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Erfindungsgebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Verhindern und/oder Behandeln
von Erkrankungen, die mit einer Dysfunktion von NOS assoziiert sind,
umfassend als wirksamen Inhaltsstoff eine Verbindung der Formel
(I):
wobei R
1 und
R
2 jeweils ein Wasserstoffatom darstellen
oder zusammengenommen eine Einfachbindung darstellen, während R
3 -CH(OH)CH(OH)CH
3,
-CH(OCOCH
3)CH(OCOCH
3)CH
3, -CH
3, -CH
2OH, oder eine Phenyl-Gruppe darstellt, wenn R
1 und
R
2 jeweils ein Wasserstoffatom darstellen,
oder -COCH(OH)CH
3, wenn R
1 und
R
2 zusammen eine Einfachbindung darstellen,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
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Stand der Technik
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Das Gefäßendothel war bekannt dafür, daß es eine
wichtige Rolle im Gefäßtonus oder
der Thrombopoiese spielt, und es war 1980, daß das Vorhandensein eines Endothelium-derived
relaxing factor (EDRF) zuerst berichtet wurde. 1987 wurde bewiesen,
daß die
EDRF-Entität
Stickstoffmonoxid (NO) ist. NO wird hergestellt, wenn L-Arginin
aus NG-Hydroxyl-L-arginin
in L-Citrullin oxidiert wird, und die Reaktion durch ein Enzym namens
NO-Synthase (NOS) katalysiert wird. NOS existiert weitverbreitet
im Gefäßendotehl,
im Nervensystem, den Nieren, den Plättchen, der Herzmuskeln, den
glatten Muskeln, etc. und es hat eine wichtige Rolle bei der Kontrolle
der systemischen Zirkulation, da das gebildete NO eine große Vielzahl
an Wirkungen hat. Die folgenden Erkrankungen mit abgesenkter NO-Produktion
sind bekannt: kardiovaskuläre
Erkrankungen wie beispielsweise Hypertension, Hyperlipämie, Arteriosklerose,
ischämische
Herzerkrankungen, Herzversagen, Thrombose; respiratorische Erkrankungen
wie beispielsweise Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen,
pulmonäre
Hypertension, ARDS; Gastrointestinalerkrankungen wie beispielsweise
Hepatopathie, Leberzirrhose, Gastrointestinal-Schleimhauterkrankungen,
hypertrophe pylorische Stenose, Pankreatitis; zerebrovaskuläre Erkrankungen
wie beispielsweise Zerebralischämie,
Infarkt, zerebrovaskuläres
Versagen, senile Demenz; Nieren- oder urologische Erkrankungen wie
beispielsweise Nierenstörungen,
Impotenz; gynäkologische
Erkrankungen wie beispielsweise Blutvergiftung; Infektionserkrankungen,
immunologische Störungen, Diabetes,
Verbrennungen; oder Erkrankungen, die durch Medikamente verursacht
werden, die die NO-Produktion
absenken. Das NOS-Gen wurde kloniert und strukturell analysiert.
Als Ergebnis wurde herausgefunden, daß das NOS-Gen eine Bindungsstelle
für (6R)-L-Erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin
(nachfolgend als "BH4" bezeichnet) enthält, das
in Verbindungen der Formel (I) als aktive Inhaltsstoffe der vorliegenden
Erfindung eingeschlossen ist, zusätzlich zu solchen für Co-Enzyme
wie beispielsweise Calmodulin (CaM), Flavin, NADPH. Außerdem wurde
vermutet, daß BH4
tatsächlich
an der Kontrolle der NOS-Funktion
beteiligt ist.
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Veränderte Seite 3, 3a der Beschreibung
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Andererseits wurde berichtet, daß der Blutdruck
bei Versuchstieren, denen intravenös ein NOS-Inhibitor injiziert
wurde (Sakuma I. et al., Circ. Res. 70: 607–611, 1992), anstieg. Eine
abgesenkte Produktion an endogenem NO wurde ebenfalls in einem Tiermodell
für Hypertension
wie beispielsweise in DOCA-Salz-Hypertensionsratten, SHR-SP-Ratten,
Dahl-S-Ratten, Goldblatt-Hypertensionsratten
beschrieben.
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INOUE, E. et al.: JOURNAL OF THE
AMERICAN SOCIETY OF NEPHROLOGY, Bd. 7, Nr. 9, September 1996 (1996–09), Seiten
1534–1535
offenbart, daß Tetrahydrobiopterin
die Entwicklung von DOCA-Salz-Hypertension in Ratten aufhebt. Dieses
Dokument ist ein nachveröffentlichtes
Dokument der vorstelligen Erfindung.
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Außerdem beschreibt PRAST, H.
et al., BIOLOGY OF NITRIC OXIDE, PROC. INT. MEET, 2ND, Bd. 1, 1992,
S. 10–12
die Wirkungen einer Sepiapterin-Behandlung
auf die Tetrahydrobiopterin-Niveaus und dem Blutdruck in spontan
hypertensiven Ratten.
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KUKOR, Z. et al., PLACENTA, Bd. 17,
Nr. 1, Januar 1996, Seiten 69–73
bezieht sich gleichermaßen auf
calciumabhängige
Stickstoffoxid-Synthese, die durch Tetrahydrobiopterin in der menschlichen
Primordialplazenta stark stimuliert wird. Kein Dokument liefert
einen direkten Beweis dafür,
der die pharmakologischen Wirkungen von BH4 auf Erkrankungen zeigt,
die mit einer Fehlfunktion von NOS assoziiert sind.
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Aus dem Artikel von Amoah-Apraku
B. et al. in dem Journal of the American Society of Nephrology, Bd.
5, Nr. 8, 1995, Seiten 1630–1633
ist bekannt, daß Guanosintriphosphatcyclohydrolase
die Stickstoffoxid-Synthese in den proximalen Tubuli der Nieren
reguliert.
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Des weiteren berichtet Bune A. J.
et al., Experimental Neurology, Bd. 4, Nr. 1, 1996, Seiten 43 bis
47 daß die
Hemmung der Tetrahydrobiopterin-Synthese
die Stickstoffoxid-Produktion durch isolierte Glomeruli in einer
Immunkomplex-Glomerulonephritis reduziert. Diese Erkrankung ist
mit einer gesteigerten NOS-Aktivität assoziiert.
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Die Ursache für die abgesenkte NO-Produktion
in diesen Modellen ist jedoch nicht aufgeklärt worden. Es gibt auch eine
Anzahl an Berichten, daß die
NO-Produktion in Spontan-Hypertensionsratten (SHR), die oft als
hypertensive Versuchstiere verwendet werden (Dominizak A. F. et
al., Hypertension 25: 1202–1211,
1995) eher erhöht
ist. Im Fall von SHR kann auch vermutet werden, daß NO gegen
den hyptertensiven Zustand zum Senken des Blutdrucks übermäßig freigesetzt
wird, aber die Wirkung von NO nicht ausreichend ist (Nava E. et al.,
Circulation 92: I-347, 1995). Obwohl darauf hingewiesen wurde, daß NO an
der Ätiologie
der Hypertension beteiligt sein kann, ist die Beziehung zwischen
der NOS-Aktivität
und der Hypertension noch nicht vollständig aufgeklärt worden.
Das Absinken der vasodilativen Reaktion bei der Hypertension kann
auch durch eine abgesenkte Aktivität des Endothelium-derived hyperdepolarizations
factor (EDHF) oder durch einen Anstieg der Mengen des Endothelium-derived
circulating factor (EDCF) verursacht sein, welche beide in ihrer
Entität
unbekannt waren.
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Das bedeutet, daß die vasorelaxierende Wirkung
von NO und die Kontrolle der NOS-Funktionen durch BH4 zu einem gewissen
Grad bekannt waren. Die Ursache für eine abgesenkte NO-Produktion
und die Beziehung zwischen der NOS-Aktivität und Hypertension waren jedoch
noch nicht aufgeklärt,
und es war nichts über die
antihypertensive Wirkung von BH4 wie auch über die Rolle von BH4 bei der
Regulierung des Blutdrucks bekannt.
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In viele industrialisierten Ländern sind
kardiovaskuläre
Erkrankungen eine der Haupttodesursachen. Zahlreiche Medikamente
wie beispielsweise Mittel gegen Hypertension, Mittel gegen Hyperlipämie, Diuretika, Vasodilatoren,
Antiplättchenmittel
sind bei der Behandlung von Erkrankungen verwendet worden. Viele
davon sind jedoch darauf angelegt, Parameter wie den Blutdruck oder
den Cholesterol-Gehalt zu verbessern, sind aber noch immer nicht
zufriedenstellend bei der Verhinderung des Auftretens, der Verzögerung oder
Verschlechterung oder dem Voranschreiten und der Langzeitprognose
dieser Erkrankungen. Kürzlich
wurde durch das Untersuchen auf molekularer Ebene anhand der oben
genannten Erkrankungen eine therapeutische Strategie, die auf Blutgefäße, insbesondere
Endothelzellen gerichtet ist, als eine der vielversprechendsten
Therapien durch Behandlung mit einem Mittel vorgeschlagen, das die
Produktion der EDRF-Endität
reguliert, d. h. NO, oder einem Mittel, daß eine antioxidierende Wirkung
hat (Gibbons, G. H., Dzau, V. J., Science, Bd. 272, 689–693, 1996).
Es wurde jedoch noch kein Medikament oder eine Therapie etabliert,
die diese therapeutische Strategie ermöglicht.
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Nitratmittel (Nitroglycerin-Präparate,
etc.) sind als wirksam als exogene NO-Donoren für das Behandeln von Angina,
Herzversagen und ähnliche
aus den oben genannten Erkrankungen angesehen worden, aber sie haben
bei Langzeitverwendung Toleranz gezeigt. Insbesondere werden Thiol-Gruppen
(SH-Gruppen) während der
Langzeitverwendung von Nitrat-Gruppen depletiert, da SH-Gruppen
für die
NO-Produktion aus diesen Nitratmitteln unverzichtbar sind. Außerdem kann
das Gleichgewicht weiterer endogener Substanzen während der
Langzeitverwendung gestört
werden, da die NO-Produktion Stoffwechselenzyme benötigt, und
weitere NO-ähnliche
Materialien wie beispielsweise Nitrosothiol während der Reaktion hergestellt
werden. Eine neue Art von NO-Donoren
mit den Eigenschaften von β-Blockern
oder K+-Kanalöffnern sind ebenfalls entwickelt
worden, aber sie sind noch immer innerhalb des Bereichs der oben
genannten NO-Donoren. Deswegen ist die Verbesserung der Funktionen
der Endothelzellen während
des Regulierens der endogenen NO-Funktion
als einer der idealsten therapeutischen Wege zur Verhinderung des
Auftretens, der Verzögerung
oder Verschlechterung oder dem Voranschreiten und der Langzeitprognose
dieser Erkrankungen vorgeschlagen worden.
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Die spontane NO-Produktion in vivo
oder die Aktivierung von NOS scheint das beste therapeutische Verfahren
zu sein. Ein Substrat für
NOS, L-Arginin, ist auf seine Wirkung gegen Erkrankungen wie beispielsweise
Hypertension (Higashi, Y. et al., Hypertension 1995, 25, 898–902) Angina
(Egashira, K. et al., Circulation 1996, 94, 130–134), Herzversagen (Rector
T. S. et al., Circulation 1996, 93, 2135–2141) oder ähnliche
untersucht worden.
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Es wurde jedoch berichtet, daß eine Vasodilatierungsreaktion,
die vom Endothel abhängig
ist und eine Nieren-NO-Produktion nur teilweise durch Langzeitverabreichung
von L-Arginin (Hayakawa H., Hirata Y., Omata M. et al., Hypertension
1994: 23: 752–756)
bei DOCA-Salz-Hypertentionsratten wieder hergestellt wurden, einem
gutbekannten Hyptertensionsmodell, bei dem die endothelabhängige Vasodilatationreaktion
durch Acetylcholin und die Nieren-NO-Produktion zum Ausgangspunkt
und durch die Stimulierung von Endotheliun-Rezeptoren (ETB) gesenkt
sind (Hirata Y., Hayakawa H., Omata M. et al., Circulation 1995:
91: 1229–1235). Es
wurde auch berichtet, daß L-Arginin-Verabreichung
zu einem Absinken des Blutdruckes in Hypertensionspatienten führt, ähnlich wie
bei gesunden Personen, aber es brachte keinen Anstieg beim renalen
Blutfluß und kein
Absinken der Filtrationsfraktionierung und Resistenz der Nierengefäße, die
bei gesunden Personen gefunden wird, und eine signifikante Abnahme
von cGMP im Blut wurde bei Hyptertensionspatienten beobachtet (Higashi
Y., Ohshima T. Kajiyama G. et al., Hypertension 1996: 25: 898–902). Diese
Tatsachen legen nahe, daß eine
unzureichende NO-Produktion in der Nierenzirkulation weder aus dem
Mangel des Substrates L-Arginin noch nur durch das Abnehmen der
enzymatischen Aktivität
von NOS resultiert. Demgemäß kann die
Beteiligung des L-Arginin-NO-Systems
bei der Kontrolle der renalen Zirkulation und beim Mechanismus der
Abnahme der endothelabhängigen
Vasodilatationsreaktion nicht durch unzureichende Verwendung oder
Mangel des Substrates L-Arginin erklärt werden. Deswegen sollte
weiter untersucht werden, ob die Veränderung der NOS-Aktivität oder Quantität an diesem
Phänomen
beteiligt ist.
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Der Zweck der antihypertensiven Therapie
liegt darin, daß Leben
der Patienten in einem zufriedenstellenden Zustand durch das Verhindern
kardiovaskulärer
Komplikationen aufgrund der Hypertension zu verlängern. Zu diesem Zweck muß der Blutdruck über eine
lange Lebensdauer durch Mittel gegen Hypertension zusätzlich zu
allgemeinen Therapien wie beispielsweise Salzreduzierung, Verbesserung
der Obesität,
Kinesetherapie etc. kontrolliert werden.
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Heutzutage am häufigsten verwendeten therapeutische
Mittel gegen Hypertension schließen Thiazide, R-Blocker, Ca-Antagonisten,
Angiotensin-Converting-Enzyme
(ACE)-Inhibitoren und α1-Blocker ein. Keines davon befriedigt jedoch
die folgenden Bedingungen, die für
Antihypertensiva wünschenswert
sind:
- 1. Milde Wirkweise und stabile Wirkungen;
- 2. Weniger Nebeneffekte in einem frühen Verwendungsstadium;
- 3. Wünschenswerter
Einfluß auf
die Zirkulationssysteme und die organischen Funktionen;
- 4. Keine unerwünschten
Wirkungen auf Faktoren, die für
kardiovasukläre
Systeme nachteilig sind, sondern eher eine Verbesserung bei Langzeitverwendung;
- 5. Bessere Compliance der Patienten mit der Therapie;
- 6. Keine Gegenanzeigen aufgrund verschiedener Komplikation und
zufälliger
Symptome;
- 7. Ein zufriedeneres Leben, das als Ergebnis der Therapie erwartet
werden kann.
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Gegenwärtig verwendete Antihypertensiva
haben die folgenden Probleme. Auf Thiazid basierende Diuretika werden
vorzugsweise angewendet, wenn einer Salzbegrenzung schwierig zu
folgen ist oder eine Neigung zur Flüssigkeitsretention beobachtet
wird, aber sie sind nicht Patienten mit einer abnormalen Glucosetoleranz,
Hyperurikämie,
Nierenfehlfunktion, Hyperlipämie
oder Hypokalämie
zu empfehlen.
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β-Blocker
werden vorzugsweise bei jungen oder tachykardischen Patienten angewendet,
aber sie werden nicht bei Patienten mit Bronchialasthma, chronisch
obstruktiver Pulmonarerkrankung, obstruktiven Läsionen der peripheren Arterien
oder Raynoud's-Symptomen
empfohlen. Sie sind aufgrund des Einflusses auf die Insulinsekretion
ebenfalls für
Hypertensionspatienten mit Diabetes ungeeignet.
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Dihydropyridin-Derivate unter den
Ca-Antagonisten haben die folgenden Nebeneffekte, d. h. ihre vasodilatorische
Wirkung kann Gesichtsrötungen
und Kopfschmerzen hervorrufen, und ihre stark hypotensive Wirkung
kann Hypotension, Schwindel und Tachykardie oder Palpitation aufgrund
von Hypertonus des Sympathicusreflexes verursachen.
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ACE-Inhibitoren haben Nebeneffekte
wie beispielsweise orthostatische Hypotension, trockenen Husten,
vaskuläre Ödeme, Hyerkalämie etc.
Bei Fällen
von Nierendysfunktion, sollte auf die Dosierung und die Hyperkalämie geachtet
werden, da sie hauptsächlich
aus den Nieren exkretiert werden. von einigen wurde berichtet, daß sie schädliche Wirkungen
auf den Fetus haben und deswegen sind sie für schwangere Frauen kontraindiziert.
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α1-Blocker sollten vorsichtig angewendet werden,
so daß sie
keine Nebeneffekte, wie beispielsweise orthostatische Hypotension,
verursachen.
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Das bedeutet, daß hinsichtlich der Nebenwirkungen,
der Sicherheit bei der Langzeitanwendung und Verbesserung der QOL
gegenwärtig
kein Medikament vollständig
zufriedenstellend ist, obwohl viele Mittel gegen Hypotension mit
verschiedenen Wirkungen vorhanden sind. Zusätzlich ist das vorherrschende
Ziel einer antihypertensiven Therapie darin bestehend, daß Voranschreiten
der Hypertensions-induzierten organischen Störungen zu verhindern und die
Häufigkeit
von Herzversagen, Nierenversagen und Zerebralapoplex und die daraus
entstehende Mortalität
zu senken. Antihypertensive Therapie kann einen Anstieg in der Anzahl
an Patienten mit Hpyertensions-induziertem Nierenversagen nicht
verhindern, obwohl berichtet wurde, daß eine antihypertensive Therapie
die Mortalität
bei Herzversagen und Zerebralapoplex verbessert. Bei der akuten
oder chronischen Glomerulonephritis oder ähnlichen wird die Hypertension
durch eine glomeruläre
Störung
verursacht. Es ist gezeigt worden, daß eine chronische Glomerulonephritis
mit Hypertension eine schlechte Prognose hat, und die Hypertension
ist einer der unabhängigen
prognostischen Verschlechterungsfaktoren bei der chronischen Glomerulonephritis.
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Es wurde jedoch keine Therapie für die Hypertension
bei der chronischen Glomerulonephritis etabliert.
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Deswegen sind therapeutische Mittel
benötigt,
die wirklich wünschenswerte
Wirkweisen zur Verfügung stellen,
und insbesondere die Entwicklung von Mitteln mit einer Schutzwirkung
für die
Nieren sind sehr gefragt.
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Die Verbindungen der Formel (I) als
wirksame Inhaltsstoffe in den erfindungsgemäßen therapeutischen Mitteln
sind bekannte Verbindungen zur Verwendung in therapeutischen Mitteln
gegen maligne Hyperphenylalaninämie,
Depression, Parkinsonsche Erkrankung, etc. Siehe z. B. die japanische
Patentveröffentlichungsoffenbarung
(KOKAI) Nrn. 25323/84, 76086/84, 277618/86 und 267781/88.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Das Ziel der vorliegenden Erfindung
liegt darin, ein sicheres therapeutisches Mittel, das die zirkulatorischen
und organischen Funktionen verbessert, das Voranschreiten von Komplikationen
verzögert
und die Lebensqualität
von Patienten durch das Verhindern des Absinkens der endogenen NO-Produktion und das
Regulieren der Funktionen der Endothelzellen, bei Erkrankungen die
mit einer NOS-Fehlfunktion assoziiert sind, zur Verfügung zu
stellen.
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Basierend auf den Ergebnissen zahlreicher
Studien wurde hypothetisch angenommen, daß das BH4-Niveau bei Erkrankungen,
die mit einer NOS-Fehlfunktion
assoziiert sind, auch gesenkt sein können. Daher wurde BH4 DOCA-salt
hypertension rats und DOCA-salt SHRs verabreicht, um die Hypothese
zu testen. Es wurden gefunden, daß das BH4-Niveau, und noch überraschender
das Expressionsniveau von NOS, tatsächlich in DOCA-salt hypertension
rats gesenkt war. Bei der BH4-Verabreichung wurde eine Abnahme der endogenen
NO-Produktion verhindert und physiologisch natürliche antihypertensive Wirkungen
wurden erreicht. DOCA-salt SHRs wiesen ebenfalls eine tatsächliche
Abnahme des BH4-Niveaus wie auch histopathologische Befunde wie
beispielsweise nekrotisierende Glomerulitis und nekrotisierende
Angiitis auf. Bei einer BH4-Verabreichung wurden antihypertensive
Wirkungen wie auch bemerkenswerte Verbesserungswirkungen auf die
histopathologischen Befunde durch das Regulieren der Funktionen
der Endothelzellen erreicht. Daher wurde die vorliegende Erfindung
auf der Grundlage vollendet, daß BH4
eine Wirkungsweise hat, die die gesenkte NOS-Funktion aktiviert.
Demgemäß ist die
vorliegende Erfindung auf eine wirksame Therapie mit BH4-Präparaten
bei Erkrankungen ausgerichtet, die mit einer NOS-Fehlfunktion assoziiert
sind.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt
den zeitlichen Verlauf der Blutdruckveränderung bei einer Kontrollgruppe
(-O-), der DOCA-Gruppe (-Δ-)
und einer Gruppe von DOCA salt hypertension rats, denen oral BH4
verabreicht wurde (DOCA + BH4-Gruppe,
-☐-).
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2 zeigt
den zeitlichen Verlauf der Veränderung
des NO2/NO3-Gehalts im Urin in
einer Kontrollgruppe (-O-), der DOCA-Gruppe (-Δ-) und einer Gruppe von DOCA
salt hypertension rats, denen oral BH4 verabreicht wurde (DOCA +
BH4-Gruppe, -☐-).
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3 zeigt
den zeitlichen Verlauf der Veränderung
der BP-Gehalts in dem Urin einer Kontroll-Gruppe (-O-), der DOCA-Gruppe
(-Δ-) und
einer Gruppe von DOCA salt hypertension rats, denen oral BH4 verabreicht wurde
(DOCA + BH4-Gruppe, -☐-).
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4 zeigt
die Ergebnisse der Messung der E-NOS-mRNA-Expression in Nierengeweben.
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5 zeigt
den zeitlichen Verlauf der Blutdruckveränderung in einer Kontrollgruppe
(-•-),
der DOCA-Gruppe (-Δ-)
und einer Gruppe von DOCA salt hypertension rats, denen oral BH4
verabreicht wurde (DOCA + BH4-Gruppe,
-O-).
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6 zeigt
den zeitlichen Verlauf der Veränderung
des BP-Gehaltes im Urin einer Kontroll-Gruppe (-•-), der DOCA-Gruppe (-Δ-) und einer
Gruppe von DOCA salt hypertension rats, denen oral BH4 verabreicht wurde
(DOCA + BH4-Gruppe, -☐-).
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7 zeigt
die Häufigkeiten
histopathologischer Befunde bei der nekrotisierenden Glomerulitis
und der nekrotisierenden Angiitis in einer Kontrollgruppe, COCA-Gruppe
und COCA + BH4-Gruppe in Nierengewebeproben.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Verhindern und/oder Behandeln
von Erkrankungen, die mit einer NOS-Fehlfunktion assoziiert sind,
umfassend als wirksamen Inhaltsstoff, eine Verbindung der Formel
(I):
wobei R
1 und
R
2 jeweils ein Wasserstoffatom oder zusammengenommen
eine Einfachbindung darstellen, während R
3 -CH(OH)CH(OH)CH
3, -CH(OCOCH
3)CH(OCOCH
3)CH
3, -CH
3, -CH
2OH, oder eine
Phenyl-Gruppe darstellt, wenn R
1 und R
2 jeweils ein Wasserstoffatom darstellen,
oder -COCH(OH)CH
3, wenn R
1 und
R
2 zusammen eine Einfachbindung darstellen,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
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Nach der hier gemachten Verwendung
bedeutet NOS-Fehlfunktion, das die Expression von NOS, die im Gefäßendothel,
Nervensystem, Niere, Plättchen,
Myokard, glatten Muskeln und anderen Organen umfassend auftritt,
aus irgendeinem Grund reduziert ist oder, daß die NOS-Wirkung aufgrund
der Fehlfunktion dieser Zellen, selbst wenn sie exprimiert wird,
nicht gezeigt wird. Ein typisches Beispiel der NOS-Fehlfunktion
ist ein Absinken der endogenen NO-Niveaus. Erkrankungen, die mit
einer NOS-Fehlfunktion assoziiert sind, schließen solche ein, die durch eine
NOS-Fehlfunktion induziert, verschlimmert oder an der Heilung verhindert
werden, wie beispielsweise Hypertension, Hyperlipämie, Arteriosklerose,
koronare Gefäßspasmen,
ischämische Herzerkrankung,
Herzversagen, Thrombose, pulmonäre
Hypertension, zerebrovaskuläres
Versage, zerebrale Gefäßspasmen,
Glomerulonephritis, chronisches Nierenversagen, Diabetes, postoperative
Restenose, Achalasie, Portalhypertension, Leberstörungen,
Störungen
der Gastrointestinalschleimhaut, hypertrophe pylorische Stenose,
Enteritis, Impotenz, Chorioretinopathie, etc. ein.
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Wenn es an Patienten mit diesen Erkrankungen
verabreicht wird, kann BH4 diese Erkrankungen verhindern oder behandeln,
indem die NOS-Funktionen durch die stimulierende Wirkung auf die
NOS-Produktion in vivo oder durch das Wiederherstellen der gesenkten
Funktion der Endothelzellen normalisiert werden.
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Demgemäß wird die vorliegende Erfindung
zum Behandeln oder Verhindern von Erkrankungen angewendet, die durch
die stimulierende Wirkung von BH4, um die NOS-Funktion zu aktivieren,
behandelt werden.
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Verbindungen der Formel (I) als wirksame
Inhaltsstoffe der vorliegenden Erfindung schließen die folgenden und pharmazeutisch
akzeptablen Salze davon ein: (6R)-L-erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin
(BH4)
(6R,S)-5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin,
1',2'-Diacetyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin
Sepiapterin
6-Methyl-5,6,7,8-tetrahydropterin
6-Hydroxymethyl-5,6,7,8-tetrahydropterin
6-Phenyl-5,6,7,8-tetrahydropterin
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Von diesen oben genannten Verbindungen
sind 5,6,7,8-Tetrahydrobiopterine oder Salze davon bevorzugt, und
BH4 oder Salze davon sind am meisten bevorzugt.
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Verbindungen der Formel (I), die
als wirksame Inhaltsstoffe der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
sind bekannte Verbindungen. Siehe beispielsweise die japanische
Patentveröffentlichungsoffenbarung
(KOKAI) Nrn. 25323/84, 76086/84, 277618/86 und 267781/88. Diese
Verbindungen können
als geeignete Salze mit pharmakologisch nicht-toxischen Säuren, einschließlich Mineralsäuren wie
beispielsweise Salzsäure,
Phosphorsäure,
Schwefelsäure,
Borsäure
und organischen Säuren
wie beispielsweise Essigsäure,
Ameisensäure,
Maleinsäure,
Fumarsäure,
Mesylsäure
verwendet werden.
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Eine pharmazeutische Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung ist gegen die oben genannten Erkrankungen
wirksam. Z. B. ist sie gegen Hypertension, einschließlich nicht
nur der Hypertension im wesentlichen sondern auch der malignen Hypertension
mit einer Nekrose der arteriolen Wände in der Niere und Retina
wirksam, welche nach einer kurzen Zeit auftritt und bei renaler
Hypertension, die von Nierenstörungen
begleitet wird. Genauer ist sie gegen alle Arten von Hypertension
wie essential Hypertension, Nierenhypertension, renovaskulärer Hypertension,
schwangerschaftsinduzierter Hypertension, seniler Hypertension und
adrenaler Hypertension wirksam.
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Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung
wird durch das Formulieren einer Verbindung der Formel (I) mit allgemeinen
verwendeten Trägerstoffen
durch konventionelle Verfahren in einer Dosierung, die für orale,
rektale oder parenterale Verabreichung (einschließlich der
Verabreichung in die Vene und die zerebrospinale Flüssigkeit)
geeignet ist.
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Der Träger, der für diese pharmazeutischen Formulierungen
verwendet wird, schließt
im allgemeinen Arzneiträger,
Bindemittel, Desintegratoren, etc. in Abhängigkeit von der gewählten Dosierungsform
ein.
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Typische Beispiele für Arzneiträger schließen Stärke, Lactose,
Sucrose, Glucose, Mannitol und Cellulose ein, und Beispiele für Bindemittel
schließen
Polyvinylpyrrolidon, Stärke,
Sucrose, Hydroxypropylcellulose, Gummi arabicum ein. Beispiele für Desintegratoren
schließen
Stärke,
Agar, Gelatinepulver, Cellulose, CMC ein, aber jegliche weitere
konventionelle Arzneiträger,
Bindemittel und Desintegratoren können ebenfalls verwendet werden.
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Zusätzlich zu solchen Trägerstoffen
kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
ebenfalls Antioxidationsmittel zur Stabilisierung der wirksamen
Inhaltsstoffe enthalten. Antioxidationsmittel können aus solchen, die konventionell
für pharmazeutische
Präparate
verwendet werden, passend ausgewählt
werden, wie beispielsweise aus Ascorbinsäure, N-Acetylcystein, L-Cystein,
dl-α-Tocopherol,
natürlichem
Tocopherol etc. Sie werden in einer Menge verwendet, die den aktiven
Inhaltsstoff (ein oder mehrere) stabilisiert und im allgemeinen
beträgt
das Verhältnis
eines Antioxidationsmittels zwischen 0,2 und 2 Gew.-Teilen gegenüber 1 Teil
des aktiven Inhaltsstoffs/der aktiven Inhaltsstoffe.
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Formulierungen der vorliegenden Erfindung,
die für
die orale Verabreichung geeignet sind, können in Form von Tabletten,
Lutschtabletten, Kapseln, Pulvern, Körnern oder feinen Körnern oder
Suspensionen in einer nicht-wäßrigen Flüssigkeit
wie beispielsweise Sirupen, Emulsionen oder Schluckmitteln (draft)
(pro re nata-Präparat),
das die vorgeschriebene Menge des aktiven Inhaltsstoffs (eines oder
mehrerer) enthält,
zur Verfügung
gestellt werden.
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Körner
werden z. B. durch homogenes Mischen des aktiven Inhaltsstoffs (eines
oder mehrerer) mit einem oder mehreren zusätzlichen Inhaltsstoffen wie
beispielsweise Trägerstoffen
und Antioxidationsmitteln, wie oben erwähnt, hergestellt, gefolgt von
der Granulierung und dem Sieden in eine gleichmäßige Körnergröße. Tabletten können durch
das Komprimieren oder Formen des aktiven Inhaltsstoffs (eines oder
mehrerer) gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren zusätzlichen
Inhaltsstoffen hergestellt werden. Kapseln werden durch das Einfüllen von
Pulver oder Körnern
des aktiven Inhaltsstoffs (eines oder mehrerer) gegebenenfalls homogen
mit einem zusätzlichen
Inhaltsstoff (einem oder mehreren) in geeignete Kapseln unter Verwendung
einer Kapselfüllmaschine
oder ähnlicher
hergestellt. Formulierungen für
die rektale Verabreichung können
als Zäpfchen
unter Verwendung konventioneller Trägerstoffe, wie beispielsweise
Kakaobutter zur Verfügung
gestellt werden. Parenterale Formulierungen können als trockene Feststoffe
des aktiven Inhaltsstoffs (eines oder mehrerer), die in stickstoffgefüllten sterilisierten
Behältern
versiegelt sind, zur Verfügung
gestellt werden. Solche trockenen festen Präparate können dem Patienten nach dem
Dispergieren oder Lösen
davon in einer vorherbestimmten Mengen sterilisierten Wassers direkt
vor der Verabreichung verabreicht werden.
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Beim Herstellen dieser Formulierungen
können
bevorzugt Antioxidationsmittel wie oben erwähnt zu dem Gemisch des wirksamen
Inhaltsstoffs und den konventionellen Trägerstoffen hinzugegeben werden,
und gegebenenfalls kann auch einer oder mehrere zusätzliche
Inhaltsstoffe ausgewählt
aus Puffern, Geschmacksstoffen, Tensiden, Viskosemitteln, Schmiermitteln
etc., falls notwendig, hinzugegeben werden.
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Die Dosierung der aktiven Inhaltsstoffe,
d. h. der Verbindungen der Formel (I) kann mit der Verabreichungsroute,
dem zu behandelnden Symptom und dem Zustand des Patienten variieren,
und die schlußendliche
Bestimmung der Dosierung sollte durch den aufgesuchten Arzt erfolgen.
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Eine geeignete Dosierung zur Behandlung
von Hypertension reicht beispielsweise von 0,1 bis 50 mg/kg (b.w.)/Tag,
und die repräsentative
optimale Dosierung beträgt
0,5 bis 10 mg/kg (b.w.)/Tag.
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Die gewünschte Dosis dieser wirksamen
Inhaltsstoffe kann einmal täglich
oder in Teildosierungen zu zwei- bis viermal pro Tag in einem geeigneten
Intervall verabreicht werden.
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Aktive Inhaltsstoffe können alleine
oder in Kombination mit pharmazeutischen Formulierungen die andere
wirksame Inhaltsstoffe, die für
die zu behandelnde Erkrankung geeignet sind, beispielsweise zur
Erleichterung der Kontrolle der Dosierung verabreicht werden.
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Zusätzlich zu den Verbindungen
der Formel (I) als wirksame Inhaltsstoffe können Formulierungen der vorliegenden
Erfindung mindestens einen zusätzlichen
wirksamen Inhaltsstoff enthalten, der ausgewählt ist aus den Substraten
oder einen Co-Enzym oder Co-Faktor für NOS, wie beispielsweise L-Argininflavinen,
z. B. FAD, FMN, etc. oder Calcium. Bessere therapeutische Wirkungen
können
erwartet werden, wenn Verbindungen der Formel (I) mit diesen wirksamen
Inhaltsstoffen gemischt werden, als wenn sie alleine verwendet werden.
Der Anteil eines jeden dieser zusätzlichen Inhaltsstoffe in Formulierungen
der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders beschränkt. Das
Gewichtsverhältnis
von mindestens einen ausgewählt
aus L-Arginin, Flavinen und Calcium zu 1 Teil der Verbindungen der
Formel (I) kann beispielsweise innerhalb eines Bereichs von 0,1
bis 10, bevorzugt von 0,5 bis 2 sein.
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Eine geeignete Dosierung solcher
gemischten Formulierungen zur Behandlung von Hypertension reicht
beispielsweise von 0,1 bis 50 mg/kg (b.w.)/Tag, bevorzugt 0,5 bis
10 mg/kg (b.w.)/Tag hinsichtlich der Gesamtmenge der aktiven Inhaltsstoffe.
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Ein Arzt kann Formulierungen, die
die Verbindungen der Formel (I) alleine oder in Kombination mit
weiteren aktiven Inhaltsstoffen in Abhängigkeit vom Alter, dem Zustand
und weiteren Faktoren des Patienten auswählen.
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Die am meisten bevorzugten aktiven
Inhaltsstoffe, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
sind (6R)-L-Erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin
(BH4) und Salze davon, aber (6R,S)-5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin,
1',2'-Diacetyl-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin,
Sepiapterin, 6-Methyl-5,6,7,8-tetrahydropterin, 6-Hydroxymethyl-5,6,7,8-tetrahydropterin
oder 6-Phenyl-5,6,7,8-tetrahydropterin und Salze davon können ebenfalls
verwendet werden. Es ist überflüssig zu
sagen, daß BH4,
der natürlich
vorkommenden Bestandteil am meisten bevorzugt ist. BH4-Dihydrochlorid
hat geringe Toxizität
gegenüber
Ratten, was aus der Tatsache beurteilt wird, daß die akute Toxizität mehr als
2 g/kg (b.w.) betrug. Ein optisch inaktives Analogon, (6R,S)-5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin
ist ebenfalls nur leicht toxisch wie in der japanischen Patentveröffentlichungsoffenbarung
Nr. 25323/84 zur Behandlung der Parkinsonschen Erkrankung berichtet
wurde, so daß sie
ebenfalls für
die Therapie gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann. Weitere Verbindungen der Formel
(I) zeigen ebenfalls nur geringe oder keine akute Toxizität.
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Die folgenden Beispiele erklären die
vorliegende Erfindung im Detail, aber die vorliegende Erfindung ist
nicht auf diese Beispiele begrenzt.
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Beispiele
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Beispiel 1: Körnchen und
feine Körnchen
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Zu 1 Teil (in Gewicht) Polyvinylpyrrolidon
(Kollidon 30), das in sterilisiertem gereinigten Wasser gelöst war,
wurden 10 Teile Ascorbinsäure
und 5 Teile L-Cysteinhydrochlorid hinzugegeben, um eine homogene
Lösung
zu ergeben, und dann wurden 10 Teile BH4-Dihydrochlorid hinzugegeben,
um eine homogene Lösung herzustellen.
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Diese Lösung wurde zu 59 Teilen eines
Trägerstoffes
(Mannitol oder Lactose) und 15 Teilen eines Desintegrationsmittels
[Maisstärke
oder Hydroxypropylcellulose (LH-22)] hinzugegeben, und das Gemisch
wurde geknetet, granuliert, getrocknet und dann gesiebt.
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Beispiel 2: Tabletten
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Die homogene Lösung des aktiven Inhaltsstoffs,
das in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde mit 58 Teilen Lactose
und 15 Teilen mikrokristalliner Cellulose gemischt, dann mit 1 Teil
Magnesiumstearat und tablettiert.
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Beispiel 3: Kapseln
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Die in Beispiel 1 hergestellte Dosierungsform
wurde in Kapseln gefüllt,
wobei die Formulierung 0,2% Magnesiumstearat als Gleitmittel einschließt.
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Beispiel
4: Injektion
BH4-Dihydrochlorid | 1,5
g |
Ascorbinsäure | 1,5
g |
L-Cysteinhydrochlorid | 0,5
g |
Mannitol | 6,5
g |
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Die oben genannten Inhaltsstoffe
wurden in sterilem gereinigten Wasser gelöst, um 100 ml zu ergeben und
dann sterilisiert, und 1 ml oder 2 ml Aliquots wurden jeweils in
ein Gefäß oder eine
Ampulle verteilt, dann lyophilisiert und versiegelt.
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Beispiel 5: Injektion
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2,0 g BH4-Dihydrochlorid wurden in
sterilen gereinigten Wasser gelöst,
um 100 ml in einer anaeroben Atmosphäre zu ergeben und dann sterilisiert
und auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 versiegelt.
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Beispiel
6: Zäpfchen
BH4-Dihydrochlorid | 150
Teile |
Ascorbinsäure | 150
Teile |
L-Cysteinhydrochlorid | 50
Teile |
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Die oben genannten Inhaltsstoffe
wurden homogen gemahlen und in 9950 Teilen Kakaobutter dispergiert.
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Beispiel
7: Körnchen
BH4-Dihydrochlorid | 5
Teile |
Ascorbinsäure | 5
Teile |
L-Cysteinhydrochlorid | 2
Teile |
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Die oben genannten Inhaltsstoffe
wurden verwendet, um eine homogene Lösung herzustellen.
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Diese Lösung wurde zu einem homogenen
Gemisch aus 55 Teilen Mannitol, 1 Teil Polyvinylpyrrolidon, 14 Teilen
Hydroxypropylcellulose und 5 Teilen L-Arginin oder Calcium hinzugegeben,
und das Gemisch wurde geknetet, granuliert, getrocknet und dann
gesiebt.
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Beispiel
8: Körnchen
BH4-Dihydrochlorid | 5
Teile |
Ascorbinsäure | 5
Teile |
L-Cysteinhydrochlorid | 5
Teile |
Mannit | 52
Teile |
Polyvinylpyrrolidon
(Kollidon 30) | 1
Teil |
Hydroxypropylcellulose
(LH-22) | 12
Teile |
L-Arginin
oder Calcium | 10
Teile |
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Die oben genannten Inhaltsstoffe
wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 granuliert und gesiebt.
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Beispiel
9: Körner
BH4-Dihydrochlorid | 5
Teile |
Ascorbinsäure | 5
Teile |
L-Cysteinhydrochlorid | 2
Teile |
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Die oben genannten Inhaltsstoffe
wurden verwendet, um eine homogene Lösung herzustellen.
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Diese Lösung wurde zu einem homogenen
Gemisch aus 10 Teilen L-Arginin oder Calcium, 50 Teilen Mannit,
1 Teil Polyvinylpyrrolidon (Kollidon 30) und 9 Teilen Hydroxypropylcellulose
(LH-22) gegeben, und das Gemisch wurde geknetet, granuliert, getrocknet
und dann gesiebt.
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Beispiel 10: Herstellung
von DOCA-salt hypertension rats
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Aus jeder 8-Wochen alten Sprague-Dawley-Ratte
(bezogen von Charles River) wurde eine Niere entfernt, außer in einer
Kontrollgruppe. Dann wurden die Tiere in die folgenden drei experimentellen
Gruppen geteilt.
- 1) Eine Gruppe, der nur Wasser
zu trinken gegeben wurde (Kontrollgruppe); Probengröße n = 3;
- 2) Eine Gruppe von DOCA-salt hypertension-Ratten, die hergestellt
wurden, indem einmal wöchentlich
subkutan 30 mg/kg b.w. Desoxycorticosteronacetat (DOCA) verabreicht
wurde, und die 1% Kochsalzlösung
als Trinkwasser eine Woche nach der Nephrektomie bekamen (DOCA-Gruppe);
n = 6;
- 3) Eine Gruppe DOCA-salt hyptertension-Ratten, der BH4 (10 mg/kg
b.w./Tag) oral verabreicht wurde (DOCA + BH4-Gruppe); n = 5.
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Zu Beginn des Experiments und nach
2, 4 und 5 Wochen (am Ende der Beobachtungsdauer) wurde Urin über 24 Stunden
unter Verwendung eines Stoffwechselkäfigs gesammelt. Am Ende der
Beobachtungsdauer, wurde unter Anästhesie mit Phenobarbital eine
Blutprobe aus der Abdominalaorta abgenommen. Die Niere wurde isoliert,
nachdem mit physiologischer Kochsalzlösung perfundiert wurde, und
histologisch und immunohistologisch untersucht.
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Messung des
Blutdrucks
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Der Blutdruck wurde durch den Schwanzschlag-Test
zu Beginn des Experimentes und nach 2, 4 und 5 Wochen gemessen.
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Messung von NO2/NO3 im Urin
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Die Messung wurde unter Verwendung
eines Nitrat-Nitrit-Assay-Kits (Kit Nr. 780001, Cyman Chemical Company)
nach dem Griess-Verfahren durchgeführt. Die NO2/NO3-Werte im Urin bezeichnen die NOS-Aktivität, insbesondere
je höher
der Wert, desto höher
die Aktivität.
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BP-Messung
im Urin
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Biopterin (BP), ein BH4-Stoffwechselprodukt,
wurde mittels HPLC entsprechend dem Verfahren von Fukushima und
Nixon (Anal. Biochem. 102: 176–188,
1980) gemessen. Die Wirkungen der BH4-Verabreichung wurden auf der
Grundlage einer Veränderung
des BP-Niveaus im Urin untersucht.
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Immunfärbung der
Nierengewebe NOS
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Die Expression von endothelialer
NOS (e-NOS) und Hirn-NOS (b-NOS) in Nierengeweben wurde in den Schnitten
der eingefrorenen isolierten Nierengewebe durch Immunfärbung mit
anti-e-NOS- und anti-b-NOS-Antikörpern
(Affinity Bioreagents) untersucht.
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Messung der NOS-mRNA-Expression
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a) Extraktion der Gesamt-RNA
aus Nierengeweben
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Die Extraktion der RNA aus Nierengeweben
wurden mit Hilfe des Guanidinium/Cäsiumchlorid-Extraktionsverfahrens
durchgeführt.
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D. h., daß eine geringe Menge an Geweben,
die aus dem Nierencotex der isolierten Niere entnommen wurde, direkt
in eine Lyselösung
von 4 M Guanidiniumthiocyanat gegeben wurde und mit einem Glas/Teflon-Homogenisator
homogenisiert wurde. Dieses Lysat wurde auf 5,7 M Cäsiumchlorid
geschichtet und bei 80 000 Upm für
2 Stunden zentrifugiert, dann wurde das Präzipitat in 0,1% Diethylpyrocarbonat
(DEP)-Lösung gelöst. Diese
Lösung
wurde mit 2,5 M Ammoniumacetat und Ethanol bei –20°C für eine Stunde präzipitiert
und bei 10 000 Upm bei 4°C
für 20
Minuten zentrifugiert, um ein Präzipitat
zu ergeben. Das Präzipitat
wurde in 0,1% DEP-Lösung
bei einer Konzentration von ungefähr 1 μg/μl gelöst und bei –20°C vor der Verwendung gelagert.
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b) Reverse Transkriptase
(RT)-Reaktion
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Aus der gesamten RNA wurde unter
Verwendung von MoMLV reverse Transkriptase cDNA synthetisiert.
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Zusammengefaßt wurde ein Gemisch aus Gesamt-RNA,
Primern, Puffer und H2O bei 95°C für 2 Minuten
erwärmt
und dann eisgekühlt.
Dann wurde das Gemisch bei 37°C
für 30
Minuten inkubiert, um die Primer an die RNA anzulagern. Dann wurde
eine Lösung,
die 0,2 M Dithiothreitol (DTT), und 5 mM Desoxyribonukleotid (dNTP),
RNAsin und MoMLV Reverse Transkriptase zu dem Gemisch hinzugegeben.
Das erhaltene Gemisch wurde für
5 Minuten auf 90°C
erwärmt
und die Reaktion wurde durch Eiskühlen gestoppt.
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c) PCR
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Eine PCR wurde unter Verwendung der
in der RT-Reaktion synthetisierten cDNA als Matrize durchgeführt.
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Genau gesagt, wurde die RT-Reaktionslösung zu
einem Gemisch aus 5'- und 3'-Primern jeweils
für die zu
detektierende e-NOS und für
Malatdehyadrogenase (MDH) hinzugegeben, welcher als interner Standard verwendet
wurde, PCR-Puffer, 2,5 mM dNTP Mischlösung und Taq-DNA-Polymerase.
Das Reaktionsgemisch wurde mit Mineralöl bedeckt und zentrifugiert,
worauf die Reaktion in einem automatischen PCR-Apparat gestartet
wurde. Die PCR-Produkte
wurden durch das Durchführen
von 30 Zyklen erhalten, wobei jeder Zyklus aus 94°C für 30 Sekunden,
50°C für 30 Sekunden
und 72°C
für 30
Sekunden besteht. Die für
die Detektion von e-NOS und MDH verwendeten Primer wurden aus Grundlage
des Berichts von Ujiie, Kl. et al., Am. J. Physiol. 267 (Renal Fluid
Elektrolyte Physiol. 36): F296-F302, 1994 ausgewählt. Genauer gesagt waren die
Basensequenzen der Primer, die für
die Detektion von e-NOS verwendet wurden TACGGAGCAGCAAATCCAC (SEQ
ID NO: 1) für
den 5'-Primer und
CAGGCTGCAGTCCTTTGATC (SEQ ID NO: 2) für den 3'-Primer. Die Basensequenzen der Primer,
die für
die Detektion von MDH verwendet wurden, waren CAAGAAGCATGGCGTATACAACCC
(SEQ ID NO: 3) für
den 5'-Primer und
TTTCAGCTCAGGGATGGCCTCG (SEQ ID NO: 4) für den 3'-Primer.
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d) Messung von NOS mRNA-Expression
mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese
und Hybridisierung nach Southern.
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Die PCR-Produkte wurden auf einem
5%igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und die NOS-mRNA-Expression
wurde mit Hilfe einer Hybridisierung nach Southern gemessen.
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Genauer gesagt wurde die PCR-Reaktionslösung auf
einem 5%igen Polyacrylamid elektrophoretisch aufgetrennt und dann
wurde das Gel auf Membranfilter überführt. Eine
Hybridisierung wurde auf den Membranfiltern unter Verwendung von
Proben durchgeführt,
die mit γ32P-ATP am 5'-Ende zur Detektion von e-NOS und MDH
markiert waren (Ujiie, K. et al., 1994, supra). Die Basensequenz
der Probe war CTGGAACAATTTCCATCCG (SEQ ID NO: 5) zur Detektion von
e-NOS und TTTGTCTTCTCCCTGGTGGA (SEQ ID NO: 6) zur Detektion von
MDH. Dann wurde eine Autoradiographie bei –70°C für einige Stunden durchgeführt und
die belichteten Autoradiogramme wurden mit Hilfe eines Densitometers
analysiert. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
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Auf Grundlage der Ergebnisse der
Autoradiographie wurde die Menge der e-NOS PCR-Produkte gegen die
Menge des Housekeeping-Gens MDH PCR-Produkt normalisiert, um die
e-NOS-Genexpression halbquantitativ zu ermitteln.
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Statistik
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Die gemessenen Werte wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung
ausgedrückt
und statistisch unter Verwendung des zweiteiligen ANOVA-Tests untersucht.
In den folgenden Analysen waren die Signifikantniveaus auf p < 0,05 eingestellt.
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Die Veränderung des Blutdrucks ist
in Tabelle 1 und 1 gezeigt.
Die DOCA-Gruppe entwickelte eine Hypertension in der Woche 4 nach
dem Beginn der Beobachtung. Der Anstieg des Blutdrucks in der COCA-Gruppe
war, verglichen mit den zwei anderen Gruppen, signifikant. Die DOCA
+ BH4-Gruppe blieb ähnlich der
Kontrollgruppe bis zum Ende des Beobachtungszeitraums auf Normalwert.
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Tabelle
1
Blutdruck (mmHg)
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Die Veränderung von NO2/NO3 im Urin ist in Tabelle 2 und 2 gezeigt. In der DOCA-Gruppe
sank der Wert von NO2/NO3 im
Urin mit der Zeit und fiel zum Ende des Beobachtungszeitraums unter
die Meßbarkeitsgrenze.
Die DOCA + BH4-Gruppe zeigte jedoch einen Anstieg in dem Wert. Das
Absinken in der DOCA-Gruppe war, verglichen mit den zwei anderen
Gruppen, signifikant, und kein signifikanter Unterschied wurde zwischen
der Kontrollgruppe und der DOCA + BH4-Gruppe gesehen.
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Tabelle
2
NO
2/NO
3 im
Urin (mmol/Tag)
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Die Veränderung von BP im Urin ist
in Tabelle 3 und 3 gezeigt.
In der DOCA-Gruppe sank der BP-Wert mit der Zeit. Die DOCA + BH4-Gruppe
zeigte jedoch einen Anstieg im BP-Wert mit der Zeit. Das Absinken
in der DOCA-Gruppe war signifikant verglichen mit den zwei anderen
Gruppen, und es wurde keine signifikante Differenz zwischen der
Kontrollgruppe und der DOCA + BH4-Gruppe gefunden.
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Tabelle
3
BP im Urin (nmol/Tag)
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Wie in Tabelle 4 gezeigt wird, stieg
das Körpergewicht
in allen Gruppen mit der Zeit an, und es wurde kein signifikanter
Unterschied zwischen den drei Gruppen gefunden.
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Tabelle
4
Körpergewicht
(g)
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Die Ergebnisse der Immunfärbung zeigten,
daß die
Expression von e-NOS in kleinen Gefäßen und die Expression von
b-NOS in der Macula densa in der DOCA-Gruppe jeweils sanken, während diese
Expression in der DOCA + BH4-Gruppe
vergleichbar mit der Kontrollgruppe oder leicht erhöht waren.
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(Ergebnisse der Messung
der NOS-mRNA-Expression)
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Wie in 4 gezeigt
ist, zeigten die Messungsergebnisse, daß die e-NOS mRNA-Expression
in der DOCA + BH-Gruppe, verglichen mit DOCA-Gruppe signifikant
erhöht
war.
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Wie oben beschrieben wurde, wiesen
DOCA-salt hypertension-Ratten einen Anstieg im Blutdruck an, ein
Sinken des NO2/NO3 im
Urin und ein Sinken der NO5-Expression in
Nierengeweben auf, was darauf hindeutet, daß eine Fehlfunktion der vasoendothelialen
Zellen in diesem Rattenmodell auftrat. Das Absinken von BP in dem
Urin wurde ebenfalls in diesem Rattenmodell beobachtet. Andererseits
unterdrückte
die orale Verabreichung von BH4 den Anstieg im Blutdruck und führte zu
einem Anstieg von NO2/NO3 im
Urin und einem Anstieg der NOS-Expression in Nierengeweben, was
darauf hindeutet, daß BH4
zur Behandlung von Erkrankungen nützlich ist, die durch eine
gesenkte endogene NO-Produktion verursacht werden, indem die NOS-Funktion aktiviert
wird (durch Regulierung des NOS-Niveaus/der NOS-Aktivität).
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Beispiel 11: Herstellung
von DOCA-salt SHR
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Aus 8 Wochen alten SHRs (bezogen
von Charles River) wurde außer
in einer Kontrollgruppe eine Niere entfernt. Dann wurden die Tiere
in die folgenden drei experimentellen Gruppen geteilt.
- 1) Eine Gruppe, der nur Trinkwasser gegeben wurde (Kontrollgruppe);
Probengröße 8 = 8;
- 2) Eine Gruppe DOCA-salt SHRs, die durch das Verabreichen von
30 mg/kg b.w. Desoxycorticostereonacetat (DOCA) subkutan einmal
pro Woche und durch 1% Kochsalzlösung
als Trinkwasser eine Woche nach der Nephrektomie (DOCA-Gruppe) hergestellt
wurden; n = 4;
- 3) Eine Gruppe DOCA-salt SHRs, denen BH4 (10 mg/kg b.w./Tag)
oral verabreicht wurde (DOCA + BH4-Gruppe); n = 6.
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Der Urin wurde für 24 Stunden unter Verwendung
eines Stoffwechselkäfigs
zu Beginn des Experiments und nach 2, 3, 4, 5 und 6 (bei Beendigung
des Beobachtungszeitraums) Wochen gesammelt. Bei Beendigung des
Beobachtungszeitraums, wurden Blutproben aus der Abdominalaorta
unter Anästhesie
mit Phenobarbital gesammelt. Die Niere wurde nach Perfundieren mit
physiologischer Kochsalzlösung
isoliert und histologisch untersucht.
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Messung des Blutdrucks
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Der Blutdruck wurde durch den Schwanzschlag-Test
beim Beginn des Experiments und nach 2, 3, 4, 5 und 6 Wochen gemessen.
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Messung von BP im Urin
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Biopterin (BP), ein Metabolit von
BH4 wurde gemäß dem Verfahren
von Fukushima und Nixon mittels HPLC gemessen. Die Wirkung der BH4-Verabreichung werden
auf der Grundlage der Veränderung
des BP-Niveaus im Urin untersucht.
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Histopatholgische Befunde
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Nach dem Einsammeln des Urins und
dem Messen des Blutdrucks nach 6 Wochen, wurden die Tiere unter
Anästhesie
aufgeschnitten, aus der Abdominalaorta verbluten gelassen und mit
physiologischer Kochsalzlösung über diese
Stelle perfundiert. Die isolierte Niere wurde in einer l0%igen Formaldehyd-Lösung fixiert, in
Paraffin eingebettet, dann in einer Dicke von 4 μm mit Hilfe eines Mikrotoms
geschnitten. Die Proben wurden mit Hematoxylin/Eosin (HE) und Periodsäure-Schiff
gefärbt.
Die Häufigkeiten
histopathologischer Befunde einer nekrotisierenden Glomerulitis
und nekrotisierenden Arteriolitis wurden zwischen den Gruppen verglichen.
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Statistik
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Die gemessenen Werten wurden als
Mittelwert ± Standardabweichung
ausgedrückt
und statistisch unter Verwendung des zweiteiligen ANOVA-Tests untersucht.
In den folgenden Analysen wurde das Signifikantsniveau auf p < 0,05 festgesetzt.
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Die Veränderung des Blutdrucks ist
in der Tabelle 5 und 5 gezeigt.
Die DOCA-Gruppe entwickelte eine bemerkenswerte Hypertension in
der 3. Woche nach dem Beginn der Beobachtung. Der Anstieg des Blutdrucks
in der DOCA-Gruppe war verglichen mit den zwei anderen Gruppen signifikant.
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Die DOCA + BH4-Gruppe zeigte jedoch
die gleichen Blutdruckniveaus wie die der Kontrollgruppe, bis zum
Ende der Beobachtungsperiode.
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Tabelle
5
Blutdruck (mmHg)
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Die Veränderung des BPs im Urin ist
in Tabelle 6 und 6 gezeigt.
In der Doca-Gruppe sank der BP-Wert mit der Zeit. In der DOCA +
BH4-Gruppe zeigte sich jedoch ein Anstieg des BP-Wertes über die
Zeit. Der Abfall in der DOCA-Gruppe war verglichen mit den zwei
anderen Gruppen signifikant und kein signifikanter Unterschied wurde
zwischen der Kontrollgruppe und der DOCA + BH4-Gruppe gefunden.
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Tabelle
6
BP im Urin (nmol/Tag)
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Die Häufigkeit histopathologischer
Befunde in Nierengewebeproben werden in Tabelle 7 und 7 gezeigt. Die DOCA-Gruppe
zeigte signifikant höhere
Häufigkeiten
nekrotisierender Glomerulitis und nekrotisierender Angiitis, verglichen
mit den zwei anderen Gruppen.
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Tabelle
7
Prozentsatz (%) der Häufigkeiten
histopathologischer Befunde in Nierengeweben
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Wie oben beschrieben wurde, wiesen
DOCA-salt SHRs einen Anstieg im Blutdruck und den histopathologischen
Befunden der nekrotisierenden Glomerulitis und nekrotisierenden
Angiitis auf. Ein Absinken des BPs im Urin wurde ebenfalls in diesen
Modellratten beobachtet. Andererseits unterdrückte die orale Verabreichung
von BH4 den Anstieg des Blutdrucks und verbesserte die histopathologischen
Befunde bemerkenswert, was darauf hindeutet, daß BH4 zur Behandlung von Erkrankungen,
die mit einer Fehlfunktion der Endothelzellen assoziiert sind, durch
das Aktivieren der NOS-Funktion nützlich ist.
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Wie erklärt wurde, stellt die vorliegende
Erfindung Mittel pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Verfügung, die
wirksam Erkrankungen verhindern und/oder verbessern, die mit einer
NOS-Fehlfunktion assoziiert sind. Zusätzlich haben die wirksamen
Inhaltsstoffe der therapeutischen Mittel der vorliegenden Erfindung bei
Langzeitverwendung keine Nebenwirkungen oder ähnliches, da sie Substanzen
sind, die in vivo inhärent existieren.