JP2006503564A - 治療学的処置のための診断マーカー - Google Patents
治療学的処置のための診断マーカー Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006503564A JP2006503564A JP2004544676A JP2004544676A JP2006503564A JP 2006503564 A JP2006503564 A JP 2006503564A JP 2004544676 A JP2004544676 A JP 2004544676A JP 2004544676 A JP2004544676 A JP 2004544676A JP 2006503564 A JP2006503564 A JP 2006503564A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- a3ar
- level
- cell
- cells
- disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
個体の疾病状態の処置において、A3アデノシンレセプター(A3AR)と相互作用する投与薬剤の有効性をモニタするための方法を提供する。生物学的マーカーの少なくとも1つのパラメータのレベルを測定し、処置前の個体におけるパラメータのレベル、または疾病状態を有する未処置の対照被験者におけるパラメータのレベルのいずれかとして測定される、処置を伴わないパラメータのレベルである対照レベルと比較した。対照に対するこれらのパラメータにおける変化のモニタは、A3ARと相互作用する、疾病状態の処置に使用され得るような、スクリーニング薬剤として使用され得る。
Description
発明の分野
本発明は、診断の分野、特に疾病状態に関連し、及び治療学的処置に関連する生物学的マーカーに関する。
本発明は、診断の分野、特に疾病状態に関連し、及び治療学的処置に関連する生物学的マーカーに関する。
先行技術
以下は、本発明の分野における技術の情勢の記載に関係すると考えられる先行技術のリストである。本明細書中でのこれらの文献の確認は、下のリストの括弧内の数字を示すことにより成される。
以下は、本発明の分野における技術の情勢の記載に関係すると考えられる先行技術のリストである。本明細書中でのこれらの文献の確認は、下のリストの括弧内の数字を示すことにより成される。
(1)Olah M.E. 及び Stiles G.L. The role of receptor structure in determining adenosine receptor activity, Pharmacol.There., 85:55-75(2000);
(2)Poulsen S.A. 及び Quinn R.J., Adenosine receptors : new opportunities for future drugs. Bioorg. Med. Chem., 6:619-641(1998);
(3)Frang X 等 Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3 by protein kinase A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:11960-11965(2000);
(4)Fishman, P.,等 Involvement of Wnt Signaling Pathway in IB-MECA Mediated Suppression of Melanoma Cells, Oncogene 21:4060-4064(2002);
(5)Ferkey, D.M.,及び Kimelman. D. GSK-3: New Thoughts on an Old Enzyme, Dev. Biol.,225:471-479(2000);
(6)Bonvini, P.,等 Nuclear beta-catenin displays GSK-3beta- and APC-independent proteasome sensitivity in melanoma cells, Biochim. Biophys. Acta., 1495:308-318(2000);
(7)Olah, M.E. 及び Stiles, G.L, The role of receptor structure in determining adenosine receptor activity, Pharmacol. Ther., 85:55-75(2000)。
(2)Poulsen S.A. 及び Quinn R.J., Adenosine receptors : new opportunities for future drugs. Bioorg. Med. Chem., 6:619-641(1998);
(3)Frang X 等 Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3 by protein kinase A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:11960-11965(2000);
(4)Fishman, P.,等 Involvement of Wnt Signaling Pathway in IB-MECA Mediated Suppression of Melanoma Cells, Oncogene 21:4060-4064(2002);
(5)Ferkey, D.M.,及び Kimelman. D. GSK-3: New Thoughts on an Old Enzyme, Dev. Biol.,225:471-479(2000);
(6)Bonvini, P.,等 Nuclear beta-catenin displays GSK-3beta- and APC-independent proteasome sensitivity in melanoma cells, Biochim. Biophys. Acta., 1495:308-318(2000);
(7)Olah, M.E. 及び Stiles, G.L, The role of receptor structure in determining adenosine receptor activity, Pharmacol. Ther., 85:55-75(2000)。
発明の背景
A3アデノシンレセプターは、Giタンパク関連細胞表面レセプターのファミリーに属する。レセプターの活性化は、その内部移行と、続くアデニル酸シクラーゼ活性、cAMP形成、及びプロテインキナーゼA(PKA)発現の阻害をもたらし、種々のシグナル伝達経路の開始をもたらす(1、2)。PKAは、cAMPを用いる活性化により親分子から解離する触媒サブユニットPKAcを含有する。近年の研究は、PKAcはGSK−3βをリン酸化し、且つ不活化することを証明している(3)。
A3アデノシンレセプターは、Giタンパク関連細胞表面レセプターのファミリーに属する。レセプターの活性化は、その内部移行と、続くアデニル酸シクラーゼ活性、cAMP形成、及びプロテインキナーゼA(PKA)発現の阻害をもたらし、種々のシグナル伝達経路の開始をもたらす(1、2)。PKAは、cAMPを用いる活性化により親分子から解離する触媒サブユニットPKAcを含有する。近年の研究は、PKAcはGSK−3βをリン酸化し、且つ不活化することを証明している(3)。
近年、A3ARに対する安定アゴニストである1−デオキシ−[6[[(3−ヨードフェニル)メチル]アミノ]−9H−プリン−9−イル]−N−メチル−β−D−リボフラ−ニューロンアミンド(nuronaminde)(IB−MECA)が、Wntシグナル伝達経路の鍵成分であるGSK−3β及びβ−カテニンの発現を変化させることが示されている。結果的に、それは細胞周期進行遺伝子であるc−myc及びサイクリンD1の発現の抑制をもたらす(4)(A10における本発明者の補正を参照されたい)。
発明の概要
本発明は、A3アデノシンレセプター(A3AR)のアゴニストが、細胞マーカーの、その発現レベル、リン酸化、及びその細胞局在を含む種々の特性を変化させるという発見に基づく。従って、多くの生物学的マーカーの発現、リン酸化、または局在の変化をモニタすることにより、A3ARモジュレータによる治療学的処置の成功を評価、またはモニタすることが可能である。
本発明は、A3アデノシンレセプター(A3AR)のアゴニストが、細胞マーカーの、その発現レベル、リン酸化、及びその細胞局在を含む種々の特性を変化させるという発見に基づく。従って、多くの生物学的マーカーの発現、リン酸化、または局在の変化をモニタすることにより、A3ARモジュレータによる治療学的処置の成功を評価、またはモニタすることが可能である。
すなわち、本発明は、処置前の個体におけるパラメータのレベルか、疾病状態を有する未処置の対照被験者のパラメータのレベルのいずれかとして決定される、処置を伴わないパラメータのレベルである対照レベルと比較した、生物学的マーカーの少なくとも1つのパラメータのレベルを連続的に、または1以上の予め定めた時点でモニタすることにより、個体の疾病状態の処置におけるA3ARと相互作用する投与薬剤の有効性をモニタする方法に関する。本処置は、個体への、A3ARと相互作用する薬剤の投与から成る。本方法は、
(i)個体への薬剤の投与後に、個体から、疾病状態に関連する細胞または上記細胞を含有する組織のサンプルを、薬剤が上記細胞に到達し、及び作用することを可能にするように選択される時点である予め定めた時点において取り出すこと;
(ii)上記細胞における、A3AR、またはA3ARシグナル伝達経路と関連しA3ARの下流にある要素であるところの少なくとも1つの生物学的マーカーの少なくとも1つの生理学的パラメータのレベルを検出すること;
(iii)上記少なくとも1つのパラメータのレベルと、上記薬剤の投与前の同一の個体に由来する細胞または組織における上記レベルであるか、または未処置の疾病状態を示す上記マーカーに対する標準対象であるところの対照レベルとを比較すること
を含み、ここで、処置された細胞と対照間の生理学的パラメータのレベルにおける差異は、疾病状態の上記処置の有効性を示すものである。
(i)個体への薬剤の投与後に、個体から、疾病状態に関連する細胞または上記細胞を含有する組織のサンプルを、薬剤が上記細胞に到達し、及び作用することを可能にするように選択される時点である予め定めた時点において取り出すこと;
(ii)上記細胞における、A3AR、またはA3ARシグナル伝達経路と関連しA3ARの下流にある要素であるところの少なくとも1つの生物学的マーカーの少なくとも1つの生理学的パラメータのレベルを検出すること;
(iii)上記少なくとも1つのパラメータのレベルと、上記薬剤の投与前の同一の個体に由来する細胞または組織における上記レベルであるか、または未処置の疾病状態を示す上記マーカーに対する標準対象であるところの対照レベルとを比較すること
を含み、ここで、処置された細胞と対照間の生理学的パラメータのレベルにおける差異は、疾病状態の上記処置の有効性を示すものである。
薬剤は、A3ARに対しアゴニスト効果またはアンタゴニスト効果を及ぼす1以上の薬であり得る。IB−MECA、Cl−IB−MECA等のようなA3ARアゴニストである薬剤が、本発明の好ましい態様である。薬剤は、典型的に、A3ARに対するアゴニスト効果、またはアンタゴニスト効果を有する単一の薬であるが、時として、例えば、アゴニストとモジュレータのように、組み合わせて投与される2以上の薬から成り得る。
本発明によれば、「生物学的マーカー」または簡潔に「マーカー」という語は、その最も広い意味で、限られないが、アミノ酸含有化合物(例えば、タンパク、ポリペプチド、またはペプチド)、核酸化合物(例えば、mRNA)、細胞から出されるまたは分泌される、疾病細胞の表面に存在する(例えば、細胞表面レセプター、細胞表面糖タンパク等)か、または細胞内に存在する(例えば、キナーゼ)細胞代謝物質を含む、いずれもの内在性の細胞関連物質を指すと解釈されるべきである。特に、生物学的マーカーは、A3ARのシグナル伝達経路と関連するマーカー、すなわち、A3ARにより媒介されるシグナル伝達と関連することが知られた、または実験的に見出された要素である。例は、PKA、PKB、GSK−3β、β−カテニン、サイクリンD1、及びc−mycを含むWntシグナル伝達経路の要素、並びにPI3K、IKK、IKB、NF−κB、及びTNF−α等のNF−κBシグナル伝達経路の要素である。
「生理学的パラメータのレベル」という語は、以下のうちの1つを指す。
(1)生物学的マーカーのタンパク、またはタンパクフラグメントの量により決定される、または生物学的マーカーのmRNAの量により決定される生物学的マーカーの発現のレベル。このパラメータは、全てのマーカー、すなわち、A3AR、PKA、PKB、GSK−3β、NF−κB、IKK、PI3K、IKK、サイクリンD1、β−カテニン、c−myc、TNF−α等のような、Wnt及び/またはNF−κB経路に関するマーカーに関連する。
(2)生物学的マーカーのリン酸化レベル。このパラメータは、PKB、PKAに、並びに特にGSK−3β及びβ−カテニンに関連する。
(3)生物学的マーカーの細胞局在、例えば、細胞膜対細胞質ゾル(A3ARについて)、細胞質ゾル対核(β−カテニン、NF−κB)における局在。
生物学的マーカーの発現のレベルの検出は、細胞質ゾル若しくは膜のいずれかでの細胞内のタンパク、またはタンパクのフラグメントの存在を検出するための、従来技術において知られている任意の手法により、及び細胞質ゾル若しくは膜のいずれかでの細胞内の、または細胞の任意の細胞間成分におけるタンパク、またはタンパクのフラグメントの存在を検出するための、従来技術において知られている任意の手法を用いるmRNAの検出のための手法により、及び細胞の任意の成分におけるmRNAレベルの検出のための手法により行われる。
タンパクのレベルを検出するための方法は、例えば通常技術の溶解、消化、分離、分取、及び精製手法を用いることによる、細胞のタンパク内容物の抽出、または細胞の膜からの、若しくは細胞質ゾルからのタンパクのフラグメントの抽出、並びにウエスタンブロット上での細胞のタンパク内容物(未精製内容物または精製された内容物のいずれか)の分離、その後の、従来技術において知られている種々の同定手法によるタンパクまたはタンパクフラグメントの検出を包含し得る。例えば、ゲル上に分離された内容物は、タンパク同定手法と共に適切な分子量マーカーを用いることにより、または適切な検出部位(標識された抗体、標識されたラクチン、標識された結合剤(アゴニスト、アンタゴニスト、基質、補助因子、ATP等)を用いることにより同定され得る。検出は、インサイチュ、すなわち、全組織サンプル中で、損傷を受けていない細胞内または組織内に存在する生物学的マーカーに、特異的な認識剤を結合させることによるものであり得る(本発明に関しては、特にA3ARのレベルの測定に関して適切である)。このような特異的な認識剤は、標識されたIB−MECAのような標識されたA3ARアゴニスト、標識されたMRS1523のような標識されたA3ARアンタゴニスト、A3ARに対する抗体であり得る。標識された認識部位の存在は、ラベルの性質に適した手法を用いて検出され得る。認識剤が、蛍光標識されている場合、検出は、共焦点顕微鏡を用いて(膜に)結合したラベルのレベルを直接的に見ることにより行われ得る。認識剤が標識されている、例えば、放射標識されている場合、レベルは、細胞内の放射標識レベルの決定により測定され得る。
発現レベルの測定は、mRNAレベルの測定でもあり得、例えば、検出は、検出可能なプローブ、例えば検出可能な部位(蛍光、放射性、色素胞部位等)を含む相補的な配列とのインサイチュハイブリッド形成を用いることによる等の、細胞含有サンプルにおけるRNA検出のための従来技術において用いられる任意の方法であり得る。インサイチュハイブリッド形成のような場合において、細胞からRNAを抽出する必要は全くなく、必要とされることは、細胞を多孔性にする処置のみである。しかしながら、微量のRNAを検出するに十分感度の高い種々の増幅方法も好ましい。このような方法は、PCR、RT−PCR、インサイチュPCR、インサイチュRT−PCR(上記の全ては、「ネステッド」PCR、及びネステッドRT−PCRをも指す)、LCR(リガーゼ連鎖反応)、及び3SR(自立性配列複製)を含む。好ましい態様によれば、RT−PCR及びネステッドRT−PCRが用いられる。増幅生成物は、ゲル上で分離し、適した標識されたプローブを用いる検出による等の、従来技術において用いられる方法により確認される。
サンプルは、例えば生検により得られた組織サンプルの膜、組織サンプルから分離された無傷の細胞、または血液、若しくは任意の他の体液中のような循環中に存在する無傷の細胞、パラフィン包埋された組織サンプルを含む被験者から得られた細胞若しくは組織サンプル、細胞質ゾル、細胞膜、核、若しくは任意の他の細胞成分から得られた、抽出されたタンパク、または核若しくは細胞質ゾルから得られたmRNAであり得る。
生理学的パラメータが、例えば、マーカーのリン酸化レベルである場合、これは、標識された抗チロシン抗体のような、リン酸化された物質に対する標識された抗体、またはリン酸化されたGSK−3βと結合する能力がある抗体を用いることにより決定され得る。
試験されるパラメータのレベルが、種々の細胞成分における局在である場合、各区画におけるマーカーの量、または種々の成分における量の比率が測定され得る。これは、細胞成分を分離すること(例えば、細胞を溶解し、且つ膜と細胞質ゾルとを別々に得ること)、または細胞質ゾルと核とを別々に得ること、及び上記した方法のいずれか1つ、若しくはタンパク含有量を測定するに用いられる他の方法を用いることにより、各々分離された細胞成分における関連する生物学的マーカーのタンパク含有量を測定することにより行われ得る。
あるいは、A3AR局在を測定するために、標識されたA3AR結合剤(抗体、アゴニスト、アンタゴニスト)、特に蛍光標識された結合剤を用い、例えば共焦点顕微鏡を用いて、細胞の表面上のA3ARの局在をモニタすることが可能である。
一般的に、生理学的パラメータは、対照と比較すると2つの様式のうちの1において変化しうる。すなわち、薬(好ましくはA3ARモジュレータ、最も好ましくはA3ARアゴニスト)の投与等の処置の結果として、高められた増殖を示す変化(本明細書中では以後「プロ−増殖」とする)、または薬の投与等の処置の結果として、低下した増殖を示す変化(本明細書中では以後「アンチ−増殖」とする)である。
処置のアンチ−増殖効果を示す変化の例:
(1)発現レベルにおいて:A3AR、PKB/Akt、PKA、β−カテニン、c−myc、サイクリンD1、NF−κB、若しくはTNF−αのタンパク若しくはmRNA発現の低下、またはGSK−3βのタンパク若しくはmRNAレベルの上昇、
(2)リン酸化レベルにおいて:GSK−3βのリン酸化レベルの低下、PKB/Akt及びPKAのリン酸化レベル並びにβ−カテニンのリン酸化レベルの上昇、
(3)局在において:対照と比較して細胞膜におけるA3ARレセプターの局在の低下、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニンの局在の低下。細胞質ゲルと比較して核内のNF−κBの局在の低下。
(1)発現レベルにおいて:A3AR、PKB/Akt、PKA、β−カテニン、c−myc、サイクリンD1、NF−κB、若しくはTNF−αのタンパク若しくはmRNA発現の低下、またはGSK−3βのタンパク若しくはmRNAレベルの上昇、
(2)リン酸化レベルにおいて:GSK−3βのリン酸化レベルの低下、PKB/Akt及びPKAのリン酸化レベル並びにβ−カテニンのリン酸化レベルの上昇、
(3)局在において:対照と比較して細胞膜におけるA3ARレセプターの局在の低下、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニンの局在の低下。細胞質ゲルと比較して核内のNF−κBの局在の低下。
処置のプロ−増殖効果を示す変化は、
(1)発現レベルにおいて:A3AR、PKB/Akt、PKA、β−カテニン、c−myc、サイクリンD1、及びNF−κBのタンパクまたはmRNA発現の上昇、またはGSK−3βのタンパクまたはmRNA発現レベルの低下、
(2)リン酸化において:GSK−3βのリン酸化レベルの上昇、PKB/Akt及びPKAのリン酸化レベル、並びにβ−カテニンのリン酸化レベルの低下、
(3)局在において:対照と比較して細胞膜内のA3ARレセプターの局在の上昇、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニン及びNF−κBの量の増加
を含む。
(1)発現レベルにおいて:A3AR、PKB/Akt、PKA、β−カテニン、c−myc、サイクリンD1、及びNF−κBのタンパクまたはmRNA発現の上昇、またはGSK−3βのタンパクまたはmRNA発現レベルの低下、
(2)リン酸化において:GSK−3βのリン酸化レベルの上昇、PKB/Akt及びPKAのリン酸化レベル、並びにβ−カテニンのリン酸化レベルの低下、
(3)局在において:対照と比較して細胞膜内のA3ARレセプターの局在の上昇、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニン及びNF−κBの量の増加
を含む。
低下した増殖を示す変化は、増殖の低下または抑制により治療上有益な効果が明らかであり得る疾病状態の処置のために投与されるA3ARモジュレータ、好ましくはA3ARアゴニストの有効性を示す。過剰の増殖により典型的に特徴づけられるこのような疾病の例は、限られないが、全てのタイプのガン;特に全てのタイプの固形腫瘍;皮膚増殖性疾病(例えば乾癬);種々の良性の増殖性疾患;炎症性疾病等を含む。
「固形腫瘍」という語は、ガン、肉腫、腺腫、及び神経細胞の起始部のガン、並びに実際は、造血細胞から生じるものでない全てのタイプのガンを指し、特に、ガン、肉腫、腺腫、肝細胞ガン、肝細胞ガン、胚芽腫、横紋筋肉腫、食道ガン、甲状腺ガン、神経節芽腫、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、骨膜腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、ラブドテリオ肉腫(rhabdotheliosarcoma)、結腸ガン、膵臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、腺ガン、腎細胞ガン、血腫、胆管ガン、黒色腫、絨毛ガン、精上皮腫、胎生期ガン、ウィルムス腫、子宮頚ガン、睾丸腫瘍、胚ガン、小型肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽腫、多発性骨髄腫、直腸ガン、甲状腺ガン、頭頸部ガン、脳腫瘍、末梢神経系ガン、中枢神経系ガン、神経芽腫、子宮内膜ガン、及び上記の転移に関する。本発明に従えば、A3ARの上昇した発現は、原発腫瘍部位のみならず、それらの転移において見受けることができることが明らかにされている。
良性の増殖性疾病は、限定されないが、良性の前立腺過形成(BPH)、消化管、子宮等における非腫瘍性ポリープを含む。
炎症性疾病は、限られないが、慢性関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症等を含む。本発明に従えば、その場所にある炎症性細胞は、炎症性細胞の様相を呈し、時として、リンパ節の排出時の炎症性細胞の様相を呈すること、並びにA3AR発現の増加、従って生理学的パラメータの特徴的な変化が、そのような細胞内で見出されることが見出された。
疾病がガンである場合、被験者から得られた細胞は、ガン化されたと疑われる細胞、及び好中球のような特に血球である他の細胞であり得る。ガン化されたと疑われる細胞を、生検、針生検、細針吸引等によるような「疑わしい」細胞を得るための既知の方法により得ることができ、疾病状態であるということの疑いは、種々の画像化(NMR、MR、スキャニング、超音波、メモグラフィック(memographic))、または病理学的な技術によって招かれ得る。血球は、血を抜くことにより単純に得られ得る。
高められた増殖性を示す変化は、治療上有益な効果が、高められた増殖により明らかであり得る疾病または状態の処置のために投与される薬(好ましくは、A3ARモジュレータ、最も好ましくはA3ARアゴニスト)の有効性を示す。これらの状態は、典型的に、損傷(傷害、虚血、低酸素)の結果としての通常の細胞死、または有害物質の投与の結果としての通常の細胞死、または化学療法もしくは放射線治療の過程中で施された物質若しくは放射線のような、有毒な処置の結果としての通常の細胞死の状態である。特にこの語は、骨髄保護療法の効果、すなわち化学療法または放射線治療に続く、好中球、及び他の白血球の数の減少の防止に関する。
A3ARと相互作用する薬剤は、A3ARアゴニストまたはA3ARアンタゴニストであり、好ましい態様に従えば、A3ARアゴニストである。
「A3AR関連シグナル伝達経路」という語は、A3ARレセプターによる活性化により開始され、その末端エフェクターの効果により継続する任意の経路に関する。これらのエフェクターは、Wnt経路及びNF−κB経路の要素を含んでいると今日知られているが、さらなる要素がしばしば発見されており、この語はこのような新しく発見された要素と、新しく発見されたA3AR活性化に関する経路をも包含する。
本発明に従って試験されたサンプルは、処置された被験者から得た細胞サンプル、組織サンプル、または細胞構成成分(例えば、細胞膜または細胞性成分)を指す。1つの態様によると、サンプルは、疾病を示すと知られている細胞であって、例えば、疾病はタイプXのガンであり、細胞はガン(乳房、結腸、皮膚、肝臓、肺、細胞等)、または上記の転移の組織の細胞である。他の態様によると、サンプルは、例えば好中球である、血液から得られる細胞のような無病の細胞であり得る。
低下した増殖により有効性が示される「疾病状態」は、腫瘍、特に固形腫瘍を含み、固形腫瘍の例は、黒色腫、結腸ガン、前立腺ガン、肝ガン、乳ガン、膵臓ガン、及び乾癬のような皮膚増殖性疾病である。
高められた増殖により有効性が示される疾病状態は、特に、化学療法または放射線治療の結果として、好中球のような白血球の血球カウントが増加する疾病である。
上記の方法の1つの利用に従って、細胞における生物学的マーカーの少なくとも1の生理学的パラメータのレベルのモニタは、疾病状態の治療のための候補者を、A3ARとの相互作用を通してスクリーニングすることにも役立ち得る。特定の例は、ガンまたは炎症性疾病の治療のためのA3ARアゴニストである。
例えば、疾病状態、例えば、治療のための目的とする標的であるガンのタイプに由来するガン細胞の特定の系の細胞培養を用いることが可能である。上記生理学的パラメータの1以上の変化の測定は、ガンの処置における薬候補の考えられる使用の指標として役立ち得る。
本発明に従えば、薬投与、及びそれに細胞を曝露することに続いて起こる、A3ARモジュレータ、及び特にA3ARアゴニストの投与後の、種々の生物学的マーカーの発現レベルにおける、または細胞局在における、薬が誘発する変動があることが見出された。これは、例えばA3AR−モジュレータ投与の結果として、特定のマーカーのタンパク量が減少した場合、この減少は、A3ARモジュレータ投与後X分で最も顕著になり得、一方2X分後には、減少は、顕著さが低下し得、及び3X分後には減少が再び顕著に成り得る。この変動的な挙動(典型的に洞様毛細血管様のパターン)は、殆どの生物学的マーカーのタンパクレベル、及びA3ARレセプターそれ自身の細胞膜上での局在を特徴づける。パラメータのレベルの変化が、対照と比較して最も顕著である投与後のある時間において、本発明の方法を行うことが最も好ましいことは明らかである。
従って、本発明の方法を行う前に、生理学的パラメータの変化が対照と比較して最も顕著である、薬の投与後の最適な時間を確立するために、予備的な測定を行うことが重要であり得る。これは、薬を投与すること、及び生理学的パラメータ(インビトロ、インビボ、最も好ましくは投与後の多数の異なる時間においてサンプルが得られる多くの被験者 における変動をモニターすること、及び処置されたサンプル(細胞、組織等)におけるパラメータ間の差異が、未処置の対照と比較して最も大きい期間を測定のための時間として選ぶことにより達成され得る。
本発明を理解し、及びどのように実際に行われたのかを確認するために、好ましい態様を、限定されない例としてのみ、添付の図面と参照しながらここに記載する。
発明の詳細な記述
本発明は、A3ARとWntシグナル伝達経路及びNF−κBシグナル伝達経路間のクロストークが存在するという発見に基づく。A3AR活性化は、PKA及びPKB/aktを抑制し、それによりGSK−3βをその活性非リン酸化型に保つことが、細胞内で見出された(4)。活性(非リン酸化)GSK−3βは、β−カテニンをリン酸化及び不活化し、核へのその移動を排除し、結果としてc−myc及びサイクリンD1のダウンレギュレーションを誘発し(5)、細胞の低下した増殖をもたらすことが示された。
本発明は、A3ARとWntシグナル伝達経路及びNF−κBシグナル伝達経路間のクロストークが存在するという発見に基づく。A3AR活性化は、PKA及びPKB/aktを抑制し、それによりGSK−3βをその活性非リン酸化型に保つことが、細胞内で見出された(4)。活性(非リン酸化)GSK−3βは、β−カテニンをリン酸化及び不活化し、核へのその移動を排除し、結果としてc−myc及びサイクリンD1のダウンレギュレーションを誘発し(5)、細胞の低下した増殖をもたらすことが示された。
NF−κB経路において、PKB/AKTレベルの低下は、IKK及びNF−κBのダウンレギュレーション、これは後者の、そのIKBとの錯体からの放出及びその核への移行を妨げるが、をもたらし、従って、核へのNF−κBのトランスロケーションを防止し、サイクリンD1およびc−mycの転写の低下した誘発を招き、増殖の低下をもたらす。NF−κBは、TNF−αの転写因子でもあり、従って、NF−κBのダウンレギュレーションは、このサイトカインのダウンレギュレーションをももたらす。
例えば黒色腫、結腸ガン、前立腺ガンを含む腫瘍、及び他の腫瘍細胞におけるような増殖性の疾病において、未処置の事のなりゆきは、リン酸化されたGSK−3βが、β−カテニンをリン酸化できずに、従ってこれは細胞質ゾル中に蓄積することを含むプロ−増殖方向における生物学的マーカーの生理学的パラメータにおける変化により明らかにされる。その後、核に転移し、サイクリンD1及びc−mycの転写を誘発し、細胞周期進行をもたらす(6〜7)。生物学的マーカーの生理学的パラメータのレベルの以下の変化の測定によりモニタされる、好結果のアンチ−増殖処置は、アンチ−増殖方向への生物学的マーカーの生理学的パラメータの変化である。
いくつかの自己免疫炎症性疾患において、レセプターに対するアゴニストを用いたA3ARの活性化は、PI3K及びPKB/Aktの抑制を誘発し、アポトーシス、及びTNF−αの生成の阻害をもたらす。従って、これら3つのタンパクのレベルをモニタすることは、A3ARアゴニストの抗炎症性効果を判断する手段を提供し得る。
以下は、ガンのように、低下した増殖により有益な効果が明らかである、疾病の好結果な処置を示す生理学的パラメータの変化である。すなわち、
(1)発現レベルにおいて:A3AR、PKB/Akt、PKA、β−カテニン、c−myc、サイクリンD1、PI3K、IKK、NF−κB、若しくはTNF−αのタンパクまたはmRNA発現の低下、またはGSK−3βのタンパク若しくはmRNAレベルの上昇、
(2)リン酸化レベルにおいて:GSK−3βのリン酸化レベルの低下、PKB/Akt及びPKA及びベータ−カテニンのリン酸化レベルの上昇、
(3)局在において:対照と比較して、細胞膜におけるA3ARレセプターの局在の低下、細胞質ゾルと比較して、核内におけるβ−カテニン及びNF−カッパBの局在の低下。
(1)発現レベルにおいて:A3AR、PKB/Akt、PKA、β−カテニン、c−myc、サイクリンD1、PI3K、IKK、NF−κB、若しくはTNF−αのタンパクまたはmRNA発現の低下、またはGSK−3βのタンパク若しくはmRNAレベルの上昇、
(2)リン酸化レベルにおいて:GSK−3βのリン酸化レベルの低下、PKB/Akt及びPKA及びベータ−カテニンのリン酸化レベルの上昇、
(3)局在において:対照と比較して、細胞膜におけるA3ARレセプターの局在の低下、細胞質ゾルと比較して、核内におけるβ−カテニン及びNF−カッパBの局在の低下。
以下は、化学療法または放射線治療に続く白血球の増殖の上昇のように、増殖の上昇により治療上の有益な効果が明らかであり得る、疾病及び状態の好結果な処置の指標である生物学的マーカーの生理学的パラメータの変化である。すなわち、
(1)発現レベルにおいて:A3AR、PKB/Akt、PKA、β−カテニン、c−myc、サイクリンD1、及びNF−κBのタンパク若しくはmRNA発現の上昇、またはGSK−3βのタンパク若しくはmRNA発現レベルの低下、
(2)リン酸化において:GSK−3βのリン酸化レベルの上昇、PKB/Akt及びPKA及びベータ−カテニンのリン酸化レベルの低下、
(3)局在において:対照と比較して細胞膜におけるA3ARレセプターの局在の上昇、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニン及びNF−カッパBの量の増加。
(1)発現レベルにおいて:A3AR、PKB/Akt、PKA、β−カテニン、c−myc、サイクリンD1、及びNF−κBのタンパク若しくはmRNA発現の上昇、またはGSK−3βのタンパク若しくはmRNA発現レベルの低下、
(2)リン酸化において:GSK−3βのリン酸化レベルの上昇、PKB/Akt及びPKA及びベータ−カテニンのリン酸化レベルの低下、
(3)局在において:対照と比較して細胞膜におけるA3ARレセプターの局在の上昇、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニン及びNF−カッパBの量の増加。
具体例
A.材料と方法
マウス、及びヒトA3AR、PKAc、c−myc、及びGSK−3βに対するウサギ多クローン性抗体を、米国、カリフォルニアのSanta Cruz Biotechnology社から購入した。
A.材料と方法
マウス、及びヒトA3AR、PKAc、c−myc、及びGSK−3βに対するウサギ多クローン性抗体を、米国、カリフォルニアのSanta Cruz Biotechnology社から購入した。
マウス及びヒトサイクリンD1に対するウサギ多クローン性抗体(ニューヨーク州北部)、A2Bアデノシンレセプター、Cy3結合抗ヤギIgG、及びフルオレセイン結合抗ウサギIgGを、カリフォルニアのChemicon社から購入した。
シクロヘキシミド及びフォルスコリンをセントルイスのSigma社から入手し、8−Br cAMP及びMG132をカリフォルニアのCalbiochem社から入手した。
2ヶ月で、平均25gの重さがあるオスICRマウス、及びNude/BalbCオス10週マウス(Harlan Laboratories社、エルサレム、イスラエル)、並びにウサギ(Harlan Laboratories社、エルサレム、イスラエル)を、以下の実験において用いた。標準ペレット飼料及び水道水を与えた。
実験を、イスラエル、ペターティクヴァのRabin Medical Centerにおける、Institutional Animal Care and Use Committeeにより確立されたガイドラインに従って行った。
B.免疫染色及び共焦点顕微鏡検査
B16−F10黒色腫細胞を、Ploy−L−リシン(500μg/ml)でコーティングされたカバーガラス上で24時間増殖した。細胞を、リン酸緩衝食塩水(PBS)中の4%ホルムアルデヒド中に、1時間(h)、室温で固定した。固定した細胞を、PBSを用いて1分間、3回すすいだ。抗体の非特異的な相互作用を防ぐために、細胞を、PBS(1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%トリトンX−100)中の4%正常ヤギ血清(NGS)中で30分間インキュベートした。シングルラベリング実験のために、細胞を、PBS(1%BSA、1%NGS、0.1%トリトンX−100)中での1:1000希釈におけるA3ARに対する1次抗体を用いて、24時間、4℃でインキュベートした。ダブルラベリング実験のために、A2Bアデノシンレセプター(A2BR)に対する抗体を、1:1000の希釈で、反応混合物に加えた。PBSを用いて3分間、3回洗浄した後、細胞を、シングルラベリング実験についてはCy3結合抗ヤギIgGを用いてインキュベートし、及びダブルラベリングについてはフルオレセイン結合抗ウサギIgGの両者を用いてインキュベートした。両抗体をPBS中で1:250に希釈し、暗所で2時間インキュベートした。細胞を、PBSを用いてさらに3回すすぎ、AM100(Chemicon社、カリフォルニア)で封入した。染色した細胞は、共焦点顕微鏡(Zeiss社、Axiovert 100M、Cy3については553で励起及び560〜615nmで発光、並びにフルオレセインについては、それぞれ492で励起及び520nmで発光)により可視化された。
B16−F10黒色腫細胞を、Ploy−L−リシン(500μg/ml)でコーティングされたカバーガラス上で24時間増殖した。細胞を、リン酸緩衝食塩水(PBS)中の4%ホルムアルデヒド中に、1時間(h)、室温で固定した。固定した細胞を、PBSを用いて1分間、3回すすいだ。抗体の非特異的な相互作用を防ぐために、細胞を、PBS(1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%トリトンX−100)中の4%正常ヤギ血清(NGS)中で30分間インキュベートした。シングルラベリング実験のために、細胞を、PBS(1%BSA、1%NGS、0.1%トリトンX−100)中での1:1000希釈におけるA3ARに対する1次抗体を用いて、24時間、4℃でインキュベートした。ダブルラベリング実験のために、A2Bアデノシンレセプター(A2BR)に対する抗体を、1:1000の希釈で、反応混合物に加えた。PBSを用いて3分間、3回洗浄した後、細胞を、シングルラベリング実験についてはCy3結合抗ヤギIgGを用いてインキュベートし、及びダブルラベリングについてはフルオレセイン結合抗ウサギIgGの両者を用いてインキュベートした。両抗体をPBS中で1:250に希釈し、暗所で2時間インキュベートした。細胞を、PBSを用いてさらに3回すすぎ、AM100(Chemicon社、カリフォルニア)で封入した。染色した細胞は、共焦点顕微鏡(Zeiss社、Axiovert 100M、Cy3については553で励起及び560〜615nmで発光、並びにフルオレセインについては、それぞれ492で励起及び520nmで発光)により可視化された。
C.ウエスタンブロット分析
A3ARタンパクの発現のレベルを検出するために、ウエスタンブロット分析を行った。細胞を、IB−MECA(10nM)、MRS1523(10nM)、フォルスコリン(50nM)、8 Br cAMP(100μM)、シクロヘキシミド20μg/ml、またはMG132(20nM)の存在下及び非存在下で、異なる時間、37℃でインキュベートした。その後、細胞を氷冷PBSを用いてすすぎ、氷冷溶解緩衝液(TNN緩衝液、50mMトリス緩衝液 pH=7.5、150mM NaCl、NP40)に移した。A3AR発現に対するトリプシンの効果を検討する実験において、細胞を、0.5mlの0.25%トリプシンを用いて、5分間インキュベートした。トリプシン処理された細胞を、氷冷PBSを用いて再び洗浄し、遠心分離により収集し、及びTNN緩衝液中での溶解に供した。細胞片を、10分間、7500xgでの遠心分離により取り除いた。上澄みをウエスタンブロット分析に用いた。タンパク濃度を、Bio−Radタンパクアッセイ染色試薬を用いて測定した。サンプルの同量(50μg)を、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて、SDS−PAGEにより分離した。その後、分離したタンパクを、ニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell社、キーン、ニューハンプシャー、米国)上でエレクトロブロットした。膜を、1%ウシ血清アルブミンを用いてブロックし、所望される1次抗体(1:1000希釈)を用いて、24時間、4℃でインキュベートした。その後、ブロットを洗浄し、2次抗体を用いて1時間、室温でインキュベートした。バンドを、BCIP/NBT色発生キット(Promega社、マディソン、ウィスコンシン、米国)を用いて記録した。異なる形で示されるデータは、少なくとも3つの実験を代表している。
A3ARタンパクの発現のレベルを検出するために、ウエスタンブロット分析を行った。細胞を、IB−MECA(10nM)、MRS1523(10nM)、フォルスコリン(50nM)、8 Br cAMP(100μM)、シクロヘキシミド20μg/ml、またはMG132(20nM)の存在下及び非存在下で、異なる時間、37℃でインキュベートした。その後、細胞を氷冷PBSを用いてすすぎ、氷冷溶解緩衝液(TNN緩衝液、50mMトリス緩衝液 pH=7.5、150mM NaCl、NP40)に移した。A3AR発現に対するトリプシンの効果を検討する実験において、細胞を、0.5mlの0.25%トリプシンを用いて、5分間インキュベートした。トリプシン処理された細胞を、氷冷PBSを用いて再び洗浄し、遠心分離により収集し、及びTNN緩衝液中での溶解に供した。細胞片を、10分間、7500xgでの遠心分離により取り除いた。上澄みをウエスタンブロット分析に用いた。タンパク濃度を、Bio−Radタンパクアッセイ染色試薬を用いて測定した。サンプルの同量(50μg)を、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて、SDS−PAGEにより分離した。その後、分離したタンパクを、ニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell社、キーン、ニューハンプシャー、米国)上でエレクトロブロットした。膜を、1%ウシ血清アルブミンを用いてブロックし、所望される1次抗体(1:1000希釈)を用いて、24時間、4℃でインキュベートした。その後、ブロットを洗浄し、2次抗体を用いて1時間、室温でインキュベートした。バンドを、BCIP/NBT色発生キット(Promega社、マディソン、ウィスコンシン、米国)を用いて記録した。異なる形で示されるデータは、少なくとも3つの実験を代表している。
D.ノザンブロット分析
全RNAを、Tri−試薬(Sigma社、セントルイス)を用いて、IB−MECAで処理されたB16−F10黒色腫細胞から単離した。その後、サンプルをフェノール:クロロホルム抽出に二度供し、クロロホルムで洗浄した。RNAをエタノールを用いた洗浄に続き、酢酸ナトリウム/エタノールで沈殿させ、その後変性させ、1.1%ホルムアルデヒドアガロースゲル中で展開し(レーンにつき25μg)、及びHybond−N膜に転写した。Kathia Ravid博士から供給していただいた、マウス(TAA3I.S)のA3AR cDNAクローン由来の390 bp EcoRIフラグメントを、ランダムプライム合成により調製した。プローブを、42℃のハイブリッド形成温度において、50%のホルムアミドの存在下で、RNAブロット分析に用いた。
全RNAを、Tri−試薬(Sigma社、セントルイス)を用いて、IB−MECAで処理されたB16−F10黒色腫細胞から単離した。その後、サンプルをフェノール:クロロホルム抽出に二度供し、クロロホルムで洗浄した。RNAをエタノールを用いた洗浄に続き、酢酸ナトリウム/エタノールで沈殿させ、その後変性させ、1.1%ホルムアルデヒドアガロースゲル中で展開し(レーンにつき25μg)、及びHybond−N膜に転写した。Kathia Ravid博士から供給していただいた、マウス(TAA3I.S)のA3AR cDNAクローン由来の390 bp EcoRIフラグメントを、ランダムプライム合成により調製した。プローブを、42℃のハイブリッド形成温度において、50%のホルムアミドの存在下で、RNAブロット分析に用いた。
E.ホルマリン固定した、パラフィン包埋された組織における、無傷のRNAの検出のためのRT−PCR
H&Eにより染色された、スライドガラス上の組織切片(5μm厚)を、病理学者により観察した。腫瘍性部位と正常部位を検出し、それぞれを別々に標識した。腫瘍性組織と正常組織を、異なるマイクロ遠心分離チューブに収集した。サンプルを、プロテイナーゼKを用いて、0.1mg/mlの最終濃度で処理し、DNA消化を考慮して37OCで1時間インキュベートした。細胞溶解物を、デオキシリボヌクレアーゼとプロテイナーゼKを不活化するために、95℃に、15分間加熱した。14,000RPMでの5分間の遠心分離に続き、17μlの上澄みをセパレートチューブに移し、4μlのRT混合物(5mM dNTPs、2.5μM ランダム六量体、5U RNasin、プラチナTaq(Invitrogene社)を用いた100U スーパースクリプトワンステップRT−PCR を加えた。
H&Eにより染色された、スライドガラス上の組織切片(5μm厚)を、病理学者により観察した。腫瘍性部位と正常部位を検出し、それぞれを別々に標識した。腫瘍性組織と正常組織を、異なるマイクロ遠心分離チューブに収集した。サンプルを、プロテイナーゼKを用いて、0.1mg/mlの最終濃度で処理し、DNA消化を考慮して37OCで1時間インキュベートした。細胞溶解物を、デオキシリボヌクレアーゼとプロテイナーゼKを不活化するために、95℃に、15分間加熱した。14,000RPMでの5分間の遠心分離に続き、17μlの上澄みをセパレートチューブに移し、4μlのRT混合物(5mM dNTPs、2.5μM ランダム六量体、5U RNasin、プラチナTaq(Invitrogene社)を用いた100U スーパースクリプトワンステップRT−PCR を加えた。
RT反応を、45℃で45分間行った。PCR反応を、セットNoIについては、増幅のために用いられるプライマーに依存して変化させた。RTは、99℃まで5分間加熱することを伴い、30秒間94℃、45秒間59℃、及び45秒間73℃の50サイクルを行った。セットNoIIについては、アニーリングを55℃で行った。生成物を、2%アガロースゲル上で電気泳動させ、臭化エチジウムを用いて染色し、及びUV照明を用いて可視化した。RT−PCR反応の特異性を、標準手法を用いて抽出されたRNA由来の正の制御と比較するアガロースゲル上のサイズ測定により、及びRT−PCR生成物を配列決定し、その配列と既知の配列(ADORA3−L77729,L77730)を比較することにより確認した。
F.インビボ実験
マウスを標準ペレット飼料で飼育し、水道水を与えた。実験を、イスラエル、ペターティクヴァの、Rabin Medical CenterにおけるInstitutional Animal Care and Use Committeeにより確立されたガイドラインに従って行った。
マウスを標準ペレット飼料で飼育し、水道水を与えた。実験を、イスラエル、ペターティクヴァの、Rabin Medical CenterにおけるInstitutional Animal Care and Use Committeeにより確立されたガイドラインに従って行った。
黒色腫:2ヶ月で、平均25gの重さのある、C57BL/6Jのオスのマウス(Harlan Laboratories、エルサレム、イスラエル)を用いた。B16−F10(2.5×105)黒色腫細胞を、マウスの側腹部に、皮下(s.c.)注入した。100μg/kg体重の投与量におけるIB−MECAを、毎日1度経口的に投与し、これは腫瘍細胞摂取後24時間から開始した。対照プローブを、賦形剤のみを用いて、毎日、経口的に処置した。マウスを、15日後に屠殺し、腫瘍病変部を切除し、タンパクを上記した測定のために抽出した。腫瘍サイズ(幅(W)及び長さ(L))を直径で測定し、以下の式に従って計算した。すなわち、腫瘍サイズ=(W)2×L/2である。15マウスを含むそれぞれのグループ及び実験を3回繰り返した。
結腸ガン:10週のNude/BalbCオスのマウスを使用した。HCT−116ヒト結腸ガン細胞(100μL PBS中1.2×106細胞)を、マウスの側腹部に、皮下接種した。腫瘍が、〜150mm3のサイズに到達してから処置を開始した。それぞれのグループは10マウスを含み、対象グループは、賦形剤のみで処理され、一方で、テストグループには、IB−MECA(10μg/kg)を毎日経口的に投与した。
32日後、マウスを屠殺し、腫瘍病変部を切除し、タンパクを上述した測定のために抽出した。腫瘍サイズを、直径の幅(W)及び長さ(L)を測定することにより求め、上式に従って計算した。
ラットにおけるAIA:Harlan Laboratories(エルサレム、イスラエル)から入手した、8〜12週のメスルイスラットに、不完全フロイントアジュバント(IFA)と10mg/mlの熱死滅させたヒト結核菌(Mt)H37Ra(Difco社、デトロイト、米国)で構成された100μlの懸濁液を、尾の付け根に皮下(SC)注射した。臨床的疾患活動性評価を評価するために、動物を、臨床的関節炎について、一日おきに検査した。評価方法は、各肢0〜4に渡る。すなわち、0−関節炎なし;1−1つの足指/指の関節の赤さ、または腫れ;2−1つを超える足指/指の関節の赤さ、または腫れ、3−足首、及び足根骨−中足骨関節関与。4−全体の足の赤さ、または腫れである。関節炎評価を、16の最大値にまで、4つの個々の足評価を加えることにより計算した。組織学的評価のために、動物を屠殺し、足を膝レベルにまで取り外し、10%ホルムアルデヒド中に固定し、脱灰し、脱水し、パラフィン包埋し、4μm切片に切断し、ヘマトキシリン−エオシンにより染色した。全ての病理学的発見の評価を、ブラインドで(L.R−W及びM.Hによる)、以下のパラメータについての0〜4の半定量評価基準を用いて行った。すなわち、a)関節組織に対する炎症性細胞湿潤の程度、b)滑膜表層細胞過形成、c)パンヌス形成、d)関節軟骨層破壊、e)0〜5で評価される骨損傷及び侵食評価、すなわち、0−正常;1−いくつかの部位における皮質骨の最小の損失;2−皮質海綿骨(cortical trabecular bone)の軽度の損失;3−多くの部位における骨の中程度の損失;4−多くの部位における骨の顕著な損失;5−炎症性工程での断片化、及び全層穿通または皮質骨におけるパンヌス(17、18)を伴う、多くの部位における骨の顕著な喪失である。全ての組織学的パラメータ評価の平均を「組織学評価」と名付けた。TNF−αを、対照及びCF101処理ラットから得られた滑膜、DLN、及び脾臓組織において測定した。TNF−αの発現のレベルを検出するために、WB分析を行った。脾臓及びDLN単核細胞及び滑膜組織を氷冷PBSを用いてすすぎ、氷冷溶解緩衝液(TNN緩衝液、50mM トリス緩衝液 pH=7.5、150mM NaCl、NP 40 0.5%、20分間)に移した。細胞片を10分間、7500gで遠心分離により除去した。上澄みをWB分析に用いた。タンパク濃度を、Bio−Radタンパクアッセイ染色試薬を用いて測定した。同量のサンプル(50μg)を、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて、SDS−PAGEにより分離した。その後、分離したタンパクを、ニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell 社、キーン、ニューハンプシャー、米国)上で、エレクトロブロットした。膜を1%ウシ血清アルブミンを用いてブロックし、多クローン性ヤギ抗ラットTNF−α抗体(1:1000希釈)(Santa Cruz Biotechnology 社、カルフォルニア、米国)を用いて、24時間、40℃でインキュベートした。その後、ブロットを洗浄し、ウサギ抗ヤギ多クローン性抗体を用いて、1時間、室温でインキュベートした。バンドをBCIP/NBT色発生キット(Promega社、マディソン、ウィスコンシン、米国)を用いて記録した。タンパク発現のデンシトメトリーを、β−アクチンに対して規準化し、対照の%として表した。
G.統計分析
結果を、p<0.05の統計的有意性で、スチューデントt検定を用いて評価した。異なる実験の平均値間の比較を行った。
結果を、p<0.05の統計的有意性で、スチューデントt検定を用いて評価した。異なる実験の平均値間の比較を行った。
例1:黒色腫細胞における生物学的マーカー局在の変化のモニタ
レセプター局在を調べるために、共焦点レーザー顕微鏡検査を利用した。未処置の細胞(対照)は、蛍光強度レベル(図1a)から確認されるように、細胞表面上でA3ARを高く示した。蛍光レベルにおける顕著な低下が、IB−MECA処置細胞において、5分後に認められた(図1b)。IB−MECAの存在下で、黒色腫細胞をA3ARアンタゴニストMRS1523に曝露すると、細胞表面の蛍光強度が、対象のそれと類似する結果となった(図1c)。これらのデータは、速いレセプターの内部移行が、IB−MECA処置により起こることを示唆する。
レセプター局在を調べるために、共焦点レーザー顕微鏡検査を利用した。未処置の細胞(対照)は、蛍光強度レベル(図1a)から確認されるように、細胞表面上でA3ARを高く示した。蛍光レベルにおける顕著な低下が、IB−MECA処置細胞において、5分後に認められた(図1b)。IB−MECAの存在下で、黒色腫細胞をA3ARアンタゴニストMRS1523に曝露すると、細胞表面の蛍光強度が、対象のそれと類似する結果となった(図1c)。これらのデータは、速いレセプターの内部移行が、IB−MECA処置により起こることを示唆する。
A3AR内部移行の動力学的な時間経過をさらに調査するために、B16−F10黒色腫細胞を、異なる時間、IB−MECAに曝露し、共焦点顕微鏡検査分析を行った。図2は、数分以内で起こり、6分後に蛍光の消失に至るゆるやかな内部移行速度を示す。黒色腫細胞のIB−MECAへの長い曝露(15分)は、細胞表面へのレセプター内部移行を生じた。これは、より長いインキュベーション時間(30及び60分)後に、内部移行/外部移行を伴う。蛍光レベルが内部移行の結果低下したという観察を確認するために、細胞の光学的区分けを行った(データは示さない)。未処置の細胞(対照)において、レセプターは細胞表面上に示され、IB−MECAに曝露すると(5分間)細胞質ゾル中に示され、A3ARが膜から細胞質ゾルに転位置するという見解を支持した。15分、及び60分の曝露後、レセプターは、細胞質ゾル中及び細胞表面上の双方に見受けられた。60分のサンプルにおいて、15分と比較すると、より多くの蛍光が細胞質ゾル中で見受けられた。A3AR局在の特異性を明らかにするために、A2Bアデノシンレセプターのものと比較した。興味深いことに、未処置の細胞において、A3ARが細胞表面上に主に局在した一方で、A2BRは細胞質ゾル中に見受けられた。細胞をIB−MECAに曝露すると、A2BRは、細胞質ゾル中でA3ARによりマスクされた。
例2:IB−MECA投与黒色腫細胞におけるA3ARのRNA及びタンパク発現レベルにおける変化のモニタ
細胞表面レセプターを取り除くトリプシンを用いて、黒色腫細胞を処置することによるレセプターの内部移行を検討した。未処置の黒色腫細胞は、高いレベルのA3ARタンパクを発現し、これはIB−MECAまたはトリプシン処理(図3 レーン1、2、及び3)後にダウンレギュレートした。これは、対照の未処置の腫瘍細胞において、大部分のA3ARが細胞表面上に示され、トリプシンによる消化に供されるということを示す。IB−MECA+トリプシン処理細胞(5分間)において、無視できる差異が、トリプシン処理細胞及びトリプシン未処理細胞間で観測され、A3ARアゴニストIM−MECAを用いた処理のために、大部分のA3ARが既に内部に取り入れられ(局在変化)、よって消化から保護されたことを証明した(図3、レーン3及び4)。
細胞表面レセプターを取り除くトリプシンを用いて、黒色腫細胞を処置することによるレセプターの内部移行を検討した。未処置の黒色腫細胞は、高いレベルのA3ARタンパクを発現し、これはIB−MECAまたはトリプシン処理(図3 レーン1、2、及び3)後にダウンレギュレートした。これは、対照の未処置の腫瘍細胞において、大部分のA3ARが細胞表面上に示され、トリプシンによる消化に供されるということを示す。IB−MECA+トリプシン処理細胞(5分間)において、無視できる差異が、トリプシン処理細胞及びトリプシン未処理細胞間で観測され、A3ARアゴニストIM−MECAを用いた処理のために、大部分のA3ARが既に内部に取り入れられ(局在変化)、よって消化から保護されたことを証明した(図3、レーン3及び4)。
黒色腫細胞におけるA3ARの時間依存的な発現を、ウエスタンブロット分析により検討した。IB−MECAが誘発する正弦波状パターンのA3AR発現の変化、すなわち、ダンレギュレーション及びアップレギュレーションが、異なる時点で起こった(図4a)。本発明の方法を行うための最適の時間を表すこのパターンは、実験的に決定された。
タンパク発現が、分解及び再合成のために変化するか否かを試験するために、細胞をMG132(タンパク分解阻害剤)及びシクロヘキシミド(タンパク合成阻害剤)の存在下で、180分間、IB−MECAに曝露した。実際に、MG132は、A3ARのダウンレギュレーションを防止し、シクロヘキシミドは、レセプターの増加を阻害し、内部移行に続き、レセプター分解及び再合成が起こったことを明らかにした(図4b)。さらに、mRNA発現レベルの上昇が観測され、A3ARのデノボ合成が起こったことを示唆した。この反応の特異性は、mRNA発現の増加を逆転させるMRS1523により説明された。
例3:IB−MECAを用いて処理された、黒色腫接種マウスにおける生物学的マーカーの発現レベルのモニタ
IB−MECAは、B16−F10黒色腫腫瘍成長の発達を顕著に抑制した(76%阻害、p<0.0001、図5a)。これらマウスから切除された腫瘍病変部において、ウエスタンブロット分析(図5b)は、PKA及びPKB/Aktの双方のレベルが低下するということを明らかにした。従って、総GSK−3βレベルの上昇は、特筆すべきであり、それによって、β−カテニンのレベルの減少へと導かれた。細胞核へのβ−カテニン/Leflのトランスロケーションに続いて、転写されることが知られているサイクリンD1及びc−mycは、IB−MECA処理された黒色腫細胞においてダウンレギュレートされたことが双方とも見出された。
IB−MECAは、B16−F10黒色腫腫瘍成長の発達を顕著に抑制した(76%阻害、p<0.0001、図5a)。これらマウスから切除された腫瘍病変部において、ウエスタンブロット分析(図5b)は、PKA及びPKB/Aktの双方のレベルが低下するということを明らかにした。従って、総GSK−3βレベルの上昇は、特筆すべきであり、それによって、β−カテニンのレベルの減少へと導かれた。細胞核へのβ−カテニン/Leflのトランスロケーションに続いて、転写されることが知られているサイクリンD1及びc−mycは、IB−MECA処理された黒色腫細胞においてダウンレギュレートされたことが双方とも見出された。
加えて、その活性化が、腫瘍発育において重要な役割を演じる転写因子NF−κBのレベルもまた、ダウンレギュレートされた。ハウスキーピングタンパクβ−アクチンのレベルは、変化しなかった(示さない)。
例4:IB−MECA処置によるマウスの結腸ガン発育の阻害中での生物学的マーカーの発現レベルのモニタ
IB−MECAは、HCT−116ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスの結腸ガン細胞の発育を顕著に抑制した(図5a)。HCT−116ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスから切除した腫瘍病変部において、ウエスタンブロット分析は、A3ARのダウンレギュレーション、GSK−3β発現レベルのアップレギュレーション、続くc−myc及びサイクリンD1のレベルの低下を明らかにした(図5b)。ハウスキーピングタンパクβ−アクチンのレベルは、変化しなかった。
IB−MECAは、HCT−116ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスの結腸ガン細胞の発育を顕著に抑制した(図5a)。HCT−116ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスから切除した腫瘍病変部において、ウエスタンブロット分析は、A3ARのダウンレギュレーション、GSK−3β発現レベルのアップレギュレーション、続くc−myc及びサイクリンD1のレベルの低下を明らかにした(図5b)。ハウスキーピングタンパクβ−アクチンのレベルは、変化しなかった。
例5:前立腺ガン(PC−3)における生物学的マーカーの発現の変化のモニタ
IB−MECAの、前立腺ガン細胞におけるA3AR活性化に対して末端の鍵タンパクに対する効果を、黒色腫細胞を用いて行ったものと同様の方法で検討した(上記参照のこと)。図6は、前立腺ガン細胞から抽出されたタンパクの免疫ブロット分析を示し、A3AR、NF−κB、c−myc、及びサイクリンD1のダウンレギュレーションが示される。
IB−MECAの、前立腺ガン細胞におけるA3AR活性化に対して末端の鍵タンパクに対する効果を、黒色腫細胞を用いて行ったものと同様の方法で検討した(上記参照のこと)。図6は、前立腺ガン細胞から抽出されたタンパクの免疫ブロット分析を示し、A3AR、NF−κB、c−myc、及びサイクリンD1のダウンレギュレーションが示される。
例6:IM−MECA投与の結果としての、結腸ガンにおける生物学的マーカーの発現レベルの変化のモニタ
HCT−116ヒト結腸ガン細胞におけるA3AR活性化に対して末端の鍵タンパクに対するIB−MECAの効果は、黒色腫細胞を用いて行ったものと同様の方法で検討した(上記参照のこと)。図7は、結腸ガン細胞から得られたタンパク抽出物の免疫ブロット分析を示し、IB−MECAを用いた処理(右のレーン)は、対照(左のレーン)と比較して、PKAc、PKB/Akt、β−カテニン、c−myc、及びサイクリンD1、及びNF−κBのダウンレギュレーション、並びにGSK−3β発現レベルのアップレギュレーションを引き起した。これらの結果は、黒色腫及び前立腺ガン細胞により得られ、且つ上に示した結果と一致し、これら制御要素の発現レベルの測定が、疾病状態の生物学的マーカーとして機能し得るという見解を支持する。
HCT−116ヒト結腸ガン細胞におけるA3AR活性化に対して末端の鍵タンパクに対するIB−MECAの効果は、黒色腫細胞を用いて行ったものと同様の方法で検討した(上記参照のこと)。図7は、結腸ガン細胞から得られたタンパク抽出物の免疫ブロット分析を示し、IB−MECAを用いた処理(右のレーン)は、対照(左のレーン)と比較して、PKAc、PKB/Akt、β−カテニン、c−myc、及びサイクリンD1、及びNF−κBのダウンレギュレーション、並びにGSK−3β発現レベルのアップレギュレーションを引き起した。これらの結果は、黒色腫及び前立腺ガン細胞により得られ、且つ上に示した結果と一致し、これら制御要素の発現レベルの測定が、疾病状態の生物学的マーカーとして機能し得るという見解を支持する。
その活性化が、腫瘍発育において重要な役割を演じる転写因子NF−κBのレベルもまた、ダウンレギュレートされたことは特筆すべきである。
例7:黒色腫細胞におけるIB−MECA処置によるA3AR活性化に対して末端の鍵タンパクの発現のモニタ
レセプター機能性を試験するために、A3AR活性化に対して末端で変化されるPKA及びGSK−3βのタンパク発現レベルを検討した。IB−MECAによる機能的レセプター感作が、15分及び60分後に観察され、低下したPKAレベル及び上昇したGSK−3βレベルにより明らかにされた。しかしながら、30分において、PKAレベルは安定化し、GSK−3βのみがわずかに増加し、レセプターの脱感作/再感作が、アゴニストへの慢性的な曝露により起こったことを示した。この反応の特異性は、A3AR活性化を相殺することが全て知られている、MRS1523、フォルスコリン、及び8−Br−cAMPを導入することにより示された。実際に、PKA及びGSK−3βに対するIB−MECAの調節効果が、上記した薬剤の存在下では逆転された(図8a、8b、及び8c)。
レセプター機能性を試験するために、A3AR活性化に対して末端で変化されるPKA及びGSK−3βのタンパク発現レベルを検討した。IB−MECAによる機能的レセプター感作が、15分及び60分後に観察され、低下したPKAレベル及び上昇したGSK−3βレベルにより明らかにされた。しかしながら、30分において、PKAレベルは安定化し、GSK−3βのみがわずかに増加し、レセプターの脱感作/再感作が、アゴニストへの慢性的な曝露により起こったことを示した。この反応の特異性は、A3AR活性化を相殺することが全て知られている、MRS1523、フォルスコリン、及び8−Br−cAMPを導入することにより示された。実際に、PKA及びGSK−3βに対するIB−MECAの調節効果が、上記した薬剤の存在下では逆転された(図8a、8b、及び8c)。
例8:IB−MECAのマウスにおける結腸ガン発育の阻害、及び生物学的マーカーの発現のダウンレギュレート
IB−MECAは、HCT−116ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスにおいて、結腸ガン細胞の発育を顕著に阻害した(図9a)。HCT−116ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスから切除された腫瘍病変部において、ウエスタンブロット分析は、A3ARのダウンレギュレーション、GSK−3β発現レベルのアップレギュレーション、続くc−myc及びサイクリンD1のレベルの低下を明らかにした(図9b)。ハウスキーピングタンパクβ−アクチンのレベルは、変化しなかった(データは示さない)。
IB−MECAは、HCT−116ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスにおいて、結腸ガン細胞の発育を顕著に阻害した(図9a)。HCT−116ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスから切除された腫瘍病変部において、ウエスタンブロット分析は、A3ARのダウンレギュレーション、GSK−3β発現レベルのアップレギュレーション、続くc−myc及びサイクリンD1のレベルの低下を明らかにした(図9b)。ハウスキーピングタンパクβ−アクチンのレベルは、変化しなかった(データは示さない)。
例9:臨床的処置における生物学的マーカーの発現レベルのモニタ
以下の検討の目的は、異なる投与量での、IB−MECAの、新たに診断された結腸直腸ガンを有する個体における、関連する生物学的マーカーの発現プロフィールを変化させる能力を測定することである。被験者は、診断生検において得られた組織に対してRT−PCRを行うことにより、治療前に、以下のマーカーのmRNAのレベルについて試験され得る。
以下の検討の目的は、異なる投与量での、IB−MECAの、新たに診断された結腸直腸ガンを有する個体における、関連する生物学的マーカーの発現プロフィールを変化させる能力を測定することである。被験者は、診断生検において得られた組織に対してRT−PCRを行うことにより、治療前に、以下のマーカーのmRNAのレベルについて試験され得る。
少なくとも1つの、好ましくはいくつかの以下の腫瘍マーカーを測定する。すなわち、A3ARレセプター、PKA、PKB/Akt、GSK−3β、β−カテニン、サイクリンD1、c−myc、NF−κBである。
診断された被験者は、悪性である高い可能性を有すると感じられる結腸直腸病変部を有する患者で、ほぼ確実に生検を受け、続いて最終的な手術を受け得る患者を含む。
生検検体は、(結腸鏡検査を通して)被験者から取り出され、上記の生物学的マーカーの試験のために、処置前に、ノザン分離またはRT−PCR増幅を受ける。
処置方法:5〜10人の患者のコホートを、段階的に増やしていくIB−MECAの投与量で、毎日または1日に2回処置する。IB−MECAを用いる処置を、最終的な手術の前に始める。
IB−MECAを用いる処置の所定の時間(処置と対照間で最大の差異を示すように予め定められた時間)後、腫瘍病変部を手術において取り除き、末端シグナル、PKA、PKB/Akt、GSK−3β、β−カテニン、サイクリンD1、c−myc、PI3K、IKK、NF−κBと共に、A3レセプターmRNA発現レベルを、RT−PCRを用いて測定する。異なるタンパクの発現のレベルを、処置前の生検検体から測定したものと比較することができる。
同様の方法で、IB−MECAを用いる処置の効果を、調節マーカーのレベルの測定を経て、乳ガン、前立腺ガン、黒色腫等の場合に測定する。類似の方法で、必要な変更を加えて、自己免疫炎症性疾病における治療の効果を判定することができる。
例10:ヒト好中球に対するA3ARレセプターの検出
20mlのヒト血液から単離された10×106好中球細胞を、15分間、0.01mMまたは10mMのCF101を用いて、37℃でインキュベートした。細胞を遠心分離により収集し、PBSを用いて洗浄した。RNAをTRI−試薬(Sigma社)を用いることにより細胞から抽出した。RNAレベルを分光光度計を用いて定量化し、各サンプルから1mgを、セクションEにおいて上記した通り、361bpフラグメントの増幅のためのプライマ−として、セットNoIIを用いることによる、プラチナTaq(Invitrogene社)を用いるスーパースクリプトワンステップRT−PCRを使用するRT−PCRに供した。RT−PCR生成物を電気泳動により検出し、サイズを既知のRNAと比較することにより検証した。
20mlのヒト血液から単離された10×106好中球細胞を、15分間、0.01mMまたは10mMのCF101を用いて、37℃でインキュベートした。細胞を遠心分離により収集し、PBSを用いて洗浄した。RNAをTRI−試薬(Sigma社)を用いることにより細胞から抽出した。RNAレベルを分光光度計を用いて定量化し、各サンプルから1mgを、セクションEにおいて上記した通り、361bpフラグメントの増幅のためのプライマ−として、セットNoIIを用いることによる、プラチナTaq(Invitrogene社)を用いるスーパースクリプトワンステップRT−PCRを使用するRT−PCRに供した。RT−PCR生成物を電気泳動により検出し、サイズを既知のRNAと比較することにより検証した。
結果を図10に示す。見受けることができるように、A3ARアゴニストIB−MECAは、好中球においてARARの発現を高めることができる。これは、初期増殖様式において、好中球が治療処置に反応したということを示す。従って、A3ARのレベルの検出変化は、増加する好中球の総数についての処置(A3ARアゴニストによる)の有効性、例えば、化学療法の効果を相殺することを示す。
例11:IB−MECAによる、炎症性反応、及びA3AR発現、及びいくつかの末端タンパクの変化
アジュバント誘発性関節炎(AIA)を、上記したようにラットに誘発した。ラットを、(i)賦形剤(これらのラットは対照となる)、(ii)10μg/KgのIB−MECA、または(iii)特異的A3ARアゴニストMRS1220、続く30分後にIB−MECA、のいずれかを用いて経口的に毎日2度の処置をした。マウスを組織学的評価、並びにシグナル伝達タンパク及びTNF−αの測定のために、28日で屠殺した。
アジュバント誘発性関節炎(AIA)を、上記したようにラットに誘発した。ラットを、(i)賦形剤(これらのラットは対照となる)、(ii)10μg/KgのIB−MECA、または(iii)特異的A3ARアゴニストMRS1220、続く30分後にIB−MECA、のいずれかを用いて経口的に毎日2度の処置をした。マウスを組織学的評価、並びにシグナル伝達タンパク及びTNF−αの測定のために、28日で屠殺した。
図10aに見受けることができるように、IB−MECAは、A3ARアンタゴニストMRS1220により帳消しにされるように、特異的である抗炎症性反応を誘発した。IB−MECAの抗炎症性活性を、組織学的評価においても、同様に見受けることができる(図10b)。
図11に見受けることができるように、IB−MECAの抗炎症性活性は、A3ARのレベルのダウンレギュレーションと関連があり、一方でA2アデノシンレセプターの効果を有さなかった。MRS1220は、特異的であり、A3ARを通して媒介されることを示すこの変化をブロックした。同様のダウンレギュレーションを、末端のシグナル伝達タンパクPI3K(図10)、PKB/Akt(図11a、及び11b)、IKKα/β、NF−κB、及びTNF−α(DLN及び滑膜組織について、それぞれ、図12及び13)においても同様に見受けることができる。アップレギュレーションが、GSK−3β及びカスパーゼ−3を含む、末端のシグナル伝達タンパクにおいて見受けられる。
これらシグナル伝達タンパクのレベルをモニタすることにより、発現に関する、及びその活性に関する双方で、自己免疫炎症性疾病の処置におけるA3ARアゴニストの効果を評価することができる。
Claims (25)
- 個体における疾病状態の処置において、A3アデノシンレセプター(A3AR)と相互作用する投与薬剤の有効性をモニタする方法であって、前記方法は、
(i)薬剤が、疾病状態に関連する個体における細胞に到達し、且つ作用することを可能にするように選択された、個体への薬剤の投与後の、定められた時点において、から前記、または前記細胞を含む組織のサンプルを取り出すこと、
(ii)前記細胞における、A3AR、またはA3ARシグナル伝達経路に関連し、A3ARの下流にある要素であるところの少なくとも1つの生物学的マーカーの少なくとも1つの生理学的パラメータのレベルを検出すること、及び
(iii)前記少なくとも1つのパラメータのレベルを、前記薬剤の投与前の同一の個体に由来する細胞または組織におけるレベルであるか、または未処置の疾病状態を示す前記マーカーに対する標準対照であるところの対照レベルを比較すること
を包含し、対照との生理学的パラメータのレベルの差異は、これらの状態に対する前記処置の有効性を示すものである方法。 - 前記A3ARと相互作用する前記薬剤が、A3ARアゴニストである請求項1に記載の方法。
- 前記A3ARシグナル伝達経路が、Wnt経路である請求項1に記載の方法。
- 前記要素が、PKA、PKB/Akt、GSK−3β、β−カテニン、サイクリンD1、c−mycから選択される少なくとも1つの要素である請求項3に記載の方法。
- 前記A3ARシグナル伝達経路が、NF−κB経路である請求項1に記載の方法。
- 前記要素が、NF−κB、PI3K、IKK、c−myc、サイクリンD1から選択される少なくとも1つの要素である請求項5に記載の方法。
- 前記生理学的パラメータが、mRNAまたはタンパク発現のレベル、リン酸化のレベル及び細胞局在である請求項1に記載の方法。
- 前記疾病状態が、増殖関連疾病である請求項1に記載の方法。
- 前記疾病が、ガンである請求項8に記載の方法。
- 前記ガンが、黒色腫、結腸ガン、または前立腺ガンである請求項9に記載の方法。
- 前記疾病が、炎症性疾病である請求項8に記載の方法。
- (a)A3AR、PKB/Akt、PKA、β−カテニン、c−myc、サイクリンD1、及びNF−κB、TNF−αのうちの少なくとも1つのタンパクレベル若しくはそれらをコードしているmRNAレベルの低下、またはGSK−3βのタンパクレベルもしくはそれをコードしているmRNAの上昇、
(b)GSK−3βのリン酸化レベルの低下、PKB/Akt、PKA、またはベータ−カテニンのリン酸化レベルの上昇から選択されるリン酸化レベルにおける少なくとも1つの変化、
(c)対照と比較して細胞膜におけるA3ARレセプターの局在の低下、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニンまたはNF−カッパBの局在の低下から選択される細胞局在における少なくとも1つの変化
から選択される生物学的マーカーの生理学的パラメータの変化により、前記疾病に対する有効な処置が示される請求項8に記載の方法。 - 前記疾病状態が、高められた増殖により有益な治療学的効果が明らかである疾病または状態である請求項1に記載の方法。
- 前記疾病状態が、化学療法または放射線治療の結果としての白血球のカウント、特に好中球の減少である請求項13に記載の方法。
- (a)A3AR、PKB/Akt、PKA、β−カテニン、c−myc、サイクリンD1、NF−κBのうちの少なくとも1つのタンパクレベル若しくはそれらをコードしているmRNのレベルの上昇、またはGSK−3βのタンパクレベル若しくはmRNAレベルの低下、
(b)GSK−3βのリン酸化レベルの上昇、PKB/Akt、PKAのリン酸化レベルまたはベータ−カテニンのリン酸化レベルの低下から選択されるリン酸化レベルにおける少なくとも1つの変化、
(c)対照と比較して細胞膜におけるA3ARレセプターの局在の上昇、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニンの局在の上昇から選択される細胞局在における少なくとも1つの変化
から選択される生物学的マーカーの生理学的パラメータの変化により、前記疾病に対する有効な処置が示される請求項13に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの生物学的マーカーの前記少なくとも1つの生理学的パラメータのレベルが、処置された被験者における前記パラメータのレベルと未処置の対照における前記パラメータのレベル間での差異が最も顕著であると予測される、薬剤の投与後の時点で測定される請求項1に記載の方法。
- 前記A3ARアゴニストが、1−デオキシ−1−[6[[(3−ヨードフェニル)メチル]アミノ]−9H−プリン−9−イル]−N−メチル−β−D−リボフラ−ニューロンアミンド(nuronaminde)(IB−MECA)である請求項2に記載の方法。
- 薬候補が、疾病細胞中で示される疾病状態の処置に有用なA3ARアゴニストであるか否かを決定する方法であって、前記方法は、
(i)前記疾病細胞または前記細胞を含む組織のサンプルを得ること、
(ii)前記サンプルを前記薬候補に接触させること、
(iii)前記細胞における、A3AR、またはA3ARの下流にある、A3ARシグナル伝達経路に関連する要素であるところの少なくとも1つの生物学的マーカーの少なくとも1つの生理学的パラメータのレベルを検出すること、及び
(iv)前記少なくとも1つのパラメータのレベルと、前記薬候補と接触させていない未処置のサンプルにおけるそのレベルを比較すること
を包含し、処置されたサンプルと未処置のサンプル間の、生理学的パラメータのレベルの差異が、薬候補がA3ARのアゴニストであることを示す方法。 - 薬候補が、疾病細胞中で示される疾病状態の処置に有用なA3ARアゴニストであるか否かを決定する方法であって、前記方法は、
(i)前記薬候補を、前記疾病状態を有する被験者に投与すること、
(ii)投与に続く、1以上の定められた時点において、前記被験者から前記疾病細胞または前記細胞を含む組織のサンプルを取り出すこと、
(iii)前記細胞における、A3AR、またはA3ARの下流にある、A3ARシグナル伝達経路に関連する要素であるところの少なくとも1つの生物学的マーカーの少なくとも1つの生理学的パラメータのレベルを検出すること、及び
(iv)前記少なくとも1つのパラメータのレベルを、前記薬候補を投与されていない被験者から取り出された疾病細胞におけるレベルと比較すること
を包含し、処理されたサンプルと未処理のサンプル間の前記生理学的パラメータのレベルの差異が、前記薬候補がA3ARのアゴニストであることを示す方法。 - 前記A3ARシグナル伝達経路が、Wnt経路である請求項18または19に記載の方法。
- 前記要素が、PKA、PKB/Akt、GSK−3β、β−カテニン、サイクリンD1、c−mycから選択される少なくとも1つの要素である請求項20に記載の方法。
- 前記A3ARシグナル伝達経路が、NF−κB経路である請求項18または19に記載の方法。
- 前記要素が、NF−κB、PI3K、IKK、TNF−α、c−myc、サイクリンD1から選択される少なくとも1つの要素である請求項22に記載の方法。
- 前記生理学的パラメータが、mRNAまたはタンパク発現のレベル、リン酸化のレベル及び細胞局在から選択される請求項18または19に記載の方法。
- 前記疾病状態が、増殖関連疾病である請求項18または19に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US41959502P | 2002-10-21 | 2002-10-21 | |
PCT/IL2003/000857 WO2004036215A2 (en) | 2002-10-21 | 2003-10-21 | Diagnostic markers for therapeutic treatment |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006503564A true JP2006503564A (ja) | 2006-02-02 |
Family
ID=32108110
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004544676A Withdrawn JP2006503564A (ja) | 2002-10-21 | 2003-10-21 | 治療学的処置のための診断マーカー |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1554574A2 (ja) |
JP (1) | JP2006503564A (ja) |
AU (1) | AU2003274649A1 (ja) |
WO (1) | WO2004036215A2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011027722A1 (ja) * | 2009-09-01 | 2011-03-10 | タカラバイオ株式会社 | 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用の組成物 |
JP2012505377A (ja) * | 2008-10-10 | 2012-03-01 | シュ・サン−ジュスティーヌ | 脊柱側弯症の分類および診断方法 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1766060A4 (en) * | 2004-05-14 | 2007-11-28 | King Pharmaceuticals Res & Dev | METHODS FOR DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF SOLID TUMORS AND MELANOMAS |
CA2586773C (en) | 2004-12-02 | 2018-03-27 | Can-Fite Biopharma Ltd. | A biological marker for inflammation |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020115635A1 (en) * | 2001-02-21 | 2002-08-22 | Pnina Fishman | Modulation of GSK-3beta activity and its different uses |
-
2003
- 2003-10-21 EP EP03758622A patent/EP1554574A2/en not_active Withdrawn
- 2003-10-21 JP JP2004544676A patent/JP2006503564A/ja not_active Withdrawn
- 2003-10-21 AU AU2003274649A patent/AU2003274649A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-21 WO PCT/IL2003/000857 patent/WO2004036215A2/en not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012505377A (ja) * | 2008-10-10 | 2012-03-01 | シュ・サン−ジュスティーヌ | 脊柱側弯症の分類および診断方法 |
WO2011027722A1 (ja) * | 2009-09-01 | 2011-03-10 | タカラバイオ株式会社 | 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用の組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2003274649A1 (en) | 2004-05-04 |
WO2004036215A3 (en) | 2004-09-10 |
AU2003274649A8 (en) | 2004-05-04 |
WO2004036215A9 (en) | 2004-08-05 |
EP1554574A2 (en) | 2005-07-20 |
WO2004036215A2 (en) | 2004-04-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230374603A1 (en) | Synthetic lethality and the treatment of cancer | |
EP2820041B1 (en) | Iaspp phosphorylation and metastatic potential | |
Srinivas et al. | 5-Fluorouracil sensitizes colorectal tumor cells towards double stranded DNA breaks by interfering with homologous recombination repair | |
Cohen et al. | Inhibition of IL‐17 and IL‐23 in Human Keratinocytes by the A3 Adenosine Receptor Agonist Piclidenoson | |
JP7319765B2 (ja) | 過敏性膀胱疾患の診断のためのバイオマーカー及びこれを利用した薬剤のスクリーニング方法 | |
US20070031871A1 (en) | Methods of predicting responsiveness to chemotherapeutic agents and selecting treatments | |
Yuan et al. | TIPE3 is a regulator of cell apoptosis in glioblastoma | |
Huang et al. | The role of HDAC2 in chromatin remodelling and response to chemotherapy in ovarian cancer | |
JP2024056774A (ja) | アネキシンa1を介した心血管石灰化の阻害に関する方法および組成物 | |
JP6270719B2 (ja) | 合成致死性および癌の治療 | |
US20040229246A1 (en) | Diagnostic markers for therapeutic treatment | |
US20160215348A1 (en) | Gene expression biomarkers and their use for diagnostic and prognostic application in patients potentially in need of hdac inhibitor treatment | |
JP2006503564A (ja) | 治療学的処置のための診断マーカー | |
Al-Shboul et al. | Differential expression of multidrug resistance protein 5 and phosphodiesterase 5 and regulation of cGMP levels in phasic and tonic smooth muscle | |
US10316319B2 (en) | Composition for diagnosis of liver metastasis of colorectal cancer and the use thereof | |
WO2017003502A1 (en) | Systems and methods for treating cancer | |
WO2017022634A1 (ja) | グリオーマの予後、遠隔部再発リスク及び浸潤を判定する方法及びキット並びにグリオーマを処置するための医薬組成物 | |
JP2007267660A (ja) | 抗癌剤のスクリーニング方法 | |
KR20240023045A (ko) | 암 치료를 위한 진단 방법 및 조성물 | |
KR101927577B1 (ko) | 간암 바이오 마커로서 h2a.z.1의 용도 | |
Revandkar | Characterization of NOTCH signalling pathway in PTEN-deficient prostate tumorigenesis | |
Do Jung | Metformin inhibits lithocholic acid-induced interleukin 8 upregulation in colorectal cancer cells by suppressing ROS production and NF-kB activity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20060823 |