DE69828620T2

DE69828620T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur vorbeugung und behandlung der chronologischer alterung der menschliches haut

Info

Publication number: DE69828620T2
Application number: DE69828620T
Authority: DE
Inventors: James Varani; J. Gary FISHER; J. John VOORHEES; Sewon Kang
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1997-02-25
Filing date: 1998-02-23
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-02-24
Also published as: EP1005333B1; EP1005333A1; CA2281944C; AU6537498A; BR9807854A; US20040034098A1; IL131543A0; DE69828620D1; JP2010195817A; CN100360121C; CA2281944A1; AU737376B2; US20010053347A1; US6919072B2; CN1251989A; EP1005333A4; WO1998036742A1; US6630516B2; JP2002515898A; IL131543A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen und speziell solche, die Retinoide aufweisen, die vorzugsweise topisch aufgebracht werden, die zur Verbesserung der Keratinocyten- und Fibroblastenproliferation verwendbar sind, die Matrix-Metallprotease (MMP)-Expression verringern und die Kollagensynthese in der Haut älterer Menschen verbessern und damit als Wirkung die Verjüngung gealterter Haut gewähren.
Soweit es die Vertreter der Mammalia sind, ist der Mensch weitgehend haarlos, d.h. der überwiegende Teil der Haut des menschlichen Körpers ist ohne Bedeckung von Haar zu sehen. Die Haut wird auf diese Weise exponiert, welche Unbilden (natürliche oder vom Menschen erzeugte) die Umwelt auch in sich birgt. Seit erstmals erkannt wurde, dass die Sonne Erytheme hervorruft, haben die Menschen Maßnahmen ergriffen, um ihre "schädlichen Strahlen" zu vermeiden. Vor einem Jahrhundert war es im viktorianischen England Mode, die Sonne um jeden Preis zu meiden. Dennoch war die Haut solcher Viktorianer noch faltig und zeigte andere Zeichen eines chronologischen Alterns.
Die menschliche Haut ist ein komplexes Organ, das sich über den ganzen Körper erstreckt. An verschiedenen Abschnitten des Körpers gibt es unterschiedliche Typen der Haut, beispielsweise ist die Gesichtshaut von der Kopfhaut verschieden und sogar die Haut auf der Vorderseite (Handinnenfläche) der Hand unterscheidet sich von der auf dem Handrücken. Obgleich der Typ der Haut über den Körper einer Person variieren kann, baut sich die Haut im Allgemeinen aus zwei Hauptlagen von Gewebe auf. Die Epidermis oder Cuticula, die äußerste Lage, ist aus oberflächlichen Lagen (von außen nach innen: Stratum corneum, Stratum lucidum und Stratum granulosum) und Tiefenlagen (Stratum spinosum und Stratum basale). Die Dermis, Cutis vera, oder die eigentliche Haut baut sich aus einer papillaren Schicht darüber und einer retikulären Schicht darunter auf.
Zur Verbesserung des Aussehens ist seit Alterszeiten eine Vielzahl von Substanzen auf die Haut aufgetragen worden, im Allgemeinen um die äußerste Lage der Haut zu beeinflussen oder um ein Hautleiden zu behandeln, indem die Haut im Allgemeinen in Mitleidenschaft gezogen wurde. Neuerlich hat es Bemühungen gegeben, die Haut zu verjüngen und die aus der Exponierung an Sonnenlicht (UV-Strahlung) und Wetter verlorengegangene Elastizität und Geschmeidigkeit wieder zurückzugewinnen.
Es gibt einen Unterschied zwischen der Physiologie chronologisch gealterter oder von sich aus gealterter Haut (alte Haut) im Vergleich mit derjenigen von photogealterter Haut (d.h. Haut, die in Folge einer Schädigung aus solarer UV-Strahlung alt erscheint). Alte Haut bewahrt typischerweise ein glattes und makelloses Aussehen im Vergleich zu der lederartigen, fleckigen und oftmals tief gefalteten photogealterten Haut. Die Epidermis der alten Haut ist typischerweise dünner als im Normalfall, während die der photogealterten Haut typischerweise dicker als normal ist (hornhautartig) und im Verlaufe der Zeit Atrophien zeigt. Photogealterte Haut hat typischerweise eine große Grenzzone (ein breites Band von eosinophilem Material unmittelbar unterhalb der Epidermis sowie Kollagenbildung und Strukturen, die für Wundheilung kennzeichnend sind), die bei chronologisch gealterter Haut fehlt. Siehe hierzu auch N. A. Fenske und C. W. Lober, "Structural and functional changes of normal aging skin", J. Am. Acad. Dermatol., 15:571-585 (1986).
Kligman et al., beschreiben in der EP-0379367A2 ein Verfahren zur Behandlung und Verhütung einer intrinsisch gealterten Haut mit Retinoiden. Kligman et al. testeten insgesamt frans-Retinsäure (als Retin-A^®-Creme) an haarlosen Albinomäusen und an 5 älteren kaukasischen Frauen, wobei die Frauen vor und nach der Studie lediglich klinisch untersucht wurden und lediglich eine Biopsie genommen wurde und diese 6 Monate in die Behandlung genommen wurde (d.h. es gibt in dieser Veröffentlichung keine Offenbarung einer Fundstelle für eine Biopsie, die von einem Probanden vor der Behandlung oder von einer weiter zurück liegenden Behandlung genommen wurde).
Die US-P-3932665 und 4934114 offenbaren die Verwendung von Retinal (Vitamin A-Aldehyd) für die Behandlung von Akne bzw. für die Behandlung von Haut-Keratosen, siehe auch die US-P-3060229. Retinal und seine Derivate sind auch als nützlich in der Behandlung solcher Zustände wie Falten, Warzen, Psoriasis, Ekzeme, Schuppen und dergleichen vorgeschlagen worden (siehe EP-0391033A2). Es gibt auch eine Bestätigung für einen Hinweis, dass Tretinoin (vollständig-trans-Retinsäure) das Aussehen von photogealterter Haut verbessert. Albert M. Kligman, "Current Status of Topical Tretinoin in the Treatment of Photoaged Skin", Drugs & Aging, 2(1):7-13 (1992); und Chas. N. Ellis et al., "Tretinoin: Its Use in Repair of Photodamage", und A. S. Zelickson et al., "Topical Tretinoin in Photoaging: An Ultrastructural Study", beide im Journal of Cutaneous Aging & Cosmetic Dermatology, Bd. l, Nr. 1, S. 33-40 und 41-47 (1988).
Burger et al., beschreiben in der US-P-5665367 Zusammensetzungen für die topische Anwendung auf der Haut, die Naringenin und/oder Quercetin und ein Retinoid enthalten. Die Zusammensetzungen sind als nützlich zum Behandeln vieler unspezifischer Hautbeschaffenheiten beschrieben worden, wie beispielsweise Falten, Akne, Hautaufhellung und Altersflecke. Die Wirkung ihrer Zusammensetzung auf die menschliche Haut wurde im Bezug auf ein Enzym (Transglutaminase) beschrieben, das für die Bildung der Zellhülle wichtig ist und damit für die Epidermis. Im Gegensatz dazu richtet sich die vorliegende Erfindung auf Veränderungen in der Dermis und der Proliferation von nützlichen Hautzellen und Strukturen.
Die Erfindung beruht auf der Entdeckung einer Methode zur Verjüngung menschlicher Haut. In Verbindung mit der Beschreibung und den Ansprüchen der vorliegenden Erfindung verwendet, schließt "Verjüngen" die Schritte des gleichzeitigen Verhütens eines Kollagenabbaus und Stimulierens der Bildung von neuem Kollagen in gealterter menschlicher Haut ein. Die Erfindung beruht auf Biopsien von behandelter und unbehandelter, sonnengeschützter menschlicher Haut von gealterten (80+ Jahre alt) Versuchspersonen im Vergleich zu Biopsien von sonnengeschützter Haut von jüngeren Personen. Im Vergleich mit der Haut von jüngeren Leuten ist die gealterte Haut dünner, hat weniger Zellen in der Epidermis (Keratinocyten) und Dermis (Fibroblasten) hat weniger dichtes und stärker desorganisiertes Bindegewebe, hat höhere Werte der cJun-Kinase-Aktivität und Matrix-Metallproteasen (MMP) und hat verringerte Werte der ERK-Aktivität, Cyclin D₂ und Prokollagen Typen I und III.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren für die kosmetische Verjüngung von chronologisch gealterter Haut gewährt, umfassend das Auftragen einer wirksamen, nichttoxischen Menge eines aktiven Inhaltsstoffes auf die Haut, der ein nicht retinoider MMP-Inhibitor ist, und eines als Retinoid aktiven Inhaltsstoffes in einer wirksamen Menge, um Prokollagen-Biosynthese zu fördern, in welchem Verfahren der MMP-Inhibitor ausgewählt wird aus Aspirin, E5510, Vitamin D3, G1 12947, TIMP's und Hydroxyharnstoff-Derivate und Tetracyclin und Derivate davon sowie die verschiedenen Salze davon.
Nach einem weiteren Aspekt gewährt die Erfindung außerdem die Verwendung eines Retinoids für die Herstellung eines Medikaments zur topischen Anwendung auf chronologisch gealterte Haut zur Hemmung von MMP's, zur Normalisierung der Erzeugung von Prokollagen, zur Hemmung des Kollagenabbaus, zur Verbesserung der ERK-Aktivität, zur Verringerung der c-Jun-Proteinwerte und/oder zur Verringerung der c-Jun-Kinase-Aktivität.
Darüber hinaus gewährt die Erfindung die Verwendung eines nicht retinoiden MMP-Inhibitors und eines als Retinoid aktiven Inhaltsstoffes, der die Prokollagensynthese fördert, und zwar für die Herstellung eines Medikaments zur topischen Anwendung auf chronologisch gealterte Haut, um MMP's zu hemmen, die Erzeugung von Prokollagen zu normalisieren, den Kollagenabbau zu hemmen, die ERK-Aktivität zu verbessern, den c-Jun-Proteinwert zu verringern und/oder die c-Jun-Kinase-Aktivität zu verringern.
Zusammenfassend haben wir festgestellt, dass gealterte menschliche Haut verjüngt werden kann, indem topisch eine oder mehrere Verbindungen in Mengen verabreicht werden, die wirksam sind, um den Kollagenabbau zu hemmen und die Prokollagensynthese zu fördern, wobei die Anwendung vorzugsweise auf einer regelmäßigen Basis ausgeführt wird. Eine bevorzugte Klasse von Verbindungen, die beide Funktionen übernimmt, sind Retinoide und speziell Retinol und trans-Retinsäure.
Gealterte menschliche Haut kann aus einer verstärkten Prokollagensynthese Nutzen ziehen. Wir haben als eine andere Erfindung festgestellt, dass Prokollagenmengen in gealterter menschlicher Haut durch die bevorzugt regelmäßige Aufbringung wirksamer Mengen eines Retinoids auf die Haut erhöht werden können, wobei in bevorzugten Ausführungsformen die Behandlung auch eine Hemmung des Kollagenabbaus durch die Verwendung eines MMP-Inhibitors einbezogen ist, wie in den Ansprüchen festgelegt ist.
Zusätzlich zu dem Behandeln und/oder Verhüten eines chronologischen Alterns der Haut gewährt unsere Entdeckung, dass wirksame Menge eines auf die Haut aufgebrachten Retinoids die Prokollagensynthese verstärken kann, eine andere Erfindung der Verhütung (Prophylaxe) von Hautgeschwüren. Durch Erhöhen des Kollagengehalts der Haut werden die Form, Festigkeit und Funktion der Haut verbessert. Die erhöhte Prokollagensynthese und damit eine Erhöhung des Kollagengehalts der Haut lindert den Verlust an Festigkeit und Stützfähigkeit in Folge von reduziertem abgebautem Kollagen, so dass eine verbesserte Prokollagensynthese zu erwarten ist, um das Auftreten und/oder die Schwere von Hautgeschwüren zu verringern.
In Verbindung mit dem Vorgenannten haben wir als noch eine andere Erfindung festgestellt, dass Keratinocyten und Fibroblasten, die beide für den Zusammenhalt der Haut nützlich sind, beide durch den topischen Auftrag eines Retinoids, der wiederum vorzugsweise auf einer regelmäßigen Basis erfolgt, in der Zahl erhöht sind. Fibroblasten sind für die Epidermis trophisch; unter normalen Bedingungen geben sie eine Reihe von Wachstumsfaktoren ab (z.B. FGF, IGF und KGF unter anderem) und erzeugen Prokollagen, das in die dermale Matrix eintritt und zum strukturellen Kollagen wird.
Eine noch andere Erfindung ist die Verringerung der cJUN-Aktivität und/oder Verringerung der Menge des in der Haut vorhandenen cJun-Proteins und die Erhöhung der ERK-Aktivität, beide in gealterter Haut, durch den topischen Auftrag einer wirksamen Menge eines Retinoids auf die gealterte Haut.
In zusätzlichen Ausführungsformen werden Prophylaxe und Behandlung des dermalen chronologischen Alterns beide verbessert, indem zusammen mit dem Wirkstoff mindestens eine zusätzliche Verbindung aufgebracht wird, die ausgewählt ist aus einem Sonnenschutzmittel für mindestens eine der UVA1, UVA2 und UVB, und einer Antioxidans, einem MMP (Matrix-Metall-Proteinase)-Hemmer und Mischungen davon.
In den Figuren zeigen:
1 unsere Darstellung bestimmter ERK- und SAP-Wege in einer idealisierten Hautzelle;
2 die Fibroblastendichte (2A), Bindegewebsmerkmale (2B), Epidermis-Dicke (2C) und Keratinocyten-Dichte (2D) in allen von uns anhand einer Biopsie untersuchten Alterspopulationen;
3 das relative Wachstumspotential (gemessen als die Zahl der Zellkolonien pro Biopsie) von Human-Keratinocyten (3A) und Fibroblasten (3B) in den von uns untersuchten verschiedenen Alterspopulationen;
4 die relative Aktivität der drei MMP (MMP-1 in 4A, MMP-9 in 4B und MMP-2 in 4C) die in jeder von uns untersuchten Alterspopulation angetroffen wurden;
5 die Unterschiede in der Expression interstitieller Kollagenase in vivo zwischen junger und alter Haut;
6 die Unterschiede in der Expression von Typ I-Prokollagen in vivo zwischen junger und alter Haut;
7 die Unterschiede in der ERK-Aktivität in vivo zwischen junger und alter Haut;
8 die Unterschiede in der Expression von phosphorylierter (aktivierter) ERK in vivo zwischen junger und alter Haut;
9 die Unterschiede in der Cyclin D₂-Expression in vivo zwischen junger und alter Haut;
10 die Unterschiede in der cJUN-Kinase-Aktivität in vivo zwischen junger und alter Haut;
11 die Änderung der Fibroblasten-Dichte (11A), der dermalen Bindegewebsmerkmale (11B), der Epidermis-Dicke (11C) und der Keratinocyten-Dichte (11D) in der Haut alter Menschen (80+ Jahre) bei Anwendung eines Retinoids (1% Retinol; ein Auftrag, abgedeckt und 7 Tage später untersucht);
12 den Einfluss einer Retinoid (Retinol)-Behandlung auf das Wachstum von Humankeratinocyten und Fibroblastenzellen, die ex vivo von Biopsieproben aufgezogen wurden;
13 gefärbte Schnitte und Vergrößerungen der Haut einer jungen Person (13A und 13B), einer älteren Person (13C und 13D) und der gleichen älteren Person (13E und 13F) nach einer einmaligen Anwendung von 1% Retinol (abgedeckt, für 7 Tage belassen und anschließend bioptiert);
14 den Einfluss auf die Aktivitäten der drei MMP-Enzyme (MMP 1, 2 und 9; analog zu 4) nach einer einmaligen Anwendung von Retinol auf die Haut eines alten Menschen nach einer Bestimmung anhand einer Biopsie;
15 die durch Retinsäure vermittelte Induktion einer Typ I-Kollagensynthese in aufgezogenen Fibroblasten von Humanhaut;
16 in vivo-Induktion von Typ III-Prokollagen α1(III) mRNA, hervorgerufen durch Retinolverabreichung an die Haut eines älteren Menschen;
17 die in vivo-Induktion von ERK-Aktivität, hervorgerufen durch Retinolverabreichung an die Haut eines älteren Menschen;
18 eine Mikrophotographie, die in gefärbten Schnitten von Biopsien der Haut älterer Menschen zeigt, dass 7 Tage nach einer einmaligen Anwendung von 1 % Retinol c-Jun-Protein verringert ist und die Mengen an Typ I- und III-Prokollagen in der Haut erhöht sind.
1 zeigt bestimmte Abbauwege, die das Funktionieren einer idealisierten Hautzelle auf der Grundlage unserer Ergebnisse beeinflussen. Die besonders wichtigen Ursachen für das chronologische Altern der menschlichen Haut werden wahrscheinlich unter einer Population älterer Menschen variieren, einschließlich solcher Faktoren wie Nahrungsaufnahme, Genetik und Umgebung. Dennoch glauben wir generell, dass das chronologische Alter der Haut auf die Aktivierung der stressaktivierten Wege (SAP's) und einer Unterdrückung der Mitogen-aktivierten Wege (ERK) zurückzuführen ist. Im Gegensatz zur herkömmlichen Ansicht im Vergleich zu unseren Erfindungen im Zusammenhang mit dem Photoaltern menschlicher Haut haben wir herausgefunden, dass das chronologische Altern und Photoaltern menschlicher Haut eine verwandte Molekular-Pathophysiologie haben. ERK vermittelt die für die gesunde Haut nötigen Aktivierungen der Wachstumsfaktoren. Eine Störung der ERK kann zu einem Ausdünnen chronologisch gealterter Haut führen, was auf die verringerte Zahl von Zellen in der Epidermis und der Dermis zurückzuführen ist. Beinahe entgegengesetzt hierzu, aktivieren SAP's die Faktoren (z.B. c-Jun), die sowohl die Hemmung der Prokollagensynthese als auch den Abbau von reifem Kollagen fördern und dadurch zu einer Herabsetzung von Form, Festigkeit und Funktion der Haut führen. Bei dem chronologischen Altern der Haut könnte man erwarten, dass eine gewisse Störung mit ERK und/oder eine gewisse Aktivierung der SAP's einbezogen sind, während wir festgestellt haben, dass beide Ereignisse in chronologisch gealterter menschlicher Haut auftreten. Wie in 1 gezeigt ist, verfügt die idealisierte Hautzelle 101 über eine Zellmembran 103, die von verschiedenen Verbindungen durchdrungen wird oder an der sie mit der Zelle über Rezeptoren an der Oberfläche der Zelle wechselwirken. Eine der Gruppen von Eingängen, bezeichnet mit 105, aktiviert den ERK-Weg, der durch Phosphorylierung ERK auslöst. Aktiviertes ERK induziert die Bildung von Cyclin D₂ (107) in dem Zellkern mit dem Ergebnis, dass das Zellwachstum gefördert wird. Die andere Gruppe der Eingänge ist mit 109 bezeichnet und aktiviert den stressaktivierten Weg, der zu Erhöhungen in der c-Jun-Kinase-Aktivität führt. Sobald es aktiviert ist (wiederum durch Phosphorylierung) wird c-Jun zu einer Komponente von AP-1, was zur Bildung von MMP 111 führt und MMP's aus der Zelle exportiert mit dem Ergebnis des Abbaus von Kollagen in der dermalen Matrix. Matrix-Metall-Proteinasen (MMP's) schließen Kollagenasen ein, Gelatinasen und andere Enzyme, die in der menschlichen Haut von Natur aus vorkommen, die extrazellulare Matrixmoleküle, wie beispielsweise Kollagen, abbauen. Ohne auf eine spezielle Theorie beschränkt sein zu wollen, wird angenommen, dass die erhöhte c-Jun-Kinase-Aktivität die Synthese von Prokollagen stört (löslicher Kollagen-Präkursor), welches dann von der Zelle in die Matrix exportiert wird (113, unter Bezugnahme auf 1), um zu strukturiertem Kollagen (unlösliches Kollagen) zu werden. Es wird angenommen, dass aktiviertes c-Jun einen oder mehrere Schritte in der Synthese von Prokollagen hemmt, wie in der Figur dargestellt wird.
Unsere Erfindung richtet sich allgemein auf die topische Verabreichung vorzugsweise auf regelmäßiger Basis mit einer Menge eines Retinoids und bevorzugt Retinol oder Retinsäure auf die Haut einer alten Person in wirksamen Mengen, um die Proliferation mindestens eines der Keratinocyten und Fibroblasten zu induzieren, um die Expression von MMP's zu reduzieren, um die Synthese von Prokollagen in der Haut älterer Personen zurück auf normalen Werten zu stimulieren und/oder um die Menge von aktivierter ERK zu erhöhen und die Aktivität von c-Jun-Kinase zu verringern und die Menge von c-Jun-Protein in der Haut älterer Personen zu reduzieren.
ANALYSE DER HAUT ÄLTERER PERSONEN
Wir haben festgestellt, dass es eine altersbezogene Abnahme der Zahl der Keratinocyten und Fibroblasten gibt, die anhand von Vergleichen replizierter 4 mm-Stanzbiopsien bestimmt wurden, die von sonnengeschützter Haut von 40 Personen im Alter von 18 bis über 80 Jahren erhalten wurden. Keratinocyten sind die Hauptzellen, aus denen die Epidermis zusammengesetzt ist. Die Zellen der Epidermis entstehen durch Differenzierung von Basalkeratinocyten, von denen einige durch aufeinanderfolgende, sich überlagernde Schichten differenzieren, um zum Stratum corneum zu werden (die äußerste Lage der Haut). 2A, 2B, 2C und 2D repräsentieren morphometrische Daten auf der Grundlage der Untersuchung der gesamten Population, die wir ausgeführt haben. Die Biopsien von unseren Probanden bestätigten mittlere Abnahmen von 27% (Keratinocyten) und 39% (Fibroblasten) bei Vergleich der jüngsten Altersgruppe (18 bis 29 Jahre) mit der ältesten Altersgruppe (80+ Jahre) (p<0,1 für beide Zelltypen), was in 2A und 2D gezeigt wird; ebenfalls haben wir bemerkt, dass altersbezogene Änderungen in der Haut als eine Abnahme der Fibroblasten oberhalb eines Alters von 30 und eine andere Abnahme oberhalb eines Alters von 80 (2A) zu erkennen sind. Unsere Populationsstudie bestätigte außerdem eine Zunahme der Zahl von unerwünschten dermalen Bindegewebsmerkmalen oberhalb eines Alters von 60 (2B) und eine Abnahme der Epidermis-Dicke oberhalb eines Alters von 60 (2C). Diese Daten zeigen, dass es eine altersbezogene Zunahme in der Bindegewebsdesorganisation und/oder -degeneration gibt (2,25-fache Zunahme in der ältesten Gruppe im Vergleich zu der jüngsten Gruppe; p<0,05), was in 2B gezeigt wird. Die Desorganisation und Degeneration der Bindegewebe wurde anhand einer mikroskopischen histologischen Untersuchung von Biopsien von Hautgewebe gemessen, die von diesen älteren Probanden erhalten wurden, und mit der Histologie der Haut von Biopsien von jungen Personen verglichen.
Diese Ergebnisse werden weiter von unserer Entdeckung altersbedingter Abnahmen des Wachstums von Keratinocyten (54% Abnahme) und Fibroblasten (50% Abnahme) bestätigt, die als die Zahl der Zellkolonien in Kultur von Biopsiegewebe im Vergleich zwischen den gleichen zwei Altersgruppen (p<0,1 für beide Zelltypen) entsprechend der Darstellung in 3 bestimmt wurden.
Wie in 4 gezeigt ist, haben wir jetzt auch eine altersbedingte Zunahme in den relativen Aktivitäten von MMP-1, MMP-2 und MMP-9 entdeckt, wenn diese Gruppen junger und alter Personen verglichen wurden (jeweils mittlere Zunahme von 40%, 82% und 53% bzw. p<0,01, 0<0,001 und p<0,01). Diese Ergebnisse wurden unter Verwendung von replizierten 4 mm-Stanzbiopsien von unseren 40 Probanden bestimmt.
Wie in 5 gezeigt wird, ergaben unsere Messungen der interstitiellen Kollagenase aus den Biopsien der Haut von 16 Personen in jeder der zwei Gruppen (jung und alt), dass die relative Expression des Kollagenaseproteins in alten Personen in nahezu den doppelten Mengen zu denen vorhanden war, die in jüngeren Probanden gefunden wurden.
6 zeigt unsere Analyse zur Bestimmung des Vorhandenseins von Typ I Prokollagen in in vivo Proben von nicht exponierter Haut, die von jeder der zwei Gruppen der getesteten Personen (jung und alt) genommen wurden. Wir haben festgestellt, dass etwa 2 Mal so viel Typ I Prokollagen in nicht exponierter (sonnengeschützter) junger Haut exprimiert wird als in nicht exponierter älterer Haut.
7 zeigt unsere Ergebnisse für die Aktivität von ERK in stationärem Zustand in Hautbiopsien von unseren Probanden sowohl von den alten (über 80+ Jahre) und jungen (19 bis 29 Jahre) entsprechend den hierin beschriebenen Methoden. Das Histogramm in 7 zeigt, dass die relative Aktivität von ERK in der Haut von älteren Probanden fast die Hälfte ihres Wertes der Aktivität in der Haut jüngerer Leute hat.
Die reduzierte ERK-Aktivität könnte ein Ergebnis reduzierter ERK-Mengen oder einer reduzierten ERK-Aktivierung in gealterter Haut oder einer Kombination von beiden sein. Daher wurden von uns 15 Probanden getestet, um die relativen Mengen in der Haut vorhandener ERK sowohl insgesamt als auch in den aktivierten (phosphorylierten) Formen zu bestimmen; die aktivierte Form stimuliert das Zellwachstum. Wie in 8 gezeigt wird, hatten ältere Probanden im Wesentlichen die gleiche Menge an Gesamt-ERK in ihrer Haut wie Probanden die ein halbes Jahrhundert jünger waren, jedoch hatten sie bedeutend weniger aktivierte, phosphorylierte Form von ERK. Dementsprechend haben wir festgestellt, dass die verringerte Aktivität der ERK in Haut alter Personen nicht auf eine verringerte Gesamtmenge an ERK zurückzuführen ist, sondern vielmehr auf die geringe Konzentration der aktivierten Form.
In dem in 1 gezeigten ERK-Weg induziert ERK Cyclin D₂, das für das Zellwachstum benötigt wird. Wiederum war zu erwarten, dass eine Interferenz mit diesem ERK-Effektor zu einem verzögerten Zellwachstum und einer verzögerten Reparatur führen würde und die Auswirkungen des Alterns auf die Haut gefördert würden. 9 zeigt unsere Ergebnisse, bei denen 12 junge Probanden und 11 alte Probanden auf Expression von Cyclin D₂ in normalerweise bedeckter (sonnengeschützter) Haut analysiert wurden. Das Histogramm in 9 zeigt, dass die Menge an Cyclin D₂, die in chronologisch gealterter Haut exprimiert wird, im Vergleich zu ihrer Expression in junger Haut deutlich verringert ist.
Wir haben 15 Probanden in zwei Altersgruppen von jungen Probanden (19 bis 29) und alten Probanden (80+) getestet, um den Grad der Aktivierung von stressaktivierter Proteinkinase ("SAPK") in jeder Gruppe zu bestimmen; die SAPK-Aktivität wird anhand der Phosphorylierung von c-Jun-Protein gemessen. 10 zeigt, dass in vivo Proben von nicht exponierter Haut von jungen Probanden etwa 25% der relativen c-Jun-Kinase-Aktivität der von nicht exponierter Haut von alten Probanden hatte. Aus diesen Ergebnissen wären erhöhte Werte an aktivierter c-Jun in der Haut der alten Personen zu erwarten, die zu einer erhöhten MMP-Aktivität führen.
RETINOIDBEHANDLUNG VON GEALTERTER HAUT
Zurückkehrend zu 1, fördert die Aktivierung von SAP (spannungsaktivierte Wege 109) den Abbau von Haut-Kollagen durch die Erzeugung von MMP einschließlich Kollagenase und die 92 kDa-Gelatinase. Das SAP kann durch UV-Strahlung aktiviert oder hochgeregelt werden (was in unserer gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung 08/588771, eingereicht am 16. Januar, 1996 und die vorläufigen Anmeldungen 60/048520, eingereicht am 4. Juni, 1997 und 60/057976, eingereicht am 5. September, 1997 beschrieben wurde, die insgesamt auf das Photoaltern menschlicher Haut Bezug nehmen und deren Offenbarungen hiermit als Fundstelle einbezogen sind), durch Tumornekrose-Faktoren (z.B. TNF-α), durch Interleukine (z.B. IL-1α) und andere Stressoren. Wie in der hier erwähnten '771-Patentanmeldung und den vorläufigen Patentanmeldungen '520 und '976 beschrieben wurde, induziert AP-1 MMP's, Enzyme, die Kollagen abbauen. Obgleich wir in den vorgenannten Patentanmeldungen in Verbindung mit dem Photoaltern gezeigt haben, dass wir in die UV-induzierte Erzeugung von Kollagenasen eingreifen können, gibt es zusätzliche Wege, die beim chronologischen Altern beteiligt sind, so dass Wege, die das chronologische Altern der Haut bewirken (z.B. der ERK-Weg) nicht notwendigerweise beeinflusst werden müssen, wenn ein Patient auf Photoalterung der Haut behandelt wird (beispielsweise unter Verwendung einer Verbindung, die lediglich die Bildung von MMP hemmt und nicht notwendigerweise den ERK-Weg beeinflusst).
Zur Untersuchung der Behandlung von chronologisch gealterter Haut erhielten 17 Probanden mit einem Alter von mindestens 80 Jahren eine topische Behandlung mit 1% Retinol oder mit Vehikel allein, wobei die Testfläche für 7 Tage abgedeckt wurde und die Testfläche anschließend bioptiert wurde. Das Vehikel setzte sich aus einer Mischung von Ethanol und Polyethylenglykol in einem Volumenverhältnis von 70:30 zusammen. Im Vergleich von Vehikel-behandelter Haut mit unbehandelter Haut von Vertretern des gleichen Altersbereichs alter Personen gab es keine signifikanten statistischen Unterschiede in irgendeinem der Parameter, die im Zusammenhang mit 2 beschrieben wurden, nämlich der Zahl der Fibroblasten und Keratinocyten, die Epidermis-Dicke und der unerwünschten dermalen Bindegewebsmerkmale. Beim Vergleichen von mit Retinol behandelter Haut mit Vehikel behandelter Haut der gleichen Personen gab es, wie in 11 gezeigt wird, erhöhte Zahlen an Keratinocyten (11A) und Fibroblasten (11D) pro Schnitt in der mit Retinol behandelten Haut (273% (p<0,001) bzw. 30% (p<0,05) mittlere Zunahmen). Zusätzlich erhöhte die Retinoidbehandlung die Epidermis-Dicke erheblich (11C). Aufgrund der kurzen Dauer der Retinoid(Retinol)-Behandlung war eine nur geringe Änderung in der Zahl der nachteiligen dermalen Bindegewebsmerkmale (11B) zu erkennen.
12A und 12B demonstrieren die Wirkungen einer 7-tägigen in vivo Retinolbehandlung auf ex vivo Wachstum von Keratinocyten und Fibroblasten, die aus den Biopsien der sonnengeschützten Haut extrahiert wurden, die von unserem einzelnen Probanden im Alter über 80 genommen wurden. D.h., ein Proband aus der Alten-Gruppe wurde mit Retinol behandelt (einmaliger Auftrag von 1 % Retinol, abgedeckt für 7 Tage) von der behandelten Fläche wurde eine Biopsie genommen und die Keratinocyten und Fibroblasten von der Biopsie ex vivo kultiviert. Die Retinolbehandlung der Zellen in vivo führte zu einer wesentlichen Erhöhung des ex vivo Wachstums beider Zellentypen. Speziell das Keratinocytenwachstum nahm um etwa 30% (12A) zu, während sich das Fibroblastenwachstum um etwa 200% (12B) mit p<0,05 für beide Fälle erhöhte. Dementsprechend konnte man erwarten, dass der topische Auftrag eines Retinoids auf gealterte Haut die Zahl von Keratinocyten und/oder die Zahl von Fibroblasten in der Haut erhöhen würde.
Die graphischen Ergebnisse unserer neuartigen Behandlungen sind in 13 gezeigt. 13A und 13B zeigen Mikrophotographien des histologischen Aussehens von sonnengeschützter Haut einer 22 Jahre alten Person, wobei der Abschnitt in 13B eine vergrößerte Ansicht der eingerahmten Fläche von 13A ist. Wie darin gezeigt wird, setzt sich die Haut aus der Epidermis E zusammen, die über der Dermis D liegt. Ein Teil der Haftung zwischen der Epidermis und der Dermis wird durch eine große Grenzfläche zwischen der Epidermis und der Dermis erleichtert. Diese Grenzfläche ist mit Hilfe der Rete-Pfropfen oder Rippen R festgelegt, die von der Epidermis nach unten in die Dermis verlaufen, sowie durch die Hautpapillen P, die von der Dermis nach oben in die Epidermis verlaufen. Diese Pfropfen und Papillen erzeugen die im Querschnitt von 13A zu erkennenden Faltungen und erhöhen die Oberfläche der Grenzfläche zwischen den 2 Lagen der Haut. Der Abschnitt an der Unterseite (13B) zeigt eine detailliertere Ansicht der Dermis, die wenige Zellen C enthält und überwiegend Kollagen L ist. Wie in diesem Schnitt von einer jüngeren Person zu erkennen ist, ist das Kollagen in der Dermis verhältnismäßig dicht und von gleichförmiger Struktur.
13C und 13D zeigen das Histogramm von Vehikel behandelter, sonnengeschützter Haut einer Person im Alter von 86 Jahren. Wie in 13C zu sehen ist, ist die Epidermis in der gealterten Haut dünner und es gibt im Wesentlichen keine Rete-Pfropfen und im Wesentlichen keine dermalen Hautpapillen. Die detaillierte Ansicht in 13D zeigt, dass die Dermis gealterter Haut im Allgemeinen weniger Zellen hat und über Kollagen verfügt, das weniger dicht ist und ungleichförmiger verteilt ist, als man dies in jüngeren Personen antrifft. Die dünnere Epidermis und die verringerte Oberfläche der Grenzfläche zwischen der Epidermis und der Dermis können dazu führen, dass alte Menschen ein stärkeres auftreten von Prellungen und Geschwulsterkrankungen zeigen, wie beispielsweise Purpura nach Bateman.
13E und 13F sind Darstellungen von Retinol behandelter, sonnengeschützter Haut von der gleichen Person, von der die in 13C und 13D gezeigte Biopsie genommen wurde, und zwar nach 7 Tagen einer vorstehend beschriebenen Behandlung (ein einziger Auftrag von Retinol). Die gezeigten Änderungen an der Haut sind durchaus bemerkenswert und unerwartet. Die Epidermis ist dicker geworden, die Oberfläche der Grenzfläche hat zugenommen, was durch das Vorhandensein neuer Rete-Pfropfen und dermaler Papillen bestätigt wird, und, was in der detaillierten Ansicht gezeigt ist, das dermale Kollagen ist dichter und in seinem Aussehen regelmäßiger geworden. Damit wirkt der topische Auftrag einer wirksamen Menge eines Retinoids dahingehend, dass die Dicke der Epidermis (z.B. verglichen mit der jungen Haut) zunimmt, die Bildung von Rete-Pfropfen und dermalen Papillen gefördert wird und die Menge, Dichte und Regelmäßigkeit des Kollagens in der Dermis zunimmt. Diese Änderungen kehren die offensichtlichen histologischen Änderungen um, die man in der alten Haut sieht, und tragen dazu bei, Prellungen, Risse, Ulzeration und ähnliche Trauma in gealterter Haut zu verhindern, die in junger Haut nicht in Erscheinung treten.
Wir haben auch die Biopsien von den vorgenannten Probanden benutzt, um die Wirkung der gleichen Retinoidbehandlung auf die relative Aktivität der gleichen Kollagenaseenzyme zu bestimmen, die für die in 4 gezeigten Ergebnisse untersucht wurden. 14A, 14B und 14C zeigen Darstellungen der mittleren Werte der MMP-Aktivität (für Kollagenase MMP-1 und Gelatinasen MMP-9 bzw. MMP-2) nach Behandlung älterer Personen mit Retinol. Wie in 14 gezeigt wird, waren 7 Tage nach einer einzigen Retinolbehandlung die Aktivitäten von MMP-1 und MMP-9 beide verringert (48% bzw. 39% mit p<0,001 für beide Enzyme); es wurde keine signifikante Änderung in der Aktivität von MMP-2 festgestellt. Die Werte der Enzymaktivitäten waren signifikant verringert für MMP-1 und 9 im Vergleich zu einer Kontrollbehandlung mit ausschließlich Vehikel. (In 14A bis 14C betrug die Zahl der Probanden für die jeweilige 10, "*" zeigt p<0,5 gegenüber den Werten von 18 bis 29 Jahre alten Personen, "**" zeigt p<0,1 und "***" zeigt p<0,001).
Unter Anwendung der vorgenannten und analoger Methoden, worin wir Proben von 7 Probanden im Alter über 80 Jahren genommen und Fibroblasten aus Biopsieproben ihrer nicht exponierten (sonnengeschützten) Haut aufgezogen haben, haben wir festgestellt, dass eine Konzentration der Retinsäure von 0,25 μg/ml die relative Expression von Kollagen um das 3-fache gegenüber derjenigen von unbehandelten Zellen erhöhte und 0,5 und 1,0 μg/ml im Allgemeinen die Biosynthese von Kollagen in diese aufgezogenen Zellen um das 5-fache gegenüber unbehandelten Zellen entsprechend der Darstellung in 15 erhöhten.
Es wurden 7 Personen im Alter von 80+ Jahren klinisch mit 1% Retinolcreme behandelt, die einmalig auf sonnengeschützter Haut aufgetragen, mit einem Pflaster abgedeckt und für 7 Tage ungestört belassen wurde. Biopsien dieser behandelten Flächen unter dem Pflaster ergaben, dass Typ III Prokollagen-mRNA in der Haut dieser Personen um etwa das 2,5-fache gegenüber den Kontrollflächen (mit Vehikel behandelt), die nach der gleichen Methode behandelt wurden (einmaliger Auftrag und abgedeckt für 7 Tage), zugenommen hatte. Diese Ergebnisse sind in 16 gezeigt.
Unter Anwendung der gleichen Methode, wie sie vorstehend für die Retinoidbehandlung beschrieben wurde (1% Retinol aufgebracht auf sonnengeschützter Haut, abgedeckt und 7 Tage später untersucht), sind von uns Probanden im Alter von 80+ Jahren behandelt und getestet worden, um die Wirkung einer Retinoidbehandlung auf die ERK-Aktivität zu ermitteln. Die Ergebnisse von Biopsien dieser Personen zeigen, dass nach der Behandlung die ERK-Aktivität in vivo mehr als das 2-fache im Vergleich zu einer mit Vehikel behandelten Biopsiefläche der gleichen Probanden betrug. Diese Ergebnisse sind in 17 gezeigt (worin die Kontrolle, mit Vehikel behandelte Haut, auf einen Wert eins normiert wurde).
In 18 sind zusätzliche sektionierte und gefärbte Biopsien von unserer Gruppe der Ältesten (80+) Probanden nach einer Retinoidbehandlung wie vorstehend ausgeführt. Wie vorstehend beschrieben wurde, induziert AP-1 die MMP-Bildung und wird durch Heterodimerisierung von c-Jun und c-Fos-Proteinen erzeugt. 18A zeigt, dass nach einer Woche einer Retinoidbehandlung (Retinol, "ROL") die c-Jun-Konzentration in der Haut von alten Personen (c-Jun ist rot gefärbt) signifikant im Vergleich zu einer Sektion einer Biopsie von Vehikel-behandelter Haut reduziert war (fast fehlte). Damit scheint unsere Erfindung die Bildung von c-Jun zu hemmen und damit die Bildung von AP-1 und der resultierenden MMP's zu hemmen. 18B und 18C zeigen, dass die Mengen an Prokollagen der Typen I und III (rot gefärbt) in Retinoid-behandelter Haut erhöht sind. (Die scheinbar geringere Dichte von Prokollagen in der Dermis in 18C ist ein Artefakt der hergestellten Sektion; es gibt in der Retinol-behandelten Sektion einen eindeutig höheren Grad der Färbung als in der mit Vehikel behandelten Sektion).
Nach einer der Ausführungsformen umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Verjüngen gealterter Haut durch Aufbringung einer wirksamen, nicht toxischen Menge eines Retinoids für eine wirksame Zeitdauer. Die wirksame Zeitdauer ist in der Regel täglich und bevorzugt mit lediglich einem Auftrag/Verabreichung der Zusammensetzung pro Tag. Eine bevorzugte Behandlung und Erhaltungstherapie benutzt eine wirksame Menge von etwa 0,4% Retinoid, obgleich höhere Dosierungen bei Rechtfertigung angewendet werden können. Das bevorzugte Retinoid ist Retinol.
In einer anderen Ausführungsform gewährt die Erfindung ein Verfahren zum Induzieren in vivo von Keratinocyt- und/oder Fibroblast-Proliferation durch die topische Verabreichung einer wirksamen, nicht toxischen Menge eines Retinoids (bevorzugt Retinol oder alle vollständige trans-Retinsäure) für eine wirksame Zeitdauer. Wiederum erfolgt die Behandlung bevorzugt täglich ein Mal oder zwei Mal mit der bevorzugten Menge von Retinoid von etwa 0,1% bis etwa 1,0%.
In noch einer anderen Ausführungsform reduziert und/oder hemmt die Erfindung MMP-1- und/oder MMP-9-Expression in der Haut von alten Personen durch topische Verabreichung einer wirksamen Menge eines Retinoids für eine wirksame Zeitdauer; wobei die bevorzugten Retinoide wiederum Retinol und alle vollständigen trans-Retinsäuren sind. Wiederum erfolgt die Behandlung bevorzugt täglich ein Mal oder zwei Mal mit der bevorzugten Menge an Retinoid von etwa 0,1% bis etwa 1,0%.
Wie vorstehend ausgeführt, lässt sich die Abnahme an Keratinocyten und Fibroblasten und die Zunahme der MMP-Expression als ein altersbezogener Zustand betrachten, ohne auf Verletzungen zurückzugreifen, wie beispielsweise eine Schädigung durch Sonne. Die vorliegende Erfindung gewährt damit eine Prophylaxe gegen eine schädliche Änderung in irgendeinem dieser altersbezogenen Parameter, wie sie außerdem eine Behandlung zur Linderung der schädlichen ätiologischen Änderungen, die durch Altern ausgelöst werden.
In einem anderen Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verbesserung oder Stimulierung der Synthese von Prokollagen der Typen I und III in der Haut von alten Personen. Wir haben festgestellt, dass eine signifikante Herabsetzung der Synthese von Prokollagen der Typen I und III in sonnengeschützter Haut von vielen gealterten Personen (mindestens 50% von ihnen) gibt und dass sich dieser Zustand durch den topischen Auftrag eines Retinoids behandeln lässt. Prokollagen ist ein Protein, das von Fibroblastzellen der Haut synthetisiert und anschließend in das extrazelluläre Medium ausgeschieden wird, wo es durch natürlich vorkommende Enzyme in Kollagen umgewandelt wird. Eine herabgesetzte Prokollagensynthese in der Haut von alten Personen ist ein Symptom für das verringerte Vorkommen von Prokollagenprotein sowohl in der oberen Dermis (extrazellulär) als auch in Fibroblasten in der gesamten Dermis und lässt sich (beispielsweise) mit Hilfe der Immunohistochemie bestimmen.
Zusammengefasst, zeigt unsere Untersuchung der in 1 dargestellten Regulationswege, dass das chronologische Altern der Haut durch Deaktivierung von ERK und/oder durch Aktivierung der SAP's hervorgerufen werden kann. Im Grunde haben wir nachgewiesen, dass beide Ereignisse in der Haut alter Personen ablaufen können. Die in 7 bis 9 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die sonnengeschützte Haut von alten Personen (Haut, die im Allgemeinen nicht auf chronischer Basis der Sonne exponiert war) verringerte Mengen an aktiver ERK und eine verringerte Menge an Cyclin D₂ aufweist, die zu einem verringerten Zellwachstum führen. Ebenfalls haben wir gezeigt, dass es in der Haut alter Personen eine Herabsetzung der Menge an synthetisiertem Prokollagen der Typen I und III gibt (siehe 6). Wenn es in der Dermis ein geringeres Zellwachstum gibt, dann ist wahrscheinlich auch die epidermale Decke in Mitleidenschaft gezogen. Unsere Ergebnisse an Versuchen verschiedener Signal gebender Komponenten des ERK-Weges, die insofern wichtig sind, dass sie für das Wachstum in menschlicher Haut sorgen, zeigen, dass das chronologische Altern in menschlicher Haut gekennzeichnet ist durch eine verringerte Aktivierung von mindestens zwei Komponenten des Weges, der das Zellwachstum fördert. Mit dem Altern der Haut führen die verringerte Aktivierung von ERK und die verringerte Erzeugung von Cyclin D₂ zu einem reduzierten Zellwachstum, was schließlich zu gealterter Haut führt. Unsere in 15 bis 17 gezeigten Ergebnisse bestätigen die in vivo Wirksamkeit einer Retinoidbehandlung im Erhöhen des Aktivitätsniveaus von ERK und der Erzeugung von Prokollagen der Typen I und III.
Andererseits zeigen die in den 4, 5 und 10 dargestellten Ergebnisse (Abbau der Dermis gegenüber der Erzeugung einer neuen Dermis), dass die nicht exponierte Haut von alten Personen über erhöhte cJUN-Kinase- und MMP-Aktivitäten verfügt. Die Aufwärtsregulierung der abbauenden MMP-Enzyme und die Abwärtsregulierung der Prokollagensynthese führen zu einem Defizit an Kollagen und rufen eine Alterung der Haut und ein beeinträchtigtes Reparaturvermögen gealterter Haut hervor. Eine Zunahme in der Aktivität des Weges, der eine erhöhte Abbaugeschwindigkeit der Haut verursacht (wie beispielsweise der durch MMP vermittelte Abbau der dermalen Matrix und Hemmung der Prokollagensynthese) gleichzeitig mit einer Abnahme der Aktivität des Weges, der Zellwachstum fördert (wie beispielsweise eine Abnahme der ERK-Aktivität) tragen beide zu einem chronischen Altern der menschlichen Haut bei. Unsere Verfahren zum Verhüten und Verjüngen von chronologisch gealterter Haut, die an nicht exponierter und sonnengeschützter Haut und oftmals unter Abdeckung der behandelten Stelle getestet wurden, lassen sich zum Behandeln des chronologischen Alterns der Haut über den gesamten Körper und einschließlich das Gesicht und die Hände anwenden. In Anbetracht der Lehren der vorgenannten Patentschrift und der vorläufigen Anmeldungen, die auf das Photoaltern gerichtet sind, wird die tägliche Anwendung eines Retinoids auf der Haut die Einflüsse des natürlichen Alterns sowie die verschärfenden Einflüsse der Sonne auf das natürliche Altern der Haut mildern.
Ohne damit auf eine spezielle Theorie der Funktion eingeschränkt sein zu wollen, gehen wir davon aus, dass die gezeigten Ergebnisse, z.B. in 13E und 13F, mindestens teilweise auf eine gewisse Kombination einer verbesserten ERK-Aktivierung, verringerter Mengen an c-Jun und erhöhter Mengen an Prokollagen der Typen I und/oder III zurückzuführen sind. Unter Anwendung der gleichen Methode, wie sie für die Retinoidbehandlung beschrieben wurde (1% Retinol aufgetragen auf sonnengeschützter Haut, abgedeckt und 7 Tage später untersucht) haben wir 3 von unseren Probanden im Alter von 80+ Jahren getestet. Die Ergebnisse der Biopsien dieser Personen zeigen, dass nach der Behandlung die ERK-Aktivität in vivo mehr als das 2-fache betrug, wie in 13 gezeigt wird (worin die Kontrolle, mit Vehikel behandelte Haut, auf einen Wert von 1 normiert ist).
Retinoide sind die eine Klasse von MMP-Inhibitoren. Die Inhibitoren der MMP's können direkt auf die MMP's und/oder auf die Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-κB wirken, durch die MMP's auf natürlichem Wege erzeugt werden. Aspirin und E5510 (beschrieben von Fujimori, T., et al., Jpn. J. Pharmacol. (1991), 55(1):81-91) hemmen die NF-κB-Aktivierung. Retinoide, wie sie beispielsweise in der US-P-4877805 offenbart wurden, sowie die dissoziierenden Retinoide, die für den AP-1-Antagonismus spezifisch sind (wie er beispielsweise beschrieben wurde von Fanjul, et al. in Nature (1994) 372:104-110), Glucocorticoide und Vitamin D₃-Target AP-1. Verbindungen zur Verstärkung der therapeutischen Wirkung von Vitamin D₃ wurden in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung mit Aktenzeichen 08/832865 (J. Voorhees et al., "Method for Assessing 1,25(OH)₂D₃-Activity in Skin and for Enhancing the Therapeutic Use of 1,25(OH)₂D₃"), eingereicht am 4. April, 1997, beschrieben, deren Offenbarung hiermit als Fundstelle einbezogen ist. Außer Retinol schließen andere Retinoide natürlich vorkommende und synthetische Analogstoffe von Vitamin A (Retinol), Vitamin A-Aldehyd (Retinal), Vitamin A-Säure (Retinsäure (RA)), einschließlich vollständig-trans, 9-cis und 13-cis-Retinsäure), Etretinat und andere ein, die in der EP-0379367A2, US-P-4887805 und 4888342 beschrieben wurden. Es ist zu erwarten, dass zahlreiche synthetische Retinoide und Verbindungen mit Retinoid-Aktivität in der vorliegenden Erfindung bis zu dem Maße verwendbar sind, dass sie eine Retinoid-Aktivität in vivo zeigen, wie sie beispielsweise in zahlreichen Patentschriften beschrieben wurden, die auf ihrem Deckblatt der Allergan Inc., zuerkannt wurden, wie beispielsweise die folgenden US-Patentschriften: 5514825, 5698700, 5696162, 5688957, 5677451, 5677323, 5677320, 5675033, 5675024, 5672710, 5688175, 5663367, 5663357, 5663347, 5648514, 5648503, 5618943, 5618931, 5618836, 5605915, 5602130. Noch andere Verbindungen, von denen beschrieben wurde, dass sie über eine Retinoid-Aktivität verfügen, wurden in anderen US-Patentschriften beschrieben: 5648563, 5648385, 5618839, 5559248, 5616712, 5616597, 5602135, 5599819, 5556996, 5534516, 5516904, 5498755, 5470999, 5468879, 5455265, 5451605, 5343173, 5426118, 5414007, 5407937, 5399586, 5399561, 5391753 und dergleichen, sowie Offenbarungen aller vorgenannten und nachfolgenden Patentschriften und Literaturstellen.
MMP's werden auch durch BB2284 gehemmt (beschrieben von Gearing, A.J.H. et al., Nature (1994) 370:555-557), GI129471 (beschrieben von McGeehan, G.M., et al., Nature (1994) 370:558-561) und TIMP's (Gewebeinhibitoren der Metall-Proteinasen, die Kollagenasen und andere Metall-Proteinasen von Vertebraten hemmen, einschließlich Gelatinase und Stromelysin). Noch andere Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, schließen Hydroxyharnstoff-Derivate ein, wie beispielsweise Galardin, Batimastat und Marimastat und solche, die in der EP-0558635A1 und EP-0558648A1 offenbart worden (offenbart darin als verwendbar zum Hemmen von MMP's in der Behandlung unter anderem von Ätologien, Hautgeschwüren, Hautkrebs und Epidermolysis bullosa). Von Retinoiden ist von Goldsmith, L.A. ("Physiology, Biochemistry and Molecular Biology of the Skin", 2. Ausg., (New York: Oxford Univ. Press, 1991) Kapitel 17) veröffentlicht worden, dass sie eine Erhöhung der stationären Werte von TIMP mRNA hervorrufen, die eine transkriptionelle Regelung nahelegen würden, obgleich wir auf der Grundlage unserer Entdeckungen festgestellt haben, dass dies in menschlicher Haut in vivo nicht der Fall ist. Noch andere Inhibitoren von MMP's, die topisch angewendet werden können und für die Ausführung der beanspruchten Erfindung verwendbar sind, schließen Tetracycline und Derivate davon ein, wie beispielsweise Minocyclin, Roliteracyclin, Chlortetracyclin, Methacyclin, Oxytetracyclin, Doxycyclin, Demeclocyclin und die verschiedenen Salze davon. Aufgrund der möglichen allergischen oder sensibilisierenden Reaktionen sollte die topische Verabreichung von Tetracyclinen sorgfältig auf derartige unerwünschte Reaktionen überwacht werden. Andere MMP- Inhibitoren schließen Genistein und Quercetin ein (beschrieben in den US-P-5637703, 5665367 und FR-A-2671724) und verwandte Verbindungen sowie andere Antioxidantien, wie beispielsweise NAC (N-Acetylcystein), Extrakt von Grünem Tee unter anderem.
Die wirksame Menge des auf die Haut aufgetragenen Wirkstoffes liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 0,001% bis 5 Gew.% und mehr bevorzugt etwa 0,01% bis 2 Gew.% und noch mehr bevorzugt 0,1 % bis 1 Gew.% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung. Die Zusammensetzungen sind so formuliert, dass sie vorzugsweise etwa 5 μg/cm² Haut beim Auftrag bereitstellen. Beispielsweise ist eine bevorzugte Zusammensetzung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung Retin-A^® als ein Retinsäure- Gel und -Creme (verfügbar bei Ortho Pharmaceuticals für die Behandlung von Akne vulgaris) in Konzentrationen von 0,01% bis 0,1%, wobei in das Vehikel vorzugsweise in Abhängigkeit von der speziellen Formulierung mindestens eines der folgenden einbezogen ist: butyliertes Hydroxytoluol, Alkohol (denaturiert mit tert-Butanol und Brucinsulfat), Stearinsäure, Isopropylmyristat, Polyoxyl-40-stearat, Stearylalkohol und dergleichen sowie kompatible Mischungen davon.
Wir haben 15 Probanden in zwei Altersgruppen getestet, junge Probanden (19 bis 29 Jahre) und alte Probanden (über 80 Jahre), um den Grad der Aktivierung der SAP-Kinase in jeder Gruppe zu bestimmen, wobei die SAP-Kinase-Aktivität anhand der Phosphorylierung von c-Jun gemessen wird. 10 zeigt, dass in vivo Proben von nicht exponierter Haut von den jungen Probanden etwa 25% der relativen c-Jun-Kinase-Aktivität gegenüber der nicht exponierten Haut von alten Probanden hatte. Aus diesen Ergebnissen könnte man entsprechend erhöhte Konzentrationen von AP-1 und MMP's in der Haut der alten Personen erwarten.
Es ist überraschend entdeckt worden, dass eine topische Behandlung alter Personen, d.h. chronologisch gealterte Haut, mit einem Retinoid zu einer Wiederherstellung der intrazellularen Prokollagen-Proteinkonzentrationen ähnlich denjenigen führte, wie sie in jungen Personen beobachtet werden (wie beispielsweise bei solchen mit einem Alter von 40 Jahren und darunter). Insbesondere haben wir festgestellt, dass ein einmaliger Auftrag von 1% Retinol auf chronologisch gealterte Haut und abgedeckt mit einem luftundurchlässigen Klebverband bei Untersuchung 7 Tage danach zu Prokollagen-Proteinkonzentrationen führte, die mit denen vergleichbar waren, die bei sonnengeschützter Haut von wesentlich jüngeren Personen (z.B. unterhalb eines Alters von 40 Jahren, angetroffen werden. Mehr bevorzugt würde bei alten Personen das Retinoid ein Mal oder zwei Mal täglich aufgebracht werden, um einen Therapieplan durchzuführen, obgleich das Mittel weniger häufig, dafür aber bevorzugt regelmäßigen Basis aufgebracht werden könnte (z.B. alle 2 Tage oder ein Mal wöchentlich). Für die Haut könnte es auch wünschenswert sein, gegenüber äußeren Angriffen abgedeckt zu werden und speziell gegenüber Quellen von UV-Licht, Detergentien und anderen aggressiven Chemikalien und dergleichen. Dementsprechend wäre es von Vorteil, der Retinoidzusammensetzung ein UV-Schutzmittel, eine Antioxidans und dergleichen hinzuzufügen.
Die Stimulation der Prokollagenerzeugung ist ein wichtiger Faktor in der Bewahrung des Zusammenhaltes chronologisch gealterter Haut. Gealterte Haut ist dünn und brüchig, was zum Teil auf den verringerten Kollagengehalt und der verringerten Organisation der Kollagenfaser zurückzuführen ist. Die Stimulation der Prokollagensynthese durch Retinoide und deren nachfolgende Umwandlung zu Kollagen müssten erwartungsgemäß die Brüchigkeit verringern, die Dicke erhöhen und das Aussehen gealterter Haut verbessern. Dementsprechend gewährt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Erhöhen der Prokollagenkonzentrationen sowohl intra- als auch extrazellulär und damit auch zur Verbesserung von Kollagenkonzentrationen insgesamt in chronologisch gealterter Haut. Wie hierin gezeigt wird, werden darüber hinaus die MMP-Konzentrationen in der Haut alter Personen im Vergleich zu denen erhöht, die in der Haut jüngerer Personen angetroffen werden. Die verbesserte Erzeugung von Prokollagen wäre enttäuschend, wenn das resultierende Kollagen in der Haut abgebaut werden würde, weshalb die Behandlung der Haut alter Personen sowohl mit einem Retinoid als auch ein MMP-Inhibitor wichtig ist, um die gewünschten Vorteile einer verbesserten Prokollagen-Biosynthese zu erzielen. Wir haben im Grunde entdeckt, dass in Haut, die nicht über eine verringerte Menge an Kollagen verfügt, die Behandlung mit einem Retinoid die Kollagenkonzentrationen nicht über das normale erhöht; somit zeigt unsere Erfindung, dass der Auftrag eines Retinoids die Kollagenkonzentrationen bis zu ihrem gewünschten Grundwert wiederherstellen kann. Damit erhöht unsere erfindungsgemäße Behandlung mit einem Retinoid nicht nur die Erzeugung von (Pro)kollagen der Fibroblasten, sondern sie greift auch in die MMP-Aktivitäten ein, die ein epidermales Ausdünnen hervorrufen.
Obgleich Retinol die bevorzugte Verbindung zur topischen Verabreichung ist, schließen wirksame Derivate von Retinol, von denen eine Verwendbarkeit zur Ausführung der vorliegenden Erfindung erwartet werden könnte, ein: Retinal, Retinsäure (einschließlich vollständige trans-, 9-cis- und 13-cis-Isomere) sowie Derivate davon (z.B. 7,8-Didehydroretinsäure) und andere, die von Kligman et al., beschrieben wurden, auf die vorstehend Bezug genommen wurde und deren Offenbarung hiermit als Fundstelle einbezogen ist, einschließlich kosmetisch zulässige Salze, Ester, Umkehrester und Ether davon, Konjugate davon und Mischungen davon.
Die hierin beschriebenen und auf kommerzieller Grundlage angesetzten Zusammensetzungen können enthalten: verschiedene konventionelle Farbmittel, Duftstoffe, Eindickungsmittel (wie beispielsweise Xanthanlösung), Konservierungsmittel, Feuchthaltemittel, Emollientien, Milderungsmittel, Tenside, Dispergiermittel, Penetrationsverstärker und dergleichen, die zugesetzt werden können, um zusätzliche Vorteile zu gewähren und den Eindruck und/oder das Aussehen des topischen Präparats zu verbessern. In ähnlicher Weise lässt sich die Zusammensetzung als eine Creme, Lotion, Salbe, Seife oder Duschgel, Shampoo oder eine Maske ansetzen.
Die vorangegangene Beschreibung und die folgenden Methoden sind als eine Veranschaulichung der Erfindung zu verstehen.
IN DEN BEISPIELEN ANGEWENDETE METHODEN
HISTOLOGIE UND MORPHOMETRIE:
Von der Gesäßhaut jeder Person wurden replizierte 4 mm Stanzbiopsien erhalten. Es wurden in Formalin fixierte Gewebestücke sektioniert, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, randomisiert und mit Blindprotokoll versehen. Die Sektionen wurden unter Verwendung eines Olympus BX40-Mikroskop in Verbindung mit einer hoch auflösenden Kamera Sony DCX-151 untersucht. Es wurden geblockte Bereiche von 200 μm auf einer Seite unter Verwendung einer NIH-Imager-Software isoliert und die Epidermishöhe an 4 Seiten (25 μm Abstand) in jedem von zwei solchen Bereichen ermittelt. Die gleichen zwei geblockten Bereiche wurden für Zählungen der Epithelzellen verwendet. Die Zahl der interstitiellen Zellkerne (d.h. Kerne unterhalb der dermo-epidermalen Verbindung, nicht in Verbindung mit Kapillaren) über der gesamten histologischen Sektion wurde als Maß für die dermale Zellenförmigkeit bestimmt. Die gleichen, mit Blindwert versehenen Sektionen wurden unter Verwendung einer Skala von 1 bis 9 für jeden Parameter der Bindegewebsfaser auf Abstand, Dicke, Desorganisationsgrad und Tiefe der Desorganisation bewertet.
HERSTELLUNG VON HAUT-ÜBERSTÄNDEN FÜR DIE BIOCHEMISCHE ANALYSE:
Es wurden Hautproben mit Mörser und Pistill unter flüssigem Stickstoff zerrieben und in einem Dounce-Gewebezerkleinerer in Puffer mit einem Gehalt von 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10 mM MgCl₂, 50 nM Glycerinphosphat, 5 mM NaVO₄, 2 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 10 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Leupeptin und 10 μg/ml Pepstatin und 0,5% NP-40 homogenisiert. Es wurden für 15 min Homogenate bei 14.000g zentrifugiert und die Überstände aufgenommen und für die biochemischen Bestimmungen entsprechend der nachfolgenden Beschreibung verwendet.
EX VIVO-ZELLWACHSTUM:
Es wurden Biopsien zu kleinen Fragmenten (näherungsweise 15 Fragmente pro Gewebestück) zerkleinert und die Gewebefragmente in Kunststoff Zellkulturflaschen gegeben. Das Kulturmedium bestand aus modifiziertem Eagle-Minimalmedium nach Dulbecco mit Earle's Salzen, nichtessentiellen Aminosäuren und 10% fötalem Rinderserum. Es wurden Gewebefragmente bei 37°C und 5% CO₂/95% Luft für bis zu einem Monat inkubiert. Jedes Fragment wurde darauf bewertet, ob Keratinocyten und/oder Fibroblasten auf dem Gewebe wuchsen und daraus der prozentuale Anteil von Fragmenten, aus denen Keratinocyten und Fibroblasten isoliert wurden, nach der Methode von Varani, J., et al., J. Clin. Invest., 96, 1747-1756 (1994) bestimmt.
MATRIX-METALLPROTEINASE-ASSAY:
Es wurden Gewebestücke unmittelbar nach der Biopsie in flüssigem Stickstoff tiefgefroren, in 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) plus 5 mM CaCl₂ homogenisiert und für 10 min bei 3.000 × g zur Entfernung der partikulären Substanz zentrifugiert. Die Fähigkeit, lösliche radioaktive Fragmente von 3H-markiertem fibrillarem Typ I Kollagen (beschrieben von Fisher, G.J., et al., Nature, 379, 335-339 (1996) und Hu, C-L, et al., Analytic. Biochem., 88, 638-643 (1978)) freizusetzen, wurde als Maß für die kollagenolytische Wirksamkeit verwendet. Es wurden Gewebeextrakte für 3 Stunden mit 1 mM Aminophenylquecksilberacetat (APMA) inkubiert, um die inaktive Form der Matrix-Metallproteinase in eine aktive Form umzuwandeln. Anschließend wurden 0,2 μCi Kollagensubstrat (NEN-DuPont, Boston, MA) für 24 Stunden mit 50 μl Gewebeextrakt inkubiert. Am Ende der 24-stündigen Inkubationszeit wurden die Proben bei 12.000 × g für 10 min zentrifugiert, um das intakte Protein zu pelletisieren. Die in der Überstandflüssigkeit verbleibende Radioaktivität wurde sodann gemessen und daraus der prozentuale Anteil von hydrolysiertem Substrat bestimmt.
Es wurde eine Gelatine-Zymographie (Varani et al., op. cit.) verwendet, um die Akivität von MMP-2 (72 kD Gelatinase, Gelatinase A) und MMP-9 (92 kD Gelatinase, Gelatinase B) zu ermitteln. Es wurden Gewebeextrakte in einem 8,5% SDS-Polyacrylamid-Gel mit einem Gehalt von 1 mg/ml Gelatine elektrophoresiert. Nach der Elektrophorese wurde das SDS mit Hilfe von 3 aufeinander folgenden Wäschen in 1% Triton X-100 entfernt. Die ersten zwei Wäschen dauerten jeweils 20 nun und die letzte erfolgte über Nacht. Die Quantifizierung der Breite der Hydrolysenzone wurde mit Hilfe der Laser-Densitometrie ausgeführt.
ASSAYS DER ERK-PHOSPHORYLIERUNG UND AKTIVITÄT:
ERK1 und ERK2 wurden in Haut-Überständen mit Antikörpern von der Santa Cruz Biotechnology Inc. einer Immunfällung unterzogen und auf enzymatische Aktivität unter Verwendung eines Myelinbasischen Proteins als Substrat assayiert, wie von J. D. Weber et al. ("Sustained activation of extracellularsignal regulated kinase I (ERK1) is required for the continued expression of cyclin D1 in G1 phase", ("verzögerte Aktivierung von mit extrazellulärem Signal regulierter Kinase I (ERK1) ist für die fortgesetzte Expression von Cyclin D1 in G1 Phase erforderlich") Biochem. J., 326:61-68 (1997)) beschrieben wurde. In Überständen wurden sowohl die Summe als auch phosphorylierte ERK1 und ERK2 mit Hilfe der Western-Blot-Analyse bestimmt, indem Antikörper von der New England Biolabs Inc. (Beverly, MA) verwendet wurden.
ASSAY AUF C-JUN-KINASE-AKTIVITÄT:
Die c-Jun-Aktivität in Haut-Überständen wurde mit Hilfe von Assays der Festphase-Kinase bestimmt (entsprechend der Beschreibung z.B. von M. Hibi et al., "Identification of an oncoprotein and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain", ("Identifikation eines Onkoproteins und von auf UV ansprechender Proteinkinase, die c-Jun-Aktivierungsdomäne bindet und potenziert"), Genes Dev., 7:2135-2148 (1993)).
NORTHERN-BLOT-ANALYSE VON RNA:
Die Gesamt-RNA (z.B. für c-Jun, Prokollagen α1(III)) wurde aus Hautproben mit Hilfe der Guanidinium-hydrochlorid-Lyse und Ultrazentrifugation isoliert (entsprechend der Beschreibung von G.J. Fisher et al., "Cellular, immunologic and biochemical characterization of topical retinoic acid-treated human skin", ("Zellulare, immunologische und biochemische Charakterisierung von topisch mit Retinsäure behandelter menschlicher Haut"), J. Investig. Dermatol., 96:699-707 (1991)). Die Northern-Analyse auf Gesamt-RNA (40 μg/Spur) mit willkürlich Primer-unterstützten ³²P-markierten cDNA-Sonden für die zu bestimmende spezielle mRNA wurde entsprechend der Beschreibung von G.J. Fisher et al. ausgeführt (in "All trans retinoc acid induces cellular retinol-binding protein in human skin in vivo", ("Vollständige trans-Retinsäure induziert zellular Retinol-bindendes Protein in menschlicher Haut in vivo") J. Investig. Dermatol., 105:80-86 (1995)). Prokollagen Typ III-mRNA wurde unter Anwendung der Umkehrtranskriptase-Polymerase-Kettenreaktion bestimmt.
WESTERN-BLOT-ANALYSE VON PROTEINEN:
In Zellkernextrakten von menschlicher Haut wurden Jun-Proteine, Cyclin D₂ (beides Antikörper von der Santa Cruz Biotechnology Inc.) und phosphoryliertes c-Jun (Antikörper von der New England Biolabs Inc.) mit Hilfe der Western-Analyse detektiert, die beschrieben wurde von G.J. Fisher et al., (in "Immunological identification and functional quantitation of retinoic acid and retinoid X receptor proteins in human skin", ("Immunologische Identifikation und funktionelle Quantifizierung von Retinsäure- und Retinoid-X-Rezeptorproteinen in menschlicher Haut") J. Biol. Chem., 269:20629-20635 (1994)).
Immunoreaktive Proteine wurden mit Hilfe der verstärkten Chemilumeneszensbestimmung sichtbar gemacht und mit Hilfe der Laserdensitometrie quantifiziert oder mit Hilfe der verstärkten Chemifluoreszensanalyse sichtbar gemacht und mit Hilfe eines Storm-Bildgebers quantifiziert (Molecular Dynamics, Palo Alto, CA).

Claims

Verfahren zur kosmetischen Verjüngung von chronologisch gealterter Haut, indem der natürliche, chronologische, altersbedingte Anstieg von Kollagen abbauenden MMP-Enzymen reduziert wird, der in chronologisch gealterter Haut vorkommt, und indem die natürliche, chronologische, altersbedingte Verringerung der Kollagen-Biosynthese verringer wird, die in chronologisch gealterter Haut vorkommt; umfassend das Auftragen einer wirksamen, nichttoxischen Menge mindestens eines aktiven, nicht retinoiden Inhaltsstoffes auf die Haut, der die Kollagen abbauenden MMP's hemmt, und eines als Retinoid aktiven Inhaltsstoffes in einer wirksamen Menge, um die Prokollagen-Biosynthese zu fördern, in welchem Verfahren der MMP-Inhibitor ausgewählt wird aus Aspirin, E5510, Vitamin D₃, GI 129471, BB 2284, Genistein, Quercetin, NAC, Extrakt von Grünem Tee, TIMP's und Tetracyclinen und Derivaten davon sowie den verschiedenen Salzen davon.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Behandlung auf den gesamten Körper angewendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem das Retinoid ausgewählt wird aus Retinol, Retinal, Retinoinsäure, Salzen von Retinoinsäure, Derivaten und Analoga davon sowie Mischungen davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem der MMP-Inhibitor Minocyclin, Rolitetracyclin, Chlortetracyclin, Methacycline, Oxytetracyclin, Doxycyclin, Demeclocyclin oder ein Salz davon ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches Verfahren das topische Auftragen, mindestens ein Mal wöchentlich in einem kosmetisch geeigneten Vehikel, von einer nichttoxischen Menge eines Retinoids umfasst, was zur Normalisierung der Prokollagensynthese wirksam ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welchem das Retinoid und der MMP-Inhibitor gemeinsam in einer einzigen Zubereitungsform aufgetragen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welchem das Retinoid und der MMP-Inhibitor in einer Zubereitungsform als eine Creme, Lotion, Salbe, Seife oder Körperwäsche, Shampoo oder eine Maske aufgetragen werden.
Verfahren nach Anspruch 5 und 6, bei welchem der Auftrag täglich erfolgt.
Verwendung eines nicht-retinoiden MMP-Inhibitors und eines als ein Retinoid wirksamen Inhaltsstoffes, der die Prokollagensynthese fördert, und zwar für die Herstellung eines Medikaments zur topischen Anwendung auf chronologisch gealterter Haut, um die MMP's zu hemmen, die Erzeugung von Prokollagen zu normalisieren, den Kollagenabbau zu hemmen, die ERK-Aktivität zu verbessern, die Menge des C-Jun-Proteins zu verringern und/oder die Aktivität der C-Jun-Kinase zu verringern, wobei der MMP-Inhibitor ausgewählt wird aus: Aspirin, E5510, Vitamin D₃, GI 129471, BB 2284, Genistein, Quercetin, NAC, Extrakt von Grünem Tee, TIMP's und Tetracyclinen und Derivaten davon sowie den verschiedenen Salzen davon.
Verfahren zum Verzögern des Einsetzen und Verringern des natürlichen, chronologischen, altersbedingten Anstiegs von Kollagen abbauenden MMP-Enzymen und der Verringerung der Kollagenbiosynthese, die in einer solchen chronologisch gealterten Haut nach einem Alter von etwa 80 Jahren vorkommen; umfassend das Bereitstellen einer topisch verabreichbaren, nichttoxischen Menge eines Retinoids und eines nicht retinoiden MMP-Inhibitors in einem kosmetisch geeigneten Vehikel und das Auftragen des Retinoids auf die Haut einer Person in einem Alter von weniger als etwa 80 Jahren mindestens ein Mal wöchentlich in einer wirksamen Menge, um das Einsetzen des chronologisch altersbedingten Abnehmens der Prokollagensynthese und das Zunehmen Kollagen abbauender MMP-Enzyme zu verzögern und zu verringern, die in chronologisch gealterter Haut vorkommen, worin der MMP-Inhibitor ausgewählt ist aus: Aspirin, E5510, Vitamin D₃, G1 12947, BB 2284, Genistein, Quercetin, NAC, Extrakt von Grünem Tee, TIMP's und Tetracyclinen und Derivaten davon sowie den verschiedenen Salzen davon.
Verfahren zum Erhöhen der Erzeugung von Prokollagen und der Menge von Kollagen, die in chronologisch gealterter Haut vorhanden ist, umfassend die Schritte des Bereitstellens eines topisch verabreichbaren, nichttoxischen Retinoids und nichttoxischen Nichtretinoid-MMP-Inhibitors und das gleichzeitige Verabreichen des Retinoids und des Nichtretinoid-MMP-Inhibitors auf der Haut in einer wirksamen Menge, um die Kollagenmenge auf Werte zurückzubringen, die normalerweise in der Haut angetroffen werden, und um den Abbau von Kollagen durch MMP's zu verringern, worin der MMP-Inhibitor ausgewählt wird aus: Aspirin, E5510, Vitamin D₃, GI 12947, BB 2284, Genistein, Quercetin, NAC, Extrakt von Grünem Tee, TIMP's und Tetracyclinen und Derivaten davon sowie den verschiedenen Salzen davon.