KR20000029189A

KR20000029189A - 신생물의 병소부위를 억제하는 화합물의 동정방법 및 상기 화합물을 함유하는 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20000029189A
Application number: KR1019990045451A
Authority: KR
Inventors: 류리; 츄빙; 리한; 톰슨더블유.조셉; 파므크리펫; 피아자게리에이.
Original assignee: 로버트 더블유. 스티븐슨; 셀 페스웨이스, 인코포레이션
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2000-05-25
Also published as: KR100644365B1

Abstract

본 발명은 포유동물에서 암전구성 및 암성의 예방과 치료에 유용한 화합물을 동정하기 위하여 포스포디에스테라제-2 (PDE2), 포스포디에스테라제-5 (PDE5) 및/또는 단백 키나제 G 중에서 하나 이상의 용도와, 상기 화합물을 함유하는 약제학적 조성물과 상기 화합물을 사용하여 신생물의 이상증식을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신생물의 병소부위를 억제하는 화합물의 동정방법 및 상기 화합물을 함유하는 약제학적 조성물 {Methods for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions, and pharmacetical compositions containing such compounds}

현재, 암치료를 위한 비외과적 수술의 경우에 환자의 암상태가 화학요법제나 호르몬제의 치료학적 이점이 이들 제제의 중증의 부작용을 상회하는 경우까지 이르게 되면 고도의 독성효과를 가진 하나이상의 화학용법제나 호르몬제를 환자에게 투여하여 암환자를 치료하고 있다. 상기 부작용은 이미 종양학자에게 널리 알려져 있으며 그 부작용의 발생빈도는 약물에 따라 다르다. 그러나, 전형적으로 화학요법제는 단기간에 걸쳐 사용되며 약물에 따른 부작용이 발생하지 않도록 약물의 휴지시간을 두게 된다. 따라서, 약물의 위험과 이점에 대한 선택을 고려해 볼때, 환자가 암전구성의 병소를 가지고 있는 경우 그 부작용으로 인하여 화학요법제를 사용하지 않고 있으며, 또한 발생된 암에 대하여 장기간에 걸쳐 화학요법제나 호르몬제를 투여하는 것도 암재발을 방지하기 위하여 지양하는 실정에 있다.

1990년대 초엽부터 암환자에게 예기치 않은 희망의 등불이 비스테로이드성 소염제로부터 나타나기 시작했다. 종양조직으로부터 과도하게 발현된 각종의 생화학적 분자들을 소개하는 암과 전구성 암에 대한 많은 연구문헌들이 발표되기 시작하였다. 이에 따라, 과도하게 발현된 특정분자들은 암과 연관이 있으며 상기 과도한 발현이 억제되는 경우 신생물은 이상증식을 치료할 수 있다는 연구결과가 꼬리를 물고 출현하게 되었다. 예를 들면, 가족성 선종양성폴립 (familial adenomatous polyposis; FAP)과 관련하여 1993년 와델 등은 상기 폴립에서 프로스타글란딘류가 과도하게 발현되고 있음에 비추어 비스테로이드성 소염제를 투여하면 상기 소염제가 프로스타글란딘 합성효소 (PGE2) 활성을 억제함으로 암관련 증상을 완화시킬 수 있다고 가정하였다 [Waddell, W.R. et al., "Sulindac for Polyposis of the Colon, " Journal of Surgical Oncology, 24:83-87, 1983]. 따라서, 와델 등은 비스테로이드성 소염제인 술린닥 (PGE2 억제제)을 여러명의 FAP 환자에게 투여하였다. 이에 따라, 와델 등은 폴립의 생성이 제거되고 상기 약물요법에 대하여 재발을 나타내지 않고 있음을 발견하였다. PGE2를 억제함에 따라 상기 비스테로이드성 소염제의 투여에 따른 사이클로옥시게나제 (COX)를 억제하게 된다. 와델 등이 술린닥을 투여하여 성공을 거둔 것과 PGE2/COX와의 관계를 미루어 볼때 발암현상에서 두개의 생화학적 대상물, 즉 PGE2와 COX의 역할을 확인하는 계기가 되었으며 이후에 출판된 문헌에서도 이러한 견해를 입증한 바 있다.

술린닥이 기존의 화학요법제나 호르몬제에 비해서 부작용이 극소하다는 사실은 신생물의 이상증식으로부터 고통을 받고 있는 환자에 있어 상당히 고무적이었고, 이에 따라 종양초기에 이를 치료하는 가능성에 대한 장을 열게 되었으며 기존의 화학요법제와 비교하여 장기간에 걸쳐 투여가 가능한 잇점이 부가되었다. 그러나, 상기 희망은 와델 등이 암전구성 환자 (FAP 환자)에게만 술린닥을 투여한 사실에 비추어 이미 발생한 암에 대하여 상기 화합물이 치료효과를 나타낼 수 있는 가에 대한 공개질문이 쏟아짐에 따라 물거품이 되고 말았다.

또한, 상기 희망은 비스테로이드성 소염제가 지니고 있는 부작용에 의해서도 사라지게 되었다. 술린닥이나 기타 비스테로이드성 소염제를 장기간에 걸쳐 투여하는 경우 PGE2가 위장보호기능을 하고 있는 소화관을 악화시키게 된다. 또한, 상기 비스테로이드성 소염제를 장기간에 걸쳐 투여하면 신장장애 및 정상적인 혈액응고를 저해하게 된다. 와델 등이 경험한 바와 같이 술린닥을 투여받은 몇몇 환자들이 부작용으로 인하여 약물투여를 중단할 수 밖에 없었으며, 이로 인해 폴립형성을 제거하기 위하여 추가적으로 외과수술에 의존해야 한다는 사실이었다 [참조: Waddell, W.R. et al., "Sulindac for Polyposis of the Colon," The American Journal of Surgery, 157: 175-79, 1989]. 따라서, 신생물의 이상증식이 나타나는 환자의 경우 상기 비스테로이드성 소염제는 FAP 환자, 간혈성 폴립형성환자 또는 전립선적제술을 받은 남성으로 PSA 수치가 증가하는 환자 (PSA 수치의 상승은 질병의 재발을 의미하나 암으로의 이행여부는 밝혀지지 않은 것)에게는 그다지 효과가 없는 치료약물이다. 상기 비스테로이드성 소염제의 부작용으로 인하여 장기간의 약물치료를 요하는 기타 신생물의 이상증식환자에게는 그 사용이 제한되고 있다. 최근에 일부 학자들은 COX-2에 특이적인 비스테로이드성 소염제로서 셀레콕시브를 투여하도록 권고하고 있다. 그러나, 상기 약물이 신장장애 및 기타 부작용을 야기시킴으로 장기간에 걸쳐 신생물의 이상증식환자에게 투여시에는 약물의 용량과 그 투여기간을 고려하도록 하는 등의 제한이 가해지고 있다. 또한, 최근에 발행된 문헌에 따르면, 결장직장의 예정부위에서 결장폴립에 대한 치료역 효과를 얻기 위해 고용량의 셀레콕시브와 같은 약물을 투여해야 한다는 점을 시사하고 있다.

결장암의 치료에 있어 가장 중요한 사실은 특정 결장성 신생물의 이상증식 ( 예를 들면, HCT-116)의 경우 COX-2를 발현하지 않으며 상기 억제제는 이러한 유형의 신생물에 대하여 비효과적인 것으로 이미 보고된 바 있다 [참조: Sheng, et al. "Inhibition of Human colon Cancer Cell Growth by Selective Inhibition of Cyclooxygenase-2," J. Clin. Invest., 99(9): 2254-9, 1997].

학자들은 최근에 발견된 사실에 따라 COX/PGE2 목표부위를 이탈하게 되었는데 그 이유는 상기 부위가 장기간에 걸쳐 신생물의 이상증식을 성공적으로 치료하는 1차 목표가 아니라는 이유때문이었다 (아마 2차 목표부위). 파무쿠 (Pamukcu) 등은 실질적으로 PGE2 및 COX 억제능력이 없는 것으로 보고된 방 있는 설포닐 화합물이 결장의 폴립세포를 포함한 각종의 종양세포의 성장을 억제한다는 사실을 뜻밖에 발견하었다 (미합중국특허 제5,401,774). 상기 설포닐 화합물은 랫트를 사용한 동물실험에서 결장발암성에 유효하다는 사실이 입증되었으며, 또한 다른 유사체 ( 이하 "엑시술린드")는 FAP 환자를 대상으로 한 임상시험에서 유효하다고 입증되었으며 보다 놀라운 사실은 이하에 설명하는 대조임상시험에서 이미 발생한 암, 즉 전립선암에 대하여 효과를 보이고 있다는 사실이다.

또한, 최근에 발표된 연구결과에서 COX I 및/또는 COX II는 모든 신생물에서 실질적으로 발현되지 않는다는 사실을 강력히 입증하여 상기 COX I 또는 COX II에 특이적인 억제제는 신생물의 이상증식을 치료함에 있어서 치료학적으로 유용하게 적용할 것이라는 희망을 사라지게 하였다 [참조: Lim et al., "Sulindac Derivatives Inhibit Growth and Induce Apoptosis in Human Prostate Cancer Cell Lines," Biochem. Pharmacology, Vol. 58, pp. 1097-1107 (1999) in press].

따라서, 신생물에서 과도하게 발현된 기타 다수의 단백질과 마찬가지로 PGE2/COX의 과도발현은 일부 신생물 이상증식의 원인이 되기 보다는 오히려 이들이 조합된 결과이다. 그러나, 상기 발견은 엑시술린드 같은 화합물 (COX 및 non-COX가 발현하는 신생물의 이상증식에 대한 활성범위)이 어떻게 작용하는가 대한 의문점을 제기시키고 있다. 상기 화합물이 종양세포에서 하는 일은 무엇인가?

피아자 등은 엑시술린드 같은 화합물이 환상-특이적 GMP 포스포디에스테라제(예를 들면, PDE5)를 억제하며 상기 효소를 사용하여 후보화합물을 검색하는 경우 기타 다른 화합물을 발견하게 되고 이는 궁극적으로 항종양효과를 나타내는 약제학적 조성물을 개발하고 제제화할 수 있다고 보고하였다[미합중국 출원번호 제 08/866,027 및 09/46,739].

상기 약제학적 조성물은 항종양효과가 극히 우수하며 환자가 부작용의 발생을 예방하는 경우 기존의 화학요법제나 COX 또는 PGE2 억제와 관련된 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 항종양효과를 가기고 있으며 cGMP에 특이적인 PDE를 억제하는 화합물은 아포프토시스 (apoptosis; 예정된 세포의 사멸이나 자살의 형태)를 유도하나 정상세포에는 해가 없는 화합물이다. 따라서, 상기 신규한 화합물은 선택적 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하는 항종양제 (selective apoptotic anti- neoplastic drugs; SAANDs)로서 새로히 정의하고 있다. 따라서, 상기 SAAND 제제는 다음과 같은 기존의 여러가지 학설에 대해서 반론을 제기하고 있다: 즉, (1) 항종양화합물은 정상세포를 죽이지 않으면 유효하지 않다; (2) COX는 신생물의 이상증식에 관여한다; 그리고 (3) 비스테로이드성 소염제에 의해 결장성 신생물을 예방하는 것은 COX의 하나 또는 두개를 억제함으로써 이루워진다.

그러나, 이하에 제시되는 새로운 연구결과에 따르면, 전형적으로 PDE5를 억제하는 모든 화합물이 종양세포에서 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하지 않는다. 예를 들면, 기존에 잘 알려진 PDE5 억제제로서 자프리나스트 및 실데나필은 단독으로 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하기 않으며 종양세포의 성장을 억제하지 않는다. 그러나, 아포프토시스성의 PDE5 억제제는 아포프토시스 (apoptosis)를 선택적으로 유도하며 (즉, 정상세포가 아닌 종양세포), COX 억제에 실질적으로 관여하지 않고 있으므로 PDE5를 항종양화합물의 검색도구로서 이용대상이 될 수 있다는 사실은 의문의 여지가 없다.

그러나, 항종양성과 아포프토시스성을 공유하면서 안전한 화합물을 개발하기 위하여 PDE5의 검색기법을 향상시키는 것이 바람직하며 이에 따라 신생물의 이상증식, 전구성 암 및 이미 발생한 암을 치료함에 있어서 유용한 용도로 새로운 약제학적 조성물을 제제화 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 일부 PDE5 억제제는 단독으로 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하나 다른 화합물은 그렇지 못하다는 사실에 대하여 의문을 가지고 연구를 진행시켜 왔으며, 이에 따라 이전에 보고되지 않았던 환상 GMP에 특이적인 포스포디에스테라제 활성형태를 발견하게 되었다. 본 발명자들은 특정한 이론에 구애됨이 상기 신규한 PDE 활성은 PDE2의 신규한 형태로서 실질적으로 c-AMP 가수분해활성, 즉 cGMP에 특이적인 PDE2의 새로운 입체형태일 수 있다고 믿게 되었다. 전형적인 PDE2는 cGMP에 특이적이 아니며 (또한 PDE2는 cAMP를 가수분해함), 종양세포에서 발견되고 있다. 상기 신규한 PDE 및 PDE2는 바람직한 항종양효과를 가진 약제학적 조성물을 검색하는데 유용하다. 기본적으로 종양세포에서 PDE5 및 PDE2활성 (신규하거나 기존의 입체형태)이 항종양효과를 가진 PDE5 억제화합물에 의해 억제되면 아포프토시스 (apoptosis)가 나타나게 된다.

광범위한 측면에서 상기 신규한 PDE 입체형태는 다음과 같은 특성을 지니고 있다.

가) cAMP에 대하여 cGMP 특이성을 나타내며,

나) cGMP 기질의 존재하에서 양성의 협동성 동력학적 양태를 나타내며;

다) cGMP에 대하여 초미세질량의 친화성을 나타내며;

라) 정제된 cGMP에 의존하는 단백 키나제와 함께 접종시에 비감수성을 나타내며

상기 신규한 PDE의 다른 특징은 다음과 같다.

- 자프리나스 및 E4021가 가지고 있는 억제능에 대한 감수성을 감소시킨다.

- 음이온교환 크로마토그라피에 의해 전형적인 PDE 활성을 분리할 수 있다.

- 칼슘 및 칼모두린에 의해 비활성화된다.

- 로리프람, 빈포세틴 및 인도리단 같은 약물에 비감수성을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예는 하나의 화합물이 cGMP-의존성 단백키나제 G (PKG) 활성을 증가시키고 종양세포의 베타-카테닌의 감소를 평가하는데 있다. SAAND의 예기치 않은 특성으로서 PKG 활성의 상승과 SAAND에 노출시에 베타-카테닌을 감소시키다는 사실이 밝혀지게 되었다. 본 발명자들은 PKG 활성의 상승은 상기에서 설명한 바와 같이 적절한 PDE류를 SAAND가 억제함으로써 적어도 부분적으로 PKG 활성이 상승된다는 사실을 믿게 되었다.

SAAND의 다른 특성은 다음과 같다

(1) 상기 특허에서 보고한 PDE5의 억제;

(2) 신규한 cGMP에 특이적인 PDE 입체형태의 억제;

(3) PDE2의 억제;

(4) 종양세포에서 세포내 cGMP의 상승;

(5) 일부 종양세포에서 cAMP 농도의 감소.

따라서, 본 발명에 따른 신규한 방법의 한가지 구현예는 어떤 화합물이 종양세포에서 PKG 활성을 증가시키고 PDE5를 억제하는 사실을 평가하는데 있다.

본 발명에 따른 신규한 검색방법의 또다른 구현예는 어떤 화합물이 종양세포에서 PKG 활성을 증가시키고 상기에서 언급한 신규한 cGMP에 특정한 PDE 및/또는 PDE2를 억제하는 사실을 평가하는데 있다. 또한 세번째의 구현예는 어떤 화합물이 종양세포에서 PKG 활성을 증가시키며, cGMP의 농도상승과 cAMP 농도의 저하를 가져오는 가를 평가하는데 있다. 이렇게 성공적으로 평가된 화합물은 SAAND로서 적용하게 된다.

무엇보다도, 본 발명은 신생물의 이상증식이나 특히 전구성 암병소부위를 안전하게 치료하는 화합물을 선택함에 있어 신규한 생체내 및 실험실내 시험방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신생물의 이상증식을 치료하는데 사용할 수 있는 화합물을 선택하는 방법에 관한 것이다. 동정된 화합물은 기존의 화학요법제를 사용함으로써 COX 억제 및 기타 비특이적 상호작용에 기인된 부작용을 최소한으로 억제할 수 있다. 관심대상이 되는 화합물은 신규한 PDE를 대상화합물에 노출시켜 시험할 수 있으며, 특정화합물이 신규한 PDE를 억제하는 경우 이에 대한 항종양효과를 조사하기 위해 구체적인 실험을 계속하게 된다 (예를 들면, 생체내 또는 실험실내 동물실험 및 임상시험의 설계 또는 그 실시).

따라서, 본 발명은 신생물의 이상증식을 치료하는데 유효한 화학물을 동정하기 위한 검색 및 선택방법과 상기 신규한 PDE 및/또는 PDE2와 COX에 대한 화합물의 억제를 확인하는데 그 목적이 있다. 본 발명의 검색 및 선택방법은 생체내 또는 실험실내 종양세포의 성장을 저해하는 화합물을 발견하는 것이 바람직하다.

상기와 같이 화합물을 선택함으로써 신생물의 이상증식을 치료하는 화합물을 개발하여 이전보다 잠재적으로 유익하고 개선된 화합물을 보다 신속하게 정확하게 동정할 수 있다. 구제적인 이점은 이하 발명의 상세한 설명에서 분명해 진다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 화합물을 함유하는 약제학적 조성물과 이를 사용한 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

도 1은 DEAE-트리스아크릴 M 칼럼을 사용하여 용출 분석한 것으로서, SW480 종양세포(neoplastic cell)로부터 얻어진 cGMP 포스포디에스터라제의 cGMP 활성을 나타낸 그래프이다.

도 2는 DEAE-트리스아크릴 M 칼럼을 사용하여 용출 분석한 것으로서, SW480 종양세포로부터 얻어진 재부하된(reloaded) cGMP 포스포디에스터라제의 cGMP 활성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 신규 PDE의 동력학적 양태를 나타낸 그래프이다.

도 4는 정제된 싸이클로옥시게나제 활성에 대한 설린닥 설파이드 유도체와 설린닥 설폰 유도체(엑시술린드, exisulind)의 효과를 설명한 것이다.

도 5는 COX 억제에 대한 시험 화합물 B와 E의 효과를 설명한 것이다.

도 6은 배양된 암세포로부터 정제된 PDE4 및 PDE5에 대한 설린닥 설파이드와 엑시술린드의 억제 효과를 설명한 것이다.

도 7은 HT-29 세포내 싸이클릭 뉴클레오타이드 수준에 따른 설린닥 설파이드의 효과를 설명한 것이다.

도 8은 화합물 B의 포스포디에스터라제 억제 활성을 설명한 것이다.

도 9는 화합물 E의 포스포디에스터라제 억제 활성을 설명한 것이다.

도 10은 HT-29 세포의 아포프토시스 및 네크로시스에 대한 설린닥 설파이드와 엑시술린드의 효과를 설명한 것이다.

도 11은 DNA 단편에 의해 측정한 것으로서, HT-29 세포 성장 억제와 아포프토시스 유도에 대한 설린닥 설파이드와 엑시술린드의 효과를 설명한 것이다.

도 12는 화합물 E의 아포프토시스 유도 특성을 설명한 것이다.

도 13은 화합물 B의 아포프토시스 유도 특성을 설명한 것이다.

도 14는 암세포 성장에 대한 설린닥 설파이드와 엑시술린드의 효과를 설명한 것이다.

도 15는 설린닥 설파이드와 대조군(DMSO)에 대한 성장 억제 활성과 아포프토시스 유도 활성을 설명한 것이다.

도 16은 화합물 E의 성장 억제 활성을 설명한 것이다.

도 17은 설린닥 대사체에 의한 마우스 포유 선(gland) 기관 배양에서의 전-악성종양(pre-melignant), 종양손상의 억제에 대한 설명이다.

도 18A는 cGMP가 첨가되지 않고 약물이 처리된 SW480 세포용해물의 SDS 단백질 겔을 나타내는 것이며, 이때 세포는 DMSO(0.03%; 레인 1 및 2), 엑시술린드(200, 400 및 600 μM; 레인 3, 4, 5), 및 E4021(0.1, 1 및 10 μM; 레인 6, 7, 8)를 처리하여 48 시간동안 배양한 것이다.

도 18B는 cGMP 및 약물이 처리된 SW480 세포용해물의 SDS(X-선 필름 노출) 겔 PKG 분석한 것이며, 이때 세포는 DMSO(0.03%; 레인 1 및 2), 엑시술린드(200, 400 및 600 μM; 레인 3, 4, 5), 및 E4021(0.1, 1 및 10 μM; 레인 6, 7, 8)를 처리하여 48 시간동안 배양한 것이다.

도 19는 대조군에 비교하여 종양세포내 β-카테닌 및 PKG 수준에 따른 엑시술린드의 영향을 웨스턴 브롯실험(Western blot experiment)한 결과를 보여주는 막대 그래프이다.

도 20은 DEAE-트리스아크릴 M 칼럼을 사용하여 용출 분석한 것으로서, HTB- 26 종양세포로부터 얻어진 cGMP 포스포디에스터라제의 cGMP 활성을 나타낸 그래프이다.

도 21은 기질의 농도에 따라 DEAE-트리스아크릴 M 칼럼을 사용하여 용출 분석한 것으로서, HTB-26 종양세포로부터 얻어진 cGMP 포스포디에스터라제의 cGMP 활성을 나타낸 그래프이다.

도 22는 DEAE-트리스아크릴 M 칼럼을 사용하여 용출 분석한 것으로서, LnCAP 종양세포로부터 얻어진 cGMP 포스포디에스터라제의 cGMP 활성을 나타낸 그래프이다.

도 23은 기질의 농도에 따라 DEAE-트리스아크릴 M 칼럼을 사용하여 용출 분석한 것으로서, LnCAP 종양세포로부터 얻어진 cGMP 포스포디에스터라제의 cGMP 활성을 나타낸 그래프이다.

도 24는 싸이클릭 뉴클레오타이드 유도체 및 선택된 PDE5 억제제에 대한 PDE5의 비촉매성 cGMP 결합 위치의 특이적 결합을 설명하는 막대 그래프이다.

도 25는 에틸렌 글리콜 완충액으로 DEAE-트리스아크릴 M 칼럼을 사용하여 용출 분석한 것으로서, SW480 종양세포로부터 얻어진 cGMP 포스포디에스터라제의 cGMP 활성을 나타낸 그래프이다.

도 26은 DEAE-트리스아크릴 M 칼럼을 사용하여 용출 분석한 것으로서, 롤러병(roller bottles)내에서 성장한 SW480 종양세포로부터 얻어진 cGMP 포스포디에스터라제의 cGMP 활성을 나타낸 그래프이다.

도 27A는 50 μM의 화합물 I로 처리한 LNCaP 세포 배지 내에서의 시간에 따른 히스톤 관련 단편 DNA의 양의 증가를 보여준다.

도 27B는 DNA 단편에 영향을 미치지 않는 화합물 I(50 μM)을 4 일동안 처리한 PrEC 전립샘 세포의 처리과정을 보여준다.

I . 신규 cGMP 특이성 포스포다이에스테라제 및 종양세포 PDE2

A. 신규 PDE 입체형태의 분리

분리된 cGMP에 특이적 포스포다이에스테라제(이것은 신규 PDE2 형태로 나타난다)는 최초 미국 메릴랜드주의 Rockville에 있는 American Tissue Type Collection에서 통상적으로 SW480으로 언급되는 인간 암종세포에서 제조되었다. SW480은 적절히 구별되는 상피선종암에서 유래된 인간 직장암세포이다. 아하에 설명한 바와 같이, 하나의 유사한 형태는 유방(즉 HTB-26 세포)와 전립선( LNCAP 세포)의 신생물에서 분리되었다.

여기에서 "분리되었다" (기존 발명으로부터 이해가 가능함)는 용어는 종양세포에서 분리될 뿐만 아니라 재조합방법에 의해 분리된다.(즉, 박테리아나 기타 비인간세포 숙주벡터의 세포주) 그러나, 인체 종양세포로부터 분리하면 이렇게 분리된 대상 단백이 가능한한 종양세포에서의 천연형태중 하나와 유사한 구조(즉 형태 또는 해부학)를 가지기 때문에 더 바람직하다. 이 형태는 실험실내 대상효소를 억제할 항종양성화합물울 선택하는데 용이하다.

신규한 PDE 활성은 SW480 직장암세포주에서 처음 발견되었다. SW480으로부터 신규한 포스포다이에스테라제를 분리하기 위하여 약 4백만개의 SW480 세포를 배양시키고 10mL의 냉각된 인산완충액으로 2번 세척한 후, 원심분리기로 펠렛화하여 150㎠ 조직배양접시에서 스크랩하였다.

상기 세포를 균일화 완충용액(20mL TMPI-EDTA-Triton, pH 7.4: 20mM Tris- HOAc, 5mM MgAc₂, 0.1mM EDTA, 0.8% Triton-100, 10μM 벤자미딘, 10μM TLCK, 2000 U/mL 어프로티닌, 2μM 펩스타틴 A)에서 재현탁시키고 폴리트론 티슈마이저( 3회, 20초/pulse)를 사용하여 얼음조에서 균질하게 하였다. 균질화된 물질은 Beckman L8 초원심분리기를 사용하여 4℃의 온도에서 60분동안 105,000g에 원심분리시킨후에 상청액은 TMPI-EDTA(60mL)로 희석하고 TMPI-EDTA 완충액으로 미리 평형화시킨 10- mL DEAE-Trisacryl M 컬럼에 적용시컸다. 사용된 컬럼을 60mL TM-EDTA로 세척하고 PDE 활성을 0.95mL/minute의 유속과 1.4mL/fraction으로 120mL TM-EDTA에서 NaOAC(0-0.5M)의 직선 기울기를 가지고 용출시켰다. 8개의 분회물을 회수하여 cGMP 가수분해(즉 수분동안에)를 시키기 위하여 즉각 정량한다. 제 1도는 각각 40-50mM와 70-80mM NaOAC로 용출된 피크 A와 피크 B, 두개의 처음 cGMP PDE 활성의 피크를 나타내는 컬럼의 용출양태를 보여주고 있다.

하기에 설명한 바와 같이, 분획물의 환상 뉴클레오티드 PDE 활성을 Thompson 등[Thompson W.J., et al., Adv. Cyclic Nucleotide Res. 10: 69-92, 1979]의 수정된 두단계 방사선 동이원소 방법을 사용하여 측정하였다. 반응의 경우 항상 적정한 기질(200,000 cpm)을 함께 Tris-HCl (40mM; pH 8.0), MgCl₂(5mM), 2- mercaptoethanol (4mM), 소혈청알부민 (30μg), cGMP (0.25 μM-5μM)을 함유한 400 ㎕에서 실시한다. 접종시간을 조정하여 15% 미만의 가수분해가 되도록 하였다. 상기 혼합물을 30℃에서 접종하고 45초동안 비등시킨 후에 반응을 중단시켰다. 이어서 혼합액을 냉각시키고 뱀독 (50㎍)을 첨가한 후 30℃의 온도에서 10분동안 접종시켰다. MeOH(1 mL)를 첨가하여 반응을 중단시킨 후에 혼합액은 음이온교환컬럼(Dowex 1-X8, 0.25mL 레진)에 이동시켰다. 용출액은 MeOH 2mL와 혼합하여 수지에 적용시켰으며, 6mL 섬광액을 첨가한 후 트리튬 활성을 1분동안 Beckman LS 6500을 이용하여 측정하였다.

또한, 피크 A 와 피크 B의 cGMP 가수분해 활성을 분획화하기 위해 오리지날 80의 15∼30 분획물을 DEAE-Trisacry M 칼럼으로 재충진시켰으며, TM-EDTA에서 NaOAC (0-0.5M)의 선상 기울기를 가지고 용출된다. 상기 분획물을 다시 즉시 cGMP가수분해(위에 0.2, 2, 5μM의 기질를 가지고 설명한 절차에 의함)을 평가하고 그 결과를 그래픽으로 제 2도에 나타내었다. 상기 제 2도에 나타낸 피크 B 부근의 경우 피크 A와 대조상태에 있는 경우 cGMP의 기질 농도가 증가함으로써 활성이 극적으로 향상되었다. 상기 결과는 PDE2의 결과와 일치하고 있으나 제 2도에서 특징화된 효소가 cGMP-특이적인 (하기 참조) 사실을 미루어 볼 때 문헌에 보고된 전형적인 PDE2에 비교될 수 있는 새로운 형태라는 사실을 암시하고 있다. 피크 A 활성은 친화성이 높은 촉매 부위에 자명한 기질 포화상태를 나타내고 있다.

B. 전형적인 SW480으로부터의 PDE2의 분리

피크 B을 SW480으로부터 분리시킬 수 있는 두가지 방법을 개발함으로써 상기 효소가 전형적인 PDE2 활성(즉 cGMP-비특이적이만 cGMP을 자극한다)을 가지고 있음을 알게 되었다. 첫 번째 방법은 150 ㎠ 조직 배양 플라스크 대신에 850㎠ 코닝 룰러 병에 SW480을 배양시키는 것이다. SW480은 각각 200mL RPMI 1640, 2mM glutamine과 25mM HEPES을 함유한 병에서 0.5rpm의 속도로 배양되게 된다. 세포를 하기 절차에 따라 회수하였다. PBS 배지는 최소 15분동안 37℃까지 가열하였다. 5% FBS/RPMI 1640 (200mL) 배지를 조제하고 글루타민 5mL를 첨가시킨다. 또한 항생제와 항진균제를 함께 5mL 첨가했다.

PBS용액 70mL를 4X Pancreatin 10mL에 첨가하였다. 상기 혼합액의 온도를 실온으로 유지시켰다. 배지를 제거하고 플라스크의 바닥이 보호되도록 4mL의 인산완충액으로 세척하였다. 모든 용액을 피펫으로 제거하였다. 4mL의 희석된 판크레틴을 플라스크에 첨가하고 플라스크는 바닥을 보호할 수 있도록 조치한다. 플라스크를 37℃에서 8-10분간 배양시켰다. 배양한 후 플라스크는 역현미경으로 체크하여 신속히 모든 세포가 성장 되었는지 확인하였다. 플라스크의 면을 수회에 걸쳐 주의깊게 충격을 주어 세포가 분리되도록 하였다. 냉각시킨 배지 10mL를 플라스크에 첨가하여 판크레틴 단백분해를 중단시켰다. 상기 용액을 밑바닥에서 진탕하여 세포을 회수하였다. 배지는 25mL 피펫을 사용하여 제거하고 세포를 얼음이 들어있는 50mL 원심분리기 튜브에 놓는다. 상기 튜브를 1000rpm의 속도로 임상원심분리기에서 4℃의 온도하에 5분동안 회전시키고 세포를 펫릿화시켰다. 상청액을 제거하고 각 펫릿을 15초동안 액화질소에서 동결시켰다. 회수된 세포를 -70℃에서 저장한다.

회수된 SW480 세포로부터 PDE는 EPLC 방법을 사용하여 분리시켰다. AKTA EPLC(파마시아사)를 사용하여 18mL DEAE TrisAcryl M 컬럼상에서 샘플충진과 용출속도를 조절하였다. SW480에 함유된 약 600만개의 세포는 실험을 위해 사용하였다. 세포를 균질화 완충용액(20mL TMPI-EDTA-Triton pH 7.4: 20mM Tris-HOAc, 5mM MgAc₂, 0.1mM EDTA, 0.8% Triton-100, 10μM 벤자미딘, 10μM TLCK, 2000U/mL 어프로티닌, 2μM 류펩틴, 2μM 펩스타틴 A)으로 재현탁시킨 후 샘플을 수작업으로 균질화시켰다. EPLC 완충용액 A는 8mM TRIS-아세테이트, 5mM Mg 아세테이트, 0.1mM EDTA (pH 7.5)로 구성되었으며 완충용액 B는 8mM TRIS-아세테이트, 5mM Mg 아세테이트, 0.1mM EDTA (pH 7.5)로 구성되었다. 상청액은 분당 1mL의 속도로 컬럼에 충진시키고 분당 1mL로 하여 60mL 완충용액 A로 세척하였다. 함량은 60mL에서 0-15% 완충용액 B, 60mL에서 15-60% 완충용액 B, 16mL에서 50-100% 완충용액 B로 설정하였다. 기울기에 따라 1.5mL 분획물이 회수되었다.

얻어진 실험결과는 상기에서 이미 제시한 신규 PDE 활성(예컨대 제 1도)에 대한 실험결과와 유사하다(제 26도). 그러나 이와 같이 분리된 피크 B 5μM cGMP에서 2-3배로 활성화 될 수 있는 0.25μM 기질농도에서 cAMP 가수분해 활성을 나타내는 것은 제외하였다.

SW480에서 전형적인 PDE2을 분류하기 위해 사용된 두 번째 방법은 상기에서 공급한 non-PFLC DEAE 컬럼 방법을 사용하여 실시하였으나, 상기 방법의 경우 30% 에틸렌 글리콜, 10mM TLCK와 3.6mM β-mercaptoethanol을 함유한 완충용액(Section IA 참조)으로 수정하여 실시하였다. 상기 시약을 완충용액에 첨가하므로써 피크 A는 40에서 150mM으로 피크 B는 75에서 280mM으로 그리고 피크 C는 200에서 500mM Na 아세테이트 (제 25도 참조)가 되도록 용출속도(제 25도 참조)를 낮은 농도에서 고농도의 나트륨아세테이트까지 이동시켰다. 제 25도에서 나타낸 피크 B는 2μM cAMP 기질을 가지고 평가할 수 있으며 5μM cGMP(제 Y도 참조)에 의해 두배의 활성도가 나타났다. 상기 피크 B에서 1.6μM의 IC₅₀에서 선택적인 PDE2 억제제인 EHNA 는 2μM cGMP PDE 활성을 억제하였으며 또한 3.8μM의 IC₅₀(그리고 10μM rolipram을 첨가한 2.5μM의 IC₅₀)에서 피크 B에서 2.0μM cAMP PDE 활성을 억제한다.

C. PDE 피크 A의 cGMP-특이성 및 신규 피크 B 활성

Secton IA에서 DEAE 컬럼에서 나온 각 분획물은 또한 Ca⁺⁺의 유무에 관계없이 또는 Ca^++-CaM 및/또는 EGTA에서 cGMP 가수분해 활성(0.25μM cGMP)을 평가하고 그리고 5μM cGMP 유무에 관계없이 cAMP (0.25μM cAMP)에 대해 평가하였다. PDE 피크 A 와 피크 B (분획물 5-22; 제 1도 참조)는 현저하게 cAMP를 가수분해하지 않거나 PDE의 전형적인 cAMP 가수분해 계열의 활성을 갖고 있지 못하다. (즉 PDE 1, 2, 3)

Ca⁺⁺(calmodulin이 유무에 관계없이) 피크 A 와 피크 B의 cAMP 나 cGMP 가수분해 활성을 비활성화 시키고 cGMP는 cAMP 가수분해을 활성화시키거나 억제하지 못한다. 피크 A와 B는 cGMP-특이적 PDE 활성을 해당한는 것을 나타내고 있으나 전형적인 또는 이미 알려진 PDE1, PDE2, PDE3 또는 PDE 4 활성과는 다르다.

이하 설명한 바와 같이 신규 PDE 피크 B의 경우 환상 GMP는 상기 효소의 cGMP 가수분해 활성을 자극하거나 어떠한 cAMP 가수분해 활성(상기 Section IB부터 피크 B의 경우와 대조로)을 자극하지 않는다. 이것은 신규 PDE 피크 B -- 본 발명의 신규 포스포다이에스테라제 -- 는 cGMP-자극적 cAMP 가수분해("cGS")가 아니거나 전형적인 또는 이미 알려진 PDE2 계열 활성도 아니다. 왜냐하면 cGMP와 cAMP 둘다 PDE2는 가수분해 하지 못한다.

D. 피크 A는 전형적인 PDE5이나 신규 피크 B(신규한 cGMP-특이적 PDE)는 비전형적이다.

어떤 PDE isoformdfm 특정화하기 위해 동력학적 양태와 기질 친화성을 평가하여야 한다. 피크 A는 전형적인 "PDE5"의 특징화을 보여주었다. 예를 들면, cGMP의 상기 효소의 Km는 1.07μM이고 Vmax는 0.16nmol/min/mg이다. 또한 아래에서 설명한 바와 같이 zaprinast(IC₅₀=1.37μM)과 E4021(IC₅₀=3nM) 그리고 sildenafil은 피크 A의 활성을 억제한다. 더욱이 zaprinast는 문헌에 보고된 결과와 일치하게 피크A의 cGMP 가수분해 활성에 대한 억제를 나타내었다.

Section IA에서 PDE 피크 B는 PDE 피크 A와 비교할 때 상당히 다른 동적인 성질을 보여준다. 예를 들면, 피크 A의 Eadie-Hofstee 플롯에서 Michaelis-Menten 동적 반응을 지시하는 환형 GMP 가수분해는 반응물질 농도가 증가함에 따라 기울기가 감소하는 선형을 보여준다. 그러나 피크 B는 cAMP가 소실됨에 따라(명백히 Km = 8.4) cGMP 가수분해에 대해 신규한 성질이 나타나게 되며 cGMP 기질이 증가(즉 제 3도 참조)에 따라 Eadie-Hotfstee 플롯의 기울기(Km ＜ 1)가 증가함을 나타났다. 이는 cGMP(즉 여기서 Km ＜ 1)에 대한 피크 B의 초미세적 유사성을 나타낸다.

cGMP 반응물질 존해하에서의 동적 연구(제 3도)와 양성적-협동화 동적 반응은 cGMP 기질의 농도가 증가함에 따라 cGMP 가수분해 활성이 증가하게 된다. 이는 cAMP 가수분해를 배제하고 미리 확인된 PDE5가 있는 새로운 효소를 배제하기 위해 두 번째의 DEAE 분리후 PDE 피크 B의 존재하에 cGMP의 0.25μM, 2μM 및 5μM 농도을 비교함으로써 발견되었다. 제 2도에서 보는 바와 같이 cGMP의 농도가 높아지면 질수록 반비례하여 PDE 피크 B와 함께 cGMP 가수분해는 점점 더 커진다.

이러한 발견은 상기 효소존재 하에 피크 B에 구속된 cGMP가 형태 변화를 일으킨는 것을 암시하고 있다. 이것은 종양세포에서 원래의 효소를 사용한 이점을 확인하지만 본 발명이 위의 특성을 갖는 효소의 원래의 형태에 제한되지는 않는다.

E. 피크 A와 관련된 PDE 피크 B의 Zaprinast 와 Sildenafil에 대한 비감수성 및 기타 PDE 억제제에 대한 효과

기타 PDE 억제제는 0.01에서 100μM까지의 약물의 12개 농도와 0.25μM³H- cGMP의 기질 농도를 사용하여 연구하였다. IC₅₀값은 프리즘 2.01(그래프패드)에 사용한 S자 모양의 다양한 기울기로 계산된다. 그 결과는 표1과 같다. 화합물 E4021과 zaprinast는 피크 A를 억제하는 반면, (고도의 친화성) 피크 B(Section IA)에서 신규 PDE 활성을 반해서 계산된 IC₅₀값은 상당히 증가된다( ＞ 50 배). 이것은 피크 A가 PDE5로 이행되는 것을 확인해 주고있다. 이 데이터는 본 발명의 신규 PDE 활성이 모든 실질적인 목적상 zaprinast 및 E4021에 비감수성을 나타낸다.

[ 표 1 ]

피크 Q 및 부분 IA 피크 B(cGMP 가수분해)와 대조되는 PDE 억제제의 비교

이와 대조적으로 설린닥 설파이드와 화합물 E는 경쟁적으로 피크 A와 B 포스포다이에스테라제를 같은 역가( PDE 피크 A는 IC₅₀=0.38, PDE 피크 B는 0.37μM)에 의해 억제시킨다다. 상기 종양치료와 피크 B (또는 이것의 형태)는 zaprinast에 비감수성을 나타내는 반면 피크 A와 B는 설린닥 설파이드와 화합물 E에 둘다 감수성을 나타내는 사실에서 이러한 치료에 유용한 화합물의 선택은 중요하다. zaprinast, E4021 및 sildenafil이 apoptosis를 유도하고 종양세포의 성장을 억제하는 지를 확인하기 위해 이들을 실험하였고 화합물 E에 대해서도 같은 실험을 하였다. 하기에서 설명한 바와 같이 zaprinast는 단독으로 상당한 apoptosis을 유도하거나 성장-억제 성질을 갖지 못하며 그 반면에 설린닥 설파이드와 화합물 E는 정확히 그 대조적이다. 즉 PDE 피크 A와 B는 모두 억제하는 화합물의 능력은 종양세포에서 apoptosis를 유도하는 능력과 상호관계를 나타내지만 화합물(즉 zaprinast)이 PDE 피크 A에 대해서만 특이성을 갖고 있다면 그 화합물은 단독으로 apoptosis을 유도하지 못할 것이다.

F. cGMP-의존성 단백질 키나제 G와 배양시 신규한 PDE 피크 B의 비감수성

PDE 피크 A와 신규 피크 B(Section IA)사이의 다른 점은 cGMP-의존성 단백질 키나제 G (이것은 전형적인 PDE5를 인산화한다)의 다양한 농도하에 각각의 cGMP-가수분해 활성으로 관찰된다. 특히 Section IA로부터 피크 A와 피크 B는 30분동안 30℃에서 단백질 키나제 G의 다른 농도에서 배양된다. 두 피크의 환형 GMP 가수분해는 인산화가 시도된 후 측정한다. PDE5에 관한 이미 발간된 정보와도 일치하게 피크 A는 피크 A가 인산화됨을 나타내면서 단백질 키나제 G의 반응에 cGMP 가수분해활성을 증가시킴을 보여준다. 이러한 데이터는 신규 cGMP-특이적 PDE 활성인 Section IA로부터 이미 알려진 PDE5 계열과 피크 B와 일치하는 isoform인 피크 A와 일치한다.

G. 전립선과 유방암 세포에서 신규 피크 B

신규 피크 B는 또한 SW480으로부터 이것을 분리시키는데 위에서 사용한 것과 유사한 방법으로 두가지 다른 종야세포, 유방암 세포, HTB-26 및 전립선 암세포, LnCAP로부터 분리된다. 이 임상시험계약서는 여러 가지 관점에서 수정된다. 다른 세포의 비교하기 위해 더 큰 재생성을 제공하기 위해 AKTA FPLC(파마시아사)는 샘플 충전과 18mL DEAE TrisAcryl M 칼럼으로 용출을 조절하는데 사용되었다. SW480은 피크 B의 참고물을 제공하기 위해 같은 절차를 여러 번 행하였다. SW480의 200- 400 million 세포는 이 실험을 위해 사용된다. LnCAP의 70 million 세포는 실험(제 22도와 23도를 참조)을 위해 사용되고 분리된 실험에서 HTB-26의 32 million 세포는 실험(제 20도와 21도를 참조)를 위해 사용된다. 균질한 완충용액에서 세포들을 재현탁시킨 후, 샘플들을 수작업으로 균질하게 만든다. FPLC 완충용액 A는 8mM TRIS-아세테이트, 5mM Mg 아세테이트, 0.1mM EDTA (pH7.5)이고 완충용액 B는 8mM TRIS-아세테이트, 5mM Mg 아세테이트, 0.1mM EDTA, 1M Na 아세테이트 (pH 7.5)이다.

상청액은 분당 1mL의 속도로 칼럼으로 옮겨지고 그 다음에 분당 1mL의 속도로 60mL 완충용액으로 세척한다. 함량은 60mL에서 0-15% 완충용액 B, 60mL에서 15- 50% 완충용액 B, 16mL에서 50-100% 완충용액 B로 용출된다. 기울기 1.5mL 부분에서 회수한다. cGMP PDE 활성 피크는 400mM Na 아세테이트(제 20-23도 참조)인 분획물 65근처에서 용출한다. 본 활성은 0.25μM cGMP (cGMP와 초미세한 친화성을 나타내는)에서 측정한다.

PDE4-특이적 약물인 Rolipram은 피크 B의 cGMP 활성이 cAMP 위로 cGMP에 대해 특이적인 것을 나타내면서 cAMP PDE 활성의 대부분을 억제한다. 세 개의 모든 피크 B들(SW480, HTB-26 및 LcCAP)은 칼슘/칼모듀린에 자극적이지 않으며 zaprinast (제 20도와 22도를 참조)같이 특이적 PDE5-특이적 억제제인 100nM E4021에 저항적이다. 피크 B는 또한 반응물질이 0.25μM에서 5μM cGMP로 증가할 때 활성이 극적으로 증가함을 보여준다. 또한, 이 세 피크들은 아래의 엑시술린드와 화합물 I에 유사함을 보여준다.

Ⅱ. 단백질 키나제 G와 β-카테닌 포함 -- 일반사항

이 실험시리즈는 엑시술린드와 같은 반종양 cGMP-특이적 PDE 억제제가 adenomatous 폴리포니스 콜리 유전자 ("APC 유전자") 질환이나 β-카테닌에 유전자코딩에 질환을 포함한 종양세포에서 cGMP-의존적 단백질 키나제 G ("PKG")에 어떤 영향을 끼치는 지를 확인하기 위해 실행한다. 하기에 설명한 바와 같이 그러한 억제제는 이러한 종양세포에서 PKG 활성을 상승시킨다. 활성에서 증가는 질환을 포함한 세포에서 PKG의 활성을 증가시킬 뿐만 아니라 APC 질환을 포함한 세포에서 PKG의 표현을 증가시킨다. 덧붙여 질환이 있는 종양세포로부터 PKG가 면역침전이 될 때 β-카테닌과 함께 침전된다.

β-카테닌은 연구자들이 APC 종양-억제 유전자에서 돌연변이를 포함한 종양이 있는 모체에서 높은 농도로 발견하여 왔기 때문에 다양한 다른 암에서 관련되어 왔다. 출생시 이러한 유전자에 돌연변이가 있는 사람들은 콜론의 선상에 작은 수천의 종양을 종종 발전시킨다. 그것이 적당히 작용을 할 때 APC 유전자는 β-카테닌과 관련되었거나 규제한다고 믿어오던 보통의 APC 단백질을 코드한다. 그래서 APC유전자 질환이나 β-카테닌 결핍을 포함한 종양세포에서 PKG는 β-카테닌과 연결되었다는 사실은 암으로 유도하는 주요한 세포 경로인 PKG를 강하게 암시한다. 또한 cGMP-특이적 억제와 PKG사이의 관계 때문에 SAANDs와 함께 치료에 대한 상승효과는 cGMP를 그러한 세포에서 PKG/β-카테닌/APC를 링크시킨다.

이러한 나중 링크는 APC 질환을 포함한 종양세포 또는 β-카테닌 질환이 SAAND에 노출될 때 β-카테닌 자체가 줄어든다는 관찰에서 더욱 지지된다. β-카테닌에서 이러한 감소는 자체 PKG에 의해 시작된다. PKG는 본 발명과 연관된 또 다른 신규 발견인 β-카테닌을 인산화한다. β-카테닌 인산화는 β-카테닌이 ubiquitin- proteasomal 시스템에 의해 약하되게 한다.

이러한 PKG에 의한 β-카테닌 인산화는 APC와 β-카테닌 돌연변이의 효과를 우회시키기 때문에 종양세포에서 중요하다. 돌연변이된 APC 단백질은 연결에서의 변화가 지금까지 G나-3b 키나제에 의한 β-카테닌의 인산화를 방해한다고 생각되는 돌연변이 APC 단백질에 연결된 β-카테닌의 연결에 영향을 끼친다. 돌연변이 β-카테닌의 경우에는 PKG 활성의 상승은 또한 돌연변이 β-카테닌가 인산화될 수 있도록한다. cGMP-PDE 억제와 함께 종양에서 PKG 활성을 상승시킴으로써 돌연변이 타입을 포함하는 종양세포에서 β-카테닌 인산화(감소로 유도하는)를 하게한다.

요약하면 상기 발견은 SAAND 후보 화합물을 확인하는 새로운 약학적 검색방법으로 유도할 뿐만 아니라 종양에 대한 치료적 접근방법에서 cGMP-특이적 PDE 억제의 역할을 더욱 공고히 한다. 상기 발견은 위에서 설명한 바와 같이 APC 질환의 유무에 관계없이 둘다 치료될 수 있기 때문에 SAANDs가 억제할 수 있는 예기치 않는 종양의 광범위한 치료효과를 설명할 수 있다.

III. PDE를 이용한 제약조성물의 검색

가) 일반사항

본 발명의 신규한 PDE와 PDE2는 PDE5의 존재유무에 관계없이 신생물의 예방과 치료에 유용한 화합물을 동정할 수 있으며 또한 중증의 부작용이 발생하지 않는다.

암과 전구성 암은 세포성장을 규제할 수 없는 질병으로 알려지고 있다. 세포성장은 수많은 요인에 따라 좌우된다. 한가지 요인은 세포들이 얼마나 빠르게 증식하고 사멸하는데 있다. 세포들은 자체내 괴사 또는 외부환경의 자극인자에 따른 아포프토시스에 따라 사멸된다. 세포분화는 종양의 성장동력학에 영향을 끼치는 또다른 인자이다. 한개의 화합물에 의하여 세포성장에 끼치는 여러가지 측면이야말로 약제학적 치료에 따른 관련 대상물을 발견하는 중요한 요소이다. 상기 기법에 따른 검색법은 세포의 성장을 억제하거나 세포의 괴사에 기여하는 다른 화합물을 선택하는 기타 시험법과 함께 사용할 수 있다.

본 발명은 여러가지 중요한 발견의 산물이다. 첫번째로 본 발명자들은 종양세포의 바람직한 성장억제제는 아포프토시스에 의해 암세포의 조기사멸을 유도하는 것이 중요하다는 사실을 발견하였다 [참조: Piazza, G.A., et al., Cancer Research, 55(14), 3110-16, 1995]. 두번째로 본 발명자들은 우연히 발견한 수개의 화합물은 현저하게 COX를 억제하지 않고 아포프토시스를 선택적으로 유도하여 PDE5도 억제한다는 사실을 발견하였다. 특히, 종래의 주요한 실험결과와 상이하게 신생물 발생부위를 치료하는 바람직한 화합물은 PDE5를 억제한다는 사실이다 (EC 3.1.4.17). PDE5는 포스포디에스테라제에 있어 적어도 10개의 유전자군의 하나이다. 본 발명의 PDE5와 신규한 PDE는 이들이 선택적으로 cAMP가 아닌 환상의 GMP를 분해하는 것이 독특하며, 그 반면에 다른 PDE군은 cGMP가 아닌 cAMP를 선택적으로 분해하거나 가수분해시키는 한편 cGMP와 cAMP 양자를 비선택적으로 분해한다. 신생물 치료에 사용되는 바람직한 화합물은 비선택적이거나 cAMP를 분해하는 포스포디에스테라제 형태를 실질적으로 억제하는 않는 것이 바람직하다.

나) COX 검색

본 발명의 바람직한 한가지 구현예는 특정화합물의 사이클로옥시게나제 억제능을 측정하고 상기 화합물의 cGMP 특이성 PDE 억제능을 측정하는데 있다. 본 시험화합물을 신생물의 발생부위를 치료하는데 유용한 기지의 화합물과 비교함으로써 직·간접적으로 본 시험화합물의 신생물 억제능을 평가하게 된다. 위장장애를 일으키지 않고 신생물의 발생부위를 치료하는데 유효하다고 알려진 표준약물의 예로서 5-fluoro-2-methyl-1-(p-methylsulfonylbenzylidene)-3-indenylacetic acid (exisulind)를 들 수 있다. 또한, 비교대상으로서 기타 유용한 약물은 인도메타신이나 술린닥의 설파이드 대사물 (5-fluoro-2-methyl-1-(p- methylsulfinylbenzylidene)-3-indenylacetic acid (술린닥 설파이드)등으로서 COX를 억제한다고 알려져 있다. 그 밖에 기타 유용한 약물로서는 1-3-(3- chloroanilino)-4-phenylphthalazine (MY5445)가 cGMP 특이성 PDF류를 억제한다고 알려져 있다.

본 발명에서 "암전구성 병소"라는 용어는 형성장애 (dysplastic)나 조직의 변화를 포함하는 비정상적 신생물이 초래하는 증후군을 의미한다. 상기 증후군의 예로서 결장, 유방, 전립선이나 폐조직에 발생하는 형성장애, 또는 형성장애성보반증후군 (dysplastic nevus syndrome)이나 피부의 악성 흑색종의 전구체 등을 포함한다. 또한, 해당병소부위가 임상적으로 확인유무에 관계없이 상기 증후군외에 폴립증 증후군, 결장폴립 및 경부의 암전구성 병소 (예를 들면, 경부 형성장애), 식도, 폐 및 전립선 부위의 형성장애, 전립선내 종양, 유방 및/또는 피부나 관련 증상 (예를 들면, 광화학선작용의 각화증)을 포함한다.

본 발명에서 "암종 (carcinoma)" 또는 "암 (cancer)"라는 용어는 암을 발생시키는 병소를 의미한다. 상기 암의 구체적인 예로서 흑색종, 유방암, 전립선암 및 결장암을 포함한다. 본 발명에서 "신생물 (neoplasia)" 및 "종양(neoplasm)"은 암성 및 암전구성 병소를 의미한다.

본 발명에서 사용하는 약자는 다음과 같다.

PG; 프로스타글란딘

PS; 프로스타글란딘 합성효소

PGE2; 프로스타글란딘 E₂

PDF; 포스포디에스테라제

COX; 사이클로게나제, 환상 뉴클레오티드

RIA; 방사선면역정량법

한개의 화합물이 COX를 억제한다는 사실은 두가지 방법중 하나를 선택하여 측정함으로써 알 수 있다. 즉, 하나의 방법은 검색한 화합물을 원래의 HL-60 세포에 노출시킴으로서 PGE2를 측정하는 방법이며, 또한 다른 방법으로서는 상기 화합물이 존재하에서 정제된 사이클로게나제 (COX)의 활성도를 측정하는 것이다. 상기 두가지 방법은 기존에 문헌에서 이미 기재한 임상시험계획서를 언급하고 있으나 바람직한 임상시험계획서는 다음과 같다.

해당 화합물은 PGE₂를 측정하고 이에 따라 프로스타글란딘 E₂의 생성을 억제하는 것을 측정함으로서 이들의 활성을 평가할 수 있다. PGE₂측정용 효소면역학적 검정법 (EIA) 키트는 미국의 일리노이스주 알링톤 고지에 본거지를 두고 있는 아머샴 (Amersham)사로부터 구입할 수 있다. 바람직한 세포의 예로서 HL-60 세포과 같이 PG를 다량으로 생성하는 세포를 들 수 있다. HL-60 세포는 인간 전골수세포로서 DMSO에 의해 분화되어 성숙한 과립구가 된다 [참조: Collins, SlJ., Ruscetti, F.W., Gallagher, R.E. and Gallo, R.C., "Normal Functional Characteristics of Cultured Human Promyelocytic Leukemia Cells (HL-60) After Induction of Differentiation by Dimethylsulfoxide", J. Exp. Med., 149:969-974, 1979]. 상기 분화된 세포는 칼슘 이온운반체인 A23187에 의해 자극을 받아 PGE2를 생성한다 [참조: Kargman, S., Prasit, P. and Evans, J.F., "Translocation of HL-60 Cell 5- Lipoxygenase", J. Biol. Chem., 266: 2374-23752, 1991]. HL-60 세포는 ATCC (ATCC:CCL240)에 의해 생성될 수 있다. 상기 HL-60 세포를 20%의 소태반 혈청 (열에 의해 비활성), 50 U/ml의 페니실린 및 50 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 함유된 RPMI 배지에서 37℃의 온도와 이산화탄소 (5%)를 첨가하여 배양시켰다.

골수양 분화 (myeloid differentiation)를 유도하기 위하여 상기 세포를 9일간 1.3% DMSO에 노출시키고 이를 세척하여 3 X 10⁶cell/ml의 농도하에서 둘베코(Dulbecco)의 인산완충액에 재현탁시켰다.

분화된 상기 HL-60 세포 (3X10⁶cell/ml)를 적당한 농도에서 시험된 화합물이 함유된 배지에 37℃에서 15분간 접종시켰다. 이어서 상기 세포를 15분간 A23187 (5 X 10⁶M)으로 자극을 가하였다. 상기에 설명한 방법에 따라 외부배지로 분비된 PCE₂를 측정하였다.

상기에서 설명한 바와 같이, 한 개의 화합물의 COX 억제를 평가하는 두 번째 방법은 시험화합물이 존재하에서 COX 활성을 측정하기 위한 것이다. 이미 기존문헌에 게재되어 있는 사이클로옥시게나제는 두가지 형태 (COX-1 및 COX-2)가 존재하며, 이들은 프로스타글란딘의 합성을 규제한다고 알려져 있다. COX-2는 COX가 유도된 형태를나타내며 COX-1은 COX의 구조적 형태를 나타낸다. COX-1의 활성도는 부파티 (Boopathy) 및 발라스브라마니언 (Balasubramanian)이 기술한 "양혈소판의 사이클로옥시게나제를 정제 및 특정화방법 [참조: Biochem. J., 239:371-377]에 의거하여 숫양 의 정액소낭에서 정제한 COX-1을 사용하여 미첼 (Mitchell)등의 방법[참조: "Selectivity of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs as Inhibitors of Constitutive and Inducible Cyclooxygenase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 11693-11697]에 따라 측정할 수 있다. COX-2의 활성도는 상기 미첼 등의 방법에 따라 양의 태반에서 정제한 COX-2를 사용하여 측정할 수 있다.

특정약물의 사이클로옥시게나제는 기존의 발명에서 제시된 방법에 따라 측정할 수 있다. 예를 들면, 상기에서 언급한 부파티 (Boopathy) 및 발라스브라마니언(Balasubramanian)의 방법 (1988년)의 경우 100 ㎛의 아라키돈산 (시그마사) 및 공동인자 (pH 7.4의 조건하에서 100 mM의 Tris-HCl 내에 1.0 mM의 글루타치온,1.0 mM의 히드로키논, 0.625 ㎛의 헤모글로빈 및 1.25 mM의 CaCl2)가 함유된 배지에 프로스타글란딘 H 합성효소 1 (카이만사, Ann Arbor, Michigan)을 접종한 후 약물을 시험하였다. 접종이 끝난 후 트리클로로 초산을 사용하여 반응을 종결시켰다. thiobarbituric acid와 말로알데히드를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 효소활성을 530 nm에서 분광광도계에 의해 측정할 수 있다.

한 개의 화합물로부터 PDE5와 신규한 PDE/PDE2를 결합시켜 이들이 나타내는 높은 억제활성과 COX-1이나 COX-2에 낮은 억제활성을 나타내는 경우 이러한 화합물은 바람직하다는 사실은 분명하다.

COX를 억제하는 화합물의 양은 시험화합물의 존재유무에 관계없이 사이클로옥시게나제의 활성도와 비교하여 측정한다. 약 100 ㎛의 농도에서 잔사 (즉 약 25% 미만)가 존재하거나 COX의 억제활성이 없다는 것은 상기 화합물이 신생물의 발생부위를 치료하는 유용도를 구체적으로 평가해야 한다는 사실을 보여주고 있다.

다) 포스포디에스테라제 억제활성의 측정

본 발명에 따른 신규한 포스포디에스테라제 활성에 대한 해당 화합물의 억제효과는 상기에서 언급한 방법으로 분리된 효소, 재조합 효소나 PDE5와 함께 PDE 및/또는 PDE2를 사용하여 검색할 수 있다. 또한, 모든 세포에 대한 환상 뉴클레오티드 양은 RIA 및 미처리되거나 자프리나스트에 의해 처리된 세포를 사용하여 측정한다.

포스포디에스테라제 활성도는 기존의 알려진 방법에 따라 측정할 수 있는데, 그 예를 들면 PDF 효소의 기질로서 방사선³H 환상 GMP (cGMP) (cyclic 3'5'- guanosine monophophate)를 사용하는 방법이다 [참고: Thompson, W.J., Teraski, W.L., Epstein, P.M. Strada, S.J. Advances in Cyclic Nucleotide Research, 10:69-92, 1979]

요컨대, 상기 정의된 기질³H-cGMP 특이적 활성용액(0.2μM; 100,000 cpm; 40 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 5 mM MgCl2 및 1 mg/mL BSA)은 400 ㎕ 중의 총부피에서 시험되는 약제를 사용하여 혼합하였다. 본 발명에서 분리시킨 PDE를 사용하여 30 ℃에서 10분 동안 혼합물을 배양하였다. 75초 동안 반응 혼합물을 끓여 반응을 정지시켰다. 얼음상에서 냉각한 후에, 0.5 mg/mL 뱀독액(snake venom: 시그마로부터 구입한 O. Hannah venom) 중의 100 ㎕를 첨가하고 30 ℃에서 10분 동안 배양하였다. 상기 반응을 알콜, 즉 100% 메탄올을 첨가하여 정지시켰다. 분석 시료들을 1 mL Dowex 1-X8 컬럼을 적용하고, 100% 메탄올 1 mL로 세척하였다.

상기 컬럼으로부터 새로 발견되고 세척된 것의 방사성양을 섬광(scintillation) 카운터로 측정하였다. 포스포다이에스테라제(phosphodiesterase) 억제도는 약제-처리된 반응의 방사성양의 측정과 대조군 시료(반응 혼합물이 부족하여 시험된 약제 용매 사용을 제외한 화합물)와 대조되는 비교에 의해 결정하였다.

선택적으로, 본 발명의 포스포다이스테라제를 억제하기 위한 목적 화합물의 기능은 스크린된 화합물에 노출된 종양(neoplastic) 세포에서 cGMP의 증가에 의해 반영시켰다. PDE 활성량은 방사면역검정법(radioimmunoassay, RIA)을 이용하는 처 리된 세포들의 추출물에서 사이클릭 GMP의 함량을 분석함으로써 결정할 수 있다.

상기 과정에서, HT-29 또는 SW-480 세포들을 플레이트에 놓고 충분히 배양하였다.

상기에 나타낸 바와 같이, SW-480은 본 발명의 PDE5 및 신규 PDE 모두를 포함하고 있으며, PDE 활성이 상기 방법으로 평가되었을 때, 결합된 cGMP 가수분해 활성을 동시에 분석하였다. 시험 화합물을 약 200 μM ∼ 200 pM의 농도로 세포배양을 사용하여 배양시켰다. 약 24 ∼ 48 시간 후에, 배양 매체를 세포들로부터 제거하고, 세포들을 용해시켰다. 반응은 0.2 N HCl/50% MeOH를 사용하여 정지시켰다. 시료는 단백질 분석을 위해 제거시켰다. 사이클릭 GMP는 Dowex 컬럼과 같은 음이온교환 크로마토그래피를 사용하는 세포의 산/알콜 추출물로부터 정제하였다. cGMP를 건조시키고 트리에틸아민에서 아세트산 무수물을 사용하는 것과 같은 공지된 방법에 의해 아세틸화시켰다[다음에 참증으로서 제시된 Steiner, A.L., Parker, C.W., Kipnis, D.M., J. Biol. Chem., 247(4): 1106∼13, 1971].

유도된 사이클릭 GMP의 요오드화된 리간드(티로신 메틸 에스테르)는 항혈청 및 적당한 완충용액의 존재하에서 표준 또는 미지의 방법으로 배양시켰다. 항혈청은 사이클릭 뉴클레오티드-햅텐을 사용하는 직접적인 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 항혈청은 숙시닐-cGMP-알부민 복합물을 사용하여 주사시킨 양(sheep)으로부터 얻은 것이고, 이를 1/20,000로 희석시켰다. 표준 곡선으로부터의 용량-보간법(補間法)(dose-interpolation) 및 에러 분석은 공지된 방법을 적용하였다[다음에 참증으로서 제시된 Seibert, A.F., Thompson, W.J., Taylor, A., Willbourn, W.H., Barnard, J. and Haynes, J., Applied Physiol., 72: 389∼395, 1992].

추가적으로, 배양매체를 산성화, 냉동(-70 ℃) 시킬 수 있으며, cGMP 및 cAMP에 대하여 분석할 수 있다.

그 외에 목적 화합물에 의해 야기된 종양 세포에서의 cGMP 함량이 증가되는 것이 관찰되었고, 또한 cGMP 함량이 감소되는 것이 관찰되었다. 특정 목적 화합물( 즉, 본질적으로 정상세포는 아니지만 종양 세포에서 선택적으로 아포프토시스가 유도된 것 중의 하나)은 몇 분내에 cGMP 함량이 증가되어 결과된 초기작용의 하나로서, 시간에 따라 cGMP-특이 PDE 억제가 일관되게 진행되는 것이 관찰된다. 두 번째로, 원하는 항-종양 화합물을 사용하는 종양세포 처리는 24시간 내에 감소된 cAMP 함량에 이르게 한다. 세포내의 약제 작용의 목표는 더 연구되고 있지만, 현재까지의 자료는 목적 화합물에 노출된 종양세포에서 초기에는 cGMP 함량에서 증가되고 다음에 수반되는 cAMP 함량의 하락은 종양세포에서 아포프토시스가 우선되는 양상을 나타내고 있다.

두 개의 사이클릭 뉴클레오티드의 비율 변화는 단지 cGMP의 절대값, cGMP-특이 포스포다이스테라제 억제, 또는 cGMP 가수분해 레벨을 측정시키는 것보다는 오히려 시험 화합물의 원하는 cGMP-특이 포스포다이스테라제의 억제 활성 계산에 더 정확한 수단이 될 수 있다. 종양 세포에서 항-종양 화합물은 함께 처리되지 않으며, cGMP 함량/cAMP 함량의 비율은 0.03∼0.05 범위이다(즉, 300∼500 fmol/mg protein의 cGMP 함량은 6000∼8000 fmol/mg protein의 cAMP 함량 이상이다).

바람직한 항-종양 화합물이 노출된 후에, 초기에는 사이클릭 GMP에서 증가되고 후에는 사이클릭 AMP에서 감소되는 결과로서 그 비율이 몇 배로 증가된다(바람직하게는 적어도 약 3배로 증가된다).

특히, 목적 화합물은 약 500 fmol/mg 단백질보다는 큰 cGMP의 레벨로 처리된 종양세포의 cGMP 함량에서 초기 증가가 이루어짐을 관찰할 수 있다. 더욱이, 각 목적 화합물은 약 400 fmol/mg 단백질보다 적은 cAMP의 레벨로 처리된 종양세포들의 cAMP 함량에서 후에 감소가 일어난다.

사이클릭 AMP의 함량 결정은 상기 cGMP에 대하여 설명된 방법과 비슷한 방사면역검정법 기술을 사용하였다. 기본적으로, 사이클릭 뉴클레오티드는 음이온교환 크로마토그래피를 사용하는 세포의 산/알콜 추출물로부터 정제하고 건조하였으며, 공지된 방법에 의해 아세틸화하고 방사면역검정 방법을 이용하여 정량하였다. 유도된 사이클릭 AMP 및 사이클릭 GMP의 요오드화된 리간드는 특이 항혈청 및 적당한 완충용액의 존재하에서 표준 또는 미지의 방법으로 배양시켰다.

사이클릭 뉴클레오티드 함량의 확인은 완전한 세포에서 사이클릭 뉴클레오티드의 턴오버(turnover) 또는 축적 결정에 의해 얻을 수 있다. 완전한 세포 cAMP를 측정하기 위하여, 미리-표지된³H-아데닌을 공지된 방법으로 사용하였다[다음에 참증으로서 제시된 Whalin, M.E., Garrett Jr., R.L., Thompson, W.J., and Strada, S.J. "Correlation of cell-free brain cyclic nucleotide phosphodiesterase activities to cyclic AMP decay in intact brain slices", Sec. Mess. and Phos. Protein Reserch, 12:311∼325, 1989]. 상기 과정은 표지된 ATP에서 사이클릭 AMP로의 이상 유출을 측정하고, 특이 프로토콜에 의존하는 완전한 세포에서 아데닐 시클라제 또는 사이클릭 뉴클레오티드 포스포다이에스테라제 활성을 제거하기 위하여 사용할 수 있다. 상기 사이클릭 GMP 축적은 공지된 방법에 의해서 미리-표지된 완전한 세포를 사용하는 연구를 하기 에는 너무 낮다[다음에 참증으로서 제시된 Reynolds, P.E., S.L. Strada and W.J. Thompson, "Cyclic GMP Accumulation In Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Measured By Intact Cell Prelabeling", Life Sci., 60:909∼918, 1997].

또한, 화합물의 PDE 억제 활성 효과는 조직 표본으로부터 결정될 수 있다. 인체로부터 조직 생체검사 또는 마취된 동물로부터의 조직은 시험 화합물에 노출된 실험물질에서 수집된다. 간단히 말해서, 조직의 시료는 6% TCA의 500 ㎕에서 균질화시켰다. 균질물의 알려진 양은 단백질 분석을 위해 제거하였다. 남은 균질물은 단백질을 침전시키기 위하여 20분 동안 얼음상에 놓았다. 그 다음에, 균질물을 30분 동안 4℃에서 15,000g로 원심분리하였다. 상청액을 회수하고, 펠렛을 회수하였다. 상청액은 물의 5배 부피의 포화된 다이에틸 에테르를 사용하여 4번 세척하였다. 위층의 에테르 층을 각 세척사이에서 버렸다.

수용성 에테르 추출물을 빠른 진공으로 건조하였다. 건조된 시료는 다음에 사용하기 위해 냉동할 수 있으며, 또는 즉시 사용될 수 있다. 건조된 추출물을 500 ㎕의 분석 완충용액으로 용해시켰다. cGMP-특이 억제량은 상기 정의된 바와 같이, RIA 방법을 사용하는 사이클릭 뉴클레오티드의 양에 대하여 분석함으로써 결정할 수 있다.

억제량은 화합물의 존재 또는 부재하에서 신규 PDE(또는 PDE2)의 활성과 비교시킴으로써, 결정하였다. 신규 PDE 활성(또는 PDE2)의 억제는 네오플라시아(neoplasia) 처리를 위해 유용한 화합물인 것으로 나타난다. 엑시술린드, 바람직하게는 10 μM 또는 그 이하의 농도에서 50%보다 높은 기준보다 큰 중요 억제 활성은 상기 화합물을 항종양성을 위해 계산되어야 함을 나타낸다.

바람직하게는, 신규 PDE 억제를 위한 IC₅₀값은 사용되는 가능성(potential)을 더욱 고려하기 위하여 화합물에 대한 50 μM보다는 적어야 한다.

D. 화합물의 암세포 증식 감소 여부 결정

선택적인 실시예로서, 본 발명의 방법은 화합물의 암세포의 증식을 감소시키는 결정 여부를 포함한다. 여러 세포주는 시험된 조직에 의존하는 시료가 사용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 세포주는 다음을 포함한다:SW-480-결장의 선암(adenocarcinoma); HT-29-결장의 선암, A-427-폐 선암 암종(carcinoma); MCF-7-가슴 선암; 및 UACC-375-흑색종(melanoma) 계열; 및 DU145-쇠약한 암종. 상기 세포주를 사용하여 얻어진 세포파괴 자료는 종양손상의 억제효과를 나타낸다.

이러한 세포주는 매우 특징이 있는 것으로, 새로운 항-암제를 위한 스크리닝 프로그램의 미국 국립 암연구소에 의해서 사용되었다.

암세포 증식을 억제하기 위한 화합물들의 능력은 ATCC로부터 얻은 HT-29 인체 결장 암종 세포주를 사용하여 측정할 수 있다. HT-29 세포는 관련된 결장 암세포 배양 모델로서 특징이 있다[Fogh, J., and Trempe, G. In:Human Tumor Cells in Vitro, J. Fogh(eds.), Plenum Press, New York, pp. 115~159, 1975]. HT-29 세포는 37 ℃, 95% 공기의 습윤대기 및 5% CO₂하에서 5% 태아의 뼈 소혈청(Gemini Bioproducts, Inc., Carlsbad, CA) 및 1mm 글루타민, 및 1% 항생물질-항진균성을 사용하여 보충된 RPMI 매체에서 유지시켰다. 간략히 말해서, HT-29 세포는 96 웰 적정에서 500 cells/well의 밀도로 플레이트 위에 놓고, 화합물을 첨가하기에 앞서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 각 세포수의 결정은 6개의 복제를 포함한다. 6일 동안 배양한 후에, 세포들을 차가운 트리클르오로아세트산을 첨가하여 최종 농도를 10% 농도로 고정시켰으며, 단백질 레벨은 문헌[다음에 참증으로서 제시된 Skehan, P., Stroreng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J. T., Bokesch, H., Kenney, S., and Boyd, M.R., "New Colorimetic Assay For Anticancer-Drug Screening", J. Natl. Cancer Inst. 82:1107∼1112, 1990]에 공지된 방법으로 설포로다민(sulforhodamine) B(SRB) 색채 단백질 염료 분석을 사용하여 측정하였다.

SRB 분석외에도, 여러 가지 다른 방법들은 증식 억제를 측정하기 위하여 이용될 수 있으며, SRB 분석을 대신할 수 있다. 이러한 방법들은 다음의 트리판(trypan) 청색 염료로 생존 가능한 세포 계산, BrdU 또는 방사표지된 티미딘(thymidine)을 사용하여 DNA 합성이 가능한 표지된 세포들, 생존 가능한 세포들의 중간 적색 염료, 또는 생존 가능한 세포들의 MTT 염료를 포함한다.

100 μM 또는 그 이하의 용량으로 약 50%보다 높은 중요한 암세포 증식억제에는 상기 화합물이 종양손상(neoplastic lesions) 치료에 유용한 것으로 나타내고 있다.

바람직하게는, IC₅₀값을 결정하고, 비교 목적을 위해 사용된다. 상기 값은 상대적인 대조군의 50%에 의해 암세포 증식을 억제하기 위한 필요 약제농도이다.

바람직하게는, 종양손상을 치료하기 위해 가능한 용도를 위해 IC₅₀값은 화합물에 대해 100 μM보다 적어야 한다.

E. 화합물의 아포프토시스 유도 여부 결정

두 번째 선택적인 실시예로서, 본 발명의 또 다른 스크리닝 방법은 암세포 배양에서 화합물의 아포프토시스 유도 여부 결정을 포함한다.

두 개의 별개의 세포사 형태는 형태학상 및 생화학적 기준은, 즉 세포괴사(necrosis) 및 아포프토시스에 의해 설명될 수 있다. 세포괴사는 플라즈마 막의 투과성 증가에 의해 수행될 수 있으며, 세포 증가 및 플라즈마 막은 몇 분 안에 파괴된다. 아포프토시스는 수포막, 세포질 응축 및 내생적인 엔도뉴클라제의 활성화로서의 특징이 있다.

아포프토시스는 정상조직의 전환 중에, 기관 및 사지(limbs)의 배발생 중에 자연적으로 발생된다. 또한, 아포프토시스는 세포파괴 T-림프세포 및 자연적으로 죽은 세포, 이온화 방사 및 특정한 화학치료제로서 유도된다. 아포프토시스의 부적당한 규제는 암, 에이즈(AIDS), 또는 알쯔하이머 질환 등을 포함하는 많은 병리학적 조건에서 중요한 역할을 하고 있다. 화합물은 상기 설명된 바와 같은 조건하에서 유지되는 암세포의 배양을 사용하여 아포프토시스의 유도를 위해 스크린될 수 있다. 시험 화합물을 사용하는 세포처리는 여러 농도에서 2∼7일 동안의 전 또는 나중에 충분히 자란 배양 및 처리 중의 하나를 포함한다. 아포프토시스 세포는 배양의 고착 및 "부양(floating)" 구획 모두에서 측정될 수 있다.

상기 구획은 상청액을 제거하고, 고착된 세포에 트립신을 처리하고, 및 다음의 원심분리 세척 단계(10분, 2000 rpm)를 거쳐 세포를 모을 수 있다. 아포토시스의 중요한 양을 얻기 위해 술린댁 및 이와 관련된 화합물로 암세포를 처리하는 프로토콜은 문헌에 설명되어 있다[Piazza, G. A., 등, Cancer Research, 55:3110∼31116, 1995]. 새로운 방법은 부유 및 고착된 세포를 수확, 적절한 처리시간과 아포토시스를 관찰하기 위한 용량 범위의 동정 및 적절한 세포 배양 조건의 동정을 포함한다.

화합물의 다음 처리에 있어서, 배양은 아크리딘 오렌지 및 에티디움 브로마이드로 표지함으로써 형광현미경을 사용하여 아포토시스 및 네크로시스가 분석될 수 있다. 아포토스된 세포 수를 측정하는 방법은 이전에 Duke ＆ Cohen" Morphological and Biochemical Assays Of Apoptosis", Current Protocols In Immunology, Coligan 등, eds., 3.17.1∼1.17.16(1992)에 의해 설명되어졌다.

예를 들면, 부유 및 고착된 세포응 트립신을 처리하고 PBS로 세 번 세척함으로써 모을 수 있다. 세포의 분획은 원심분리될 수 있다. 그런 다음, 침전물은 배지 및 PBS 중의 아크리딘 오렌지와 에티디움 브로마이드를 포함하는 염색 혼합물에서 재용해되고 가볍게 혼합되었다. 그런 후 혼합물을 현미경 슬라이드에 올려놓고 아포토시스의 형태를 관찰하였다.

또한, 아포토시스는 실험 화합물로 처리된 세포의 DNA 단편의 증가를 측정함으로써 정량될 수 있다. 세포질 히스톤 관련 DNA 단편(모노- 및 올리고뉴클레오좀)의 시험관내 결정을 위한 상업적 광도계 EIA가 사용되었다(세포사(death) 검출 ELISA^okys, Cat. No. 1,774,425, Boehringer Mannheim). 보헤린거 만하임(Boehringer Mannheim) 분석은 DNA 및 히스톤에 대한 마우스 모노클로날 헝체를 사용하는 샌드위치-효소-면역분석 원칙에 기초를 둔다. 이것은 세포 용해물의 세포질 분획에 있어서 모노- 및 올리고뉴클레오좀이 특이적으로 결합하게 한다.

본 발명에 따라, 아포토시스는 다음과 같이 측정되었다. 샘플(세포용해물)을 스트렙타비딘-코팅된 마이브로타이터 플레이트("MTP")에 놓았다. rm 다음에, 항-히스톤-바이오틴 및 항-DNA 퍼옥시다제 복합물의 혼합물을 첨가하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간동안, 항-히스톤 항체는 뉴클레오좀의 히스톤 성분에 결합되는 동시에 바이오틴화를 통하여 스트렙타비딘-코팅된 MTP에 면역 복합물을 고정시켰다.

첨가적으로, 항-DNA 퍼옥시다제 항체는 뉴클레오좀의 DNA 성분과 반응한다. 세척함으로써 결합되지 않은 항체를 제거한 후, 뉴클레오좀의 양은 면역복합물에 머물러 있는 퍼옥시다제에 의해 측정될 수 있다. 퍼옥시다제는 기질인 ABTS7(2,2'-아지도-[3-에틸벤즈티아졸린-설포네이트])와의 광반응으로 측정된다.

예를 들면, SW-480 결장 선암세포(adenocarcinoma)를 웰당 10.000 세포의 밀도로 96-웰 MTP에 넣었다. 그런 다음, 세포는 실험 화합물로 처리되고, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, MTP는 원심분리되고, 상층액은 제거되었다. 그런 후, 각 웰의 세포 침전물은 30분 동안 용해 완충액에서 재용해되었다. 용해물은 원심분리되고 상층액의 분획(즉, 세포질 분획)은 스트렙타비딘-코팅된 MTP로 옮겼다. MTP 중의 용해된 침전물(즉, 고분자량, 단편화되지 않은 DNA를 포함하는 세포핵)을 흔들지 않도록 조심해야 한다. 옮긴 다음, 샘플이 분석됐다.

아포토시스 반응의 지표인 배자극(fold stimulation: FS=OD_max/OD_veh)은 주어진 농도에서 실험된 각 화합물에 대해 결정된다. 또한, EC₅₀값은 실험 화합물의 농도 시리즈를 측정됨으로써 결정된다.

아포토시스의 통계적으로 중요한 증가(즉, 100 μM 농도에서 2배 이상 자극)는 화합물이 종양 손상(lesion)의 치료에 유용하다는 첨가적인 지표이다. 바람직하게는, 아포토시스 활성에 대한 EC₅₀값은 종양 손상의 치료에 적합한 것으로 여겨지는 화합물 100 μM 이하여야 한다. 여기서, EC₅₀는 매개물(vehicle) 처리에 대한 아포토시스의 50% 유도를 일으키는 농도로써 정의된다.

F. 포유류 선(gland) 기관 배양 모델 실험

상기 방법에 의해 확인된 실험 화합물은 포유류 선 기관 배양 시스템에 있어서 전-종양 손상을 억제하는 항종양활성에 대해 실험될 수 있다. 마우스 선 기관 배양 기술은 NSAIDs, 레티노이드, 타모시펜(tamoxifen), 셀레늄 및 천연 생산물과 같은 알려진 항종양제의 효과를 연구하기 위해 다른 연구자들에 의해 성공적으로 사용되고 본 발명의 스크린 방법에 대해 유효하다.

예를 들면, 암컷 BALB/c 마우스에게 시험관내 호르몬에 반응한 선의 활성을 높이기 위해 매일 에스트라디올 및 프로게스트론의 화합물을 처리할 수 있다.

동물은 죽이고 흉부의 포유선을 무균상태에서 잘라내고 인슐린, 프로락틴, 하이드로코티손 및 알도스테론이 부가된 성장배지에서 10일 동안 배양하였다.

DMBA(7, 12-다이메틸벤즈안트라신)이 악성전 손상 형성을 유도하기 위해 배지에 첨가??다. 완전히 발달한 선에서 프로락틴, 하이드로코티손 및 알도스테론을 제거하면 결과적으로 선은 퇴화하나 전-악성종양 손상이 생긴다.

실험 화합물을 DMSO에 녹이고 배양기간동안 배양배지에 첨가했다. 배양기간의 말에, 선은 글라스 슬라이드에서 10% 포르말린으로 고정, 알룸 칼마인(alum carmine)으로 염색 및 마운팅되었다. 포유 손상의 사건은 손상없는 선에 대한 포유류 손상을 가진 선의 비율이다. 실험 화합물이 처리된 선에 있어서 포유 손상의 사건은 처리하지 않은 선의 그것과 비교된다.

포유류 손상된 지역의 범위는 지상 조직(digitation) 패드위의 선의 이미지를 투사함으로써 측정될 수 있다. 선에 의해 덮어진 지역을 패드위에 놓고 이 지역을 100%로 하였다. 퇴화하지 않은 구조 각각에 의해 덮여진 공간은 또한 지상 조직(digitation)에서 윤곽을 그릴 수 있고 컴퓨터에 의해 측정될 수 있다.

실험결과

수 많은 화합물은 종양 치료에 있어 다양한 임상시험계획서로 조사되고 잠재적인 사용을 위해 검색된다. 이러한 실험결과를 아래와 같이 보고하고 있다. 이 실험 화합물은 다음과 같이 해당 두음자를 따서 하기와 같이 표시한다.

A- 락-테레오-(E)-1-(N,N'-다이에틸아미노에단에티오)-1-(부탄-1',4'-올리도)-[3',4':1,2]-6- 플루오로-2-메틸-3-(p-메틸설포닐벤질리덴)-인단;

B- (Z)-5-플루오로-2-메틸-1-(3,4,5-트리메토실멘질리덴)-3-아세트산;

C- (Z)-5-플루오로-2-메틸-1-(p-클로로벤질리덴)-3-아세트산;

D- 락-(E)-1-(부탄-1',4'-올리도)-[3',4':1,2]-6-플루오로-2-메틸-3-(p-메틸설포닐벤질리덴)1S-인다닐-N-아세틸시스테인;

E- (Z)-5-플루오로-2-메틸-1-(3,4,5-트리메토옥시벤질리덴)-3-인데닐아세타마이드, N-벤질;

F- (Z)-5-플루오로-2-메틸-1-(p-메틸설포닐벤질리덴)-3-인데닐아세타마이드,N,N'-다이사이클로헥실;

G- 리보-(E)-1-트리아조로-[2',3':1'',3'']-1-(부탄-1',4'-올리도)-[3',4':1,2]-6-플루오로-2-메틸-3-(p-메틸설포닐벤질리덴)-인단; 그리고

H- 락-(E)-1-(부탄-1',4'-올리도)-[3',4':1,2]-6-플루오로-2-메틸-3-(p-메틸설포닐벤질리덴)-1S-인다닐-글루타티온).

예 1 - COX 억제 평가

표쥰 화합물 및 실험 화합물은 COX 평가에 대하여 임상시험계획서와 일치하게 COX 억제 활성을 위해 분석한다. 제 4도는 정제된 사이클로옥시게나제(타입 1)활성에 대해 설린닥 설파이드나 엑시술린드의 다양한 농도에 대한 효과를 나타낸다. 사이클로옥시게나제 활성은 이미 설명한 (Mitchelle et al, supra)바와 같이 숫양 정액낭포로부터 정제된 사이클로옥시게나제을 사용함으로써 결정된다. 설린닥설파이드에 대한 IC50 값은 엑시술린드에 대한 값이 10,000μM보다 큰데 반해 약 1.76μM로 계산된다. 이러한 데이터는 엑시술린드가 아닌 설린닥 설파이드(sulindac sulfide)가 COX-I 억제제임을 보여준다. 유사한 데이터가 COX-2 동위효소(isoenzyme)[Thompson, et al., Journal of the National Cancer Institute, 87: 1259-1260, 1995]에 대해서 얻어진다.

제 5도는 COX 억제에 대한 실험 화합물 B와 E의 효과를 보여준다. COX 활성은 제 4도에서 나타낸 화합물과 같이 결정된다. 데이터는 실험 화합물 B와 E가 상당히 COX-1을 억제하지 못함을 보여주고 있다.

[ 표 2 ]

화합물들의 종류에 대한 사이클로옥시제나제 억제 활성

임상시험계획서와 일치하게 E를 통한 화합물 A은 위의 표 2에서 보고된 바와 같이 COX 억제 활성에 대해 평가된다. 화합물 C는 100μM 용량에서 25%보다 더 크게 COX를 억제함이 발견되었고 검색을 더욱 선택할 수 없다.

예 2 - cGMP PDE 억제 평가

표준 화합물과 실험 화합물은 상기에서 설명된 평가에 대한 임상시험계획서와 일치하게 cGMP PDE 억제 활성에 대해 분석한다. 제 6도는 이미 설명한 바와 같이 (W. J. Thompson et al., supra) 인체 콜론 HT-29로 배양된 종양 세포에서 정제된 PDE4 또는 cGMP PDE 활성에 대한 설린닥 설파이드와 엑시술린드의 다양한 농도에 대한 효과를 보여준다. PDE 4의 억제에 대한 설린닥(sulindac)의 IC50 값은 41μM이고 cGMP PDEDP 억제에 대한 값은 17μM이다. PDE 4 억제에 해한 엑시술린드의 IC50 값은 181μM이고 cGMP PDE 억제에 대한 값은 56μM이다. 이러한 데이터는 설린닥 설파이드와 엑시술린드 둘다 포스포다이에스테라제 활성을 억제함을 보여준다. 이 두 화합물은 PDE4 동위형(isoform)에 대한 cGMP PDE 둥위효소에 대한 선택성을 나타낸다.

제 7도는 설명된 상기평가와 일치하게 배양된 HT-29 세포에서 결정된 것과 같이 cGMP 또는 cAMP 생성에 대한 설린닥 설파이드 효과를 나타낸다. HT-29 세포는 30분동안 설린닥 설파이드와 함께 치료되고 cGMP 또는 cAMP는 기존의 방사선면역정량법(radioimmunoassay)로 측정된다. 지시된 바와 같이 7.3μM(제 7A도)의 EC50 값과 함께 50%보다 더 크게 cGMP의 농도을 증가시킨다. cAMP의 농도는 알려진 PDE4 억제제, rolipram,가 cAMP을 증가시킨다 하더라도(제 7B도) 치료에 의해 영향을 받지 않는다. 이 데이터는 PDE4와 관련된 cGMP PDE을 억제하는 약리학적 중요성을 증명한다.

제 8도는 포스포다이에스테라제의 cGMP PDE 또는 PDE4에 대한 실험 화합물 B의 지시된 용량에 대한 효과를 나타낸다. 계산된 IC50 값은 cGMP PDEDP 대해 18μM이고 PDE4에 대해 58μM이다.

제 9도는 PDE4 또는 cGMP PDEDP 대한 실험 화합물 E의 지시된 용량에 대한 효과를 나타낸다. 계산된 IC50은 cGMP PDE에 대해 0.08μM이고 PDE4에 대해서는 25μM보다 더 크다.

[ 표 3 ]

화합물들의 종류 사이의 cGMP PDE 억제 활성

상기 표 3의 화합물은 임상시험계획서에서 설명된 바와 같이 PDE 억제 활성에 대해 평가된다. COX를 억제하지 못하는 화합물중에서 오직 화합물 EAKS이 10μM에서 50% 억제 보다 큰게 나타남을 알 수 있다. 제 8도에서 언급한 바와 같이 화합물 B는 20μM의 용량에서 50%보다 큰 억제를 나타낸다. 그래서 단일 용량실험에서 사용된 용량농도에 의존하기 때문에 몇몇 화합물들은 다른 경우 약간 높은 용량에서 활성되기 때문에 검색될 수 있다. 사용된 용량은 주관적이며 심지어 유력한 화합물을 확인하기 위해 어떤 농도에서 활성 화합물이 발견된 후 더 낮게 측정된다.

예 3 - Apoptosis 평가

표준 화합물과 실험 화합물은 상기 평가에 대한 임상시험계획서와 일치하게 신규 PDE 억제 활성에 대해 평가된다. 임상시험계획서과 일치하게 제 10도는 아포프토틱(apoptotic)과 세포괴사 세포사(necrotic cell death)에 대한 설린닥 설파이드와 엑시술린드의 효과를 나타낸다. HT-29 세포는 설린닥 설파이드 또는 엑시술린드의 지시된 용량하에 6일동안 치료된다. 아포프토틱과 세포괴사 세포사는 미리 결정된다[Duke and Cohen, In: Current Protocols in Immunology, 3.17.1 - 3.17.16, New York, John Wiley and Sons, 1992]. 데이터는 설린닥 설파이드와 엑시술린드 둘다 세포괴사(necrosis) 유도없이 아포프토틱 세포사(apoptotic cell death)를 일으킬 수 있다. 모든 데이터는 같은 실험으로 수집된다.

제 11도는 DNA 단편에 의해 결정된 바와 같이 종양 성장 억제와 아포프토시스 유도에 대한 설린닥 설파이드와 엑시술린드의 효과를 보여준다. 엑시술린드에 의한 상기 도표(11A); 성장 억제 (개방기호, 좌축)와 DNA 단편 (폐쇄기호,우축). 설린닥 설파이드에 의한 하기 도표(11B); 성장 억제(개방기호) 그리고 DAN 단편 ( 폐쇄기호). 성장 억제는 치료 6일 후 SRB 평가에 의해 결정된다. DNA 단편은 치료 48시간후 결정된다. 모든 데이터는 같은 실험에서 수집된다.

제 12도는 화합물 E의 성질을 유도하는 아포프토시스를 보여준다. HT-29 대장선종양 세포는 48시간동안 화합물 E의 지시된 농도에서 치료되고 아포프토시스는 DNA 단편 평가에 의해 결정된다. 계산된 EC50 값은 0.05μM이다.

제 13도는 화합물 B에 대한 성질을 유도하는 아포프토시스를 보여준다. HT- 29 대장선종양 세포는 48시간동안 화합물 B의 지시된 농도에서 치료되고 아포프토시스는 DNA 단편 평가에 의해 결정된다. 계산된 EC50 값은 175μM이다.

[ 표 4 ]

화합물들의 종류 사이의 아포프토시스의 억제 활성

배수관련 임상시험계획서, 상기와 일치하게 E를 통한 화합물 A는 위의 표4에서 보고된 바와 같이 활성을 유도하는 아포프토시스에 대해 실험된다. 화합물 B, C 및 E는 100μM 용량에서 2.0배보다 더 크게 상당한 아포프토틱 유도 활성을 나타낸다. 이러한 세 화합물들 중에 이 용량에서 오직 B와 E는 COX을 억제하지 못하나 cGMP-특이적 PDE를 억제한다.

포스포다이에스테라제 억제제 계열에 대한 아포프토틱 유도 활성이 결정한다. 데이터는 하기의 표5와 같다. 아포프토시스와 괴사는 설명된 평가, 상기와 일치하게 아크리딘 오렌지(acridine orange)와 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 라벨 후 형태학적으로 결정된다. 데이터는 신규 cGMP-특이적 PDE가 HT-29 세포의 아포프토시스를 유도하는 검색 화합물에 대해 유용하다.

[ 표 5 ]

PDE 억제제에 대한 아포프토시스-억제 자료

예 4 - 성장 억제 평가

표준 화합물과 실험 화합물은 평가, 상기에 대한 임상시험계획서와 일차하게 PDE5 억제 활성에 대해 분석된다. 제 14도는 HT-29세포의 성장의 설린닥 설파이드와 엑시술린드의 다양한 농도에 억제 효과를 나타낸다. HT-29 세포는 지시된 바와 같이 다양한 엑시술린드 (triangles) 또는 설린닥 설파이드 (squares) 용량에서 6일동안 치료된다. 세포수는 이미 설명한 바와 같이 [Piazza et al., Cancer Research, 55:3110-3116, 1995] 설포로다민(sulforhodamine) 평가에 의해 측정된다. 설린닥 설파이드에 대한 IC50 값은 약 45μM이고 엑시술린드에 대해서는 200μM이다. 데이터는 설린닥 설파이드와 엑시술린드 모두 종양 세포성장을 억제할 수 있다.

제 15도는 성장 억제와 설린닥 설파이드의 아포프토시스-유도 활성를 나타낸다. 시간경과 실험은 매체로서 0.1% DMSO (개방기호) 또는 설린닥 설파이드, 120μM (폐쇄기호)와 같이 치료되는 HT-29를 포함한 것을 보여준다. 성장 억제(15A top)는 트리판 블루 스테이닝후 보이는 세포들의 수를 셈으로써 측정된다. 아포프토시스(15B 밑)은 이미 설명한 바와 같이[Duke and Cohen, in: Current Protocols in Immunology, 3.17.1 - 3.17.16, New York, John Wiley and Sons, 1992] acridine orange와 ethidium bromide를 가지고 스테이닝 한후 형태학적 결정에 의해 측정된다. 이 데이터는 설린닥 설파이드가 종양 세포 성장을 억제할 수 있고 아포프토시스에서 증가가 수행되는 효과가 있다. 모든 데이터는 같은 실험에서 수집된다.

제 16도는 실험 화합물 E의 성장 억제 활성을 보여준다. HT-29 대장상종형 세포는 6일동안 화합물 E 지시된 농도에서 치료되고 세포수는 SRB 평가에 의해 결정된다. 계산된 IC50 값은 0.04μM이다.

[ 표 6 ]

화합물들의 종류 사이의 증식-억제 활성

섹션 검색된 임상시험계획서와 일치하게 E를 통한 화합물 A는 상기 표 6에서 보고된 바와 같이 성장 억제 활성에 대한 실험이 행해졌다. 모든 실험 화합물은 100μM 단독 용량 실험을 초과하는 활성을 보여준다.

포스포다이에스테라제 억제제 계열을 위한 성장 억제 활성이 결정된다. 데이터는 하기의 표 7에 나타난다. HT-29 세포는 다양한 포스포다이에스테라제 억제제와 함께 6일 동안 치료된다. 세포성장은 설명된 SRB 평가에 의해 결정된다. 위의 결과에 대한 아래의 데이터는 신규 PDE 억제제가 종양 세포 성장을 억제하는데 효과적임을 나타낸다.

[ 표 7 ]

PDE 억제제에 대한 증식 억제

종양의 다양한 형태에 대한 이 검색된 방법의 효과를 보여주기 위해 화합물들은 많은 세포주에서 실험되어진다. 다양한 세포주에서 설린닥 설파이드와 엑시술린드의 효과는 결정된다. 데이터는 하기의 표 8에서와 같다. IC₅₀값은 SRB 평가에 의해 결정된다. 데이터는 비교할 수 있는 용량범위에서 효과적으로 다양한 종양 범위에 대해 이러한 화합물의 다양한 효과성을 보여준다. 따라서, 본 발명에 의해 확인되고 선택된 화합물들은 다양한 종양 형태를 치료하는데 유용하다.

[ 표 8 ]

여러 세포 계열의 증식 억제

예 5- 표유동물의 분비선 배양모델에서의 활성

제 17도는 sulindac 대사산물에 의한 표유동물의 분비선 배양모델에서 암전구성에 대한 억제를 보여준다. 표유동물의 분비선 배양모델 실험은 이미 설명된 방법(Mehta and Moon, Cancer Research, 46:5832-5835, 1986)으로 행해진다. 이 결과는 sulindac과 엑시술린드가 효과적으로 암전구성의 형성을 억제하나 sulfide는 비활성임을 증명한다. 데이터는 사이클로옥시게나제 억제가 바람직한 화합물의 반종양 성질에 대해 불필요하다는 가설을 증명한다.

종양 치료를 위한 화합물을 선택하기위해, 본 발명은 여러 가지 프로토콜로부터 실험 화합물의 실험 데이터를 비교하는 이론적 설명을 제공한다. 본 발명의 전체구성에 있어서, 실험 화합물은 인간의 종양을 치료를 위한 가능성에 따라 분류될 수 있다. 바람직한 효과를 가지는 화합물은 부가적인 실험 및 인간에의 사용에 대해 선택되어질 것이다.

다양한 실험 화합물 및 여러 가지 프로토콜의 질적인 데이터는 하기의 표 9에 나타내었다. 이러한 데이터는 엑시술린드, 화합물 B 및 화합물 E는 4가지 분석을을 통과할 적당한 활성을 가짐을 보여진다: COX 억제의 결핍, cGMP-특이적 PDE 억제의 존재, 성장 억제 및 아포토시스(apoptosis) 유도. 포유동물선(gland) 기관 배양에 있어서 이러한 화합물의 활성은 본 발명의 효과를 유효하게 한다. 스크린 프로토콜의 질적인 평가는 화합물 E를 최고로, 화합물 B 및 다음으로 엑시술린드 순서로 등급지었다.

[ 표 9 ]

여러 화합물의 활성

또한, 본 발명의 스크린 방법에 사용되는 PKG 활성에 대한 새로운 분석을 밝히나, 다른 목적(예를 들면, 정상적인 세포 기능에 있어서 PKG의 역할 연구)을 위한 PKG 활성 분석에 있어서는 더 일반적인 사용을 밝힌다. 설명을 위해, 화합물이 종양 치료에 있어서 유용한지를 확신하는 약물 평가에 PKG 활성이 이 어떻게 사용되는지를 설명하기 전에, 먼저 PKG 분석을 기술할 필요가 있다.

새로운 PKG 분석

본 발명의 새로운 PKG 분석은 각각이 적어도 cAMP 결합 부위 및 포스포다이에스테라제 타입 5("PDE5")의 인산화 위치를 가지는 다수의 아미노산 서열의 고체상에의 결합을 포함한다. 이러한 서열은 알려져 있고 하기의 참조에 설명되어 있다. 바람직하게는, 결합된 PDE5 서열은 하기에서 설명될 PDE5의 촉매부위를 포함하지 않는다. PDE5 서열이 고체상에 결합하는 한가지 방법은 PDE5 서열과 아미노산 결합쌍의 하나의 멤버의 융합 단백질로써 서열을 발현하고 고체상(예로는 비드(beads))에 아미노산 결합쌍의 다른 멤버를 화학적으로 연결하는 것이다.

사용될 수 있는 하나의 결합쌍은 글루타티온 S-전이효소("GST") 및 글루타티온("GSH")이고, 여기서 GST는 상기에서 설명한 PDE5 서열을 가진 융합 단백질이고, GSH는 고체상에 공유적으로 결합한 것이다. 이런 방식으로, PDE5 서열/GSt 융합 단백질은 하기에서 설명한 것처럼 고체상의 융합 단백질을 포함하는 용액을 통과하므로써 간단히 고체상에 결합할 수 있다.

RT-PCR 방법은 PDE 1∼10 패밀리 중에서 선택된 소(bovine) PDE5A cDNA 서열로부터 제조한 전방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 PDE5의 cGB 부위를 제조하는데 사용된다. 전체 RNA에 대한 5'-3', Inc. 기기 및 mRNA에 대한 올리고(dT) 컬럼 정제는 HT-29 세포에 대해 사용되었다. 전방향 프라이머(GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G, 203∼227) 및 역방향 프라이머(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG, 1664∼1686)은 인간 PDE5a(203∼1686 bp, cGB-PDE5)의 인산화 위치 및 낮은 친화와 고친화 cGMP 결합 위치를 암호화하는 1484 bp 단편을 합성하는데 사용된다. 합성된 cGB-PDE5 염기 단편은 소(bovine) PDE5A에 대해 97% 상동성을 갖는 494 아미노산을 암호화한다. 그런 다음, 상기 합성 염기를 tac 프로모터를 가진 글루타티온-S-전이효소(GST) 융합 벡터(Pharmacia Biotech)의 EcoRI 및 XhoI 절단 위치에 도입하였다. 그런 후, 융합 벡터를 대장균 BL21(DE3) 박테리아(Invitrogen)에 트랜스펙션하였다. 트랜스팩션된 BL21 박테리아는 로그상으로 자라고 IPTG가 유도물질로 첨가되었다. 유도는 20℃에서 24시간동안 수행되었다. 박테리아는 수획되고 용해되었다. 용해성 세포물을 GSH 복합 세파로스 4B(GSH-세파로스 4B)에 가하였다. GST-cGB-PDE5 융합 단백질은 GSH-세파로스 비드(beads)에 결합하고 다른 단백질은 차가 운 PBS를 가함으로써 비드(beads)로부터 떨어졌다.

발현된 GST-cGB-PDE5 융합 단백질은 7.5% SDS-PAGE상에 85 Kd 단백질로 보였다. 상기 단백질은 cGMP 결합 및 단백질 G와 A에 의한 인산화를 특징으로 한다. 상기 단백질은 두 개의 cGMP 결합 위치 및 천연 소(bovine) PDE5의 K_d=1.3μM에 가까운 K_d=1.6±0.2 μM을 나타낸다. GSH 복합 세파로스 비드(beads)에 결합한 GST-cGB-PDE5 시험관내에서 cGMP-의존 단백질 카이네즈 및 cAMP-의존 단백질 카이네즈 A에 의해 인산화될 수 있다. PKG에 의한 GST-cGB-PDE5 인산화의 K_m은 2.7 μM이고 Vmax는 2.8 μM인 반면에, BPDEtide 인산화의 K_m은 68 μM이다.

GST-cGB-PDE5 단백질 하나에 대한 한 분자의 인산염의 결합비율로 PKG에 의한 인산화된다.

상기에서 설명한 PDE5-결합 고체상을 사용한 PKG를 포함할 것이라고 여겨지는 액체 샘플을 분석하기 위해, 샘플 및 고체상은³²P-γ-ATP를 포함하는 인산화 완충액으로 혼합되었다. 이러한 용액은 30℃에서 30분 동안 배양됨으로써 만일 PKG가 존재한다면 일어날 PKG에 의해 PDE5 서열이 인산화된다. 그런 다음, 고체상은 용액으로부터 분리되고(예를 들면, 원심분리 또는 여과에 의해) 남아있는 용액 및 반응하지 않은³²P-γ-ATP를 제거하기 위해 인산-완충 식염수("PBS")로 세척하였다.

그런 다음, 고체상이 직접³²P가 결합되었는지를 확인하기 위하여 시험될 수 있다(액체 씬틸레이션 측정기(liquid scintillation counter)에 의해). 만일 상기의 결합이 확인된다면, PKG는 PDE5를 인산화하기 때문에 샘플은 PKG를 포함한다는 것을 지시한다. 상기에서 설명한바와 같이, 만일 PDE5는 융합 단백질을 토하여 결합된다면, PDE5-포함하는 융합 단백질은 SDS 완충액을 사용하여 고체상으로부터 용출될 수 있고 용출액은³²P 결합을 위해 분석될 수 있다. 다른 단백질이 존재한다는 가능성이 있다면 융합 단백질 분획이³²P 결합 분석을 위해 용출액은 여러개의 단백질로 분리될 수 있는(예를 들면 겔 분리에 의해) 이점이 있다.

인산화된 융합 단백질은 SDS 완충액을 사용하여 고체상으로부터 용출되고 전기영동에 의해 재용해될 수 있다. 만일 겔분리가 수행된다면, 단백질은 단백질의 위치를 알아내기 위해 염색될 수 있고 PKG에 의한 융합 단백질의 PDE5 부분의³²P 인산화는 겔에 대한 X-레이 필름 노출에 의해 측정될 수 있다. 만일³²P가 X-레이 필름으로 보여진다면, 이것은 PKG는 고체상으로부터 용출된 융합 단백질의 PDE5 부분을 인산화하는 PKG가 포함된 원료 샘플에 존재한다는 것을 나타낸다.

바람직하게는 분석에 있어서, PKG를 억제하지 않고 단백질 카이네즈 A("PKA")를 특이적으로 억제하는 단백질 카이네즈 억제제("PKI") 과량(예를 들면 100배)을 분석 완충액에 첨가하여야 한다. PKA 억제는 PKG 기질(예를들면, PDE5)을 인산화시키기 때문에 바람직하다. PKI를 첨가함으로써, PKA에 의한 인산화는 제거될 것이고 검출되는 인산화는 PKG만에 의한 것만 높게 나타날 것이다.

본 발명의 분석을 위해 제조될 수 있는 기기는 각각의 용기에 준비된 다음돠같은 시약을 포함한다:

1. 세포 용해 완충액: 50 mM 트리스-HCl, 1% NP-40, 150 mM NaCl,1 mM EDTA, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM NaF, 500 μM IBMX, 단백질 가수분해 억제제.

2. 단백질 카이네즈 G 고체상 기질: 재조합 GST-cGB-PDE5가 결합된 세파로스 4B(50% 현탁액)

3. 2×인산화 완충액:³²P-γ-ATP(3000 mCi/mmol, 5∼10 μCi/분석), 10 mM KH₂PO₄, 10 mM K₂HPO₄, 200 μM ATP, 5 mM MgCl₂

4. PKA 단백질 카이네즈 I 억제제

상기 반응을 수행하기 위한 휴대용 용기 등이 또한 기기에 제공되어야 한다.

상기에 의해, 분석적 종래 기술에 의해 여전히 다른 형에 설명된 분석형을 적용하기 위한 여러 가지 방법을 즉시 계획할 수 있다.

요약하면, PDE5의 적어도 한부분(또는 PKG에 의해 선택적으로 인산화될 수 있는 다른 단백질)을 사용하여, PKG의 존재 및 상대적 양(대조군과 비교하여)은 표지된 인산화 작용제를 사용하여 인산화될 수 있는 단백질의 인산화를 측정함으로써 확인될 수 있다.

종양세포에서 SAANDs는 PKG 활성을 증가시킨다.

상기에서 설명되어 있는 PKG 분석을 사용하여, 다음의 실험은 SAAND가 처리된 종양세포에서 PKG 발현의 증가 또는 cGMP 수준의 증가(또는 양쪽)로 인해 SAANDs는 PKG 활성을 증가시킨다는 것을 밝히기 위해 수행되었다.

실험과정

두가지 다른 타입의 PDE 억제제는 종양세포에서의 PKG에 대한 영향을 위해 측정되었다. SAAND인 엑시술린드는 항-종양성을 갖기 때문에 측정되었다.

또한, SAAND가 아닌 고전적 PDE5 억제제인 E4021은 PKA 증가가 단순히 PDE5 억제때문인지 또는 PKG 증가가 PDE5의 SAANDs 억제에 대한 세포고사 전 효과에 관여하는지를 확인하기 위하여 측정되었고 새로운 PDE는 Liu 등의 1998년 10월 15일에 출원한 미국 특허 출원 제 09/173,375호에 설명되어 있다.

APC 돌연변이를 포함하는 종양에 대한 cGMP-특이적 PDE 억제의 효과를 실험하기 위해, SW 480 결장 암세포를 사용하였다. SW 480은 APC 돌연변이를 포함하는 것으로 알려져 있다. RPMI 5% 혈청에 있는 약 5백만 SW480 세포를 8개의 디시(dish) 각각에 첨가했다.

2개 - 10 cm 디시(dish) - 30 ㎕ DMSO 매개물(vehicle) 대조군 (약이 처리되지 않는)

3개 - 10 cm 디시(dish) - DMSO 중의 200 μM, 400 μM, 600μM 엑시술린드, 및

3개 - 10 cm 디시(dish) - E4021; DMSO 중의 0.1 μM, 1 μM 및 10 μM.

디시(dish)는 5% CO₂배양기에서 37℃온도로 48시간동안 배양하였다.

액체 배지는 디시로부터 아스퍼레이션되었다(세포 그 자체는 디시에 고착될 것이다). 고차된 세포는 차가운 PBS로 세척하고 200 ㎕ 세포 용균 완충액(즉, 단백질 가수분해 억제제가 첨가된 50 mM 트리스-HCl, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 500 μM IBMX)이 각 디시에 첨가됐다. 세포용해 완충액을 첨가한 후 즉시 각 접시에 고착된 세포들을 긁어냈고, 그 모아진 세포용해액을 microfuge tube에 담은 뒤 4℃에서 15분간 서서히 교반하여 세포가 완전히 용해되게 하였다. microfuge tube에 세포가 완전히 용해된 후 상기 microfuge tube를 14,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 새 옮겨 담았다.

그 후 각 microfuge tube의 내용물에 단백질 assay를 하게 되는데, 상기 약물이 세포성장을 억제한다면, 약물처리한 샘플보다 대조군의 총 단백질량이 더 많게 될 것이며, 상기 약물이 그러한 억제효과가 없을 때에는 대조군과 처리군의 단백질량은 사실상 별 차이가 없을 것이다. 상기의 경우에 있어서 대조군과 E-4021의 microfuge tube는 과량의 엑시술린드로 처리된 샘플군과 표준화시키기 위해 희석을 시켰다 (소량의 엑시술린드로 처리된 샘플군과 과량의 엑시술린드로 처리된 샘플군을 표준화시켜야 했다). 따라서, 단백질 assay를 한 후, 각 샘플들의 총 단백질 농도를 표준화시켜야 한다 (예, 희석).

각 약물농도 및 대조군을 위해 두 종류의 PKG assay가 수행되는데, 하기와 같이 하나는 cGMP가 첨가되고 다른 하나는 cGMP가 첨가되지 않는다. 상기 두 종류의 assay를 수행하는 이유는 cGMP가 PKG를 활성화시키기 때문이다. PKG의 활성을 본 발명의 noble PKG assay를 통하여 측정하면, 일반적으로 PKG 활성의 증가가 세포내의 cGMP의 증가 (cGMP-specific한 PDE 억제로 인해 야기된 것일 수 있음) 때문인지 또는 PKG 단백질발현의 증가때문인지 밝혀 내기가 어렵다.

cGMP를 첨가한 샘플과 그렇지 아니한 샘플의 PKG활성을 조사함으로써, 혹 PKG활성의 증가가 측정된다면 그 증가가 PKG 단백질발현의 증가에 기인한 것인지 아닌지를 확인할 수 있다. 따라서, 항종양성 약물이 대조군에 비해 PKG활성을 향상시킨다면, 약물처리된 샘플에 있어서의 PKG 활성증가는 하기의 경우에 있어서PKG 단백질 발현의 증가에 (활성에 기인하기 보다는) 인한 것이라고 볼 수 있다;

(1) cGMP를 포함하는 약물처리된 샘플이 cGMP를 포함하는 대조군 샘플보다 PKG활성이 더 큰 경우

(2) cGMP를 포함하는 약물처리되지 않은 샘플이 대조군 샘플보다 PKG활성이 더 큰 경우

cGMP를 포함하는 샘플과 cGMP를 포함하지 않는 샘플을 준비하고, 50μL의 각 세포 용해액을 상기 20μL의 PDE5/GST solid slurry substrate phase에 첨가한다. 약물처리군과 대조군의 용해샘플을 측정키위해 각 혼합물에 10μCi 32P-γ-ATP용액(200μM ATP; 4.5mM MgCl2 ; 5mM KH2PO4; 5mM K2HPO4).

상기 결과 생성되는 혼합물을 30℃에서 30분간 배양한 후, 원심분리하여 고체층을 분리한 후 상등액을 따라 버린다. 각 튜브에 잇는 고체층은 700μL의 cold PBS로 씻은 후 Laemmli sample buffer(Bio-Rad) (30μL)를 첨가한다. 상기 혼합물을 5분간 끓인 후 7.5＆ SDS-PAGE gel에 넣고 150V로 1시간동안 이동시킨다. 상기 gel은 85Kd GST-PDE5 융해단백질 밴드를 탐색코자 commassie blue로 염색한다.

gel을 건조시킨후 X-ray film위에 놓게 되는데, 만일 PDE5가 인산화되면 그에 해당하는 검은 밴드가 나타나게 되며, 각 밴드의 진한 정도로써 인산화된 정도를 알 수 있다.

Fig. 18A 및 18B에서 알 수 있듯이, extra cGMP가 첨가된 대조군과 첨가되지 않은 대조군에 비해, SAAND 엑시술린드는 cGMP가 첨가된 샘플과 첨가되지 않은 샘플 모두에서 약물투여량에 비례하여 PKG활성을 증가시키고 있음을 알 수 있으며, 이러한 현상은 약물을 처리한 각 샘플에서 85Kd 밴드가 더 진하게 나타남으로써 더욱 두드러진다. 또한, 엑시술린드로 처리한 SW480샘플들은 cGMP가 첨가됨으로써 cGMP가 첨가되지 않고 엑시술린드 만으로 처리된샘플들보다 더 큰 인산화활성을 보였다. 따라서, 약물을 처리한 샘플에서의 PKG활성의 증가는 SAAND가 cGMP-specific PDE를 억제에 의한 cellular cGMP의 증가뿐 아니라, APC 돌연변이를 갖는 종양세포내에서의 PKG단백질 발현의 증가에도 기인 된다.

E-4021로 처리된 SW480샘플들이 대조군에 비해서(Fig. 18A 및 18B 참조) PKG활성을 보이지 않는다는 것은 APC 돌연변이를 갖는 종양세포내에서의 SAAND에 의한 PKG의 활성증가가 단순히 classic PDE5의 억제에 기인하지 않음을 보여주고 있다.

상기의 X-ray film 방법 이외에도, SDS-PAGE gel로부터 85 Kd 밴드를 통해 PKG활성을 측정할 수 있으며, 이 때 상기 gel에서 해당 밴드를 잘라낸 후 방사능측정기를 사용하여 그 밴드속에 결속된 32P양을 측정할 수 있다.

β-catenin 돌연변이를 함유한 종양세포내에서 cGM-specific PDE의 억제효과를 시험하기 위하여, HCT116 종양세포가 사용되었는데, HCT116는 β-catenin 돌연변이를 함유하나 APC돌연변이는 포함하지 않는다.

상기 SW480 과정과 동일한 방법으로 HCT116을 배양하였고, 본 실험에서는 오직 엑시술린드 와 대조군이 사용되었다. 엑시술린으로 처리된 세포들은 해당 대조군에 비해 인산화된 PKG를 훨씬 더 많이 생산해 냄으로써 약물처리된 세포에서의 PKG활성은 APC돌연변이와 무관함을 나타내었다. 따라서, 본 발명은 목적상, 청구항의 'reducing β-catenin'는 그 단백질의 야생타입(wild type)과 돌연변이형을 나타내기로 한다.

Western Blot을 통한 PKG발현의 증가 및 β-catenin의 감소에 대한 확증

상기에서 기술된 바와 같이, SAAND는 PKG의 발현증가 및 cGMP의 증가를 가져오며, 두 경우 모두 SAAND로 처리된 종양세포의 PKG활성을 증가시키는데, 여기서는 Western Blot을 통해 더욱 확증되었다.

엑시술린드로 처리된 SW480 세포들은 이전과 같이 ice-cold PBS로 씻은 후 microfuge tube에서 얻었으며, 그 세포들은 개질된 RIPA 완충용액하에 15분간 교반되며 용해되었다. 세포용해액은 급회전시킨 후 상등액을 다시 새 microcentrifuge tube에 옮기고, BioRad DC Protein Assay (Temecula, CA)를 수행하여 샘플의 단백질 농도를 측정하였고, 이전과 같이 표준화하였다.

각 샘플을 50μg씩 취하여 10% SDS-PAGE gel에서 이동분리 시킨후 단백질을 nitrocellulose membrane에 옮겼다. 상기 nitrocellulose membrane은 5% nonfat dry milk가 함유된 새로이 만들어진 TBST용액으로 실온에서 1시간동안 교반하면서 block하였다.

염소의 anti-PKG 일차 항체를 신선한 5% nonfat dry milk으로 농도를 맞춘후, 상기 nitrocellulose membrane을 넣고 실온에서 1 시간동안 교반하였다. nitrocellulose membrane을 TBST용액으로 3번 씻은후 토끼의 항염소 항체와 결합된 2차 POD를 함유하는 용액하에 실온에서 1 시간동안 교반하였다. 상기 nitrocellulose membrane를 TBST용액으로 10분간씩 3번 씻은후 Boehringer Mannheim BM blue POD substrate로 팀색하였다.

Fig. 19에 나타나 있듯이, 엑스술린드는 β-catenin를 감소시키고 PKG를 증가시키는데, 이는 Western Blot을 통해 밝혀졌다. SW480 세포를 엑시술린드나 vehicle(0.1% DMSO)로 48시간 처리된 후, 각 세포용해액의 상등액을 50μg씩 취하여 10% SDS-PAGE gel에서 이동분리 시킨후 단백질을 nitrocellulose membrane에 옮기고 토끼의 anti-β-catenin 및 anti-PKG항체를 사용하여 검침하였다.

SAANDs는 종양세포의 수를 감소시킨다.

본 실험에서는 SW480세포를 200, 400 또는 600 μM 엑시술린드 또는 vehicle(0.1% DMSO)로 배양하였다.

세포는 상기와 같이 처리후 48시간이 지나 수확하였고 immunoblotting을 수행하였다. immunoblotting은 Western blot으로 팀색하였으며 그 결과 엑시술린드로 처리한 군이 대조군에 비해 β-catenin의 발현이 50%감소했음이 밝혀졌으며 따라서,β-catenin은 SAAND처리에 의해 감소됨을 알 수 있다. 상기의 약물처리와 PKG의 활성증가의 확증 및 하기의 PKG에 의해 c이 인산화된다는 사실을 종양세포에서 β-catenin의 감소가 PKG의활성에 의해 개시됨을 나타낸다. 그러므로, 종양세포에서 PKG활성을 항종양성 성분의 검침을 위한 도구로 유용하게 사용할 수 있다.

PKG에 의한 β-catenin의 인산화

실함실에서 PKG는 β-catenin을 인산화시킨다. 이것을 획립시킨 실험은 하기한 "β-catenin immunoprecipitation"과 같은 방법으로 약물처리하지 않은 SW480세포로부터 β-catenin-containing complex를 immunoprecipitating하는 것이다. 상기의 immunoprecipitated complex는 여전히 고체층(즉 beads)에 trap되지만 32P-γ-ATP 및 순수 PKG (100단위)와 혼합하게 된다.

PKG가 첨가되지 않은 해당 대조군들이 준비된다.

단백질을 SDS 완충용액을 사용하여 고체층으로부터 분리한 후, 단백질을 포함한 혼합물을 7.5% SDS-PAGE gel로 이동분리 시킨다. 혼합물을 gel에서 이동시키면 과도한 32P-γ-ATP의 양이 제거된다. 따라서, 93Kd β-catenin 밴드에서 탐색되는 어떠한 32P-γ-ATP도 β-catenin의 인산화에 기인한 것이다. extra PKG의 처리없는 대조군과 비교하여 extra PKG로 처리된 93Kd β-catenin 밴드에서 탐색되는 어떠한 32P-γ-ATP의 증가도 그 extra PKG로 처리된 밴드의 β-catenin의 인산화에 기인한 것이다.

상기 결과는 최소한의 사실상 거의 감지될 수 없을 정도의 인산화를 보이는 대조군에 비하여 PKG로 처리한 밴드에는 인산화의 증가가 현저하므로 β-catenin이 PKG에 의해 인산화 될 수 있음을 나타낸다.

PKG에 의한 돌연변이 β-catenin의 인산화

APC돌연변이는 없지만 그대신 β-catenin돌연변이를 포함하는 HCT116 세포를 상기한 방법대로 수행하였으며, 그 결과 β-catenin돌연변이가 PKG에 의해 인산화됨이 나타났다.

따라서, 본 발명의 목적상, 청구항의 β-catenin의 인산화는 그 단백질의 wild type 및 돌연변이형을 나타내기로 한다.

β-catenin은 PKG와 침전한다.

상기 Western blot과 같은 방법으로 SW480 및 HCT116의 세포용해액의 상등액을 마련한다. 상기 세포용해액은 각 500μg의 세포용해액 마다 150μL의 단백질 A Sepharose bead slurry (50%)를 넣어 사전에 깨끗게 한 뒤, 4℃의 tube shaker에서 10분간 배양한다. 단백질 A beads는 4℃에서 14,000g의 속도로 10분간 원심분리하여 제거하며, 상등액은 새 centrifuge tube에 담는다. 10μg의 토끼 anti-β-catenin 항체 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York)를 500μg의 세포용해액에 첨가한다. 세포용해액/항체의 혼합액을 4℃의 tube shaker에서 2시간 동안 서서히 섞는다. immunocomplex는 150μL의 단백질 A Sepharose bead slurry (75μL의 빽빽한 beads) 와 4℃의 tube shaker에서 overnight 서서히 혼합함으로써 포획된다. 상기 Sepharose beads는 pulse centrifugation에 의해 수거하고(14,000 rpm에서 microcentrifuge로 5초간), tkdemddord,s 버리며, beads는 800 μL의 ice-cold PBS완충용액으로 3번 씻는다. Sepharose beads는 150μL의 샘플 완충용액에 2번 씻고 가볍게 혼합한gn 5분간 끓여서 immunocomplexes를 beads로부터 분리시킨다.

beads는 원심분리에 의해 수거되며 상등액을 사용하여SDS-PAGE를 수행한다.

상등액으로 Western blot을 수행한다. membrane을 토끼 anti-β-catenin 항체로 검침한 후, TBST로 10분씩 3번 씻어서 과도한 토끼 anti-β-catenin 항체를 제거한다. horseradish와 결합된 염소의 anti-rabbit 항체를 첨가한 후, 실온에 1시간 incubate한다. 이 과정이 끝나면 HRPO 기질과 β-catenin이 존재함을 육안으로 식벽할 수 있게되며, 이 실험으로부터 β-catenin의 존재가 명확하게 판명된다. SAAND는 종양세포내에서 PKG활동을 증가시킨다.

상기 PKG assay를 이용하여, SAAND로 처리한 종양세포내에서 cGMP 또는 PKG 발현의 증가(또는 모두)로 인하여 SAAND가 PKG 활동을 증가시킴을 확립하기 위해 다음과 같은 실험을 하였다.

실험과정

서로 다른 두 종류의 PDE 억제제가 종양세포내에서 PKG에 미치는 영향을 측정하였으며, exisulid인 SAAND이 항종양성물질로서 측정되었다. 또한, PKG의 증가가 단순히 classic PDE의 억제로 인한 것인지 또는 SAAND의 PDE5 및 novel PDE의 억제로 인한 pro-apoptotic 효과에 의한 것인지를 확인하기 위하여 PDE5 억제제인 E4021을 측정하였으며, 후자에 대하여는 Liu등에 의해 1998년 10월 15일에 미국에 특허출원(번호: 09/173,375) 된 바 있다.

cGMP-specific한 PDE가 APC돌연변이를 일으킨 종양세포내에서의 억제효과를 시험하기 위하여 APC 돌연변이에 의한 것으로 밝혀진 SW480직장 종양세포를 사용하였으며, RPMI 5%혈장에 약 5백만개의 SW480 직장 종양세포를 다음과 같이 각각 8개의 시험용접시에 담았다.

(2개) 10cm 접시... 30μL DMSO vehicle control (약물 무첨가)

(3개) 10cm 접시... 200μL, 400μM, 600μM 엑시술린드 in DMSO 및

(3개) 10cm 접시... E4021; 0.1μM, 1μM, 및 10μM in DMSO

접시들은 5% CO₂incubator에서 37℃로 48시간 동안 배양한다.

액체용매는 접시에서 흡인해 낸다(따라서 세포는 접시에 고착된다). 접시에 고착된 세포는 cold PBS 및 200μL 세포용해완충액 (즉, 50mM Tris-HCl, 1% NP-40, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM Na3VO4, 1mM NaF, 500μM IBMX 및 proteinase 억제제)으로 씻어낸 후 다시 각 접시에 담았다. 세포용해완충액을 첨가한 후 즉시 각 접시에 고착된 세포들을 긁어냈고, 그 모아진 세포용해액을 microfuge tube에 담은 뒤 4℃에서 15분간 서서히 교반하여 세포가 완전히 용해되게 하였다. microfuge tube에 세포가 완전히 용해된 후 상기 microfuge tube를 14,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 새 옮겨 담았다.

cGMP를 포함하는 샘플과 cGMP를 포함하지 않는 샘플을 준비하고, 50μL의 각 세포용해액을 상기 20μL의 PDE5/GST solid slurry substrate phase에 첨가한다. 약물처리군과 대조군의 용해샘플을 측정키위해 각 혼합물에 10μCi 32P-γ-ATP용액(200μM ATP; 4.5mM MgCl2 ; 5mM KH2PO4; 5mM K2HPO4).

Fig. 18A 및 18B에서 알 수 있듯이, extra cGMP가 첨가된 대조군과 첨가되지 않은 대조군에 비해, SAAND 엑시술린드는 cGMP가 첨가된 샘플과 첨가되지 않은 샘플 모두에서 약물투여량에 비례하여 PKG활성을 증가시키고 있음을 알 수 있으며, 이러한 현상은 약물을 처리한 각 샘플에서 85Kd 밴드가 더 진하게 나타남으로써 더욱 두드러진다. 또한, 엑시술린드로 처리한 SW480샘플들은 cGMP가 첨가됨으로써 cGMP가 첨가되지 않고 엑시술린드 만으로 처리된샘플들보더 더 큰 인산화활성을 보였다. 따라서, 약물을 처리한 샘플에서의 PKG활성의 증가는 SAAND가 cGMP-specific PDE를 억제에 의한 cellular cGMP의 증가뿐 아니라, APC 돌연변이를 갖는 종양세포내에서의 PKG단백질 발현의 증가에도 기인 된다.

상기 SW480 과정과 동일한 방법으로 HCT116을 배양하였고, 본 실험에서는 오직 엑시술린드 와 대조군이 사용되었다. exisulin으로 처리된 세포들은 해당 대조군에 비해 인산화된 PKG를 훨씬 더 많이 생산해 냄으로써 약물처리된 세포에서의 PKG활성은 APC돌연변이와 무관함을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 목적상, 청구항의 'reducing β-catenin'는 그 단백질의 wild type 과 돌연변이형을 나타내기로 한다.

Fig. 19에 나타나 있듯이, 엑시술린드는 β-catenin를 감소시키고 PKG를 증가시키는데, 이는 Western Blot을 통해 밝혀졌다. SW480 세포를 엑시술린드나 vehicle(0.1% DMSO) 로 48시간 처리된 후, 각 세포용해액의 상등액을 50μg씩 취하여 10% SDS-PAGE gel에서 이동분리 시킨후 단백질을 nitrocellulose membrane에 옮기고 토끼의 anti-β-catenin 및 anti-PKG항체를 사용하여 검침하였다.

SAANDs는 종양세포의 ??를 감소시킨다.

본 실험에서는 SW480세포를 200, 400 또는 600 μM 엑시술린드 또는 vehicle(0.1% DMSO) 로 배양하였다.

세포는 상기와 같이 처리후 48시간이 지나 수확하였고 immunoblotting을 수행하였다. immunoblotting은 Western blot으로 팀색하였으며 그 결과 엑시술린드로 처리한 군이 대조군에 비해 β-catenin의 발현이 50%감소했음이 밝혀졌으며 따라서, β-catenin은 SAAND처리에 의해 감소됨을 알 수 있다. 상기의 약물처리와 PKG의 활성증가의 확증 및 하기의 PKG에 의해 c이 인산화된다는 사실은 종양세포에서 β-catenin의 감소가 PKG의활성에 의해 개시됨을 나타낸다. 그러므로, 종양세포에서 PKG활성을 항종양성 성분의 검침을 위한 도구로 유용하게 사용할 수 있다.

PKG에 의한 β-catenin의 인산화

PKG가 첨가되지 않은 해당 대조군들이 준비된다.

PKG에 의한 돌연변이 β-catenin의 인산화

β-catenin은 PKG와 침전한다.

상기 Western blot과 같은 방법으로 SW480 및 HCT116의 세포용해액의 상등액을 마련한다. 상기 세포용해액은 각 500μg의 세포용해액 마다 150μL의 단백질 A Sepharose bead slurry (50%)를 넣어 사전에 깨끗게 한 뒤, 4℃의 tube shaker에서 10분간 배양한다. 단백질 A beads는 4℃에서 14,000g의 속도로 10분간 우??심분리하여 제거하며, 상등액은 새 centrifuge tube에 담는다. 10μg의 토끼 anti-β-catenin 항체 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York)를 500μg의 세포용해액에 첨가한다. 세포용해액/항체의 혼합액을 4℃의 tube shaker에서 2시간 동안 서서히 섞는다. immunocomplex는 150μL의 단백질 A Sepharose bead slurry (75μL의 빽빽한 beads) 와 4℃의 tube shaker에서 overnight 서서히 혼합함으로써 포획된다. 상기 Sepharose beads는 pulse centrifugation에 의해 수거하고(14,000 rpm에서 microcentrifuge로 5초간), tkdemddord,s 버리며, beads는 800 μL의 ice-cold PBS완충용액으로 3번 씻는다. Sepharose beads는 150μL의 샘플 완충용액에 2번 씻고 가볍게 혼합한gn 5분간 끓여서 immunocomplexes를 beads로부터 분리시킨다.

상등액으로 Western blot을 수행한다. membrane을 토끼 anti-β-catenin 항체로 검침한 후, TBST로 10분씩 3번 씻어서 과도한 토끼 anti-β-catenin 항체를 제거한다. horseradish와 결합된 염소의 anti-rabbit 항체를 첨가한 후, 실온에 1시간 incubate한다. 이 과정이 끝나면 HRPO 기질과 β-catenin이 존재함을 육안으로 식별할 수 있게되며, 이 실험으로부터 β-catenin의 존재가 명확하게 판명된다.

상기 membrane에서 PKG를 탐색하고자 anti-β-catenin항체 결합체를 2% SDS 및 100μM2β-mercaptoethanol의 62mM Tris-HCl(pH7.6) 완충용액에 넣어 55℃에서 0.5시간동안 분리시켰다. 그후 membrane을 5% nonfat dry milk의TBST로 교반하면서 block시킨후 토끼 polyclonal anti-PKG항체(Calbiochem, LaJolla, CA),즉, 에 결합된 염소, anti-rabbit 2차 항체로 검침하였다.membrane상의 PKG의 존재유무는 기질로써 육안식별이 가능하며, 본 실험에서 사실상 PKG가 육안으로 식별되었다.membrane상에 있는 단백질들이 오직 세포의 상등액으로부터 얻어진 β-catenin과 immunoprecipitate된 것이라는 점을 고려할 때, 상기결과는 PKG가 세포의 상등액으로부터 얻어진 β-catenin을 함유하는 단백질에 물리적으로 결합되어 있음을 명백히 보여주었다.

상기 Western blot membrane에 대해서도 상기와 같이 분리시킨후 anti-GSK3-β를 사용하여 β-catenin과 co-precipitate하는지 여부를 검침하였다. 이 실험에서는 membrane에 GSK3-β검출하였는데, 이는 GSK3-β가 β-catenin 및 PKG와 co- precipitate함을 나타내며, 따라서 상기 3 단백질은 한 complex의 일부분임을 짐작할 수 있다. GSK3-β와 β-catenin이 정상세포에서 APC complex의 일부분을 구성하므로 PKG는 그 complex의 일부분으로서 β-catenin의 인산화작용에 관여되는 것으로 추측된다.

cGMP PDE 억제제를 함유하는 항종양성 제약조성물

상기에서 설명한 바와 같이, 엑시술린드는 바람직한 항종양특성을 나타내는 화합물이다. 항종양제로서 상기 약물의 효과와 용도는 종양세포에서 cGMP에 특이적인 PDE 활성을 억제함으로서 발휘된다는 사실이 이미 알려져 있다.

무엇보다도 본 발명에 따른 후보화합물의 선정기준에 따라 인체치료에 유효한 화합물을 선택할 수 있다는 사실은 신생물의 이상증식환자를 대상으로 한 임상시험에서 검증된 바 있다. 엑시술린드가 항종양효과를 가지고 있다는 사실 (실험실내)이 밝혀진 후에 본 발명에 따른 후보화합물의 선정기준에 적합한 화합물을 검색함으로써 2회에 걸친 임상실험에서 엑시술린드 이외에 다른 화합물의 경우에도 본 발명의 선정기준에 따라 선택할 수 있음이 밝혀졌다.

상기에서 언급한 바와 같이, 신생물의이상증식은 그 대다수가 선종양성폴리증결장 (adenomatous polyposis coli; APC)의 돌연변이가 나타날 가능성이 있다. 무엇보다도 본 발명에 따른 후보화합물의 선정기준은 APC의 돌연변이 가능성이 있는 신생물의 이상증식환자를 대상으로 한 인체실험에서 확립된 바 있다. 상기 APC 질환은 결장에서 수십만개의 폴립이 10대에 나타나는 것을 특징으로 하며 그 통상적인 치료법은 20세가 되기 전에 결장의 외과적 적제수술로 제거하게 된다.

첫번째의 임상시험은 APC 환자를 대상으로 엑시술린드를 사용하여 실시하였다. 상기 임상시험에서 환자들은 직장 (소장이 부착된) 주위에 있는 결장의 작은 부분을 제외하고 이미 결장적제수술을 받았으며 그 직장기능이 유지되고 있는 상태였다. 그러나, 상기 환자들은 통상적으로 남아았는 소규모의 결장부위에 폴립이 형성되어 있었으며 이에 따라 주기적으로 제거수술이 요구되었다 (예를 들면, 전기소작).

첫번째의 임상시험에서 엑시술린드를 사용한 것은 약물투여군과 위약군에게 12개월에 걸쳐 형성된 새로운 폴립의 누적된 수를 비교함으로 엑시술린드의 항종양성효과를 평가하기 위한 예방적 임상실험이었다. 임상시험기준에 적합한 환자의 경우 매년 결장에서 9∼44개의 폴립이 발생하였다. 대상환자의 모든 폴립은 임상시험이 개시후와 6개월, 12개월 간격으로 제거하였다. 상기 임상시험에는 34명의 적격환자가 참여하였다. 매년 결장에서 9∼44개의 폴립이 발생하는 APC 환자를 대상으로 12개월에 걸쳐 형성된 폴비의 예측 평균수에 따르면, 엑시술린드의 폴립형성을 감소시키는 비율은 위약군과 비교하여 임상적이거나 통계적으로 유의적으로 높았다. 상기 임상시험을 실시후 최초 6개월동안에 생성된 포립의 평균 수에 따르면, 엑시술린드를 투여한 환자의 경우 포립의 발생빈도가 위약군과 비교하여 1/3 수준으로 나타났다 (연간 평균치는 각각 9개 및 26개; p = 0.013). 또한, 상기 임상시험에서 12개월에 걸쳐 형성된 폴립의 평균 수에 따르면, 엑시술린드를 투여한 환자의 경우 포립의 발생빈도가 위약군과 비교하여 1/2 수준으로 나타났다 (연간 평균치는 각각 18개 및 38개; p = 0.020).

전립선암을 가지고 있는 남성환자를 대상으로 별도로 임상시험을 실시하였으며 이에 따라 이들의 전립선을 모두 제거하였다. 본 시험은 방사선으로 전립선적출수술후에 전립선 특이적 항원 (prostate specific antigen; PSA)의 농도가 감지될 수 있는 환자를 대상으로 하였으며 모두 전립선 암의 재발을 암시하고 있는 상태였다.

전립선 암의 평가대상으로 96명의 환자가 참여하였다. 상기 임상시험에서 엑시술린드를 환자에게 1일 500 mg을 이중맹검과 위약대조에 의해 다기관임상시험을 실시하였다. 하기에 나타낸 데이타에서 나타난 바와 같이, 엑시술린드 투여군과 위약군 사이에 PSA 농도의 경우 통계적으로 유의적 차이를 보여주고 있다. 엑시술린드 투여군에서 PSA 농도는 위약군의 PSA 농도와 비교하여 혀저하게 감소되었다. PSA 농도가 상승한다는 사실이 그 자체로 질환을 나타내는 것은 아니지만, 이는 상기 대상환자에서 전립선 암의 재발을 암시하는 지표로서 의학계에 널리 알려져 있다.

전반적으로 평균 PSA 농도는 엑시술린드 투여군과 위약군 사이에 있어 차이가 있다는 평가를 내린 후에 소분류군에 대한 중간평가를 실시하였다. 본 임상시험에 참가한 환자를 암전이성을 가져오는 위험도에 비추어 중증위험군, 중등증위험군 및 경증위험군을 분류하였다. 본 분류기준은 미국의사협회에서 발행하는 전문지인 JAMA의 방법론에 의거하였다 (JAMA May 5, 1999, pp. 1591-97). 본 임상시험의 대상환자가 어느 위험군에 속하는 있는 가를 확인하기 위하여 임상실시자에게 환자들의 병력을 제공하고 환자에 투여되는 약물이 무엇인가를 모르게 하였다. 임상실시자는 상기 언급된 JAMA의 방법론에 따라 대상환자를 적절한 위험군으로 배정하였다. 이에 따른 통계학적 분석에서 중증위험군과 중등증위험군에 속하는 엑시술린드 투여군과 위약군 사이에 있어 평균 PSA 농도에 통계학적으로 유의한 차이가 나타났다. 그 결과를 다음 표 10에 나타내었다.

[ 표 10 ]

상승 PSA를 사용하는 후-전립선에서의 평균 PSA 레벨상의 엑시술린드의 효과

상기 임상시험과 엑시술린드를 투여한 기타 몇개의 임상시험에서 이상반응, 임상검사 (간기능검사, 혈액검사 및 뇨검사), 기초임상 (혈압, 맥박, 호흡수, 체온 및 체중), 신체검사 및 상부 내시경검사를 실시한 결과 엑시술린드의 안전성이 확립되었다.

400명의 환자에게 엑시술린드를 투여한 수개의 임상시험에서 안전성과 관련된 문제는 발생하지 않았다. 엑시술린드를 투여시에 기존의 화학요법제를 투여시에 발생하는 혈액장애, 용량제한적 구토 또는 신경학적이거나 신장독성 등의 부작용이 나타나지 않았다. 또한, 엑시술린드는 기초임상에서도 임상학적으로 유으한 변화를 가져오지 않았다. APC 환자에 있어 결장조직의 폴립발생조직과 정상조직을 한 쌍으로 한 생검에서 엑시술린드는 폴립의 아포프토시스 (apoptosis) 속도를 증가시키므로 정상조직에 대하여 최소한의 영향을 준다는 사실이 밝혀졌다,

엑시술린드의 최대허용량은 subtotal colectomy 환자의 경우 600 mg, 결장수술을 받지 않은 환자의 경우 400 mg, 그리고 소아환자의 경우는 350 mg이었다. 다만, 초기치료시에 간기능 수치가 상승되는 이상반응이 초래되어 용량을 감소시킨 바 있다. 간기능 수치의 상승은 가역적이므로 용량을 감소시에 이상반응은 나타나지 않는다. 경도에서 중등도의 기타 이상반응 (예를 들면, 때때로 위통)의 경우 전형적으로 짧게 나타났으며 이에 따라 엑시술린드의 투여량을 중단하거나 감량시킬 필요는 없었다.

간단히 말해서, 상기 임상결과에 따르면 엑시술린드의 경우 신생물의 이상증식을 임상적으로 처치시에 유효하며 내약성이 우수하고 장기간 치료가 가능하다는 사실을 보여주고 있다. 또한, 상기 임상결과에서 특히 cGMP에 특이적인 PDE 활성을 억제하는 추가 화합물을 선택시에 (본 발명의 기타 선정기준에 적합) 생체내 실험에서 치료학적으로 유효한 결과를 가져왔다.

또한, 작용기전이 알려지기 이전이나 본 발명의 선정기준이 적합유무가 밝혀지기 전에 발명된 추가 화합물은 cGMP 활성을 억제하는 (Z)-5-플루오로-2-메칠-(4-피리디리덴)-3-(N-벤질)인데닐아세타미드 염산염 (화합물 I)이다. 본 화합물은 인체 및 실험실내 실험에서 신생물의 이상증식에 대하여 광범위한 종양효과를 가져온다고 밝혀졌다. 동물실험이나 임상시험의 경우 단일 및 증량요법으로 본 화합물의 안전성은 확립되었다.

이하에 나타낸 자료에 따라 당업계에 종사하는 자가 알 수 있듯이, 상기 화합물 I은 기존의 화학요법제나 항종양효과가 있는 비스테로이드성소염제의 허용량(대부분의 경우 독성을 나타냄)보다 훨씬 증가된 용량으로 동물에게 안전하게 투여할 수 있다. 예를 들면, 랫트를 사용한 급성독성실험에서 상기 화합물 I를 단일용량 (메체로서 0.5% 카복시-메틸셀률로스)으로 2,000 mg/kg을 투여시에 아무런 독성증상이 관찰되지 않았다. 4,000 mg/kg의 용량에서 체중증가가 약간 감소되었다. 1,000 mg/kg의 단일용량으로 투여시에 체중증가가 감소되었으며, 부검시에 약간의 동물에게 장간막유착이 관찰되었다.

개를 사용한 동물실험에서 캡슐제형으로 상기 화합물 I을 1,000 mg/kg의 용량으로 투여시 두마리의 숫컷과 두마리 암컷으로 구성된 단일군에서 아무런 독성증상이 관찰되지 않았다. 캡슐제형인 상기 화합물 I의 특성으로 미루어 상기 용량을 각 동물에게 적어도 13개의 캡슐을 투여하였으며 이 용량은 동물에게 스트레스를 주지 않는 최대용량으로 사료된다. 따라서, 1일 1,000 mg/kg의 용량으로 7회에 걸쳐 연속적으로 동물에게 투여하였다. 개개의 투여단계에서 약물과 관련된 이상반응은 관찰되지 않았다.

따라서, 화합물 I을 단일용량으로 동물에게 투여시에 급성독성은 관찰되지 않았다. 상기 동물실험결과에 따르면, 화합물 I의 경구 LD50은 개의 경우 1,000 mg/kg, 그리고 랫트의 경우 4,000 mg/kg 이상으로 간주되며 복강내 투여시 LD50은 랫트의 경우 1,000 mg/kg 이상으로 간주된다.

랫트를 사용하여 7일간의 걸친 용량설정실험에서 화합물 I을 1일 0, 50, 500 또는 2,000 mg/kg의 용량으로 투여시 1일 50 mg/kg의 용량에서 독성증상이 관찰되지 않았다. 1일 500 mg/kg의 용량을 동물에 투여시 약물과 관련된 효과로 인하여 암컷에게서 절대적이고 상대적인 간의 중량이 상승하였다. 1일 2,000 mg/kg의 용량을 투여시에 관찰된 부작용은 숫컷의 경우 호흡곤란 및/또는 비정상적인 호흡소리, 체중증가 및 사료섭취량의 감소이었으며 암컷의 경우 간중량이 증가하였다. 어느 용량단계에서도 간기능이나 혈액학적 변화, 또는 현미경으로 관찰시 나타나는 병소학적 변화는 관찰되지 않았다.

또한, 랫트를 사용하여 28일간에 걸친 임상시험에서 화합물 I을 하루에 0, 50, 500 또는 2,000 mg/kg의 용량으로 투여하였다. CP-461과 관련된 비정상적 임상증상은 관찰되지 않았으며, 또한 체중변화, 검안경검사, 간기능 및 혈액검사, 그리고 요검사검사에서도 특이한 증상은 관찰되지 않았다. 동물을 부검후 육안적으로 관찰시에 조직변화는 나타나지 않았다. 각 기관의 중량을 조사시에 2,000 mg/kg의 용량에서 간중량이 통계적으로 유의하게 증가되었으며, 상기 용량에서 갑상선 중량이 통계적으로 유의하게 증가되었다. 상기용량보다 낮은 용량에서 통계적으로 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 각 조직에 대한 조직병소학적검사에서 갑상선의 경우 모낭세포의 비대, 유사분열 수의 증가 (가능한 세포증식)가 관찰되었으며, 간의 경우 경도의 소엽중앙부 비대가 나타났다. 일반적으로, 1일 500 mg/kg의 용량을 투여시에 한 마리의 암컷에서 갑상선의 유사분열 수가 증가되었으나, 상기 변화는 1일 2,000 mg/kg의 용량을 투여시 소수의 동물에게 한정되었다. 간에 대한 조사에서 미소체에 존재하는 효소에게 약간 자극을 주어 갑상선호르몬의 대사가 항진되었으며 이로 인하여 갑상선자극이 초래되었다. 따라서, 당업계에 종사하는 자는 상기와 같은 약물효과가 기존의 화학요법제나 비스테로이드성 소염제를 유사한 용량으로 투여시에 나타나는 약물효과보다 극히 작다는 사실을 이해할 수 있을 것이다.

화합물 I의 안전성을 구체적으로 확립하기 위하여 화합물 I에 의해 유도된 전립선암 세포주의 아포프토시스 (apoptosis)를 정상조직으로부터 유래된 전립선 상피세포에 대한 약물효과와 비교할 수 있도록 하는 임상시험을 실시하였다. 안드로겐에 감수성을 나타내는 전립선암 세포주인 LNCaP (ATTC사, Rockville, MD)를 5%소태반혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI 160 배지에 넣고 이를 표준조건하에서 배양시켰다. 정상적 전립선 (클론네틱사, San Diego, CA)에서 유래된 제1차 전립선 상피세포배양물 (PrEC)은 상기 배양물의 성장을 위해 최적화시킨 무혈청 배지를제외한 종양세포주를 사용하면서 동일한 반응조건하에서 성장하게 하였다. 상기 실험을 실시하면서 LNCaP 또는 PrEC 세포주를 웰당 밀도를 10,000개의 세포로 하여 96개의 웰플레이트에 접종하였다. 접종후 24시간 후에 상기 세포를 메체 (0.1% DMSO) 또는 DMSO에 용해시킨 50 ㎛의 화합물 I (유리염기)에 의해 처리하였다. 각 시간별 약물처리 후 (4, 24, 48, 72 또는 99시간), 상기 세포를 용해처리하여 아포프토시스 (apoptosis)에 따른 지표로서 히스톤과 관련된 DNA를 측정하였다 (참조: Piazza et al., Cancer Research 57: 2452-2459, 1997).

제 27도는 50 ㎛의 화합물 I (유리염기)에 의해 처리한 후에 LNCaP 세포주 배양물에서 히스톤과 관련된 DNA의 단편량은 시간이 경과함에 따라 증가하고 있는 것을 보여주고 있다. DNA 단편의 현저한 증가는 24시간에 걸친 약물처리후에 관찰되었다. 이와 대조적으로 PrEC 세포 (정상 전립선)를 화합물 I (50 ㎛)으로 처리시에 4일이상의 약물처리시에도 DNA 단편량은 증가하지 않았다. 상기 결과에 따라 정상세포에 반대가 되는 종양세포내에서 아포프토시스 (apoptosis)의 선택적 유도를 보여주고 있다. 이러한 사실은 빠르게 증식하는 정상세포와 종양세포 모두에게 아포프토시스 (apoptosis) 또는 괴사를 유도하는 기존의 화학요법제와 크게 대조를 이루고 있다.

마지막으로, 약물의 경구투여에 따른 임상시험에서 그 안전성을 조사시에 화합물 I은 항종양효과를 발휘하는데 필요하다고 사료되는 용량을 초과한 어떠한 용량단계에서도 유의적인 이상반응을 나타내지 않았다.

상기에서 설명한 바와 같이, 화합물 I은 강력한 항종양효과를 지니고 있다.화합물 I을 투여하여 얻어진 종양성장억제에 대한 IC50은 SW-480 세포주내에서 0.7㎛이었다. 상기 결과는 암생성의 지표로서 염색체이상 잠재 foci (aberrant crypt foci; ACF)를 사용한 양서류에 대하여 화합물 I의 항종양효과를 평가시에도 확인된 바 있다. 아족시메탄 (azoxymethane; AOM)으로 유도된 암생성에 대하여 양서류를 사용한 상기 동물실험은 생체내에서 결장암 발현에 대한 화합물 I (유리 염기 및 염)의 항종양효과를 평가하기 위한 것이었다. 상기 ACF는 결장종양의 전구체로서 이를 억제하면 화학적으로 예방효과를 가져올 수 있다는 사실을 암시하고 있다.

랫트를 사용한 동물실험에서 ACF가 개시되는 것은 암생성인자를 2주간 연속해서 주입함으로써 일어나게 된다. 상기 ACF가 개시되기 1주일 전과 본 실험기간동안 화합물 I을 투여하였다. ACF는 투여후 5주후에 발견되었다. 사육실에 있는 숫컷 랫트 피셔종 344마리를 대상으로 화합물 I을 경구투여하였다. 1일 사료섭취량 (체중당 mg/kg)은 본 실험기간동안 차이를 두고 공급하였으며 이에 따라 화합물 I의 투여량은 해당 용량을 비교하기 위하여 사료 kg당 그램으로 나타내었다. 화합물 I이 동물의 성장이나 사료에 영향이 있는가를 확인하기 위하여 본 실험기간동안 체중을 측정하였다. 실험동물들은 대조군보다 체중이 감소하였는데 이는 약물의 생체학적이용율을 나타내고 있다. 그러나, 양군간의 체중차이는 10% 미만으로서 ACF 형성에 영향이 없었다.

화합물 1의 유리염기는 ACF 형성을 억제하였는데 이는 콜론당 잠재인자가 감소된 것으로 측정되었기 때문이며 이를 표 11에 요약하여 나타내었다. 저투여군 ( 사료섭취량: 0.5g/kg)을 제외하고 치료군과 대조군 사이의 차이는 유의적인 것이었으며 1.0 및 2.0g/kg의 사료량을 제공하였을 때 통계적으로 유의성을 나타내었다.

[ 표 11 ]

화합물 I에 의해 변형 음와 병소(aberrant crypt foci)의 억제

또한, 화합물 I은 소급하여 본 발명의 선정기준에 적합하며 본 선정기준을 타당성을 입증하는데 사용되는 화합물중의 하나이다. 예를 들면, 상기에서 언급한 임상시험계획서에서 H29 세포 엑기스로부터 cGMP에 특이적인 PDE를 사용시에 cGMP에 특이적인 PDE에 대한 화합물 I의 IC50운 0.68 uM이다. 상기 화합물의 COX I 억제능 (100 ㎛의 경우)은 25% 미만이다.

아포프시스 (apopsis) 친화성과 관련하여 화합물 I의 DNA 단편에 대한 EC50은 15 ㎛이다. 또한, SW-480 세포내에서 화합물 I에 대한 아포프시스(apopsis) 백분율을 각각의 농도에서 표 12에 나타내었다.

[ 표 12 ]

형태학으로 결정된 화합물 I에 의한 SW-480 결장 선암 세포의 HT-29의 아포프토시스 유도

화합물 I의 활성은 결장암 세포주나 결장암을 갖고 있는 동물모델에 국한되지 않는다. 상기 화합물은 여러가지 종양성 세포주에 대하여 광범위한 항종양효과를 나타낸다. 여러가지 형태의 인간 암세포주를 5% 소태반혈청, 2 mM L-글루타민 및 중탄산나트륨을 함유하는 RPMI 1640 배지에 넣고 이를 표준조건하에서 배양시켰다.

상기 화합물 I의 종양세포에 대한 억제효과를 측정하기 위하여 세포주를 웰당 밀도를 1000개의 세포로 하여 96개의 웰플레이트에 접종하였다. 접종후 24시간이 지난 후에 DMSO에 용해시킨 유리염기로서의 화합물 I (최종농도: 0.1%)을 각종 농도에서 세포주에 투여하였다. 종양세포성자에 대한 약물효과는 5일간의 연속투여를 통하여 중성의 적색 세포독성검정법에 따라 측정하였다. 중성의 적색염료는 ATP-의존성 이송기전에 의해 생존해 있는 세포가 이를 선택적으로 흡수한다.

하기 표 13에서 요약한 바와 같이, 화합물 I (유리염기)은 각종의 조직으로부터 유래된 일련의 배양된 인간 세포주에 대하여 시험하였을 때 강력한 종양성장억제효과를 나타낸다. 화합물 I은 세포주로부터 유래된 종양의 조직생성에 관계없이 비교대상이 될 수 있는 종양억제효과를 나타낸다. 모든 세포주에 대한 G150 농도 (매체대조군에 대하여 50%까기 종양성장억제를 시킬 수 있는 약물의 농도)를 계산시에 1-2 uM으로 나타났다.

하기에 나타낸 표 13과 함께 우리들은 화합물 I (염산염)에 대한 인간 백혈병 세포주 (CCRF-CEM, K562 및 Molt4), 골수종 세포주 (RPMI8226), 췌장암 세포주(PAN-1) 및 난소암 세포주 (OVCAR-3)의 감수성을 비교한 바 있다.

[ 표 13 ]

화합물 I에 의한 여러 인체 종양 세포의 증식 억제

동물 및 인체에 대한 안전성과 화합물 1의 매우 광범위한 세포배양효과를 고려할 때 본 발명의 선정기준에 적합한 화합물 (cGMP에 특이적인 PDE를 억제)은 유용한 항종양제로서 사용될 수 있다.

항종양제로서 치료학적으로 유효한 활성을 나타낼 수 있는 cGMP에 특이적인 추가 PDE 억제화합물을 구조적으로 동정하기 위하여 당업계에 종사하는 자는 본 발명에서 열거한 수많은 모델 화합물 (참고문헌에서 열거한 이들의 유사체 포함)이 있으며 동일한 형상을 지니고 있으나 화학적으로 상이한 추가화합물을 컴퓨터 모델링에 대한 기본 화합물로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 몰레큐러 시뮤레이션사에서 발매중인 소프트웨어 (WebLab ViewerProTM)에는 분자투시도와 화학적 교환능이 장착되어 있다. 상기 소프트웨어는 스캐취 상태나 도입된 화학구조의 정확도를 검증하기 위하여 기존의 활성화합물의 3D 투시도를 포함하는 다양한 기능이 있다. 또한, 상기 소프트웨어는 사용자가 정의한 형상에 따라 구조를 임의적으로 조정할 수 있으며, 거리 및 각도나 두개의 평면상을 측정할 수 있다.

이와 같이 기타 활성화합물의 구조가 나타나게 됨으로서 사용자는 상기 소프트웨어를 이용하여 집단분석 및 2D/3D 유사성 검색기법에 따라 본 발명의 선정기준에 의한 검색 및 선정이 가능한 신규한 추가화합물을 동정할 수 있다. 상기 소프트웨어에 의한 방법에 따르면, 그 구조나 비슷하거나 동일한 특성을 갖고 있는 화합물의 경우 유사한 활성을 나타내며 본 발명의 선정기준에 의해 확인될 수 있다는 원칙을 고수하여야 한다.

상기와 같이 추가화합물이 컴퓨터 모델링에 따라 확인되는 경우 상당수의 화합물이나 그 유도체는 제약업계에서 통상의 지식을 갖고 있는 자에 의해서 일반적으로 사용하고 있는 기존의 조합식 화학기법 (combinatorial chemistry techniques)을 사용하여 합성이 가능하다. 상기 조합식 화학기법은 하기 회사로부터 임대가 가능하다: Bothell Washinton 지역의 New Chemical Entities사, 캘리포니아 팔로알토 지역의 Protogen 연구소, 캘리포니아 남부 프란시스코 지역의 Axys사, 마세츄주 Natick 지역의 RBI사 등이 있다. 그 밖에 수많은 임대회사가 있다. 상당수의 제약회사들은 관련 프로젝트를 실시하는 시설을 가지고 있다. 간단히 요약하면 당업계에 통상적인 지식을 가진 자는 검색대상의 수많은 화합물을 용이하게 찾아내어 본 발명에서 열거한 화합물의 특성을 지니는 신생물 이상증식을 치료하는 유망한 화합물을 선택하게 된다. 검색할 수 있는 화합물을 동정하고 본 발명의 선정기준에 맞추기 위하여 선택한 항종양 화합물을 PDE5 단백에 결합시키는 것을 주지하고 있다면 흥미로운 일이 될것이다. 이하에 설명하는 절차에 따라 본 발명의 선정기준에 적합한 화합물을 PDE5의 cGMP 촉매부위에 결합시키는 것이다.

이를 실시하기 위하여 촉매영역을 함유하고 있지 않는 PDE5 서열을 사용하였다. 상기 서열을 형성하는 한가지 방법은 융합단백으로서 그 서열을 발현시키는 것이며, 바람직하게는 글루타치온 S-전환효소 (GST)를 함께 이용하는 것인데 그 이유는 곧 자명해 진다.

RT-PCR 방법은 소의 PDA5A cDNA 서열 (McAllister-Lucas L. M. et al., J. Biol. Chem. 268, 22863-228873, 1993)으로부터 설계된 전방 및 역방 프라이머와 함께 PDE5의 cGB 영역을 획득하는데 사용되며, 또한 PDE 1-10 계열의 5'-3' 중에서 선택하게 된다. mRNA의 올리고 (dT) 컬럼정제법에 따라 전체 RNA에 대한 키트를 HT-29 세포와 함께 사용한다. 전방 프라이머 (GAA-TTC-TGT-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G, 203-227) 및 역방 프라이머 (CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG, 166401686)을 사용하여 인산화부위와 인간 PDE5A (204-1686 bp, cGB-PDE5)의 낮고 높은 친화성을 지닌 cGMP 결합부위를 코딩하는 1484 bp 단편을 합성하게 된다. 상기와 같이 합성된 PDE5 뉴클레오티드 단편은 소의 PDE5A에 대하여 97%의 유사성을 가지고 494개의 아미노산을 암호화하게 된다. 상기 암호화된 PDE5 뉴클레오티드 단편은 탈크 프로모터와 함께 pGEX-5X-3 글루타치온-S-전이효소 (GST) 융합벡터 (파이시아 바이오테크사)로 크론화되며 EcoRI 및 XhoI은 절단부위가 된다. 상기 융합벡터는 대장균 BL21 (DE3) 박테리아 (인비트로젠사)로 형질감염된다. 상기 혈질감염된 BL-21 박테리아는 log 단계에서 성장하며 이어서 IPTG는 유도기로서 추가된다. 상기 유도는 20℃에서 24시간동안 이루워진다. 상기 박테리아를 추출하여 용해시킨다. 용해된 세포용해질은 GSH가 포접된 Sepharose 4B (GSH-Sepharose 4B)에 결합시킬 수 있으며 기타 단백질은 과도하게 냉각시킨 인산완충액에 의해 비드를 세척한다.

발현된 GST-cGB-PDE5 융합단백은 85 Kd 단백으로서 7.5% SDS-PAGE 겔상에 나타나게 된다. 상기 단백은 단백키나제 G 및 A에 따른 cGMP 결합과 인산화반응을 특징으로 한다. 또한, 상기 단백은 두개의 cGMP 결합부위를 나타내며 상기 K_d는 1.6±0.2 ㎛으로서 자연에 서식하는 소의 PDE5가 가지고 있는 Kd = 1.3 uM에 근접하게 된다. GSH가 포접된 세팔로스 (sephalose) 비드에 대한 GST-cGB-PDE5는 cGMP-의존성 단백키나제 및 cAMP-의존성 단백키나제 A에 의해 실험실내에서 인산화될 수 있다. PKG에 의한 GST-cGB-PDE5 인산화반응의 K_M은 2.7 ㎛이며 Vmax는 2.8 uM이다. 그 반면에 BPDE 인산화반응의 K_M은 68 ㎛이다. PKG에 의한 인산화반응는 인산염분자가 1:1의 비율로 GST-cGB-PDE5 융합단백에 포접되고 있음을 보여준다.

관심대상이 되고 있는 화합물에 대한 cGMP 결합정량법 (Francis S.H. et al., J. Biol. Chem. 255, 620-626, 1980)은 5 mM의 인산완충나트륨 (pH = 6.8), 1 mM의 EDTA, 0.25 mg/ml의 BSA, H³-cGMP (2 uM, NEN) 및 GST-cGB-PDE5 융합단백(정량당 30 ug)을 함유하는 전체량이 100 uL로 하여 실시한다. 개개의 실험화합물을³H- cGMP 기질로서 동시에 첨가하고 이 혼합물을 22℃에서 배양시킨다. 상기 배양된 화합물을 여과막으로서 GF/B가 장착된 브란델 MB-24 세포회수기에 옮겨서 10 mL의 냉각된 5 mM 칼륨 완충액 (pH 6.8)을 사용하여 2회 세척한다. 상기 세척된 혼합물의 막을 절단하여 섬광바이알에 옮기고 1 ml의 물과 6 ml의 Ready Safe액이 담긴 섬광혼합물을 각 바이알에 첨가한다. 상기 바이알을 벡크만 LS 6500 섬광계수기에서 계수한다.

이를 계산하기 위하여 결합한 단백질을 5분동안 끓여서 블랭크 샘플을 제조하며 결합된 계수는 비등시키지 않는 단백질과 비교했을 때 1%보다 작다. 여과 막이나 다른 장치에 의해 담굼질함으로써 검정하게 된다.

PDE 억제제로서 설파이드, 엑시술린드, 화합물 B, 화합물 E, E4021 및 자프리나스트 및 환상 뉴클레이티드 유사체로서 cAMP, 환상 IMP, 8-브로모-cGMP, 환상 UMP, 환상 CMP, 8-브로모-cAMP, 2'-O-부틸-cGMP 및 2'-O-부틸-cAMP의 경우 이들이 GST-cGB-PDE5 융합단백의 cGMP 결합부위와 경쟁적으로 결합할 수 있느냐를 시험하기 위하여 선택된다. 그 결과를 제 24도에 나타내었다. cGMP는 특이적으로 GST-cGB-PDE5 융합단백과 결합한다. 환상 AMP, cUMP, 8-브로모-cAMP, 2'-O-부틸-cAMP 및 2'-O-부틸-cGMP는 결합부위에서 cGMP와 경쟁하지 않는다. 환상 IMP와 8-브로모- cGMP는 고농도 (100 um)에서 cGMP 결합부위와 부분적으로 경쟁할 수 있다. PDE5 억제제의 경우 GST-cGB-PDE5 융합단백의 결합부위에 있어서 cGMP와 경쟁하지 않는다. 따라서, 이들 억제제는 PDE5의 cGMP 결합부위와 결합하지 않는다.

그러나, 화합물 E는 PDE5 (즉 피크 A)에 cGMP와 함께 경쟁적으로 결합하지 않는다.

또한, 화합물 E는 PDE에 cGMP와 함께 경쟁적으로 결합한다 (피크 B). 화합물 E는 PDE5의 cGMP 결합부위에 결합되지 않는다는 점을 고려하여 볼때, 화합물 E와 cGMP 사이에 경쟁적인 결합부위가 존재하고 있음으로 화합물 E와 같이 바람직한 화합물은 PDE5 상에서 cGMP의 촉매부위에 결합한다는 사실이며 이는 당업계에서 통상적인 지식을 갖고 있는 자에게 이미 알려진 정보(기존의 경쟁부위실험)이나 다른 화합물을 검색하는데 도움이 될 것이다. 다라서, 본 발명에서 제시한 바람직한 화합물군의 화학구조 및 cGMP 결합부위에 대한 정보를 통하여 당업계에서 통상적인 지식을 갖고 있는 자는 치료용도로서 기타 화학물질을 검색, 동정 및 선택 (본 발명의 선정기준에 준함)할 수 있다.

본 발명에 따라 선택되는 화합물은 제약학적 조성물로서 제제화될 수 있는데, 이는 통상적으로 제약학적 조성물을 가르킨다. 예를 들면, 화합물 (상기 언급한 고형제) 및 약제학적으로 허용가능한 물질로서 고형이나 액상형태, 정맥주사나 복강내 주사, 연고형태의 국소형 투여, 또는 좌약형태로서 직장이나 국소형투여 등을 지칭하고 있다. 이중에서 경구용 제형이 가장 바람직하다.

경구형 제약학적 조성물에 있어 기존에 잘 알려진 약제학적으로 허용가능한 제형으로는 캡슐, 정제, 환제, 산제, 트로키제 및 과립제를 포함한다. 상기 고형제제의 경우 담체로서 자당, 유당 및 전분과 같은 적어도 하나의 희석제를 함유한다. 상기 담체는 통상적으로 마그네슘 스테아레이트와 같은 활탁제를 추가적으로 함유할 수 있다. 캡슐, 정제, 트로키제 및 환제의 경우 담체로서 완충제를 함유할 수 있다. 정제, 환제 및 과립제와 같은 제형은 이들의 표면에 장용성 코팅을 실시함으로써 제조할 수 있다. 또한, 장용성으로 코팅된 화합물은 환자에 투여하기 위하여 정제, 환제 또는 과립제로 압착하여 제조할 수 있다. 장용성 코팅제제는 셀락(shelllac) 또는 유드라짓 S와 같은 결장내 pH에서 용해나 붕해되는 것을 선택할 수 있다.

약제학적 조성물에 있어 약제학적으로 허용가능한 제형은 경구용 액상제형으로서, 예를 들면 약제학적으로 허용가능하고 당업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 유화제, 용액, 현탁제, 시럽, 및 엘릭사제을 들 수 있다. 상기 불활성 희석제외에 해당 조성물은 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미료, 향료 및 방향제를 함유할 수 있다.

정맥주사나 복강내 주사를 위한 약제학적 조성물에 있어 약제학적으로 허용가능한 담체는 통상의 약제학적 식염수를 함유한다.

국소용 투여를 위한 약제학적 조성물의 약제학적으로 허용가능한 담체는 DMSO, 알콜 또는 프로필렌 글리콜 등을 들 수 있으며 피부에 약물이 보존되도록 패취형태나 액상을 유지하는 물질과 함께 사용함으로써 약물이 건조되지 않도록 한다.

직장투여를 위한 약제학적 조성물의 약제학적으로 허용가능한 제형은 좌제로서 본 발명의 화합물 이외에 코코아 버터, 좌제 왁스, 또는 겔을 함유할 수 있다.

본 발명의 약제학적으로 허용가능한 담체와 화합물은 환자에 투여하기 위한 단위제형으로서 약제학적 조성물로서 제제화한다. 단위제형으로서 활성성분의 함량(즉, 본 발명에 따라 선택되는 화합물물)을 다르게 하여 바람직한 투여방법 (즉, 경구 또는 직장투여)에 따라 종양의 이상증식을 치료할 수 있는 활성을 얻는데 유효한 활성성분의 양을 결정하게 된다.

따라서, 선택되는 용량은 투여된 활성화합물의 특성 (예를 들면, 신속히 확인 될 수 있는 IC50), 투여경로, 바람직한 치료기간 및 기타요인을 감안하여 결정한다. 바람직한 경우, 투여용량은 활성화합물에 대한 1일 요구량이 단일 용량이거나 다용량을 분복 (예를 들면, 1일 2∼4회 투여)하여 결정할 수 있다. 정맥투여의 경우 최초용량은 평균 성인남자의 혈중농도에서 IC50이 얻어지는 용량을 기준으로 한다 (즉, 4L). 본 발명에 따라 선택되는 활성화합물의 최초용량은 0.5∼600 mg으로 선택할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 적응증, 사용상의 주의사항을 수재하고 있는 적절한 포장재료 (예를 들면, 설명서)가 삽입된 용기 (예를 들면, 상자나 병 또는 두가지 모두)에 포장하는 것이 바람직하다.

본 발명의 경우 상기에서 설명한 내용에 비추어 변형 및 수정이 가능하다는 점은 명확하다. 따라서, 이하 설명하는 특허청구범위안에서 본 발명이 언급한 사항이외에 다른 사항을 수재할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 포유동물에서 암전구성 및 암성의 예방과 치료에 유용하다.

Claims

약제학적으로 허용가능한 담체와 사이클로옥시게나제(COX) 억제활성을 가지면서 PDE 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하는 신생물의 이상증식을 치료하는 약제학적 조성물에 있어서, 상기 PDE는

가) cAMP에 대하여 cGMP 특이성을 나타내며,

나) cGMP 기질의 존재하에서 양성의 협동성 동력학적 양태를 나타내며;

다) cGMP에 대하여 초미세질량의 친화성을 나타내며; 그리고

라) 정제된 cGMP에 의존하는 단백 키나제와 함께 접종시에 비감수성을 나타내며; 그리고

신생물의 이상증식을 치료하는 화합물로서는 상기 COX 억제활성이 상기 PDE억제활성보다 낮은 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 신생물의 이상증식세포를 배양하여 종양세포성장의 억제활성를 갖는 화합물중에서 선택하며, 또한 신생물의 이상증식을 치료시에 이상증식세포를 억제하는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 2항에 있어서, 종양세포성장을 억제하는 상기 화합물의 활성은 아포프토시스 (apoptosis)의 유도능을 평가함으로서 확인되는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 신생물의 이상증식을 억제하는 활성을 가지면서 PDE 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하는 신생물의 이상증식을 치료하는 약제학적 조성물에 있어서, 상기 PDE는

가) cAMP에 대하여 cGMP 특이성을 나타내며,

나) cGMP 기질의 존재하에서 양성의 협동성 동력학적 양태를 나타내며;

다) cGMP에 대하여 초미세질량의 친화성을 나타내며;그리고

라) 정제된 cGMP에 의존하는 단백 키나제와 함께 접종시에 비감수성을 나타내며; 그리고

마) 신생물의 이상증식을 억제하는 활성을 가지면서 상기 PDE 억제활성을 나타내는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 화합물은 신생물의 이상증식세포내에서 아포프토시스(apoptosis)를 유도하고 그 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하는 화합물을 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 화합물은 COX 억제활성을 가지고 있으며 상기 COX 억제활성이 상기 PDE 억제활성보다 낮은 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 PDE 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하는 신생물의 이상증식을 치료하는 약제학적 조성물에 있어서, 상기 PDE는

가) cAMP에 대하여 cGMP 특이성을 나타내며,

나) cGMP 기질의 존재하에서 양성의 협동성 동력학적 양태를 나타내며;

다) cGMP에 대하여 초미세질량의 친화성을 나타내며; 그리고

라) 정제된 cGMP에 의존하는 단백 키나제와 함께 접종시에 비감수성을 나타내며; 그리고

마) 상기 PDE 억제활성을 나타내는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 화합물은 신생물의 이상증식세포내에서 아포프토시스(apoptosis)를 유도하고 그 아포프토시스 (apoptosis)를 유도능을 가지고 있는 화합물을 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 사이클로옥시게나제(COX) 억제활성을 가지면서 PDE2 억제활성을 갖는 화합물 중에서 선택된 화합물을 포함하고 있으며, 또한 상기 COX 억제활성이 상기 PDE 억제활성보다 낮은 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 화합물은 신생물의 이상증식세포를 배양하여 종양세포성장의 억제활성를 갖는 화합물 중에서 선택하며, 또한 신생물의 이상증식을 치료시에 이상증식세포를 억제하는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 10항에 있어서, 종양세포성장을 억제하는 상기 화합물의 활성은 아포프토시스 (apoptosis)의 유도능을 평가함으로서 확인되는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 신생물의 이상증식을 억제하는 활성을 가지면서 PDE2 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하며, 또한 신생물의 이상증식을 억제하는 활성을 가지면서 상기 PDE 억제활성을 나타내는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 12항에 있어서, 상기 화합물은 신생물의 이상증식세포내에서 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하고 그 아포프토시스 (apoptosis)를 유도능을 가지고 있는 화합물을 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 화합물은 COX 억제활성을 가지고 있으며 상기 COX 억제활성이 상기 PDE 억제활성보다 낮은 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 PDE 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하며, 또한 상기 억제활성을 나타내는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 15항에 있어서, 상기 화합물은 신생물의 이상증식세포내에서 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하고 그 아포프토시스 (apoptosis)를 유도능을 가지고 있는 화합물을 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
사이클로옥시게나제(COX) 억제활성을 가지면서 PDE2 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하고 있으며, 또한 상기 COX 억제활성이 상기 PDE 억제활성보다 낮은 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
제 17항에 있어서, 상기 화합물은 신생물의 이상증식세포를 배양하여 종양세포성장의 억제활성를 갖는 화합물중에서 선택하며, 또한 신생물의 이상증식을 치료시에 이상증식세포를 억제하는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
제 18항에 있어서, 종양세포성장을 억제하는 상기 화합물의 활성은 아포프토시스 (apoptosis)의 유도능을 평가함으로서 확인되는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
신생물의 이상증식을 억제하는 활성을 가지면서 PDE2 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하며, 또한 신생물의 이상증식을 억제하는 활성을 가지면서 상기 PDE 억제활성을 나타내는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
제 20항에 있어서, 상기 화합물은 신생물의 이상증식세포내에서 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하고 그 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하는 화합물을 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
제 21항에 있어서, COX 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하고 있으며, 또한 상기 COX 억제활성이 상기 PDE 억제활성보다 낮은 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
PDE2 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하며, 또한 상기 PDE 억제활성을 나타내는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 화합물은 신생물의 이상증식세포내에서 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하고 그 아포프토시스 (apoptosis)를 유도능을 가지고 있는 화합물을 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
사이클로옥시게나제(COX) 억제활성을 가지면서 PDE 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하는 신생물의 이상증식을 치료하는 약제학적 조성물을 동정함에 있어서, 상기 PDE는

가) cAMP에 대하여 cGMP 특이성을 나타내며,

나) cGMP 기질의 존재하에서 양성의 협동성 동력학적 양태를 나타내며;

다) cGMP에 대하여 초미세질량의 친화성을 나타내며; 그리고

라) 정제된 cGMP에 의존하는 단백 키나제와 함께 접종시에 비감수성을 나타내며; 그리고

신생물의 이상증식을 치료하는 화합물로서는 상기 COX 억제활성이 상기 PDE 억제활성보다 낮은 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물을 동정하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 화합물은 배양물내에서 종양세포의 성장을 억제하는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하고 신생물의 이상증식을 치료하는 화합물 중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물을 동정하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 화합물은 종양세포내에서 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하고 그 아포프토시스 (apoptosis)를 유도능을 가지고 있는 화합물 중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물을 동정하는 방법.
종양의 성장억제활성을 가지면서 PDE 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하는 신생물의 이상증식을 치료하는 약제학적 조성물을 선택함에 있어서, 상기 PDE는

가) cAMP에 대하여 cGMP 특이성을 나타내며,

나) cGMP 기질의 존재하에서 양성의 협동성 동력학적 양태를 나타내며;

다) cGMP에 대하여 초미세질량의 친화성을 나타내며; 그리고

라) 정제된 cGMP에 의존하는 단백 키나제와 함께 접종시에 비감수성을 나타내며; 그리고

종양의 성장억제활성을 가지면서 PDE 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하는 신생물의 이상증식을 치료하는 화합물을 선택하는 방법.
PDE 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하는 신생물의 이상증식을 치료하는 후보화합물을 검색함에 있어서, 상기 PDE는

가) cAMP에 대하여 cGMP 특이성을 나타내며,

나) cGMP 기질의 존재하에서 양성의 협동성 동력학적 양태를 나타내며;

다) cGMP에 대하여 초미세질량의 친화성을 나타내며; 그리고

라) 정제된 cGMP에 의존하는 단백 키나제와 함께 접종시에 비감수성을 나타내며; 그리고

PDE 억제활성을 갖는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하는 신생물의 이상증식을 치료하는 화합물을 검색하는 방법.
제 29항에 있어서, 상기 화합물은 종양세포내에서 아포프토시스 (apoptosis)를 유도하고 그 아포프토시스 (apoptosis)를 유도능을 가지고 있는 화합물 중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 검색하는 방법.
제 29항에 있어서, 상기 화합물은 프로스타글란딘의 합성을 억제하고, 또한 프로스타글란딘의 억제능력이 미미한 화합물 중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 검색하는 방법.
제 29항에 있어서, 상기 PDE 활성은 PDE5 및 신규한 PDE를 함유하는 종양세포주로부터 cGMP에 특이적인 PDE 활성을 분리하여 확인하고, 상기 결합된 PDE 분리물을 신규한 PDE를 억제하지 않는 농도에서 PDE5 억제제에 노출시켜서 PDE5의 활성을 억제하며, 또한 남아있는 cGMP 활성에 대하여 시험화합물의 억제활성을 확인함에 따라 신규한 PDE에 대한 시험화합물의 억제활성이 측정될 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 검색하는 방법.
분리된 포스포에스테라제는,

가) cAMP에 대하여 cGMP 특이성을 나타내며,

나) cGMP 기질의 존재하에서 양성의 협동성 동력학적 양태를 나타내며;

다) cGMP에 대하여 초미세질량의 친화성을 나타내며; 그리고

라) 정제된 cGMP에 의존하는 단백 키나제와 함께 접종시에 비감수성을 나타내는 것을 특징으로 하는 분리된 포스포에스테라제.
제 33항에 있어서, 자프리나스트 및 E4021의 억제활성에 대하여 감소된 감수성을 나타내는 것을 특징으로 하는 분리된 포스포에스테라제.
제 33항에 있어서, 분리된 포스포에스테라제는 음이온교환 크로마토그라피에서 전형적인 PDE5 활성을 나터내는 것으로부터 분리할 수 있는 것을 특징으로 하는 분리된 포스포에스테라제.
제 35항에 있어서, 분리된 포스포에스테라제는 칼슘 및 칼모두린에 의해 현저하게 활성화되지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 포스포에스테라제.
제 36항에 있어서, 분리된 포스포에스테라제는 롤리프람, 빈포세틴 및 인도리단에 비감수성을 나타내는 것을 특징으로 하는 분리된 포스포에스테라제.
약제학적으로 허용가능한 담체와 신생물의 이상증식의 치료에 있어 항종양효과를 가지면서 신생물내에서 PKG 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 38항에 있어서, 상기 화합물은 PDE5를 억제하고 있으며, 또한 상기 PDE5를 억제하는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 38항에 있어서, 상기 화합물은 치료하고자 하는 신생물의 β-카테닌을 감소시키고 상기 β-카테닌을 감소시키는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 38항에 있어서, 상기 화합물은 cGMP에 특이적인 포스포디에스테라제 (PDE)를 억제하고 상기 PDE를 억제하는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 38항에 있어서, 상기 화합물은 PKG 발현능을 증가시키고 상기 PKG 발현능을 증가시키는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 38항에 있어서, 상기 화합물은 PKG 활성을 증가시키고 상기 PKG 활성을 증가시키는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
제 38항에 있어서, 상기 화합물은 PDE2를 억제하고 상기 PDE2를 억제시키는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 치료하고자 하는 신생물의 이상증식을 나타내는 종양세포내에서 PKG 활성을 증가시키는 화합물을 포함하고, 또한 종양세포내에서 PKG 활성을 증가시키고 종양세포내에서 신생물의 β-카테닌을 감소시키는 화합물을 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 신생물내에서 PKG 활성을 증가시키면서 신생물의 성장에 대하여 억제활성을 나타내는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물에 있어서, 신생물내에서 PKG 활성을 증가시키면서 신생물의 성장에 대하여 억제활성을 나타내는 화합물은 정상세포의 성장에 실질적인 장애가 없이 신생물의 이상증식을 억제하는 가능성을 지닌 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 사이클로옥시게나제(COX) 억제활성을 가지면서 종양세포내에서 PKG 활성을 증가시키는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하며, 또한 신생물의 이상증식을 치료시에 상기 COX 억제활성이 PKG 활성의 증가시키는 능력보다 낮은 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식 치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 종양세포의 억제활성을 가지면서 종양세포내에서 PKG 활성을 증가시키는 화합물중에서 선택된 화합물을 포함하며, 또한 종양세포의 억제활성을 가지면서 종양세포내에서 PKG 활성을 증가시키는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 치료하고자 하는 신생물의 β-카테닌이 PKG에 의해 인산화되며 신생물의 이상증식을 치료하는 화합물로서 PKG가 β-카테닌를 인산화시키는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 약제학적 조성물.
신생물의 이상증식을 치료하는 화합물을 선택하는 방법에 있어서, 신생물의 이상증식을 치료하는 화합물이 항종양활성을 가지고 있으며 상기 신생물내에서 PKG활성을 증가시키는 화합물을 포함하고, 또한 항종양활성을 나타내며 상기 신생물내에서 PKG 활성을 증가시키는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
제 50항에 있어서, 상기 화합물은 PDE5를 억제하고 상기 PDE5를 억제하는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
제 50항에 있어서, 상기 화합물은 치료하고자 하는 신생물의 β-카테닌을 감소시키고 상기 β-카테닌을 감소시키는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
제 50항에 있어서, 상기 화합물은 cGMP에 특이적인 포스포디에스테라제 (PDE)를 억제하며 상기 PDE를 억제하는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
제 50항에 있어서, 상기 화합물은 PKG 발현능을 증가시키고 상기 PKG 발현능을 증가시키는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
제 50항에 있어서, 상기 화합물은 PKG 활성을 증가시키고 상기 PKG 활성을 증가시키는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
제 50항에 있어서, 상기 화합물은 PDE2를 억제하고 상기 PDE2를 억제시키는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
신생물의 이상증식을 치료하는 화합물을 선택하는 방법에 있어서, 상기 화합물은 신생물내에서 PKG 활성을 증가시키면서 종양세포내에서 β-카테닌을 감소시키는 화합물을 포함하며, 또한 신생물내에서 PKG 활성을 증가시키면서 종양세포내에서 β-카테닌을 감소시키는 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
신생물내에서 PKG 활성을 증가시키면서 신생물의 성장에 대하여 억제활성을 나타내는 신생물의 이상증식을 치료하는 후보화합물을 동정함에 있어서, PKG 활성을 증가시키고 정상세포의 성장에 실질적인 장애가 없이 신생물의 이상증식을 억제하는 가능성을 지닌 화합물중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 후보화합물을 동정하는 방법.
사이클로옥시게나제(COX) 억제활성을 가지면서 신생물내에서 PKG 활성을 증가시키는 신생물의 이상증식치료용 후보화합물을 동정함에 있어서, 낮은 COX 활성과 PKG 활성의 증가를 나타내는 화합물을신생물의 이상증식을 치료하는 후보화합물로서 선택하는 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 후보화합물을 동정하는 방법.
종양세포의 억제활성을 가지면서 종양세포내에서 PKG 활성을 증가시키는 화합물을 선택하고, 또한 종양세포의 억제활성을 가지면서 종양세포내에서 PKG 활성을 증가시키는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.
치료하고자 하는 신생물의 β-카테닌이 PKG에 의해 인산화되며 신생물의 이상증식을 치료하는 화합물로서 PKG가 β-카테닌를 인산화시키는 화합물을 선택하여서 된 것을 특징으로 하는 신생물의 이상증식치료용 화합물을 선택하는 방법.