DE69733921T2

DE69733921T2 - Hefestämme für die Braugärung

Info

Publication number: DE69733921T2
Application number: DE69733921T
Authority: DE
Inventors: François Gendre; Pierre Brignon; Jacques Proth; Myriam Shingleton
Original assignee: Brasseries Kronenbourg SA
Current assignee: Brasseries Kronenbourg SA
Priority date: 1996-07-08
Filing date: 1997-07-07
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2017-07-08
Also published as: DE69733921D1; EP0818530A1; FR2750703B1; DK0818530T3; FR2750703A1; EP0818530B1; ES2245789T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Hefestämme für die Braugärung und ein Verfahren zur Selektion dieser Hefen.
Die Braugärung umfasst mehrere Stufen: die Hauptgärung oder alkoholische Gärung, die im Durchschnitt einige Tage dauert, gefolgt von einer Reifungsphase oder einer Warmlagerung mit einer Dauer von einigen zusätzlichen Tagen (3 bis 4 Tage) und vervollständigt von einer Stabilisierungsphase oder Kaltlagerung, die 4 bis 15 Tage dauert und während der die Temperatur bei 0°C gehalten wird.
Die Reifungsphase hat in erster Linie zum Ziel, die Resorption von Diketonen, wie insbesondere 2,3-Pentandion und vor allem Diacetyl, die für die Bildung von unerwünschten Aromen verantwortlich sind, durch die Hefen zu ermöglichen. Diacetyl gibt beispielsweise über einer Grenzkonzentration von 0,05 bis 0,1 ppm dem Bier einen Geschmack von ranziger Butter.
Das Diacetyl resultiert aus der nicht-enzymatischen Oxidation von alpha-Acetolactat, das ein Zwischenprodukt des Biosynthesewegs für Valin ist.
alpha-Acetolactat wird während der Gärung produziert und führt zur Bildung von Pyruvat durch Acetolactatsynthase, produziert durch Gen ILV2. Im normalen Biosyntheseweg des Valins wird das α-Acetolactat dann durch Reduktoisomerase, produziert vom Gen ILV5, in Dihydroxyisovalerat umgewandelt.
Wenn alpha-Acetolactat im Überschuss produziert wird, akkumuliert es im Kulturmedium, wo es zu Diacetyl oxidiert wird. Die Hefe ist fähig, das freie Diacetyl in Verbindungen abzubauen, die bei in Bier angetroffenen Konzentratio nen sensorisch neutral sind. Diese Verbindungen sind Acetoin und 2,3-Butandiol.
Die Oxidation von alpha-Acetolactat in Diacetyl muss demnach vor Eliminierung der Hefen durchgeführt werden, damit diese es abbauen können. Eine der wesentlichen Rollen der Reifungsphase ist es, diese Oxidation und den Abbau des Diacetyls, das sich daraus ableitet, zuzulassen.
Zur Lösung der Probleme, die auf dem Vorliegen von Diacetyl beruhen, im Verlauf der Braugärung und um den Brauprozess zu beschleunigen, wurden zwei Ansätze empfohlen, die auf die Reifungsphase zurückgreifen:

– Beschleunigen der Umwandlung von alpha-Acetolactat in Diacetyl oder
– Reduzieren der Bildung von alpha-Acetolactat.

Die Publikation von J. R. M. HAMMOND, erschienen in YEAST, Bd. 11, (1995), zeigt (Seiten 1619–1620) drei unterschiedliche Techniken auf, die aus dem einen oder dem anderen dieser Ansätze hervorgehen und die Verringerung der im Verlauf der Gärung produzierten Diacetylmenge erlauben.
a) Um die Umwandlung des alpha-Acetolactats zu beschleunigen, wurde vorgeschlagen, alpha-Acetolactatdecarboxylase (ALDC) zu verwenden, die ein Bakterienenzym ist, das alpha-Acetolactat direkt in Acetoin umwandelt.
Dieses Enzym, das in der Hefe nicht vorliegt, kann dem Gärmedium zugesetzt werden; dies zieht auf jeden Fall bedeutende Mehrkosten für die Produktion mit sich.
Das Gen ALDC mit bakteriellem Ursprung kann auch in der Hefe kloniert und exprimiert werden. Die so erhaltenen Hefen bilden genetisch modifizierte Organismen, deren Verwendung Reglementierungen unterworfen ist.
Es wurde auch vorgeschlagen, den metabolischen Durchsatz des Biosynthesewegs des Valins stromabwärts von alpha-Acetolactat zu erhöhen, indem die Kopienzahl des Gens ILV5 erhöht wird. Wie die vorangehende Technik beinhaltet jedoch diese Technik die Modifikation der Hefen durch Gentechnik und weist demnach dieselben Nachteile auf.
b) Im Rahmen des zweiten Ansatzes wurde vorgeschlagen, Mutanten zu selektionieren, in denen die Aktivität der Acetolactatsynthase, die vom Gen ILV2 produziert wird, reduziert ist. Diese Mutanten werden auf der Basis ihrer Resistenz gegenüber einem Herbizid, Sulfometuronmethyl erhalten; einige der resistenten Klone weisen eine Reduktion der Aktivität der Acetolactatsynthase auf, was sich durch eine geringere Produktion an alpha-Acetolactat äußert. Diese Mutanten werden auf der Basis ihres langsamen Wachstums auf Minimalmedium in Abwesenheit von Valin und Isoleucin ausgewählt.
Die Erfinder haben nun durch Selektion, ausgehend von einer industriellen Fermentpräparation, bestehend aus einem Gemisch von Saccharomyces cerevisiae-Stämmen Stämme erhalten, die Vorläufer des Diacetyls und des 2,3-Pentadions in sehr geringen Mengen produzieren und die außerdem diese Letztgenannten sehr schnell resorbieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Reinkultur eines Saccharomyces cerevisiae-Stamms, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm ein Wachstumsverhältnis R, das durch die Formel:
R = (1, 5 T_YPG) + t_YNB (worin t_YPG die Generationszeit auf reichhaltigem Medium darstellt und t die Generationszeit auf Minimalmedium darstellt) definiert ist, von unter oder gleich 6,5 besitzt und dass er aus der Gruppe, bestehend aus:

– dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der k9 genannt wird, der am 20. Juni 1996 bei der CNCM (Collection Nationiale de Cultures de Microorganismes, 28, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS, FRANKREICH) unter der Nummer I-1736 hinterlegt wurde;
– dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der k10 genannt wird, der am 20. Juni 1996 bei der CNCM unter der Nummer I-1737 hinterlegt wurde;
– dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der k11 genannt wird, der am 20. Juni 1996 bei der CNCM unter der Nummer I-1738 hinterlegt wurde;
– dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der k39 genannt wird, der am 20. Juni 1996 bei der CNCM unter Nummer I-1742 hinterlegt wurde;
– dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der k44 genannt wird, der am 20. Juni 1996 bei der CNCM unter der Nummer I-1743 hinterlegt wurde, ausgewählt ist.

Dieser Wert des Wachstumsverhältnisses R gibt die Tatsache wieder, dass diese Stämme gleichzeitig eine kurze Generationszeit, d.h. ein schnelles Wachstum auf reichhaltigem Medium aufweisen und dass ihr Wachstum auf Minimalmedium wenig beeinträchtigt ist. Die Erfinder haben eine Korrelation zwischen diesem Charakteristikum und einem schwachen Gehalt des Mediums an Diketonen und insbesondere an Diacetyl und 2,3-Pentandion am Ende der Gärung konstatiert.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform besitzen Saccharomyces cerevisiae-Stämme gemäß der Erfindung außerdem die folgenden Merkmale:

– eine bedeutende Maltaseaktivität (eine induzierbare Maltaseaktivität über 0,65 Mikromol freigesetztes PNP/Minute/Milligramm Gesamtproteine), was eine vorzeitige und schnelle Verwertung der Maltose erlaubt;
– gute Flockenbildungseigenschaften (eine Rückstandshöhe der Zellen über 8 Millimeter nach den unten in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen), was es vermeidet, auf die Zentrifugation zur Abtrennung der Hefen am Ende der Gärung zurückzugreifen.

Die Hefestämme gemäß der Erfindung sind zur Bierherstellung einsetzbar. Diese Verwendung ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. In diesem Rahmen werden die Stämme der Erfindung vorteilhafterweise isoliert oder auch in Kombination miteinander verwendet.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Brauferment, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem Stamm gemäß der Erfindung oder einem Gemisch aus Stämmen gemäß der Erfindung besteht.
Die Hefen gemäß der Erfindung bieten einen wichtigen Vorteil für die Gesamtdauer des Bierherstellungsverfahrens und den Erhalt eines Produktes mit verbesserten organoleptischen Qualitäten. Der Vorteil bezüglich der Dauer des Bierherstellungsverfahrens resultiert gleichzeitig in einer schnellen Hauptgärung und auch in einer drastischen Verringerung, sogar der Suppression der Reifungsphase.
Die Dauer der Hauptgärung wird infolge einer erhöhten Geschwindigkeit des Verbrauchs der fermentierbaren Zucker und einer gleichzeitigen Fermentation der Maltose und der Glucose, die in der Würze enthalten sind, verringert (diese Stämme weisen keine Diauxie auf, die den sequentiellen Verbrauch der Glucose und der Maltose mit sich zieht).
Die Reifungsphase ist beträchtlich reduziert, sogar supprimiert, und zwar aufgrund der Tatsache der Produktion sehr schwacher Mengen an Diacetyl und 2,3-Pentandion und ihrer schnellen Resorption. Somit liegt die Konzentration dieser Verbindungen an einer Schwelle, die für das Ende der Gärungsphase akzeptabel ist.
Die organoleptische Qualität des Biers ist infolge der Schnelligkeit der zwei Stufen der Gärung und der Reifung verbessert, denn die langsamen Gärungen führen zu Produkten mit sehr schwacher Qualität.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Hefen erlaubt somit einen beträchtlichen Zeitgewinn für die Gesamtheit des Herstellungsverfahrens, eine erhöhte Produktivität der Anlagen für die Hauptgärung und eine bedeutende Verringerung der Investitionen für das Material, das für die Reifungsphase notwendig ist.
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der Beschreibungsergänzung, die nun folgt, besser verständlich; diese bezieht sich auf Ausführungsformen der Hefen gemäß der Erfindung.
Es muss selbstverständlich sein, dass diese Beispiele allein zur Erläuterung des Gegenstands der Erfindung angeführt werden, für den sie in keiner Weise eine Beschränkung darstellen.
BEISPIEL 1: MERKMALE DER HEFEN GEMÄSS DER ERFINDUNG
Die morphologischen und biochemischen Charakteristika verschiedener Stämme, die ausgehend von einem industriellen Ferment, als „mélange 2285" bezeichnet, erhalten wurden, sind in den Tabellen I und I bis angegeben.
Die Stämme gemäß der Erfindung sind die Klone k9, k10, k11, k39 und k44.
TABELLE I
TABELLE I bis
Karyotyp:
Man kultiviert die Hefen während 24 Stunden bei 30°C unter Bewegung (160 Upm) auf YPG-Medium (2% Hefeextrakt, 1% Pepton, 2% Glucose).
Der Karyotyp jedes der Klone wird durch Elektrophorese in gepulstem Feld mit Hilfe des Systems CHEF MAPPER von BIO-RAD (BIO-RAD S.A., IVRY-SUR-SEINE) nach Anweisungen des Herstellers analysiert.
Es werden zwei Wanderungen realisiert: eine erlaubt die Trennung der Gesamtheit der Chromosome von Saccharomyces cerevisiae mit sehr guter Auflösung der Chromosomen mit mittlerem Molekulargewicht (597 bis 1005 kb) und die andere erlaubt die Trennung der Chromosome mit niedrigem Molekulargewicht (150 bis 300 kb).
So zeigen die Klone k9, k10, k11, k16, k31, k44, k39, k3 und k12 die in 1 dargestellten Karyotypen:
Legende der 1 (Wanderung der Gesamtheit der Chromosome)
Bahnen:

1 und 11: Stamm YNN295
2: Klon k11
3: Klon k9
4: Klon k10
5: Klon k16
6: Klon k31
7: Klon k44
8: Klon k39
9: Klon k3
10: Klon k12

Der Saccharomyces cerevisiae-Laborstamm YNN295 wurde als Marker für das Molekulargewicht verwendet.
BEISPIEL 2: WACHSTUMSTESTS
Kulturmedien
Die Hefen werden während 48 bis 72 Stunden auf zwei synthetischen Medien bei 30°C kultiviert: „reichhaltiges" YPG-Medium, bestehend aus:

– 2% Hefeextrakt
– 1% Pepton
– 2% Glucose.

„Armes" YNB-Medium mit der folgenden Zusammensetzung:

– 0,67% Hefe-Stickstoffbase (ohne Aminosäuren)
– 2% Glucose.

Die festen Medien werden erhalten, indem 2% Agar zu dem flüssigen Medium gegeben wird.
Alle Medien werden 20 Minuten bei 110°C autoklaviert.
Ausgehend von Klonen, die auf YPG-Medium oder YNB-Medium (0,67% Hefe-Stickstoffbase, 2% Glucose, 2% Agar) kultiviert worden waren, beimpft man jeweils das YPG-Medium oder das YNB-Medium (YNB ohne Agar fest) derart, dass eine OD_595nm = 10⁷ Zellen/ml erhalten wird. Jede Kultur wird 9 Stunden lang unter Bewegung (160 Upm) mit Entnahmen jede Stunde ab Beginn der Kultur, um die OD₅₉₅ nm zu messen, inkubiert. Am Ende des Experiments wird jede Kultur im Lichtmikroskop untersucht, um die Abwesenheit von Kontamination sicherzustellen.
Die Generationszeit wird berechnet, wenn das Wachstum sich in der exponentiellen Phase befindet.
Berechnung der Generationszeit (g):

X = Zellkonzentration zur Zeit t und
n = Generationszahl.

Das Wachstum gehört demnach zum Typ: Xt2 = 2n × Xt1 wobei: n = ln(Xt2/Xt1)/ln2
Die Generationszeit „g", die als g = t/n definiert ist, wird für t = 2h im linearen Teil der Kurven (umfassend zwischen 4 h und 6 h) errechnet: g = 2 × ln2/ln(Xt2/Xt1).
Die Generationszeit der Klone k9, k10, k11, k16, k31, k44, k39, k3 und k12 ist in der Tabelle II unten angegeben:
TABELLE II
BEISPIEL 3: MALTASEAKTIVITÄT
Die Maltaseaktivität der Klone wird durch das Verfahren von HALVORSON und ELIAS [Biochem. Biophys. Acta, 30, 28 (1958)] gemessen.
Man kultiviert die Hefen während 24 Stunden bei 30°C auf festem YPG-Medium. Eine Öse mit 10 Mikroliter NUNC (POLYLABO)-Hefen wird in 1 Milliliter sterilem Wasser resuspendiert. Die Hefen werden durch Zusatz von 0,15 Milliliter Chloroform permeabilisiert. Man bewegt das ganze 30 Minuten lang bei 30°C, dann ergänzt man mit sterilem Wasser mit 4°C auf 2 Milliliter. Dann wird die konstitutive Maltase dosiert.
Die induzierbare Maltaseaktivität wird durch Kultur der Hefen unter denselben Bedingungen, wie sie oben beschrieben wurden, aber auf festem YPM-Medium gemessen.
Die Maltaseaktivität der Klone k9, k10, k11, k16, k31, k44, k39, k3 und k12, ausgedrückt in Mikromol PNP (p-Nitrophenyl-alpha-D-glucopyranosid), die pro Minute und pro Milligramm Gesamtprotein freigesetzt werden, ist in der Tabelle III unten dargestellt:
TABELLE III
BEISPIEL 4: TEST AUF AUSFLOCKUNG
Das Ausflocken der Klone wird in folgender Weise gemessen. Die Hefen werden auf festem YPG-Medium kultiviert, dann punktförmig in YPG-Medium aufgetragen, zu einer OD₅₉₅ _nm = 0,2 bei 30°C kultiviert, und zwar bis zur Erschöpfung des Mediums. 10 Milliliter Kulturen werden dann in graduierte konische Röhrchen (Becton Dickinson, vertrieben von COGER, 79 rue des Morillons, 75015 PARIS CEDEX) übertragen. Nach 6 Stunden bei Umgebungstemperatur wird die Höhe des Rückstands der ausgeflockten Zellen in Millimeter gemessen.
Die Ausflockung der Klone k9, k10, k11, k16, k31, k44, k39, k3 und k12 ist in der Tabelle IV unten dargestellt: TABELLE IV
F = schwaches Ausflocken, Höhe des Rückstands der Zelle unter 7 Millimeter
M = mittleres Ausflocken, Höhe des Zellrückstands liegt zwischen 7 und 8 Millimetern
B = starkes Ausflocken, Höhe des Zellrückstands liegt über 8 Millimetern.
BEISPIEL 5: UNTERSUCHUNG DER STÄMME UNTER DEN BEDINGUNGEN EINER BRAUGÄRUNG
Die entsprechenden Stämme werden dann unter Bedingungen der Braugärung in TOD („Tank Out Door", zylindrischer konischer Tank) mit 10 Hektoliter getestet. Die Bedingungen zur Tanklagerung sind die Folgenden: Würze mit 14° PLATO (Messeinheit der Dichte in der Brauerei, die den prozentualen Anteil an Extrakt als Gewicht bei 20°C darstellt, und dem Gewicht der Saccharoselösungen, bestimmt bei 20°C entspricht, zurückgeführt auf das Gewicht desselben Volumens an Wasser bei 4°C), Beimpfung mit 15 × 10⁶ Zellen/ml, Belüftung mit 10 ppm während der gesamten Dauer der Lagerung im Tank, Temperatur bei Lagerung im Tank 10°C. Das Temperaturprofil für alle Gärungen ist das Folgende: 10°C bis 7° PLATO, dann 12°C bis zum Ende der Reifung. Die Überwachung der Dichte wird jeden Tag durchgeführt, die Überwachung der Vorläufer von Diacetyl und 2,3-Pentandion wird bis zum Erreichen der Endnormen der Reifung durchgeführt (220 ppb für Diacetyl, 180 ppb für 2,3-Pentandion).
In der folgenden Tabelle V sind die erfindungsgemäßen Klone nach ihrer Gärgeschwindigkeit, ausgedrückt durch TPFER, die Dauer zur Erreichung von 94% der Grenzabschwächung (d.h. Verbrauch von 94% der fermentierbaren Zucker), klassifiziert.
TABELLE V
Man beobachtet, dass all diese Klone TPFER-Werte unter 210 Stunden haben. Die Klone, die nach ihrer niedrigen Generationszeit auf reichem. und armem Medium, ihrer bedeutenden Maltaseaktivität und ihrer guten Ausflockungseigenschaften selektioniert wurden, d.h. die Klone K11, K9, K44, K39 und K10, haben alle TPFER-Werte unter 210 Stunden.
Die unten stehende Tabelle VI klassifiziert die Klone nach der Zeit, die zur Resorption der Vorläufer benötigt wird.
TABELLE VI
Die Kurven der 2 und 3 zeigen die Vergleiche des Gärverhaltens des Klons k11 und von Mélange 2285. 2 stellt die Resorption der Diacetylvorläufer als Funktion der Kulturzeit dar. 3 stellt die Variation der Dichte in °PLATO als Funktion der Kulturzeit dar.

Claims

Reinkultur eines Saccharomyces cerevisiae-Stamms, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm ein Wachstumsverhältnis R, das durch die Formel R = (1,5 T_YPG) + t_YNB, worin T_YPG die Generationszeit auf reichhaltigem Medium darstellt und t_YNB die Generationszeit auf Minimalmedium darstellt, definiert ist, von unter oder gleich 6,5 besitzt und dass er aus der Gruppe, bestehend aus: – dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der k9 genannt wird, der am 20. Juni 1996 bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28, rue due Docteur Roux, 75724 PARIS, FRANKREICH) unter der Nummer I-1736 hinterlegt wurde; – dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der k10 genannt wird, der am 20. Juni 1996 bei der CNCM unter der Nummer I-1737 hinterlegt wurde; – dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der k11 genannt wird, der am 20. Juni 1996 bei der CNCM unter der Nummer I-1738 hinterlegt wurde; – dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der k39 genannt wird, der am 20. Juni 1996 bei der CNCM unter der Nummer I-1742 hinterlegt wurde; – dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der k44 genannt wird, der am 20. Juni 1996 bei der CNCM unter der Nummer I-1743 hinterlegt wurde, ausgewählt ist.
Verwendung von Reinkulturen von Saccharomyces cerevisiae-Stämmen nach Anspruch 1 zur Bierherstellung, wobei die Stämme isoliert oder in Kombination miteinander verwendet werden.
Brauferment, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer Reinkultur eines Saccharomyces cerevisiae-Stamms oder einer Kultur eines Gemisches von Stämmen nach Anspruch 1 besteht.