DE69834582T2

DE69834582T2 - Biokatalytisches verfahren für die herstellung von 3-o-acyl-flavonoiden

Info

Publication number: DE69834582T2
Application number: DE69834582T
Authority: DE
Inventors: Ist. per Studio delle Sost. Giovanni Via del Santuario 110 NICOLOSI; Inst. per lo Studio delle Sost. Mario Via del Santuario 110 PIATTELLI; Ist. per Studio delle Sostanze Daniela Via del Santuario 110 LAMBUSTA; Inst. per lo Studio delle Sostanze Angela Via del Santuario 110 PATTI
Original assignee: RAO ERBE DI RAO FELICE; RAO-ERBE DI RAO FELICE; Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Current assignee: RAO ERBE DI RAO FELICE; RAO-ERBE DI RAO FELICE; Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Priority date: 1998-06-18
Filing date: 1998-06-18
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2018-06-19
Also published as: AU8627798A; WO1999066062A1; EP1088094B1; EP1088094A1; DE69834582D1; ES2263213T3

Description

Flavonoide sind eine wichtige Klasse natürlicher Polyphenole, die in verschiedenen Pflanzen vorhanden sind.
Viele davon besitzen wichtige biologische Aktivitäten, wie zum Beispiel hepatoprotektive, Anticholesterol-, antineoplastische, antiinflammatorische, Antiinfluenza-, Antiulcer- und vasoprotektive Aktivität. Einige Flavonoide nützen die inhibitorische Aktivität gegen Tyrosinkinase und Phosphatidylinositol-Kinase aus. Darüberhinaus sind ihre antioxidantischen Eigenschaften gegen Peroxidradikale vergleichbar mit, wenn nicht besser als jene von herkömmlichen phenolischen Antioxidantien. Viele dieser chemischen und biologischen Eigenschaften sind mit der Position von Hydroxylgruppen im Flavangerüst streng korreliert.
Auf Grund ihrer polyhydroxylierten Natur sind Flavonoide in lipophilem Medium (Öle und Emulsionen) unlöslich und schwach biologisch verfügbar, so dass ihr Einsatz beschränkt ist.
Es ist notwendig, ein synthetisches Verfahren zu entwickeln, um die selektive Veresterung der Hydroxylgruppe an der C-3-Position zu erreichen, ohne die anderen Phenolgruppen in dem Molekül einzuschließen.
Die regioeselektive Alkoholyse von peracetylierten Flavonoiden wurde von Natoli et al. (Natoli, M; Nicolosi, G.; Piattelli, M, J. Org. Chem. 1992, 57, 5776–5778) berichtet. Das beschriebene Verfahren verwendet Lipase von Pseudomonas cepacia, welche die Alkoholyse der Acetoxylgruppe in verschiedener Position, jedoch nicht an C-3 katalysierte; dennoch wird das 3-Acetoxylderivat in sehr geringer Ausbeute wiedergewonnen.
Lambusta et al., Synthesis 1993, 1155–1158 berichteten die Herstellung von (+)-3-0-Acetylcatechin durch Alkoholyse von peracetyliertem (+)-Catechin in der Gegenwart von Lipase von Pseudomonas cepacia, doch die angewandten Reaktionsbedingungen waren nachteilig für das Enzym und in der Folge wurde dessen schnelle Inaktivierung beobachtet.
EP 0618203 berichtet Catechine, die in C-3-Position acetyliert sind, und durch Veresterung von freiem Catechin hergestellt wurden, welches durch Carboxylesterase von Streptomyces rachei oder Aspergillus niger katalysiert wurde. Die Verwendung dieses Verfahrens erlaubt Ester mit Acetyl-, Propyl- und Butyrylgruppen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun herausgefunden, dass es möglich ist, 3-Monoester von Flavonoid als einziges Reaktionsprodukt zu erhalten, indem die Alkoholyse eines peracetylierten Flavonoids in organischem Lösungsmittel in der Gegenwart von Lipase von Mucor miehei durchgeführt wird.
Daher ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein wirksames Verfahren zur Herstellung von 3-Monoestern von Flavonoiden, welches umfasst:

a) die chemische Veresterung des Flavonoids mit einer aliphatischen Acylgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, um das entsprechende peracetylierte Flavonoid, oder alternativ, das teilweise acetylierte Flavonoid zu erhalten;
b) die Alkoholyse des obigen Esters mit einem aliphatischen Alkohol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder mit einem mehrwertigen Alkohol in Gegenwart von Lipase aus Mucor miehei in einem organischen Lösungsmittel.

Vorteilhafterweise behält die Lipase gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ihre katalytische Aktivität für mehrere Verfahrenszyklen.
Diese Erfindung umfasst auch neue Monoester von Flavonoiden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Lipase von Mucor miehei ist seit langer Zeit gut bekannt, wurde jedoch bisher niemals in der Veresterung von Phenolen oder der Hydrolyse von peracetylierten Phenolen eingesetzt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Alkoholyse von teilweise oder vollständig acetylierten Flavonoiden in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt.
Bevorzugte Beispiele für Lösungsmittel können aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Ether, noch bevorzugter tert.-Butylmethylether, sein.
Alle Flavonoide, die an der C-3-Position eine Hydroxylfunktion besitzen, können verwendet werden. Beispiele für solche Flavonoide sind: Quercetin, Galangin, Morin, Fisetin, Kämpferol, Kämpferid, (+)-Catechin, (-)-Catechin (+)-Epicatechin, (-)-Epicatechin.
In einer bevorzugten Ausführungsform sieht das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Lipase von Mucor miehei vor, die auf einen festen Träger adsorbiert ist, wie zum Beispiel das kommerziell erhältliche Lipozyme^® IM von Novo Nordisk oder Chirazyme^® L-9 von Boehringer Mannheim. Auch Celite oder andere übliche Träger können verwendet werden.
In einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Acylierung des Flavonoids durch herkömmliche Verfahren ausgeführt. Zum Beispiel kann das Acylierungsmittel Acylhalogenid, vorzugsweise Acylchlorid, sein. Beispiele für aliphatische Acylgruppen mit C₂ bis C₁₈ können im Zusammenhang mit dieser Erfindung Acetyl, Propionyl, Butyryl, Valeryl, Hexanoyl, Heptanoyl, Octanoyl, Nonanoyl, Decanoyl, Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, Heptadecanoyl, Oleoyl, Stearoyl sein. Palmitoyl wird bevorzugt.
Der nächste Schritt ist eine Alkoholyse, die in organischem Lösungsmittel unter Verwendung eines aliphatischen Alkohols mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen durchgeführt wird, wie oben offenbart.
Beispiele für diesen aliphatischen Alkohol sind Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, n-Butanol, t-Butanol, Amylalkohol n-Hexanol, n-Octanol. n-Butanol wird bevorzugt. Beispiele für mehrwertige Alkohole sind Glycerin und Glycole.
Das interessierende Produkt, nämlich das Flavonoid-3-monoester wird aus dem Reaktionsgemisch durch herkömmliche Verfahren, die dem Fachmann wohl bekannt sind, wiedergewonnen. Durch geeignete Auswahl der Acylgruppe und des aliphatischen Alkohols kann das gewünschte Produkt durch Abkühlen des Reaktionsgemischs wiedergewonnen werden.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hat neue 3-Monoester ergeben, und zwar von Quercetin, wie in der Formel 1 gezeigt:
worin R eine Acylgruppe mit 3 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Von Galangin, wie in der Formel 2 gezeigt:
worin R eine Acylgruppe mit 3 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Von Morin, wie in der Formel 3 gezeigt:
worin R eine Acylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Von Fisetin, wie in der Formel 4 gezeigt:
worin R eine Acylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Von Kämpferol, wie in der Formel 5 gezeigt:
worin R eine Acylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Von Kämpferid, wie in der Formel 6 gezeigt:
worin R eine Acylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Von (+)-Catechin, wie in der Formel 7 gezeigt:
worin R eine Acylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Von (-)-Catechin, wie in der Formel 8 gezeigt:
worin R eine Acylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Von (-)-Epicatechin, wie in der Formel 9 gezeigt:
worin R eine Acylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Von (+)-Epicatechin, wie in der Formel 10 gezeigt:
worin R eine Acylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
Diese Verbindungen sind als Antioxidantien nützlich.
Um ein Beispiel für das experimentelle Verfahren zu geben, wird hier der spezielle Fall von Quercetin berichtet.
Quercetin (1) wird durch ein herkömmliches chemisches Verfahren unter Verwendung einer aliphatischen Acylgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen verestert, um das entsprechende Pentacylderivat zu ergeben (Schritt A). Diese Ester werden der Alkoholyse mit einem aliphatischen Alkohol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen in der Gegenwart von Lipasen von Mucor miehei (Lipozyme^® IM, Chirazyme^® L-9, oder auf einem inerten Träger adsorbiert) unter Verwendung von tert.-Butylmethylether als Lösungsmittel unterworfen (Schritt B).
Die Alkoholyse ergibt Monoester, in welchen alle phenolischen Hydroxylfunktionen frei sind, während die alkoholische Gruppe an der Position C-3 verestert bleibt. Es ist anzumerken, dass bei dem der Alkoholyse unterworfenen Ester die Hydroxylgruppen an dem A- oder B-Ring teilweise verestert sein können. Dies wird durch Veresterung mit nicht ausreichenden Mengen an Acylierungsmittel oder durch ein herkömmliches Schutzverfahren erreicht. Darüberhinaus ist es möglich, gemischte Ester zu verwenden, in welchen die Hydroxylgruppen in verschiedenen Positionen durch verschiedene Acylgruppen verestert sind. Auf diese Weise wird eine Reihe von Vorteilen verwirklicht. Zum Beispiel erfolgt die Alkoholyse partieller Ester schneller. Im Fall von gemischten Estern ist es vorteilhaft, alle anderen Hydroxylgruppen mit kurzkettigen Säuregruppen zu verestern, wenn der gewünschte 3-Monoester eine langkettige Acylgruppe aufweist, und damit die Bedingungen der abschließenden Alkoholyse zu erleichtern.
Die Lipase von Mucor miehei, die in immmobilisierter Form, wie etwa als Lipozyme IM, eingesetzt wird, behält ihre Aktivität für zumindest 10 Verwendungszyklen bei.
Die Verwendung von Lipasen aus Schweinepankreas, Pseudomonas cepacia, Chromobacterium viscosum, Candida cylindracea, Candida antarctica, Aspergillus niger, Rhizopus niveus, Rhizopus javanicus, Rhizopus delemar, Candida lipolitica, Penicillium roqueforti, Penicillium cyclopium und Esterase aus Schweineleber ergibt nur eine spärliche Umsetzung oder katalysiert die Alkoholyse überhaupt nicht.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung weiter.
Beispiel:
Quercetin (1 g, 3,3 mmol) wurde in tert.-Butylmethylether (50 ml), das Triethylamin (5 ml) enthielt, und Palmitoylchlorid (5,2 ml, 7,2 mmol) wurde bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 12 Stunden wurde die Lösung mit verdünnter H₂SO₄ angesäuert und drei Mal mit CH₂C1₂ extrahiert. Die erhaltene organische Phase wurde zur Trockne gebracht und ergab 4,75 Gramm Pentapalmitoyl-Quercetin (Ausbeute 96 %).
Lipozyme IM (2,5 Gramm) wurde zu einer Lösung von tert.-Butylmethylether (250 ml), das Pentapalmitoyl-Quercetin (3 g, 2,9 mmol) und n-Butanol (1 l, 10,9 mmol) enthielt, zugegeben, und die Suspension wurde bei 45 °C geschüttelt (300 U/min). Nach 5 Tagen wurde die Reaktion gestoppt und das Enzym abgefiltert. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand zu Hexan (200 ml) zugegeben. Bei Abkühlen der Lösung wurden 1 g 3-O-Palmitoylquercetin (92 % Ausbeute) als niedrigschmelzender Feststoff erhalten.
¹H-nmr: ¹HNMR(CD₃Cl₃): δ 0.89 (bt, -CH₃), 1.30 (bs, -(CH₂)₁₃-), 1.73 (bt, – CH₂CO-), 6.31 (d, J = 2.2 Hz, H6), 6.55 (d, J = 2.2 Hz, H8), 7.02 (d, J = 8.2 Hz, H5'), 7.40 (dd, J = 2.2, 8.2 Hz, H6'), 7.47 (d, J=2.2 Hz, H2').
Auf dieselbe Art wurden die folgenden 3-Monoester von Quercetin hergestellt.

Claims

Verfahren zur Herstellung von 3-Monoestern von Flavonoiden umfassend die folgenden Schritte: a) chemische Veresterung eines Flavonoids mit einer aliphatischen Acylgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, um das entsprechende peracetylierte Flavonoid, oder alternativ, das teilweise acetylierte Flavonoid zu erhalten; b) darauf folgende Alkoholyse mit einem aliphatischen Alkohol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, in Gegenwart von Lipase aus Mucor miehei in einem organischen Lösungsmittel.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Flavonoid ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Quercetin, Galangin, Morin, Fisetin, Kämpferol, Kämpferid, (+)-Catechin, (-)-Catechin, (+)-Epicatechin, (-)-Epicatechin.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das aliphatische Acyl ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Acetyl, Propionyl, Butyryl, Valeryl, Hexanoyl, Heptanoyl, Octanoyl, Nonanoyl, Decanoyl, Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, Heptadecanoyl, Oleoyl, Stearoyl.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Lipase aus Mucor miehei auf einem Träger vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Lipase auf Celite als Träger vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Lösungsmittel ein halogenierter aliphatischen Kohlenwasserstoff, ein aromatischer Kohlenwasserstoff oder ein Ether ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Lösungsmittel tert.-Butylmethylether ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei in Schritt a) die Veresterung teilweise und mit nicht ausreichendem Acylierungsmittel erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei in Schritt a) die Veresterung teilweise erfolgt und durch vorhergehendes Schützen der Hydroxylgruppen und anschließendes Entschützen ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei in Schritt a) die Veresterung teilweise erfolgt und in aufeinander folgenden Schritten mit unterschiedlichen Acylierungsmitteln durchgeführt wird, um gemischte Ester zu erhalten.