SK50062012A3

SK50062012A3 - Quercetin derivatives, pharmaceutical compositions comprising them and their use

Info

Publication number: SK50062012A3
Application number: SK5006-2012A
Authority: SK
Inventors: Milan Stefek; Lucia Kovacikova; Ivana Milackova; Miroslav Veverka; Emil Svajdlenka; Eva Veverkova
Original assignee: Ustav Experimentalnej Farmakologie A Toxikologie Sav
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2013-09-03
Also published as: WO2013130020A1

Description

Deriváty kvercetínu, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a ich použitie

Oblasť techniky

Vynález sa týka derivátov kvercetínu všeobecného vzorca (I)

a ich farmaceutický akceptovateľných solí, hydrátov a solvátov, v ktorom skupiny Ri až R5 sú nezávisle H, benzyl a minimálne jedna skupina je ClCl^CHhjnCCO-, 4-O-acetylferuloyl alebo 2-chlór-l,4-naftochinón-3-yl. Vynález sa týka aj farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje deriváty kvercitínu a ich použitia.

Látky, ktoré sú predmetom vynálezu sú užitočné ako bifunkčné agens kombinujúce antioxidačnú aktivitu so schopnosťou inhibovať aldózareduktázu, prvý enzým polyolovej dráhy, na liečbu a kontrolu humánnych chorôb kde oxidačný stres a polyolová dráha sú kľúčovými etiologickými faktormi, vrátane vývoja neskorých diabetických komplikácií (makro- a mikroangiopatia, ateroskleróza, retinopatia, katarakta, nefropatia a neuropatia), rezistencie hepatálneho karcinómu na chemoterapiu, abnormálnej proliferácie vaskulámych hladkosvalových buniek počas aterosklerózy arestenózy, zápalovách ochorení ako je uveitída, sepsa, rakovine hrubého čreva, periodontitída a astma. Vynález sa takisto týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich semi-syntetické deriváty kvercetínu vzorca I a terapeutických metód zahŕňajúcich podanie semi-syntetických derivátov kvercetínu cicavcom. Vynález sa taktiež týka zlúčenín užitočných ako inermediáty na prípravu semisyntetických derivátov kvercetínu obsiahnutých týmto vynálezom.

Doterajší stav techniky

Diabetický pacienti sú náchylní na vznik chronických zdravotných komplikácií, úzko súvisiacich s hyperglykémiou, ktoré sú zodpovedné za významné zvýšenie morbidity a mortality diabetických pacientov. Pre vývoj nových terapeutických prístupov k prevencii a liečbe diabetických komplikácií (DK) je základným predpokladom identifikácia mechanizmov, ktoré na molekulovej úrovni vedú k bunkovej toxicite hyperglykémie.

Etiopatogenéza DK je multifaktoriálna - na ich vzniku sa podieľa viacero biochemických dejov odvíjajúcich sa od hyperglykénie ako spoločného menovateľa. Oxidačný stress a polyolová dráha sa považujú za kľúčové v etiológii diabetických komplikácií (Brownlee 2005). Za podmienok hyperglykémie nadbytočná glukóza iniciuje rad glyko-oxidačných premien endogénnych proteínov a stáva sa substrátom aldózareduktázy, prvého enzýmu polyolovej cesty (obrázok-príloha). Výsledkom je akumulácia produktov pokročilej glykácie proteínov (AGEs), generácia reaktívnych foriem kyslíka a intracelulárne hromadenie osmolytu sorbitolu [Baynes JW, Thorpe SR. Role of oxidative stress in diabetic complications: a new perspective on an old paradigm. Diabetes. 48:1-9 (1999); Obrosova IG. Increased sorbitol pathway activity generates oxidative stress in tissue sites for diabetic

-2complications. Antioxid Redox Signál. 7:1543-1552 (2005); Oates PJ. Aldose reductase, still a compelling target for diabetic neuropathy. Curr Drug Targets. 9:14-36 (2008)]. Vyčerpanie bunkových zásob NADPH aldózareduktázou môže znížiť hladiny redukovaného glutatiónu, endogénneho antioxidantu, a tak indukovať oxidačný stres.

Kľúčovým predpokladom na zníženie incidencie, progresie a závažnosti diabetických komplikácií u diabetikov je prísna kontrola hladiny glukózy. Avšak v dennom režime diabetického pacienta sa nemožno vyhnúť periódam hyperglykémie, so všetkými vyššie zmienenými škodlivými dôsledkami glukózovej toxicity. Teda je žiaduca dodatočná terapia interferujúca s patologickými procesmi na molekulovej úrovni, založená na antioxidantoch (AO), inhibítorov aldózareduktázy (ARI) a anti-glykačných agens, ktorá by zmiernila toxický efekt glukózy.

Súbežné podanie AO a ARI môže znižovať nároky na detoxifikačnú úlohu aldózareduktázy voči toxickým karbonylovým produktom významne zvýšených v diabetických tkanivách [Baynes JW. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes. 40(4):405-12 (1991), Thorpe SR, Baynes JW. Role of the Maillard reaction in diabetes mellitus and diseases of aging. Drugs Aging 9(2):69-77 (1996), Thomalley PJ. Measurement of protein glycation, glycated peptides, and glycation free adducts. Perit Dial Int. 25(6):522-33 (2005), Turk Z. Glycotoxines, carbonyl stress and relevance to diabetes and its complications. Physiol Res. 59(2):147-56 (2010)]. Navyše, antioxidačná aktivita môže potláčať procesy pokročilej glykácie (glykoxidácie) na úrovni medziproduktov radikálovej povahy [Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes 54:1615-1625 (2005), Baynes JW. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes 40(4):405-12 (1991), Thorpe SR, Baynes JW.Role of the Maillard reaction in diabetes mellitus and diseases of aging. Drugs Aging 9(2):69-77 (1996), Giacco F, Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complications. Circ Res. 107(9):1058-70 (2010), Brownlee M. Glycosylation products as toxic mediators of diabetic complications. Annu Rev Med. 42:159-66 (1991), Brownlee M. Negatíve consequences of glycation. Metabolism 49(2 Suppl 1):9-13 (2000)]. Je zrejmé, že v prípade chorôb multifaktorálneho pôvodu modulácia jediného cieľa, dokonca i v prípade veľmi účinného liečiva, neposkytne požadovaný efekt. Inovatívne stratégie zamerané na ovplyvnenie viacerých cieľov („multi-target“ stratégie) sú zamerané na racionálny dizajn chemických entít schopných simultánne ovplyvniť viaceré kľúčové mechanizmy. Tento prístup zvyšuje šancu úspešnej terapeutickej intervencie, znižuje risk vedľajších účinkov a je ekonomický. Inhibítory aldózareduktázy s antioxidačnou aktivitou sú teda žiaduce.

Príkladom „multi-target“ stratégie v liečbe diabetických komplikácií sú bifunkčné zlúčeniny kombinujúce shopnosť inhibovať aldózareduktázu s antioxidačným účinkom vrátane pyrido-pyrimidínov [La Motta C, Sartini S, Mugnaini L, Simorini F, Taliani S, Salemo S, Marini AM, Da Settimo F, Lavecchia A, Novellino E, Cantore M, Failli P, Ciuffi M. Pyrido(l,2-a)pyrimidin-4-one derivatives as a novel class of selective aldose reductase inhibitors exhibiting antioxidant activity. J Med Chem. 50(20):4917-27 (2007)], pyridazínov [Coudert P, Albuisson E, Boire JY, Duroux E, Bastide P, Couquelet J. Synthesis of pyridazine acetic acid derivatives possessing aldose reductase inhibitory activity and antioxidant properties. Eur J Med Chem. 29:471-477 (1994)], benzopyránov [Constantino L, Rastelli G, Gamberini MC et al. l-Benzopyran-4-one antioxidants and aldose reductase inhibitors. J. Med Chem. 42:1881-1893 (1999)] a karboxymetylovaných pyridoindolov [Stefek M, Snirc V, Djoubissie PO, Majekova M, Demopoulos V, Rackova L, Bezakova Z, Karasu C, Carbone V, El-Kabbani O. Carboxymethylated pyridoindole antioxidants as aldose reductase inhibitors: Synthesis, activity, partitioning, and molecular modeling. Bioorg Med Chem. 16:4908-4920 (2008)], zlúčeniny kombinujúce schopnosť inhibovať aldózareduktázu so schopnosťou zmierniť neenzýmovú glykáciu [Demopoulos VJ, Zaher N, Zika C, Anagnostou C, Mamadou

-3E, Alexiou P, Nicolaou I. Compounds that combine aldose reductase inhibitory activity and ability to prevent the glycation (glucation and/or fructation) of proteins as putative pharmacotherapeutic agents. Drug Design Reviews-Online. 2:293-304 (2005)], alebo zlúčeniny kombinujúce antioxidačnú aktivitu so schopnosťou chelátovať redox reaktívne kovové ióny ako železo a meď [Randazzo J, Zhang P, Makita J, Blessing K, Kador PF. Orally Active Multi-Functional Antioxidants Delay Cataract Formation in Streptozotocin (Type 1) Diabetic and Gamma-Irradiated Rats. PLoS ONE.6:4. el8980 (2011)].

Nedávno sa preukázalo, že aldózareduktáza sa okrem svojej úlohy pri redukcii glukózy pri vzniku diabetických komplikácií účinne podieľa na redukcii aldehydov odvodených od peroxidácie lipidov a ich konjugátov s glutatiónom [Ramana KV. Aldose reductase: new insights for an old enzýme. BioMol Concepts. 2:103-114 (2011)]. Aldehydy vznikajúce peroxidáciou lipidov, ako 4-hydroxy-trans-2-nonenal (HNE) a ich konjugáty s glutatiónom (napr. GS-HNE), sú účinne redukované aldózareduktázou na odpovedajúce alkoholy, DHN (1,4-dihydroxy-nonén) and GS-DHN (glutationyl-l,4-dihydroxy-nonéne), ktoré sprostredkúvajú zápalové signály. Redukovaný konjugát glutatiónu GS-DHN sa považuje za nový signálny intermediát prenosu signálov iniciovaných reaktívnymi formami kyslíka, ktorý môže v konečnom dôsledku viesť k zápalovej reakcii [Srivastava SK, Yadav UC, Reddy AB, et al. Aldose reductase inhibition suppresses oxidative stress-induced inflammatory disorders. Chem Biol Interaction. 191:330-8 (2011)]. Preukázalo sa, že inhibitory aldózareduktázy obmedzujú významne zápalové signály indukované cytokínmi, rastovými faktormi, endotoxínmi, vysokou glukózou, alergénmi a autoimúnnymi reakciami v bunkových a zvieracích modeloch [Ramana KV, Srivastava SK. Aldose reductase: a novel therapeutic target for inflammatory pathologies. Int J Biochem Celí Biol. 42(1):17-20 (2010)].

Zápalové ochorenia patria medzi hlavné príčiny chorobnosti a úmrtnosti svetovej populácie. Inhibitory aldózareduktázy tak predstavujú nový terapeutický prístup k liečbe zápalových ochorení ako sú atheroskleróza, astma, rakovina hrubého čreva, uveitída, sepsa, artritída, periodontitída a iné poškodenia, ktoré môžu stimulovať imunitný systém a tvorbu veľkých množstiev zápalových cytokínov a chemokínov [Ramana KV. Aldose reductase: new insights for an old enzýme. BioMol Concepts. 2:103-114 (2011), Srivastava SK, Yadav UC, Reddy AB, et al. Aldose reductase inhibition suppresses oxidative stress-induced inflammatory disorders. Chem Biol Interaction. 191:330-8 (2011), Ramana KV, Srivastava SK. Aldose reductase: A novel therapeutic target for inflammatory pathologies. The International Journal of Biochemistry & Celí Biology. 42:17-20 (2010), Tammali R, Saxena A, Srivastava SK, Ramana KV. Aldose Reductase Regulates Vascular Smooth Muscle Celí Proliferation by Modulating Gl/S Phase Transition of Celí Cycle. Endocrinology. 151(5):2140-2150 (2010), Tammali R, Srivastava SK, Ramana KV. Targeting aldose reductase for the treatment of cancer. Curr Cancer Drug Targets. 11(5):560-571 (2011), Kador PF, O’Meara JD, Blessing K, Marx DB, Reinhardt RA. Efficacy of Structurally Diverse Aldose Reductase Inhibitors on Experimental Periodontitis in Rats. J Periodontol. 82:926-933 (2011), Yadav UC, Ramana KV, Srivastava SK. Aldose reductase inhibition suppresses airway inflammation. Chem Biol Interact. 191(1-3):339-45 (2011), Yadav UC, Srivastava SK, Ramana KV. Understanding the role of aldose reductase in ocular inflammation. Curr Mol Med. 10(6):540-9 (2010)]. Inhibícia aldózareduktázy predstavuje atraktívnu stratégiu budúcej protizápalovej terapie.

V poslednej dobe sa značná pozornosť venuje výskumu terapií na báze látok prírodného pôvodu. Rozmanité zložky ako vitamíny, minerály, vláknina a početné fytochemikálie, vrátane flavonoidov, môžu prispieť k liečivým účinkom ovocia a zeleniny. Skutočne, flavonoidy sú schopné ovplyvniť mnohoraké mechanizmy alebo etiologické faktory zodpovedné za vývoj diabetických komplikácií vrátane oxidačného stresu, neenzýmovej glykácie a polyolovej dráhy [Bhimanagouda S, Pätil GK, Jayaprakasha KN, Chidambara

-4Murthy, Amit Vikram. Bioactive Compounds: Historical Perspectives, Opportunities,and Challenges. J Agric Food Chem 5:8142-8160 (2009), Majumdar S, Srirangam R. Potential of the bioflavonoids in the prevention/treatment of ocular disorders. J Pharm Pharmacol 62(8):951-965 (2010), Kalt W, Hanneken A, Milbury P, Tremblay F. Recent Research on Polyphenolics in Vision and Eye Health. J Agric Food Chem 58:4001-4007 (2010), Stefek M. Natural flavonoids as potential multifunctional agents in prevention of diabetic cataract. Interdiscip Toxicol. 4(2):69-7 (2011)].

Kvercetín je naj hojnejšie konzumovaným flavonoidom v ľudskej diéte [Boots AW, Haenen GRMM, Bast A. Health effects of quercetin: From antioxidant to nutraceutical. Eur J Pharm. 585:325-337 (2008)]. Preukázalo sa, že kvercetín a iné flavonoidy majú ochranné účinky voči zákalu očnej šošovky [patentový spis US 2010/0292287 Al, Stefek M, Karasu C. Eye lens in aging and diabetes: effect of quercetin. Rejuvenation Res. 14(5):525-534 (2011), Stefek M. Natural flavonoids as potential multifunctional agents in prevention of diabetic cataract. Interdiscip Toxicol. 4(2):69-7 (2011)]. V rastlinách je kvercetín prítomný hlavne vo forme O-glykozidov s cukomou skupinou ako je glukóza, galaktóza, ramnóza, rutinóza alebo xylóza. Gykozidová štruktúra má veľký vplyv na biologickú dostupnosť kvercetínu [Arts IC, Sesink AL, Faassen-Peters M, Hollman PC. The type of sugar moiety is a major determinant of the small intestinal uptake and subsequent biliary excretion of dietary quercetin glycosides. Br J Nutr. 91:841-847 (2004), Crozier A, Del Rio D, Clifford MN. Bioavailability of dietary flavonoids and phenolic compounds. Mol Aspects Med. 31:446-467 (2010), Stefek M, Karasu C. Eye lens in aging and diabetes: effect of quercetin. Rejuvenation Res. 14(5):525-534 (2011)].

Pre deriváty kvercetínu napr. O-benzyl kvercetíny sú podobne deklarované biologické účinky, najma antioxidačné. Americký patentový spis US 2 892 846A opisuje spôsob prípravy 7-O-benzylkvercetínu, a konštatuje jeho zvýšenú antioxidačnú aktivitu v porovnaní s kvercetínom, dáta nie sú uvedené. Spis GB 1 295 606A chráni 3,3',4',5,7-O-pentabenzyl kvercetín a postup prípravy a jeho použitie pri liečení cievnych porúch pacientov trpiacich diabetickou retinitídou, aterosklerózou a ďalšími ochoreniami.

Benzylová skupina je prednostne používaná aj pre selektívnu ochranu hydroxylových skupín kvercetínu, takýto derivát sa napríklad acyluje a benzyl sa následne odstráni napr. hydrogenáciou, čím sa získajú požadované acyl deriváty. Najčastejšie rozdiely jednotlivých postupov sú v tých krokoch syntézy, v ktorých dochádza k acylácii a deprotekcii benzylových skupín.

Takýto postup využíva napr. US 2011/0034413A1 alebo US 6235294B1 na prípravu esterov kvercetínu ako kozmetických prípravkov s antioxidačnými vlastnosťami. Spis US 2002/0106338A1 opisuje kvercetínové deriváty, substituované mono až penta acyl alebo alkyl skupinou a ich kozmetické a farmaceutické kompozície, s chránením hydroxylových skupín kvercetínu s benzylom. Patentový spis WO 2009064485 (Al) uvádza antioxidačné účinné proliečivá derivátov kvercetínu s 3 alebo 7 alebo 3,7 di-Opropylamino skupinou substituované napr. s kyselinou kávovou alebo ferulovou pričom 3',4,7 tribenzyl kvercetín je využitý pre východiskové 3 O-propylamino deriváty kvercetínu.

Z patentovej lituratúry je ďalej známy US 2 892 846 A. V dokumente je opísaný kvercetín, kde R1-R5 sú H, ako východisková látka pri príprave 7-O-benzylkvercetínu. Citovaný dokument opisuje detailný postup prípravy 7-O-benzylkvercetínu, ktorý vykazuje zvýšenú antioxidačnú aktivitu v porovnaní s kvercetínom.

Dokument GB 1 295 606 sa týka 3,3',4',5,7-pentabenzyl kvercetínu, ktorý je derivátom kvercetín, kde R1-R5 sú benzyl. Opísaný je spôsob prípravy 3,3',4',5,7- pentabenzyl

-5kvercetínu a jeho použitie pri liečení cievnych porúch pacientov trpiacich diabetickou retinitídou, aterosklerózou, chronickou glomerulonefritídou, a pod.

VUS dokumente US 2011/00344413 Al je opísaný kvercetín a známosť jeho antioxidačnej aktivity ako aj ďalších biologických účinkov ako je vazorelaxačný, antidiabetický, antihistaminický, protizápalový účinok, podpora imunitného systému a ďalšie vrátane protirakovinového účinku. V príklade 1 je opísaný postup syntézy 3,7-bis-benzyloxy2-(4-benzyloxy-3 -hydroxyfenyl)-5 -hydroxychromen-4-ón.

V dokumente CN 101250176 A sú opísané deriváty majúce flavónovú kostru, kde substituenty naviazané v polohe 3,3',4',5,7 môžu nezávisle na sebe znamenať hydroxy alebo benzyloxy skupinu. Opísané deriváty kvercitínu majú protirakovinový účinok. V tomto dokumente je uvedená zlúčenina 5-O-benzylkvercitínu a v schéme na strane 6 je uvedený kvercetín a jeho premena na 3,7-bis-benzyloxy-2-(4-benzyloxy-3hydroxyfenyl)-5-hydroxychromen-4-ón

US 2002/0106338 Al dokument v príklade 2 opisuje 3', 4', 7-tribenzylkvercitín.

US dokument 2003/0055103 Al opisuje semi-syntetické flavonoidy s charakterizovaným spôsobom ich prípravy. Opísanými zlúčeninami je kvercetín a jeho deriváty, ktorém sú účinné pri liečbe ischemických cievnych ochorení a/alebo degeneretívnych poškodení mozgu.

Dokument WO 2009064485 Al sa týka flavonoidov s antioxidačnou aktivitou, spôsobu ich prípravy a ich použitia. Medzi opísanými zlúčeninami sú deriváty kvercetínu, ktoré majú v polohe 3, resp. v polohe 3 alebo 7, naviazanú skupinu odvodenú od zlúčenín známych svojim antioxidačným účinkom.Zlúčeniny podľa WO 2009064485 Al sú účinné pri liečbe neurogeneratívnych ochorení , amyotrofickej laterálnej skleróze, rakoviny, ochorení srdca, zápalových ochorení, astmy a pod.

V dokumente JP 3232851 Aje opísané, že kvercetín je schopný inhibovať aldózareduktázu, s využitím pri liečení komplikácií spojených s diabetes mellitus ako je katarakta, retinopatia, ochorenie obličiek alebo nervové poruchy.

Z dokumentu US 2010/0292287 Al vyplýva známosť inhibičného účinku kvercetínu na aldózareduktázu a tým jeho užitočnosť pri liečení alebo prevencii diabetickj katarakty, neuropatií a iných komplikáciách spojených s diabetom.

Vzhľadom na farmaceutický význam kvercetínových derivátov je zrejmé, že neexistuje konečný stav pre optimálnu modifikáciu kvercetínu. Deriváty kvercetínu môžu byť lipofilné alebo hydrofilné v závislosti od druhu a polohy substituentov v molekule kvercetínu.

Je dôležité upraviť selektívne rôzne hydroxylové skupiny kvercetínových derivátov nakoľko nie sú rovnocenné, ani z chemického ani biofunkčného hľadiska. Ďalšie modifikácie s vhodnými skupinami vyvažujúcimi lipofilno-hydrofilné vzťahy a biologický účinok tak poskytujú alternatívu k doteraz získaným derivátom kvercetínu. Prekvapujúco sa zistilo, že deriváty kvercetínu s chlórpivalovou alebo chlórnaftochinónovou skupinou pripravené podľa vynálezu vykazujú vysokú inhibičnú aktivitu vo vzťahu k aldózareduktáze.

-6Cieľom vynálezu je poskytnúť nové látky so zlepšenou inhibičnou aktivitou vo vzťahu k aldózareduktáze, zvýšenou antioxidačnou kapacitou, vybavené vysokou selektivitou a optimálnou biologickou dostupnosťou.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka derivátov kvercetínu všeobecného vzorca (I)

a ich farmaceutický akceptovateľné solí, hydrátov a solvátov, v ktorom skupiny Ri až R5 sú nezávisle H, benzyl a minimálne jedna skupina je C1CH2(CH3)2CCO-, 4-O-acetylferuloyl alebo 2-chlór-1,4-naftochinón-3-yl.

Takže predložený vynález sa týka derivátov kvarcetínu vzorca 1, na použitie pri liečbe a kontrole humánnych chorôb, u ktorých oxidačný stres a polyolová dráha sú kľúčovými etiologickými faktormi, ako rozvoj diabetických komplikácií (makro- a mikroangiopatia, ateroskleróza, retinopatia, katarakta, nefropatia a neuropatia), rezistencia hepatálneho karcinómu na chemoterapiu, abnormálna proliferácia vaskulárnych hladkosvalových buniek v ateroskleróze a restenóze, zápalové ochorenia ako je uveitída, sepsa, rakovina hrubého čreva, periodontitída a astma.

Podľa ďalšieho aspektu vynález sa týka použitia derivátov kvercetínu vzorca 1, na prípravu liečiv na liečbu alebo prevenciu chorôb alebo porúch kde oxidačný stress a polyolová dráha sú kľúčovými etiologickými faktormi, ako rozvoj diabetických komplikácií (makro- a mikroangiopatia, ateroskleróza, retinopatia, katarakta, nefropatia a neuropatia), rezistencia hepatálneho karcinómu na chemoterapiu, abnormálna proliferácia vaskulárnych hladkosvalových buniek v ateroskleróze a restenóze, zápalové ochorenia ako je uveitída, sepsa, rakovina hrubého čreva, periodontitída a astma.

Predložený vynález sa týka aj farmaceutických prípravkov obsahujúcich aspoň jednu zlúčeninu vzorca I a farmaceutický prijateľný nosič.

Podľa ďalšieho aspektu vynálezu je uvedená formulácia tuhá orálna alebo injekčná lieková forma na systémové podanie alebo vo forme kvapiek, pást, gélov alebo mastí na lokálne podanie.

Látky všeobecného vzorca I môžu byť pripravené alkylačnými a acylačnými metódami a sú opísané v štandardných prácach ako Houben-Weyl, “Methoden der organischen Chemié”, Georg Thieme Verlag, Stuttgart. Podmienky, za ktorých sa uskutočňujú takéto acylačné reakcie s napr. acylhalogenidom sú dobre známe odborníkovi v danej oblasti; môžu sa

-Ί uskutočniť v prítomnosti bázy vo vhodnom rozpúšťadle, alebo alternatívne v prítomnosti aktivovaného derivátu kyseliny. Acylačná reakcia môže byť uskutočnená štandardným spôsobom v bezvodom rozpúšťadle, ktoré umožní počiatočné kvercetínu alebo cez selektívne benzylovaný polyfenolický kvercetín. Táto acylácia môže byť uskutočnená na jednej alebo dokonca na všetkých hydroxylových skupinách kvercetínu alebo benzylovaných derivátov kvercetínu (Molecules 2010,15,4722).

Kvercetínový skelet selektívne alkylovaný v rôznych pozíciách sa môže získať známou metódou (US 2 892 846A, Tetrahedron, 2002, 58, 10001-10009, Beilstein Journal of Organic Chemistry 2009, 5, 60). Aby sa dosiahla selektívna derivatizácia, bola adoptovaná acylačno/bezylačná stratégia (J. Amer. Chem. Soc. 1958, 20, 5531, J. Amer. Chem. Soc.1958, 20, 5527, J. Org. Chem. 1962, 27, 1294). Na druhej strane, je dobre známa alternatívna stratégia používajúca priamu acyláciu kvercetínu, ktorá závisí na relatívnej reaktivite hydroxylov v rôznych pozíciách vzhľadom k acylačnému činidlu a poskytuje zložitú reakčnú zmes (patentové spisy: US patent 3661890A, 6235294B1, WO 200121164A2) ktoré sa ľahko separujú chromatograficky vzhľadom na ich rozdielnu polaritu. Teda príležitostne sa môže použiť táto priama cesta acylácie, čo sa alikovalo s použitím pivaloylchloridu (3-chlór-2,2dimetylpropanoyl chlorid) a následnou separáciou produktov.

Na potreby orálneho terapeutického podania môže byť aktívna zlúčenina kombinovaná s jedným alebo viacerými nosičmi a použitá vo forme ingestívnych tabliet, bukálnych tabliet, pastiliek, kapsúl, elixírov, suspenzií, sirupov, oblátok a pod. Množstvo aktívnej zlúčeniny v takýchto terapeuticky používaných zmesiach je také, aby sa dosiahla efektívna dávková hladina.

Tablety, pastilky, pilulky, kapsule a pod. môžu tiež obsahovať nasledovné: pojivá ako tragakant, agátová guma, obilný škrob alebo želatína; pomocné látky ako hydrofosforečnan vápenatý; látky na zvýšenie rozpadavosti ako obilný škrob, zemiakový škrob, kyselina algínová a pod.; lubrifikátory ako stearan horčíka; a sladidlá ako sacharóza, fruktóza, laktóza alebo aspartát alebo esenciálne oleje ako mentol, olej wintergreen alebo sa môže pridať čerešňová aróma. Ak je jednotkovou dávkovou formou kapsula, môže okrem hore vymenovaných látok obsahovať rozpúšťadlo ako rastlinný olej alebo polyetylénglykol. Prítomné môžu byť rôzne ďalšie látky ako povrchové polevy alebo látky inak modifikujúce fyzikálnu formu pevnej jednotkovej dávkovej formy. Napríklad tablety, pilulky alebo kapsuly môžu byť potiahnuté želatínou, voskom, šelakovou živicou, cukrom a pod. Forma sirupu alebo elixíru môže obsahovať aktívnu zlúčeninu, sacharózu alebo fruktózu ako sladidlo, metyl a propylparabény ako konzervačné prostriedky, farby a čerešňovú alebo pomarančovú arómu ako dochucovadlá. Prirodzene, každá látka použitá na prípravu akejkoľvek jednotkovej dávkovej formy by mala byť farmaceutický akceptovateľná a v použitom množstve netoxická. Navyše, aktívna zlúčenina môže byť inkorporovaná do preparátov a prostriedkov s riadeným uvoľňovaním.

Zlúčeniny alebo zmesi môžu byť tiež podané intravenózne alebo intraperitoneálne infúziou alebo injekciou. Roztoky aktívnej zlúčeniny alebo jej soli sa môžu pripraviť vo vode, prípadne sa môžu miešať s netoxickým surfaktantom. Disperzie sa môžu pripraviť vglycerole, tekutých polyetylenglykoloch, triacetíne a v ich zmesiach a v olejoch. Za normálnych podmienok uskladnenia a použitia obsahujú tieto prípravky konzervačné prostriedky na ochranu pred rastom mikroorganizmov.

Farmaceutické dávkové formy vhodné na injekcie alebo na infúzie môžu obsahovať sterilné vodné roztoky alebo disperzie, alebo sterilné prášky obsahujúce aktívnu zložku, ktoré sú prispôsobené pre okamžitú prípravu sterilných injekčných alebo infuznych roztokov alebo disperzií, prípadne sú enkapsulované v lipozómoch. Vo všetkých prípadoch by mala byť konečná dávková forma sterilná, tekutá a stabilná v podmienkach výroby a uskladnenia. Tekutý nosič alebo vehikulum môže byť rozpúšťadlo alebo tekutá disperzia obsahujúca napr.

-8vodu, etanol, polyol (napr. glycerol, propylenglykol, tekuté polyedtylénglykoly, a pod.), rastlinné oleje, netoxické estery glycerolu a ich vhodné zmesi. Náležitá tekutosť sa môže udržať napr. tvorbou lipozómov dodržaním požadovanej veľkosti častíc v prípade disperzií alebo použitím surfaktantov. Prevencia pôsobenia mikroorganizmov sa môže dosiahnuť rôznymi antibakteriálnymi a antifungálnymi látkami, napr. parabénmi, chlórbutanolom, fenolom, kyselinou sorbovou, timerosalom, a pod. V mnohých prípadoch je vhodnejšie použiť izotonické látky, napr. cukry, pufrealebo chlorid sodný. Predĺžená absorpcia injekčných zmesí sa môže dosiahnuť použitím látok spomaľujúcich absorpciu, ako napr. monosterát alumínia a želatína.

Sterilné injekčné roztoky sa môžu pripraviť inkorporovaním aktívnej zlúčeniny v požadovanom množstve do vhodného rozpúšťadla s rôznymi ďalšími horeuvedenými zložkami a v prípade potreby s následou filtračnou sterilizáciou. V prípade sterilných práškov na prípravu sterilných injekčných roztokov sú preferovanými metódami prípravy techniky vákuového a zmrazovacieho sušenia, ktoré ponechávajú prášok aktívnej zložky plus požadované aditívum prítomné v predtým sterilné filtrovaných roztokoch.

Na lokálne podávanie môžu byť prítomné zlúčeniny aplikované v čistej forme, t.j. ak sú to tekutiny. Vo všeobecnosti je však žiadúce podávať ich na kožu ako zmesi alebo zostavy v kombinácii s dermatologicky prijateľným nosičom, ktorý môže byť pevný alebo tekutý.

Použiteľné pevné nosiče zahrňujú jemne rozmelnené tuhé látky ako sú talok, hlina, mikrokryštalická celulóza, kremeň a pod. Použiteľné tekuté nosiče zahrňujú vodu, alkoholy alebo glykoly, alebo zmesi voda-alkohol/glykol, v ktorých môže byť prítomná zlúčenina rozpustená alebo dispergovaná na účinnú úroveň, voliteľne s pomocou netoxických surfaktantov. Adjuvanty, ako sú voňavky a ďalšie antimikrobiálne látky sa môžu pridať na optimalizáciu vlastností na dané použitie. Výsledné tekuté zlúčeniny sa môžu aplikovať z absorbujúcich podušiek, na impregnáciu bandáží a iných obväzov, alebo sprejovať na zasiahnutú oblasť pomocou pumpovacích alebo aerosólových sprejov. Zahusťovadlá, ako syntetické polyméry, mastné kyseliny, soli a estery mastných kyselín, mastné alkoholy, modifikované celulózy alebo modifikované minerálne materiály sa môžu tiež použiť s tekutými nosičmi na tvorbu rozotierateľných pást, gélov, mastí, mydiel a pod. na aplikáciu priamo na kožu používateľa.

Všeobecné experimentálne postupy

Merania NMR spektier sa uskutočnili na spektrometre VNMRS-600 MHz Varian pri teplote 298K a boli zaznamenané v DMSO-d6. Pracovná frekvencia pre ^XH bola 599.773 MHz, pre ¹³C bola 150.829 MHz. Koncentrácie vzoriek boli približne 50 mM. Chemické posuny sú udávané v ppm relatívne k reziduálneho signálu rozpúšťadla. LS/hmotnostné spectra boli zmerané na prístroji Agilent Technologies MSD SL Ion Trap hmotnostný spektrometer s ESI APCI zdrojom spojený s 1100 Šerieš HPLC systémom. Body topenia boli merané na prístroji NAGEMA (VEB Muhlenbau Dresden) a neboli korigované.

NADPH, β-merkaptoetanol, d,l-glyceraldehyd, D-glukuronát a valproát sodný sa získali od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Dietylaminoetyl celulóza DEAE DE 52 bola od Whatman International Ltd. (Maidstone, England). Ostatné chemikále sa získali z domácich komerčných zdrojov a boli kvality p.a. Proteíny v enzýmových preparátoch sa stanovili metódou podľa Geigera a Bessmana [Geiger P J, Bessman SP. Protein determination by Lowry's method in the presence of sulfhydryl reagents. Anál. Biochem. 49:467 (1972)]. Samce potkanov Wistar staré 8 až 9 týždňov sa použili ako donory orgánov. Zvieratá pochádzali z chovnej stanice Ústavu experimentálnej farmakológie a toxikológie Dobrá Voda (Slovensko). Štúdia bolo schválené Etickou komisiou ÚEFT SAV a uskutočnené podľa Princípov starostlivosti o laboratórne zvieratá (NIH publikácia 83-25, revidovaná 1985)

-9a slovenského zákona regulujúceho zvieracie experimenty (výnos 289, časť 1396, júl 9, 2003).

Vynález je ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré prezentujú postupy chemických syntéz, meranie inhibície aldózareduktázy, meranie selektivity a antioxidačnej kapacity nových látok. Uvedené príklady neobmedzujú rozsah nárokov patentu. Odborníkom v danej oblasti je zrejmé, že mnohé modifikácie z hľadiska materálov a metód možno uplatniť bez zúženia účelu a obsahu tohto vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

3,7-Dihydroxy-2-(4'-hydroxy-3'-(chlórpivaloyloxy)fenyl)-5-hydroxy-chromen-4-ón

Krok A

Chlórpivaloyl chlorid (1,05 g) rozpustený v acetóne (30 ml) sa pridával k zmesi 3,7bis-benzyloxy-2-(4'-benzyloxy-3'-hydroxyfenyl)-5-hydroxy-chromen-4-ónu (1,0 g, podľa Tetrahedron, 2002, 58, 10001-10009) a trietylamínu (0,69 g) v suchom acetóne (50 ml). Reakčná zmes sa nechala miešať počas 12 h pri 25°C pod dusíkovou atmosférou. Vylúčená zrazenina sa odfiltrovala, odparila dosucha. 3,7-Bis-benzyloxy-2-(4-benzyloxy-3(chlórpivaloyloxy)fenyl)-5-hydroxy-chromen-4-ón sa čistil pomocou stĺpcovej chromatografie (silikagél) s použitím elučnej zmesi ethylacetátu/hexánu (1:1,5 v/v). Požadovaný medziprodukt sa izoloval ako biela kryštalická látka. Výťažok 1,1 g, t.t. 186-190 °C.

Krok B

K roztoku produktu z predchádzajúceho kroku A (0,8 g) v metanole (80 ml) sa pridalo 10% Pd/C na uhlí (0,08 g, 10% w/w). Reakčná zmes sa nechala miešať pod vodíkovou atmosférou (415 kPa) počas 12 h pri 25°C. Surová zmes sa prefiltrovala cez Celit. Filtrát sa odparil a získaný surový produkt sa čistil pomocou stĺpcovej chromatografie (silikagél) s použitím elučnej zmesi metylénchlorid/metanol (9:0,5, v/v). Výťažok 0,2 g, t.t. 93-100 °C, LC/Mass M⁺419, Rf-0,6 (dichlórmetán/metanol/kyselina mravčia 9:0,5:0,1). Titulná látka sa charakterizovala pomocou ER^cm’¹) 3150-3500b, 1732m, 1651s, 1598s, 1134s, elementárnej analýzy, ’H a ¹³C NMR. NMR dáta v Tabuľke 1.

13

Tabuľka 1. Ha C chemické posuny, δΗ (J, Hz), flavónového derivátu príklad 1.

označenie	Ή	¹³C	pozícia,	ÔH (J, Hz)
2	-	145,40	Q
3	-	136,05	Q
4	-	175,89	Q

5	-	160,76	Q
6	6,19	98,23	CH, d	J₆.8 = 2,1
7	-	163,99	Q
8	6,44	93,47	CH, d	J₈.6=2,l
9	-	156,12	Q
10	-	103,05	Q
r	-	122,00	Q
T	7,95	126,55	CH, dd	J23' = 8,6 J₂'6^z = 2,2
3'	7,09	116,76	CH, d	J3',2' = 8,6
4'	-	150,81	Q
5'	-	138,24	Q
6'	7,83	122,38	CH	J₆',2' = 2,2
OH (3)	9,54	-
OH (5)	12,40	-
OH (7)	10,78	-
OH (49	10,48	-
A (59	-	172,64	-C=O
B	-	44,46	Q
C	4,40	22,85	ch₃ S
D	3,90	51,71	ch₂ S

Príklad 2

2-(3',4'-Dichlórpivaloyloxyfenyl)-7-(2-chlórpivaloyloxy)-3,5-dihydroxy-chromen-4-ón a

2-(3',4'-dihydroxyfenyl)-7-(2-chlórpivaloyloxy)-3,5-dihydroxy-chromen-4-ón a

2-(3'-hydroxy-4-chlórpivaloyloxyfenyl)-7,3,5-trihydroxy-chromen-4-ón a

2-(3',4'-dichlórpivaloyloxyfenyl)-5-hydroxy-7,3-di-chlórpivaloyloxy-chromen-4-ón

Chlórpivaloylchlorid (4,65 g) rozpustený v acetóne (30 ml) sa pridával k zmesi kvercetínu (3,0 g) a DIPEA (N,N-di-izopropyletylamín, 4 g) v suchom acetóne (170 ml) pri teplote 5°C. Reakčná zmes sa nechala miešať počas 2 h pri 5 °C a potom 2 h pri 25 °C. Vzniknutá zrazenina sa odfiltrovala, odparila dosucha a premyla vodou (100 ml). Získala sa zmes surových produktov (7,6g), ktorá sa následne rozseparovala pomocou stĺpcovej chromatografie (silikagél) s použitím elučnej zmesi dichlórmetán/metanol (9:0,05 v/v). 2(3 ',4 '-Dichlórpivaloyloxyfenyl)-7-(2-chlórpivaloyloxy)-3,5 -dihy droxy-chromen-4-ón (štruktúra A) s hodnotou Rf-0,71, biela kryštalická látka. Výťažok 0,96 g, t.t. 210-211 °C. IR (λ,αη-ΐ) 3150-3500b, 1760s, 1647s, 1600s,1158s, 1080s.Rf-0.78 (dichlórmetán/metanol 9:0,5). NMR dáta v Tabuľke 2.

Tabuľka 2. ’H a ¹³C chemické posuny, ÔH (J, Hz), flavónového derivátu príkladu 2, štruktúra A.

označenie		¹³c	pozícia	ÔH (J, Hz)
2	-	145,13	Q
3	-	138,31	Q
4	-	176,88	Q
5	-	160,21	Q
6	6,60	103,87	CH d	J₆.8=2,l
7	-	155,57	Q
8	7,03	101,24	CH d	J₈.6 = 2,1
9	-	155,03	Q
10	-	107,66	Q
ľ	-	129,40	Q
2'	8,19	126,39	CH dd	J2',3' = 8,8 J₂',6' = 2,1
3'	7,44	123,89	CH d	J3',2' = 8,8
4'	-	143,13	Q
5'	-	141,81	Q
6'	8,09	122,96	CH d	J₆;₂' = 2,31
OH (3)	10,24	-
OH (5)	12,35	-
A (7)	-	172,49	-C=O
B	-	44,69	Q
C	1,39	22,59	ch₃
D	3,88	51,65	ch₂
A'(4')	-	172,24	-C=O
B'	-	44,79	Q
C'	1,39	22,71	ch₃
D'	3,88	51,60	ch₂
A- (5)	-	172,33	-C=O
B	-	44,77	Q
C	1,40	22,66	ch₃
Ό	3,89	51,59	ch₂

-12Ako daľší produkt sa získal 2-(3',4'-dihydroxyfenyl)-7-(2-chlórpivaloyloxy)-3,5dihydroxy-chromen-4-ón (štruktúra B) s hodnotou Rf-0,26 (dichlórmetán/metanol 9:0,5), biela kryštalická látka. Výťažok 0,6 g, t.t. 173-175 °C. NMR dáta v Tabuľke 3.

Tabuľka 3. ’Ha ¹³C chemické posuny, δΗ (J, Hz), flavónového derivátu príklad 2, štruktúra B.

označenie	Ή	¹³c	pozícia	δΗ (J, Hz)
2	-	148,29
3	-	136,55
4	-	176,19
5	-	160,16
6	6,55	103,60	CH, d	Jó,8 = 2,2
7	-	155,15
8	6,97	100,96	CH, d	Je, 6 = 2,2
9	-	154,75
10	-	107,40
ľ	-	121,56
2'	7,61	120,33	CH, dd	J₂'₃- = 8,4 J₂'6' = 2,2
3'	6,90	115,60	CH, d	j₃.₂' = 8,4
4'	-	148,16
5'	-	145,10
6'	7,75	115,37	CH, d	Jó',2' = 2,2
OH (3)	9,71	-
OH (5)	12,60	-
OH (4')	9,69	-
OH (5 )	9,30	-
A (7)	-	172,56	-C=O
B	-	44,78	Q
C	1,39	22,52	ch₃
D	3,89	51,68	ch₂

-13Ako daľší produkt sa sa separoval 2-(3'-hydroxy-4'-chlórpivaloyloxyfenyl)-3,5,7trihydroxy-chromen-4-ón (štruktúra C) s hodnotou Rf-0,24 (dichlórmetán/metanol 9:0,5), biela kryštalická látka. Výťažok 0,2 g. NMR dáta v Tabuľke 4.

Tabuľka 4. 'H a ¹³ C chemické posuny, δΗ (J, Hz), flavónového derivátu príklad 2, štruktúra C.

označenie		¹³c	Pozícia	ÔH (J, Hz)
2	-	145,10	Q
3	-	137,00	Q
4	-	176,22	Q
5	-	160,77	Q
6	6,21	98,31	CH, d	Jó,8 = 2,2
7	-	164,22	Q
8	6,42	93,406	CH, d	Js.6 = 2,2
9	-	156,29	Q
10	-	103,17	Q
ľ	-	129,40	Q
2'	7,62	118,76	CH, dd	J2',3' = 8,4 J₂'6' = 2,2
3'	7,13	122,99	CH, d	J₃',2' = 8,4
4'	-	139,50	Q
5'	-	148,80	Q
6'	7,82	115,98	CH, d	Jó',2' = 2,2
OH (3)	9,71	-
OH (5)	12,35	-
OH (7)	10,85	-
OH (5')	10,07	-
A (49	-	172,50	-C=O
B	-	44,49	Q
C	1,39	22,84	ch₃
D	3,89	51,70	ch₂

Ako daľší produkt sa separoval 2-(3',4'-dichlórpivaloyloxyfenyl)-5-hydroxy-3,7dichlórpivaloyoxy-chromen-4-ón (štruktúra D) s hodnotou Rf-0,85 (dichlórmetán/metanol 9:0,5), biela kryštalická látka. Výťažok 2,16 g, t.t. 140-145 °C. IR ()._)Cm-i) 2800-3000b, 1765s, 1649s, 1606s, 1140s, 1084s. NMR dáta sú zhrnuté v Tabuľke 5.

Tabuľka 5. *H a¹³ C chemické posuny, δΗ (J, Hz), flavónového derivátu príklad 2, štruktúra D.

označenie	’H	’¹³Č	pozícia	δΗ (J, Hz)
2	-	155,38	Q
3	-	131,63	Q
4	-	175,22	Q
5	-	160,39	Q
6	6,71	105,42	CH d	J₆.8=2,l
7	-	156,19	Q
8	7,10	101,94	CH d	Js,6=2,1
9	-	155,70	Q
10	-	108,50	Q
ľ	-	126,91	Q
2'	7,91	127,47	CH dd	j₂;₃' = 8,5 J₂',6' = 2,1
Ύ	7,49	124,42	CH d	J3',2' = 8,5
ľ	-	144,69	Q
5'	-	141,85	Q
6'	7,78	123,97	CH d	J₆',₂' = 2,1
OH (5)	11,97	-
A (7)	-	172,41	-C=O
B	-	44,67	Q
C	1,39	22,49	ch₃
D	3,90	51,61	ch₂
A'(3)	-	171,86	-C=O
B'	-	44,53	Q
C'	1,40	22,84	ch₃
D	3,84	50,93	ch₂
A- (4)	-	172,12	-C=O
B	-	44,81	Q
C	1,40	22,69	ch₃
D	3,88	51,55	ch₂
	-	172,08	-C=O

B	-	44,81	Q
C'	1,40	22,61	ch₃
Ό'	3,88	51,47	ch₂

Príklad 3

3,7-Bis-hydroxy-2-(3^z-hydroxy-4'-(2-chlór-l,4-naftochinón-3-oxy)fenyl)-5-hydroxychromen-4-ón

2,3-Dichlór-l,4-naftochinón (0,75g) sa pridával do zmesi kvercetínu (lg) v 2pentanón-toluéne (100 ml, 1:1 v/v). Následne sa prikvapkal DIPEA (0,45g) v toluéne (5 ml) a zmes sa nechala refluxovať za stáleho miešania počas 12 h pod inertnou atmosférou. Vzniknutá zrazenina sa odfiltrovala a premyla horúcim toluénom (10 ml). Spojené filtráty sa odparili za zníženého tlaku. Do odparenej gumovitej masy sa pridala ľadová vodu (50 g) a etanol (20 ml). Vzniknutá zrazenina sa odfiltrovala a vysušila. Žltkastý materiál sa dva krát čistil pomocou stĺpcovej chromatografie (silikagél) s použitím elučnej zmesi (prvý eluent: etylacetát/metanol 9:0,1 v/v, druhý eluent: dichlórmetán/metanol/kyselina mravčia 9:0,5:0,05 v/v/v). Získalo sa 3,7-bis-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-(2-chlór-l,4-naftochinón-3-oxy)fenyl)-5hydroxy-chromen-4-ón ako žltá kryštalická látka. Produkt sa udržiaval pod dusíkovou atmosférou. Výťažok 0,505 g, t.t. 165-170 °C dec. LC/Mass M⁺ 492. IR (x,_Cm-i) 3050-3450b, 1639s, 1622s, 1598s, 1595s, 1497s, 1009s. Zlúčenina sa charakterizovala pomocou elementárnej analýzy, ’H a ¹³C NMR.

Príklad 4

3,7-Dihydroxy-2-(3'-hydroxy-4'-(4-O-acetylferuloyloxy)fenyl)-5-hydroxy-chromen-4-ón

Analogicky k postupu príklad 1, s použitím chloridu kyseliny 4-O-acetylferulovej (Eur. Food Res. Technol. 2006, 222, 492-508). Získal sa 3,7-dihydroxy-2-(3'-hydroxy-4'-(4-Oacetylferuloyloxy)fenyl)-5-hydroxy-chromen-4-ón s t.t. 176-183°C, IR (χ, _cm_i) 1763s, 1729s, 1631-1618m, 1506s, 1174d, 1104. Zlúčenina sa charakterizovala pomocou elementárnej analýzy, ’H a ¹³C NMR.

-16Príklad 5

Meranie aktivity aldózareduktázy (ALR2) in vitro

Príprava ALR2. ALR2 z potkaních šošoviek bola čiastočne purifikovaná metódou adaptovanou podľa [Hayman S, Kinoshita J H. Isolation and properties of lens aldose reductase. J Biol Chem. 240: 877-882 (1965)] nasledovne: šošovky boli rýchlo vypreparované z potkanov po ich eutanázii a homogenizované v sklenenom homogenizátore s teflónovým piestom v 5 objemoch chladnej destilovanej vody. Homogenát sa centrifugoval pri 10 000 g pri 0 až 4 °C po dobu 20 min. Supematant sa precipitoval nasýteným sulfátom amónnym postupne pri 40 %, 50 % potom pri 75 % nasýtení. Po prvých dvoch precipitáciách sa použil supernatant. Sediment z posledného kroku, obsahujúci ALR2 aktivitu sa dispergoval v 75% sulfáte amónnom a bol uložený v menších alikvotných častiach v kontajneri s tekutým dusíkom.

Enzýmová skúška. ALR2 aktivita sa merala spektrofotometricky [Stefek M, Snirc V, Djoubissie PO, Majekova M, Demopoulos V, Rackova L, Bezakova Z, Karasu C, Carbone V, El-Kabbani O. Carboxymethylated pyridoindole antioxidants as aldose reductase inhibitors: Synthesis, activity, partitioning, and molecular modeling. Bioorg Med Chem. 16:4908-4920 (2008)] prostredníctvom stanovenia spotreby NADPH pri 340 nm a vyjadrila sa ako pokles optickej denzity (O.D.)/s/mg proteínu. Reakčná zmes obsahovala 4,67 mM d,l-glyceraldehyd ako substrát, 0.11 mM NADPH, 0.067 M fosfátový pufer, pH 6,2 a 0,05 ml enzýmového preparátu v celkovom objeme 1,5 ml. Referenčná prázdna vzorka obsahovala všetky vyššie menované zložky s výnimkou substrátu d,l-glyceraldehydu, aby sa korigovala oxidácia NADPH nasúvisiaca s redukciou substrátu. Enzýmová reakcia sa iniciovala pridaním d,lglyceraldehydu a monitorovala sa po dobu 4 min po úvodnej 1 minútovej perióde pri 30 °C. Aktivity enzýmu sa adjustovali zriedením enzýmových preparátov destilovanou vodou tak aby 0,05 ml preparátu poskytlo priemernú reakčnú rýchlosť pre kontrolné vzorky v rozsahu 0,020 ± 0,005 jednotiek absorbancie/min. Vplyv inhibítorov na enzýmovú aktivitu sa stanovil pridaním inhibítora do reakčnej zmesi v požadovaných koncentráciách. Inhibítor o rovnakej koncentrácii bol pridaný do referenčnej vzorky. Hodnoty IC50 (koncentrácia inhibítora potrebná na dosiahnutie 50%-nej inhibície enzýmovej reakcie) sa stanovila metódou najmenších štvorcov z lineárnej časti semilogaritmických inhibičných kriviek. Každá krivka bola tvorená prinajmenšom použitím štyroch koncentrácií inhibítora spôsobujúce inhibíciu v rozsahu od prinajmenšom 25 do 75 %.

Tabuľka 1. Inhibícia aldózareduktázy (ALR2) izolovanej z potkaních očných šošoviek

Zlúčenina	IC₅₀ (μΜ)
Z príkladu 3	2,09 ± 0,57
Z príkladu 1	14,55 ± 4,60
Z príkladu 4	14,39 ± 4,94
Kvercetín	13,55 ± 3,64

-17Experimentálne výsledky sú priemerné hodnoty ± SD z prinajmenšom troch experimentov.

Príklad 6

Meranie aktivity aldehydreduktázy (ALR1) in vitro

Príprava ALR1. ALR1 sa čiastočne purifikovala z potkaních ľadvín ako je opísané podľa [Constantino L, Rastelli G, Gamberini MC et al. l-Benzopyran-4-one antioxidants and aldose reductase inhibitors. J. Med. Chem. 42:1881-1893 (1999)] nasledovne: ľadviny sa rýchlo vyňali potkanom po eutanázii a homogenizovali nožovým homogenizátorom a následným spracovaním v sklenenom homogenizátore s teflónovým piestom v 3 objemoch 10 mM natrium fosfátového pufru, pH 7,2, obsahujúcom 0,25 M sacharózu, 2,0 mM EDTA dvojdraselná soľ a 2,5 mM β-merkaptoetanol. Homogenát sa centrifúgoval pri 16 000 g pri 0 až 4°C po dobu 30 min a supernatant sa podrobil frakčnej precipitácii sulfátom amónnym pri 40 %, 50 % a 75 %-nej saturácii. Sediment získaný z poslednej precipitácie, majúci ALR1 aktivitu sa znova rozpustil v 10 mM sodného fosfátového pufru, pH 7,2, obsahujúcom 2,0 mM EDTA dvoj draselnú soľ a 2,0 mM β-merkaptoetanol aby sa dosiahla koncentrácia proteínov približne 20 mg/ml. Do roztoku sa pridala živica DEAE DE 52 (33 mg/ml) a po miernom miešaní po dobu 15 min sa odstránila centrifugáciou. Supernatant obsahujúci ALR1 sa potom skladoval v menších alikvotných častiach v tekutom dusíku. Žiadna významná kontaminácia ALR2 v preparátoch ALR1 nebola zaznamenaná, keďže žiadna spotreba NADPH nebola zaznamenaná v prítomnosti glukózy až do koncentrácie 150 mM.

Enzýmová skúška. Aktivita ALR1 sa merala spektrofotometricky [Stefek M, Snirc V, Djoubissie PO, Majekova M, Demopoulos V, Rackova L, Bezakova Z, Karasu C, Carbone V, El-Kabbani O. Carboxymethylated pyridoindole antioxidants as aldose reductase inhibitors: Synthesis, activity, partitioning, and molecular modeling. Bioorg Med Chem. 16:4908-4920 (2008)] stanovením spotreby NADPH pri 340 nm a vyjadrila sa ako pokles optickej denzity (O.D.)/s/mg proteínu. Reakčná zmes obsahovala 20 mM D-glukuronátu ako substrátu, 0,12 mM NADPH v 0,1 M fosfátovom pufre pH 7,2 a 0,05 ml enzýmového preparátu v celkovom objeme 1,5 ml. Referenčná prázdna vzorka obsahovala všetky vyššie menované zložky s výnimkou substrátu D-glukuronátu, aby sa korigovala oxidácia NADPH nasúvisiaca s redukciou substrátu. Enzýmová reakcia sa iniciovala pridaním D-glukuronátu a monitorovala sa po dobu 4 min po počiatočnej perióde po úvodnej 1 minútovej perióde pri 37 °C. Aktivity enzýmu sa adjustovali zriedením enzýmových preparátov destilovanou vodou tak aby 0,05 ml preparátu poskytlo priemernú reakčnú rýchlosť pre kontrolné vzorky v rozsahu 0,020 ± 0,005 jednotiek absorbancie/min. Vplyv inhibítorov na enzýmovú aktivitu sa stanovil pridaním inhibítora do reakčnej zmesi v požadovaných koncentráciách. Inhibítor o rovnakej koncentrácii sa pridal do referenčnej vzorky. Hodnoty IC50 (koncentrácia inhibítora potrebná na dosiahnutie 50%-nej inhibície enzýmovej reakcie) sa stanovili metódou najmenších štvorcov z lineárnej časti semilogaritmických inhibičných kriviek. Každá krivka bola tvorená prinajmenšom použitím štyroch koncentrácií inhibítora spôsobujúce inhibíciu v rozsahu od prinajmenšom 25 do 75 %.

-18Tabuľka 2. Inhibícia aldózareduktázy (ALR1) izolovanej z potkaních obličiek

Zlúčenina	C(pM)	I(%)
Z príkladu 3	10	54,2 ± 0,6
Z príkladu 1	10	60,1 ± 4,1
Z príkladu 4	10	11,4 ± 2,7
	20	17,7
	50	33,8
Kvercetín	100	61,5 ± 3,2

I (%): Percento inhibície aldehydreduktázy. Hodnota IC50 pre príklad 3 bola 11,1 ± 1,1 pmol/l. Výsledky sú priemerom z dvoch experimentov alebo priemer ± SD z prinajmenšom troch meraní.

Príklad 7

Meranie antioxidačnej aktivity in vitro

DPPH test. Pri hodnotení antiradikálovej aktivity derivátov, etanolický roztok DPPH (50 μΜ) sa inkuboval v prítomnosti testovanej zlúčeniny (50 μΜ) pri laboratórnej teplote (Štefek a spol. 2008). Pokles absorbancie zaznamenaný pri Xmax = 518 nm, v priebehu prvého 75 s intervalu sa použil ako marker antiradikálovej aktivity.

-19Tabuľka 3. Antiradikálová aktivita v DPPH teste

Zlúčenina	(“ÁA5i8nm/75 s)
Z príkladu 3	0,462 + 0,015
Z príkladu 1	0,446 ± 0,024
Z príkladu 4	0,040 ± 0,026
Kvercetín	0,386 ± 0,025
Trolox	0,520 + 0,031

Etanolický roztok DPPH radikálu (50 μΜ) sa inkuboval v prítomnosti testovaných látok (50 μΜ). Stanovil sa pokles absorbancie zaznamenaný pri λ _max= 518 nm, v priebehu prvého 75 s intervalu. Výsledky sú priemerné hodnoty ± SD prinajmenšom z troch meraní.

Priemyselné využitie

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom vynálezu, sa môžu vhodne podávať ako farmaceutický prostriedok vo farmaceutických zmesiach obsahujúcich zlúčeninu v kombinácii s vhodným pomocným nosičom. Takéto farmaceutické zmesi sa môžu pripraviť metódami a obsahovať nosiče, ktoré sú dobre známe. Všeobecne uznávaným kompendiom týchto metód a prísad je Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin (Mark Publ. Co., 15th Ed., 1975). Zlúčeniny a zmesi predkladaného vynálezu môžu sa podávať parenterálne (subkutánnou, intravenóznou, intramuskulámou, intraperitoneálnou, intrasternálnou injekciou alebo infúznymi technikami), miestne, orálne, alebo rektálne.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Deriváty kvercetínu všeobecného vzorca (I) a ich farmaceutický akceptovateľné soli, hydráty a solváty, v ktorom skupiny Ri až Rs sú nezávisle H, benzyl a minimálne jedna skupina je ClCH^CIfy^CCO-, 4-0acetylferuloyl alebo 2-chlór-l,4-naftochinón-3-yl.
2. Deriváty kvercetínu podľa nároku 1, na použitie pri liečbe a kontrole humánnych chorôb, u ktorých oxidačný stres a polyolová dráha sú kľúčovými etiologickými faktormi, ako rozvoj diabetických komplikácií ako je makro- a mikroangiopatia, ateroskleróza, retinopatia, katarakta, nefropatia a neuropatia, rezistencia hepatálneho karcinómu na chemoterapiu, abnormálna proliferácia vaskulárnych hladkosvalových buniek v ateroskleróze a restenóze, zápalové ochorenia ako je uveitída, sepsa, rakovina hrubého čreva, periodontitída a astma.
3. Použitie derivátov kvercetínu podľa nároku 1, na prípravu liečiv na liečbu alebo prevenciu chorôb alebo porúch kde oxidačný stres a polyolová dráha sú kľúčovými etiologickými faktormi, ako rozvoj diabetických komplikácií ako je makro- a mikroangiopatia, ateroskleróza, retinopatia, katarakta, nefropatia a neuropatia, rezistencia hepatálneho karcinómu na chemoterapiu, abnormálna proliferácia vaskulárnych hladkosvalových buniek v ateroskleróze a restenóze, zápalové ochorenia ako je uveitída, sepsa, rakovina hrubého čreva, periodontitída a astma.
4. Farmaceutický prípravok obsahujúci aspoň jednu zlúčeninu podľa nároku 1 a farmaceutický prijateľný nosič.
5. Farmaceutický prípravok obsahujúci aspoň jednu zlúčeninu podľa nároku 1, vyznačujúci satým, že uvedená formulácia je pevná orálna alebo injekčná lieková forma na systémové podanie alebo vo forme kvapiek, pást, gélov alebo mastí na lokálne podanie.