JPH1194823A - 腫瘍性病変を抑制する化合物の同定方法 - Google Patents

腫瘍性病変を抑制する化合物の同定方法

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JPH1194823A JP10150033A JP15003398A JPH1194823A JP H1194823 A JPH1194823 A JP H1194823A JP 10150033 A JP10150033 A JP 10150033A JP 15003398 A JP15003398 A JP 15003398A JP H1194823 A JPH1194823 A JP H1194823A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】哺乳動物の腫瘍症の治療に有用な化合物を同定
する方法を提供すること。 【解決手段】化合物のホスホジエステラーゼ阻害活性
を、ＣＯＸ阻害活性と一緒に測定する。培養された腫瘍
細胞への影響を含む成長抑制及びアポトーシスも測定す
る。ホスホジエステラーゼ阻害、成長抑制、アポトーシ
ス誘導を示す化合物は、実質的なプロスタグランジン阻
害活性は示さないが、腫瘍症の治療には望ましい。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳類の前癌性及
び癌性病変の治療及び予防に有用な化合物の同定方法に
関する。本出願は、米国特許出願第08/866,027号明細書
（Piazzaら、1997年5 月30日提出）の一部継続出願であ
る。
【０００２】
【従来の技術】家族性アデノーマポリープ症(「ＦＡＰ」)
は、遺伝疾病であって、その患者の結腸は、多くの場
合、実質的に数えられない程多くのポリープ又はアデノ
ーマを含む。そのような患者は、それぞれが癌に発展す
る重大なリスクを負う非常に多くのポリープ又はアデノ
ーマを発症するので、典型的な治療は、結腸の外科的除
去である。1983年頃、Waddell は、非ステロイド性抗炎
症性薬(「ＮＳＡＩＤ」)、スリンダクをＦＡＰ患者に投与
すると、結腸ポリープ（一種の前癌性病変）を消失しか
つその再発を防止することを発見した。スリンダクにつ
いてのＦＡＰ患者におけるWaddell の経験は、いくつか
の後の研究で確証された。残念ながら、スリンダク及び
他のＮＳＡＩＤは、長期投与している患者の消化系（腎
臓及び正常な血液凝固の阻止等の副作用はもちろんのこ
と）を悪化させるので、これは、長期投与が必要なＦＡ
Ｐ又は他の癌又は前癌性の徴候の（即ち、腫瘍症）、実
際的な治療にはならない。
【０００３】Waddell は、当初、結腸ポリープにおける
スリンダクの作用のメカニズムが、プロスタグランジン
（ＰＧ）の合成の阻害を含むと仮定した(Waddell,W.R.
ら、「Sulindac for Polyposis of the colon 」、Jour
nal of Surgical Oncology、24、83〜87頁、1983年) 。
プロスタグランジン(「ＰＧ」)合成の阻害は、ＮＳＡＩＤ
が引き起こすシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の阻害に
起因する。ＮＳＡＩＤの共通の利益は、炎症の減少であ
り、ＰＧレベルの減少により引き起こされることが知ら
れている。ＮＳＡＩＤは、ＣＯＸを阻害し、ＰＧ合成を
阻害することが知られているので、結腸ポリープの消失
は、この特性に起因すると広く考えられている。実際、
これに反する最近の発見にもかかわらず、ＦＡＰ又は他
の前癌性又は癌性病変の患者へのＰＧ合成の阻害剤（例
えば、ＮＳＡＩＤ）の投与が、ＰＧレベルの減少により
病変を消失させるということは、一般通念となってい
る。
【０００４】しかしながら、最近の発見は、科学者を完
全に異なる方向へ導いている。つまり腫瘍症患者を成功
裡に治療するのにＣＯＸを阻害する必要はないというこ
とである。Pamukcu らの米国特許第5,401,774 号明細書
は、ＰＧ合成阻害剤として（従ってＮＳＡＩＤ又は抗炎
症性化合物として）先に不活性であると報告されたスル
ホニル化合物が、結腸ポリープ細胞を含む種々の腫瘍性
細胞の成長を、思いがけずも阻害することを開示した。
これらのスルホニル誘導体は、結腸発癌性のラットモデ
ルに有効であることが立証され、その一種（現在、エキ
シスリンド(exisulind) と呼ばれる) は、ＦＡＰ患者に
ついての予備的なヒトの臨床試験で有効であることが立
証された。
【０００５】この発見、及び抗腫瘍性活性とＣＯＸ阻害
の関係を切り離したことの重要性は、極めて大きい。こ
れら２つの現象が関連しているとすれば、ＦＡＰ患者に
対する安全なＮＳＡＩＤ治療にはほとんど望みがない。
というのは、胃炎のような、ＮＳＡＩＤの副作用も、Ｃ
ＯＸ阻害により引き起こされるからである。プロスタグ
ランジンは、胃の内壁で保護機能を果たす。ＮＳＡＩＤ
が投与されると、ＣＯＸが阻害され、ＰＧレベルが減少
して、胃炎が起こる。このような副作用は、それ自身、
短期間（急性）のＮＳＡＩＤ治療では現れない。しかし
ながら、長期間（慢性）のＮＳＡＩＤ治療中は、胃炎、
出血及び潰瘍が非常によくある。かなりの場合、ＮＳＡ
ＩＤ治療は、これらの副作用及び他の致死的な副作用が
厳しいので中止する必要がある。さらに、その副作用の
厳しさは、年と共に増加するが、多分これは、胃の粘膜
中の自然なＰＧレベルが、年と共に降下するからであ
る。従って、腫瘍性病変を治療するために有用な化合物
は、腫瘍性細胞成長を望ましく抑制できるが、ＣＯＸを
阻害しないものである。
【０００６】化合物をスクリーニングする従来の方法を
用いて、腫瘍症細胞成長を抑制する改良された化合物を
発見することができる。このシナリオでは、薬剤は、in
vitroモデルを使用してスクリーニングされる。しか
し、従来のin vitroスクリーニング方法は、後に動物モ
デルでは有効でないとされる多くの化合物を合格させて
しまう。というのは、数多くの予期できない問題、例え
ば、in vitroスクリーニングは有効性を予測できるもの
ではないという問題があるからである。動物モデルの研
究は、時間がかかり、かつ高価である。従って、ヒトの
試験の前に化合物をスクリーニングするために、腫瘍症
を治療するための予測的な情報を提供する、より正確な
in vitroスクリーニング方法が必要である。ヒトの癌を
阻害する特異的な標的の情報は、より高度な正確さと効
率を可能とし、それゆえに、高度に有効で安全な化合物
を、動物実験の前に同定することが可能となる。
【０００７】現在、合理的な薬剤発見方法が、医薬品工
業において応用され、臨床的に有用な化合物を同定する
ための方法が改良されつつある。一般に、合理的な薬剤
発見方法は、「錠と鍵」の概念と関係し、治療上の標的
分子（錠）と医薬品化合物（鍵）との構造的な関係が定
義される。そのような方法は、専門のコンピューターソ
フトウエアによって更に高められ、そのソフトウエア
で、化合物のデータベースにアクセスしてもっともらし
い標的分子との幾何学的適合性を同定する。残念なこと
に、これらのシステムを使用するには、標的分子（錠）
に対する知識が必要である。この標的は、例えば、酵
素、タンパク質、膜又は核内受容体、若しくは核酸配列
等であってもよい。
【０００８】腫瘍症のような複雑な疾病において、科学
者は、数多くの標的を同定している。しかしながら、腫
瘍症の治療に利用できる多くの薬剤は、正常な組織に特
異的でなくかつ毒性があり、その薬剤は、前癌を示すも
のではなく腫瘍性細胞が癌に進行した時にのみ使用され
る。癌に関するメカニズムの更なる理解は、科学者を更
に特異的な抗腫瘍性薬剤、すなわち、早期の疾病過程に
おいて安全に投与することができる薬剤を設計する道へ
と導くだろう。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、腫瘍症、特
に前癌性病変を安全に治療及び予防する能力について化
合物をスクリーニングする新規なin vitroの方法であ
る。特に、本発明は、ＣＯＸ阻害及び他の非特異的相互
作用に関連する副作用を最小限に抑えて、前癌性の病変
を含む腫瘍症の治療及び予防ができる化合物を同定する
方法を提供するものである。そのため、本発明の一具体
例において、スクリーニング方法は、試験化合物のＣＯ
Ｘ阻害活性を測定することを含む。本発明者は、癌の阻
害とホスホジエステラーゼタイプ５イソ酵素(「ＰＤＥ
５」)の阻害との関係を発見したので、本発明は、当該化
合物のＰＤＥ５阻害活性の測定を含む。好ましくは、本
発明のスクリーニング方法は、更に、化合物が細胞培養
中に腫瘍細胞の成長を抑制するか否かの測定を含む。具
体例ごとに、本発明のスクリーニング方法は、化合物の
ＣＯＸ阻害活性の測定、化合物のＰＤＥ５阻害活性の測
定及び化合物が、腫瘍細胞中でアポトーシスを誘発する
か否かを測定することを含む。本方法で化合物をスクリ
ーニングすることによって、有益でかつ改良された化合
物を、これまでよりもはるかに迅速かつ正確に同定でき
る。更なる利益を、以下の説明から明らかにする。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の方法は、腫瘍の治療又は
予防に使用できる化合物を同定するのに有用であり、こ
の方法は、従来のＮＳＡＩＤの重大な副作用で特徴づけ
られない。癌及び前癌は、制御できない細胞成長を含む
疾病として考えられる。細胞成長は、数多くの異なる要
因を含む。ある要因は、細胞増殖の速さであり、別の要
因は、細胞死の速さである。細胞は、環境の刺激の型に
依存してネクローシス又はアポトーシスで死滅する。細
胞分化は、腫瘍成長速度が影響する、また別の要因であ
る。試験化合物に影響される細胞成長の多くの様相の解
明は、薬剤治療に対する関連標的の発見に重要である。
この選択性に基づくスクリーニング分析を、どの化合物
が成長抑制活性を有するかを測定する試験と結び付ける
ことができる。本発明は、いくつかの重要な発見の産物
である。第一に、本発明者は、腫瘍細胞成長の所望の抑
制剤が、アポトーシスによる癌細胞の早期死滅を誘導す
ることを発見した（Piazza,G.A. ら、Cancer Research
、55(14)、3110〜16頁、1995年参照）。第二に、本発
明者は、実質的なＣＯＸ阻害なしにアポトーシスを選択
的に誘導する化合物も、ホスホジエステラーゼ(「ＰＤ
Ｅ」)を阻害することを思いがけず発見した。特に、主な
科学的研究とは対照的に、腫瘍性病変の治療のための所
望の化合物は、ホスホジエステラーゼのタイプ５イソ酵
素の形態(「ＰＤＥ５」)（EC 3.1.4.17 ）を選択的に阻害
する。ＰＤＥ５は、少なくとも７つのホスホジエステラ
ーゼのイソ酵素のうちの１つである。ＰＤＥ５は、サイ
クリックＧＭＰを選択的に分解する点で珍しく、同時
に、他の型のＰＤＥは、非選択的又はサイクリックＡＭ
Ｐを分解する。所望の化合物は、他のホスホジエステラ
ーゼの型を実質的に阻害しないことが好ましい。
【００１１】本発明の好ましい態様は、所定の化合物の
シクロオキシゲナーゼ阻害活性の測定を含み、かつ当該
化合物のＰＤＥ５阻害活性の測定を含む。試験化合物の
腫瘍性病変を治療する有望な能力に対して採点(score)
は、その試験化合物の活性を一定のカットオフ値(cutof
f value)に対して直接的に評価するか、又は試験化合物
の活性を腫瘍性病変の治療に有用な公知化合物に対して
間接的に比較することにより行われる。胃炎を引き起こ
すことなく腫瘍性病変の治療に有効であると知られてい
る標準化合物は、５−フルオロ−２−メチル−１−（ｐ
−メチルスルホニルベンジリデン）−３−インデニル酢
酸(「エキシスリンド」)である。比較目的の他の有用な化
合物には、インドメタシンやスリンダクの硫化代謝物、
５−フルオロ−２−メチル−１−（ｐ−メチルスルフィ
ニルベンジリデン）−３−インデニル酢酸(「硫化スリン
ダク」)のような、ＣＯＸを阻害するものが知られてい
る。比較目的の他の有用な化合物には、１−( ３−クロ
ロアニリノ）−４−フェニフタラジン(「ＭＹ５４４５」)
のような、ＰＤＥ５を阻害するものが知られている。
【００１２】試験化合物は、もし化合物がエキシスリン
ドとそれ以上又は同等の作用を有し、かつＣＯＸを阻害
しなければ、明らかに有望な候補とされる。一般に、所
望の化合物は、ＰＤＥ５を阻害し、かつ細胞成長を抑制
し、アポトーシスを誘導するが、薬理学的に受け入れら
れた薬剤ではＣＯＸを阻害しない。
【００１３】ここで使用される、「前癌性病変」の用語
は、組織の異常腫瘍性（形成異常を含む）変化で表現さ
れる症候群を含む。例えば、結腸、乳房、前立腺、肺の
組織中の形成異常成長を含み、又は、そのような形成異
常斑点症候群の状態、皮膚の悪性黒色腫の前駆体を含
む。例えば、病変が臨床的に同定できるか否かとは関係
なく、形成異常斑点症候群、ポリープ病症候群、結腸ポ
リープ、頚部の前癌性病変（即ち、頚部の形成異常）、
食道、肺、前立腺の形成異常、前立腺内腫瘍症、乳房及
び又は皮膚及び関連した病気（例えば、光活性化の角化
症）を含む。ここで使用される、「癌腫(carcinoma) 」
又は「癌(cancer)」の用語は、癌性の病変を指す。例え
ば、悪性黒色腫、乳癌、前立腺癌及び結腸癌を含む。こ
こで使用される「腫瘍症」及び「腫瘍」の用語は、共に
癌性及び前癌性の病変を指す。ここで使用される、略語
ＰＧは、プロスタグランジンを表し、ＰＳは、プロスタ
グランジンシンセターゼ、ＰＧＥ2 は、プロスタグラン
ジンＥ2 、ＰＤＥは、ホスホジエステラーゼ、ＣＯＸ
は、シクロオキシゲナーゼ、ＲＩＡは、放射免疫測定法
を表す。ここで使用される、「ＰＤＥ５」は、ｃＧＭＰ
特異性加水分解性酵素活性及び高親和性ｃＧＭＰ結合を
示す、酵素及びそのイソ型を指す。本発明はまた、薬学
的に許容される投与量で実質的にＰＤＥ５阻害活性を示
す化合物を同定し、かつ化合物に感受性の腫瘍症を有す
る、その治療が必要な患者に一以上のその化合物を投与
して、その治療が必要な患者を治療する方法を提供する
ものである。
【００１４】スクリーニング手順 以下のスクリーニング手順、及び代わりの手順は、腫瘍
症、特に前癌性病変の腫瘍症を治療又は予防する潜在能
力の測定に、試験化合物をスクリーニングする好ましい
方法の理解の助けになる。
【００１５】１．ＣＯＸ阻害活性の測定 ＣＯＸ阻害は、２つの方法で測定できる。一の方法は、
スクリーニングされている化合物にさらした後に、無処
置ＨＬ−６０細胞によるＰＧＥ2 分泌を測定することを
含む。もう一方の方法は、精製されたシクロオキシゲナ
ーゼ（ＣＯＸ）の活性を、当該化合物の存在下で測定す
ることを含む。双方とも、文献で既に記述された手順を
含む。
【００１６】１．Ａ．ＰＧＥ2 分泌 この試験化合物は、当業者に公知の製法で、プロスタグ
ランジンＥ2 (「ＰＧＥ 2 」)生成を阻害するか否か測定す
るために評価される。例えば、細胞から分泌されたＰＧ
Ｅ2 を、ＰＧＥ2 用酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）キッ
ト（Amersham,Arlington Heights, IL USA. から市場で
入手可能）で、測定する。適した細胞には、ＨＬ−６０
細胞のようなＰＧの豊富なものが含まれる。ＨＬ−６０
細胞は、成熟した顆粒球中でＤＭＳＯにより分化したヒ
トの前骨髄球である（Collins, S. J.、Ruscetti, F.
W.、Gallagher,R.E.及びGallo,R.C.、「Normal Functio
nalCharacteristics of Cultured Human Promyelocytic
Leukemia Cells(HL-60) After Induction of Differen
tiation By Dimethylsulfoxide 」、J.Exp.Med.、149
、 969〜974 頁、1979年参照）。この分化された細胞
は、カルシウムイオン透過担体A23187（Kargman,S 、Pr
asit,P. 及びEvans,J.F.、「Translocation of HL-60 C
ell 5-Lipoxygenase」、266 、 23745〜23752 頁、1991
年）で刺激した後にＰＧＥ2 を生成する。ＨＬ−６０
は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ：Ｃ
ＣＬ２４０）から入手できる。このＨＬ−６０は、２０
％熱不活性化した胎児のウシの血清、５０U/mlペニシリ
ン及び５０μg/mlストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ
１６４０培地において５％ＣＯ2 雰囲気下、３７℃で生
育する。骨髄球性の分化を誘導するために、細胞を、
１．３％ＤＭＳＯ中に９日間さらし、その後、洗浄し、
Dulbecco製のリン酸塩で緩衝された生理食塩水中、３×
１０6 細胞/ml で再懸濁する。分化したＨＬ−６０細胞
（細胞/ml ）は、１５分間３７℃で、所望の濃度で試験
された化合物の存在下で培養する。細胞を、その後、A2
3187（５×１０6 Ｍ）で、１５分間刺激する。外側の培
地から分泌したＰＧＥ2 は、上述した方法で測定され
る。
【００１７】１．Ｂ．精製シクロオキシゲナーゼ ２つの異なったシクロオキシゲナーゼの形態（ＣＯＸ−
Ｉ及びＣＯＸ−２）は、文献でプロスタグランジン合成
を調節するためのものとして報告されている。ＣＯＸ−
２は、ＣＯＸの誘導性形態を意味するのに対し、ＣＯＸ
−Ｉは、構成的形態を意味することが知られている。Ｃ
ＯＸ−Ｉ活性は、Mitchellらが記述した方法(「Selectiv
ity of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs as Inh
ibitorsof Constitutive and Inducible Cyclooxygenas
e」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90、 11693〜11697
頁、1993年、ここに参考として導入する）で、Boopathy
& Balasubramanian「Purification And Characterizat
ion Of Sheep Platelet Cyclooxygenase」（Biochem.
J.、239 、 371〜377 頁、1988年、ここに参考として導
入する）の記述によって雄羊の精嚢から精製したＣＯＸ
−Ｉを使用して測定される。ＣＯＸ−２活性は、Mitche
llら（1993年、同上）に記述された方法で、羊の胎盤か
ら精製したＣＯＸ−２を使用して測定される。
【００１８】薬剤のシクロオキシゲナーゼ阻害活性は、
当該技術分野で公知の方法で測定される。例えば、Boop
athy & Balasubramanian（1988年、同上）は、製法を記
述し、この製法において、プロスタグランジンＨシンセ
ターゼ(Cayman Chemical、Ann Arbor 、Michigan）は、
３７℃で２０分間、１００μＭのアラキドン酸(SigmaCh
emical Co.)、補助因子（例えば、１．０mMグルタチオ
ン、１．０mMヒドロキノン、０．６２５μＭヘモグロビ
ン及び１．２５mMＣａＣｌ2 の１００mMTris−ＨＣｌｐ
Ｈ７．４）及び試験される薬剤と共に培養される。培養
後、この反応は、トリクロロ酢酸で終結される。その
後、酵素の活性は、反応が、チオバルビツール酸及びマ
ロンアルデヒド添加で停止した後に、分光光度的に５３
０nmで測定される。大きなＰＤＥ５阻害活性と比較して
最小のＣＯＸ−Ｉ又はＣＯＸ−２阻害活性を示す化合物
は、全く望ましくないことは明らかである。
【００１９】１．Ｃ．結果の分析 阻害の量は、シクロオキシゲナーゼの活性を、試験化合
物の存在と不在中において比較して測定される。約１０
０μＭの濃度でＣＯＸ阻害活性が低いか又はない（即
ち、約２５％未満）ことを示す化合物が、腫瘍症治療の
有用性を更に評価すべきものである。好ましくは、ＩＣ
50濃度が１０００μＭより大きい化合物について、更に
有用性があるかどうか検討すべきである。
【００２０】２．ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ５）阻
害活性の測定 化合物は、ホスホジエステラーゼ活性への阻害的な影響
に対して、ＨＴ−２９又はＳＷ−４８０のような腫瘍株
細胞から単離した酵素、又は組み替え体ＨＳ−ＰＤＥ５
を用いて、例えば、又は全体の細胞中でサイクリックヌ
クレオチドのレベルを測定して、スクリーニングされ
る。
【００２１】２．Ａ．酵素分析 ホスホジエステラーゼ活性は、当該技術分野で公知の、
放射性 3ＨサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）（サイクリ
ック３’，５’−モノリン酸グアノシン）をＰＤＥ５酵
素の基質として使用するような方法で測定される（Thom
pson,W.J. 、Teraski,W.L.、Epstein,P.M.、Strada,S.
J. 、Advances in Cyclic Nucleotide Research、10、6
9〜92頁、1979年、ここに参考として導入する）。言い
換えれば、定義された放射性 3Ｈ−ｃＧＭＰ特異活性
（０．２μＭ、100000cpm 、４０mM Tris-ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、５mMＭｇＣｌ2 、１mg/ml ＢＳＡを含む）
を、全量４００μｌでテストすべき薬剤と混合する。こ
の混合物を、３０℃で１０分間、ＨＴ−２９細胞から単
離し、部分的に精製したＰＤＥ５と培養する。反応は、
例えば、反応混合物を７５秒間煮沸して終結させる。氷
冷後、１００μｌの０．５mg/ml ヘビ毒（O.Hannah毒、
Sigma から入手可能）を添加し、１０分間、３０℃で培
養する。この反応は、その後、アルコール、例えば１ml
の１００％メタノールを添加して終結させる。分析試料
は、アニオンクロマトグラフィカラム（１mlDowex 、Al
drich から）を適用し、１mlの１００％メタノールで洗
浄した。このカラムの展開及び洗浄中の放射能の量は、
ここで、シンチレーションカウンターで測定する。ＰＤ
Ｅ５阻害の程度は、薬剤処理した反応中の放射能の量を
算出し、コントロール試料( 反応混合物で試験化合物を
欠くもの）と比較して測定する。
【００２２】２．Ｂ．サイクリックヌクレオチド測定 これとは別に、ＰＤＥ５を阻害する所望の化合物の能力
は、スクリーニングしている化合物にさらした腫瘍性細
胞中のｃＧＭＰの増加に反映される。ＰＤＥ５活性の量
は、サイクリックＧＭＰの量を治療した細胞の抽出にお
いて放射免疫測定法（ＲＩＡ）を用いて分析して測定さ
れる。この手順で、ＨＴ−２９又はＳＷ−４８０細胞
は、培養基で培養され、集密的に成長される。試験化合
物は、その後、細胞培養物と、約２００μＭから約２０
０ｐＭの間の化合物の濃度で培養される。約２４から４
８時間後、培養培地は、細胞から除去され、細胞は可溶
化される。この反応は、０．２N ＨＣｌ／５０％ＭｅＯ
Ｈを使用して停止する。試料は、タンパク質分析のため
に除去される。サイクリックＧＭＰは、Dowex カラムの
ようなアニオン交換クロマトグラフィを使用した細胞の
酸／アルコール抽出で精製される。このｃＧＭＰを乾燥
し、トリエチルアミン中の無水酢酸を用いるような公表
された手順にし従ってアセチル化する（Steiner,A.L.、
Parker,C.W. 、Kipnis,D.M. 、J. Biol. Chem.、247
(4)、1106〜1113頁、1971年、ここに参考として導入す
る）。このアセチル化ｃＧＭＰを、放射免疫測定法の手
順（Harper,J. 、Brooker,G.、Advances in Nucleotide
Research 、10、 1〜33頁、1979年、ここに参考として
導入する）を用いて定量化する。誘導体化したサイクリ
ックＧＭＰのヨウ素化したリガンド（チロシンメチルエ
ステル）を、抗血清及び適当な緩衝液の存在中で標準物
質又は未知物質と培養する。抗血清は、サイクリックヌ
クレオチドハプテンを使用して指示された技術で精製す
る。この抗血清は、羊からのもので、スクシニル−ｃＧ
ＭＰ−アルブミン結合体と共に注入され、1/20000 希釈
される。検量線からの薬剤内挿法及び誤差分析は、既述
を適用する（Seibert,A.F.、Thompson,W.J. 、Taylor,
A.、Wilbourn,W. H.、Barnard,J.及びHaynes, J.、J.Ap
plied Physiol.、72、 389〜395 頁、1992年、ここに参
考として導入する）。
【００２３】加えて、培養培地を酸性化し、凍結し(-７
０℃) 、ｃＧＭＰ及びｃＡＭＰについても分析する。所
望の試験化合物に引き起こされるｃＧＭＰ含有量の増加
が観測されるのに加え、ｃＡＭＰ含有量の現象が観測さ
れる。特に望ましい化合物（即ち、腫瘍性細胞中でアポ
トーシスを選択的に誘導する化合物であるが、実質的に
正常細胞中にはない）は、数分でｃＧＭＰ含有量の増加
に起因する一定の初期作用のような、ＰＤＥ５阻害と一
致した時間経過が続いて起こることが観測された。第２
に、所望の抗腫瘍性化合物による腫瘍性細胞の治療は、
ｃＡＭＰ含有量を２４時間以内に減少させる。薬剤作用
の細胞間標的は、更に研究されるが、現在のデータは、
ｃＧＭＰ含有量の初期増加もその後のｃＡＭＰ含有量の
降下も、所望の化合物にさらされた腫瘍性細胞のアポト
ーシスに先行する考えを維持している。２つのサイクリ
ックヌクレオチドの比率の変化は、試験化合物の所望の
ＰＤＥ５阻害活性を評価する正確な道具であり、これ
は、ｃＧＭＰの絶対値のみ、ＰＤＥ５阻害のみ、ｃＡＭ
Ｐの絶対値のみを測定するよりも正確である。腫瘍性細
胞は、抗腫瘍性化合物で治療されないとき、ｃＧＭＰ含
有量／ｃＡＭＰ含有量比は、０．０３〜０．０５の範囲
にある（即ち、３００〜５００fmol/mg タンパク質ｃＧ
ＭＰ含有量／６０００〜８０００fmol/mg タンパク質ｃ
ＡＭＰ含有量）。所望の抗腫瘍性化合物にさらした後、
この比は、サイクリックＧＭＰの初期増加及びサイクリ
ックＡＭＰのその後の減少の結果として数倍に増加する
（好ましくは少なくとも約３倍増）。
【００２４】特に所望な化合物は、治療した腫瘍性細胞
中のｃＧＭＰ含有量の初期増加は、約５００fmol/mg タ
ンパク質よりも大きいｃＧＭＰレベルに達成することが
特に観測された。加えて、特に所望な化合物は、腫瘍性
細胞中のｃＡＭＰ含有量のその後の減少を、４０００fm
ol/mg タンパク質よりも小さいｃＡＭＰレベルにさせ
る。サイクリックＡＭＰの含有量を測定するため、上述
したｃＧＭＰ用のものと類似する放射免疫測定法の技術
が使用される。根本的に、サイクリックヌクレオチド
は、アニオン交換クロマトグラフィを使用した細胞の酸
／アルコール抽出で精製され、乾燥され、公表された手
順でアセチル化され、放射免疫測定法の手順を使って定
量化される。サイクリックＡＭＰ及びサイクリックＧＭ
Ｐで誘導体化したヨウ素化したリガンドを、抗血清及び
適当な緩衝液の存在中で標準物質又は未知物質で培養す
る。
【００２５】サイクリックヌクレオチド含有量の検証
は、無処置細胞中のサイクリックヌクレオチドの代謝回
転又は蓄積を測定して得られる。無処置細胞のｃＡＭＰ
を測定するため、 3Ｈ−アデニン前標識を、公表された
手順に従って使用する（WhalinM. E.、R.L.Garrett Jr.
、W.J.Thompson及びS.J.Strada、「Correlation of ce
ll-free brain cyclic nucleotide phosphodiesterase
activities to cyclicAMP decay in intact brain slic
es」、Sec.Mess.and Phos.Protain Research、12、 311
〜325 頁、1989年、ここに参考として導入する）。この
手順は、標識したＡＭＰとサイクリックＡＭＰの溶剤を
測定し、無処置細胞のアデニル酸シクラーゼ、又はサイ
クリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を、特
定の手順に依存して評価するために使用する。サイクリ
ックＧＭＰの蓄積は、無処置細胞の前標識を、公表され
た手順（Reynolds, P. E. 、S.J.Strada及びW.J.Thomps
on、「Cyclic GMP accumulation in pulmonary microva
scular endothelial cellsmeasured by intact cell pr
elabeling」、Life Sci. 、60、 909〜918 、1997年、
ここに参考として導入する）に従って研究するには低す
ぎる。
【００２６】２．Ｃ．組織試料分析 試験化合物のＰＤＥ５阻害活性も、組織試料から測定す
る。哺乳動物( 好ましくはラット) の肝臓のような組織
試料は、試験化合物にさらした被験者から収集する。言
い換えれば、組織の試料を、５００μｌの６％ＴＣＡ中
でホモジナイズする。ホモジェネートの公知量は、タン
パク質分析のために除去される。残りのホモジェネート
は、氷に２０分間つけてタンパク質を沈殿させる。次
に、このホモジェネートを、３０分、15000g、４℃で遠
心分離する。その上澄みを回収し、ペレットは回収す
る。その上澄みを、ジエチルエーテルを５倍の容積の水
で飽和させたもので４回洗浄する。上部エーテル層は、
洗浄ごとに廃棄される。水性のエーテル抽出物を、高速
真空で乾燥する。一度乾燥すると、試料は、更に使用す
るため凍結される。乾燥した抽出物は、５００μｌの分
析緩衝液に溶解される。ＰＤＥ５阻害の量は、サイクリ
ックヌクレオチドの量を、Biotrak EIA システムのアセ
チル化手順（Amersham、Arlington Heights 、IL、USA
から入手可能）のような、酵素免疫学的測定法（ＥＩ
Ａ）で分析して測定する。言い換えれば、前記詳述した
ＲＩＡ手順も使用できる。
【００２７】２．Ｄ．結果の分析 阻害の量は、ＰＤＥ５の活性を、試験化合物の存在と不
在下で比較して測定する。ＰＤＥ５活性の阻害は、試験
化合物が腫瘍症の治療に有用であることを示す。基準の
阻害活性より大きい重大な阻害活性、つまりエキシスリ
ンドのように、好ましくは１０μＭかそれ以下の濃度で
５０％より大きいことを示す化合物が、その抗腫瘍性の
特性について更に評価されるべきものである。好ましく
は、ＰＤＥ５阻害に対するＩＣ50値は、更に有用性を考
慮した化合物に対し、５０μＭ未満であるべきである。
【００２８】３．化合物が腫瘍細胞の数を減少するか否
かの測定 代わりの態様である、本発明のスクリーニング方法は、
化合物が更に腫瘍細胞の成長を減少するか否かの測定を
含む。種々の株細胞には、試験された組織に依存する試
料が使用される。例えば、これら株細胞は、ＳＷ−４８
０（結腸腺癌）、ＨＴ−２９（結腸腺癌）、Ａ−４２７
（肺腺癌癌腫）、ＭＣＦ−７（乳腺癌）、ＵＡＣＣ−３
７５（黒色腫株）、ＤＵ１４５（前立腺癌腫）を含む。
これら株細胞を使って得た細胞障害性データは、腫瘍性
病変への阻害効果を示す。これら株細胞は、よく特徴づ
けられ、合衆国国立癌研究所での新規抗癌薬剤のための
スクリーニング計画に使用されている。
【００２９】３．Ａ．ＨＴ−２９株細胞による腫瘍阻害 化合物の腫瘍細胞成長を抑制する能力は、ＡＴＣＣ(Bet
hesda, MD)から得られたＨＴ−２９ヒト結腸癌腫株細胞
を使って測定する。ＨＴ−２９細胞は、関連する結腸腫
瘍細胞培養モデル（Fogh,J. 及び、Trempe,G. 、Human
Tumor Cells invitro、J.Fogh(eds.)、Plenum Press、N
ew York、 115〜159 頁、1975年）としてあらかじめ特
徴づけられる。ＨＴ−２９細胞は、５％の胎児の血清
（Gemini Bioproducts, Inc.、Carlsbad, CA）及び２mm
のグルタミン、及び１％の抗生物質−抗真菌剤を加えた
ＲＰＭＩ培地で、加湿した９５％空気、５％ＣＯ2 雰囲
気下、３７℃で維持する。言い換えれば、ＨＴ−２９細
胞は、化合物を加える前に、９６穴マイクロタイタープ
レート中、５００細胞／穴の密度で培養基で培養し、２
４時間、３７℃で培養される。各細胞数の測定は、６つ
の複製を含めた。６日間の培養後、細胞を、冷却したト
リクロロ酢酸を加えて１０％の最終濃度で固定し、タン
パク質レベルは、Skehan,P. 、Storeng,R.、Scudiero,
D. 、Monks,A.、McMahon,J.、Vistica,D.、Warren,J.T.
、Bokesch,H.、Kenney,S. 及びBoyd,M.R.、「New Colo
rimetric Assay For Anticancer-Drug Screening」、J.
Natl.Cancer Inst. 、82、1107〜1112頁、1990年（ここ
に参考として導入する）で記述されたスルホローダミン
Ｂ（ＳＲＢ）比色タンパク質染色分析で測定する。ＳＲ
Ｂ分析に加え、他の数多くの方法が、成長抑制の測定に
利用でき、かつＳＲＢ分析に代わり得る。これらの方法
には、生存細胞をその後トリパンブルーで染色して数
え、BrdU又は放射標識したチミジンでＤＮＡ合成ができ
る細胞を標識し、生存細胞をニュートラルレッドで染色
し、又は生存細胞をＭＴＴで染色する方法が含まれる。
【００３０】３．Ｂ．結果の分析 重要な腫瘍細胞成長抑制で１００μＭ又はそれ以下で約
５０％より大きい化合物が、腫瘍性病変に有用であるこ
とを更に示す。好ましくは、ＩＣ50値は、測定され、か
つ比較の目的に使用される。このＩＣ50値は、コントロ
ールと比較して腫瘍細胞成長が５０％まで阻害するのに
必要な薬剤の濃度と同じである。好ましくは、ＩＣ50値
は、腫瘍性病変を治療するための有用性を更に検討すべ
き化合物に対し、１００μＭ未満であるべきである。
【００３１】４．化合物がアポトーシスに誘導するか否
かの測定 第２の代わりの態様は、本発明のスクリーニング方法で
あり、更に化合物が腫瘍細胞中でアポトーシスを誘導す
るか否かを測定することを含む。細胞死の２つの明確な
形態は、形態学及び生化学的特徴、つまりネクローシス
かアポトーシスかで記述される。ネクローシスは、血漿
膜の透過率の増加を伴い、細胞は膨張し、血漿膜は数分
で破裂する。アポトーシスは、血漿の小疱形成、細胞質
凝縮及び内在性のエンドヌクレアーゼの活性化で特徴づ
けられる。この２つに関し、アポトーシスは、真核生物
細胞死の最も通常の形態である。アポトーシスは、正常
な組織代謝回転中、器官及び肢の胚発生中に自然に起こ
る。アポトーシスは、細胞障害性のＴ−リンパ球及び天
然キラー細胞に、イオン化放射線に及びある化学療法薬
によっても誘導される。アポトーシスの不適当な制御
は、癌、ＡＩＤＳ、アルツハイマー症等を含めた多くの
病理学的な状況で重要な役割を果たすと考えられる。化
合物は、アポトーシスの誘導のため、上述した条件で維
持した腫瘍細胞の培養物を用いてスクリーニングする。
試験化合物との細胞の処理には、集密的培養物の前又は
後、種々の濃度で２から７日間の処理が含まれる。アポ
トーシス細胞は、付属及び「浮遊する」培養コンパート
メントの双方で測定する。両コンパートメントは、上澄
みを除き、付属的な細胞をトリプシン処理し、かつ両製
剤を後に続く遠心分離洗浄工程（１０分、2000rpn ）で
配合して収集する（Piazza,G.A. ら、Cancer Research
、55、3100〜3116頁、1995年参照、ここに参考として
導入する）。新規特徴は、浮遊細胞、付属細胞の双方を
収集すること、最適な処理時間の同定、観測するアポト
ーシスに対する投与量の範囲、最適な細胞培養条件の同
定が含まれる。
【００３２】４．Ａ．アポトーシスの形態学的観測 以下の試験化合物の処理によって、培養物は、以下のア
クリジンオレンジ及び臭化エチジウムで標識し、蛍光顕
微鏡でアポトーシス及びネクローシスを分析する。アポ
トーシス細胞数の測定方法は、Duke & Cohen、「Morpho
logical And Biochemical Assays Of Apoptosis 」、Cu
rrent Protocols In Immunology 、Coligan ら、eds 、
3.17.1-3.17.16、（1992年、ここに参考として導入す
る）に既述されている。例えば、浮遊及び付属細胞は、
トリプシン処理され、ＰＢＳで３回洗浄されて収集され
る。一定分量の細胞は、遠心分離される。そのペレット
を、その後培地及びアクリジンアレンジ及び臭化エチジ
ウムをＰＢＳ中に含む色素混合物で再懸濁し、徐々に混
合する。本混合物を顕微鏡スライドに置き、検査する。
【００３３】４．Ｂ．ＤＮＡ断片化によるアポトーシス
の分析 アポトーシスは、試験化合物で処理された細胞中のＤＮ
Ａ断片化の増加を測定して、数量化される。細胞質のヒ
ストン関連ＤＮＡ断片（モノ及びオリゴヌクレオソー
ム）のin vitro定量測定用の市販の測光ＥＩＡは、入手
できる（細胞死検出ＥＬＩＳＡokys、Cat.No.1774425、
Boehringer Mannheim ）。このBoehringerMannheim の
分析は、それぞれ、ＤＮＡ及びヒストンに対するマウス
モデル抗体を使用したサンドイッチ酵素免疫学的測定法
の原理に基づいた。この分析で、細胞溶解物の細胞質断
片中のモノ及びオリゴヌクレオソームの特異的な測定が
できる。売主によれば、アポトーシスは、次のように測
定される。試料（細胞溶解物)を、ストレプトアビジン
皮膜したマイクロタイタープレート(「ＭＴＰ」)に置く。
続いて、抗ヒストンビオチンと抗ＤＮＡペルオキシダー
ゼ結合体との混合物を加え、２時間培養する。培養期の
間、抗ヒストン抗体は、ヌクレオソームのヒストン成分
と結合し、そのビオチン化物を経由して、免疫複合体を
ストレプトアビジン皮膜ＭＴＰに同時に固定する。加え
て、抗ＤＮＡペルオキシダーゼ抗体は、ヌクレオソーム
のＤＮＡ成分と反応する。非結合性抗体を洗浄工程で除
去した後、ヌクレオソームの量は、免疫複合体中に保持
したペルオキシダーゼで数量化される。ペルオキシダー
ゼは、ＡＢＴＳ７（２，２'-アジド−［３−エチルベン
ズチアゾリン−スルホネート])* を基質として測光的に
測定される。例えば、ＳＷ−４８０結腸腺癌細胞は、９
６−穴ＭＴＰで10000 細胞／穴で培養される。細胞は、
その後試験化合物で処理され、４８時間、３７℃で培養
される。培養後、ＭＴＰを遠心分離し、上澄みを除去す
る。各穴ごとの細胞ペレットは、その後、溶解緩衝液中
で３０分間再懸濁される。この溶解物は、その後、遠心
分離され、上澄み液の一部（即ち、細胞質フラクショ
ン）は、ストレプトアビジン皮膜ＭＴＰに転移される。
溶解したペレットを振らないように注意する（即ち、細
胞核に高分子量の、断片化されていないＤＮＡが含まれ
る）。試料をその後、分析する。刺激倍率（ＦＳ＝ＯＤ
max ／ＯＤveh ）は、アポトーシス応答の指標であり、
所定の濃度で試験した各化合物につき測定される。ＥＣ
50値も、一連の試験化合物の濃度を評価して測定する。
【００３４】４．Ｃ．結果の分析 統計的に、アポトーシスの重大な増加（即ち、濃度１０
０μＭで２倍の刺激以上）は、化合物が、腫瘍性病変の
治療に有用であることを更に示す。好ましくは、アポト
ーシス活性に対するＥＣ50値は、腫瘍性病変の治療に有
用であると更に考えられる化合物に対し、１００μＭ未
満であるべきである。ＥＣ50は、ここで、溶媒(vehicl
e) 処理と関連して５０％のアポトーシス誘導を引き起
こす濃度として定義される。
【００３５】５．確証、乳腺器官培養モデル試験 上記方法で同定した試験化合物は、乳腺器官培養系にお
ける前腫瘍性病変の発生率を阻害する能力を測るために
抗腫瘍性活性について試験される。このマウス乳腺器官
培養技術は、他の研究者がＮＳＡＩＤ、レチノイド、タ
モキシフェン、セレニウム、及び一定の自然生成物のよ
うな公知抗腫瘍性薬剤の影響を研究するために成功裡に
使用され、本発明のスクリーニング方法の確証に有用で
ある。例えば、メスのＢＡＬＢ／c マウスは、エストラ
ジオールとプロゲステロンの組み合わせで、腺をin vit
roでホルモンと反応するように用意するために、毎日処
理される。動物を犠牲にし、胸部の乳腺を無菌的に摘出
し、１０日間、インシュリン、プロラクチン、ヒドロコ
ルチゾン、アルドステロンで補足した成長培地で培養す
る。ＤＭＢＡ（7,12−ジメチルベンズ(a) アントラセ
ン）を投与して前癌状態の病変の形態に誘導する。完全
に発展した腺は、その後、プロラクチン、ヒドロコルチ
ゾン、アルドステロンの欠乏になり、腺が消失するが、
前癌状態の病変ではない。試験化合物を、ＤＭＳＯに溶
解し、培養培地を培養期の持続のために添加する。培養
期の最後に、腺を１０％ホルマリンに固定し、ミョウバ
ンカルミンで染色し、ガラススライドにのせる。乳房病
変の形成の発生率は、乳房病変の腺と未病変の腺の比で
ある。試験化合物が治療した腺における乳房病変の発生
率は、未治療の腺と比較される。乳房病変で占められた
部位の範囲は、デジタルパッド上に腺の像を投影して定
量化される。腺で覆われた部位をパッド上にトレース
し、この部位を部位の１００％と考える。それぞれ消失
しない構造で覆われた空間も、デジタルパッドで輪郭を
描き、コンピュータで定量化する。
【００３６】
【実施例】数多くの試験化合物を、種々の手順で試験
し、腫瘍症の治療中の有用性をスクリーニングした。こ
の試験の結果を以下に示す。試験化合物は、以後、以下
に示す文字コードで示す。 Ａ．ラセミ−トレオ−（Ｅ）−１−（Ｎ, Ｎ' −ジエチ
ルアミノエタネチオ）−１−（ブタン−１’，４’−オ
リド）−［３’，４’：１，２］−６−フルオロー２−
メチルー３−（ｐ−メチルスルホニルベンジリデン）−
インダン Ｂ．（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１−（３，
４，５−トリメトキシベンジリデン）−３−酢酸 Ｃ．（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１−（ｐ−ク
ロロベンジリデン）−３−酢酸 Ｄ．ラセミ−（Ｅ）−１−（ブタン−１’，４’−オリ
ド）−［３’，４’：１，２］−６−フルオロー２−メ
チルー３−（ｐ−メチルスルホニルベンジリデン）−１
Ｓ−インダニル−Ｎ−アセチルシステイン Ｅ．（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１−（３，
４，５−トリメトキシベンジリデン）−３−インデニル
アセトアミド，Ｎ−ベンジル Ｅ．（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１−（ｐ−メ
チルスルホニルベンジリデン）−３−インデニルアセト
アミド，Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル Ｆ．リボ−（Ｅ）−１−トリアゾロ［２’，３’：
１”，３”］−１−（ブタン−１’，４’−オリド）−
［３’，４’：１，２］−６−フルオロー２−メチル−
３−（ｐ−メチルスルホニルベンジリデン）−インダン Ｇ．ラセミ−（Ｅ）−１−（ブタン−１’，４’−オリ
ド）−［３’，４’：１，２］−６−フルオロー２−メ
チルー３−（ｐ−メチルスルホニルベンジリデン）１Ｓ
−インダニル−グルタチオン
【００３７】実施例１−ＣＯＸ阻害の分析 基準化合物と試験化合物を、そのＣＯＸ阻害活性につい
て、上記１．Ｂ．のＣＯＸ分析の手順に従って分析し
た。図１は、精製したシクロオキシゲナーゼ（タイプ
１）活性への、硫化スリンダク又はエキシスリンドの種
々の濃度の影響を示す。シクロオキシゲナーゼ活性は、
雄羊精嚢（Mitchellら、同上）から精製したシクロオキ
シゲナーゼを用いて測定した。硫化スリンダクに対する
ＩＣ−５０値は、約１．７６μＭと算出され、その時、
エキシスリンドに対する値は、１００００μＭより大き
かった。このデータは、エキシスリンドではなく、硫化
スリンダクが、ＣＯＸ−Ｉ阻害剤であることを示してい
る。類似したデータが、ＣＯＸ−２イソ酵素でも得られ
た（Thompsonら、Journal of the National Cancer Ins
titute、87、1259〜1260頁、1995年）。図２は、試験化
合物Ｂ及びＥの、ＣＯＸ阻害への影響を示す。ＣＯＸ活
性は、図１に示された化合物に対して測定した。データ
は、試験化合物Ｂ、Ｅの双方とも、ＣＯＸ−Ｉを阻害し
なかったことを示す。
【表１】 一連の化合物中のシクロオキシゲナーゼ阻害活性 基準化合物 １００μＭにおける阻害（％） インドメタシン ９５ ＭＹ５４４５ ９４ 硫化スリンダク ９７ エキシスリンド ＜２５ 試験化合物 １００μＭにおける阻害（％） Ａ ＜２５ Ｂ ＜２５ Ｃ ８７ Ｄ ＜２５ Ｅ ＜２５ 上記１．Ｂ．の手順に従って、化合物Ａ乃至Ｅは、これ
を表１に報告したように、ＣＯＸ阻害活性について評価
した。化合物Ｃは、１００μＭ投与量で２５％より大き
くＣＯＸを阻害することがわかったので、化合物Ｃを選
んで更にスクリーニングすることはなかった。
【００３８】実施例２−ＰＤＥ５阻害活性 基準化合物と試験化合物を、そのＰＤＥ５阻害活性につ
いて、上記２．Ａ．の分析手順に従って分析した。図３
は、ヒトの結腸ＨＴ−２９から培養した腫瘍細胞（W.J.
Thompsonら、同上）から精製したＰＤＥ−４又はＰＤＥ
５活性への、硫化スリンダク及びエキシスリンドの種々
の濃度の影響をしめす。ＰＤＥ４阻害に対する硫化スリ
ンダクのＩＣ50値は、４１μＭ、ＰＤＥ５を阻害するも
ので１７μＭだった。ＰＤＥ４を阻害するエキシスリン
ドのＩＣ50値は、１８１μＭ、ＰＤＥ５を阻害するもの
で５６μＭだった。このデータは、硫化スリンダクもエ
キシスリンドも、ホスホジエステラーゼ活性を阻害する
ことを示す。両化合物は、ＰＤＥ５イソ酵素の形態に選
択的である。図４は、２．Ｂ．の分析に従って培養した
ＨＴ−２９細胞で測定されたｃＧＭＰ又はｃＡＭＰ生産
に対する、硫化スリンダクの影響を示す。ＨＴ−２９細
胞を、硫化スリンダクで３０分処理し、ｃＧＭＰ又はｃ
ＡＭＰは、従来の放射免疫測定方法で測定した。指摘し
たように、硫化スリンダクは、７．３μＭ（頂部）のＥ
Ｃ50値で５０％より大きくｃＧＭＰレベルを増加した。
ｃＡＭＰのレベルは、処理に影響されないが、公知のＰ
ＤＥ４阻害剤であるロリプラムは、ｃＡＭＰ（底部）を
増加した。データは、ＰＤＥ５のＰＤＥ４と比較した阻
害の薬理学的な重要性を立証する。図５は、ホスホジエ
ステラーゼのＰＤＥ５又はＰＤＥ４イソ酵素における、
試験化合物Ｂの指示された投与量に対する影響を示す。
算出したＰＤＥ５に対するＩＣ50値は１８μＭ、ＰＤＥ
４に対する値は５８μＭだった。図６は、試験化合物Ｅ
の指示投与量に対するＰＤＥ４又はＰＤＥ５の影響を示
す。算出したＩＣ50値は、ＰＤＥ５に対して０．０８μ
Ｍ、ＰＤＥ４に対して２５μＭより大きい値だった。
【表２】 一連の化合物中のＰＤＥ５阻害活性 基準化合物 １０μＭにおける阻害（％） インドメタシン ３４ ＭＹ５４４５ ８６ 硫化スリンダク ９７ エキシスリンド ３９ 試験化合物 １０μＭにおける阻害（％） Ａ ＜２５ Ｂ ＜２５ Ｃ ＜２５ Ｄ ３６ Ｅ ７５ 表２中の上記化合物の、ＰＤＥ阻害活性を、上述の２．
Ａ．の手順で評価した。ＣＯＸを阻害しない化合物の中
で、化合物Ｅのみが、１０μＭで５０％より大きい阻害
が見られた。図１１に示したように、化合物Ｂは、２０
μＭの投与量で５０％より大きい阻害を示した。従っ
て、単一用量試験で用いた投与量レベルに従い、一定の
化合物は、スクリーニングされるが、他の化合物は、わ
ずかに高い投与量で活性化される。使用した投与量は、
主観的であり、活性化合物が、一定のレベルでより強力
な化合物を同定することが発見された後に低くすること
ができるであろう。
【００３９】実施例３−アポトーシス分析 基準化合物と試験化合物のＰＤＥ５阻害活性を、上記
４．Ａ．及び４．Ｂ．の分析に対する手順に従って分析
した。４．Ａ．の分析に従い、図７は、硫化スリンダク
及びエキシスリンドの、アポトーシス及びネクローシス
細胞死への影響を示す。ＨＴ−２９細胞を、６日間、硫
化スリンダク又はエキシスリンドの指示投与量で処理し
た。アポトーシス及びネクローシス細胞死は、既に測定
されている（Duke及びCohen 、Current Protocols in I
mmunology 、3.17.1〜3.17.16 頁、New York、John Wil
ey and Sons 、1992年）。このデータは、硫化スリンダ
クもエキシスリンドも、ネクローシスを誘導せずにアポ
トーシス細胞死を引き起こすことができることを示す。
全データは、同一実験から収集した。４．Ｂ．の分析に
従い、図８は、腫瘍成長抑制及びＤＮＡ断片化で測定し
たアポトーシス誘導への、硫化スリンダク及びスルホン
スリンダクの影響を示す。上図は、エキシスリンドに対
する成長抑制（白抜き記号、右軸）及びＤＮＡ断片化
（黒塗り記号、左軸）である。下図は、硫化スリンダク
に対する成長抑制（白抜き記号）及びＤＮＡ断片化（黒
塗り記号）である。成長抑制は、６日間の処理の後にＳ
ＲＢ分析して測定した。ＤＮＡ断片化は、４８時間の処
理後に測定した。全データは同一実験から収集した。図
９は、化合物Ｅの特性を含むアポトーシスを示す。ＨＴ
−２９結腸腺癌細胞を、指示濃度の化合物Ｅで４８時間
処理し、アポトーシスをＤＮＡ断片化分析で測定した。
算出されたＥＣ50値は、０．０５μＭだった。図１０
は、化合物Ｂの特性を含むアポトーシスを示す。ＨＴ−
２９結腸腺癌細胞を、指示濃度の化合物Ｂで４８時間処
理し、アポトーシスを、ＤＮＡ断片化分析で測定した。
算出されたＥＣ50値は、１７５μＭだった。
【表３】 一連の化合物中のアポトーシス誘導活性 基準化合物 １００μＭにおける誘導（倍） インドメタシン ＜２．０ ＭＹ５４４５ ４．７ 硫化スリンダク ７．９ エキシスリンド ＜２．０ 試験化合物 １００μＭにおける誘導（倍） Ａ ＜２．０ Ｂ ３．４ Ｃ ５．６ Ｄ ＜２．０ Ｅ ４．６ 上記の４．Ｂ．の分析に従って、上記表３に報告したよ
うに、化合物Ａ乃至Ｅの、アポトーシス誘導活性を試験
した。化合物Ｂ、Ｃ及びＥは、１００μＭの投与量で
２．０倍より大きい、重大なアポトーシス誘導活性を示
した。これら３つの化合物のうち、化合物Ｂ及びＥのみ
投与すると、ＣＯＸは阻害されず、ＰＤＥ５が阻害され
る。一連のホスホジエステラーゼ阻害剤のアポトーシス
誘導活性を測定した。そのデータを以下の表４に示す。
ＨＴ−２９細胞を、６日間、種々のホスホジエステラー
ゼ阻害剤で処理した。アポトーシス及びネクローシス
を、上記４．Ａ．の分析に従って標識した後に、アクリ
ジンオレンジ及び臭化エチジウムで形態学的に測定し
た。このデータは、ＰＤＥ５が、ＨＴ−２９細胞のアポ
トーシスを誘導する化合物のスクリーニングに有用であ
ることを示している。
【表４】 ＰＤＥ阻害剤のアポトーシス誘導データ 阻害剤 報告された選択性 アポトーシス％ ネクローシス％ 溶媒 ８ ６ ８−メトキシ−ＩＢＭＸ ＰＤＥ１ ２ １ ミルリノン ＰＤＥ３ １８ ０ ＲＯ−２０−１７２４ ＰＤＥ４ １１ ２ ＭＹ５４４５ ＰＤＥ５ ８０ ５ ＩＢＭＸ 選択性なし ４ １３
【００４０】実施例４−成長抑制分析 基準化合物と試験化合物のＰＤＥ５阻害活性を、３．
Ａ．の分析に対する手順に従って分析した。図１１は、
ＨＴ−２９細胞の成長における抑制への、種々の濃度の
硫化スリンダク及びエキシスリンドの影響を示す。ＨＴ
−２９細胞は、６日間、エキシスリンド（三角形）又は
硫化物（四角形）で示した種々の投与量で処理した。細
胞数は、既に記述されている（Piazzaら、Cancer Resea
rch 、55、3110〜3116頁、1995年）スルホローダミン分
析で測定した。硫化物に対するＩＣ 50値は、約４５μＭ
であり、スルホンに対しては２００μＭである。このデ
ータは、硫化スリンダク及びエキシスリンドが、腫瘍細
胞成長を抑制できることを示している。図１２は、硫化
スリンダクの成長抑制及びアポトーシス誘導活性を示
す。時間経過の実験を、ＨＴ−２９細胞の溶媒０．１％
ＤＭＳＯ（白抜き記号）又は硫化スリンダク１２０μＭ
（黒塗り記号）のいずれかで処理したものを含めて示
す。成長抑制（上図）は、トリパンブルーで染色した後
に生存細胞を数えて測定した。アポトーシス（下図）
は、形態学的測定に続き、既に記述された（Duke及びCo
hen 、Current Protocols in Immunology 、3.17.1〜3.
17.16 頁、New York、John Wiley and Sons 、1992年）
アクリジンオレンジ及び臭化エチジウムで染色して測定
された。このデータは、硫化スリンダクが腫瘍細胞成長
を抑制でき、この硫化スリンダクの影響が、アポトーシ
スの増加を伴うことを示す。全データは同一の実験から
収集した。図１３は、試験化合物Ｅの成長抑制活性を示
す。ＨＴ−２９結腸腺癌細胞を、指示濃度の化合物Ｅで
６日間処理し、細胞数をＳＲＢ分析で測定した。算出し
たＩＣ50値は、０．０４μＭだった。
【表５】 一連の化合物中の成長抑制活性 基準化合物 １００μＭにおける抑制（％） インドメタシン ７５ ＭＹ５４４５ ８８ 硫化スリンダク ８８ エキシスリンド ＜５０ 試験化合物 １００μＭにおける抑制（％） Ａ ６８ Ｂ ７７ Ｃ ８０ Ｄ ７８ Ｅ ６２ 上記３．Ａ．のスクリーニング手順に従って、上記表５
に報告されているように、化合物Ａ乃至Ｅの成長抑制活
性を試験した。全ての試験化合物は、１００μＭの単一
用量試験で、基準エキシスリンドを超えた活性を示し
た。一連のホスホジエステラーゼ抑制剤の成長抑制活性
を測定した。そのデータを以下の表６に示す。ＨＴ−２
９細胞を、６日間、ホスホジエステラーゼの種々の抑制
剤で処理した。細胞成長は、３．Ａ．に従ったＳＲＢ分
析によって測定された。このデータは、ＰＤＥ５阻害が
腫瘍細胞成長を抑制するのに有効だったことを示す。
【表６】 ＰＤＥ阻害剤の成長抑制のデータ 阻害剤 記録された選択性 成長抑制(IC50,μM) ８−メトキシ−ＩＢＭＸ ＰＤＥ１ ＞２００μＭ ミルリノン ＰＤＥ３ ＞２００μＭ ＲＯ−２０−１７２４ ＰＤＥ４ ＞２００μＭ ＭＹ５４４５ ＰＤＥ５ ５μＭ ＩＢＭＸ 選択性なし ＞２００μＭ 種々の形態の腫瘍症におけるこのスクリーニング方法の
有効性を示すために、化合物を、多数の株細胞で試験し
た。種々の株細胞における硫化スリンダク及びエキシス
リンドの効果を測定した。このデータを以下の表７に示
す。ＩＣ50値は、ＳＲＢ分析で測定した。このデータ
は、広範な腫瘍症におけるこれら化合物の広範な有効性
を示している。従って、本発明で同定された化合物は、
複数の形態の腫瘍症の治療に有用であると考えられる。
【表７】 種々の株細胞の成長抑制のデータ 細胞の型／ ＩＣ50（μＭ） 組織特異性 硫化スリンダク エキシスリンド ＨＴ−２９、結腸 ６０ １２０ ＨＴＣ１１６、結腸 ４５ ９０ ＭＣＦ７／Ｓ、乳房 ３０ ９０ ＵＡＣＣ３７５、黒色腫 ５０ １００ Ａ−４２７、肺 ９０ １３０ 気管支の上皮細胞（正常） ３０ ９０ ＮＲＫ、腎臓（正常） ５０ １８０ ＫＮＲＫ、腎臓（癌化） ６０ ２４０ ヒト前立腺癌腫ＰＣ３ ８２
【００４１】実施例５−乳腺器官培養モデルにおける活
性 図１４は、スリンダク代謝による乳腺器官培養におけ
る、妊娠前の病変の阻害を示す。乳腺器官培養実験を、
既に記述された方法（Mehta 及びMoon、Cancer Researc
h 、46、5832〜5835頁、1986年）で実行した。この結果
は、硫化スリンダクが不活性な間、スリンダクとエキシ
スリンドは、妊娠前の病変の形成を有効に阻害すること
を立証した。このデータは、シクロオキシゲナーゼ阻害
が、所望の化合物の抗腫瘍性特性に必須ではないとの仮
定を支持している。
【００４２】分析 腫瘍症を治療に対する有用性を有する化合物を同定する
ために、本発明は、いくつかの手順から試験化合物の実
験データを比較するための原理を提供する。本発明の枠
組みの中で、試験化合物は、その試験化合物のヒトの腫
瘍症の治療に対する有用性に従って並べられる。所望の
効果を有する試験化合物を、更に高価でかつ時間を消費
するような、ヒトの臨床試験を開始する前に認可を得る
必要がある動物実験のために選択する。種々の試験化合
物の定性データ及びいくつかの手順を、以下の表８に示
す。このデータは、エキシスリンド、化合物Ｂ及びＥ
が、適当な活性を示して４つの分析のスクリーンを通過
することを表しており、その４つの分析は、ＣＯＸ阻害
の欠如、ＰＤＥ阻害、成長抑制、アポトーシス誘導であ
る。乳腺器官培養におけるこれらの化合物の活性は、本
発明の有効性を確証する。スクリーニング手順の定性的
な評価は、化合物Ｅが最高で、次に化合物Ｂ、さらにエ
キシスリンドが並ぶ。
【表８】 種々の化合物の活性プロフィール COX PDE5 乳腺 化合物 阻害 阻害 成長抑制 アポトーシス 器官培養 エキシスリンド - ++ ++ ++ +++ 硫化スリンダク ++++ +++ +++ +++ - ＭＹ５４４５ ++++ +++ +++ +++ + Ａ - - +++ ++ ++ Ｂ - +++ +++ +++ ++ Ｄ - - ++ - - Ｅ - ++++ ++++ ++++ ++++ Ｆ - - ++ + - Ｇ - - +++ ++ +++ Ｈ - - ++ - - 表８コード：化合物の活性は、最大の活性及び効力の試験を含む一連の実験の 評価に基づく。 −不活性 ＋わずかに活性 ＋＋中程度に活性 ＋＋＋強く活性＋＋＋＋記録された中で最も高い活性
【００４３】明らかに、多数の本発明の修正及び改変
は、上記教示に照らして可能である。従って、添付した
請求の範囲の範囲内で理解することができ、本発明は、
ここで特異的に記述されているのと別に実行してもよ
い。
【図面の簡単な説明】
【図１】精製したシクロオキシゲナーゼの活性に対す
る、スリンダクのスルフィン誘導体及びスリンダクのス
ルホン誘導体（a.k.a.エキシスリンド）の影響を示す。
【図２】ＣＯＸ阻害に対する、試験化合物Ｂ及びＥの影
響を示す。
【図３】培養された腫瘍細胞から精製したＰＤＥ−４及
びＰＤＥ５に対する、硫化スリンダク及びエキシスリン
ドの影響を示す。
【図４】ＨＴ−２９細胞中のサイクリックヌクレオチド
レベルに対する、硫化スリンダクの影響を示す。
【図５】化合物Ｂのホスホジエステラーゼ阻害活性を示
す。
【図６】化合物Ｅのホスホジエステラーゼ阻害活性を示
す。
【図７】ＨＴ−２９細胞のアポトーシス及びネクローシ
スに対する硫化スリンダク及びエキシスリンドの影響を
示す。
【図８】ＤＮＡ断片化で測定されたＨＴ−２９細胞成長
抑制及びアポトーシス誘導に対する硫化スリンダク及び
エキシスリンドの影響を示す。
【図９】化合物Ｅのアポトーシス誘導特性を示す。
【図１０】化合物Ｂのアポトーシス誘導特性を示す。
【図１１】腫瘍細胞成長に対する、硫化スリンダク及び
エキシスリンドの影響を示す。
【図１２】硫化スリンダク及びコントロール（ＤＭＳ
Ｏ）の成長抑制及びアポトーシス誘導活性を示す。
【図１３】化合物Ｅの成長抑制活性を示す。
【図１４】スリンダク代謝物で培養したマウスの乳腺器
官中の、妊娠前の腫瘍性病変の阻害を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年６月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゲアリー エイ ピアッザ アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 18901 ドイルスタウン エヴァーヴィュ ー ドライヴ 4600 (72)発明者 ダブリュー ジョセフ トンプソン アメリカ合衆国 アラバマ州 36608 モ ービル ウッドヒル サークル 244

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】腫瘍症を治療する潜在能力を有する化合物
    の同定方法であって、化合物のシクロオキシゲナーゼ
    （ＣＯＸ）阻害活性を測定し、かつ該化合物のＰＤＥ５
    阻害活性を測定し、低ＣＯＸ阻害活性と高ＰＤＥ５阻害
    活性を示す化合物が、腫瘍症治療の潜在能力を有するも
    のであるとすることを特徴とする、当該化合物の同定方
    法。
  2. 【請求項２】化合物が、培養中の腫瘍細胞成長を抑制す
    るか否かを測定する工程を含み、腫瘍細胞成長を抑制す
    る化合物が、腫瘍症治療の潜在能力を有するものである
    とすることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方
    法。
  3. 【請求項３】化合物のＣＯＸ阻害活性を、該化合物と精
    製したシクロオキシゲナーゼを接触させ、かつ、シクロ
    オキシゲナーゼ活性の変化を測定することにより行い、
    約１００μＭの濃度において２５％未満のＣＯＸ阻害活
    性を示す化合物を、腫瘍症治療の潜在能力についてさら
    に評価すべきものであるとすることを特徴とする、請求
    の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】化合物のＣＯＸ阻害活性を、該化合物とＰ
    ＥＧ−２を分泌する細胞を接触させ、かつ、細胞からの
    ＰＥＧ−２分泌の減少を測定することにより行い、ＰＥ
    Ｇ−２分泌の減少を、プロスタグランジンシンセターゼ
    活性の減少と相関させることを特徴とする、請求の範囲
    第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】化合物が腫瘍細胞のアポトーシスを誘導す
    るか否かを測定し、アポトーシスの誘導を示す化合物
    を、腫瘍症治療の潜在能力を有するものであるとするこ
    とを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。
  6. 【請求項６】化合物が試料中で腫瘍細胞成長を抑制する
    か否かを測定し、腫瘍細胞成長の抑制を示す化合物を、
    腫瘍症治療の有用性を有するものであるとすることを特
    徴とする、請求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】該化合物と細胞培養物を接触させ、細胞間
    のサイクリックＧＭＰの濃度を測定することによりＰＤ
    Ｅ活性を測定し、１０μＭの濃度において５０％より大
    きいＰＤＥ阻害活性を示す化合物を、腫瘍細胞の治療の
    潜在能力についてさらに評価すべきものであるとするこ
    とを特徴とする、請求の範囲第５項記載の方法。
  8. 【請求項８】細胞間のサイクリックＧＭＰ／サイクリッ
    クＡＭＰの濃度比を測定することによりＰＤＥ活性を測
    定し、当該比が１０μＭの濃度において３倍以上に増加
    する化合物を、腫瘍細胞の治療の潜在能力についてさら
    に評価すべきものであるとすることを特徴とする、請求
    の範囲第５項記載の方法。
  9. 【請求項９】アポトーシスを、化合物と細胞培養物を接
    触させ、該化合物が細胞質内の断片化したＤＮＡの量を
    増加させるかを測定することにより測定し、１００μＭ
    の濃度において２倍の刺激より大きいアポトーシスの増
    加を示す化合物を、腫瘍細胞の治療の潜在能力について
    さらに評価すべきものであるとすることを特徴とする、
    請求の範囲第５項記載の方法。
  10. 【請求項１０】腫瘍症治療の潜在的有用性を有する化合
    物の選択方法であって、該化合物の成長抑制活性を測定
    し、該化合物のＰＤＥ５阻害活性を測定し、成長抑制活
    性及びＰＤＥ５阻害活性を示す化合物を選択することを
    特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】成長抑制活性に対するＩＣ50値が、腫瘍
    症の治療に使用する際に、約１００μＭ未満である化合
    物を同定する工程を更に含む、請求の範囲第１０項記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】化合物が細胞のアポトーシスを起こすか
    否かを測定し、アポトーシスを起こす化合物を選択する
    工程を更に含む、請求の範囲第１０項記載の方法。
  13. 【請求項１３】アポトーシス活性に対するＥＣ50値が、
    約１００μＭ未満である化合物を選択する工程を更に含
    む、請求の範囲第１２項記載の方法。
  14. 【請求項１４】該化合物のＣＯＸ阻害活性を測定し、Ｐ
    ＤＥ５阻害活性と比較してＣＯＸ阻害活性が低い化合物
    を選択する工程を更に含む、請求の範囲第１０項記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】化合物のＣＯＸ阻害活性を、該化合物と
    シクロオキシゲナーゼを接触させ、かつ、シクロオキシ
    ゲナーゼ活性の変化を測定することにより測定し、シク
    ロオキシゲナーゼ活性の減少を、プロスタグランジンシ
    ンセターゼ活性の減少と相関させることを特徴とする、
    請求の範囲第１４項記載の方法。
  16. 【請求項１６】化合物のＣＯＸ阻害活性を、該化合物と
    ＰＧＥ−２を分泌する細胞とを接触させ、かつ、細胞か
    らのＰＧＥ−２分泌の減少を測定することにより測定
    し、ＰＧＥ−２分泌の減少を、プロスタグランジンシン
    セターゼ活性の減少と相関させることを特徴とする、請
    求の範囲第１４項記載の方法。
  17. 【請求項１７】腫瘍症の予防及び慢性的な治療を必要と
    する患者への投与に有用な化合物の同定方法であって、
    該化合物のＣＯＸ阻害活性を測定し、該化合物のＰＤＥ
    ５阻害活性を測定し、ＰＤＥ５阻害活性を示す化合物
    を、腫瘍症治療が必要な患者の治療に有用なものである
    とすることを特徴とする方法。
  18. 【請求項１８】ＰＤＥ５イソ酵素阻害に対する選択性を
    有する化合物を測定することを特徴とする、請求の範囲
    第１７項記載の方法。
  19. 【請求項１９】化合物の成長抑制活性を測定し、かなり
    の成長抑制活性を示す濃度で、ＣＯＸ阻害活性よりかな
    り大きいホスホジエステラーゼ阻害活性を有する化合物
    を同定する工程を更に含む、請求の範囲第１７項記載の
    方法。
  20. 【請求項２０】成長抑制活性が、試料中の細胞数の減少
    により測定されることを特徴とする、請求の範囲第１９
    項記載の方法。
  21. 【請求項２１】成長抑制活性が、試料中のアポトーシス
    誘導レベルにより測定されることを特徴とする、請求の
    範囲第１７項記載の方法。
  22. 【請求項２２】アポトーシス誘導レベルが、ネクローシ
    ス誘導レベルよりもかなり大きい化合物を、腫瘍症の治
    療が必要な患者の治療に有用なものであるとすることを
    特徴とする、請求の範囲第１７項記載の方法。
  23. 【請求項２３】腫瘍症を治療する潜在能力を有する化合
    物のスクリーニング方法であって、化合物のＰＤＥ５阻
    害活性を測定し、前もって決定された値よりも大きい阻
    害活性を有する化合物を選択することを特徴とする方
    法。
  24. 【請求項２４】選択された化合物が、細胞間でアポトー
    シスを誘導するか否かを測定し、前もって決定された値
    よりも大きいアポトーシス誘導活性を有する化合物を選
    択する、請求の範囲第２３項記載の方法。
  25. 【請求項２５】選択された化合物が、プロスタグランジ
    ン合成を阻害するか否かを測定し、前もって決定された
    値よりも小さい阻害活性を有する化合物を選択する、請
    求の範囲第２４項記載の方法。
  26. 【請求項２６】ＰＤＥ５活性が、細胞間サイクリックＧ
    ＭＰ及びサイクリックＡＭＰを測定し、かつサイクリッ
    クＧＭＰとサイクリックＡＭＰの比の増加が生じるか否
    かを測定することによって測定されることを特徴とす
    る、請求の範囲第２４項記載の方法。
  27. 【請求項２７】腫瘍症を治療する潜在能力を有する化合
    物の同定方法であって、該化合物のＣＯＸ−Ｉ阻害活性
    を測定し、かつ、該化合物のＰＤＥ５阻害活性を測定
    し、低ＣＯＸ−Ｉ阻害活性と高ＰＤＥ５阻害活性を示す
    化合物が、腫瘍症治療の潜在能力を有するものとするこ
    とを特徴とする方法。
  28. 【請求項２８】腫瘍症を治療する潜在能力を有する化合
    物の同定方法であって、腫瘍性細胞を約２００μＭと２
    ００ｐＭの間の濃度の評価されるべき化合物を用いて処
    理し、処理細胞におけるｃＧＭＰの細胞間の量を測定
    し、かつ、処理細胞におけるｃＡＭＰの細胞間の量を測
    定し、処理細胞におけるｃＧＭＰ／ｃＡＭＰの比と比較
    した未処理腫瘍性細胞におけるｃＧＭＰ／ｃＡＭＰの比
    が、約３倍又はそれ以上に増加した化合物が、腫瘍症治
    療の潜在能力を有するものとすることを特徴とする、当
    該化合物の同定方法。
  29. 【請求項２９】処理細胞におけるｃＧＭＰの細胞間の量
    が５００fmol/mg タンパク質より大きい化合物が、腫瘍
    症治療の潜在能力を有するものとすることを特徴とす
    る、請求の範囲第２８項記載の方法。
  30. 【請求項３０】処理細胞におけるｃＡＭＰの細胞間の量
    が４０００fmol/mgタンパク質より小さい化合物が、腫
    瘍症治療の潜在能力を有するものとすることを特徴とす
    る、請求の範囲第２８項記載の方法。
  31. 【請求項３１】処理細胞におけるｃＡＭＰの細胞間の量
    が４０００fmol/mgタンパク質より小さい化合物が、腫
    瘍症治療の潜在能力を有するものとすることを特徴とす
    る、請求の範囲第３０項記載の方法。
  32. 【請求項３２】腫瘍症の治療に有用な化合物を選択する
    方法であって、該化合物の成長抑制活性と、該化合物の
    ＰＤＥ５阻害活性とを比較し、成長抑制活性及びＰＤＥ
    ５阻害活性を示す化合物を選択することを特徴とする、
    当該選択方法。
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