CZ165198A3 - Způsob identifikace sloučenin pro inhibici neoplastických lézí - Google Patents
Způsob identifikace sloučenin pro inhibici neoplastických lézí Download PDFInfo
- Publication number
- CZ165198A3 CZ165198A3 CZ981651A CZ165198A CZ165198A3 CZ 165198 A3 CZ165198 A3 CZ 165198A3 CZ 981651 A CZ981651 A CZ 981651A CZ 165198 A CZ165198 A CZ 165198A CZ 165198 A3 CZ165198 A3 CZ 165198A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- compound
- inhibitory activity
- compounds
- activity
- pde5
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 217
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title claims description 50
- 230000003902 lesion Effects 0.000 title description 35
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 title description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 81
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 61
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 55
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 claims abstract description 44
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 96
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 70
- 102000004005 Prostaglandin-endoperoxide synthases Human genes 0.000 claims description 69
- 108090000459 Prostaglandin-endoperoxide synthases Proteins 0.000 claims description 69
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 37
- ZOOGRGPOEVQQDX-UHFFFAOYSA-N cyclic GMP Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C=NC2=C1NC(N)=NC2=O ZOOGRGPOEVQQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 claims description 14
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 12
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 9
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 8
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 8
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 claims description 8
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 claims description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 6
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 2
- 101100189582 Dictyostelium discoideum pdeD gene Proteins 0.000 claims 14
- 101150098694 PDE5A gene Proteins 0.000 claims 14
- 102100029175 cGMP-specific 3',5'-cyclic phosphodiesterase Human genes 0.000 claims 14
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims 1
- 210000000448 cultured tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 51
- 229950000484 exisulind Drugs 0.000 description 32
- MVGSNCBCUWPVDA-MFOYZWKCSA-N sulindac sulfone Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(F)=CC=C2\C1=C/C1=CC=C(S(C)(=O)=O)C=C1 MVGSNCBCUWPVDA-MFOYZWKCSA-N 0.000 description 32
- LFWHFZJPXXOYNR-RQZCQDPDSA-N 2-[(3e)-6-fluoro-2-methyl-3-[(4-methylsulfanylphenyl)methylidene]inden-1-yl]acetic acid Chemical compound C1=CC(SC)=CC=C1\C=C/1C2=CC=C(F)C=C2C(CC(O)=O)=C\1C LFWHFZJPXXOYNR-RQZCQDPDSA-N 0.000 description 28
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 17
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 13
- 101100296720 Dictyostelium discoideum Pde4 gene Proteins 0.000 description 11
- 101100082610 Plasmodium falciparum (isolate 3D7) PDEdelta gene Proteins 0.000 description 11
- JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N compound E Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]1C(N(C)C2=CC=CC=C2C(C=2C=CC=CC=2)=N1)=O)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N 0.000 description 11
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 9
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 9
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- -1 prostaglandin PG Chemical class 0.000 description 8
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- MLKXDPUZXIRXEP-MFOYZWKCSA-N sulindac Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(F)=CC=C2\C1=C/C1=CC=C(S(C)=O)C=C1 MLKXDPUZXIRXEP-MFOYZWKCSA-N 0.000 description 7
- 206010051925 Intestinal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 6
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 6
- 108050003267 Prostaglandin G/H synthase 2 Proteins 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 231100000338 sulforhodamine B assay Toxicity 0.000 description 6
- 238000003210 sulforhodamine B staining Methods 0.000 description 6
- 229960000894 sulindac Drugs 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 5
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 208000032177 Intestinal Polyps Diseases 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 229940082638 cardiac stimulant phosphodiesterase inhibitors Drugs 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000002571 phosphodiesterase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010053155 Epigastric discomfort Diseases 0.000 description 3
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 3
- 208000015768 polyposis Diseases 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- ZIVVFXPARRPZIS-UHFFFAOYSA-N 2-(3h-inden-1-yl)acetamide Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)N)=CCC2=C1 ZIVVFXPARRPZIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKTORXLUQLQJCM-UHFFFAOYSA-N 4-phosphonobutylphosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCCP(O)(O)=O JKTORXLUQLQJCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HIYAVKIYRIFSCZ-CYEMHPAKSA-N 5-(methylamino)-2-[[(2S,3R,5R,6S,8R,9R)-3,5,9-trimethyl-2-[(2S)-1-oxo-1-(1H-pyrrol-2-yl)propan-2-yl]-1,7-dioxaspiro[5.5]undecan-8-yl]methyl]-1,3-benzoxazole-4-carboxylic acid Chemical compound O=C([C@@H](C)[C@H]1O[C@@]2([C@@H](C[C@H]1C)C)O[C@@H]([C@@H](CC2)C)CC=1OC2=CC=C(C(=C2N=1)C(O)=O)NC)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-CYEMHPAKSA-N 0.000 description 2
- ARSRBNBHOADGJU-UHFFFAOYSA-N 7,12-dimethyltetraphene Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(C=CC=C1)C1=C2C ARSRBNBHOADGJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 2
- PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N Aldosterone Natural products C1CC2C3CCC(C(=O)CO)C3(C=O)CC(O)C2C2(C)C1=CC(=O)CC2 PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N Aldosterone Chemical compound C([C@@]1([C@@H](C(=O)CO)CC[C@H]1[C@@H]1CC2)C=O)[C@H](O)[C@@H]1[C@]1(C)C2=CC(=O)CC1 PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N 0.000 description 2
- 206010004950 Birth mark Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 101100135868 Dictyostelium discoideum pde3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101001117089 Drosophila melanogaster Calcium/calmodulin-dependent 3',5'-cyclic nucleotide phosphodiesterase 1 Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 2
- 208000006994 Precancerous Conditions Diseases 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 2
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229960002478 aldosterone Drugs 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002583 anti-histone Effects 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- HIYAVKIYRIFSCZ-UHFFFAOYSA-N calcium ionophore A23187 Natural products N=1C2=C(C(O)=O)C(NC)=CC=C2OC=1CC(C(CC1)C)OC1(C(CC1C)C)OC1C(C)C(=O)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960003574 milrinone Drugs 0.000 description 2
- PZRHRDRVRGEVNW-UHFFFAOYSA-N milrinone Chemical compound N1C(=O)C(C#N)=CC(C=2C=CN=CC=2)=C1C PZRHRDRVRGEVNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 2
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MLKXDPUZXIRXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[6-fluoro-2-methyl-3-[(4-methylsulfinylphenyl)methylidene]-1-indenyl]acetic acid Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(F)=CC=C2C1=CC1=CC=C(S(C)=O)C=C1 MLKXDPUZXIRXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 2-thiobarbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=S)N1 RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- LNRBMIIVYJYIMH-UHFFFAOYSA-N 6-fluoro-2-methyl-3-[(4-methylsulfonylphenyl)methylidene]-1,2-dihydroindene Chemical compound CC1CC2=CC(F)=CC=C2C1=CC1=CC=C(S(C)(=O)=O)C=C1 LNRBMIIVYJYIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100024318 Calcium/calmodulin-dependent 3',5'-cyclic nucleotide phosphodiesterase 1B Human genes 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 1
- 102000010906 Cyclooxygenase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010037464 Cyclooxygenase 1 Proteins 0.000 description 1
- VFZRZRDOXPRTSC-UHFFFAOYSA-N DMBA Natural products COC1=CC(OC)=CC(C=O)=C1 VFZRZRDOXPRTSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017788 Gastric haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000573199 Homo sapiens Protein PML Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101000909851 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) cAMP/cGMP dual specificity phosphodiesterase Rv0805 Proteins 0.000 description 1
- CEHQLKSLMFIHBF-UHFFFAOYSA-N N-(3-chlorophenyl)-4-phenyl-1-phthalazinamine Chemical compound ClC1=CC=CC(NC=2C3=CC=CC=C3C(C=3C=CC=CC=3)=NN=2)=C1 CEHQLKSLMFIHBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000272108 Ophiophagus hannah Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229940123932 Phosphodiesterase 4 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940123333 Phosphodiesterase 5 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 208000009621 actinic keratosis Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003491 cAMP production Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 239000012259 ether extract Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000054896 human PML Human genes 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002587 phosphodiesterase IV inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002590 phosphodiesterase V inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 208000014081 polyp of colon Diseases 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000001855 preneoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 210000004765 promyelocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- HJORMJIFDVBMOB-UHFFFAOYSA-N rolipram Chemical compound COC1=CC=C(C2CC(=O)NC2)C=C1OC1CCCC1 HJORMJIFDVBMOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950005741 rolipram Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- MVGSNCBCUWPVDA-UHFFFAOYSA-N sulindac sulfone Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(F)=CC=C2C1=CC1=CC=C(S(C)(=O)=O)C=C1 MVGSNCBCUWPVDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/533—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving isomerase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Způsob identifikace sloučenin pro inhibici neoplastických lézí
Oblast techniky
Vynález vytváří způsob identifikace sloučenin potenciálně užitečných pro léčení a prevenci prekancerozních a kancerozních lézí u savců. Tato přihláška je částečně pokračovací US patentové přihlášky číslo 08/866 027 původců Piazzy a j., přihlášené 30. května 1997.
Dosavadní stav techniky
Familiální a denomatozní polypoza (FAP) je zděděná nemoc, kde tlusté střevo oběti obsahuje mnoho polypů nebo adenomů ve skutečnosti ve většině případů nepočitatelných. Poněvadž tito pacienti vyvíjejí tolik polypů nebo adenomů, z nichž každý je významným rizikem vývoje na rakovinu, je typickým léčením chirurgické odstranění tlustého střeva.
Kolem roku 1983 Waddell objevil, že nesteroidní protizánětlivé léčivo (NSAID) sulindak působí regresi střevních polypů (typ prekancerozní léze) a zabrání jejich opakování, když toto léčivo bylo podáváno pacientům s FAP. Waddellova zkušenost se sulindakem u FAP pacientů byla potvrzena v několika následných studiích. Naneštěstí, protože sulindak a jiné NSAID zatěžují zažívací trakt (neřku-li postranní efekty zahrnující ledviny a interferenci s normálním srážením krve) pacientů, kterým byl chronicky podáván, nelze je použít pro praktické léčení FAP nebo jinou rakovinu nebo prekancerozní indikaci (to je neoplasii) vyžadující dlouhodobé podávání.
Waddell původně předpokládal, že mechanizmus působení sulindaku na střevní polypy zahrnuje inhibici syntézy prostaglandinu (PG). (Waddell, W.R. a j. Sulindak pro polypozu tlustého střeva Journal of Curgical Oncology, 24:83-87,19§3 ) .
* ·
- 2 Inhibice syntézy prostaglandinu PG vyplývá z inhibice cyklooxygenasy (COX) vyvolané NSAID. Běžná výhoda NSAID spočívá v redukci zánětu, což je známo že je vyvoláno redukcí hladin PG. Protože NSAID jsou známy, že ihnibují COX, který inhibuje PG syntézu, má se široce za to, že regrese střevních polypů je přisouditelná této vlastnosti. Ve skutečnosti přes současné objevy se naopak dostává do konvenčního vědomí, že podávání inhibitoru PG syntézy (například NSAID) pacientům s FAP nebo jinými prekancerozními nebo kancerozními lézemi vede k regresi léze vlivem redukce PG hladin.
Nedávné objevy však vedou vědce v úplně rozdílném směru, a to že není nutné inhibovat COX, aby se úspěšné léčily neoplasie pacientů. Pamukcu a j. v US patentu č. 5 401 774 uvedli, že sulfonylové sloučeniny, které byly dříve uváděny, že jsou inaktivní jako inhibitory PG syntézy (a tudíž ne NSAID nebo protizánětlivé sloučeniny) neočekávaně inhibovaly růst různých neoplastických buněk včetně polypových buněk tlustého střeva. Tyto sulfonylové deriváty se ukázaly být účinné u krysích modelů střevní karcinogenese a jedna varianta (nyní označována jako exisulind) se ukázala účinnou v předběžných lidských klinických zkouškách s FAP pacienty.
Důležitost tohoto objevu - a rozvázání antineoplastické aktivity COX inhibice - nemohou být přeháněny. Kdyby tyto dva jevy byly ve vztahu, byla by malá naděje pro bezpečnou NSAID terapii pro FAP pacienty, protože postranní účinky NSAID jako je podráždění žaludku, jsou také vyvolány COX inhibicí. Prostaglandiny hrají ochrannou funkci ve výstelce žaludku. Když se podávají NSAID, COX se inhibuje a PG hladiny se redukují: podráždění žaludku je běžným výsledkem. Tyto postranní účinky se nemohou projevit v krátkodobé (akutní) NSAID terapii. Avšak během dlouhodobé (chronické) NSAID terapie jsou žaludeční podráždění, krvácení a ulcerace velmi běžné.
• « « · · · • · · · · · · « « v · · · *
- 3 Ve významném počtu případů NSAID terapie musí být zastavena vlivem závažnosti těchto postranních účinků a jiných potenciálně letálních postranních účinků. Dále vážnost těchto postranních účinku vzrůstá s věkem, pravděpodobně proto, že přirozené PG hladiny v žaludeční sliznici klesají s věkem. Tedy užitečné sloučeniny pro léčení neoplastických lézí by měly vhodně inhibovat růst neoplastických buněk, ale neměly by inhibovat COX.
Konvenční metody pro třídění sloučenin mohou být použity ke zjištění výhodných sloučenin, které inhibují růst neoplastických buněk. Za tohoto scénáře léčiva mohou být tříděna pomocí modelů in vitro. Ale konvenční in vitro třídicí metody mohou být použity u mnoha sloučenin, které se později ukáží být neúčinnými u zvířecích modelů vzhledem k mnoha neočekávaným problémům, z nichž jeden může být ten, že in vitro třídění není předpokladem účinnosti.
Modelové studie na zvířatech jsou časově náročné a nákladné. Tudíž je potřebná preciznější in vitro třídicí metoda, která vytváří prediktivní informaci pro léčení neoplasie, k třídění sloučenin před testováním na lidech. Znalost specifického cíle pro inhibici lidské rakoviny by umožnilo větší přesnost a účinnost, čímž mohou být identifikovány vysoce: efektivní a bezpečné sloučeniny přes testováním na zvířatech.
V současnosti racionální metody při vývoji léčiv se aplikují ve farmaceutickém průmyslu k zlepšení metod pro iden-) tifikaci klinicky užitečných sloučenin. Typicky racionální metody objevování léčiv se týkají konceptu zámek a klíč, čímž se definují strukturální vztahy mezi terapeutickou cílenou molekulou (zámek) a farmaceutickými sloučeninami (klíč). Takovéto metody jsou značně zhodnoceny speciálním počítačovým softwarem, kterýma databáze sloučenin k indentifikaci, vhodných geometrických shod s cílenou molekulou.
Naneštěstí k použití těchto systémů, se musí proniknout k cílené molekule (zámek). Cílem může být enzym, protein, membrána nebo jádrový receptor nebo například sekvence nukleové kyseliny.
U komplexních nemocí jako je neoplasie, vědci identifikovali mnoho potenciálních cílů. Avšak mnoho léčiv dostupných pro léčení neoplasie je nespecifických a toxických k normálním tkáním a nejsou indikovány pro předrakovinné stavy a používají se jen když neoplastické buňky vedou k rakovině. Větší poznání mechanizmu zahrnutého v rakovině může vést vědce na cestě k navrhování specifičtějších antineoplastických léčiv, léčiv, která mohou být bezpečně podávána dříve v chorobném procesu.
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká nové in vitro metody pro roztřiciovací zkoušky sloučenin na jejich schopnost léčit a předcházet bezpečně neoplasii, zejména prekancerozním lézím. Zejména předložený vynález vytváří způsob identifikačních testů sloučenin, které mohou být použity k léčení a prevenci neoplasie včetně prekancerozních lézí, s minimálními postranními účinky spojenými s COX inhibicí a jinými nespecifickými interakcemi.
V jednom provedení tohoto vynálezu roztřiňovací metoda zahrnuje určení COX inhibiční aktivity testované sloučeniy. Poněvadž původci objevili vztah mezi inhibicí rakoviny a inhibicí typu -5 isoenzymu fosfodiesterasy (PDE5), tento vynález zahrnuje určení PDE5 inhibiční aktivity sloučenin. Výhodně roztřiáovací metoda tohoto vynálezu dále zahrnuje určení, zda sloučeniny ihnibují růst nádorových buněk v buněčné kultuře.
V alternativním provedení roztřiáovací metoda tohoto vynálezu zahrnuje určení COX inhibiční aktivity sloučeniny, určení PDE5 inhibiční aktivity sloučeniny a určení, zda sloučenina vyvolá apoptosi v nádorových buňkách.
Tříděním sloučenin tímto způsobem mohou být potenciálně výhodné a lepší sloučeniny identifikovány rychleji a s větší přesností, než to bylo možné v minulosti. DalIH výhody budou zjevné z detailního popisu, který následuje.
Stručný popis výkresů
| Obr. | 1 | znázorňuje účinek sulfidového derivátu sulindaku a sulfonového derivátu sulindaku (a.k.a.exisulind) na aktivitu vyčištěné cyklooxygenasy, |
| obr. | 2 | znázorňuje účinky testovaných sloučenin B a E na COX inhibici, |
| obr. | 3 | znázorňuje inhibiční účinky sulfidu sulindaku a exisulindu na PDE4 a PDE5 vyčištěných z kultivovaných nádorových buněk, |
| obr. | 4 | znázorňuje účinky sulindaksulfidu na cyklické nukleotidové hladiny u HT-29 buněk, |
| obr. | 5 | znázorňuje fosfodiesterasovou inhibiční aktivitu sloučeniny B, |
| obr. | 6 | znázorňuje fosfodiesterasovou inhibiční aktivitu) sloučeniny E, |
| obr. | 7 | znázorňuje účinky sulindaksulfidu a exisulindu na apoptosu a nekrosu HT-29 buněk, |
obr.
znázorňuje účinky sulindaksulfidu a exisulindu na inhibici růstu HT-29 buněk a indukci apoptosy jak je určeno DNA fragmentací, znázorňuje apoptosu vyvolávající vlastnosti slouče- niny E, znázorňuje vlastnosti indukující apoptosu u sloučeniny B, znázorňuje účinky sulindaksulfidu a exisulindu na růst nádorových buněk, znázorňuje růstovou inhibiční a apoptosu vyvolávající aktivitu sulindaksulfidu a kontroly (DMSO), v
znázorhuje růstovou ihnibiční aktivitu sloučeniny E a obr. 14 znázorňuje inhibici premaligních neoplastických ltzí u myší prsní žlázové kultury pomocí metabolitu sulindaku.
• 4 * 4
« · 4 · · 4 · • · ♦ · • 4 4 4*
- 7 Detailní popis výhodných provedení
Způsob tohoto vynálezu je užitečný pro identifikaci sloučenin, které mohou být použity pro léčení nebo prevenci novotvarů a které nejsou vyznačeny významnými postranními účinky konvenčních NSAID.
Rakovina a předrakovinný stav mohou být považovány za nemoci, které zahrnují neregulovaný buněčný růst. Buněčný růst zahrnuje množství rozdílných faktorů. Jedním faktorem je jak rychle buňky proliferují a další zahrnuje jak rychle buňky zanikají. Buňky mohou zaniknout bud nekrozou nebo apoptosou v závislosti na druhu okolních stimulů. Buněčná diferenciace je ještě dalším faktorem, který ovlivňuje kinetiku nádorového růstu. Rozhodnutí, který z mnoha aspektů buněčného růstu je ovlivněn testovanou sloučeninou, je důležité k zjištění odpovídajícího cíle pro farmaceutickou terapii. Roztřidovací zkoušky, založené na této selektivitě mohou být kombinovány se zkouškami k určení, které sloučeniny mají aktivitu inhibující růst.
Tento vynález je produktem několika důležitých objevů. Zaprvé původci vynálezu objevili, že žádoucí inhibitory růstu nádorových buněk vyvolávají předčasný zánik rakovinných buněk apoptosou (viz Piazza, G. A. a j., Cancer Research, 55(14), 3110-16, 1995). Zadruhé původci vynálezu neočekávaně objevili, že sloučeniny, které selektivně indukují apoptosu bez podstatné COX inhibice také inhibují fosfodiesterasu (PDE). Zejména a v kontrastu s vůdčími vědeckými studiemi, žádoucí sloučeniny pro léčení neoplastických lézí selektivně inhibují typ 5 isoenzymové formy fosfodiesterasy (PDE5) (EC 3.1.4.17). PDE5 je jedním z alespoň 7 isoenzymů fosfodiesterasy. PDE5 je unikátní v tom, že selektivně degraduje cyklickou GMP, zatímco jiné typy PDE jsou bud neselektivní nebo degradují cyklickou AMP.
Výhodně požadované sloučeniny nepodstatně inhibují jiné fosfodiesterasové typy.
Výhodné provedení tohoto vynálezu zahrnuje určení cyklooxygenasové inhibiční aktivity dané sloučeniny a určení PDE5 ihnibiční aktivity sloučeniny. Testované sloučeniny jsou vyhodnocovány na jejich pravděpodobnou schopnost léčit neoplastické léze buá přímo stanovením jejich aktivit vůči specifickým určitým hodnotám nebo nepřímo porovnáním jejich aktivity vůči známým sloučeninám užitečným pro léčení neoplastických lézí.
Standardní sloučenina, která je známa, že je účinná pro léčení neoplastických lézí bez vyvolání žaludečních potíží je 5-fluor-2-methyl-l-(p-methylsulfonylbenzyliden)-3-indenyloctová kyselina (exisulind). Jiné užitečné sloučeniny pro srovánací účely zahrnují ty sloučeniny, které jsou známy, že inhibují COX jako je indomethacin a sulfidový metabolit sulindak: 5-fluor-2-methyl-l-(p-methylsulfinylbenzyliden)-3-indenyloctová kyselina (sulindaksulfid), Jiné užitečné sloučeniny pro srovnávací účely zahrnují ty, které jsou známy, že inhibují PDE5, jako je 1-(3-chloranilino)-4-fenylftalazin (MY5445).
Testovaná sloučenina je jasně určena, že je slibným kandidátem, když se ukáže být lepší než nebo srovnatelná s exisulindem a neinhibuje COX. Obecně požadované sloučeniny jsou ty, které inhibují PDE5 a inhibují buněčný růst a vyvolávají apoptosu, ale neinhibují COX ve farmakologicky akceptovaných dávkách.
Jak je zde použito, výraz prekancerozní léze zahrnuje syndromy představené neoplastickými, včetně displastických, změnami tkáně.
··*·’· · ·· B · 9«· · · · ···· ♦
- 9 Příklady zahrnují displastické růsty ve střevních, prsních, prostatových nebo plicních tkáních nebo stavy jako je syndrom mateřského znaménka, prekursoru maligního melanomů kůže.
Příklady také zahrnují navíc k displastickým syndromům materského znaménka, polypozní syndromy, střevní polypy, prekancerozní léze čípku (to je cervikální displasie), jícnu, plic, prostatické displasie, prostatické intraneoplasie, prsní a/nebo kožní a příbuzné stavy (napříkla aktinická keratosa) at jsou tyto léze klinicky identifikovatelné nebo ne.
Jak je zde použito, výraz karcinom nebo rakovina se týká lézí, které jsou kancerozní. Příklady zahrnují maligní melanomy, prsní rakovinu, prostatovou rakovinu a rakovinu tlustého střeva. Jak je zde použito, výrazy neoplasie a neoplasmy se týkají jak rakovinných, tak předrakovinných lézí.
Jak je zde použito, zkratka PG se týká prostaglandinu, ΡΞ se týká prostaglandinsynthetasy, PGE2 představuje prostaglandin , PDE představuje fosfodiesterasu, COX představuje cyklooxygenasu, ΚΙΆ představuje radioimunozkoušku.
Jak je zde použito, PDE5 se týká toho enzymu a jakýchkoli jeho isoforem, které vykazují malé cGMP specifické hydrolytické enzymové aktivity a vysokou afinitní cGMP vazbu.
V dalším aspektu tohoto vynálezu existuje způsob pro léčení pacientů při potřebě léčení neoplasie, identifikací sloučenin, které vykazují podstatnou PDE5 inhibiční aktivitu ve farmakologicky akceptovatelných dávkách a podávání jedné nebo více těchto sloučenin pacientu při jeho potřebě s neoplasií senzitivní na tuto sloučeninu.
* · β ·44 • 4 ·♦· ·*
4 4 4*
....... ·· ··
- 10 Screeningové protokoly
Následující screeningové protokoly a alternativní protokoly jsou opatřeny k pomoci porozumění výhodným metodám použitým k třídicím testům sloučenin k určení jejich potenciálu na léčení nebo prevenci neoplasie, zejména prekancerozních lézí.
1. Určení COX inhibiční aktivity
COX inhibice může být určena jednou ze dvou metod. Jedna metoda zahrnuje měření PGE2 sekrece intaktními HL-60 buňkami po jejich vystavení sloučenině, která se roztřiduje. Jiná metoda zahrnuje měření aktivity vyčištěných cyklooxygenas (COX) v přítomnosti sloučeniny. Obě metody zahrnují protokoly dříve popsané v literatuře.
l.A. PGE2 sekrece
Sloučeniny mohou být vyhodnocovány k určení, zda vykazovaly produkci prostaglandin E2 (PGE2), pomocí postupů známých ve stavu techniky. Například PGE2 vylučovaný z buňky může být měřen pomocí inzymové imunozkouškové (EIA) soupravy pro PGE2, jaká je komerčně dostupná od Amersham, Arlington Heights, IL USA. Vhodné buňky zahrnují ty, které vytvářejí nadbytek PG, jako jsou HL-60 buňky.
HL-60 buňky jsou lidské promyelocyty, které jsou diferenciovaný DMSO ve zralých granulocytech. (Viz Collins,
S.J., Russetti, F.W., Gallagher, R.E., a Gallo, R.C., Normální funkční charakteristiky kultivovaných lidských promyelocyticky leukemických buněk (HL-60) po indukci diferenciace dimethylsulfoxidem, J. Exp. Med., 149:969-974, 1979.
Tyto diferenciované buňky produkují PGE^ po stimulaci vápenným ionoforem A23187 (viz Kargman, S., Prášit, P. a Evans, J.F., Translokace HL-60 buněčné 5-lipooxygenasy, J.Biol.Chem. 266:23745-23752, 1991).
HL-60 jsou dostupné od Američan Type Culture Collection (ATCC:CCL240). Mohou být pěstovány v RPMI 1640 mediu, doplněném 20 % tepelného inaktivovaného fetálního bovinního séra, 50 j/ml penicilinu a 50 mikrog/ml streptomycinu v atmosféře 5%ního CO^ při 37 °C. K vyvolání myeloidové diferenciace jsou buňky vystaveny l,3%nímu DMSO po dobu 9 dní a pak jsou promyty a resuspendovány v Dulbeccově fosfátem pufrovaném solném roztoku v koncentraci 3 x 10^ buněk/ml.
Diferenciované HL-60 buňky (3χ10θ buněk/ml) mohou být inkubovány po dobu 15 minut při 37 °C v přítomnosti sloučenin, které jsou testovány, v požadované koncentraci. Buňky jsou pak stimulovány pomocí A23187 (5x10 ^M) po dobu 15 minut. vylučovaný do vnějšího prostředí je měřen jak bylo výše popsáno.
l.B. Purifikované cyklooxygenasy rozdílné formy cyklooxygenasy (COX-I a COX-2) jsou uváděny v literatuře k regulaci prostaglandinové syntézy. Je známo, že COX-2 představuje indukovatelnou formu COX, zatímco COX-I představuje konstitutivní formu. COX-I aktivita může být měřena za použití metody popsané Mitchellem a j. (Selektivita nesteroidních protizánětlivých léčiv jako inhibitorů konstitutivní a indukovatelné cyklooxygenasy, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90:11693-11697, 1993, což se zde začleňuje odkazem,) za použití COX-I vyčištěné z beraních seminálních váčků, jak je popsáno Boopathyem a Balasubramanianem Čištění a charakterizace ovcí destičkové cyklooxygenasy, (Biochem. J., 239:371-377, 1988, což se zde začleňuje odkazem).
COX-2 aktivita může být měřena za použití COX-2 vyčištěné z ovčí placenty, jak je popsáno Mitchellem a j., 1993, viz výše.
Cyklooxygenasová inhibični aktivita léčiva může být popsána způsoby známými ve stavu techniky. Například Boopathy a Balasubramanian, 1988, viz výše, popisuje postup, ve kterém prostaglandin H synthasa 1 (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan) se inkubuje při 37 °C po dobu 20 minut se 100 mikromoly arachidonové kyseliny (Sigma Chemical Co.), kofaktory (jako je 1,0 mmol glutathionw, 1,0 mM hydrochinonJ, 0,625 mikromol hemoglobinu a 1,25 mM CaC^ ve 100 mM tris-HCl, pH 7,4) a léčiva, které má být testováno.
Po inkubaci reakce může být ukončena trichloroctovou kyselinou. Enzymatická aktivita pak může být měřena spektrofotometricky při 530 nm po skončení reakce přidáním thiobarbiturové kyseliny a malonaldehydu.
Samozřejmě sloučenina, která vykazuje minimální COX-I nebo COX-2 inhibični aktivitu ve vztahu k její větší PDE5 inhibični aktivitě nemůže být zcela nežádoucí.
l.C. Analýza výsledků
Velikost inhibice je určena srovnáním aktivity cyklooxygenasy v přítomnosti a absenci testované sloučeniny. Zbytková nebo žádná COX inhibični aktivita (to je menší než asi 25%ní) při koncentraci asi 100 mikroM je indikativní pro to, že sloučenina by měla být vyhodnocována dále na užitečnost pro léčení neoplasie. Výhodně C^g koncentrace by měla být větší než 1000 mikroM pro sloučeninu, která má být dále uvažována pro případné použití.
• · · · · • · * · · · · · · ·
Φ · ♦ · · · ·« ·· ··
2. Určování fosfodiesterasové (PDE5) inhibiční aktivity
Sloučeniny mohou být zkoušeny na inhibiční účinek na fosfodiesterasovou aktivitu pomocí buů enzymu izolovaného z jakékoli nádorové buněčné linie jako je HT-29 nebo SW-480, nebo rekombinantní HS-PDE5 například, nebo měřením úrovní cyklických nukleotidů u všech buněk.
2.A. Enzymová zkouška
Fosfodiesterasová aktivita může být určena použitím metod známých ve stavu techniky tak, jako je metoda využívající radioaktivní H cyklický GMP (cGMP) (cyklický 3',5'-guanosinmonofosfat) jako substrát pro PDE5 enzym. (Thom*son, W.J., Teraski, W.L., Epstein, P.M., Strada, S.J., Advances in Cyclic Nucleotide Research, 10:69-92, 1979, což je zde začleněno odkazem.)
Stručně, roztok definovaného substrátu Η-cGMP specifické aktivity (0,2 mikroM, 100 000 cpm obsahující 40 mM tris-HCl (pH 8,0), 5,0 mM a 1 mg/ml ΒΞΑ) se smíchá s léčivem, které má být testováno v celkovém objemu 400 mikrol. Směs se inkubuje při 30 °C po dobu 10 minut s částečně vyčištěným PDE5 izolovaným z HT-29 buněk. Reakce se ukončí, například varem reakční směsi po dobu 75 sekund. Po ochlazení na ledu se přidá 100 mikrol 0,5 mg/ml hadího jedu (O.hannah jed dostupný od Sigmy) a inkubuje po dobu 10 minut při 30 °C. Tato reakce se pak ukončí přídavkem alkoholu, například 1 ml 100%ního methanolu.
Zkušební vzorky se aplikují na aniontovou chromatografickou kolonu (1 ml Dovex, od Aldricha) a promyje 1 ml 100%ního methanolu. Množství radioaktivity v průtoku a promytích
z kolony se pak měří scintilačním počítačem. Stupeň PDE5 inhibice se určuje výpočtem množství radioaktivity v drogou ošetřených reakcích a srovnává vůči kontrolnímu vzorku (reakční směs bez testované sloučeniny).
2.B. Měření cyklických nukleotidů
Alternativně se schopnost požadovaných sloučenin k in hibici PDE5 odráží vzrůstem cGMP v neoplastických buňkách vystavených sloučenině, která je tříděna. Množství PDE5 aktivity může být určeno zkoušením na množství cyklického GMP v extraktu ošetřených buněk pomocí radioimunozkoušky (RIA). Při tomto postupu se HT-29 nebo SW-480 naplátují a pěstují do spojitosti. Testovaná sloučenina se pak inkubuje s buněčnou kulturou v koncentraci sloučeniny mezi asi 200 mikroM do asi 200 pM. Asi 24 až 48 hodin potom se kultivační medium získá z buněk a buňky se solubilizují. Reakce se zastaví pomocí 0,2N HCl/50%ní MeOH. Vzorek se vyjme pro proteinovou zkoušku.
Cyklický GMP se vyčistí z kyselinových/alkoholických extraktů buněk za použití aniontoměnné chromatografie jako je Dovex kolona. cGMP se vysuší, acyluje podle publikovaných postupů, jako je použití acetanhydridu v triethylaminu, (Steiner, A.L., Parker, C.W., Kipnis, D.M., J.Biol.Chem. 247 (4): 1106-13, 1971, což je zde začleněno odkazem). Acetylovaný cGMP se kvantizuje za použití radioimunozkouškových postupů (Harper, J., Brooker, G., Advances in Nucleotide Research, 10:1-33, 1979, což je zde začleněno odkazem). Jodované ligandy (pyrosinmethylester) odvozeného cyklického GMP se inkubují se standardy nebo neznámými v přítomnosti antisera a vhodných pufrů.
Antisérum může být vytvořeno použitím cyklických nukleo tidhaptenových usměrněných technik. Antiserum je z ovcí injektovaných sukcinyl-cGMP-albuminovými konjugáty a zředěné
1/20 000. Dávková interpolace a analýza chyb ze standardních křivek jsou aplikovány jak je dříve popsáno (Seibert,A.F.,
Thompson, W.J., Taylor, A., Wilbourn, W.H., Barnard, J., a
Haynes, J., J. Applied Physiol., 72:389-395, 1992, což je zde začleněno odkazem).
Navíc kultivační medium múze být okyseleno, zmraženo (-70 °C) a také analyzováno na cGMP a cAMP.
Navíc k zjištění růstu obsahu cGMP vyvolaného vhodnými zkoušenými sloučeninami, byly zjištěny poklesy obsahu cAMP. Bylo zjištěno, že zvláště žádaná sloučenina (to je jedna,která selektivně vyvolává apoptosu v neoplastických buňkách, ale v podstatě ne v normálních buňkách) vyplývá z časového průběhu konzistentního s PDE5 inhibicí jako jedna počáteční akce končící ve zvýšeném cGMP obsahu v průběhu minut. Zadruhé ošetření neoplastických buněk žádanou antineoplastickou sloučeninou vede ke sníženému cAMP obsahu během 24 hodin. Nitrobuněčné cíle působení léčiva se dále studují, ale běžné údaje podporují koncept, že jak počáteční růst cGMP obsahu následovaný následným poklesem cAMP obsahu předchází apoptosu v neoplastických buňkách vystavených žádaným sloučeninám.
Změna poměru 2 cyklických nukleotidů může být přesnějším nástrojem pro vyhodnocení žádané PDE5 inhibiční aktivity testovaných sloučenin, spíše než pouhé měření absolutní hodnoty cGMP, jen PDE5 inhibice, nebo jen absolutní hodnoty cGMP.
V neoplastických buňkách neošetřených antineoplastickými sloučeninami je poměr obsahu cGMP/obsahem cAMP v rozmezí 0,03 až 0,05 (to znamená 300 až 500 fmol/mg obsahu proteinu cGMP oproti 6000 až 8000 fmol/mg obsahu proteinu cAMP) . Po vystavení žádaným antineoplastickým sloučeninám, tento poměr vzrůstá několikanásobně (výhodně alespoň asi trojnásobně) ·· ·
- 16 jako výsledek počátečního nárůstu cyklického GMP a pozdějšího poklesu cyklického AMP.
Specificky bylo zjištěno, že zvlášt vhodné sloučeniny dosahují počáteční růst obsahu cGMP v ošetřených neoplastických buňkách na úroveň cGMP větší než asi 500 fmol/mg proteinu. Navíc zvlášř vhodné sloučeniny vyvolávají pozdější pokles obsahu cAMP v ošetřených neoplastických buňkách na úroveň cAMP menší než asi 4000 fmol/mg proteinu.
K určení obsahu cyklického AMP se používají radioimunozkouškové techniky podobné těm, které jsou popsány výše pro cGMP. V základě, cyklické nukleotidy se vyčistí z kyselina/ alkohol extraktů buněk pomocí aniontoměnné chromatografie, vysuší, acylují podle publikovaných postupů a kvantizují za použití radioimunozkouškových postupů. Jodované ligandy derivatizovaného cyklického AMP a cyklického GMP se inkubují pomocí standardů nebo neznámých látek v přítomnosti specifického antiséra a vhodných pufrů.
Verifikace obsahu cyklického nukleotidu může být získána určením obratu nebo akumulace cyklických nukleotidů v neporušených buňkách. K měření neporušené buněčné cAMP, se použije 3
H-adeninového předznačení podle publikovaných postupů (Whalin,
M.E., R.L. Garrett Jr., W.J. Thompson a S.J. Strada, Korelace fosfodiesterasových aktivit nebuněčných mozkových cyklických nukleotidů vůči rozkladu cyklického AMP v intaktních mozkových řezech, Sec, Mess. and Phos. Protein Research, 12:311-325, 1989, což je zde začleněno odkazem). Postup měří tok značeného ATP vůči cyklickému AMP a může být použit k určení aktivit intaktní buněčné adenylatcyklasy nebo cyklické nukleotidfosfodiesterasy v závislosti na specifickém protokolu. Akumulace cyklického GMP byla příliš nízká, aby byla studována s intaktním buněčným předznačením podle publikovaných postupů (Reynolds, P.E., S.J.Strada a W.J.Thompson, Akumulace cyklického GMP «· ·· ··
- 17 v pulmonárních mikrovaskulárních endothelálních buňkách měřená předznačením intaktních buněk, Life Sci., 60:909-918, 1997, což je zde začleněno odkazem).
2.C. Zkouška tkáňových vzorků
PDE5 inhibiční aktivita testované sloučeniny může být také určena z tkáňového vzorku. Tkáňové vzorky jako jsou savčí (výhodně krysí játra) se získají ze subjektů vystavených testované sloučenině. Stručně, vzorek tkáně se homogenizuje v 500 mikrol 6%ního TCA. Známé množství homogenátu se vezme pro proteinovou analýzu. Zbývající homogenát se nechá ležet na ledu po dobu 20 minut, aby se umožnilo vysrážení proteinů. Dále se homogenát centrifuguje po dobu 30 minut při 15 000 g při teplotě 4 °C. Získá se supernatant a peleta. Supernatant se promyje 4 x vodou nasyceným diethyletherem. Vrchní etherová vrstva se odstraní mezi každým promytím. Vodný etherický extrakt se vysuší v rychlém vakuu. Jednou vysušený, může být vzorek zmrazen pro příští použití nebo ihned použit. Vysušený extrakt se rozpustí v 5 mikrol zkušebního pufru. Velikost PDE5 inhibice se určí zkoušením na množství cyklických nukleotidů za použití enzymové imunozkoušky (El) jako je Biotrak EIA systémový acetylační protokol (dostupný od Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Alternativně mohou být použity RIA postupy jak jsou detailně popsány výše.
2.D. Výsledky analýzy
Množství inhibice se určí srovnáním aktivity PDE5 v přítomnosti a nepřítomnosti testované sloučeniny. Inhibice PDE5 aktivity je indikativní pro to, že sloučenina je užitečná pro léčení neoplasie.
4 • ·
4
4 4 t * «4
4 • 4 • 4 4· •* *·.
4 «4
4·
44·4
Významná inhibiční aktivita větší než aktivita exisulindu, výhodně větší než 50 % při koncentraci 10 mikroM nebo nižší, je indikací, že sloučenina by měla být dále vyhodnocována na antineoplastické vlastnosti. Výhodně, IC^q hodnota pro PDE5 inhibici by měla být menší než 50 mikroM pro sloučeninu, se kterou se má dále uvažovat pro potenciální použití.
3. Určení, zda sloučenina redukuje počet nádorových buněk
V alternativním provedení screeningová metoda tohoto vynálezu zahrnuje další určení, zda sloučenina redukuje růst nádorových buněk. Různé buněčné linie mohou být použity ve vzorku v závislosti na tkáni, která má být testována. Například tyto buněčné linie zahrnují: SW-480 - střevní adenokarcinom, HT-29 - střevní adenokarcinom, A-427 - plicní adenokarcinomní karcinom, MCF-7 - prsní adenokarcinom a UACC-375 - melanomní linie a DU145 - prostatový karcinom. Cytotoxická data, která jsou získána při použití těchto buněčných linií jsou indikativní pro inhibiční efekt na neoplastické leze. Tyto buněčné linie jsou dobře charakterizovány a jsou používány United States National Cancer Institute v jejich screeningovém programu pro nová protirakovinová léčiva.
3.A. Nádorová inhibice v HT-29 buněčné linii
Schopnost sloučeniny inhibovat růst nádorových buněk může být měřena pomocí HT-29 lidské střevní karcinomní buněčné linie získané z ATCC (Bethesda, M.D.). HT-29 buňky byly dříve charakterizovány jako odpovídající kultivační model střevních nádorových buněk (Fogh, J., a Trempe, G., v Lidské nádorové buňky in vitro, j. Fogh (eds.), Plenům Press, New York, str. 115-159, 1975).
· • ·
HT-29 buňky jsou udržovány v RPMI mediu doplněném 5%ním fetálním sérem (Gemini Bioproducts, lne., Carlsbad, CA) a 2 mm glutaminu a 1 % antibiotika - antimykotika, ve zvlhčené atmosféře 95 % vzduchu a 5 % CC^ při 37 °C. Stručně, HT-29 buňky se uloží v hustotě 500 buněk/prohlubeň v 96prohlubňových mikrotitračních plotnách a inkubují po dobu 24 hodin při 37 °C před přídavkem sloučeniny. Každé určení počtu buněk zahrnuje 6 replikátů. Po 6 dnech v kultivaci se buňky fixují přídavkem studené trichloroctové kyseliny do finální koncentrace 10 % a úrovně proteinů se měří pomocí sulforhodaminu B (SRB) kolorimetrické proteinové barvicí zkoušky, jak je dříve popsáno autory Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Mongs, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J.T., Bokesch, H., Kenney, S., a Boyd, M.R., Nová kolorimetrická zkouška pro třídění protirakovinných léčiv, J.Nati.Cancer Inst. 82:1107-1112, 1990, což je zde začleněno odkazem.
Navíc k SRB zkoušce je mnoho jiných metod dostupných k měření růstové inhibice a mohly by být substituovány za SRB zkoušku. Tyto metody zahrnují počítání životných buněk po barvení trypanovou modří značení buněk schopných DNA syntézy s BrdU nebo radioznačeným thymidinem, barvení životných buněk neutrální červení nebo MTT barvení životných buněk.
3.B. Analýza výsledků
Významná inhibice růstu nádorových buněk větší než asi 50 % při dávce 100 mikroM nebo nižší je dále indikativní v tom, že sloučenina je užitečná pro léčení neoplastických lézí. Výhodně je určena hodnota IC^g a použita pro srovnávací účely. Tato hodnota je ekvivalentní koncentraci léčiva potřebného k inhibicí růstu nádorové buňky o 50 % ve vztahu ke kontrole.
- 20 výhodně by měla být hodnota menší než 100 mikroM pro sloučeninu, která má být uvažována dále pro potenciální použití pro léčení neoplastických lézí.
4. Určení, zda sloučenina vyvolává apoptosu
V druhém alternativním provedení screeningová metoda tohoto vynálezu dále zahrnuje určení, zda sloučenina vyvolává apoptosu u kultivovaných nádorových buněk.
Dvě odlišné formy zániku buněk mohou být popsány morfologickými a biochemickými kritérii: nekrosa a apoptosa.
Nekrosa je doprovázena zvýšenou permeabilitou plazmové membrány, buňky botnají a plazmová membrána praská v rozmezí minut. Apoptosa je vyznačena zpuchýřkovatěním membrány, kondenzací cytoplazmy a aktivací endogenních endonukleas.
Z těchto dvou apoptosa je nejběžnější formou zániku eukaryotických buněk. Vyskytuje se přirozeně během obměny normální tkáně a během embryonálního vývoje orgánů a končetin. Apoptosa je také vyvolána cytotoxickými T-lymfocyty a přirozenými ničivými buňkami, ionizačním zářením a některými chemoterapeutickými léčivy. Nepřiměřená regulace apoptosy může hrát důležitou roli u mnoha patologických stavů včetně rakoviny, AIDS, Alsheimerovy nemoci atd.
Sloučeniny mohou být tříděny pro indukci apoptosy pomocí kultur nádorových buněk udržovaných za výše popsaných podmínek. Zpracování buněk s testovanými sloučeninami zahrnuje buň pre- nebo postkonfluentní kultury a zpracování po 2 až 7 dní při různých koncentracích.
Apoptotické buňky jsou měřeny jako přichycené a plovoucí skupiny kultur.
* · · ·
- 21 Obě skupiny jsou sloučeny odstraněním supernatantu, trypsinizací přichycených buněk a sloučením obou přípravků po odstředivém promývacím stupni (10 minut, 2000 otáček/min).
Protokol pro ošetření nádorových buněčných kultur sulindakem a příbuznými sloučeninami k získání významného množství apoptosy je popsán v literatuře. (Viz Piazza, G.A., a j., Cancer Research, 55:3110-16, 1995, což je zde začleněno odkazem). Nové rysy zahrnují shromáždění jak plovoucích tak přichycených buněk, identifikací optimálních časů ošetření a rozmezí dávek pro zjištění apoptosy a identifikaci optimálních buněčných kultivačních podmínek.
4.A. Morfologické zjišťování apoptosy
Po ošetření testovanou sloučeninou mohou být kultury zkoušeny na apoptosu a nekrosu fluorescenční mikroskopií po označení akridinovou oranží aethidiumbromidem. Způsob měření počtu apoptotických buněk byl dříve popsán Dukem a Cohenem Morfologické a biochemické zkoušky apoptosy, Current Protocols in Immunology, Coligan a j., eds., 3.17.1-3.17.16, 1992, což je zde začleněno odkazem.
Například plovoucí a přichycené buňky mohou být sloučeny trypsinizací a promyty třikrát v PBS. Alikvoty buněk mohou být odstředěny. Peleta pak může být resuspendována v mediu a barvicí směs obsahující akridinovou oranž a ethidiumbromid připravené v PBS mohou být jemně smíchány. Směs pak může být uložena na mikroskopické sklíčko a studována.
4.B. Analýza apoptosy DNA fragmentací
Apoptosa může být také kvantifikována měřením vzrůstu fragmentace DNA v buňkách, které byly ošetřeny testovanými sloučeninami.
• · «
• « · v ·
a ·· * ·« a · ·· • a ·· «
Komerční fotometrická EIA pro kvantitativní in vitro určení cytoplasmatických histonových sdružených DNA fragmentů (monook v s a oligonukleosomů) je dostupná (Cell Death Detection ELISA 7 , katal. č. 1 774 425, Boehringer Mannheim). Boehringer Mannheim zkouška je založena na sendvičovém enzymovém imunozkouškovém principu za použití myších monoklonálních protilátek usměrněných proti DNA a histonům. To umožňuje specifické určení monoa oligonukleosomů v cytoplasmatické frakci buněčných lyzátů.
Podle prodávajícího se apoptosa měří následujícím způsobem. Vzorek (buněčný lyzát) se uloží do streptavidinem pokryté mikrotitrační plotny (MTP). Následně se přidá směs antihistonového biotinu a antiDNAperoxidasového konjugátu a inkubuje po dobu 2 hodin. Během inkubační periody se váže antihistonová protilátka k histonové komponentě nukleosomu a současně fixuje imunokomplex k streptavidinem pokryté MTP cestou její biotinylace. Dále antiDNAperoxidasová protilátka reaguje s DNA komponentou nukleosomu. Po odstranění nevázaných protilátek pomocí promývacího stupně se množství nukleosomu kvantifikuje peroxidasou zůstávající v imunokomplexu. Peroxidasa se určí fotometricky pomocí ABTS7 (2,2'-azido-/3-ethylbenzthiazolinsulfonat/) jako substrátu.
Například SW-480 střevní adenokarcinomní buňky se uloží v 96ti prohlubňové MTP při hustotě 10 000 buněk na prohlubeň. Buňky se pak ošetří testovanou sloučeninou a ponechají se inkubovat po dobu 48 hodin při 37 °C. Po inkubaci se MTP odstředí a supernatant se odstraní. Buněčná peleta v každé prohlubni se pak resuspenduje v lýzním pufru po dobu 30 minut. Lyzáty se pak odstředí a alikvoty supernatantu (to je cytoplasmatická frakce) se převedou do streptavidinem povlečené MTP. Je třeba dát pozor, aby se lýzované pelety netřepaly (to je buněčná nuklea obsahující vysokomolekulární ncfragmentovanou DNA v MTP. Vzorky se pak analyzují.
• 4
Složená stimulace (FS=OD /OD veh), indikátor apopmax r f totické odezvy se určuje pro každou testovanou sloučeninu při dané koncaentraci. EC^g hodnoty mohou být také určeny vyhodnocením série koncentrací testované sloučeniny.
4. C. Výsledky analýzy
Statisticky významná zvýšení apoptosy, to je větší než dvojnásobná stimulace při koncentraci 100 mikroM, jsou dále indikativní, že sloučenina je vhodná pro léčení neoplastických lézí. Výhodně by měla být hodnota pro apoptotickou aktivitu menší než 100 mikroM pro sloučeninu, která má být dále uvažována na potenciální použití pro léčení neoplastických lézí. EC^q je zde definována jako koncentrace, která vyvolá 50%ní indukci apoptosy ve vztahu k ošetření vehikulem.
5. Vyhodnocení - prsní žlázové orgánové kultivační modelové testy
Testované sloučeniny identifikované výše uvedenými metodami mohou být testovány na antineoplastickou aktivitu pomocí jejich schopnosti inhibovat výskyt preneoplastických lézí? v prsním žlázovém orgánovém kultivačním systému. Tato myší prsní žlázová orgánová kultivační technika byla úspěšně použita jinými vynálezci ke studiu účinku známých antineoplastických prostředků, jako jsou NSAID, retinoidy, tamoxifen, selen a určité přírodní produkty a je užitečná pro vyhodnocení screeningové metody tohoto vynálezu.
Například samice BALB/c myší mohou být ošetřeny kombinací estradiolu a progesteronu denně, aby se vybavily žlázy, aby měly odezvu na hormony in vitro. Tato zvířata se utratí a hrudní prsní žlázy se odstraní asepticky a inkubují po
• · · · · • * · · · • · · · · · • · · · · · • 9 · · · · dní v růstovém mediu doplněném insulinem, prolaktinem, hydrokortisonem a aldosteronem. DMBA (7,12-dimethylbenz(a)anthracen) se podává k vyvolání tvorby premaligních lézí. Plně vyvinuté žlázy se pak zbaví prolaktinu, hydrokortisonu a aldosteronu, což má za následek regresi žláz, ale ne premaligních lézí.
Testovaná sloučenina se rozpustí v DMSO a přidá do kultivačního media po dobu trvání kultivační periody. Na konci kultivační periody se žlázy fixují v 10%ním formalinu, zbarví alumkarminem a upevní na sklíčkách. Výskyt tvořících se prsních lézí je poměr žláz s prsními lézerai a žláz bez lézí. Výskyt prsních lézí u testovanou sloučeninou ošetřených žláz je porovnán s výskytem u neošetřených žláz.
Rozsah plochy zabrané prsními lézemi může být kvantifikován projekcí obrazu žlázy na digitalizovanou podložku. Plocha pokrytá žlázou se zaznamená na podložku a považuje se za 100%ní plochu. Prostor pokrytý každou z neregresovaných struktur je také načrtnut na digitalizační podložce a kvantifikován počítačem.
• · • · · • * · ·
- 25 Příklady provedení vynálezu
Mnohé testované sloučeniny byly zkoušeny v různých protokolech a roztříděny na potenciální použití při léčení neoplasie. Výsledky těchto testů jsou uvedeny dále. Testované slou< čeniny jsou zde označeny písmenným kódem, který odpovídá následujícímu :
A - rac-threo-(E)-1-(N,N'-diethylaminoethanthio)-1-(butan1' , 4 ' -olido ) -/3' , 4 ' : 1,2,/-6-fluor-2-methy 1-3 - (p-methylsulfonylbenzyliden)indan,
B - (Z)-5-fluor-2-methyl-l-(3,4,5-trimethoxybenzyliden)3-octová kyselina,
C - (Z)-5-fluor-2-methyl-l-(p-chlorbenzyliden)-3-octová kyselina,
D - rac-(E)-1-(butan-1',4'-olido)-/3',4':1,2/-6-fluor-2-methyl-3-(p-methylsulfonylbenzyliden)-lS-indanyl-N-acetylcystein,
E - (Z)-5-fluor-2-methyl-l-(3,4,5-trimethoxybenzyliden)3-indenylacetamid,N-benzyl,
F - (Z)-5-fluor-2-methyl-l-(p-methylsulfonylbenzyliden)3-indenylacetamid,N,Ν'-dicyklohexyl,
G - ribo-(E)-l-triazolo-,/2 ' , 3 ' : 1' ' , 3 ''jZ-l-butan-1' , 4 'olido)-/*3' ,4' : 1,2y-6-f luor-2-methyl-3 ( p-methylsulfonylbenzyliden)indan, a
H - rac-(E)-1-(butan-1',4'-olido)-/3',4':1,2/-6-fluor-
2-methyl-3-(p-methylsulfonylbenzyliden)-lS-indanylglutathion.
···* · · * · · ·« · ♦ ·· ♦ ·· *
Příklad 1
COX inhibiční zkouška
Referenční sloučeniny a testované sloučeniny byly analyzovány na jejich COX inhibiční aktivitu v souhlase s protokolem pro COX zkoušku sekce l.B. uvedené výše. Obr. 1 ukazuje účinek různých koncentrací bud sulindaksulfidu nebo exisulindu na vyčištěnou cyklooxygenasní (typ 1) aktivitu.
Aktivita cyklooxygenasy byla určena pomocí vyčištěné cyklooxygenasy z beraních semenných váčků jak je popsáno dříve (Mitchell a j., viz výše). Hodnota IC-50 pro sulindaksulfid byla vypočtena, že je přibližně 1,76 mikroM, zatímco tato hodnota pro exisulind byla větší než 10 000 mikroM. Tyto údaje ukazují, že sulindaksulfid, ale ne exisulind je COX-I inhibitor. Podobné údaje byly získány pro COX-2 isoenzym. (Thompson a j., Yournal of the National Cancer Institute, 87:1259-1260, 1995.
Obr. 2 ukazuje účinek testovaných sloučenin B a E na COX inhibici. COX aktivita byla určena jako pro sloučeniny znázorněné v obr. 1. Údaje ukazují, že obě testované sloučeniny B a E neinhibují významně COX-I.
Tabulka 1
Cyklooxygenasová inhibiční aktivita mezi sérií sloučenin
| Referenční sloučeniny | % inhibice při 100 mikroM |
| indomethacin | 95 |
| MY5445 | 94 |
| sulindaksulfid | 97 |
| exisulind | menší než 25 |
pokrčování tabulky 1
| Testované sloučeniny | % inhibice při 100 mikroM |
| sloučenina A | menší než 25 |
| B | menší než 25 |
| C | 87 |
| D | menší než 25 |
| E | menší než 25 |
Podle protokolu sekce I.B., viz výše, byly sloučeniny A až E vyhodnoceny pro COX inhibiční aktivitu jak je uvedeno výše v tabulce 1. Sloučenina C jak bylo zjitěno, inhibuje COX více než 25 % při 100 mikroM dávce a tudíž by nebyla vybrána pro další roztřidování.
Příklad 2
PDE5 inhibiční zkouška
Referenční sloučeniny a testované sloučeniny byly analyzovány na jejich PDE5 inhibiční aktivitu podle protokolu pro zkoušku sekce 2.A. uvedené výše.
Obr. 3 ukazuje účinek různých koncentrací sulindaksulfidu a exisulindu na jejich PDE4 nebo PDE5 aktivitu vyčištěných z lidského střeva HT-29 kultivovaných nádorových buněk, jak je dříve popsáno (W.J.Thompson a j., viz výše). Hodnota sulindaksulfidu pro inhibici PDE4 byla 41 mikroM a pro inhibici PDE5 byla 17 mikroM. Hodnota exisulindu pro inhibici PDE4 byla 181 mikroM a pro inhibici PDE5 byla 56 mikroM. Tyto údaje ukazují, že jak sulindaksulfid, tak exisulind vykazují fosfodiesterasovou aktivitu.
··9 9
9 • 9 • 9
- 28 • 9
9
9· ··
Obě sloučeniny vykazují selektivitu pro PDE5 isoenzymovou formu.
Obr. 4 ukazuje účinek sulindaksulfidu na bud cGMP nebo cAMP produkci, jak je určeno na kultivovaných HT-29 buňkách podle zkoušky sekce 2.B. uvedené výše. HT-29 buňky byly zpracovány sulindaksulfidem po dobu 30 minut a cGMP nebo cAMP byly měřeny konvenční radioimunozkouškovou metodou. Jak je indikováno, sulindaksulfid zvýšil úrovně cGMP o více než 50 % s ΕΟ^θ hodnotou 7,3 mikroM (vrchol). Úrovně cAMP nebyly zpracováním ovlivněny, ačkoli známý PDE4 inhibitor, rolipram, zvýšil cAMP. (Dole)
Údaje demonstrují farmakologický význam inhibice PDE5 ve vztahu k PDE4.
Obr. 5 ukazuje účinek indikované dávky testované sloučeniny B na bud PDE5 nebo PDE4 isoenzymy fosfodiesterasy. Vypočtená hodnota IC^g pro PDE5 byla 18 mikroM a 58 mikroM pro PDE4 .
Obr. 6 ukazuje účinek indikované dávky testované sloučeniny E na bud PDE4 nebo PDE5. Vypočtená IC^-g hodnota byla 0,08 mikroM pro PDE5 a větší než 25 mikroM pro PDE4.
Tabulka 2
PDE5 inhibični aktivita v sérii sloučenin
| Referenční sloučeniny | % inhibice při 10 mikroM |
| indomethacin | 34 |
| MY5445 | 86 |
| sulindaksulfid | 97 |
| exisulind | 39 |
- 29 pokračování tabulky 2
| Testované sloučeniny | % inhibice při 10 mikroM |
| A | menší než 25 |
| B | menší než 25 |
| C | menší než 25 |
| D | 36 |
| E | 75 |
Výše uvedené sloučeniny v tabulce 2 byly vyhodnoceny na PDE inhibiční aktivitu jak je popsáno v protokolu sekce 2.A. uvedené výše. Ze sloučenin, které neinhibovaly COX, jedině sloučenina E jak bylo zjištěno vyvolala větší než 50%ní inhibici při 10 mikroM. Jak je zaznamenáno v obr. 11, sloučenina B vykázala inhibici větší než 50 % při dávce 20 mikroM. Tudíž v závislosti na dávkovači použité úrovni v dávkovacím testu jedné dávky, některé sloučeniny mohou být roztříděny, že jinak mohou být aktivní při mírně vyšších dávkách. Použité dávkování je subjektivní a může se snížit, když bylo u aktivních sloučenin zjitěno, že při určitých úrovních jsou dokonce potentnějšími sloučeninami.
Příklad 3
Zkouška apoptosy
Referenční sloučeniny a testované sloučeniny byly analýzovány na jejich PDE5 inhibiční aktivitu podle protokolu pro zkoušku sekce 4.A. a 4.B. uvedených výše. V souhlase se zkouškou 4.A. obr. 7 ukazuje účinky sulindaksulfidu a exisulindu na apoptotický a nekrotický zánik buněk.
• · « * ·
- 30 HT-29 buňky byly ošetřovány po dobu 6 dnů indikovanou dávkou bud sulindaksulfidu nebo exisulindu. Apoptotický a nekrotický zánik buněk byl určen dříve (Duke a Cohen v: Current Protocols in Immunology, 3.17.1-3.17.16, New York, John Wiley a Sons, 1992). Údaje ukazují, že jak sulindaksulfid a exisulind jsou schopny vyvolat apoptotický zánik buněk bez vyvolání nekrosy. Všechny údaje byly shrnuty ze stejného experimentu.
Podle zkoušky 4.B., obr. 8 ukazuje účinek sulindaksulfidu a sulfonu na inhibici nádorového růstu a vyvolání apoptosy jak je určeno fragmentací DNA. Vrchní obr. ukazuje inhibici růstu (otevřené symboly, pravá osa) a DNA fragmentaci (uzavřené symboly, levá osa) exisulindem. Spodní obr. ukazuje inhibici růstu (otevřené symboly) a DNA fragmentaci (uzavřené symboly) sulindaksulfidem. Inhibice růstu byla určena SRB zkouškou po 6 dnech c ošetření. DNA fragmentace byla určena po 48 hodinách ošetření. Všechny údaje byly shrnuty ze stejného experimentu.
Obr. 9 ukazuje apoptosu vyvolávající vlastnosti sloučeniny E. HT-29 střevní adenokarcinomní buňky byly ošetřeny uvedenou koncentrací sloučeniny E po dobu 48 hodin a apoptosa byla určena zkouškou fragmentace DNA. Vypočtená ΕΟ^θ hodnota byla 0,05 mikroM.
Obr. 10 ukazuje apoptosu vyvolávající vlastnosti sloučenin B. HT-29 střevní adenokarcinomní buňky byly ošetřeny indikovanou koncentrací sloučeniny B po dobu 48 hodin a apoptosa byla určena zkouškou fragmentace DNA. Vypočtená EC^^ hodnota byla přibližně 175 mikroM.
Tabulka 3
Apoptosu vyvolávající aktivita v sérii sloučenin
| Referenční sloučeniny | nás. indukce při | 100 mikroM |
| indomethacín | menší než | 2,0 |
| MY5445 | 4,7 | |
| sulindaksulfid | 7,9 | |
| exisulind | menší než | 2,0 |
| Testované sloučeniny | nás. indukce při | 100 mikroM |
| A | menší než | 2,0 |
| B | 3,4 | |
| C | 5,6 | |
| D | menší než | 2,0 |
| E | 4,6 |
V souhlase s protokolem sekce 4.B. uvedené výše, sloučeniny A až E byly testovány na aktivitu vyvolávající apoptosu, jak je uvedeno v tabulce 3 výše. Sloučeniny B, C a E vykázaly významnou apoptosu indukující aktivitu větší než 2,0 násobek pWi dávce 100 mikroM. Z těchto tří sloučenin při tomto dávkování jedině sloučeniny B a E neinhibovaly COX a inhibovaly PDE5.
Byla určena apoptosu vyvolávající aktivita pro sérii fosfodiesterasových inhibitorů. Údaje jsou uvedeny v tabulce 4, která následuje. HT-29 buňky byly ošetřeny po dobu 6 dní různými inhibitory fosfodiesterasy. Apoptosa a nekrosa byly určeny morfologicky po označení akridin oranží a ethidiumbromidem podle zkoušky sekce 4.A. uvedené výše. Údaje ukazují, že PDE5 je užitečný pro roztřiáování sloučenin, které vyvolávají apoptosu HT-29 buněk.
| • · * | • 4 | v | • · ·· |
| • · ♦ * | • 4 | * | • 44· · · |
| 4 · · · | • 4 | 4 | 4 4 · |
| 44 ·· | • * | • | 44 44 |
Tabulka 4
Apoptosu vyvolávající údaje pro PDE inhibitory
| Inhibitor | Zaznamenaná selektivita | % apoptosy | % nekrosy |
| vehikulum | 8 | 6 | |
| 8-methoxy-IBMX | PDE1 | 2 | 1 |
| milrinone | PDE3 | 18 | 0 |
| RO-20-1724 | PDE4 | 11 | 2 |
| MY5445 | PDE5 | 80 | 5 |
| IBMX | neselektivní | 4 | 13 |
Příklad 4
Zkouška inhibice růstu
Referenční sloučeniny a testované sloučeniny byly analýzovány na jejich PDE5 inhibiční aktivitu podle protokolu pro zkoušku sekce 3.A., viz výše. Obr. 11 ukazuje inhibiční účinek různých koncentrací sulindaksulfidu a exisulindu na růst HT-29 buněk. HT-29 buňky byly ošetřovány po 6 dnů různými dávkami exisulindu (trojúhelníky) nebo sulfidu (čtverce) jak je uvedeno. Počet buněk byl měřen sulforodaminovou zkouškou, jak je dříve popsáno (Piazza a j., Cancer Research, 55:3110-3116, 1995). ΙΟ,,θ hodnota pro sulfid byl přibližně 45 mikroM a 200 mikroM pro sulfon. Údaje ukazují, že jak sulindaksulfid tak exisulind jsou schopny inhibovat nádorový buněčný růst.
Obr, 12 ukazuje růstovou inhibiční a apoptosu vyvolávající aktivitu sulindaksulfidu. Průběh experimentu je znázorněn v zahrnutí HT-29 buněk ošetřených bud vehikulem, 0,l%ním DMSO (otevřené symboly) nebo sulindaksulfidem, 120 mikroM (uzavřené symboly).
- 33 Inhibice růstu (vrch) byla měřena počítáním životných buněk po zbarvení trypanovou modří. Apoptosa (spodek) byla měřena morfologickým určením po zbarvení akridinovou oranží a ethidiumbromidem, jak bylo dříve popsáno (Duke a Cohen, v: Current Protocols in Immunology, 3.17.1-3.17.16, New York, John Willey and Sons, 1992). Údaje demonstrují, že sulindaksulfid je schopen inhibovat růst nádorových buněk a že tento efekt je spojen s růstem apoptosy. Všechny údaje byly shrnuty z téhot experimentu .
Obr. 13 ukazuje růstovou inhibiční aktivitu testované sloučeniny E. HT-29 střevní adenokarcinomní buňky byly ošetřeny indikovanou koncentrací sloučeniny E během 6 dnů a počet buněk byl určen SRB zkouškou. Vypočtená hodnota ΙΟ,-θ byla 0,04 mikroM.
Tabulka 5
Inhibiční aktivita růstu v sérii sloučenin
| Referenční sloučeniny | % inhibice při 100 | mikroM |
| indomethacin | 75 | |
| MY5445 | 88 | |
| sulindaksulfid | 88 | |
| exisulind | menší než 50 | |
| Testované sloučeniny | % inhibice při 100 | mikroM |
| A | 68 | |
| B | 77 | |
| C | 80 | |
| D | 78 | |
| E | 62 |
- 34 V souhlase se screeningovým protokolem sekce 3.A., viz výše, sloučeniny A až E byly testovány na inhibiční aktivitu růstu jak je uvedeno výše v tabulce 5. Všechny testované sloučeniny vykázaly aktivitu přesahující srovnávací látku exisulínd při 100 mikroM jednotlivého testu.
Byla určena inhibiční aktivita růstu pro sérii fosfo diesterasových inhibitorů. Údaje jsou uvedeny v následující tabulce 6. m HT-29 buňky byly ošetřovány po dobu 6 dní různými inhibitory fosfodiesterasy. Buněčný růst byl určen SRB zkouškou podle sekce 3.A., viz výše. Údaje ukazují, že inhibitory PDE5 byly účinné na inhibici růstu nádorových buněk.
| Tabulka 6 |
Inhibiční údaje růstu pro PDE inhibitory
| Inhibitor | Zaznamenaná selektivita | Inhibice růstu (ICcn, mikroM) dU | ||
| 8-methoxy -IBMX | PDE1 | větší | než | 200 |
| milrinon | PDE3 | větší | než | 200 |
| RO-20-1724 | PDE4 | větší | než | 200 |
| MY5445 | PDE5 | 5 | ||
| IBMX | nesektivní | v . v T vetší | než | 100 |
- 35 « · *
| • · | 4 | 4 · *· |
| • « * | r | • ·· · · · |
| • · | • | · · |
| 4 * | * | ·· ·· |
Aby se ukázala účinnost této roztřidovací metody na různé formy neoplasie, byly sloučeniny testovány na početných buněčných liniích. Účinky sulindaksulfidu a exisulindu na různé buněčné linie byly určeny. Údaje jsou uvedeny v následující tabulce 7. ICj-θ hodnoty byly určeny SRB zkouškou. Údaje ukazují širokou účinnost těchto sloučenin na široký rozsah neoplasie s účinností ve srovnatelném dávkovém rozsahu. Tudíž sloučeniny identifikované tímto vynálezem by měly být užitečné pro léčení mnohonásobných forem neoplasie.
Tabulka 7
Inhibiční údaje růstu různých buněčných linií
| Buněčný | typ/ | IC5Q (mikroM) |
| tkáňová | specif ita | |
| sulindaksulfid exisulind |
| HT-29,tlusté střevo | 60 | 120 |
| HCT116, tlusté střevo | 45 | 90 |
| MCF7/S, prsa | 30 | 90 |
| UACC375, melanom | 50 | 100 |
| A-427, plíce | 90 | 130 |
| bronchiální epiteliální buňky (normální) | 30 | 90 |
| NRK, ledvina (normální) | 50 | 180 |
| KNRK, ledvina (transformovaná) | 60 | 240 |
| lidský prostatový karcinom PC3 | 82 |
Příklad 5
Aktivita v prsním žlázovém orgánovém kultivačním modelu
Obr. 14 ukazuje inhibici premaligních lézí v prsníj žlázové orgánové kultuře metabolity sulindaku.
Experimenty s prsní žlázovou orgánovou kulturou byly provedeny jak bylo dříve popsáno (Mehta a Moon, Cancer Researach, 46; 5832-5835, 1986). Výsledky demonstrují, že sulinadak a exisulind účinně inhibují tvorbu premaligních lézí, zatímco sulindaksulfid byl inaktivní. Údaje podporují hypotézu, že cyklooxygenasová inhibice není nutná pro antineoplastické vlastnosti požadovaných sloučenin.
Analýza
K identifikaci sloučenin, které mají potenciální použití pro léčení neoplasie tento vynález vytváří racionálie pro porovnání experimentálních údajů testovaných sloučenin zněkolika protokolů. V rámci tohoto vynálezu testované sloučeniny mohou být uspořádány podle jejich potenciálního použití pro léčení neoplasie u lidí. Tyto sloučeniny mající požadované účinky mohou být vybrány pro nákladnější a dlouhodobější studie na zvířatech, které jsou požadovány k získání povolení před počátkem klinických zkoušek u lidí.
Kvalitativní údaje různých testovaných sloučenin a různých protokolů jsou uvedeny v tabulce 8, která následuje. Údaje ukazují, že exisulind, sloučenina B a sloučenina E vykazují vhodnou aktivitu, aby prošly sítem 4 zkoušek: ztrátu COX inhibice, PDE inhibici, růstovou inhibici a indukci apoptosy. Aktivita těchto sloučenin v prsních žlázových orgánových kulturách potvrzuje účinnost tohoto vynálezu. Kvalitativní vyhodnocení screeningových protokolů řadí sloučeninu E nejlépe, pak sloučeninu B a pak exisulind.
- 37 Tabulka 8
Aktivitní profil různých sloučenin
| Sloučenina | COX inhibice | PDE5 Inhibice | Inhibice růstu | Apoptosa | Prsní žlázová orgánová kultura |
| exisulind | _ | ++ | ++ | ++ | +++ |
| sulindak sulfid | ++++ | +++ | +++ | + + + | - |
| MY5445 | ++++ | +++ | +++ | +++ | + |
| A | - | - | +++ | ++ | ++ |
| B | - | +++ | +++ | +++ | ++ |
| D | - | - | ++ | - | - |
| E | - | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ |
| F | - | - | ++ | + | - |
| G | - | - | +++ | 4-4- | +++ |
| H | - | - | ++ | - | - |
Kód tabulky 8:
aktivita sloučenin založená na vyhodnocení série experimentů zahrnujících testy na maximální aktivitu a potenci.
- neaktivní + mírně aktivní ++ středně aktivní +++ silně aktivní ++++ nejvyšší aktivita, která byla kdy zaznamenána.
Samozřejmě početné modifikace a variace předloženého vynálezu jsou možné ve světle výše uvedených skutečností. Je třeba vzít na vědomí, že v rozsahu připojených patentových nároků může být vynález prováděn jinak/ než je zde konkrétně popsáno.
Claims (32)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob identifikace sloučenin s potenciálem pro léčení neoplasie vyznačený tím, že se určí cyklooxygenasová (COX) inhibiční aktivita sloučeniny a určí se PDE5 inhibiční aktivita sloučeniny, přičemž nízká COX inhibiční aktivita ve vztahu k vysoké inhibiční PDE5 aktivitě je ukazatelem, že sloučenina má potenciál pro léčení neoplasie.
- 2. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že se určí, zda sloučenina inhibuje nádorový buněčný růst v kultuře, přičemž inhibice nádorového buněčného růstu je dalším ukazatelem, že sloučenina má potenciál pro léčení neoplasie.
- 3. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že COX inhibiční aktivita sloučeniny se určí stykem sloučeniny s vyčištěnou cyklooxygenasou a měří se změna, je-li nějaká, cyklooxygenasové aktivity, přičemž COX inhibiční aktivita menší než 25 % p0i koncentraci asi 100 mikroM je ukazatelem, že sloučenina by měla být dále hodnocena na potenciál pro léčení neoplasie.
- 4. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že se COX inhibiční aktivita sloučeniny určí stykem sloučeniny s buňkou, která vylučuje PGE-2 a měří se pokles/ je-li nějaký, PGE-2 sekrece z buňky, pfíičemž pokles PGE-2 sekrece koreluje s poklesem v prostaglandinové synthetasní aktivitě.
- 5. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že se dále určí, zda sloučenina vyvolává apoptosu nádorové buňky, přičemž indukce apoptosy je dalším ukazatelem, že sloučenina má potenciál pro léčení neoplasie.4 · * 4 ·
- 6.Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že se dále určí, zda sloučenina inhibuje růst nádorových buněk ve vzorku11 přičemž inhibice růstu nádorových buněk je dalším ukazatelem, že sloučenina je užitečná pro léčení neoplasie.
- 7.Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že PDE aktivita se určí stykem sloučeniny s buněčnou kulturou a určí se nitrobuněčná cyklická GMP koncentrace, přičemž PDE inhibiční aktivita větší než 50 % při koncentraci 10 mikroM je ukazatelem, že sloučenina by měla být dále hodnocena na potenciál pro léčení neoplasie.
- 8. Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, ze PDE aktivita se určí určením poměru nitrobuněčné cyklické GMP/cyklické AMP koncentrace, přičemž růst poměru větší než trojnásobek při koncentraci 10 mikroM je ukazatelem, že sloučenina by měla být hodnocena dále na potenciál pro léčení neoplasie.
- 9. Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že apoptosa se určí stykem sloučeniny s buněčnou kulturou a určí se, zda sloučenina zvýšila množství fragmentované DNA v cytoplasmě, přičemž vzrůst apoptosy větší než dvojnásobek stimulace při koncentraci 100 mikroM je dalším ukazatelem, že sloučenina by měla být dále hodnocena na potenciál pro léčení neoplasie.
- 10. Způsob výběru sloučenin potenciálně užitečných pro léčení neoplasie vyznačený tím, že se určí růstová ihnibiční aktivita sloučenina, určí se PDE5 inhibiční aktivita sloučeniny a vyberou se sloučeniny, které vykazují růstovou ihnibiční aktivitu a PDE5 inhibiční aktivitu.
- 11. Způsob podle nároku 10 vyznačený tím, že se identifikují sloučeniny, kde IC^g hodnota pro růstovou inhibiční aktivitu je menší než asi 100 mikroM pro potenciální použití při léčení neoplasie.i » · · · * « · · ♦ * • · · · · · «« · · · ·
- 12. Způsob podle nároku 10 vyznačený tím, že se dále určí, zda sloučenina vyvolává apoptosu v buňce a vyberou se sloučeniny, které vyvolávají apoptosu.
- 13. Způsob podle nároku 12 vyznačený tím, že se dále vyberou sloučeniny1,' kde EC^ hodnota pro apoptotickou aktivitu je menší než asi 100 mikroM.
- 14. Způsob podle nároku 10 vyznačený tím, že se určí COX inhibiční aktivita sloučeniny a vyberou se sloučeniny s nízkou COX inhibiční aktivitou ve vztahu k PDE5 inhibiční aktivitě.
- 15. Způsob podle nároku 14 vyznačený tím, že se COX inhibiční aktivita sloučeniny určí stykem sloučeniny s cyklooxygenasou a měří se změna1,1 je-li nějaká, cyklooxygenasové aktivity, přičemž pokles cyklooxygenasové aktivity koreluje s poklesem prostaglandinové synthetasní aktivity.
- 16. Způsob podle nároku 14 vyznačený tím, že COX inhibiční aktivita sloučeniny se určí stykem sloučeniny s buňkou1, která vylučuje PGE-2 a měří se pokles, je-li nějaký, PGE-2 sekrece z buňky, přičemž pokles PGE-2 sekrece koreluje s poklesem prostaglandinové synthetasní aktivity.
- 17. Způsob identifikace sloučenin potenciálně užitečných pro podávání pacientům při potřebě preventivního a chronického léčení neoplasie vyznačený tím, že se určí COX inhibiční aktivita sloučenin^ určí se PDE5 inhibiční aktivita sloučenin, přičemž se identifikují ty sloučeniny pro potenciální použití při léčení neoplasie u pacientů při potřebě tohoto léčení, jestliže tyto sloučeniny vykazují PDE5 inhibiční aktivitu.
- 18. Způsob podle nároku 17 vyznačený tím, že se určí selektivita sloučenin pro inhibici PDE5 isoenzymu.
- 19. Způsob podle nároku 17 vyznačený tím, že se dále určí růstová inhibiční aktivita sloučenin a identifikují se ty sloučeniny s fosfodiesterasovou inhibiční aktivitou podstatně větší, než je COX inhibiční aktivita při koncentracích vykazujících podstatnou růstovou inhibiční aktivitu.
- 20. Způsob podle nároku 19 vyznačený tím, že růstová inhibiční aktivita se určí snížením počtu buněk ve vzorku.
- 21. Způsob podle nároku 17 vyznačený tím, že růstová inhibiční aktivita se určí úrovní vyvolávající apoptosu ve vzorku.
- 22. Způsob podle nároku 17 vyznačený tím, že sloučeniny se dále identifikují na potenciální použití při léčení neoplasie u pacientů v případě jeho potřeby, jestliže je úroveň vyvolání apoptosy podstatně větší než úroveň vyvolání nekrosy.
- 23. Způsob roztřiČování sloučenin s potenciálem na léčení neoplasie vyznačený tím, že se určí PDE5 inhibiční aktivita sloučenin a vyberou se sloučeniny s inhibiční aktivitou větší než je předem stanovená hodnota.
- 24. Způsob podle nároku 23 vyznačený tím, že se dále určíj zda vybrané sloučeniny vyvolávají apoptosu v buňce a dále se vyberou sloučeniny s apoptosu vyvolávající aktivitou větší než je předem stanovená hodnota.
- 25. Způsob podle nároku 24 vyznačený tím, že se dále určíj zda vybrané sloučeniny inhibují prostaglandinovou syntézu a dále se vyberou sloučeniny s inhibiční aktivitou menší než je předem stanovená hodnota.
- 26. Způsob podle nároku 24 vyznačený tím, že PDE5 aktivita se určí měřením nitrobuněčného cyklického GMP a cyklického • · * · ♦ *· ··AMP a určí se, zda se vyskytuje vzrůst poměru cyklického GMP k cyklickému AMP.
- 27. Způsob identifikace sloučeniny s potenciálem pro léčení neoplasie vyznačený tím, že se určí COX-I inhibiční aktivita sloučeniny a určí se PDE5 inhibiční aktivita sloučeniny, přičemž nízká COX-I inhibiční aktivita a vysoká inhibice PDE5 aktivity jsou ukazatelem, že sloučenina má potenciál pro léčení neoplasie.
- 28. Způsob identifikace sloučeniny s potenciálem pro léčení neoplasie vyznačený tím, že se ošetří neoplastické buňky sloučeninou, která má být hodnocena při koncentraci mezi asi 200 mikroM do 200 pM, určí se nitrobuněčné množství cGMP v ošetřených buňkách, určí se vnitrobuněčné množství cAMP v ošetřených buňkách, přičemž asi 3násobný nebo větší vzrůst poměru cGMP/cAMP v ošetřených buňkách ve srovnání s poměrem cGMP/cAMP v neošetřených neoplastických buňkách je ukazatelem, že sloučenina má potenciál pro léčení neoplasie.
- 29. Způsob podle nároku 28 vyznačený tím, že nitrobuněčné množstv cGMP v ošetřených buňkách větší než 500 fmol/mg proteinu je ukazatelem, že sloučenina má potenciál pro léčení neoplasie.
- 30. Způsob podle nároku 28 vyznačený tím, že nitrobuněčné množství cAMP v ošetřených buňkách menší než 4000 fmol/mg proteinu je ukazatelem, že sloučenina má potenciál pro léčení neoplasie.
- 31. Způsob podle nároku 30 vyznačený tím, že nitrobuněčné množství cAMP v ošetřených buňkách menší než 4000 fmol/mg proteinu je ukazatelem, že sloučenina má potenciál na léčení neoplasie.» v
- 32. Způsob selekce sloučenin potenciálně užitečných pro léčení neoplasie vyznačený tím, že se porovná růstová inhibiční aktivita sloučeniny s PDE5 inhibiční aktivitou sloučeniny a vyberou se sloučeniny, které vykazují růstovou inhibiční aktivitu a PDE5 inhibiční aktivitu.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/866,027 US5858694A (en) | 1997-05-30 | 1997-05-30 | Method for identifying compounds for inhibition of cancerous lesions |
| US4673998A | 1998-03-24 | 1998-03-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ165198A3 true CZ165198A3 (cs) | 1999-01-13 |
| CZ295868B6 CZ295868B6 (cs) | 2005-11-16 |
Family
ID=26724247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19981651A CZ295868B6 (cs) | 1997-05-30 | 1998-05-28 | Způsob identifikace a výběru sloučeniny s potenciálem pro léčení neoplasie |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6500610B1 (cs) |
| EP (2) | EP1038523A3 (cs) |
| JP (3) | JP3053381B2 (cs) |
| KR (1) | KR100304859B1 (cs) |
| AT (1) | ATE198771T1 (cs) |
| AU (1) | AU709666B2 (cs) |
| CA (1) | CA2238283C (cs) |
| CZ (1) | CZ295868B6 (cs) |
| DE (2) | DE881300T1 (cs) |
| DK (1) | DK0881300T3 (cs) |
| ES (1) | ES2132055T3 (cs) |
| HK (1) | HK1012196A1 (cs) |
| IL (1) | IL124699A (cs) |
| NO (1) | NO321717B1 (cs) |
| TR (1) | TR199800960A3 (cs) |
| TW (1) | TW591111B (cs) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040009464A1 (en) * | 1998-10-15 | 2004-01-15 | Li Liu | Methods for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions, and pharmacetical compositions containing such compounds |
| US20020009764A1 (en) * | 1999-10-08 | 2002-01-24 | W. Joseph Thompson | Methods for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions, and pharmaceutical compositions containing such compounds |
| IL132366A0 (en) * | 1998-10-15 | 2001-03-19 | Cell Pathways Inc | Methods for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions and pharmaceutical compositions containing such compounds |
| US20050244914A1 (en) * | 1999-10-08 | 2005-11-03 | Li Liu | Methods for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions, and pharmaceutical compositions containing such compounds |
| DE10060388A1 (de) * | 2000-12-05 | 2002-06-06 | Merck Patent Gmbh | Verwendung von Pyrazolo [4,3-d]pyrimidinen |
| FR2824334B1 (fr) | 2001-05-03 | 2003-10-10 | Coletica | Procede pour tester une substance eventuellement active dans le domaine de la lipolyse et son utilisation principalement cosmetique |
| JP2005516586A (ja) * | 2001-07-20 | 2005-06-09 | ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァースティ オブ イリノイ | 癌の処置に対する遺伝子標的を同定するための試薬および方法 |
| DE10135815A1 (de) * | 2001-07-23 | 2003-02-06 | Bayer Ag | Verwendung von 2-Alkoxyphenyl-substituierten Imidazotriazinonen |
| WO2003012030A2 (en) * | 2001-08-01 | 2003-02-13 | University Of Utah, Technology Transfer Office | Isoform-selective inhibitors and activators of pde3 cyclic |
| WO2003038430A1 (fr) * | 2001-10-29 | 2003-05-08 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Technique d'analyse |
| US20050048573A1 (en) * | 2003-02-03 | 2005-03-03 | Plexxikon, Inc. | PDE5A crystal structure and uses |
| US7711584B2 (en) | 2003-09-04 | 2010-05-04 | Hartford Fire Insurance Company | System for reducing the risk associated with an insured building structure through the incorporation of selected technologies |
| EP1690852A1 (en) * | 2003-12-01 | 2006-08-16 | Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd | Novel target protein of anticancer agent and novel anticancer agent (spnal) corresponding thereto |
| US7585859B2 (en) * | 2004-05-06 | 2009-09-08 | Plexxikon, Inc. | PDE4B inhibitors and uses therefor |
| EP1786813A2 (en) * | 2004-09-03 | 2007-05-23 | Plexxikon, Inc. | Bicyclic heteroaryl pde4b inhibitors |
| WO2006074443A2 (en) | 2005-01-07 | 2006-07-13 | The Johns Hopkins University | Pde5 inhibitor compositions and methods for immunotherapy |
| WO2006097459A1 (en) * | 2005-03-14 | 2006-09-21 | Nycomed Gmbh | Method for preventing cardiovascular diseases |
| EP1968616A4 (en) * | 2006-01-04 | 2009-10-21 | Southern Res Inst | DERIVATIVES OF SULINDAC, USE AND PREPARATION THEREOF |
| JP2007224007A (ja) * | 2006-03-27 | 2007-09-06 | Univ De Santiago De Compostela | ｙｅｓｓｏｔｏｘｉｎｓのヒト腫瘍細胞増殖抑制剤としての治療的な使用 |
| US8673914B2 (en) | 2011-03-28 | 2014-03-18 | St. John's University | Use of phosphodiesterase inhibitors for treating multidrug resistance |
| WO2017168174A1 (en) | 2016-04-02 | 2017-10-05 | N4 Pharma Uk Limited | New pharmaceutical forms of sildenafil |
Family Cites Families (107)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE274218C (cs) | ||||
| GB807826A (en) | 1955-03-14 | 1959-01-21 | Thomae Gmbh Dr K | Derivatives of pyrimido[5,4-d] pyrimidine and production thereof |
| US3031450A (en) | 1959-04-30 | 1962-04-24 | Thomae Gmbh Dr K | Substituted pyrimido-[5, 4-d]-pyrimidines |
| AT290523B (de) | 1962-01-05 | 1971-06-11 | Merck & Co Inc | Verfahren zur Herstellung neuer α-(3-Indolyl)-carbonsäuren |
| US3322755A (en) | 1964-03-10 | 1967-05-30 | Boehringer Sohn Ingelheim | Basic-substituted 1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimido [5, 4-d]-pyrimidines |
| US3812127A (en) | 1966-10-31 | 1974-05-21 | Pfizer | 4-(quinolin-4-yl)piperazine-1-carboxylic acid esters |
| GB1199768A (en) | 1966-10-31 | 1970-07-22 | Pfizer & Co C | Nitrogen Heterocycles and process for their preparation |
| US3517005A (en) | 1967-10-26 | 1970-06-23 | Pfizer & Co C | Certain 2- and 4-substituted quinazolines |
| US3752826A (en) | 1970-01-26 | 1973-08-14 | Mcneilab Inc | Aroyl substituted pyrroles |
| US3654349A (en) | 1970-05-01 | 1972-04-04 | Merck & Co Inc | Substituted indenyl acetic acids |
| US3647858A (en) | 1970-05-01 | 1972-03-07 | Merck & Co Inc | Process for preparing 1-benzylidene-3-indenyl acetic acids |
| US3819631A (en) | 1970-12-15 | 1974-06-25 | May & Baker Ltd | Azapurinones |
| GB1493685A (en) | 1970-12-15 | 1977-11-30 | May & Baker Ltd | 8-azapurinones |
| US3780040A (en) | 1972-06-02 | 1973-12-18 | R Schnettler | 2-substituted-3,4-dihydroquinazolines |
| JPS536156B2 (cs) | 1972-10-30 | 1978-03-04 | ||
| JPS5825980B2 (ja) * | 1976-02-12 | 1983-05-31 | ヤマサ醤油株式会社 | サイクリックヌクレオチドの定量法 |
| US4001237A (en) | 1976-02-18 | 1977-01-04 | Bristol-Myers Company | Oxazole, isoxazole, thiazole and isothiazole amides |
| US4060615A (en) | 1976-02-18 | 1977-11-29 | Mead Johnson & Company | 2-Piperazinyl-6,7-dimethoxyquinazolines |
| US4001238A (en) | 1976-02-18 | 1977-01-04 | Bristol-Myers Company | 1,3,4-oxadiazole amides |
| US4076711A (en) | 1976-04-05 | 1978-02-28 | Schering Corporation | Triazolo [4,5-d]-pyrimidines |
| US4171363A (en) | 1977-02-22 | 1979-10-16 | Bristol-Myers Company | 1,2,3-Thiadiazole process |
| US4101548A (en) | 1977-02-22 | 1978-07-18 | Bristol-Myers Company | 1,2,3-Thiadiazole amides |
| US4079057A (en) | 1977-05-31 | 1978-03-14 | Bristol-Myers Company | Selective immunosuppressive agents |
| US4102885A (en) | 1977-06-20 | 1978-07-25 | Bristol-Myers Company | Process for preparing 2,4-dihaloquinazolines |
| US4098788A (en) | 1977-06-20 | 1978-07-04 | Bristol-Myers Company | Process for preparing quinazolines |
| US4138561A (en) | 1977-09-30 | 1979-02-06 | Bristol-Myers Company | Cyanocarboxamidines and quinazoline process |
| US4146718A (en) | 1978-04-10 | 1979-03-27 | Bristol-Myers Company | Alkyl 5,6-dichloro-3,4-dihydro-2(1h)-iminoquinazoline-3-acetate hydrohalides |
| US4209623A (en) | 1978-06-07 | 1980-06-24 | Bristol-Myers Company | Pyrimidine-5-N-(1H-tetrazol-5-yl)-carboxamides |
| US4208521A (en) | 1978-07-31 | 1980-06-17 | Bristol-Myers Company | Process for the preparation of imidazo[2,1-b]quinazolinones |
| US4161595A (en) | 1978-10-02 | 1979-07-17 | Bristol-Myers Company | Levulinic acid salt |
| DE2845766A1 (de) | 1978-10-18 | 1980-04-30 | Schering Ag | Pyrido eckige klammer auf 2,1-b eckige klammer zu -chinazolinon-derivate, ihre herstellung und verwendung |
| JPS5653659A (en) | 1979-10-09 | 1981-05-13 | Mitsubishi Yuka Yakuhin Kk | Blood platelet coagulation suppressing agent |
| GB2063249A (en) | 1979-10-09 | 1981-06-03 | Mitsubishi Yuka Pharma | 4-Phenylphthalazine derivatives |
| US4423075A (en) | 1980-06-19 | 1983-12-27 | Ayerst, Mckenna & Harrison Inc. | Aldose reductase inhibition by 5-fluoro-2-methyl-1-[[4-(methylsulfonyl)phenyl]methylene]-1H-indene-3-acetic acid |
| JPS57167974A (en) | 1981-04-09 | 1982-10-16 | Mitsubishi Yuka Yakuhin Kk | Preparation of 4-phenylphthalazine derivative |
| DE3131365A1 (de) | 1981-08-07 | 1983-02-24 | Henkel KGaA, 4000 Düsseldorf | Neue diglycidyl-substituierte heterocyclische verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in arzneimittelzubereitungen mit cytostatischer wirksamkeit |
| US5250535A (en) | 1982-02-01 | 1993-10-05 | Syntex Inc. | Substituted 9-(1 or 3-monoacyloxy or 1,3-diacyloxy-2-propoxymethyl) purines as antiviral agent |
| US4460591A (en) | 1982-08-26 | 1984-07-17 | Sri International | 8,10-Dideazaminopterins |
| FI94133C (fi) * | 1985-04-19 | 1995-07-25 | Sankyo Co | Menetelmä lääkeaineina käyttökelpoisten griseoliinihapon johdannaisten valmistamiseksi |
| US4837239A (en) | 1985-08-23 | 1989-06-06 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Cardiotonic phosphodiesterase inhibitors complexed with water soluble vitamins |
| DE3770095D1 (de) | 1986-08-21 | 1991-06-20 | Pfizer | Chinazolindione und pyridopyrimidindione. |
| CA1303037C (en) | 1987-02-02 | 1992-06-09 | Smith Kline & French Laboratories Limited | Purinone derivatives as bronchodilators vasodilators and anti-allergic agents |
| AU3192289A (en) | 1988-02-08 | 1989-08-25 | Schering Corporation | Nucleosidetype compounds which are phosphodiesterase inhibitors |
| US5091431A (en) | 1988-02-08 | 1992-02-25 | Schering Corporation | Phosphodiesterase inhibitors |
| US5254571A (en) | 1988-04-21 | 1993-10-19 | Smith Kline & French Laboratories Ltd. | Chemical compounds |
| GB8814352D0 (en) | 1988-06-16 | 1988-07-20 | Smith Kline French Lab | Chemical compounds |
| DE68908786T2 (de) | 1988-06-16 | 1994-03-17 | Smith Kline French Lab | Condensierte Pyrimidinderivate, Verfahren und Zwischenprodukte zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen. |
| US5075310A (en) | 1988-07-01 | 1991-12-24 | Smith Kline & French Laboratories, Ltd. | Pyrimidone derivatives as bronchodilators |
| US4923874A (en) | 1988-07-21 | 1990-05-08 | G. D. Searle & Co. | Use of 8-azapurin-6-one derivatives for control of hypertension |
| GB8817651D0 (en) | 1988-07-25 | 1988-09-01 | Smith Kline French Lab | Chemical compounds |
| GB8827988D0 (en) | 1988-11-30 | 1989-01-05 | Smith Kline French Lab | Chemical compounds |
| US4971972A (en) | 1989-03-23 | 1990-11-20 | Schering Corporation | Phosphodiesterase inhibitors having an optionally substituted purine derivative portion and a benzo- or cyclopenta-furan portion |
| GB8909560D0 (en) | 1989-04-26 | 1989-06-14 | Smith Kline French Lab | Chemical compounds |
| US5376683A (en) | 1989-07-14 | 1994-12-27 | Schering Aktiengesellschaft | Δ8- and Δ9-prostaglandin derivatives, process for their production and their pharmaceutical use |
| GB8923131D0 (en) | 1989-10-13 | 1989-11-29 | Smith Kline French Lab | Chemical compounds |
| US5091430A (en) | 1990-03-13 | 1992-02-25 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | O6 -substituted guanine compounds and methods for depleting O6 -alkylguanine-DNA alkyltransferase levels |
| GB9013750D0 (en) | 1990-06-20 | 1990-08-08 | Pfizer Ltd | Therapeutic agents |
| ZA914727B (en) | 1990-06-21 | 1992-03-25 | Schering Corp | Polycyclic guanine derivatives |
| ZA916646B (en) | 1990-08-23 | 1992-07-29 | Synphar Lab Inc | Novel isocarbostiryl compounds and anti-tumor use thereof |
| US5175151A (en) | 1990-09-07 | 1992-12-29 | Schering Corporation | Antiviral compounds and antihypertensive compounds |
| AU659106B2 (en) | 1990-11-06 | 1995-05-11 | Fgn, Inc. | Method for treating colonic polyps by the use of esters and amides of substituted phenyl and pyridyl amino carboxylates |
| AU658373B2 (en) | 1990-11-06 | 1995-04-13 | Fgn, Inc. | Esters and amides of substituted pyrrole acetic acids |
| AU650914B2 (en) | 1990-11-06 | 1994-07-07 | Fgn, Inc. | Esters and amides of substituted phenyl acetic acids |
| AU650689B2 (en) | 1990-11-06 | 1994-06-30 | Fgn, Inc. | Esters and amides of substituted indenyl acetic acids |
| AU659107B2 (en) | 1990-11-06 | 1995-05-11 | Fgn, Inc. | Method for treating colonic polyps by the use of esters and amides of substituted fused ring phenyl acetic acids |
| US5401774A (en) * | 1991-03-08 | 1995-03-28 | University Of Arizona | Method for treating patients with precancerous lesions by administering substituted sulfonyl idenyl acetic and propionic acids and esters to patients with lesions sensitive to such compounds |
| EP0508586B1 (en) * | 1991-03-08 | 1995-05-31 | Fgn, Inc. | Substituted indenyl compounds |
| US5239083A (en) | 1991-03-11 | 1993-08-24 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Indole derivatives which inhibit steroid 5α reductase |
| US5223501A (en) | 1991-05-10 | 1993-06-29 | Merck & Co., Inc. | Substituted pyrimidinones bearing acidic functional groups as angiotensin ii antagonists |
| GB9114760D0 (en) | 1991-07-09 | 1991-08-28 | Pfizer Ltd | Therapeutic agents |
| PT100905A (pt) | 1991-09-30 | 1994-02-28 | Eisai Co Ltd | Compostos heterociclicos azotados biciclicos contendo aneis de benzeno, ciclo-hexano ou piridina e de pirimidina, piridina ou imidazol substituidos e composicoes farmaceuticas que os contem |
| GB9121028D0 (en) | 1991-10-03 | 1991-11-13 | Pfizer Ltd | Therapeutic agents |
| GB9126260D0 (en) | 1991-12-11 | 1992-02-12 | Pfizer Ltd | Therapeutic agents |
| US5731167A (en) | 1992-01-17 | 1998-03-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Autotaxin: motility stimulating protein useful in cancer diagnosis and therapy |
| JP2657760B2 (ja) | 1992-07-15 | 1997-09-24 | 小野薬品工業株式会社 | ４−アミノキナゾリン誘導体およびそれを含有する医薬品 |
| CA2140440A1 (en) | 1992-08-06 | 1994-02-17 | Ellen M. Dobrusin | 2-thioindoles (selenoindoles) and related disulfides (selenides) which inhibit protein tyrosine kinases and which have antitumor properties |
| EP0682109A4 (en) | 1993-01-29 | 1997-06-04 | Taisho Pharmaceutical Co Ltd | CYCLIC NUCLEOTIDASE AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME. |
| US6156312A (en) * | 1993-06-23 | 2000-12-05 | Leskovar; Peter | Agents, affecting the hyperactivated immunological effector cells |
| DE4330177A1 (de) | 1993-08-31 | 1995-03-02 | Schering Ag | Neue 9-Chlor-prostaglandin-derivate |
| EP0669324A4 (en) | 1993-09-10 | 1996-04-03 | Eisai Co Ltd | CHINAZOLIN DERIVATIVES. |
| JPH09507300A (ja) * | 1994-01-06 | 1997-07-22 | テラピン テクノロジーズ，インコーポレイテッド | 標的の代用物および改良された参照パネル |
| AU701529B2 (en) * | 1994-04-05 | 1999-01-28 | Purdue Research Foundation | NADH oxidase as a target in diagnosis and therapy |
| US5776962A (en) * | 1994-08-03 | 1998-07-07 | Cell Pathways, Inc. | Lactone compounds for treating patient with precancerous lesions |
| US5696159A (en) | 1994-08-03 | 1997-12-09 | Cell Pathways, Inc. | Lactone compounds for treating patients with precancerous lesions |
| DE19501481A1 (de) | 1995-01-19 | 1996-07-25 | Bayer Ag | 2,8-Disubstituierte Chinazolinone |
| US5674876A (en) | 1995-01-20 | 1997-10-07 | Research Development Foundation | ρ-heteroatom-substituted phenols and uses thereof |
| US5488055A (en) | 1995-03-10 | 1996-01-30 | Sanofi Winthrop Inc. | Substituted N-cycloalkylmethyl-1H-pyrazolo(3,4-b)quinolin-4 amines and compositions and methods of use thereof |
| US5614530A (en) | 1995-03-10 | 1997-03-25 | Sterling Winthrop Inc. | Substituted N-arylmethyl and heterocyclmethyl-1H-pyrazolo[3,4-b]quinolin-4-amines and compositions and methods of use thereof |
| DE19518082A1 (de) | 1995-05-17 | 1996-11-21 | Merck Patent Gmbh | 4(-Arylaminomethylen)-2,4-dihydropyrazol-3-one |
| US5874440A (en) | 1995-06-07 | 1999-02-23 | Cell Pathways, Inc. | Method of treating a patient having precancerous lesions with phenyl pyrimidinone derivatives |
| GB9526246D0 (en) | 1995-12-21 | 1996-02-21 | Celltech Therapeutics Ltd | Chemical compounds |
| GB9526245D0 (en) | 1995-12-21 | 1996-02-21 | Celltech Therapeutics Ltd | Chemical compounds |
| GB9526243D0 (en) | 1995-12-21 | 1996-02-21 | Celltech Therapeutics Ltd | Chemical compounds |
| US5798246A (en) | 1996-03-25 | 1998-08-25 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Cyclic nucleotide phosphodiesterase |
| US5998477A (en) * | 1996-06-13 | 1999-12-07 | Cell Pathways Inc. | Substituted methoxy benzylidene indenyl-acetic and propionic acids for treating patients with precancerous lesions |
| US6063818A (en) * | 1996-06-13 | 2000-05-16 | Cell Pathways Inc. | Substituted benzylidene indenyl formamides, acetamides and propionamides |
| WO1998009523A1 (en) * | 1996-09-05 | 1998-03-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods for treatment of neurological disorders and neurodegenerative diseases |
| US5869519A (en) | 1996-12-16 | 1999-02-09 | Idun Pharmaceuticals, Inc. | C-terminal modified (n-substituted)-2-indolyl dipeptides as inhibitors of the ICE/ced-3 family of cysteine proteases |
| US6294585B1 (en) | 1996-09-18 | 2001-09-25 | Applied Genetics Incorporated Dermatics | Treatment of neurodegenerative diseases |
| US5858694A (en) * | 1997-05-30 | 1999-01-12 | Cell Pathways, Inc. | Method for identifying compounds for inhibition of cancerous lesions |
| US5932465A (en) | 1997-10-16 | 1999-08-03 | Icos Corporation | Phosphodiesterase 8A |
| US5922595A (en) | 1997-12-09 | 1999-07-13 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Cyclic GMP phosphodiesterase |
| US5852035A (en) | 1997-12-12 | 1998-12-22 | Cell Pathways, Inc. | Method for inhibiting neoplastic cells and related conditions by exposure to substituted N- arylmethyl and heterocyclmethyl-1H-pyrazolo (3,4-B) quinolin-4-amines |
| US5942520A (en) | 1998-01-27 | 1999-08-24 | Cell Pathways, Inc. | Method for inhibiting neoplastic cells by exposure to substituted N-cycloalkylmethyl-1-H-pyrazolo (3,4-B) quinolone-4 amines |
| US6200771B1 (en) * | 1998-10-15 | 2001-03-13 | Cell Pathways, Inc. | Method of using a novel phosphodiesterase in pharmaceutical screeing to identify compounds for treatment of neoplasia |
| US6235782B1 (en) * | 1998-11-12 | 2001-05-22 | Rifat Pamukcu | Method for treating a patient with neoplasia by treatment with a platinum coordination complex |
| US6235776B1 (en) * | 1998-11-12 | 2001-05-22 | Cell Pathways, Inc. | Method for treating a patient with neoplasia by treatment with a paclitaxel derivative |
-
1998
- 1998-05-20 CA CA002238283A patent/CA2238283C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-25 TW TW087108072A patent/TW591111B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-05-28 KR KR1019980019380A patent/KR100304859B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-05-28 CZ CZ19981651A patent/CZ295868B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-05-29 AT AT98304247T patent/ATE198771T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-05-29 AU AU69794/98A patent/AU709666B2/en not_active Ceased
- 1998-05-29 EP EP00112020A patent/EP1038523A3/en not_active Withdrawn
- 1998-05-29 DE DE0881300T patent/DE881300T1/de active Pending
- 1998-05-29 IL IL12469998A patent/IL124699A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-05-29 DE DE69800488T patent/DE69800488T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-29 DK DK98304247T patent/DK0881300T3/da active
- 1998-05-29 ES ES98304247T patent/ES2132055T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-29 TR TR1998/00960A patent/TR199800960A3/tr unknown
- 1998-05-29 NO NO19982477A patent/NO321717B1/no unknown
- 1998-05-29 EP EP98304247A patent/EP0881300B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-29 JP JP10150033A patent/JP3053381B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-16 HK HK98113546A patent/HK1012196A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-07-02 JP JP18961599A patent/JP3234818B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-08 US US09/414,625 patent/US6500610B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-02-22 JP JP2000044184A patent/JP2000198746A/ja active Pending
-
2002
- 2002-01-07 US US10/040,776 patent/US20030004093A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-24 US US10/252,983 patent/US20030190686A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5858694A (en) | Method for identifying compounds for inhibition of cancerous lesions | |
| CZ165198A3 (cs) | Způsob identifikace sloučenin pro inhibici neoplastických lézí | |
| US6200771B1 (en) | Method of using a novel phosphodiesterase in pharmaceutical screeing to identify compounds for treatment of neoplasia | |
| US6130053A (en) | Method for selecting compounds for inhibition of neoplastic lesions | |
| JP2006516950A (ja) | Ｗｎｔ仲介ＥｒｂＢシグナル伝達、それに関連する組成物および用途 | |
| AU770308B2 (en) | Methods for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions, and pharmaceutical compositions containing such compounds | |
| US20030064421A1 (en) | Methods for treating a patient with neoplasia by administering cGMP-specific PDE-inhibiting compounds | |
| KR100413591B1 (ko) | 종양 억제 능력을 갖는 화합물의 선별 방법 및 상기화합물을 함유하는 약학 조성물 | |
| AU5953899A (en) | Method for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions | |
| AU4064402A (en) | Method for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions | |
| US20030109418A1 (en) | Methods for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions, and pharmaceutical compositions containing such compounds | |
| US6906064B2 (en) | Method for treating a patient with neoplasia using Iressa | |
| US20050244914A1 (en) | Methods for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions, and pharmaceutical compositions containing such compounds | |
| CZ9903637A3 (cs) | Metoda identifikace sloučenin inhibujících nádorový proces a prostředky obsahující tyto sloučeniny | |
| Kensler et al. | Mechanisms of chemoprotection against aflatoxin-induced hepatocarcinogenesis by oltipraz | |
| US20040009464A1 (en) | Methods for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions, and pharmacetical compositions containing such compounds | |
| KR20000029189A (ko) | 신생물의 병소부위를 억제하는 화합물의 동정방법 및 상기 화합물을 함유하는 약제학적 조성물 | |
| WO2002041914A1 (en) | Method for treating neoplasia by administering an anti-her2 antibody and a cgmp-specific phosphodiesterase inhibitor | |
| WO2001078651A2 (en) | Method for treating neoplasmin with topoisomase i inhibitor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090528 |