KR19980087436A - 신조직 병소를 저해하는 화합물을 확인하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포유류에서 신조직 형성증을 치료하는데 이용할 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 화합물의 포스포디에스테라제 저해 활성은 COX 저해 활성과 함께 측정한다. 배양된 종양 세포에서 성정 저해와 아포토시스(apoptosis; 염증 반응 없이 세포가 죽는 예정된 세포 죽음을 말하는데, 이 경우 세포는 특정 단계에서 죽게 되고 이는 괴사와 대비되는 상태임) 유도 효과도 측정한다. 포스포디에스테라제 저해, 성정 저해, 아포토시스 유도를 하고, 프로스타글란딘 저해 활성이 없은 화합물이 신조직 형성증을 치료하는 능력이 있는 바람직한 화합물이다.
Description
기술분야
본 발명은 포유류에서 암전구증과 암 병소의 치료와 예방에 유용한 화합물을 확인하는 방법에 관계한다. 본 출원은 1997년 5월 30일자 출원된 Piazz et al.,의 미국 특허 출원 08/866,027의 연속출원이다.
배경기술
가족성 선종증육종증(FAP)는 환자의 결장에 거의 대부분 경우 폴립(poly) 또는 선종이 헤아릴 수 없이 많이 포함된 유전성 질환이다. 이와 같은 환자에게서는 상당히 많은 폴립 또는 선종이 발생되는데 이들은 암으로 발전할 가능성이 상당히 크고-이의 일반적인 치료는 결장을 외과적으로 제거하는 것이다. 1983년쯤에, Waddell은 FAP 환자에 비-스테로이드성 항-염증성 약물(NSAID)을 투여하였을 경우에, 결장 폴립(암전구증 병소)을 퇴행시키고 이의 재발을 막는다는 것을 발견하였다. Waddell이 FAP 환자에 설린닥을 사용한 실험에서 몇 가지 연구 내용을 확인할 수 있었다. 불행하게도, 설린닥과 다른 NSAID을 임상적으로 환자에 투여하였을 경우에 환자의 소화계에 상당히 공격적인 영향(신장과 연관된 부작용은 말할 것도 없고 정상적인 혈액 응고를 방해함)을 주기 때문에 FAP 또는 임의 다른 암 또는 암전구증 증상(가령 신조직 형성증) 등 장시간 투여를 요하는 환자에 실제 치료로 이용되지 못했다.
Waddell은 결장 폴립에 설린닥의 작용 기작은 프로스타글란딘(PG)의 합성을 방해하는 것으로 주장하였다(Waddell. W.R. et al., Sulindac for Polyposis of the Colon,Journal of Surgical Oncology, 24:83-87, 1983.). NSAID에 의한 사이클로옥시제나제(COX)의 합성이 저해되어 프로스타글란딘(PG)의 합성이 방해를 받는다. NSAID의 통상적인 장점은 염증을 감소시키고 이는 PG 수준의 감소가 그 원인이라는 것은 알려진 바 있다. NSAID는 PG 합성을 방해하는 COX을 저해하는 것으로 공지되어 있어 결장 폴립의 퇴행은 이와 같은 성질로 인한 것으로 보인다. 사실, 이와 같은 부작용이 최근의 발견에도 불구하고, FAP 또는 임의 다른 암 또는 암전구증 증상 환자에 PG 합성을 저해하는 물질(가령 NSAID)를 투여하여 PG 수준을 감소시켜 병소를 퇴행시키는 것이 통상적인 방법이다.
그러나, 최근의 발견은 완전히 다른 방향으로 과학자들을 유도하였는데- 신조직형성 환자를 성공적으로 치료하기 위해 COX를 저해할 필요가 없다는 것이다. Pamukcu et al.,의 미국 특허 5,401,774에서는 이미 PG 합성 저해물질로써 활성이 없는 것으로 보고된 설포닐 화합물(NSAID 또는 항-염증성 화합물이 아님)이 결장 폴립 세포를 포함하는 다양한 신조직 세포의 성장을 기대이상으로 저해한다는 것이다. 이와 같은 설포닐 유도체는 결장 육종을 가진 쥐 모델에서 효과가 입증되었고, 한가지 변이체(엑시설린드라고 칭함)도 FAP 환자의 인체 예비 임상 실험에서 효과가 입증되었다.
이와 같은 발견은 [그리고 항-신조직 활성과 COX저해와 무관하다는 것은] 상당히 중요하다. 이와 같은 두 가지 현상이 연관되어 있는 경우에 COX저해에 의한 위장 자극과 같은 NSAID의 부작용으로 인하여 FAP 환자의 NSAID 치료가 거의 희망이 없을 것이다. NSAID를 투여하였을 경우에, COX는 저해되고, PG 수준이 감소되고, 위장 자극이 일반적인 결과가 된다. 그러나, 장시간의 NSAID 요법동안에 위장 자극, 출혈, 궤양 등이 가장 흔한 부작용이다. 대부분의 경우에, 이와 같은 심각한 부작용과 다른 치명적인 부작용으로 인하여 NSAID 치료가 중단된다. 따라서, 신조직 병소를 치료하는데 유용한 화합물은 신조직 세포 성장을 저해하면서, COX는 저해하지 않아야 한다.
화합물을 스크리닝하는 통상적인 방법을 이용하여 신조직 세포 성장을 저해하는 개량된 화합물을 발견할 수 있다. 이와 같은 가정 하에, 시험관 모델을 이용하여 약물을 스크리닝할 수 있다. 그러나, 통상적인 스크리닝 방법은 예상하지 못한 문제들로 인하여 동물 모델에서 효과가 없는 것으로 나중에 나타나는 많은 화합물을 통과시키는데 그 중에 하나는 시험과 스크린이 효과를 예상할 수 없다는 것이다. 따라서, 사람에게 테스트하기 전에 화합물을 스크리닝하는데 신조직 형성증을 치료하는데 예상 정보를 제공하는 좀더 정확한 시험관 스크리닝이 필요하다. 사람 암을 저해하기 위한 특정 표적에 대한 지식이 좀더 정확한 효과를 예측하게 하여 동물 테스트전에 좀더 효과적이고 안전한 화합물을 확인할 수 있다.
현재, 임상적으로 유용한 화합물을 확인하기 위해 방법을 개량하는 제약학적 산업에 신약 개발 방법을 적용할 수 있다. 일반적으로, 이상적인 신약 개발 방법은 열쇠와 자물쇠 이론과 연관되는데, 이는 치료요법적 표적 분자(자물쇠)와 제약학적 화합물(열쇠)와의 구조적 관계를 정의하는 것이다. 이와 같은 방법은 표적 분자에 맞는 구조를 확인하는 화합물의 데이터베이스를 가지는 특정 컴퓨터 소프트웨어에 의해 상당히 진전되었다. 불행하게도, 이와 같은 시스템을 이용하기 위해서는 표적 분자(자물쇠)를 인식하여야 한다. 예를 들면, 표적은 효소, 단백질, 막, 핵 수용체 또는 핵산 서열이 될 수 있다.
신조직형성과 같은 복합 질병에서, 과학자들은 가능성이 있는 표적을 확인하였다. 그러나, 신조직형성에 이용할 수 있는 많은 약물이 비-특이적이고 정상조직에도 독성을 가지기 때문에, 암전구증을 예시하지 못하고 이는 신조직 세포가 암으로 진행할 때 사용할 수 있다. 암과 연관된 기작을 좀더 이해하기 위해서는 좀 더 특이적인 항-신조직 약물에 대해 연구해야 하고 이와 같은 약물은 질병 진행 초기 과정에 안전하게 투여할 수 있는 것이어야 한다.
본 발명은 신조직 형성증, 특히 암전구증 병소를 안전하게 치료하고 예방하는 능력을 가지는 테스트 화합물질을 시험관에서 스크리닝하는 신규한 방법에 관계한다. 특히, 본 발명은 COX저해 및 다른 특정 상호작용과 연관된 부작용을 최소로 하면서 암전구증 병소를 포함하는 신조직 형성증을 예방하고 치료하는데 이용될 수 있는 테스트 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 스크리닝 방법은 테스트 화합물에서 COX 저해 활성을 결정하는 것과 관계 있다. 발명자들은 암 저해와 포스포디에스테라제 type-5(PDE5) 이소엔자임(isoenzyme) 저해간에 상관 관계를 밝혔기 때문에, 본 발명은 화합물의 PDE5 저해 활성을 결장하는 것도 포함한다. 적절하게는, 본 발명의 스크리닝방법에는 화합물이 세포 배양물에서 종양 세포의 생장을 저해하는 지를 결정하는 것도 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 스크리닝 방법에는 화합물의 COX 저해 활성을 결정하고, 화합물의 PDE5 저해 활성을 결정하고, 화합물이 종양 세포에서 아포토시스(apoptosis; 염증 반응 없이 세포가 죽는 예정된 세포 죽음을 말하는데, 이 경우 세포는 특정 단계에서 죽게 되고 이는 괴사와 대비되는 상태임)를 유도하는 지를 결정하는 것이다.
이와 같은 방식으로 화합물을 스크리닝함으로써, 과거에 비해 유익하고 개량된 화합물을 좀더 신속하고 좀더 정확하게 확인할 수 있다. 또한, 이 방법의 장점은 다음의 상세한 설명에서 명백해질 것이다.
도 1에서는 정제된 사이클로옥시제나제 활성에서 설린닥(a.k.a. 엑시설린드[exisulind]) 설폰 유도체와 설린닥 설파이드 유도체의 효과를 설명한다.
도 2에서는 COX저해에서 시험 화합물 B와 E의 효과를 설명한다.
도 3에서는 배양된 종양 세포로부터 정제한 PDE-4와 PDE-5에서 설린닥 설파이드와 엑시설린드의 저해 효과를 설명한다.
도 4에서는 HT-29 세포에서 사이클릭 뉴클레오티드 수준에서 설린닥 설파이드의 효과를 설명한다.
도 5에서는 화합물 B의 포스포디에스테라제 저해 활성을 설명하는 것이다.
도 6에서는 화합물 E의 포스포디에스테라제 저해 활성을 설명하는 것이다.
도 7에서는 HT-29 세포의 아포토시스와 괴사에서 설린닥 설파이드와 엑시설린드의 효과를 설명한다.
도 8에서는 DNA 분절화에의해 결정되는 HT-29 세포 성장 저해와 아포토시스 유도에서 설린닥 설파이드와 엑시설린드의 효과를 설명한 것이다.
도 9에서는 화합물 E가 아포토시스를 유도하는 성질을 설명하는 것이다.
도 10에서는 화합물 B가 아포토시스를 유도하는 성질을 설명하는 것이다.
도 11에서는 종양 세포 성장에 설린닥 설파이드와 엑시설린드의 효과를 설명하는 것이다.
도 12에서는 설린닥 설파이드와 기준물질(DMSO)의 성장 저해와 아포토시스-유도 활성을 설명하는 것이다.
도 13에서는 화합물 E의 성장 저해 활성을 설명하는 것이다.
도 14에서는 설린닥 대사물질에의해 쥐 유선(mammary gland) 기관 배양물에서 암전구증-종양, 신조직 병소의 저해를 설명하는 것이다.
본 발명의 방법은 신조직 형성증을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있고, 통상적인 NASID의 심각한 부작용이 없는 화합물을 확인하는데 유용하다.
암과 암전구증은 세포성장이 제어되지 않는 것과 연관된 질병이다. 세포 성장은 여러 가지 다른 인자들이 관여한다. 한 인자는 얼마나 빨리 세포를 증식시키고, 다른 인자는 얼마나 빨라 세포를 죽이는가에 관계한다. 세포는 환경 자극에 따라 괴사(necrosis; 외부 물질 주입 가려으 화학물질 또는 물리적인 작용 등에 의해 세포 막의 파열로 인한 죽음) 또는 아포토시스에 의해 죽을 수 있다. 세포 분화는 종양 성장 역학에 영향을 주는 또 다른 인자이다. 이와 같은 세포 성장에 관한 많은 점들이 테스트 화합물에 의해 영향을 받고 이는 제약학적 요법에 관련 표적을 발견하는데 중요하다. 이와 같은 선택성에 기초한 스크리닝 검사는 성장 저해 활성을 가지는 화합물이 어떤 것인가를 결장하는 테스트와 복합될 수 있다.
본 발명은 몇 가지 중요한 발견에 기초하여 이루어진 것이다. 첫째, 본 발명자들은 바람직한 종양세포 성장 저해 물질이 아포토시스에 의한 암 세포의 조기 죽음을 유도하였다(Piazza G.A., et al.,Cancer Research, 55(14), 3110-16, 1995.). 둘째, 본 발명자들은 실제 COX저해 없이 선택적으로 아포토시스를 유도하는 화합물이 포스포디에스테라제(PDE)도 저해한다는 것이다. 특히, 선두 과학자들의 연구와는 상반되게, 신조직형성 병소를 치료하는 화합물이 포스포디에스테라제 type 5 이소엔자임(PDE5)를 선택적으로 저해한다는 것이다(EC3.1.4.17). PDE5는 적어도 7가지 포스포디에스테라제 이소엔자임중에 하나이다. PDE5는 선택적으로 cGMP를 분해하는 독특한 성질을 가지는데 다른 PDE 형은 비-선택적으로 cAMP를 분해한다. 적절하게는 바람직한 화합물은 다른 포스포디에스테라제 형태를 실제 저해하지 못한다.
본 발명의 적절한 구체예에서는 주어진 화합물의 사이클로옥시제나제 저해 활성을 결정하고, 화합물의 PDE5 저해 활성을 결정하는 것과 연관이 있다. 테스트 화합물은 특정 차단 값을 직접적으로 평가하거나 또는 신조직 병소를 치료하는데 유용한 공지의 화합물에 대해 활성을 비교함으로써 간접적으로 신조직 병소를 치료하는 능력에 대해 평가한다. 위장 자극 없이 신조직 형성 치료에 유용한 것으로 공지된 표준 화합물은 5-플로로-2-메틸-1-(p-메틸설포닐벤질리덴)-3-인델아세트산(엑시설린드) 이다. 비교를 목적으로 다른 유용한 화합물에는 인도메타신, 설린닥의 설파이드 화합물; 5-플로로-2-메틸-1-(p-메틸설포닐벤질리덴)-3-인데닐아세트산(설린닥 설파이드)과 같은 COX를 저해하는 화합물을 포함한다. 비교를 목적으로 다른 유용한 화합물에는 1-(3-클로로아닐린)-4-페닐프탈라진(NY5445)와 같은 PDE5를 저해하는 것으로 공지된 화합물을 포함한다.
테스트 화합물은 COX를 저해하지 않고 엑시설린드와 비교하였을 때 더 나은 효과를 가지는 추천 물질이 될 수 있는 지를 분명하게 결정한다. 일반적으로, 바람직한 화합물은 제약학적 수용 가능한 약량에서 PDE5를 저해하고, 세포 성장을 저해하고, 아포토시스를 유도하며, COX를 저해하지 않는 것이 된다.
여기에서 사용하는 것과 같이, 암전구증 병소는 비정상적인 이형성(displastic), 조직의 변화 등을 포함하는 신조직형성을 가지는 증상을 말한다. 예를 들면, 결장, 유방, 전립선 또는 폐 조직에서 이형성 성장 또는 이형성 신경 증후군, 피부의 악성 흑색종의 전구물질과 같은 질환을 포함한다. 예를 들면, 이형성 신경 증후군에 추가하여, 병소가 임상적으로 확인되었는지에 상관없이 용종 증후군, 결장 폴립, 경(cervix)의 암전구증 병소, 식도, 폐, 전립선 이형성, 전립선 내신조직형성, 유방 또는 피부연관된 질환(가령, 각질증)을 포함한다.
여기에서 사용한 것과 같이, 육종, 암은 암인 병소를 말하는 것이다. 예를 들면, 악성 흑색종, 유방 암, 전립선 암, 결장 암을 포함한다. 여기에서 사용한 것과 같이, 신조직형성 및 신조직증은 암과 암전구증 병소와 염관되는 것이다.
여기에서 사용한 것과 같이, PG는 프로스타글란딘을 말하고; PS는 프로스타글란딘 합성효소를 말하고; PGE2는 프로스타글란딘 E2를 말하고; PDE는 포스포디에스테라제를 말하고; COX는 사이클로옥시제나제를 말하고; RIA는 방사능면역검사를 말하는 약어이다.
여기에서 사용한 것과 같이, PDE5는 cGMP 특이적 가수분해 효소 활성을 가지고 cGMP 결합에 높은 친화력을 가지는 효소 및 이의 동소체형을 말한다.
본 발명의 다른 특징으로는 제약학적 수용 가능한 약량에서 실제 PDE5 저해 활성을 가지는 화합물을 확인하고 이 화합물에 감응성이 있는 신조직증이 있는 치료를 요하는 환자에게 하나이상의 이와 같은 화합물을 투여하는 것으로 신조직 형성을 치료할 필요가 있는 환자를 치료하는 방법에 있다.
스크리닝 과정
다음의 스크리닝 과정은 테스트 화합물에서 신조직 형성증 특히 암전구증 병소를 치료하거나 예방하는 능력을 가지는 지를 결장하는데 유용한 적절한 방법이다.
1. COX저해 활성의 결정
두 가지 방법으로 COX저해를 결정한다. 한 가지 방법은 스크린될 화합물에 HL-60 세포를 노출시켜 PGE2분비를 측정하는 것이다. 다른 방법은 화합물 존재 하에 정제된 사이클로옥시제나제(COX)의 활성을 측정하는 것이다. 이 두 가지 방법은 기존 문헌에 상술된 것과 관계가 있다.
1.A. PGE2분비
본 화합물은 본 기술에 공지된 과정에 따라 프로스타글란딘(PGE2) 생산을 저해하는 지를 평가한다. 예를 들면, Amersham, Arlington, IL, USA애서 구입할 수 있는 PGE2용 효소 면역검사 키트(EIA)를 이용하여 세포로부터 분비된 PGE2를 측정한다. HL-60세포와 같은 PG가 풍부한 세포가 적절하다. HL-60세포는 성숙한 입상세포에서 DMSO로 분화되는 사람 pro-골수세포이다(Collins, S.J., Ruscetti, F.W., Gallagher, R.E. and Gallo, R.C., Normal Functional Characteristics of Cultured Human Promyelocytic Leukemia Cells(HL-60) After Induction Differentiation By Dimethylsulfoxide,J. Exp. Med., 149:969-974, 1979). 이와 같은 분화된 세포는 칼슘 이오노포어 A23187로 자극한 후에 PGE2를 생산한다(Kargman,S.,Prasit, P. and Evans, J.F., Translication of HL-60 Cell 5-Lipoxygenase,J. Biol. Chem., 266:23745-23752, 1991). HL-60 세포는 American Type Culture Collection(ATCC:CCL240)에서 이용할 수 있다. 20% 열 변성된 태아 송아지 혈청, 50U/㎖ 페니실린, 50㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO2하에서 생장시킨다. 골수 분화를 유도하기 위해, 세포는 9일간 1.3% DMSO에 노출시키고 그 다음 3X106세포/㎖농도에서 Dulbecco 인산완충염으로 세척하고 재현탁시킨다.
분화된 HL-60 세포(3X106세포/㎖)는 적절한 농도의 테스트 화합물 존재 하에 37℃에서 15분간 배양한다. 그 다음 세포는 15분간 A23187(5X10-6M)로 자극한다. 전술한 것과 같이 배지 외부로 배출된 PGE2를 측정한다.
1.B 정제된 사이클로옥시제나제
프로스타글란딘 합성을 조절하는 것으로 문헌에는 두 가지 다른 형의 사이클로옥시제나제(COX-1와 COX-2)가 있다고 한다. COX-1은 구성형을 나타내고, COX-2는 유도형을 나타낸다. COX-1 활성은 Mitchell et al.(Selectivity of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs as Inhibitors of Constitutive and Inducible Cycooxygenase,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,90:11693-11697, 1993, which is incorporated herein by reference)가 상술하는 방법에 따라 Boopathy Balasubramanian, Purification And Characterization Of Sheep Platelet Cyclooxygenase(Biochem. J.,239:371, 1988, which is incorporated herein by reference.)에서 상술하는 방법과 동일하게 숫양 정액 담체에서 정제된 COX-1을 이용하여 COX-1 활성을 측정한다. Mitchell et al., 1993에서 상술하는 것과 같이 양 태반으로부터 정제한 COX-2를 이용하여 COX-2 활성을 측정한다.
본 기술에 공지된 방법에 따라 약물의 사이클로옥시제나제 저해 활성을 결정할 수 있다. 가령, Boopathy Balasubramanian, 1988은 프로스타글란딘 H 합성 효소 I(Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan)을 100μM 아라키돈산(sigma chemical Co.,), 공인자(1.0mM 글루타티온, 1.0mM 하이드로퀴논, 0.625μM 헤모글로빈, 1.25mM CaCl2/100mM 트리스-HCl, pH 7.4)와 테스트되는 약물과 함께 37℃에서 2-분간 배양하였다. 배양 후에, 반응은 트리클로로아세트산으로 결정한다. 반응은 티오바르비튜린산과 말론알데히드를 첨가함으로써 반응을 종료시키고 530㎚에서 분관광도를 측정하여 결장한다.
분명한 것은, PDE5 저해 활성에 비해 COX-1 또는 COX-2 저해 활성이 적은 화합물이 바람직하다.
1.C 분석 결과
테스트 화합물 존재 하에 사이클로옥시제나제 활성을 비교함으로써 저해 정도를 결정한다. 약 100μM 농도에서 잔류 또는 COX 저해 활성(약 25%이하)이 없다는 것은 신조직 형성증을 치료하는데 유용한가를 추가로 평가해야 한다는 것을 말한다. 적절하게는 화합물이 가능성이 있는 것으로 보려면 이의 IC50농도는 100μM이상이 되어야 한다.
2. 포스포디에스테라제(PDE5) 저해 활성 측정
HT-29 또는 SW-480과 같은 임의 종양 세포주에서 분리한 효소 또는 제조합 HS-PDE5를 이용하여 포스포디에스테라제 활성에 대해 화합물의 제해효과를 스크리닝하는데 가령 전체 세포에서 사이클릭 뉴클레오티드 수준을 측정하는 것이다.
2.A. 효소 검사
PDE5 효소에 대한 기질로써 방사능 활성3H cGMP(사이클릭 3',5'-구아노신 모노포스페이트)를 이용하여 본 기술에 공지된 방법을 이용하여 포스포디에스테라제 활성을 측정한다(Thompson, W.J., Teraski, W.L., Epstein, P.M., Strada, S.J.,Advances in Cyclic Nucleotide Research,10:69-92, 1979, which is incorporated herein by reference). 간략하면,3H cGMP 방사능 활성 기질 용액(0.2μ M; 100,000cpm; 40mM 트리스-HCl(pH 8.0), 5mM MgCl2, 1㎎/㎖ BSA를 포함)은 총 400㎕가 되도록 테스트할 약물과 혼합한다. 혼합물은 HT-29 세포에서 분리한 부분적으로 정제된 PDE5와 10분간 30℃에서 배양하였다. 75초간 반응 혼합물을 끓여서 반응은 종료시킨다. 얼음에서 냉각시킨 후, 0.5㎎/㎖ 뱀 독(Sigma에서 이용할 수 있는 O. Hannah 독) 100㎕을 첨가하고 30℃에서 10분간 배양한다. 100% 메탄올을 첨가하여 반응을 종료시킨다. 검사 샘플은 음이온 크로마토그래피 칼럼(1㎖ Dowex, from Aldrich)에 얹고 100% 메탄올 1㎖로 세척한다. 신틸레이션 카운터를 사용하여 관퉁한 것과 칼럼에서 세척한 것에서의 방사능활성을 측정한다. 약물 처리된 반응에서의 방사능 활성을 계산하고 기준 샘플(반응 혼합물에 테스트된 화합물이 부족한)과 비교하여 PDE5 저해 정도를 결장한다.
2.B. 사이클릭 뉴클레티드의 측정
또는 PDE5를 저해하는 화합물의 능력은 스크린된 화합물에 노출된 신조직 세포에서 cGMP의 양이 증가하는 것으로 알 수 있다. 방사능면역검사(RIA)를 이용하여 처리된 세포의 추출물에서 cGMP의 양을 검사하여 PDE5 활성의 양을 결정할 수 있다. 이와 같은 과정에서 HT-29 또는 SW-480 세포를 도말하고 합류되도록 생장시킨다. 테스트 화합물은 약 200μM 내지 200pM 농도사이에서 세포 배양물과 배양한다. 약 24 내지 48시간 후에, 세포에서 배양 배지를 제거하고 세포는 가용화시킨다. 반응은 0.2N HCl/50% MeOH를 이용하여 중단시킨다. 단백질 검사를 위해 샘플을 떼낸다. Dowex 칼럼과 같은 음이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 세포의 산/알코올 추출물에서 cGMP를 정제한다. cGMP는 건조시키고, 공지된 과정에 따라 무수 아세트산/트리에탄올아민을 이용하여 아세틸화시킨다(Steiner, A.L., Parker, C.W., Kipnis, D.M.,J. Biol. Chem., 247(4):1106-13, 1971, which is incorporated herein by reference). 유도된 cGMP의 요오드화된 리간드(티로신 메틸 에스테르)는 표준 또는 미지의 항-혈청과 적절한 완충액 존재 하에 배양시킨다. 사이클릭 뉴클레오티드 헵텐 기술을 이용하여 항-혈청을 생산한다. 숙시닐-cGMP-알부민 공액물을 양에 투여하여 항-혈청을 얻고 이는 1/20,000으로 희석하였다. (Seibert, A.F., Thompson, W.J., Taylor, A., Wilbourn, W.H., Barnard, J. and Haynes, J.,J. Applied Physiol.,72:389-395, 1992) 에서 설명한 것과 같이 표준 곡선에서 약량-보간법 및 에러 분석을 사용한다.
또한, 배양 배지는 산성화시키고, -70℃에서 냉동하고, cGMP 와 cAMP에 대해 분석한다.
바람직한 테스트 화합물에 의한 cGMP의 함량의 증가를 관찰하는데 추가하여, cAMP의 감소에 대해서도 관찰한다. 특정 바람직한 화합물은 PDE5 저해와 일치하는 시간 과정을 따랐는데 초기 반응은 수분내에 cGMP 양이 증가되었다. 둘째, 바람직한 테스트 화합물로 신조직을 처리하면 24시간이내에 cAMP 함량이 감소되었다. 약물 작용의 세포내 표적에 대해서는 연구중이나 현재 연구는 cGMP의 초기 증가와 이어서 cAMP의 감소는 화합물에 노출된 신조직 형성 세포의 아포토시스에 선행한다는 개념을 지원한다.
cGMP의 절대 값만을 측정하거나, PDE5 저해만을 측정하거나 또는 cGMP의 절대값만을 측정하는 것보다는 두 가지 사이클릭 뉴클레오티드의 비율에서 변화가 테스트 화합물의 바람직한 PDE5 저해 활성을 평가하는데 더 정확한 도구가 된다. 항-신조직 형성 화합물로 처리안된 신조직 형성 세포에서, cGMP와 cAMP의 비율은 0.03 내지 0.05범위(가령, cGMP는 300-500fmol/㎎단백질, cAMP는 6000-8000fmol/㎎단백질)가 된다. 바람직한 항-신조직 형성 화합물에 노출시킨 후에, cGMP의 양이 증가하고, cAMP의 양이 감소하여 이 비율은 몇 배(적절하게는 약 3배 증가) 증가되었다.
특히, 특정 바람직한 화합물은 처리된 신조직 형성 세포에서 cGMP의 수준에 약 500fmol/단백질㎎ 이상으로 증가되었다. 또한, 특정 바람직한 화합물은 처리된 신조직 형성 세포에서 cAMP의 수준에 약 4000fmol/단백질㎎ 이하로 감소되었다.
cAMP의 양을 측정하기 위해, cGMP에서 상술한 것과 유사한 방사능면역검사 기술을 이용하였다. 기본적으로, 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 세포 산/알코올 추출물을 정제하고, 건조시키고, 공지된 기술에 따라 아세틸화시키고 방사능면역검사 과정을 이용하여 정량 분석한다. 유도된 cAMP 또는 cGMP의 요오도화된 리간드는 특정 항혈청 및 적절한 완충액 존재 하에 표준 또는 미지 조건으로 배양시킨다.
고유 세포에서 사이클릭 뉴클레오티드의 축적 또는 이동을 결정하여 사이클릭 뉴클레오티드의 양을 검사할 수 있다. 고유 세포 cAMP를 측정하기 위해, 공지된 과정에 따라3H-아데닌 프레라벨링을 이용한다(Whalin M.E., R.L. Garrett Jr., W.J. Thomposon, and S.J. Strada, Correlation of cell-free vrain cyclic nucleotide phosphodiesterase activities to cyclic AMP decay in intact brain slices,Sec. Mess. and Phos. Protein Research,12:311-325, 1989, shich is incorporated herein by reference). 과정은 라벨된 ATP와 cAMP의 유동을 측정하고, 이를 이용하여 특정 과정에 따라 고유 세포의 아데닐레이트 사이클라레제 또는 사이클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제 활성을 평가한다. 사이클릭 GMP 축적은 너무 적어서 공지된 과정에 따라 고유 세포 프레라벨리연구에 이용할 수 없다(Reynolds, P.E., S.J. Strada and W.J. Thompson, Cyclic GMP accumulation in pulmonary microvascular endothelial cells measured by intact cell prelabeling,Life Sci.,60:909-918. 1997, which is incorporated herein by reference).
2.C. 조직 샘플 검사
테스트 화합물의 PDE5 저해 활성은 조직 샘플에서 결장할 수 있다. 포유류(적절하게는 쥐) 간과 같은 조직 샘플을 모아서 테스트 화합물에 노출시킨다. 간략하면, 조직 샘플은 6% TCA 500㎕에 균질화시킨다. 균질화물질 일정량을 단백질 분석을 위해 남겨둔다. 나머지 균질화뮬질은 얼음에서 20분간 두어 단백질이 침전하도록 한다. 그 다음, 균질화물질은 4℃에서 15,000g에서 30분간 원심 분리한다. 상청액은 제거하고 펠렛을 회수한다. 각 세척시마다 윗층 에테르 층은 제거한다. 수용성 에테르 추출물은 스피드 백에서 건조시킨다. 일단 건조된 후에, 샘플은 추가 사용을 위해서 냉동시키거나 바로 사용한다. Biotrak EIA 시스템 아세틸화 과정(Amersham, Arlington Heights, IL, USA)을 이용하여 시이클릭 뉴클레오티드 양을 평가하여 PDE5 저해 양을 결정한다. 또는 전술한 RIA 과정을 이용할 수 있다.
2.D. 분석 결과
테스트 화합물 유무하에 PDE5의 활성을 비교하여 저해정도를 결장한다. PDE5 활성을 저해한다면 이 화합물은 신조직 형성증을 치료하는데 유용하다는 것을 나타낸다. 기준이 되는 엑시설린드보다 더 큰 저해 활성 가령 10μM 또는 그 이하에서 50% 이상이 되는 경우에 이 화합물은 항-신조직 형성 성질에 대해 평가될 것이다. 적절하게는, 사용 가능성이 있는 것으로 간주되는 화합물의 PDE5 저해 활성의 IC50값은 50μM이하가 되어야 한다.
3. 화합물이 종양 세포의 수를 감소시키는지를 결정
또 다른 구체예로써, 본 발명의 스크리닝 방법은 화합물이 종양 세포의 생장을 감소시키는 지를 확인하는 것이다. 테스트될 조직에 따라 다양한 세포주가 샘플로 이용되었다. 가령, 이들 세포주에는 다음이 포함된다; SW-480-결장 선암; HT-29-결장 선암, A-27-폐 선암 육종; MCF-7-유방 선암; UACC-375- 흑색종; DU145-전립선 육종.
이들 세포주를 이용한 세포 독성 검사에서는 신조직 형성 병소에 저해 효과가 있음을 나타내고 있다. 이들 세포주들은 특징이 잘 알려져 있고, 미국 국립 암연구소가 새로운 항암제를 위한 스크리닝 프로그램에 사용하는 것들이다.
3.A. HT-29 세포에서 종양 저해
ATCC(Bethesda, MD)에서 수득한 HT-29 사람 결장 육종 세포주를 이용하여 종양 세포 성장을 방해하는 화합물의 능력을 측정하였다. HT-29 세포는 관련 결장 세포 베양물 모델에서 이미 특징이 조사되었다(Fogh, J., and Trempe, G. In: Human Tumor Cells in Vitro, J. Fogh(eds.), Plenum Press, New York, pp. 115-159, 1975). HT-29 세포는 37℃에서, 95% 공기와 5% CO2하에서 5% 태아 혈청(Gemini Bioproducts, Inc., Carlsbad, CA), 2㎜ 글루타민, 1% 항생제 안티마이신이 보충된 RPMI 배지에 유지시킨다. 간략하면, HT-29 세포는 96웰 미량 적정 플레이트에서 화합물을 첨가하기 전에 웰당 500개 세포 밀도로 도말하고, 37℃에서 24시간동안 배양한다. 각 세포 수를 결정하기 위해 6개 씩 반복한다. 배양물에서 6일후에, 세포는 최종 농도가 10%가 되도록 차가운 트리클로로아세트산을 첨가하여 고정시키고, Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J.T., Bokesch, H., Kenney, S., and Boyd, M.R., New Colorimetric Assay For Anticancer-Drug Screening.J. Natl. Cancer Inst.82:1107-1112,1990에서 상술하는 것과 같이, 설포로다민 B(SRB) 발색 단백질 착색 검사를 이용하여 단백질 수준을 측정한다.
SRB 검사에 추가하여, 생장 저해를 측정하는데 이용될 수 있는 다른 방법들도 많은데 이러한 방법 등이 SRB 검사에 대체될 수 있을 것이다. 이와 같은 방법에는 트립판 블루 착색후 살아있는 세포수 측정, BrdU 또는 방사능라벨된 티미딘으로 DNA 합성할 수 있는 세포 라벨링, 살아있는 세포의 뉴트랄 레드 착색 또는 살아있는 세포의 MTT 착색 등을 포함한다.
3.B 분석 결과
100μM 또는 그 이하의 약량에서 50% 이상의 종양 생장 저해는 화합물이 신조직 형성 병소를 치료하는데 유용하다는 것을 나타낸다. 적절하게는, IC50값을 결정하고 이는 비교를 목적으로 이용한다. 이 값은 기준과 비교하여 50% 정도의 종양 세포 성장을 저해하는데 필요한 약물의 농도와 같다. 적절하게는, 신조직 형성 병소를 치료하는데 이용 가능한 화합물의 IC50은 100μM이하가 된다.
4. 화합물이 아포토시스를 유도하는 지를 측정
또 다른 구체예에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 종양 세포 배양물에서 화합물이 아포토시스를 유도하는지를 결장하는 것이다.
세포 죽음의 형태는 형태학적인 기준과 생화학적인 기준에 의해 두 가지 별개의 형태로 설명할 수 있다. 괴사(necrosis)는 혈장 막의 침투성이 증가되고; 세포가 팽창하고 혈장 막이 수분이내에 파열되는 것을 수반한다. 아포토시스는 막 출혈, 세포질 응축, 내생 엔도뉴클레아제의 활성을 수반한다.
두 가지 중에서, 아포토시스가 진핵 세포 죽음에서 가장 흔한 형태가 된다. 이는 정상적인 조직 이동 및 기관과 사지의 배 발생동안에 자연적으로 발생한다. 또한, 방사능 이온화와 특정 화학요법제 약물로 인한 세포독성 T-임파세포와 네츄럴 킬러 세포에 의해 유도될 수 있다. 암, AIDS, 알즈마이어 질환 등을 포함하는 많은 병리학적 조건에서 아포토시스의 부적절한 조절이 중요한 역할을 하는 것으로 간주된다. 전술한 조건에서 유지되는 종양 세포 조직 배양물을 이용하여 아포토시스 유도를 하는 화합물을 스크리닝하였다. 세포를 테스트 화합물로 처리하는 것은 선-합류 또는 후-합류 배양물에서 이루어지고 다양한 농도에서 2 내지 7일간 처리한다. 아포토시스 세포는 배양물의 부착된 부분 및 부유 부분 모두에서 측정한다. 상청액을 제거하고, 부착된 세포는 트립신처리하고 원심분리(10분, 2000rpm) 세척 후에 두 가지 준비물을 복합시켜 두 가지 부분을 수집한다. 아포토시스 상당량을 수득하기 위한 설린닥 및 관련 화합물로 종양 세포 배양물을 처리하는 방법은 문헌에 공지되어 있다(Piazza, G.A., et al.,Cancer Research,55:3110-16, 1995). 신규한 특징은 부유 세포와 부착된 세포를 수집하고, 적절한 처리 시간 및 관찰된 아포토시스에 대한 약량 범위를 확인하고 적절한 세포 배양 조건을 확인하는 것을 포함한다.
4.A. 아포토시스의 형태학적 변화 관찰
테스트 화합물로 처리한 후에, 배양물은 아포토시스에 대한 검사와 아크리딘 오렌지와 에티디움 브로마이드로 라벨링한 후에, 형광 현미경에 의해 괴사에 대해 검사한다. 아포토시스 세포 수를 측정하는 방법은 Duke Cohen, Coligen Morphological And Biochemical Assays Of Apoptosis,Current Protocols In Immunology,Coligan et al., eds., 3.17.1-3.17.16에 상술되어 있다.
가령, 트립신처리하고 PBS에서 3회 세척하여 부유 세포와 부착된 세포를 수득한다. 펠렛은 배지와 PBS에서 준비된 아크리딘 오렌지와 에티디움 브로마이드를 포함하는 염료 혼합물에 재현탁시킨다. 혼합물은 현미경 슬라이드에 두고 검사한다.
4.B. DNA 분절화에 의한 아포토시스 분석
테스트 화합물로 처리한 세포에서 DNA 분절화가 증가되는 것을 측정하여 아포토시스를 정량분석할 수 있다. 세포질 히스톤-관련된 DNA-분절화의 시험과 정량 분석을 위한 상업적으로 이용할 수 있는 광도측정 EIA(모노뉴클레오좀과 올리고뉴클레오좀)을 이용할 수 있다(Cell Death Detection ELISAokys, Cat. No. 1,774,425, Boehringer Mannheim). Boehringer Mannheim 검사는 각각 DNA와 히스톤에 대한 단클론항체를 이용하는 샌드위치-효소-면역검사에 기초한다. 이는 세포 용혈물질에서 세포질 부분에 있는 모노뉴클레오좀과 올리고뉴클레오좀을 특이적으로 측정하도록 한다.
Vendor에 따르면, 다음과 같은 방식으로 아포토시스를 측정할 수 있다. 샘플(세포-용해질)은 스트렙타아비딘-피복된 미량적정 플레이트(MTP)에 둔다. 연속하여, 항-히스톤-바이오틴 및 항-DNA 과산화효소 결합체를 첨가하고, 두 시간 동안 배양한다. 배양 기간 동안에 항-히스톤 항체는 뉴클레오좀의 히스톤 부분에 결합하고 동시에 바이오틴화에 의해 스트렙타아비딘-피복된 MTP에 면역복합체가 고정된다. 또한, 항-DNA 과산화효소 항체는 뉴클레오좀 DNA 성분과 결합한다. 세척단계를 통하여 결합안된 항체를 제거한 후에, 뉴클레오좀의 양은 면역복합체에 있는 과산화효소로 정량화시킨다. 과산화효소는 기질로써 ABTS7(2'2'-아지도-[에틸벤지티아졸린-설포네이트]*)로 광도측정을 하여 결정한다.
예를 들면, SW-480 결장 선암은 웰당 10,000 세포 밀도에서 96-웰 MTP에 둔다. 세포는 테스트 화합물로 처리하고 37℃에서 48시간동안 배양시킨다. 배양후에, MTP는 원심분리하고 상청액은 버린다. 각 웰에 세포 펠렛은 30분간 용해 완충액에서 재현탁시킨다. 용해물은 원심분리시키고 상청액 일부(가령 세포질 부분)은 스트렙타아비딘 피복된 MTP로 전달한다. 용혈된 펠렛(가령 고분자량 분절 안된 DNA를 포함하는 세포 핵)이 MTP에서 흔들리지 않도록 주의한다. 샘플은 분석한다.
아포토시스 반응의 지시자인 폴드 자극(fold stimulation)(FS=ODmax/ODveh)은 주어진 농도에서 각 화합물에 대해 결정한다. 테스트 화합물의 일련의 농도를 평가함으로써 EC50값을 결정할 수 있다.
4.C. 분석 결과
아포토시스의 통계학적인 유의성이 증가한다는 것(가령, 100μM 농도에서 2 배이상 폴드 자극)은 화합물에 신조직 병소를 치료하는데 유용하다는 것을 나타낸다. 적절하게는, 아포토시스 활성에 대한 EC50값은 신조직 병소를 치료하는데 해당 화합물이 유용하다는 것을 말한다. 여기에서 정의하는 EC50값은 담체 치료와 연관된 아포토시스를 50% 유도하는 농도를 의미한다.
5. 평가-유선 기관 배양물 모델 테스트
전술한 방법으로 확인된 테스트 화합물은 유선 기관 배양물 시스템에서 암전구증 병소 발병을 저해하는 능력으로 항-신조직 활성을 테스트한다. 이와 같은 쥐 유선 기고나 배양 기술은 NSAIDs, 레티노이드(retinoids), 탐옥시펜(tamoxifen) 및 다른 자연 생성물과 같은 공지의 항-신조직 형성 물질의 효과를 연구하는 다른 연구자들에 의해 성공적으로 이용된 것들이고 이는 본 발명의 스크리닝 방법의 효과를 평가하는데에도 유용하다.
가령, 암컷 BALB/c 쥐는 시험관에서 호르몬에 반응성이 있는 선에 프라임시키기 위해서 매일 에스트라디올과 프로게스테론 복합물로 처리한다. 동물을 죽이고 흉부 유선은 멸균 상태에서 절제되고, 인슐린, 프로락틴, 하이드로코티손, 알도스테론이 보충된 생장 배지에 10일간 배양시킨다. DMBA(7,12-디메틸벤자안트라센)을 투여하여 전암종양 병소 형성을 유도한다. 완전히 발달된 선에서는 프로락틴, 하이드로코티손, 알도스테론을 제거하여 선이 퇴행하도록 하고 전암 병소는 퇴행하지 않도록 한다.
테스트 화합물은 DMSO에 용해시키고, 배양 기간 배양 배지에 첨가한다. 배양 종료시기에, 선은 10% 포르말린으로 고정시키고, 알룸 카르민(alum carmine)으로 착색시키고, 슬라이드 글라스에 얹는다. 유선 병소를 형성하는 비율은 유선 병소가 있는 선과 병소가 없는 선의 비율이 된다. 테스트 화합물에 유선 병소 발생율은 처리 안된 선과 비교한다.
유선 병소가 차지하는 지역은 지상(digitatin) 패드에 선의 이미지를 투사하여 정량화시킨다. 선에 의해 차지되는 지역은 패드에 남게되고 이는 100% 지역으로 간주한다. 퇴행 안된 구조가 차지하는 공간은 자상 패드에서 나타나고 이는 컴퓨터를 이용하여 정량화할 수 있다.
실험 부분
다수의 테스트 화합물을 다양한 프로토콜에 따라 검사하고 신조직 형성에 유용한 것에 대해 스크리닝한다. 이들 테스트의 결과는 다음과 같다. 이하 테스트 화합물은 문자 코드로 나타내고 이는 다음과 같은 물질이 된다.
A; rac-트레오-(E)-1-(N,N'-디에틸아미노에텐티오)-1-(부탄-1',4'-올리도)- [3',4':1,2]-6-플로로-2-메틸-3-(p-메틸설포닐벤질리덴)-인단;
B; (Z)-5-플로로-2-메틸-1-(3,4,5-트리메톡시벤질리덴)-3-아세트산;
C; (Z)-5-플로로-2-메틸-1-(p-클로로벤질리덴)-3-아세트산;
D;
E; (Z)-5-플로로-2-메틸-1-(3,4,5-트리메톡시벤질리덴)-3-인데닐아세타미드, N-벤질;
H;
실시예 1-COX 저해 검사
단락 1.B의 COX 저해 검사 프로토콜에 따라 이들의 COX 저해 활성을 가준 화합물과 테스트 화합물에 대해서 분석하였다. 도 1에서는 정제된 사이클로옥시제나제(type 1) 활성에서 설린닥 설파이드 또는 엑시설린드의 다양한 농도 효과를 나타낸다. 사이클로옥시제나제 활성은 수컷 정자 담체로부터 정제한 사이클로옥시제나제를 이용하여 전술한 것과 같이 결정한다(Mitchell et al.,). 설린닥 설파이드의 IC50값은 약 1.76μM으로 계산되고, 엑시설린드의 값은 10,000μM보다 컸다. 이들 데이터에서 엑시설린드가 아닌 설린닥 설파이드는 COX-1 저해제인 것을 알 수 있다. COX-2 효소에 대해서도 유사한 데이터를 얻었다(Thompson, et al., Journal of the National Cancer Institute, 87:1259-1260, 1995)
도 2에서는 COX 저해에서 화합물 B와 E의 효과를 나타낸 것이다. 도 1에서 나타낸 화합물에 대해 COX 활성을 결정하였다. 데이터에서는 화합물 B와 E 모두 COX를 저해하지 못하는 것으로 나타났다.
| 기준 물질 100 μM에서 저해도 % |
| 인도메타신 95MY5445 94설린닥 설파이드 97엑시설린드 25 |
| 시험 물질 100μM농도에서 저해도% |
| A 25B 25C 87D 25E 25 |
단락 1.B의 프로토콜에 따르면, 화합물 A 내지 E를 표 1 에서 보고한 바과 같이 COX 저해 활성에 대해 평가하였다. 화합물 C가 100μM 농도에서 COX 저해 활성이 25% 이상 되었고 따라서, 추가 스크리닝에 선택되지 않았다.
실시예 2. PDE5 저해 검사
기준 화합물과 테스트 화합물에 대해 2.A 단락에서 상술하는 프로토콜에 따라 이들의 PDE5 저해 활성을 평가하였다. 도 3에서는 W.J. Thompson et al.,supra에서 상술하는 것과 같이, 사람 결장 HT-29 배양된 종양 세포로부터 정제한 PDE4 또는 PDE5 활성에서 설린닥 설파이드와 엑시설린드의 다양한 농도 효과를 평가하였다. 설린닥 설파이드의 PDE4에대한 IC50값은 41μM이고, PDE5에대한 IC50값은 17μM이다. 엑시설린드의 PDE4에대한 IC50값은 181μM이고, PDE5에대한 IC50값은 56μM이다. 이와 같은 데이터에서 설린닥 설파이드와 엑시설린드은 포스포디에스테라제 활성을 저해한다는 것을 알 수 있다. 이들 두 가지 화합물은 PDE5 동소체 형에 대해 선택성을 나타낸다.
도 4에서는 단락 2.B의 검사과정에따라 배양된 HT-29 세포에서 결정한 것과 같이 cGMP 또는 cAMP 생산에 대한 설린닥 설파이드의 효과를 나타낸다. HT-29 세포는 30분간 설린닥 설파이드로 처리하고, 통상적인 방사면역검사 방법을 이용하여 cGMP 또는 cAMP을 측정한다. 나타낸 바와 같이, 설린닥 설파이드는 EC50값인 7.3μM(최고)의 50% 이상으로 cGMP 수준을 증가시켰다. cAMP의 수준은 공지의 PDE4 저해제, 로리프람(rolipram) 처리에 의해 영향을 받지 않았고, cAMP(최저)은 증가되었다. 이 데이터에서는 PDE4와 연관하여 PDE5 저해가 약리학적으로 중요함을 설명하는 것이다.
도 5에서는 PDE5 또는 PDE4 동소체 포스포디에스테라제에서 테스트 화합물 B의 지적한 약량의 효과를 나타낸다. PDE5에 대한 계산된 IC50은 18μM 이고, PDE에 대한 IC50값은 58μM이다.
도 6에서는 PDE5 또는 PDE4 동소체 포스포디에스테라제에서 테스트 화합물 E의 지적한 약량의 효과를 나타낸다. PDE5에 대한 계산된 IC50은 0.08μM 이고, PDE에 대한 IC50값은 25μM이상 이다.
| 기준 화합물 10 μM에서 저해도% |
| 인도메타신 34MY5445 86설린닥 설파이드 97엑시설린드 39 |
| 테스트 화합물 10μM에서 저해도% |
| A 25B 25C 25D 36E 75 |
표 2의 화합물은 2.A.의 프로토콜에 따라 PDE 저해 활성을 평가하였다. COX를 저해하지 않는 화합물 중에서 10μM 농도에서 50% 이상 저해를 하는 화합물은 화합물 E 뿐이다. 도 11에서 나타낸 것과 같이, 화합물 B는 20μM 농도에서 50% 이상 저해를 나타낸다. 따라서, 단일 약량 테스트에서 이용된 약량 수준에 따라 일부 화합물이 스크리닝되고, 더 높은 약량에서 활성을 가진다. 사용된 약량은 주체가 되고, 이는 활성 화합물이 특정 수준에서 더 강력한 화합물이 된다는 것을 발견된 뒤에 약량이 낮아질 수 있다.
실시예 3. 아포토시스 검사
가준 화합물과 테스트 화합물은 4.A 단락의 프로토콜에 따라 PDE5 저해 활성에 대해 분석하였다. 4.A. 검사에 따라, 도 7에서는 아포토시스와 괴사성 세포 죽음에서 설린닥 설파이드와 엑시설린드의 효과를 나타낸다. HT-29 세포는 설린닥 설파이드 또는 엑시설린드의 약량으로 6일간 처리하였다. Duke and Cohen, In: Current Protocols in Immunology, 3.17.1-3.17.16, New York, John Wiley and Sons, 1992)에 따라 아포토시스 성 세포 죽음과 괴사성 세포 죽음을 결정하였다. 이 데이터에서 설린닥 설파이드와 엑시설린드는 괴사 없이 아포토시스성 세포 죽음을 일으킬 수 있다는 것을 나타낸다. 모든 데이터는 동일한 실험에서 수득한다.
4.B에 따르면, 도 8에서는 DNA 분절에 의해 결정된 것과 같이, 종양 성장 저해와 아포토시스 유도에 설린닥 설파이드와 엑시설린드의 효과를 나타낸다. 상위 도면에서는 엑시설린드에의한 성장 저해(○, 우측), DNA 분절화(■, 좌측). 아래 도면에서는 설린닥 설파이드에 의한 성장 저해(○)와 DNA 분절화(■) 등을 나타낸다. 6일간 처리 후에 SRB 검사로 성장 저해를 결장한다. DNA 분절화는 48시간 처리후에 결정한다. 모든 데이터는 동일 실험에서 수득한 것이다.
도 9에서는 화합물 E의 아포토시스 유도 성질을 나타내는 것이다. 48시간동안 화합물 E의 지정된 농도로 HT-29 결장 선암 세포를 처리하고 DNA 분절화 검사에의해 아포토시스를 결정한다. 계산된 EC50값은 0.05μM이다.
도 10에서는 화합물 B의 아포토시스 유도 성질을 나타내는 것이다. 48시간동안 화합물 E의 지정된 농도로 HT-29 결장 선암 세포를 처리하고 DNA 분절화 검사에의해 아포토시스를 결정한다. 계산된 EC50값은 175μM이다.
| 기준 화합물 100μM에서 폴드 유도 |
| 인도메타신 2.0MY5445 4.7설린닥설파이드 7.9엑시설린드 2.0 |
| 시험 화합물 100μM에서 폴드 유도 |
| A 2.0B 3.4C 5.6D 2.0E 4.6 |
4.B의 프로토콜에 따르면, 상기 표 3에서 보고된 바와 같이 아포토시스 유도 활성에 대해 화합물 A 내지 E를 테스트하였다. 화합물 B, C, E에서는 100μM 농도에서 2.0배 이상의 아포토시스 유도 활성을 나타낸다. 이들 세 가지 화합물 가운데, 이 약량에서 화합물 B와 E만이 COX를 저해하지 않고, PDE5를 저해하였다.
일련의 포스포디에스테라제 저해물질의 아포토시스 유도 활성을 결장한다. 데이터는 하기 표 4에 나타낸다. HT-29 세포는 다양한 포스포디에스테라제 저해물질로 6일간 처리한다. 4.A. 검사 과정에 따라 아크리딘 오렌지와 에티디움 브로마이드 라벨링후에 아포토시스와 괴사의 형태학적 변화를 측정한다. 데이터에서는 PDE5가 HT-29 세포의 아포토시스를 유도하는 화합물을 스크리닝하는데 유용하다는 것을 나타낸다.
| 저해물질 선택성 Apoptosis% 괴사% |
| 담체 8 68-메톡시-IBMX PDE1 2 1밀리논 PDE3 18 0RO-20-1724 PDE4 11 2MY5445 PDE5 80 5IBMX 선택성 없음 4 13 |
실시예 4-성장 저해 검사
3.A. 프로토콜에 따라 PDE5 저해 활성에 대해 기준 화합물과 테스트 화합물을 분석하였다. 도 11에서는 HT-29 세포의 성장에 설린닥 설파이드와 엑시설린드의 다양한 농도 효과를 나타낸다. HT-29 세포는 지적한 바와 같이 다양한 농도의 설린닥 설파이드와 엑시설린드로 6일간 처리한다. Piazza et al.,Cancer Research, 55:3110-3116, 1995 에서 상술하는 바와 같이 설포로다민 검사를 이용하여 세포수를 측정한다. 데이터에서는 설린닥 설파이드와 엑시설린드 모두 종양 세포 성장을 저해할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 12에서는 설린닥 설파이드의 아포토시스 유도 활성와 성장 저해 활성을 나타낸다. 시간 과정 실험에서 담체, 0.1% DMSO(□) 또는 설린닥 설파이드, 120μM(■)로 처리한 HT-29 세포에 관한 것이다. 트립판 블루 착색 후에 살아있는 세포의 수를 헤아려 성장 저해(최고)를 결정한다. Duke and Cohen, In: Current Protocols in Immunology, 3.17.1-3.17.16, New York, John Wiley and Sons, 1992에서 상술하는 것과 같이 아크리딘 오렌지와 에티디움 브로마이드로 착색한 후에 형태학적인 변화를 측정하여 아포토시스(최저)를 결정한다. 데이터에서는 설린닥 설파이드가 종양 세포 성정을 저해할 수 있고 이 효과는 아포토시스가 증가되는 것을 수반한다. 모든 데이터는 동일 실험에서 수집한 것이다.
도 13에서는 화합물 E의 성장 저해 활성을 나타낸 것이다. HT-29 결장 선암 세포는 6일간 화합물 E를 지정한 농도로 처리하고 SRB 검사를 이용하여 세포수를 헤아린다. 계산된 IC50값은 0.04μM이다.
| 기준 화합물 100 μM 농도에서 저해도% |
| 인도메타신 75MY5445 88설린닥 설파이드 88엑시설린드 50 |
| 테스트 화합물 100 μM 농도에서 저해도% |
| A 68B 77C 80D 78E 62 |
3.A. 프로토콜에 따르면, 표5에서 볼 수 있는 것과 같이, 성장 저해 활성에 대해 화합물 A 내지 E를 테스트하였다. 모든 테스트된 화합물은 100μM에서 테스트를 실시한 기준이 되는 엑시설린드보다 우수한 활성을 나타내었다.
일련의 포스포디에스테라제 저해물질의 성장 저해 활성을 측정하였다. 데이터는 아래의 표 6에 나타내었다. 다양한 농도의 포스포디에스테라제 저해물질로 6일간 HT-29 세포를 처리하였다. 3.A 프로토콜에 따라 SRB 검사를 이용하여 성장 저해를 측정하였다. 데이터에서는 PDE5 저해물질이 종양 세포 성장을 저해하는데 효과가 있음을 나타낸다.
| 저해물질 선택성 성장 저해도(IC50,μM) |
| 8-methoxy-IBMX PDE1 200μM밀리논 PDE3 200μMRO-20-1724 PDE4 200μMMY5445 PDE5 5μMIBMX 선택성없음 100μM |
다양한 신조직 형성증에 이와 같은 스크리닝 방법의 효과를 보이기 위해서 다양한 세포주에대해 화합물을 테스트하였다. 다양한 세포주에 설린닥 설파이드와 엑시설린드의 효과를 결정하였다. 데이터는 아래 표 7에 나타내었다. SRB 검사를 이용하여 IC50값을 측정한다. 이 데이터에서는 비교할만한 약량범위에서 다양한 범위의 신조직 형성증에 이들 화합물이 광범위한 효과를 가지는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 확인된 화합물은 다양한 신조직 형성증의 치료에 유용하다.
| 세포형 IC50(μM)조직 특이성 설린닥 설파이드 엑시설린드 |
| HT-29, 결장 60 120HCT116, 결장 45 90MCF7/S, 유방 30 90UACC375, 흑색종 50 100A-427, 폐 90 130기관지 상피 세포(정상) 30 90NRK, 신장(정상) 50 180KNRK, 신장(형질변형된) 60 240사람 전립선 암 PC3 82 |
실시예 5-유선 기관 베양물 모델에서의 활성
도 14에서는 설린닥 대사물질에의해 유선 기관 배양물에서 암전구증 병소의 저해를 나타낸다. 유선 기관 배양물 실험은 Mehta and Moon,Cancer Research,46:5832-5835, 1986)에 따라 실행한다. 결과를 보면 설린닥과 엑시설린드는 암전구증 병소의 형성을 효과적으로 저해하나 설린닥 설파이드는 활성이 없었다. 데이터는 바람직한 화합물의 항-신조직 성질에 사이클로옥시제나제 저해가 필수적인 것이 아님을 뒷받침하는 것이다.
분석
신조직 형성증을 치료할 수 있는 화합물을 확인하기 위해, 본 발명은 몇 가지 프로토콜에서 테스트 화합물의 실험 데이터를 비교하였다. 본 발명의 작업범위내에서, 테스트 화합물은 사람에서 신조직 형성증을 치료하는 능력을 순위로 매긴다. 사람에서 임상실험을 하기 전에 승인을 필요로 하는 좀 더 고가의 그리고 시간 소모가 있는 동물 연구에서 바람직한 효과를 가지는 화합물을 선택할 수 있다.
하기 표 8에는 다양한 테스트 화합물과 몇 가지 프로토콜의 정량적인 데이터를 나타내었다. 데이터에는 엑시설린드, 화합물 B와 E는 COX저해, PDE 저해, 성장 저해. 아포토시스 유도와 같은 네 가지 검사를 스크리닝을 통과하는 적절한 활성을 가지는 것으로 나타났다. 유선 기관 배양물에서 이들 화합물의 활성은 본 발명에 효과가 있음이 증명되었다. 스크리닝 프로토콜의 정성 분석에서 화합물 E가 최고를 나타내었고, 그 다음이 화합물 B, 그리고 엑시설린드가 3번째로 우수하였다.
| 화합물 | COX저해 | PDE5저해 | 성장저해 | apoptosis | 유선기관배양 |
| 엑시설린드 | - | ++ | ++ | ++ | +++ |
| 설린닥설파이드 | ++++ | +++ | +++ | +++ | - |
| MY5445 | ++++ | +++ | +++ | +++ | + |
| A | - | - | +++ | ++ | ++ |
| B | - | +++ | +++ | +++ | ++ |
| D | - | - | ++ | - | - |
| E | - | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ |
| F | - | - | ++ | + | - |
| G | - | - | +++ | ++ | +++ |
| H | - | - | ++ | -_ | - |
| -;활성없음, +;약한활성, ++;중간활성,+++;강한활성, ++++;최대활성 |
분명한 것은, 본 발명의 다양한 변형관 수정이 가능하다. 따라서, 본 발명의 범위은 다음의 청구범위에 한한다.
신조직 병소를 치료하는데 유용한 화합물은 신조직 세포 성장을 저해하면서, COX는 저해하지 않아야 한다.
화합물을 스크리닝하는 통상적인 방법을 이용하여 신조직 세포 성장을 저해하는 개량된 화합물을 발견할 수 있다. 이와 같은 가정 하에, 시험관 모델을 이용하여 약물을 스크리닝할 수 있다. 그러나, 통상적인 스크리닝 방법은 예상하지 못한 문제들로 인하여 동물 모델에서 효과가 없는 것으로 나중에 나타나는 많은 화합물을 통과시키는데 그 중에 하나는 시험과 스크린이 효과를 예상할 수 없다는 것이다. 따라서, 사람에게 테스트하기 전에 화합물을 스크리닝하는데 신조직 형성증을 치료하는데 예상 정보를 제공하는 좀더 정확한 시험관 스크리닝이 필요하다. 사람 암을 저해하기 위한 특정 표적에 대한 지식이 좀더 정확한 효과를 예측하게 하여 동물 테스트전에 좀더 효과적이고 안전한 화합물을 확인할 수 있다.
Claims (32)
- 신조직형성증을 치료할 수 있는 능력이 있는 화합물을 확인하는 방법에 있어서,-화합물의 사이클로옥시제나제(COX) 저해 활성을 측정하고,-화합물의 PDE5 저해 활성을 측정하고,이때, PDE5 저해활성이 높고 COX 저해 활성이 낮은 것은 화합물이 신조직형성증을 치료할 수 있는 능력이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,-화합물이 배양물에서 세포의 생장을 저해하는 지를 측정하고,-종양 세포의 생장을 저해하는 것은 화합물이 신조직 형성을 치료할 수 있는 능력이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 화합물의 COX 저해 활성의 측정은-정제된 사이클로옥시제나제와 화합물을 접촉시키고,-사이클로옥시제나제의 활성에 변화가 있는 지를 측정하고,-100μM 농도에서 약 25%이하의 COX 저해 활성이 있는 것은 화합물이 신조직형성을 치료할 수 있는 능력이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 화합물의 COX 저해 활성은-PGE-2를 분비하는 세포와 화합물을 접하게 하고,-세포로부터 PGE-2 분비가 감소되었는 지를 측정하고,-PGE-2 분비 감소는 프로스타글란딘 활성에서 감소와 상관관계가 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,-화합물에 종양 세포의 아포토시스를 유도하는 지를 측정하고,-아포토시스를 유도하는 경우 화합물이 신조직형성증을 치료할 수 있는 능력이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서,-화합물이 샘플에서 종양 세포 생장을 저해하는 지를 측정하고,-종양 세포 생장을 저해하는 경우에 화합물이 신조직 형성증을 치료할 수 있는 능력이 있음을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서,-화합물과 세포 배양물을 접촉시키고,-세포내 cGMP 농도를 결정하고,-이때, 10μM 농도에서 PDE5의 활성 저해가 50%인 경우에 화합물은 신조직 형성증을 치료하는 능력이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, PDE 활성은-세포내 cGMP/cAMP 농도의 비율을 측정하고,이때, 10μM 농도에서 3배이상 이 비율이 증가된 경우에는 화합물이 신조직 형성증을 치료할 수 있는 능력이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 아포토시스는-화합물과 세포 배양물을 접촉시키고,-화합물이 세포질에서 분절된 DNA를 증가시키는 지를 측정하고,이때, 100μM농도에서 2배이상 아포토시스를 증가시키는 것은 화합물이 신조직 형성증을 치료할 수 있는 능력이 있는 것으로 평가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 신조직형성증을 치료하는데 유용한 화합물을 선별하는 방법에 있어서,-화합물의 성장 저해 활성을 측정하고,-화합물의 PDE5 저해 활성을 측정하고,-성장 저해 활성과 PDE5 자해 활성을 가지는 화합물을 선별하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 성장 저해 활성의 IC50값이 신조직 형성증을 치료하는데 유용한 100μM 이하가 되는 화합물을 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서,-화합물이 세포에서 아포토시스를 유도하는 지를 측정하고,-아포토시스를 유도하는 화합물을 선별하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서,-아포토시스 활성의 EC50값이 100μM이하가 되는 화합물을 선별하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서,-화합물의 COX 저해 활성을 측정하고,-PDE5 활성 저해에 대해 COX 저해 활성이 낮은 화합물을 선별하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 화합물의 COX 저해 활성은-사이클로옥시제나제와 화합물을 접촉시키고,-사이클로옥시제나제의 활성에 변화가 있는 지를 측정하고,-사이클로옥시제나제 활성이 감소된 것은 프로스타글란딘 합성효소 활성에서의 감소와 연관되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14 항에 있어서,화합물의 COX 저해 활성은-PGE-2를 분비하는 세포와 화합물을 접촉시키고,-세포로부터 PGE-2 분비가 감소되었는 지를 측정하고,-PGE-2 분비 감소는 프로스타글란딘 합성효소 활성에서 감소와 상관관계가 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 신조직형성증을 예방하고 만성적인 치료가 필요한 환자에 투여할 수 있는 화합물을 확인하는 방법에 있어서,-화합물의 COX 저해 활성을 측정하고,-화합물의 PDE5 저해 활성을 측정하고,-화합물이 PDE5 저해 활성이 있는 경우에 신조직형성증의 치료를 요하는 환자에 신조직형성증을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, PDE5 동소체를 저해하는 화합물의 선택성이 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 화합물의 성장 저해를 측정하고; 실제 성장 저해 활성을 나타내는 농도에서 COX 저해 활성보다 더 큰 포스포디에스테라제 저해 활성을 가지는 화합물을 확인하는 단계가 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 샘플에서 세포 수의 감소로 성장 저해 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 샘플에서 아포토시스를 유도하는 수준으로 성장 저해 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 아포토시스를 유도하는 수준이 괴사를 유도하는 수준보다 실제 큰 경우 신조직 형성증을 가지는 환자에 이를 치료하는데 사용될 수 있는 화합물을 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 신조직형성증을 치료하는 능력이 있는 화합물을 스크리닝하는 방법에 있어서, 화합물의 PDE5 저해 활성을 측정하고, 예상치보다 더 큰 저해 활성을 가지는 화합물을 선별하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 세포에서 선택된 화합물이 아포토시스를 유도하는 지를 측정하고, 예상치보다 더 크게 아포토시스를 유도하는 화합물을 선별하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 24 항에 있어서, 선택된 화합물이 프로스타글란딘 합성을 저해하는 지를 측정하고, 예상치보다 더 큰 저해 활성을 가진 화합물을 선별하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 24 항에 있어서, PDE5 활성은 세포내 cGMP와 aAMP를 측정하여 결정하고, cGMP에 대해 cAMP의 비율이 증가된 지를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 신조직 형성증을 치료할 수 있는 능력이 있는 화합물을 확인하는 방법에 있어서,-화합물의 COX-1 저해 활성을 측정하고;-화합물의 PDE5 저해 활성을 측정하고;-COX-1 저해 활성이 낮고, PDE5 저해 활성이 높은 것은 화합물이 신조직 형성증을 치료하는 능력이 있다는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 신조직 형성증을 치료할 수 있는 능력이 있는 화합물을 확인하는 방법에 있있어서,-200μM 내지 200pM 농도에서 화합물로 신조직 형성 세포를 처리하고,-처리된 세포에서 세포내 cGMP의 양을 측정하고, 처리된 세포에서 세포내 cGMP의 양을 측정하고,이때, 처리 안된 신조직 형성 세포에서 cGMP/cAMP의 비율과 비교하여 처리된 세포에서 cGMP/cAMP의 비율이 약 3배 증가된 경우에, 화합물은 신조직형성을 치료하는 능력이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 처리된 세포에서 cGMP의 세포내 양이 500fmol/단백질㎎이상인 경우에 화합물이 신조직 형성증을 치료할 수 있는 능력이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 처리된 세포에서 cAMP의 세포내 양이 400fmol/단백질㎎이상인 경우에 화합물이 신조직 형성증을 치료할 수 있는 능력이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 처리된 세포에서 cAMP의 세포내 양이 400fmol/단백질㎎이상인 경우에 화합물이 신조직 형성증을 치료할 수 있는 능력이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 신조직 형성증을 치료하는데 유용한 화합물을 선별하는 방법에 있어서,-화합물의 PDE5 저해 활성과 화합물의 성장 저해 활성을 비교하고,-성장 저해 활성과 PDE5 저해 활성을 나타내는 화합물을 선별하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
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