10일 후 생존 동물에 대한 부검을 실시한 바, 특별한 병변 육안 소견이 없었으며, 투여 익일부터 10일간 어떠한 체중의 감소 없이 정상적인 체중의 증가가 관찰되었다.

결론적으로 본 발명의 디오스민은 상기의 농도로 경구투여시 독성이 관찰되지 않았다.

실시예 2: 실험동물의 식이 조성과 디오스민의 동물 투여 실험-(1)

1) 동물실험

3주령의 스프라그 다우리(Sprague Dawley) 흰쥐 20마리를 충북 음성군의 대한실험 동물센터로부터 구입하여 1주일간 제일제당 실험동물 사료로 사육하고, 4주령(체중: 90∼110g)이 되었을 때, 난괴법(randomized block design)에 의해 2개의 그룹으로 나누었다. 두 그룹의 쥐들에게 각각 두 가지의 서로 다른 고콜레스테롤 식이, 즉, 정상식이(AIN-76 실험동물 식이)에 1% 콜레스테롤이 함유된 식이(대조군)와 1% 콜레스테롤 및 디오스민 0.05%가 함유된 식이를 각각 섭취시켰다. 두 그룹의 쥐들에게 섭취시킨 식이의 조성을 하기 표 1에 나타내었다.

식이군성분	대조군	디스오민 투여군
카제인	20	20
D,L-메티오닌	0.3	0.3
옥수수 전분	15	15
슈크로즈	49	48.95
셀룰로즈 분말	5	5
미네랄 혼합물	3.5	3.5
비타민 혼합물	1	1
바이타르트산 콜린	0.2	0.2
옥수수유	5	5
콜레스테롤	1	1
디스오민	-	0.05
총	100(%)	100(%)

모든 식이들은 고콜레스테롤 식이(1%, wt/wt)에 해당하고, 실험용 흰쥐의 실험실 식이인 AIN-76 식이 조성 중 셀룰로즈, 미네랄 혼합물 및 비타민 혼합물 성분은 미국의 테크라드 프리미어사(TEKLAD premier, Madison, Wisconsin)로부터 구입하였다.

두 식이군의 쥐들에게 6주동안 해당 식이를 물과 함께 자유로이 섭취하도록 하였으며, 식이 섭취량을 매일 기록하고 7일마다 체중을 측정하였다. 동물사육이 종료된 후 사육 일지의 자료를 분석한 결과, 식이 섭취량과 체중증가에 있어서는 2개군간 유의적인 차이가 없었으며 정상적인 성장을 보였다.

동물실험을 수행한지 6주 후, 2개 그룹의 쥐를 희생시킨 다음, 혈액을 분석하고, ACAT 활성을 측정하였다.

2) 혈액 분석

희생된 쥐로부터 채취된 혈액을 2시간 정도 정치한 다음 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층부의 혈청을 분리하여 초저온냉동고에 보관하였다가 혈액 분석하였다. 혈액 분석은, 혈액화학분석기(CIBA Corning 550 Express, USA)를 이용하여 총 콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 농도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

식이군지질 함량	대조군	디오스민 투여군
총 콜레스테롤(mg/㎗)	135 ± 28	120 ± 8
트리글리세라이드(mg/㎗)	57 ± 13	45 ± 8

상기 표 2로부터 알 수 있듯이, 디오스민 투여군은 혈중 콜레스테롤 및 중성지질의 농도를 대조군과 비교해서 각각 12% 및 21% 가량 감소시켰다.

3) ACAT 활성 측정

3-1) 마이크로좀의 제조

희생된 쥐로부터 적출된 간 조직 1g을 5 ml의 용액 1(0.1 M 인산칼륨(pH 7.4), 0.1 mM EDTA 및 10 mM β-머캅토에탄올)에 넣고 균질화하였다. 이 균질액을 4 ℃에서 3,000 x g으로 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브로 옮겨, 4 ℃에서 15,000 x g로 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 5 ml 초원심분리 튜브(Beckman)로 옮겨, 4 ℃에서 100,000 x g로 1시간 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 펠렛을 3 ml의 용액 1로 현탁시킨 후, 이 용액을 4 ℃에서 100,000 x g로 1시간 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 펠렛(마이크로좀 침전물)을 1 ml의 "용액 1"로 현탁시킨 후, 현탁액중의 단백질 농도를 로우리(Lowry) 등의 방법으로 측정하여 단백질 농도를 4 내지 8 mg/ml로 조절하였다. 이 마이크로좀 현탁액을 딥 프리저(deep freezer)에 보관하였다.

3-2) ACAT 활성 측정

아세톤에 1 mg/ml의 농도로 용해된 콜레스테롤 용액 6.67 ㎕를 아세톤중의 10% 트리톤(Triton) WR-1339 6 ㎕와 혼합하고, 질소가스를 이용하여 아세톤을 증발시킨 후, 10 ml 부피당 300mg의 콜레스테롤이 포함되도록 증류수를 가했다. 10 ㎕의 콜레스테롤 수용액, 10 ㎕의 1 M 인산 칼륨(pH 7.4), 5 ㎕의 0.6 mM 혈청 알부민(BSA), 10 ㎕의 상기 단계 2-1)에서 얻은 현탁액(마이크로좀) 및 55 ㎕의 증류수를 혼합하였다(총 90㎕). 이 혼합물을 37℃로 유지되는 수욕(waterbath)에서 30분 동안 예비 반응시켰다.

방사능 표지된 올레일-CoA와 올레일-CoA를 혼합하여 제조된 10 ㎕의 올레일-CoA 용액(0.3 mg/ml)을 예비 반응된 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 37℃로 유지되는 수욕에서 30분 동안 반응시켰다. 여기에, 500 ㎕의 이소프로판올:헵탄 = 4:1(v/v%) 용액, 300 ㎕의 헵탄 및 200 ㎕의 0.1 M 인산 칼륨(pH 7.4)을 가하고, 볼텍스(vortex)로 격렬하게 혼합한 후, 상온에서 2분 동안 방치하였다.

200 ㎕의 상층액을 신틸레이션 병에 넣고, 신틸레이션 액(Lumac 사 제품) 4 ml를 섞어 신틸레이션 계수기(scintillation counter)로 방사선량을 측정하였다. ACAT 활성은 측정된 방사선량으로부터 시간당 방사선량을 계산하여 피코몰/분/mg 단백질 단위로 나타내었다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

식이군	ACAT 활성 저해도(%)
대조군	0
디오스민 투여군	15

상기 표 3으로부터 알 수 있듯이, 디오스민 투여군은 ACAT 활성을 15% 정도 저해하였다.

4) HMG-CoA 환원효소 활성 측정

HMG-CoA 환원효소의 활성을 측정하기 위해, 본 발명에서는 헐커(Hulcher) 등이 발표한 방법(J. Lipid Res. 14:625-641(1973))을 수정하여 사용하였다. 측정원리는 HMG-CoA가 HMG-CoA 환원효소의 작용에 의해 메발론산염으로 환원될 때 생성되는 조효소(Coenzyme)-A(CoA-SH)를 분광광도계로 측정하여 HMG-CoA 환원효소의 활성도로 환산하는 것이다. 구체적인 방법 및 그 결과를 하기에 나타내었다.

4-1) 마이크로좀의 제조

희생된 쥐로부터 간조직 3g을 채취한 후, 100 ㎖의 냉각 염수(cold saline)(0.15M NaCl)와 100 ㎖의 냉각 완충액 A(0.1M 트리에탄올아민, HCl/0.2M EDTA/2mM 디티오트레이톨)로 간조직을 세척하였다. 간조직 1g 당 2 ㎖의 냉각 완충액 A를 첨가하여 파쇄하고 호모게나이져(homogenizer)로 완전히 균질화한 후, 분쇄된 간 조직을 원심분리(15,000 x g, 15분간)하여 상등액을 채취하였다. 채취된 상등액을 초원심분리(100,000 x g, 60분간)하고 상등액을 제거하여 마이크로좀 침전물을 수득하였다. 획득한 마이크로좀 침전물을 5 ㎖의 냉각 완충액 A로 세척하고, 다시 초원심분리(100,000 x g, 60분간)하여 침전물을 획득하였다. 침전물을 1㎖의 냉각 완충액 A로 세척하고 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다.

4-2) HMG-CoA 환원효소 활성 측정

HMG-CoA 환원효소 활성 측정에 사용되는 반응기질은 하기와 같다; ① 완충액 B : 0.1M 트리에탄올아민, HCl/0.02M EDTA(pH 7.4), ② HMG-CoA 용액 : 150 μmoles/배양혼합물, 및 ③ NADPH 용액 : 2 μmoles/배양혼합물.

상기 단계 4-1)에서 얻은 현탁액(마이크로좀)을 반응기질과 혼합하여 원심분리 튜브에 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 20㎕의 0.01M 아비산나트륨 용액으로 처리하여 1분간 방치한 다음, 100㎕의 시트르산염 완충액(2M 시트르산염/3% 텅스텐나트륨, pH 3.5)과 37℃에서 10분간 반응시키고 고속 원심분리(25,000 x g, 15분간)하여 단백질을 제거하였다. 상등액중 1㎖을 취하여 마개달린 튜브로 옮기고 2M 트리스염산 용액(pH 10.6) 0.2㎖과 2M 트리스염산 용액(pH 8.0) 0.1㎖을 넣어 반응물의 pH를 8.0으로 조절하였다. 이어, 반응물을 20㎕의 DTNB 완충액(3mM DTNB/0.1M 트리에탄올아민/0.2M EDTA, pH 7.4)과 잘 혼합한 후 분광광도계로 412nm의 빛에 대한 흡광도를 측정하여, 형성된 CoA-SH의 양(HMG-CoA 환원효소 활성도)을 산출하였다. 이를 기준으로 하여, 대조군 및 디오스민 투여군의 HMG-CoA 환원효소 활성 저해도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

식 이 군	HMG CoA 환원효소 활성 저해도 (%)
대 조 군	0
디오스민 투여군	25

상기 표 4로부터 알 수 있듯이, 디오스민 투여군은 HMG-CoA 환원효소 활성을 25% 정도 저해하였다.

실시예 3: 디오스민의 인체 투여 실험

디오스민을 50대 중반 남자 2명에게 캅셀당 하루 10 ㎎/㎏의 양으로 경구 투여하였다. 이 남자들은 혈중 콜레스테롤이 230 내지 270mg/㎗이고, 중성지질이 200 내지 220mg/㎗인 고지혈증 환자였다. 60일 후 혈중 콜레스테롤 및 중성지질(트리글리세라이드)을 측정한 결과, 각각의 농도가 15%, 10%씩 감소하였다.

따라서, 디오스민은 인체 고지혈증 치료에 효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 4: 실험동물의 식이 조성과 디오스민의 동물 투여 실험-(2)

1) 동물실험

실험동물로서 체중이 2.5 - 2.6 kg 정도의 3개월령 뉴질랜드 백색종(New Zealand White)의 건강한 수컷 토끼 18마리를 연암원예 축산대학으로부터 분양받아 실험에 사용하였다. 동물들을 온도 20 ± 2℃, 습도 55 ± 5% 및 12시간 명/암 주기로 조절되는 환경의 동물사육실에서 사육하면서 실험을 수행하였다.

실험군은 1% 콜레스테롤이 첨가되어 있는 토끼용 고형사료(RC 4 diet, Oriental Yeast Co., Japan)만을 섭취시키는 대조군 및, 대조약제 로바스타틴 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) 및 디오스민(Sigma Co., St. Louis, MO.)을 사료에 혼합하여 투여하는 시험군의 총 3개의 실험군으로 나누었다. 1개군의 실험에 6 마리의 토끼를 사용하였으며, 각 실험군 및 RC4 식이 조성은 하기 표 5와 같다.

실험군	조 성
1	RC4(1% 콜레스테롤) 식이(대조군)
2	RC4(1% 콜레스테롤) 식이 + 로바스타틴 1mg/kg(대조약제)
3	RC4(1% 콜레스테롤) 식이 + 0.1% 디오스민
* RC4 식이 조성: 수분 7.6%, 조단백질 22.8%, 조지방 2.8%, 조회분 8.8%, 조섬유 14.4%, 가용성 무질소물 42.7%, 콜레스테롤 1%

모든 실험군의 식이는 고콜레스테롤 식이(1%, wt/wt)에 해당하며, 실험용 토끼들에게 6주동안 해당 식이를 물과 함께 자유로이 섭취하도록 하였다.

동물 실험을 수행한지 6주 후, 3개 그룹의 토끼를 희생시킨 다음, 혈액 분석, 대동맥내 지방선의 면적 측정, 및 간조직을 비롯한 각 장기 조직의 관찰을 수행하였다.

2) 혈액 분석

희생된 쥐로부터 채취된 혈액을 2시간 정도 정치한 다음 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층부의 혈청을 분리하여 초저온 냉동고에 보관하였다가 혈액 분석하였다. 혈액 화학 분석기(CIBA Corning 550 Express, USA)를 이용하여, 총 콜레스테롤 및 중성지질(트리글리세라이드)의 농도를 측정하였다. 그 결과, 디오스민 투여군이 대조군 및 로바스타틴 투여군에 비해 혈중 콜레스테롤 및 중성지질의 농도가 크게 감소하였음을 확인하였다.

3) 대동맥내 지방선 면적 측정

각 실험군 토끼들의 흉부를 절개하여 대동맥궁을 따라 하방으로 5 cm 정도를 절취한 후, 혈관주변부의 지방을 잘 제거하고 대동맥의 중앙부위를 종축방향을 따라 절개하여 접시 위에 핀으로 고정하였다. 수분이 있는 상태의 조직을 사진 촬영하였다. 에스퍼 등의 방법(Esper E, Runge WJ, Gunther R, Buchwald H. Natural history of atherosclerosis and hyperlipidemia in heterozygous WHHL[WHHL-Hh] rabbits Ⅱ. Morphometric evaluation of spontaneously occurring aortic and coronary lesion. J Lab Clin Med 121: 103-110, 1993)을 이용하여, 절개된 대동맥을 무수 프로필렌 글리콜로 2분씩 3회 수세하고, 프로필렌 글리콜에 녹인 오일 레드 오(Oil Red O, ORO) 포화용액으로 30분간 지방을 염색하였다. 염색된 대동맥을 85% 프로필렌 글리콜로 3분씩 2회 수세하여 여분의 염색액을 제거하고 생리식염수로 세척한 후 사진촬영을 하였다. 이 사진을 투사(tracing)하여 화상분석기(LEICA, Q-600, Germany)로 전체 대동맥 면적에 대한 염색부위(지방선 축적 면적)의 비율(%)을 계산하였다. 그 결과, 디오스민 투여군의 경우, 동맥내피에 형성된 죽상경화반(대식세포-지질 복합체) 면적이 약 14%로서 대조군의 35%보다 현저하게 감소하였음을 알 수 있었다.

또한, 도 1은 실험에 사용된 토끼의 동맥내피를 보여주는 사진으로서, 도 1a, 1b 및 1c는 각각 대조군, 로바스타틴 투여군 및 디오스민 투여군에 해당하는 사진이다. 도 1a의 동맥내피 표면에는 아주 두꺼운 대식세포-지질 복합층이 침착하여 죽상경화반을 형성하고 있으며, 도 1b 및 1c의 동맥내피 표면은 아주 깨끗하여 죽상경화반이 거의 형성되지 않았음을 알 수 있다.

4) 장기의 조직 관찰

토끼 부검시 흉부를 절개하고 대동맥 일부와 심장, 폐, 간, 신장 및 근육 등을 절취하여 육안적으로 특이 소견의 유무를 확인한 다음, 각 장기의 1/2은 급속 동결시키고 1/2은 10% 중성 포르말린에 넣어 24시간 이상 고정하였다. 이어, 각 조직들을 흐르는 물로 충분히 수세하고, 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올로 단계적으로 탈수시킨 다음 파라핀 투과 과정을 거쳐 포매장치(SHANDON, Histocentre 2, USA)를 이용하여 포매하고, 박절편기(LEICA, RM2045, Germany)로 약 4 ㎛의 두께로 조직절편을 제작하였다. 제작된 조직 절편을 헤마톡실린 앤드 에오신(Hematoxylin ＆ eosin)으로 염색하고, 크실렌으로 투명화시킨 후 퍼마운트(permount)로 봉입한 후 광학현미경(100 x 배율)으로 관찰하였다.

상기한 결과로부터 본 발명의 디오스민을 매일 유효량 섭취할 경우 동맥경화증 및 고지혈증의 예방 및 치료 효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 5: 디오스민의 약학 조성물 및 제제의 제조

하기 성분들을 포함하는 디오스민 조성물을 제조하였다.

디오스민 200 mg

비타민 C 50 mg

락토스(담체) 150 mg

총 400 mg

상기 성분들을 잘 혼합하여 캅셀당 총 400 mg이 되도록 경질 젤라틴 캅셀에 충전하였다. 제조된 캅셀을 하루에 1 내지 10개 섭취함으로써 동맥경화증, 고지혈증 및 당뇨병을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 조성물들은 비타민 C외에 건강에 유익한 다른 성분들을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 일반조제법에 따라 정제, 과립제, 산제, 마이크로캅셀, 드링크제, 현탁제, 유제, 시럽제, 기타 액제 등 각종 경구용 제제로 제조할 수 있다.

실시예 6: 디오스민을 이용한 기능성 식품의 제조

1) 토마토 케찹, 쏘스, 쥬스 제조

디오스민을 통상적인 토마토 케찹, 쏘스 및 쥬스에 0.1 내지 5 중량%의 양으로 첨가하여 기능성 식품으로서 케찹, 쏘스 및 쥬스를 제조하였다.

2) 라면, 국수, 빵, 케익, 쿠키, 크래커 등의 밀가루 식품 제조

밀가루 기능성 식품을 제조하기 위해서 원료인 밀가루에 디오스민을 0.1 내지 0.5 중량%의 양으로 첨가한 후 최종 식품을 제조하였다.

3) 스프 및 육즙(gravies) 제조

스프 또는 육즙의 원료에 디오스민을 0.1 내지 1 중량%의 양으로 첨가한 후 최종 식품을 제조하였다.

4) 그라운드 비프(ground beef) 제조

그라운드 비프의 원료에 디오스민을 0.1 내지 0.5 중량%의 양으로 첨가한 후 최종식품을 제조하였다.

5) 유제품(dairy products)(우유, 아이스크림, 치즈, 요구르트 등) 제조

우유에 디오스민을 0.1 내지 5 중량%의 양으로 첨가한 후 최종 식품을 제조하였다. 특히, 치즈 제조시에는 우유 단백질을 응고시키고 회수한 다음 디오스민을 첨가하고, 요구르트 제조시에는 발효를 끝낸 후 응고된 단백질에 디오스민을 첨가하였다.

디오스민을 포함하는 본 발명의 조성물은, 동물에게 투여시 동맥내피에 대식세포-지질 복합체가 침착되는 것을 강력히 억제할 뿐만 아니라, ACAT 및 HMG-CoA 환원효소의 활성을 억제하고, 혈중 콜레스테롤 및 중성지질의 농도를 감소시키므로, 동맥경화증 및 고지혈증 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (4)

1. 활성 성분으로서 디오스민(diosmin) 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 동맥경화증 예방 및 치료용 약학 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,

   디오스민 유효량이 0.1 mg 내지 500 mg/kg 체중/일임을 특징으로 하는 조성물.
3. 활성 성분으로서 디오스민 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 고지혈증 예방 및 치료용 약학 조성물.
4. 제 3 항에 있어서,

   디오스민 유효량이 0.1 mg 내지 500 mg/kg 체중/일임을 특징으로 하는 조성물.