DE69800488T2 - Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Hemmung von neoplastischen Verletzungen - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung
• Die Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche sich für die Behandlung und Vorbeugung von Krebsvorstufen und Krebs in Säugern eignen.
• Familiär-hereditäre Adenopathie ("FAP") ist eine Erbkrankheit, wobei der Dickdarm der Erkrankten meistens praktisch unzählige Polypen oder Adenoma enthält. Diese Patienten enwickeln so viele Polypen oder Adenoma, die sich zum Krebs entwickeln können, dass man normalerweise den Dickdarm herausoperiert. Etwa im Jahr 1983 entdeckte Waddell, dass das nicht steroide, entzündungshemmende Medikament ("NSAID") Sulindac einen Rückgang der Dickdarmpolypen (eine Art von Krebsvorstufe) verursacht und deren Rückkehr hemmt, wenn dieses Medikament Patienten mit FAP verabreicht wurde. Waddells Ergebnisse mit Sulindac bei FAP-Patienten wurden in mehreren, folgenden Studien bestätigt. Da Sulindac wie auch andere NSAIDs unglücklicherweise den Verdauungstrakt derjenigen Patienten beeinträchtigen, welchen sie über einen längeren Zeitraum hinweg verabreicht werden, (von Nebeneffekten bei den Nieren und Auswirkungen auf die Blutgerinnung ganz zu schweigen), bilden sie keine praktikable Behandlungsmethode bei FAP oder anderen Krebs- oder Krebsvorstufen-Indikationen (insbesondere Neoplasmen), welche eine Langzeitbehandlung erfordern.
• Waddell stellte ursprünglich die Hypothese auf, dass der Mechanismus der Wirkung von Sulindac auf Dickdarmpolypen die Hemmung der Synthese von Prostaglandin (PG) einschließt. (Waddell, W. R. et. al., "Sulindac for Polyposis of the Colon", Journal of Surgical Oncology, 24: 83-87, 1983). Die Hemmung der Synthese von Prostaglandin ("PG") resultiert aus der von NSAIDs verursachten Hemmung der Cyclooxygenase (COX). Ein allgemeiner Vorteil von NSAIDs ist die Reduzierung von Entzündungen, was bekanntlich durch die Reduzierung der PG-Spiegel verursacht wird. Da NSAIDs bekanntlich COX hemmen, welche Ihrerseits die PG-Synthese hemmt, wird allgemein angenommen, dass der Rückgang von Dickdarmpolypen auf diese Eigenschaft zurückzuführen ist. In der Tat ist es ungeachtet jüngster, gegenteiliger Entdeckungen zur allgemeinen Lehre geworden, dass die Verabreichung einer die PG-Synthese hemmenden Substanz (bspw. eines NSAID) bei einem Patienten mit FAP oder mit Krebsvorstufen oder mit Krebs infolge einer Reduzierung der PG-Spiegel zu einem Rückgang dieser Schädigungen führt. In der Tat haben Forscher Phosphodiesterase als Ziel ausgeschlossen (vgl. J. D. Gaffen et. al.: Increased killing of malignant cells by giving indomethacin with methotrexate, Prog. Lipid Res., 25 pp. 543-545, 1986).
• Jüngste Entdeckungen führen die Wissenschaftler jedoch in eine vollständig andere Richtung - nämlich, dass es nicht notwendig ist, COX zu hemmen, um Neoplasie- Patienten erfolgreich zu behandeln. Pamukeu et al. haben in dem US-Patent 5,401,774 offenbart, dass Sulfonylverbindungen, welche als bei der PG-Synthesehemmung als inaktive Substanzen eingestuft worden waren (und deshalb weder ein NSAID noch ein Entzündungen hemmendes Gegenmittel darstellen), völlig unerwartet das Wachstum einer Vielzahl von neoplastischen Zellen, einschließlich von Dickdarmpolypenzellen, hemmten. Dieses Sulfonylderivate haben sich bei Rattenmodellen der Dickdarmkarzinogenese als effektiv erwiesen, und eine (nicht als Exisulind bezeichnete) Variante hat sich in vorläufigen, klinischen Humanversuchen mit FAP-Patienten als wirksam erwiesen.
• Die Bedeutung dieser Entdeckung - und die Entkopplung der antineoplastischen Aktivität von der COX-Hemmungswirkung - kann nicht überschätzt werden. Wenn diese beiden Phänomene eine direkte Beziehung hätten, gäbe es wenig Hoffnung für eine sichere NSAID-Therapie bei FAP-Patienten, da die Nebeneffekte von NSAIDs wie Magenentzündung ebenfalls durch die COX-Hemmung ausgelöst werden. Prostaglandine haben eine Schutzfunktion bei der Auskleidung des Magens. Wenn NSAIDs verabreicht werden, wird COX gehemmt, und die PG-Spiegel werden reduziert: Eine Magenentzündung ist das übliche Ergebnis. Diese Nebeneffekte müssen sich nicht bei einer kurzzeitigen (akuten) NSAID-Therapie offenbaren. Bei einer länger dauernden (chronischen) NSAID- Therapie sind jedoch Magenentzündungen, Blutungen sowie Ulzerationen sehr verbreitet. In einer erheblichen Anzahl von Fällen mußte die NSAID-Therapie infolge der Heftig­ ± keit dieser Nebeneffekte und anderer, potentiell tödlicher Nebeneffekte, abgebrochen werden. Darüber hinaus steigt die Heftigkeit dieser Nebeneffekte mit dem Alter, vermutlich deshalb, weil die natürlichen PG-Spiegel in der Magenschleimhaut mit zunehmendem Alter absinken. Somit sollten für die Behandlung neoplastischer Schäden geeignete Verbindungen das Wachstum neoplastischer Zellen hemmen, sie sollten jedoch COX nicht hemmen.
• Herkömmliche Verfahren zum Testen von Verbindungen können verwendet werden, um bessere Verbindungen zu finden, welche das Wachstum neoplastischer Zellen hemmen. Im Rahmen eines derartigen Szenarios können Medikamente unter Verwendung von in vitro-Modellen herausgefilter werden. Es hat sich jedoch gezeigt, dass herkömmliche in vitro-Filtermethoden eine Vielzahl von Verbindungen zulassen, welche sich später in Tierversuchen als unwirksam erwiesen haben, und zwar infolge einer Vielzahl von im Vorhinein nicht berücksichtigter Probleme, wobei ein Problem darin besteht, dass ein in vitro-Filterverfahren nicht in der Lage ist, die Wirksamkeit vorherzubestimmen. Studien an Tiermodellen sind zeitraubend und teuer. Deshalb wird ein genaueres in vitro- Filterungsverfahren zur Vorselektion von Verbindungen vor dem Test am Menschen benötigt, welches eine Vorhersage über die Eigenschaften bei der Behandlung von Neoplasie bietet. Die Kenntnis einer speziellen Zielsubstanz zur Hemmung von Humankrebs würde eine höhere Präzision und Effektivität bedeuten, wobei hochwirksame und sichere Verbindungen vor der Durchführung von Tierversuchen identifiziert werden könnten.
• Gegenwärtig werden in der pharmazeutischen Industrie zweckmäßige Verfahren zur Ermittlung von Medikamenten angewendet, um die Verfahren zur Erkennung klinisch wirksamer Stoffe zu verbessern. Typischerweise beziehen sich die zweckmäßigen Verfahren zur Ermittlung von Medikamenten auf ein "Schloß und Schlüssel"-Konzept, wobei strukturelle Beziehungen zwischen einem therapeutischen Zielmolekül (Schloß) und pharmazeutischen Verbindungen (Schlüssel) definiert werden. Derartige Verfahren werden in erheblichem Umfang durch spezielle Computersoftware unterstützt, welche auf Datenbanken über chemische Verbindungen zugreift, um mögliche geometrische Eignungen gegenüber dem Zielmolekül zu identifizieren. Unglücklicherweise muss man zur Anwendung derartiger Systeme Einsicht in das Zielmolekül (Schloß) haben. Das Zielmolekül kann ein Enzym sein, ein Protein, eine Membran oder ein Nucleus-Rezeptor, bspw. eine Nucleinsäuresequenz.
• Bei komplexen Krankheiten wie Neoplasie haben die Wissenschaftler eine Mehrzahl von potentiellen Zielsubstanzen identifiziert. Jedoch ist eine Vielzahl der für die Behandlung von Neoplasie zur Verfügung stehenden Medikamente unspezifisch und für normales Gewebe toxisch, und sie sind nicht anwendbar bei Krebsvorstufen und werden nur dann verwendet, wenn die Bildung von neoplastischen Zellen dem Krebs vorangeht. Ein besseres Verständnis der bei der Krebsentstehung ablaufenden Mechanismen könnte die Wissenschaftler auf einen Weg zur Entwicklung spezifischer antineoplastischer Medikamente führen - Medikamente, welche in einem früheren Krankheitsstadium unbedenklich verabreicht werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
• Die Erfindung bezieht sich auf ein neues in vitro-Verfahren zur Vorselektierung von Testverbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur unbedenklichen Behandlung und Vermeidung von Neoplasie, insbesondere von Krebsvorstufen. Insbesondere bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Testsubstanzen, welche zur Behandlung und Vermeidung von Neoplasie einschließlich von Krebsvorstufen bei minimalen Nebeneffekten im Hinblick auf COX-Hemmung und andere unspezifische Interaktionen verwendet werden können.
• Bei einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Selektierungsverfahren deshalb die Bestimmung der COX-Hemmungswirkung einer Testsubstanz. Da die Erfinder eine Beziehung zwischen der Krebshemmung und der Hemmung des Isoenzyms Phosphodiesterase Typ 5 ("PDE5") festgestellt haben, umfaßt die Erfindung die Bestimmung der PDE5-Hemmungswirkung der Substanz. Vorzugsweise umfaßt das erfindungsgemäße Selektierungsverfahren die Bestimmung, ob die Substanzen das Wachstum von Tumorzellen in einer Zellkultur hemmen.
• Bei einer anderen Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Selektierungsverfahren die Bestimmung der COX hemmenden Wirkung der Substanz, die Bestimmung der PDE5 hemmenden Wirkung der Substanz und die Bestimmung, ob die Substanz in Tumorzellen Apoptosis auslöst.
• Bei einer derartigen Vorselektierung von Verbindungen können potentiell heilsame und verbesserte Verbindungen schneller und mit einer größeren Präzision identifiziert werden als dies in der Vergangenheit möglich war. Weitere Vorteile werden ersichtlich aus der folgenden Beschreibung.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
• Fig. 1 zeigt die Auswirkung der Sulfid-Derivate von Sulindac und der Sulfon-Derivate von Sulindac (bekannt als Exisulind) auf die Aktivität von reiner Cyclooxygenase.
• Fig. 2 zeigt den Einfluß der Testverbindungen B und E auf die COX hemmende Wirkung.
• Fig. 3 zeigt den hemmenden Einfluß von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf PDE-4 und PDE5, welche aus kultivierten Tumorzellen isoliert wurden.
• Fig. 4 zeigt die Wirkungen von Sulindac-Sulfid auf die Konzentration zyklischer Nucleotide in HT-29-Zellen.
• Fig. 5 zeigt die Phosphodiesterase hemmende Wirkung der Verbindung B.
• Fig. 6 zeigt die Phosphodiesterase hemmende Wirkung der Verbindung E.
• Fig. 7 zeigt die Wirkungen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf die Apoptosis und Nekrose von HT-29-Zellen.
• Fig. 8 zeigt die Wirkungen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf die Hemmung des Wachstums von HT-29-Zellen und auf die Auslösung von Apoptosis, festgestellt durch DNS-Fragmentation.
• Fig. 9 zeigt die Apoptosis auslösenden Eigenschaften der Verbindung E.
• Fig. 10 zeigt die Apoptosis auslösenden Eigenschaften der Verbindung B.
• Fig. 11 zeigt den Einfluß von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf das Tumorzellenwachstum.
• Fig. 12 zeigt die wachstumshemmende und Apoptosis auslösende Wirkung von modifiziertem Sulindac-Sulfid (Dimethylsulfoxid DMSO).
• Fig. 13 zeigt die wachstumshemmende Wirkung der Verbindung E.
• Fig. 14 zeigt die Hemmung von prämalignen, neoplastischen Schädigungen in einer Gewebekultur des Brustdrüsenorgans von Mäusen durch Sulindac-Metaboliten.
Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
• Das erfindungsgemäße Verfahren ist nützlich zur Identifizierung von Verbindungen, welche zur Behandlung oder Vermeidung von Neoplasmen verwendet werden können, und welche sich nicht durch die schwerwiegenden Nebeneffekte konventioneller NSAIDs auszeichnet.
• Krebs und Krebsvorstufen können als Krankheiten angesehen werden, welche ein ungeordnetes Zellwachstum mit sich bringen. Das. Zellwachstum umfaßt eine Vielzahl von unterschiedlichen Faktoren. Ein Faktor besteht darin, wie schnell sich die Zellen fortpflanzen, und ein anderer Faktor ist, wie schnell die Zellen absterben. In Abhängigkeit von der Art der Umgebungsreize können Zellen entweder durch Necrosis oder durch Apoptosis sterben. Die Zelldifferenzierung ist noch ein anderer Faktor, der die Kinetik eines Tumorwachstums beeinflußt. Eine Aufklärung, welcher der vielen Aspekte des Zellwachstums von einer Testsubstanz beeinflußt wird, ist wichtig für die Entdeckung eines sachdienlichen Mittels für die pharmazeutische Therapie. Auf dieser Unterscheidungsfähigkeit aufbauende Auswahltests können mit Tests zur Bestimmung der wachstumshemmenden Wirkung der Substanzen kombiniert werden.
• Die vorliegende Erfindung ist das Ergebnis mehrerer wichtiger Entdeckungen. Zunächst entdeckten die Erfinder, dass gewünschte Inhibitoren für das Tumorzellenwachstum den frühzeitigen Tod von Krebszellen durch Apoptosis auslösen (vgl. Piazza, G. A. et, al., Cancer Research, 55 (14), 3110-16, 1995). Als nächstes entdeckten die Erfinder unerwartet, das Verbindungen, welche gezielt Apoptosis auslösen, ohne COX in nennenswertem Umfang zu hemmen, auch Phosphodiesterase ("PDE") hemmen. Insbesondere, und entgegen führenden wissenschaftlichen Studien hemmen erwünschte Verbindungen für die Behandlung neoplastischer Schädigungen gezielt die Typ 5-Isoenzym-Form der Phosphodiesterase ("PDE5") (EC 3.1.4.17). PDE5 ist eines von wenigstens sieben Isoenzymen der Phosphodiesterase. PDE5 ist insofern einzigartig, als es gezielt das zyklische GMP vermindert, während andere PDE-Arten entweder ungezielt wirken oder zyklisches AMP vermindern. Vorzugsweise hemmen erwünschte Verbindungen andere Phosphodiesterasearten nicht in erheblichen Umfang.
• Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die Untersuchung der Cyclooxygenase hemmenden Wirkung einer vorgegebenen Verbindung, und die Ermittlung der PDE5 hemmenden Wirkung dieser Substanz. Die Testverbindungen werden festgelegt hinsichtlich ihrer möglichen Fähigkeit zur Behandlung von neoplastischen Schädigungen, entweder direkt durch Abschätzen ihrer Wirkungen gegenüber spezifischen Grenzwerten oder indirekt durch Vergleich ihrer Aktivitäten gegenüber bekannten, für die Behandlung neoplastischer Schädigungen nützlicher Verbindungen. Eine Standardverbindung, die bekanntermaßen bei der Behandlung neoplastischer Schädigungen wirksam ist, ohne Magenreizungen zu verursachen, ist 5-Fluor-2-methyl-1-(p- methylsulfonylbenzyliden)-3-indenylessigsäure ("Exisulind"). Andere für vergleichbare Zwecke nützliche Verbindungen umfassen solche Substanzen, welche bekanntermaßen ICOX hemmen, bspw. Indomethacin und die Sulfid-Metaboliten von Sulindac: 5-Fluor-2- methyl-1-(p-methylsulfonylbenzyliden)-3-indenylessigsäure ("Sulindac-Sulfid"). Andere, zu vergleichbaren Zwecken einsetzbare Verbindungen sind solche, welche bekanntermaßen PDE5 hemmen, wie bspw. 1-(3-Chloranilin)-4-phenyphthalazin ("MY5445").
• Eine Testverbindung wird klar als vielversprechender Kandidat eingestuft, wenn sie sich besser oder vergleichbar verhält wie Exisulind und COX nicht hemmt. Im allgemeinen sind wünschenswerte Verbindungen solche, welche PDE5 hemmen und das Zellwachstum hemmen und Apoptosis auslösen, jedoch bei pharmakologisch akzeptablen Dosen COX nicht hemmen.
• Wie der Begriff "Krebsvorstufen-Schädigungenu hier verwendet wird, so umfaßt er Syndrome, die durch abnormale neoplastische, einschließlich dysplastische Gewebeveränderungen beschrieben werden. Beispiele umfassen dysplastisches Wachstum in Dickdarm-, Brust-, Prostata- oder Lungengewebe, oder Verhältnisse wie bei dem dysplastischen Nävussyndrom, einem Vorzeichen für ein bösartiges Hautmelanom. Weitere Beispiele sind neben dem dysplastischen Nävussyndrom auch Polyposissyndrome, Dickdarmpolypen, Krebsvorstufen-Schädigungen des Halses (insbesondere Dysplasia cervicalis), der Speiseröhre, der Lunge, ferner Prostatadysplasie, Prostataintraneoplasie, ferner Schädigungen der Brust und/oder Haut und damit zusammenhängende Verhältnisse (bspw. Keratitis actinica), unabhängig davon, ob die Schädigungen klinisch identifizierbar sind oder nicht.
• Der hier verwendete Begriff "Karzinom" oder "Krebs" bezieht sich auf krebsartige Schädigungen. Beispiele sind bösartige Melanome, Brustkrebs, Prostatakrebs und Dickdarmkrebs. Die hier verwendeten Begriffe "Neoplasie" und "Neoplasmen" beziehen sich sowohl auf Krebsschäden wie auch auf Krebsvorstufen-Schädigungen.
• Die hier verwendete Abkürzung PG bedeutet Prostaglandin; PS bedeutet Prostaglandinsynthetase; PGE2 bedeutet Prostaglandin E2; PDE bedeutet Phosphodiesterase; COX bedeutet Cyclooxygenase; RIA bedeutet Radioimmunoassay.
• Der hier verwendete Begriff "PDE5" bezieht sich auf dasjenige Enzym und auf jede seiner Isoformen, welches cGMP-spezifische hydrolytische Enzymaktivitäten und eine hohe Affinität zur Bindung von cGMP zeigt.
• Ein anderer Aspekt besteht in einem Verfahren zur Behandlung von Patienten mit einem Bedarf zur Behandlung von Neoplasie durch Identifizierung von Verbindungen, welche bei pharmakologisch akzeptablen Dosen eine erhebliche Hemmungswirkung gegenüber PDE5 zeigen, und die Behandlung des Patienten mit einer oder mehrerer dieser Verbindungen, auf welche die Neoplasie des Patienten anspricht.
Untersuchungsprotokolle
• Die folgenden Untersuchungsprotokolle und andere Protokolle werden vorgestellt zum besseren Verständnis bevorzugter Verfahren für die Untersuchung von Testverbindungen zwecks Bestimmung ihrer Eignung zur Behandlung von Neoplasie, insbesondere von Krebsvorstufen.
1. Bestimmung der COX hemmenden Wirkung
• Die Hemmung von COX kann mit zwei verschiedenen Verfahren festgestellt werden. Das eine Verfahren umfaßt die Messung der PGE2-Absonderung durch intakte HL-60- Zellen, nachdem diese der auszuwählenden Substanz ausgesetzt wurden. Das zweite Verfahren umfaßt die Messung der Aktivität von gereinigten Cyclooxygenasen (COXs) in Gegenwart der Verbindung. Beide Testverfahren sind verknüpft mit bereits in der Literatur beschriebenen Meßprotokollen.
1. A. PGE2-Sekretion
• Die besagten Verbindungen können nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren bewertet werden, um festzustellen, ob sie die Produktion von Prostaglandin E2 ("PGE2") hemmen. Bspw. kann von einer Zelle abgesondertes PGE2 unter Verwendung eines Enzym-Immunoassay(EIA)-Werkzeugs für PGE2 gemessen werden, wie dies kommerziell von Amersham, Arlington Heights, IL, USA, erhältlich ist. Unter den geeigneten Zellen sind solche, welche PG im Überfluß liefern, wie bspw. HL-60-Zellen. HL-60- Zellen sind menschliche Promyelozyten, welche in reifen Granulozyten mittels DMSO differenziert werden (vgl. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R:E. und Gallo, R. C., "Normal Functional Characteristics of Cultured Human Promyelocytic Leukemia Cells (HL-60) After Induction of Differentiation By Dimethylsulfoxide", J. Exp. Med., 149: 969- 974, 1979). Diese differenzierten Zellen produzieren PGE2 nach Stimulation mit einem Kalciumionenträger A23187 (vgl. Kargman, S., Prasit, P. und Evans, J. F., "Translocation of HL-60 Cell 5-Lipoxygenase", J. Biol. Chem., 266 : 23745-23752, 1991). HL-60 erhält man aus einer Kulturenanhäufung amerikanischen Typs (ATCC:CCL 240). Sie können in einem RPMI 1640-Medium gezüchtet werden, das ergänzt wird mit 20% von durch Hitze inaktiviertem Rinderfötusserum, 50 U/ml Penizillin und 50 ug/ml Streptomycin, unter einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; bei 37ºC. Um die myeloische Differenzierung auszulösen, werden die Zellen für einen Zeitraum von 9 Tagen 1,3-prozentigem Dimethylsulfoxid ausgesetzt und sodann gewaschen und in Dulbecc's phosphatgepuffertem Salz zu 3 · 106 Zellen/ml aufgeschlämmt.
• Die differenzierten HL-60-Zellen (3 · 106 Zellen/ml) können für einen Zeitraum von 15 min bei 37ºC in Gegenwart der zu testenden Verbindung in der gewünschten Konzentration bebrütet werden. Sodann werden die Zellen mit A23187 (5 · 10 M) über einen Zeitraum von 15 min stimuliert. Die PGE2-Absonderung in das externe Medium wird wie oben beschrieben gemessen.
1. B. Gereinigte Cyclooxygenasen
• Zwei unterschiedliche Formen der Cyclooxygenasen (COX-1 und COX-2) wurden in der Literatur als Regulatoren für die Prostaglandinsynthese beschrieben. Es ist bekannt, dass COX-2 die induzierende Form von COX darstellt, während COX-1 die konstitutive Form bildet. Die COX-1-Aktivität kann unten Verwendung des von Mitchell et al. beschriebenen Verfahrens gemessen werden (Selectivity of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs as Inhibitors of Constitutive and Inducible Cyclooxygenase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 11693-11697, 1993), wobei COX-1 verwendet wird, das von den Vesiculae seminalis von Schafböcken isoliert wurde, wie dies bei Boopathy & Balasubramanian: "Purification and Characterization of Sheep Platelet Cyclooxygenase" (Biochem. J., 239 : 371-377, 1988) beschrieben worden ist. Die COX-2-Aktivität kann unter Verwendung von COX-2 gemessen werden, welches von der Plazenta von Schafen isoliert wurde, wie dies bei Mitchell et al., 1993, a.a.O., beschrieben worden ist.
• Die Cyclooxygenase hemmende Wirkung eines Medikaments kann mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise haben Boopathy & Balasubramanian, 1988, a.a.O., ein Verfahren beschrieben, wobei Prostaglandin-H-Synthase 1 (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan) bei 37ºC für einen Zeitraum von 20 min zusammen mit 100 uM Arachidonsäure (Sigma Chemical Co.), Kofaktoren (wie bspw. 1,0 mM Glutathion, 1,0 mM Hydrochinon (0,625 uM Hämoglobin und 1,25 mM CaCl&sub2; in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4) und dem zu testenden Medikament bebrütet wurde. Sodann kann die enzymatische Aktivität spektralphotometrisch bei 530 nm gemessen werden, nachdem die Reaktion durch Zugabe von Thiobarbitursäure und Malonaldehyd abgebrochen worden ist.
• Offensichtlich muss eine Verbindung, welche eine minimale COX-1 oder COX-2 hemmende Aktivität im Verhältnis zu ihrer größeren PDE5 hemmenden Aktivität aufweist, nicht völlig ungeeignet sein.
1. C. Auswertung der Ergebnisse
• Der Grad der Hemmungswirkung wird bestimmt, indem die Wirkung der Cyclooxygenase in Gegenwart und in Abwesenheit der Testsubstanz verglichen wird. Sofern die COX hemmende Wirkung bei einer Konzentration von etwa 100 uM verschwindet oder auf einen Restwert absinkt (d. h., weniger als etwa 25%), so zeigt dies an, dass die Verbindung für ihre Eignung zur Behandlung von Neoplasie weiter untersucht werden sollte. Vorzugsweise sollte die IC&sub5;&sub0;-Konzentration für eine Verbindung bei mehr als 1000 uM liegen, damit die Substanz weiterhin als potentiell geeignet eingestuft wird.
2. Bestimmung der Phosphodiesterase (PDE5) hemmenden Wirkung
• Verbindungen können hinsichtlich ihrer hemmenden Wirkung auf die Aktivität von Phosphodiesterase entweder unter Verwendung von Enzymen untersucht werden, welche von irgendeiner Tumorzelllinie wie HT-29 oder SW-480 isoliert worden sind, oder bspw. mittels neukombinierter HS-PDE5, oder durch Messung der Konzentration zyklischer Nucleotide in ganzen Zellen.
2. A. Enzym-Assay
• Die Aktivität von Phosphodiesterase kann durch Verwendung im Stand der Technik bekannter Verfahren ermittelt werden, bspw. mittels einem Verfahren, welches radioaktives ³H-cGMP (zyklisches 3',5'-Guanosin-monophosphat) als Substrat für das PDE5-Enzym verwendet (Thompson, W. J., Teraski, W. L., Epstein, P. M., Strada, S. J., "Advances in Cyclic Nucleotide Research", 10 : 69-92, 1979). Kurzgesagt, eine Lösung mit spezifischer Aktivität und ³H-cGMP-Substrat (0,2 uM; 100.000 cpm; enthaltend 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml BSA) wird mit dem zu untersuchenden Medikament in einem gesamten Volumen von 400 ul vermischt. Die Mischung wird über einen Zeitraum von 10 Minuten bei einer Temperatur von 30ºC mit partiell gereinigter PDE5 bebrütet, die von HT-29-Zellen isoliert wurde. Die Reaktionen werden abgebrochen, indem bspw. die Reaktionsmischung für 75 Sekunden gekocht wird. Nach Abkühlen mittels Eis werden 100 ul eines Schlangengifts (It. O. Hannah ist das Gift bei Sigma erhältlich) in einer Konzentration von 0,5 mg/ml hinzugegeben, und der Bebrütungsvorgang wird bei 30ºC für einen Zeitraum von 10 min. fortgesetzt. Diese Reaktion wird durch Hinzufügen eines Alkohols, bspw. 1 ml von 100-prozentigem Methanol, abgebrochen. Die Untersuchungsproben werden einer Anionensäulenchromatographie unterzogen (1 ml Dowex, von Aldrich) und mit 1 ml von 100-prozentigem Methanol gewaschen. Der Grad der Radioaktivität in den Abzugsprodukten und dem Sumpfprodukt der Säulen wird sodann mit einem Scintillationszähler gemessen. Der Grad der PDE5-Hemmung wird sodann ermittelt, indem die Radioaktivitätsmenge bei den mit dem Medikament behandelten Reaktionsprodukten berechnet und mit einer Kontrollprobe (einer Reaktionsmischung ohne die getestete Verbindung) verglichen wird.
2.B. Messung der zyklischen Nukleotide
• Alternativ hierzu spiegelt sich die Fähigkeit erwünschter Verbindungen zur Hemmung von PDE5 in einem Anstieg von cGMP bei neoplastischen Zellen wieder, welche einer zu testenden Verbindung ausgesetzt werden. Der Grad der PDE5-Aktivität kann ermittelt werden, indem die Menge des zyklischen GMP in dem Extrakt der behandelten Zellen unter Verwendung eines Radioimmunoassay (RIA) getestet wird. Bei diesem Verfahren werden HT-29- oder SW-480-Zellen auf Platten bis zum Zusammenfließen gezüchtet. Sodann wird die zu testende Verbindung mit der Zellkultur bei einer Konzentration der Verbindung zwischen etwa 200 uM und etwa 200 pM bebrütet. Etwa 24 bis 48 Stunden später wird der Kulturnährboden von den Zellen entfernt, und die Zellen werden aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch Verwendung von 0,2 N HCl/50% MeOH abgebrochen. Eine Probe wird zur Proteinuntersuchung abgenommen. Zyklisches GMP wird aus den Säure-/Alkohol-Extrakten der Zellen mittels Anionenaustauschchromatographie wie bspw. einer Dowex-Säule isoliert. Das eGMP wird getrocknet, gemäß den veröffentlichten Verfahren acetyliert, bspw. unter Verwendung von Essigsäureanhydrid in Triethylamin (Steiner, A. L., Parker, C. W., Kipnis, D. M., J. Biol. Chem., 247 4: 1106-13, 1971). Das acetylierte cGMP wird unter Verwendung von Radioimmunoassay-Verfahren (Harper, J., Brooker, G., Advances in Nucleotide Research, 10 : 1-33, 1979) quantitativ bestimmt. Jodierte Liganden (Tyrosinmethylester) von abgeleitetem zyklischem GMP werden in der Gegenwart von Antiseren und geeigneten Pufferlösungen mit Standardsubstanzen oder unbekannten Substanzen bebrütet. Das Antiserum kann unter Verwendung von auf zyklische Nucleotid-Haptene gerichteten Techniken hergestellt werden. Das Antiserum stammt von Schafen, welche mit Succinyl-cGMP-Albumin- Konjugationsverbindungen geimpft wurden, und ist im Verhältnis 1/20.000 verdünnt. Die Dosis-Interpolation und Fehleranalyse mittels Standardkurven wird wie bereits beschrieben angewendet (Seibert, A. F., Thompson, W. J., Taylor, A., Wilbourn, W. H., Barnard J. und Haynes, J., "J. Applied Physiol.", 72: 389-395, 1992).
• Zusätzlich kann der Kulturnährboden gesäuert werden, gefroren (-70ºC) und ebenfalls hinsichtlich cGMP und cAMP analysiert werden.
• Zusätzlich zu dem beobachtbaren, durch die erwünschten Testverbindungen verursachten Anstieg des cGMP-Anteils wurden Verminderungen des cAMP-Anteils beobachtet. Es wurde beobachtet, das eine besonders erwünschte Verbindung (d. h., eine Verbindung, die selektiv Apoptosis in neoplastischen Zellen auslöste, jedoch nicht in nennenswertem Umfang bei normalen Zellen) einem Zeitverlauf folgt, der mit einer Hemmung von PDE5 als Ursprungswirkung zusammenhängt, die innerhalb von Minuten zu einem erhöhten cGMP-Anteil führt. Zweitens führt die Behandlung neoplastischer Zellen mit einer erwünschten, antineoplastisch wirkenden Verbindung zu einer Verminderung des cAMP-Anteils innerhalb von 24 Stunden. Die intrazellulären Ziele der Medikamentenwirkungen werden weiter untersucht, aber die aktuellen Daten stützen das Konzept, dass sowohl der anfängliche Anstieg des cGMP-Anteils wie auch der anschließende Abfall des cAMP-Anteils der Apoptosis in neoplastischen, der gewünschten Verbindung ausgesetzten Zellen vorangeht.
• Die Veränderung in dem Verhältnis zwischen den zwei zyklischen Nucleotiden kann ein exakteres Werkzeug zur Bewertung der erwünschten PDE5-Hemmungswirkung von Testverbindungen sein verglichen mit einer Messung nur des Absolutwerts von cGMP, nur der PDE5-Hemmungswirkung, oder nur des absoluten Wertes von cAMP. Bei neoplastischen Zellen, welche nicht mit antineoplastisch wirkenden Verbindungen behandelt werden, ist das Verhältnis von cGMP-Anteil/cAMP-Anteil in dem Bereich von 0,03 - 0,05 (d. h., 300-500 fmol/mg des Proteinanteils von cGMP gegenüber 6000-8000 fmol/mg des Proteinanteils von cAMP). Nach einer Behandlung mit erwünschten antineoplastisch wirkenden Verbindungen erhöht sich das Verhältnis um ein mehrfaches (vorzugsweise mindestens ein Anstieg auf das dreifache) als Ergebnis des anfänglichen Anstiegs des zyklischen GMP und der späteren Reduzierung des zyklischen AMP.
• Es wurde beobachtet, dass insbesondere erwünschte Verbindungen bei behandelten neoplastischen Zellen typischerweise einen anfänglichen Anstieg in dem cGMP-Anteil auf ein cGMP-Niveau von mehr als 500 fmol/mg Protein erreichen. Zusätzlich verursachen besonders wünschenswerte Verbindungen bei behandelten neoplastischen Zellen später einen Abfall bei dem cAMP-Anteil auf ein cAMP-Niveau von weniger als 4000 fmol/mg Protein.
• Um den Anteil des zyklischen AMP zu bestimmen, werden Radioimmunoassaytechnologien verwendet, die ähnlich zu den oben für cGMP beschriebenen sind. Im Grunde werden zyklische Nucleotide von Säure-/Alkoholextrakten von Zellen gewonnen unter Verwendung der Anionenaustauschchromatographie, getrocknet, gemäß den beschriebenen Verfahren acetyliert und mittels Radioimmunoassay-Verfahren quantitativ erfaßt. Iodierte Liganden von abgeleitetem zyklischem AMP und zyklischem GMP werden mit. Standardsubstanzen oder unbekannten Substanzen in Gegenwart der spezifischen Antisera und geeigneter Pufferlösungen bebrütet.
• Eine Bestätigung des Anteils zyklischer Nucleotide lässt sich erreichen durch die Untersuchung des Umsatzes oder der Anhäufung von zyklischen Nucleotiden innerhalb von intakten Zellen. Um cAMP innerhalb von intakten Zellen zu messen, wird eine Vormarkierung mit ³H-Adenin gemäß dem veröffentlichten Verfahren vorgenommen (Whalin M. E., R. L. Garrett Jr., W. J. Thompson, und S. J. Strada: "Correlation of cell-free brain cyclic nucleotide phosphodiesterase activities to cyclic AMP decay in intact brain slices", Sec. Mess. and Phos. Protein Research, 12 : 311-325, 1989). Das Verfahren mißt den Übergang von markiertem ATP in zyklisches AMP und kann verwendet werden, um in Abhängigkeit von dem spezifischen Meßprotokoll die Wirksamkeit von Adenylatcyclase oder von zyklischer Nucleotidphosphodiesterase innerhalb von intakten Zellen abzuschätzen. Die Anhäufung von zyklischem GMP war zu niedrig, um mit den bekannten Verfahren zur Markierung intakter Zellen gemessen zu werden (Reynolds, P. E., S. J. Strada und W. J. Thompson: "Cyclic GMP accumulation in pulmonary microvascular endothelial cells measured by intact cell prelabeling," Life Sci., 60: 909-918, 1997).
2.C. Untersuchung von Gewebeproben
• Die PDE5 hemmende Wirkung einer Testverbindung kann auch mittels einer Gewebeprobe untersucht werden. Die Gewebeproben, bspw. aus der Leber von Säugetieren (insbesondere Ratten), werden Subjekten entnommen, welche der Testverbindung ausgesetzt waren. Kurz gesagt, eine Gewebeprobe wird in 500 ul von 6% TCA homogenisiert. Eine bekannte Menge des Homogenisats wird zur Proteinanalyse abgenommen.
• Das verbleibende Homogenisat kann sich innerhalb von 20 Minuten unter Einwirkung von Eis setzen, damit sich die Proteine niederschlagen können. Als nächstes wird das Homogenisat für 30 Minuten bei einer Temperatur von 4ºC und 15.000 g zentrifugiert. Der obenauf schwimmende Anteil wird entfernt und die groben Anteile werden entfernt. Der obenauf schwimmende Anteil wird viermal mit fünf Volumenteilen von mit Wasser gesättigtem Dieethylether gewaschen. Die obere Etherschicht wird zwischen jedem Waschdurchgang weggegossen. Der wässrige Etherextrakt wird in einem Schnellevakuierer getrocknet. In getrocknetem Zustand kann die Probe für zukünftige Anwendungen eingefroren oder sofort verwendet werden. Das getrocknete Extrakt wird in 500 ul der Assay-Puffersubstanz gelöst. Der Grad der PDE5-Hemmung wird bestimmt durch Untersuchung der Menge von zyklischen Nucleotiden mittels eines Enzymimmunoassay (EIA), wie bspw. dem Biotrak-EIA-System-Acetylierungsprotokoll (erhältlich von Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Alternativ dazu können RIA-Verfahren wie oben im Einzelnen beschrieben verwendet werden.
2. D. Auswertung der Ergebnisse
• Die Hemmungswirkung wird bestimmt durch Vergleich der Aktivität von PDE5 in der Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung. Die Hemmung der PDE5-Aktivität zeigt an, dass die Verbindung für die Behandlung von Neoplasie nützlich ist. Eine erhebliche Hemmungswirkung größer als die des Vergleichsproduktes Exisulind, vorzugsweise um mehr als 50% bei einer Konzentration von 10 uM oder niedriger, zeigt an, dass eine Verbindung weiterhin als antineoplastisch wirkend eingestuft werden sollte. Vorzugsweise sollte der IC&sub5;&sub0;-Wert für die Hemmung von PDE5 für eine Verbindung unterhalb von 50 uM liegen, um diese Verbindung weiterhin als potentiell einsatzfähig einzustufen.
3. Untersuchung, ob eine Verbindung die Anzahl von Tumorzellen vermindert
• Bei einer alternativen Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Auswahlverfahren weiterhin die Entscheidung, ob die Verbindung das Wachstum von Tumorzellen reduziert. Verschiedene Zelllinien können in Abhängigkeit von dem zu testenden Gewebe in dem Test verwendet werden. Beispielsweise umfassen diese Zelllinien: SW-480- Dickdarmadenokarzinom; HT-29 - Dickdarmadenokarzinom, A-427 - Lungenadenokarzinom; MCF-7 - Brustadenokarzinom; und UACC-375 - Melanomlinie; und DU145 - Prostatakarzinom. In der Verwendung derartiger Zeillinien erhaltene Zytotoxizitätsdaten weisen auf einen Hemmungseffekt bei neoplastischen Schädigungen hin. Diese Zelllinien sind gut charakterisiert und werden von dem nationalen Krebsinstitut der USA in deren Auswahlprogramm für neue Antikrebsmedikamente eingesetzt.
3. A. Tumorhemmung in einer KT-29-Zelllinie
• Die Fähigkeit einer Verbindung zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen kann in der Verwendung der menschlichen Dickdarmkarzinomzelllinie HT-29 gemessen werden, die aus ATCC erhalten wird (Bethesda, MD). HT-29-Zellen sind früher als relevantes Dickdarmtumorzellenkulturmodell beschrieben worden (Fogh, J. Trempe, G. in: "Human Tumor Cells in Vitro", J. Fogh (eds.), Plenuma Press, New York, pp. 115-159, 1975). HT- 29-Zellen werden in RPMI-Medien aufbewahrt, welche ergänzt werden mit 5% fötalem Serum (Gemini Bioproducts, Inc., Carlsbad, Kalifornien) und 2 mm Glutamin, und 1%- igem Antibiotikum-Antimykotikum in einer feuchten Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO&sub2; bei 37ºC. Kurz gesagt, HT-29-Zellen werden auf einer Platte gezüchtet mit einer Dichte von 500 Zellen/Vertiefung in Mikrotitrierplatten mit 96 Vertiefungen und vor Zugabe der Verbindung 24 Stunden lang bei 37ºC bebrütet. Jede Bestimmung einer Zellenanzahl umfaßte sechs Wiederholungen. Nach sechs Tagen in der Kultur wurden die Zellen durch Beifügung von kalter Trichloressigsäure auf eine endgültige Konzentration von 10% fixiert, und die Proteinkonzentrationen wurden gemessen unter Verwendung des kolorimetri< schen Schwefel-Rhodamin-B (SRB)-Proteinfarbtest, wie dieser bereits von Skehan, P., Storen, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J. T., Bokesch, H., Kenney, S., und Boyd, M. R.: "New Coloritmetric Assay for Anticancer-Drug Screening," J. Natl. Cancerlnst. 82: 1107-1112, 1990, beschrieben worden ist.
• Zusätzlich zu dem SRB-Test sind eine Reihe von anderen Verfahren zugänglich, um die Hemmung des Wachstums zu messen, und diese könnten anstelle des SRB-Tests durchgeführt werden. Diese Verfahren beinhalten das Zählen der lebensfähigen Zellen im Anschluß an eine Trypanblaufärbung, das Markieren von zur DNS-Synthese geeigrneten Zellen mit BrdU oder radioaktiv markiertem Thymidin, die neutrale Rotfärbung von lebensfähigen Zellen, oder die MTT-Färbung von lebensfähigen Zellen.
3. B. Auswertung der Ergebnisse
• Eine deutliche Hemmung des Tumorzellenwachstums um mehr als 50% bei einer Dosis von 100 uM oder darunter zeigt weiterhin an, dass die Verbindung sich für die Behandlung neoplastischer Schädigungen eignet. Vorzugsweise wird ein IC&sub5;&sub0;-Wert ermittelt und für Vergleichszwecke herangezogen. Dieser Wert ist äquivalent zu der Medikamentenkonzentration, welche benötigt wird, um das Tumorzellenwachstum um 50% im Verhältnis zu einer Gegenprobe zu hemmen. Vorzugsweise sollte der IC&sub5;&sub0;-Wert unterhalb von 100 uM liegen, damit die Verbindung weiterhin als geeignet für die Behandlung neoplastischer Schädigungen eingestuft wird.
4. Untersuchung, ob eine Verbindung Apoptosis auslöst
• Bei einer zweiten, modifizierten Ausführungsform umfaßt die erfindungsgemäße Auswahlmethode weiterhin die Ermittlung, ob die Verbindung in Kulturen von Tumorzellen Apoptosis auslöst.
• Anhand von morphologischen und biochemischen Kriterien können zwei unterschiedliche Formen des Zelltodes beschrieben werden: Necrosis und Apoptosis. Necrosis wird begleitet von einer verstärkten Durchlässigkeit der Plasmamembran; die Zellen schwellen an und die Plasmamembran reißt innerhalb von Minuten. Apoptosis ist gekennzeichnet durch eine Blasenbildung der Membran, einer Kondensation des Zytoplasmas und der Aktivierung von endogenen Endonukleasen.
• Von diesen beiden Formen ist die Apoptosis die üblichste Form des Todes von eukarioten Zellen. Sie tritt gewöhnlich während normaler Gewebeveränderungen und während der embryonalen Entwicklung von Organen und Gliedmaßen auf. Apoptosis wird auch durch zytotoxische T-Lymphozyten und durch natürliche Killerzellen ausgelöst, durch ionisierende Bestrahlung und durch verschiedene chemotherapeutische Medikamente. Es wird angenommen, dass eine unangemessene Regulierung der Apoptosis eine wichtige Rolle bei vielen pathologischen Zuständen einschließlich Krebs, AIDS, Alzheimerkrankheit, etc. spielt. Verbindungen können hinsichtlich der Auslösung von Apoptosis untersucht werden unter Verwendung von Tumorzellkulturen, welche unter den oben beschriebenen Bedingungen erhalten werden. Die Behandlung von Zellen mit Testverbindungen umfaßt entweder prä- oder post-konfluente Kulturen und die Behandlung für zwei bis sieben Tage unter verschiedenen Konzentrationen. Apoptotische Zellen werden sowohl in den festgelegten wie auch in den "fließenden" Kulturbereichen gemessen. Beide Bereiche werden eingesammelt, indem der obenauf schwimmende Anteil entfernt wird, die festliegenden Zellen mit Trypsin behandelt werden, und beide Behandlungen mit einem folgenden Zentrifugen-Wasch-Schritt (10 Minuten, 2000 U/min) kombiniert werden. Das Testprotokoll für die Behandlung von Tumorzellkulturen mit Sulindac und entsprechenden Verbindungen zwecks Erzeugung eines deutlichen Apoptosisgrades ist in der Literatur beschrieben worden (vgl. Piazza, G. A., et al.: "Cancer Research", 55: 3110-16, 1995). Die neuen Merkmale umfassen das Einsammeln sowohl der fließenden als auch der festgelegten Zellen, die Identifizierung von für die Beobachtung von Apoptosis optimalen Behandlungszeiten und Dosenbereichen, und die Erkennung von optimalen Zellkulturzuständen.
4. A. Morphologische Beobachtung der Apoptosis
• Im Anschluß an die Behandlung mit einer Testverbindung können die Kulturen auf Apoptosis und Necrosis mittels der Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden, nachdem sie mit Acridinorange und 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenyl-phenanthridiniumbromid markiert worden sind. Das Verfahren zur Messung der Anzahl von Zellen mit Apoptosiserscheinungen wurde bereits von Duke & Cohen, "Morphological and Biochemical Assays of Apoptosis", Current Protocols in Immunology, Coligan et al., eds., 3.17.1-3.17.16 (1992), beschrieben.
• Beispielsweise können fließende und festgelegte Zellen mittels einer Trypsin- Behandlung eingesammelt und dreimal in PBS gewaschen werden. Stichproben von Zellen können zentrifugiert werden. Der Kuchen kann sodann wieder in einen Nährboden und einer Färbungsmischung suspendiert werden, die Acridinorange und in PBS zubereitetes 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenyl-phenanthridiniumbromid enthält und behutsam zusammengemischt worden ist. Die entstandene Mischung kann sodann auf einen Objektträger gegeben und untersucht werden.
4. B. Analyse der Apoptosis mittels DNS-Fragmentation
• Die Apoptosis kann auch quantitativ bestimmt werden, indem ein Anstieg in der DNS- Fragmentierung innerhalb von mit der Testverbindung behandelten Zellen gemessen wird. Kommerzielle photometrische Enzymimmunoassays für die quantitative in vitro- Bestimmung der zytoplasmischen DNS-Fragment-assoziierten Histone (Mono- und Oligonukleosome) sind verfügbar (Cell Death Detection ELISAºkys, Cat. No. 1.774, 425, Boehringer, Mannheim). Das Testverfahren von Boehringer, Mannheim basiert auf einem Sandwich-Enzym-Immungssay-Prinzip unter Verwendung monoklonaler Antikörper von Mäusen, welche gegen DNS bzw. Histone gerichtet sind. Dies erlaubt die spezifische Bestimmung von Mono- und Oligonukleosomen in der zytoplasmischen Fraktion von Zell-Lysaten.
• Nach Angaben des Verkäufers wird Apoptosis auf die folgende Art gemessen. Die Probe (Zell-Lysate) wird auf eine mit Streptavidin überzogenen Mikrotitrierplatte ("MTP") gegeben. Anschließend wird eine Mischung aus Anti-Histon-Biotin und einer Anti-DNS- Peroxidase-Konjugationsverbindung hinzugefügt und für zwei Stunden bebrütet. Während der Inkubationszeit bindet sich der Anti-Histon-Antikörper an die Histon- Komponente der Nukleosomen und fixiert gleichzeitig den Immunkomplex über seine Biotinreaktion an der mit Streptavidin überzogenen MTP. Zusätzlich reagiert der Anti- DNS-Peroxidase-Antikörper mit der DNS-Komponente der Nukleosomen. Nach Entfernung der ungebundenen Antikörper durch eine Waschstufe wird die Menge der Nukleosomen durch die in dem Immunkomplex zurückgehaltene Peroxidase quantitativ bestimmt. Die Peroxidase wird photometrisch mit ABTS7 (2,2'-Azido-[3-ethylbenzthiazolinsulfonat])* als Substrat bestimmt.
• Beispielsweise werden SW-480-Dickdarmadenokarzinomzellen auf einer 96-muldigen MTP bei einer Dichte von 10.000 Zellen pro Mulde plaziert. Sodann werden die Zellen mit der Testverbindung behandelt, und dann gewährt man ihnen eine Inkubationszeit von 48 Stunden bei 37ºC. Nach der Inkubation wird die MTP zentrifugiert und der obere Flüssigkeitsanteil wird entfernt. Der Zellkuchen in jeder Mulde wird sodann wiederum in einer Lysis-Puffer-Substanz für 30 Minuten suspendiert. Die Lysate werden sodann zentrifugiert und Stichproben der oberen Flüssigkeitsfraktion (d. h. der zytoplasmischen Fraktion) werden auf eine mit Streptavidin überzogene MTP übertragen. Es wird sorgsam darauf geachtet, dass die Lysiskuchen (d. h. die Zellkerne, welche unfragmentierte DNS mit einem hohen Molekulargewicht enthalten) in der MTP nicht geschüttelt werden. Sodann werden die Proben analysiert.
• Der Grad der Stimulation (FS = ODmax/ODveh), ein Indikator für eine apoptotische Reaktion, wird für jede getestete Verbindung bei einer vorgegebenen Konzentration ermittelt. Darüber hinaus können auch EC&sub5;&sub0;-Werte ermittelt werden, indem eine Reihe von Konzentrationen der Testverbindung ausgewertet werden.
4. C. Auswertung der Ergebnisse
• Ein statistisch signifikanter Anstieg der Apoptosis (d. h., mehr als die zweifache Stimulation bei einer Konzentration von 100 uM) zeigt ferner an, dass die Verbindung für die Behandlung neoplastischer Schädigungen geeignet ist. Vorzugsweise sollte der EC&sub5;&sub0;- Wert für die Apoptosiswirkung unterhalb von 100 uM liegen, damit eine Verbindung weiterhin als potentiell nützlich für die Behandlung neoplastischer Schädigungen eingestuft wird. EG50 ist hierbei als diejenige Konzentration definiert, welche eine 50%-ige Auslösung der Apoptosis im Verhältnis zu einer Behandlung mit dem reinen Vehikulum bewirkt.
5. Gültigkeitsprüfung anhand des Brustdrüsenorgankulturmodells
• Durch die oben beschriebenen Verfahren identifizierte Testverbindungen können auf ihre antineoplastische Aktivität anhand ihrer Fähigkeit zur Hemmung des Auftretens von präneoplastischen Schädigungen in einem Brustdrüsenorgankultursystem getestet werden. Diese Technik, welche auf eine Brustdrüsenorgankultur von Mäusen zurückgreift, wurde von anderen Forschern erfolgreich angewendet, um die Wirkungen bekannter antineoplastischer Wirkstoffe wie NSAIDs, Retinoide, dem Östrogenblocker Tamoxifen, Selen und gewissen natürlichen Produkten zu studieren, und ist nützlich für die Gültigkeitsprüfung der erfindungsgemäßen Auswahlmethode.
• Bspw. können weibliche BALB/c-Mäuse täglich mit einer Kombination von Östradiol und Progesteron behandelt werden, um die Drüsen zu aktivieren, so dass diese in vitro auf Hormone reagieren. Die Tiere werden geopfert, und die Brustdrüsen des Torax werden aseptisch exzidiert und für einen Zeitraum von 10 Tagen einer Inkubation auf einem mit Insulin, Prolactin, Hydrokortison und Aldosteron ergänzten Nährboden ausgesetzt. DMBA (7,12-Dimethylbenz(a)anthrazen) wird zugegeben, um die Ausbildung von prämalignen Schäden auszulösen. Den voll entwickelten Drüsen werden sodann Prolactin, Hydrokortison und Aldosteron entnommen, was zu einem Rückgang der Drüsen, nicht jedoch der prämalignen Schäden, führt.
• Die Testverbindung wird in DMSO gelöst und dem Kulturnährboden für die Dauer der Kulturperiode hinzugefügt. Am Ende der Kulturperiode werden die Drüsen in 10%-igem Formalin fixiert, mit Alauncarmin gefärbt und auf Glasträgern montiert. Der Umfang des Auftretens von Brustschäden ist das Verhältnis von Drüsen mit Brustschäden und Drüsen ohne Schäden. Die Häufigkeit von Brustschäden in mit der Testverbindung behandelten Drüsen wird mit der bei unbehandelten Drüsen verglichen.
• Das Ausmaß des von den Drüsenschädigungen eingenommenen Bereichs kann quantitativ ermittelt werden, indem ein Bild der Drüse auf ein Digitalisiertablett projiziert wird. Die von der Drüse bedeckte Fläche wird auf dem Tablett nachgezogen und als 100% des Bereichs angesehen. Der von jeder der nicht zurückentwickelten Strukturen bedeckte Bereich wird ebenfalls auf dem Digitalisiertablett umrissen und durch den Computer quantitativ erfaßt.
Experimenteller Teil
• Eine Reihe von Testverbindungen wurden nach den verschiedenen Protokollen untersucht und hinsichtlich ihrer potentiellen Verwendbarkeit zur Behandlung von Neoplasie selektiert. Die Ergebnisse dieser Tests werden weiter unten wiedergegeben. Die Testverbindungen werden im folgenden mit einem Buchstabencode bezeichnet, der mit folgenden Substanzen korrespondiert:
• A- Rac-threo-(E)-1-(N,N'-diethylaminethanthio)-1-(butan-1',4'-olido)-[3',4':1,2]-6-fluor- 2-methyl-3-(p-methylsulfonylbenzyliden)-indan;
• B- (Z)-5-Fluor-2-methyl-1-(3,4,5-trimethoxybenzyliden)-3-essigsäure;
• C- (Z)-5-Fluor-2-methyl-1-(p-chlorbenzyliden)-3-essigsäure;
• D - Rac-(E)-1-(butan-1',4'-olido)-[3',4': 1,2]-6-fluor-2-methyl-3-(p-methylsulfonylbenzyliden)-1S-indanyl-N-acetylcystein;
• E- (Z)-5-Fluor-2-methyl-1-(3,4,5-trimethoxybenzyliden)-3-indenylacetamid,N-benzyl;
• F- (Z)-5-Fluor-2-methyl-1-(p-methylsulfonylbenzyliden)-3-indenylacetamid,N,N'-dicyclohexyl;
• G- ribo-(E)-1-Triazolo-[2',3':1",3"]-1-(butan-1',4'-olido)-[3',4':1,2]-6-fluor-2-methyl-3- (p-methylsulfonylbenzyliden)-indan; und
• H- rac-(E)-1-(butan-1',4'-olido)-[3',4': 1,2]-6-fluor-2-methyl-3-(p-methylsulfonylbenzyliden)-1S-indanyl-glutathion).
Beispiel 1 - Test der COX-Hemmung
• Vergleichsverbindungen und Testverbindungen wurden hinsichtlich ihrer COX hemmenden Aktivität gemäß dem COX-Meßprotokoll aus dem obigen Abschnitt 1.B. analysiert. Fig. 1 zeigt die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen sowohl von Sulindac- Sulfid wie auch von Exisulind auf die Aktivität von gereinigter Cyclooxygenase (Typ 1). Die Aktivität der Cyclooxygenase wurde ermittelt unter Verwendung gereinigter Cyclooxygenase von den Vesiculae seminalis von Schafböcken, wie bereits beschrieben (Mitchell et al. vgl. oben). Der IC-50-Wert für Sulindac-Sulfid wurde nährungsweise zu 1,76 uM gerechnet, während derjenige für Exisulind größer als 10.000 uM war. Diese Daten zeigen, daß Sulindac-Sulfid, jedoch nicht Exisulind, ein COX-1-Inhibitor ist. Ähnliche Daten wurden für das COX-2-Isoenzym erhalten (Thompson, et al., Journal of the National Cancer Institute, 87: 1259-1260, 1995).
• Fig. 2 zeigt die Wirkung der Testverbindungen B und E bei der Hemmung von COX. Die COX-Aktivität wurde wie für die in Fig. 1 wiedergegebenen Verbindungen ermittelt. Die Daten zeigen, daß beide Testverbindungen B und E COX-1 nicht nennenswert hemmen.
Tabelle 1: Cyclooxygenase hemmende Wirkung der Verbindungen Vergleichsverbindungen prozentuale Hemmungswirkung bei 100 uM
• Indomethacin 95
• MY5445 94
• Sulindac Sulfid 97
• Exisulind < 25
Testverbindungen prozentuale Hemmungswirkung bei 100 uM
• A < 25
• B < 25
• C 87
• D < 25
• E < 25
• Gemäß dem Meßprotokoll nach dem obigen Abschnitt 1.B. wurden die Verbindungen A bis E hinsichtlich ihrer COX hemmenden Aktivität gemäß der obigen Tabelle 1 untersucht. Es stellte sich heraus, daß die Verbindung C die COX bei einer Dosis von 100 uM um mehr als 25% hemmte und aus diesem Grunde nicht für die weitere Beurteilung ausgewählt werden würde.
Beispiel 2 - Test der PDE5-Hemmung
• Vergleichsverbindungen und Testverbindungen wurden hinsichtlich Ihrer PDE5 hemmenden Wirkung gemäß dem Meßprotokoll aus dem obigen Abschnitt 2.A. analysiert. Fig. 3 zeigt den Einfluß verschiedener Konzentrationen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf die Aktivität von entweder PDE4 oder PDE5, jeweils isoliert von in einer Kultur gezüchteten, menschlichen HT-29-Dickdarmtumorzellen, wie zuvor beschrieben (W. J. Thompson et al., vgl. oben). Der IC&sub5;&sub0;-Wert von Sulindac-Sulfid für die Hemmung von PDE4 lag bei 41 uM, und für die PDE5-Hemmung bei 17uM. Der IC&sub5;&sub0;-Wert von Exisulind für die Hemmung von PDE4 lag bei 181 uM und für die PDE5-Hemmung bei 56 uM.
• Diese Daten zeigen, daß sowohl Sulindac-Sulfid wie Exisulind die Aktivität von Phosphodiesterase hemmen. Beide Verbindungen zeigen eine Selektivität für die PDES- Isoenzym-Form.
• Fig. 4 zeigt den Einfluß von Sulindac-Sulfid auf die Produktion von cGMP einerseits und cAMP andererseits, wie er anhand von HT-29-Zellkulturen gemäß dem Test nach dem obigen Abschnitt 2.8. ermittelt wurde. Die HT-29-Zellen wurden mit Sulindac-Sulfid über einen Zeitraum von dreißig Minuten behandelt, und cGMP oder cAMP wurden mit der herkömmlichen Radioimmunoassay-Methode gemessen. Wie angedeutet, erhöhte Sulindac-Sulfid die cGMP-Konzentration um mehr als 50% mit einem EC&sub5;&sub0;-Wert von 7,3 uM (oben). Die Konzentration von cAMP wurde durch die Behandlung nicht beeinflußt, obwohl ein bekannter PDE4-Inhibitor, nämlich Rolipram, die cAMP-Konzentration erhöhte (unten). Die Daten demonstrieren die pharmakologische Bedeutung der Hemmung von PDE5 im Verhältnis zu PDE4.
• Fig. 5 veranschaulicht den Einfluß der angezeigten Dosis der Testverbindung B auf die PDE5-Isozyme der Phospodiesterase einerseits und auf PDE4 andererseits. Der berechnte IC&sub5;&sub0;-Wert für PDE5 war 18uM und 58uM für PDE4.
• Fig. 6 veranschaulicht den Einfluß der angezeigten Dosis der Testverbindung E auf PDE4 einerseits und PDE5 andererseits. Der berechnete IC&sub5;&sub0;-Wert lag bei 0,08 uM für PDE5 und bei mehr als 25uM für PDE4.
Tabelle 2: PDE5 hemmende Wirkung der Verbindungen Vergleichsverbindungen prozentuale Hemmungswirkung bei 10 uM
• Indomethacin 34
• MY5445 86
• Sulindac Sulfid 97
• Exisulind 39
Testverbindungen prozentuale Hemmungswirkung bei 10 uM
• A < 25
• B < 25
• C < 25
• D 36
• E 75
• Die obigen Verbindungen aus Tabelle 2 wurden hinsichtlich ihrer PDE hemmenden Aktivität bewertet, wie in dem Protokoll gemäß dem obigen Abschnitt 2.A. beschrieben. Man fand heraus, daß von den Verbindungen, welche COX nicht hemmten, nur die Verbindung E bei 10 uM eine Hemmung von mehr als 50% verursachte. Wie in Fig. 11 angemerkt, zeigte die Verbindung B eine Hemmung von mehr als 50% bei einer Dosis von 20 uM. Aus diesem Grunde könnten einige Verbindungen in Abhängigkeit von dem Dosierungsniveau bei einem Test mit einer einzigen Dosis ausgeschieden werden, welche andererseits bei geringfügig erhöhten Dosen wirksam sein könnten. Die verwendete Dosis ist subjektiv und kann um ein gewisses Niveau gesenkt werden, nachdem aktive Verbindungen gefunden wurden, um noch kräftigere Verbindungen zu erkennen.
Beispiel 3 - Test der Apoptosis
• Vergleichsverbindungen und Testverbindungen wurden hinsichtlich ihrer PDE5 hemmenden Aktivität gemäß dem Untersuchungsprotokoll nach den obigen Abschnitten 4.A und 4.B. analysiert. Nach dem Test gemäß 4.A. zeigt Fig. 7 den Einfluß von Sulindac- Sulfid und Exisulind auf den Zelltod durch Apoptosis und durch Necrosis. HT-29-Zellen wurden über sechs Tage hinweg mit der angezeigten Dosis von Sulindac-Sulfid einerseits und Exisulind andererseits behandelt. Der Zelltod durch Apoptosis und Necrosis wurde bereits früher untersucht (Duke und Cohan in: Current Protocols in Immunology, 3.17.1-3.17.16, New York, John Wiley and Sons, 1992). Die Daten zeigen, daß sowohl Sulindac-Sulfid wie auch Exisulind in der Lage sind, Zelltod durch Apoptosis zu verursachen, ohne Necrosis auszulösen. Alle Daten stammen von demselben Experiment.
• Gemäß dem Test 4.8. zeigt Fig. 8 den Einfluß von Sulindac-Sulfid und Sulfon auf die Hemmung von Tumorwachstum und auf die Auslösung von Apoptosis, was anhandeiner DNS-Fragmentation ermittelt wurde. Obere Figur: Wachstumshemmung (offene Symbole, rechte Achse) und DNS-Fragementierung (geschlossene Symbole, linke Achse) durch Exisuünd. Untere Figur: Wachstumshemmung (offene Symbole) und DNS- Fragmentierung (geschlossene Symbole) bei Sulindac-Sulfid. Die Wachstumshemmung wurde anhand des SRB-Tests nach sechs Tagen Behandlungszeit ermittelt. Die DNS- Fragmentierung wurde nach 48 Stunden Behandlungszeit ermittelt. Alle Daten stammen von demselben Experiment.
• Fig. 9 zeigt die Apoptosis auslösenden Eigenschaften der Verbindung E. HT-29- Dickdarm-Adenokarzinomzellen wurden mit der angezeigten Konzentration der Verbindung E für einen Zeitraum von 48 Stunden behandelt, und die Apoptosis wurde anhand des DNS-Fragmentierungstests ermittelt. Der berechnete EC&sub5;&sub0;-Wert lag bei 0,05 uM. Fig. 10 zeigt die Apoptosis auslösenden Eigenschaften der Verbindung B. HT-29- Dickdarm-Adenokarzinomzellen wurden mit der angezeigten Konzentration der Verbindung B über einen Zeitraum von 48 Stunden hinweg behandelt, und Apoptosis wurde anhand des DNS-Fragmentierungstests ermittelt. Der berechnete EC&sub5;&sub0;-Wert lag etwa bei 175 uM.
Tabelle 3: Apoptose auslösende Eigenschaften der Verbindungen Vergleichsverbindungen x-fache Auslösung bei 100 uM
• Indomethacin < 2.0
• MY5445 4.7
• Sulindac Sulfid 7.9
• Exisulind < 2.0
Testverbindungen x-fache Auslösung bei 100 piM
• A < 2.0
• B 3.4
• C 5.6
• D < 2.0
• E 4.6
• Gemäß dem Protokoll nach dem obigen Abschnitt 4.B, wurden die Verbindungen A bis E hinsichtlich ihrer Apoptosis auslösenden Aktivität untersucht, wie in der obigen Tabelle wiedergegeben. Die Verbindungen B, C und E zeigten eine deutliche Apoptosis auslösende Aktivität, mehr als 2,0-fach, bei einer Dosis von 100 uM. Von diesen drei Verbindungen hemmten nur B und E bei dieser Dosierung PDE5, nicht jedoch COX.
• Die Apoptosis auslösende Aktivität für eine Reihe von Phosphodiesterase-Inhibitoren wurde ermittelt. Die Daten sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengestellt. HT-29- Zellen wurden über einen Zeitraum von sechs Tagen mit verschiedenen Inhibitoren für Phosphodiesterase behandelt. Der Apoptosis- und Necrosis-Grad wurde nach einer Markierung mit AcridinOrange und 3.8-Diamino-5-ethyl-6-phenyl- phenanthridiniumbromid gemäß dem Test nach dem obigen Abschnitt 4.A. morphologisch ermittelt. Die Daten zeigen, daß PDE5 hilfreich bei der Auswahl von Verbindungen ist, welche bei HT-29-ZeIlen Apoptosis auslösen. Tabelle 4: Apoptose-Werte von PDE-Inhibitoren
Beispiel 4 - Test der Wachstumshemmung
• Vergleichsverbindungen und Testverbindungen wurden hinsichtlich ihrer PDE5 hemmenden Aktivität gemäß dem Testprotokoll nach dem Abschnitt 3.A. analysiert. Fig. 11 zeigt die hemmende Wirkurig verschiedener Konzentrationen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf das Wachstum von HT-29-Zellen. HT-29-Zellen wurden wie dargestellt über einen Zeitraum von sechs Tagen mit verschiedenen Dosen von Exisulind (Dreieicke) oder Sulfid (Quadrate) behandelt. Die Zellenanzahl wurde mittels einem Schwefel-Rhodamin-Test gemessen, wie bereits beschrieben (Piazza et al., Cancer Research, 55: 3110-3116, 1995). Der IC&sub5;&sub0;-Wert für Sulfid lag etwa bei 45 uM und bei 200 uM für das Sulfon. Die Daten zeigen, daß sowohl Sulindac-Sulfid wie auch Exisuünd in der Lage sind, das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen.
• Fig. 12 zeigt die wachstumshemmende und Apoptosis auslösende Wirkung von Sulindac-Sulfid. Dargestellt ist der Zeitverlauf des Experimentes, wobei HT-29-Zellen mit dem Vehiculum einerseits, nämlich 0,1-prozentigem Dimethylsulfoxyd (offene Symbole) und mit Sulindac-Sulfid, 120 uM (geschlossene Symbole) andererseits behandelt wurden. Die Wachstumshemmung (oben) wurde durch Auszählen lebensfähiger Zellen nach einer Trypanblaufärbung gemessen. Die Apoptosis (unten) wurde gemessen durch morphologische Untersuchung nach Einfärbung mit Acridinorange und 3,8-Diamino-5-ethyl- 5-phenyl-phenanthridiniumbromid, wie zuvor beschrieben (Duke und Cohan in: Current Protocols in Immunology, 3.17.1-3.17.16, New York, John Wiley and Sons, 1992). Die Daten demonstrieren, daß Sulindac-Sulfid in der Lage ist, das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen, und daß der Effekt von einer Zunahme der Apoptosis begleitet ist. Alle Daten stammen von demselben Experiment.
• Fig. 13 zeigt die wachstumshemmende Wirkung der Testverbindung E. HT-29- Dickdarmadenokarzinomzellen wurden mit der angezeigten Konzentration der Verbindung E über einen Zeitraum von sechs Tagen hinweg behandelt, und die Zellenanzahl wurde mit der SRB-Testmethode untersucht. Der berechnete IC&sub5;&sub0;-Wert lag bei 0,04 uM.
Tabelle 5: Wachstumshemmende Wirkung von Verbindungen Vergleichsverbindungen prozentuale Hemmungswirkung bei 100 uM
• Indomethacin 75
• MY5445 88
• Sulindac Sulfid 88
• Exisulind < 50
Testverbindungen prozentuale Hemmungswirkung bei 100 uM
• A 68
• B 77
• C 80
• D 78
• E 62
• Gemäß dem Selektierungsprotokoll nach dem obigen Abschnitt 3.A. wurden die Verbindungen A bis E hinsichtlich ihrer wachstumshemmenden Wirkung untersucht, wie in der obigen Tabelle 5 wiedergegeben. Alle Testverbindungen zeigten eine den Referenzwert von Exisulind bei einem Test mit einer einzigen Dosis von 100 uM übersteigende Aktivität.
• Die wachstumshemmende Wirkung für ein Reihe von Phosphodiesterase-Inhibitoren wurde ermittelt. Die Daten sind in der folgenden Tabelle 6 wiedergegeben. HT-29-Zellen wurden über einen Zeitraum von sechs Tagen hinweg mit verschiedenen Inhibitoren für Phosphordiesterate behandelt. Das Zellwachstum wurde nach der SRB-Meßmethode gemäß dem obigen Abschnitt 3.A. ermittelt. Die Daten zeigen, daß die Inhibitoren für PDE5 das Wachstum von Tumorzellen wirksam hemmen. Tabelle 6: Wachstumshemmende Wirkung von PDE-Inhibitoren
• Um die Wirksamkeit dieses Selektierungsverfahrens auf verschiedene Formen von Neoplasie aufzuzeigen, wurden die Verbindungen mit einer Vielzahl von Zell-Linien getestet. Die Wirkungen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf verschiedene Zell-Linien wurden ermittelt. Die Daten sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengestellt. Die 1050-Werte wurden mit der SRB-Meßmethode ermittelt. Die Daten zeigen die breite Wirksamkeit dieser Verbindungen auf einem weiten Bereich von Neoplasie, mit Wirksamkeit über einen vergleichbaren Dosisbereich. Deshalb sollten durch die vorliegende Erfindung erkrankte Verbindungen für die Behandlung einer Vielzahl von Neoplasieformen nützlich sein. Tabelle 7: Wachstumshemmende Wirkung in verschiedenen Zellinien
Beispiel 5 - Wirkung bei dem Brustdrüsenorgankulturmodell
• Fig. 14 zeigt die Hemmung von prämalignen Schäden in einer Brustdrüsenorgankultur durch Sulindac-Metaboliten. Das Brustdrüsenorgankulturexperiment wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Mehta und Moon, Cancer Research, 46: 5832-5835, 1986). Die Ergebnisse zeigen, daß Sulindac und Exisuünd die Bildung von prämalignen Schäden hemmen, während Sulindac-Sulfid nicht aktiv war. Die Daten unterstützen die Hypothese, daß die Cyclooxygenase-Hemmung für die antineoplastischen Eigenschaften der erwünschten Verbindungen nicht notwendig ist.
Auswertung
• Um Verbindungen, welche sich für die Behandlung von Neoplasie eignen, zu identifizieren, schafft die Erfindung eine Rationalisierung für den Vergleich von experimentellen Daten der Testverbindungen aus verschiedenen Protokollen. Innerhalb des erfindungsgemäßen Rahmens können Testverbindungen gemäß ihrer möglichen Anwendbarkeit bei der Behandlung von Neoplasie beim Menschen eingeordnet werden. Diese Verbindungen mit wünschenswerten Wirkungen können für die teureren und zeitaufwendigen Tierversuche ausgewählt werden, welche erforderlich sind, um vor der Einleitung klinischer Versuche am Menschen eine Bestätigung zu erhalten.
• Qualitative Daten von verschiedenen Testverbindungen und die verschiedenen Protokolle sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben. Die Daten zeigen, daß Exisulind, die Verbindung B und die Verbindung E eine ausreichende Wirksamkeit zeigen, um den Auswahltest hinsichtlich von vier Untersuchungen zu bestehen: Fehlende COX- Hemmung, PDE-Hemmung, Wachstumshemmung und Apoptosis-Auslösung. Die Wirksamkeit dieser Verbindungen in der Brustdrüsenorgankultur bestätigt die Effektivität der vorliegenden Erfindung. Die qualitativen Bewertungen des Auswahlprotokolls ordnen die Verbindung E am besten ein, darauf folgt die Verbindung B und sodann Exisulind. Tabelle 8: Aktivitätsprofil von verschiedenen Verbindungen
• Legende zu Tabelle 8: Die Aktivität der Verbindungen basiert auf der Auswertung einer Vielzahl von Experimenten einschließlich Experimenten zur maximalen Aktivität und Leistungsfähigkeit.
• - Nicht aktiv
• + ganz wenig aktiv
• + + etwas aktiv
• + + + sehr aktiv
• + + + + Höchste, jemals zuvor beschriebene Aktivität
• Offensichtlich sind im Licht der obigen Lehrsätze zahllose Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich. Deshalb sollte darauf hingewiesen werden, daß die Erfindung im Rahmen der beigefügten Ansprüche auch auf anderem Wege als im einzelnen beschrieben ausgeführt werden kann.

Claims (18)

1. Verfahren zur Identfizierung von zur Behandlung von Neoplasie geeigneten Verbindungen mit folgenden Verfahrensschritten:

- Bestimmung der Cyclooxygenase (COX) hemmenden Wirkung der Verbindung; und

- Bestimmung der cGMP-speziflschen PDE-Hemmungswirkung der Verbindung durch Ermittlung der Wirkung gegenüber der cGMPspezfischen PDE-Enzym-Aktivüät;

- wobei eine Eignung der Verbindung zur Behandlung von Neoplasie angezeigt wird, wenn die Cyclooxygenase hemmende Wirkung niedriger ist als die Hemmungswirkung der cGMPspezifischen PDE-Aktivität

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die PDE vom Typ PDE5 ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, ferner gekennzeichnet durch den Verfahrenschritt

- Untersuchung, ob die Verbindung das Wachstum von Tumorzellen in einer Zellkultur hemmt;

- wobei eine Eignung der Verbindung zur Behandlung von Neoplasle angezeigt wird, wenn das Tumorzellenwachstum gehemmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die COX hemmende Aktivität der Verbindung auf folgende Weise bestimmt wird:

- Man bringt die Verbindung mit gereinigter Cyclooxygenase in Kontakt und

- mißt die Veränderung der Wirksamkeit der Cyclooxygenase, falls eine solche feststellbar ist;

- wobei eine die COX hemmende Wirkung von weniger als 25% bei einer Konzentration von etwa 100 uM anzeigt, dass die Verbindung als geeignet zur Behandlung von Neoplasie eingestuft werden sollte.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die COX hemmende Aktivität der Verbindung auf folgende Weise bestimmt wird:

- Man bringt die Verbindung mit einer Zelle in Kontakt, welche PGE- 2 ausschüttet; und

- mißt den Rückgang der PGE-2-Abscheidung der Zelle, falls ein solcher feststellbar ist;

- wobei einem Rückgang der PGE-2-Abscheidung auch ein Rückgang der Prostaglandin-Synthesewirkung entspricht.

6. Verfahren nach Anspruch 3, ferner gekennzeichnet durch den Verfahrenschritt

- Untersuchung, ob die Verbindung bei einer Tumorzelle Apoptosis auslöst;

- wobei die Auslösung von Apoptosis weiterhin die Eignung der Verbindung zur Behandlung von Neoplasie anzeigt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, ferner gekennzeichnet durch den Verfahrenschritt

- Untersuchung, ob die Verbindung das Wachstum von Tumorzellen in einer Probe hemmt;

- wobei eine Hemmung des Wachstums von Tumorzellen weiterhin die Eignung der Verbindung zur Behandlung von Neoplasie anzeigt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die PDE5- Aktivität auf folgende Weise bestimmt wird:

- Die Verbindung wird mit einer Zellkultur in Kontakt gebracht; und

- Bestimmung der intrazellulären Konzentration von cyclischem GMP;

- wobei eine PDE-Hemmungs-Wirkung von mehr als 50% bei einer Konzentration von 10 uM anzeigt, dass die Verbindung als geeignet für die Behandlung von Neoplasie eingestuft werden sollte.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die PDE5- Aktivität auf folgende Weise bestimmt wird:

- Bestimmung des Konzentrationsverhältnisses von intrazellulärem cyclischem GMP zu cyclischem AMP;

- wobei eine Erhöhung dieses Verhältnisses auf mehr als das Dreifache bei einer Konzentration von 10 uM anzeigt, dass die Verbindung als geeignet für die Behandlung von Neoplasie eingestuft werden sollte.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Apoptosis auf folgende Weise untersucht wird:

- Man bringt die Verbindung in Kontakt mit einer Zellkultur; und

- Untersucht, ob die Verbindung die Konzentration an fragmentierter DNS in dem Zytoplasma erhöht;

- wobei ein Anstieg der Apoptosis auf mehr als die zweifache Stimulation bei einer Konzentration von 100 uM anzeigt, dass die Verbindung als geeignet für die Behandlung von Neoplasie eingestuft werden sollte.

11. Verfahren zur Auswahl einer Verbindung für die Behandlung von Neoplasle, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:

- Untersuchung der wachstumshemmenden Wirkung der Verbindung, auf neoplastische Zellen;

- Untersuchung der cGMP-spezifischen, PDE5 hemmenden Wirkung der Verbindung; und

- Auswahl derjenigen Verbindung, welche sowohl eine wachstumshemmende Wirkung als auch eine cGMP-spezifische, enzymhemmende Wirkung aufweist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die PDE vom Typ PDE5 ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11, ferner gekennzeichnet durch den Verfahrenschritt:

- Auswahl derjenigen Verbindung zur Behandlung von Neoplasie, bei welcher der IC&sub5;&sub0;-Wert für die wachstumshemmende Wirkung weniger als etwa 100 uM beträgt.

14. Verfahren nach Anspruch 11, ferner gekennzeichnet durch den Verfahrenschritt:

- Untersuchung, ob die Verbindung in einer Zelle Apoptosis auslöst; und

- Auswahl derjenigen Verbindung, welche Apoptosis auslöst.

15. Verfahren nach Anspruch 13, ferner gekennzeichnet durch den Verfahrenschritt:

- Auswahl derjenigen Verbindung, bei welcher der ECK-Wert für die Apoptosis-Wirkung weniger als etwa 100 uM beträgt.

16. Verfahren nach Anspruch 12, ferner gekennzeichnet durch die Verfahrenschritte:

- Untersuchung der COX hemmenden Wirkung der Verbindung; und

- Auswahl derjenigen Verbindung, deren COX hemmende Wirkung niedriger ist als ihre PDE-5 hemmende Wirkung.

17. Verfahren zur Identifizierung einer zur Behandlung von Neoplasie geeigneten Verbindung mit folgenden Verfahrensschritten:

- Auswahl einer Verbindung mit cGMP-spezifischer; PDE hemmenden Wirkung; und

- Untersuchung der der Verbindung auf ihre wachstumshemmende Wirkung auf neoplastische Zellen;

- wobei sich eine Verbindung, welche sowohl die cGMP-spezifische Enzym-Hemmungswirkung als auch die wachstumshemmende Wirkung auf neoplastische Zellen zeigt, zur Hemmung von Neoplasmen eignet, ohne das Wachstum normaler Zellen merklich zu beeinträchtigen.

18. Verfahren zur Identifizierung einer zur Behandlung von Neoplasie geeigneten Verbindung mit folgenden Verfahrensschritten:

- Behandlung neoplastischer Zellen mit der zu bewertenden Verbindung;

- Untersuchung der intrazellulären Menge von cGMP in den behandelten Zeilen;

- Untersuchung der intrazellulären Menge von cAMP in den behandelten Zellen;

- wobei eine Erhöhung des Verhältnisses von cGMP zu cAMP in den behandelten Zellen gegenüber dem Verhältnis von cGMP zu cAMP in den unbehandelten neoplastischen Zeilen die Eignung der Verbindung für die Behandlung von Neoplasle anzeigt.