DE69725721T3

DE69725721T3 - Vorbeugende oder heilende mittel für krankheiten, die durch mangel an stickoxid-synthase (nos) ausgelöst sind

Info

Publication number: DE69725721T3
Application number: DE69725721T
Authority: DE
Inventors: Takafumi Takatsuki-shi ISHIHARA; Yoshiharu Kanayama; Mikio Okamura; Junichi Yoshikawa; Haruo Shintaku
Original assignee: Daiichi Asubio Pharma Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-29
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2017-08-30
Also published as: DE69725721T2; ES2210562T5; KR20060094988A; DE69725721D1; EP0908182B2; KR100650962B1; JP2009132723A; ES2210562T3; EP0908182A1; WO1998008516A1; ATE252385T1; EP0908182A4; US7820667B2; KR19990067189A; US20060009458A1; EP0908182B1; US20030232835A1

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Verhindern und/oder Behandeln von Erkrankungen, die mit einer Dysfunktion von NOS assoziiert sind, umfassend als wirksamen Inhaltsstoff eine Verbindung der Formel (I):
wobei R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom darstellen und R³ (6R)-L-Erythro-CH(OH)CH(OH)CH₃ darstellt, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Stand der Technik
Das Gefäßendothel war bekannt dafür, daß es eine wichtige Rolle im Gefäßtonus oder der Thrombopoiese spielt, und es war 1980, daß das Vorhandensein eines Endothelium-derived relaxing factor (EDRF) zuerst berichtet wurde. 1987 wurde bewiesen, daß die EDRF-Entität Stickstoffmonoxid (NO) ist. NO wird hergestellt, wenn L-Arginin aus N^G-Hydroxyl-L-arginin in L-Citrullin oxidiert wird, und die Reaktion durch ein Enzym namens NO-Synthase (NOS) katalysiert wird. NOS existiert weitverbreitet im Gefäßendotehl, im Nervensystem, den Nieren, den Plättchen, der Herzmuskeln, den glatten Muskeln, etc. und es hat eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der systemischen Zirkulation, da das gebildete NO eine große Vielzahl an Wirkungen hat. Die folgenden Erkrankungen mit abgesenkter NO-Produktion sind bekannt: kardiovaskuläre Erkrankungen wie beispielsweise Hypertension, Hyperlipämie, Arteriosklerose, ischämische Herzerkrankungen, Herzversagen, Thrombose; respiratorische Erkrankungen wie beispielsweise Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen, pulmonäre Hypertension, ARDS; Gastrointestinalerkrankungen wie beispielsweise Hepatopathie, Leberzirrhose, Gastrointestinal-Schleimhauterkrankungen, hypertrophe pylorische Stenose, Pankreatitis; zerebrovaskuläre Erkrankungen wie beispielsweise Zerebralischämie, Infarkt, zerebrovaskuläres Versagen, senile Demenz; Nieren- oder urologische Erkrankungen wie beispielsweise Nierenstörungen, Impotenz; gynäkologische Erkrankungen wie beispielsweise Blutvergiftung; Infektionserkrankungen, immunologische Störungen, Diabetes, Verbrennungen; oder Erkrankungen, die durch Medikamente verursacht werden, die die NO-Produktion absenken. Das NOS-Gen wurde kloniert und strukturell analysiert. Als Ergebnis wurde herausgefunden, daß das NOS-Gen eine Bindungsstelle für (6R)-L-Erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (nachfolgend als "BH4" bezeichnet) enthält, das in Verbindungen der Formel (I) als aktive Inhaltsstoffe der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist, zusätzlich zu solchen für Co-Enzyme wie beispielsweise Calmodulin (CaM), Flavin, NADPH. Außerdem wurde vermutet, daß BH4 tatsächlich an der Kontrolle der NOS-Funktion beteiligt ist.
Andererseits wurde berichtet, daß der Blutdruck bei Versuchstieren, denen intravenös ein NOS-Inhibitor injiziert wurde (Sakuma I. et al., Circ. Res. 70: 607–611, 1992), anstieg. Eine abgesenkte Produktion an endogenem NO wurde ebenfalls in einem Tiermodell für Hypertension wie beispielsweise in DOCA-Salz-Hypertensionsratten, SHR-SP-Ratten, Dahl-S-Ratten, Goldblatt-Hypertensionsratten beschrieben.
INOUE, E. et al.: JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF NEPHROLOGY, Bd. 7, Nr. 9, September 1996 (1996-09), Seiten 1534–1535 offenbart, daß Tetrahydrobiopterin die Entwicklung von DOCA-Salz-Hypertension in Ratten aufhebt. Dieses Dokument ist ein nachveröffentlichtes Dokument der vorstelligen Erfindung.
Außerdem beschreibt PRAST, H. et al., BIOLOGY OF NITRIC OXIDE, PROC. INT. MEET, 2ND, Bd. 1, 1992, S. 10–12 die Wirkungen einer Sepiapterin-Behandlung auf die Tetrahydrobiopterin-Niveaus und dem Blutdruck in spontan hypertensiven Ratten.
KUKOR, Z. et al., PLACENTA, Bd. 17, Nr. 1, Januar 1996, Seiten 69–73 bezieht sich gleichermaßen auf calciumabhängige Stickstoffoxid-Synthese, die durch Tetrahydrobiopterin in der menschlichen Primordialplazenta stark stimuliert wird. Kein Dokument liefert einen direkten Beweis dafür, der die pharmakologischen Wirkungen von BH4 auf Erkrankungen zeigt, die mit einer Fehlfunktion von NOS assoziiert sind.
Aus dem Artikel von Amoah-Apraku B. et al. in dem Journal of the American Society of Nephrology, Bd. 5, Nr. 8, 1995, Seiten 1630–1633 ist bekannt, daß Guanosintriphosphatcyclohydrolase die Stickstoffoxid-Synthese in den proximalen Tubuli der Nieren reguliert.
Des weiteren berichtet Bune A.J. et al., Experimental Neurology, Bd. 4, Nr. 1, 1996, Seiten 43 bis 47 daß die Hemmung der Tetrahydrobiopterin-Synthese die Stickstoffoxid-Produktion durch isolierte Glomeruli in einer Immunkomplex-Glomerulonephritis reduziert. Diese Erkrankung ist mit einer gesteigerten NOS-Aktivität assoziiert.
Die Ursache für die abgesenkte NO-Produktion in diesen Modellen ist jedoch nicht aufgeklärt worden. Es gibt auch eine Anzahl an Berichten, daß die NO-Produktion in Spontan-Hypertensionsratten (SHR), die oft als hypertensive Versuchstiere verwendet werden (Dominizak A.F. et al., Hypertension 25: 1202–1211, 1995) eher erhöht ist. Im Fall von SHR kann auch vermutet werden, daß NO gegen den hypertensiven Zustand zum Senken des Blutdrucks übermäßig freigesetzt wird, aber die Wirkung von NO nicht ausreichend ist (Nava E. et al., Circulation 92: I-347, 1995). Obwohl darauf hingewiesen wurde, daß NO an der Ätiologie der Hypertension beteiligt sein kann, ist die Beziehung zwischen der NOS-Aktivität und der Hypertension noch nicht vollständig aufgeklärt worden. Das Absinken der vasodilativen Reaktion bei der Hypertension kann auch durch eine abgesenkte Aktivität des Endothelium-derived hyperdepolarizations factor (EDHF) oder durch einen Anstieg der Mengen des Endothelium-derived circulating factor (EDCF) verursacht sein, welche beide in ihrer Entität unbekannt waren.
Das bedeutet, daß die vasorelaxierende Wirkung von NO und die Kontrolle der NOS-Funktionen durch BH4 zu einem gewissen Grad bekannt waren. Die Ursache für eine abgesenkte NO-Produktion und die Beziehung zwischen der NOS-Aktivität und Hypertension waren jedoch noch nicht aufgeklärt, und es war nichts über die antihypertensive Wirkung von BH4 wie auch über die Rolle von BH4 bei der Regulierung des Blutdrucks bekannt.
In viele industrialisierten Ländern sind kardiovaskuläre Erkrankungen eine der Haupttodesursachen. Zahlreiche Medikamente wie beispielsweise Mittel gegen Hypertension, Mittel gegen Hyperlipämie, Diuretika, Vasodilatoren, Antiplättchenmittel sind bei der Behandlung von Erkrankungen verwendet worden. Viele davon sind jedoch darauf angelegt, Parameter wie den Blutdruck oder den Cholesterol-Gehalt zu verbessern, sind aber noch immer nicht zufriedenstellend bei der Verhinderung des Auftretens, der Verzögerung oder Verschlechterung oder dem Voranschreiten und der Langzeitprognose dieser Erkrankungen. Kürzlich wurde durch das Untersuchen auf molekularer Ebene anhand der oben genannten Erkrankungen eine therapeu tische Strategie, die auf Blutgefäße, insbesondere Endothelzellen gerichtet ist, als eine der vielversprechendsten Therapien durch Behandlung mit einem Mittel vorgeschlagen, das die Produktion der EDRF-Endität reguliert, d.h. NO, oder einem Mittel, daß eine antioxidierende Wirkung hat (Gibbons, G.H., Dzau, V.J., Science, Bd. 272, 689–693, 1996). Es wurde jedoch noch kein Medikament oder eine Therapie etabliert, die diese therapeutische Strategie ermöglicht.
Nitratmittel (Nitroglycerin-Präparate, etc.) sind als wirksam als exogene NO-Donoren für das Behandeln von Angina, Herzversagen und ähnliche aus den oben genannten Erkrankungen angesehen worden, aber sie haben bei Langzeitverwendung Toleranz gezeigt. Insbesondere werden Thiol-Gruppen (SH-Gruppen) während der Langzeitverwendung von Nitrat-Gruppen depletiert, da SH-Gruppen für die NO-Produktion aus diesen Nitratmitteln unverzichtbar sind. Außerdem kann das Gleichgewicht weiterer endogener Substanzen während der Langzeitverwendung gestört werden, da die NO-Produktion Stoffwechselenzyme benötigt, und weitere NO-ähnliche Materialien wie beispielsweise Nitrosothiol während der Reaktion hergestellt werden. Eine neue Art von NO-Donoren mit den Eigenschaften von β-Blockern oder K⁺-Kanalöffnern sind ebenfalls entwickelt worden, aber sie sind noch immer innerhalb des Bereichs der oben genannten NO-Donoren. Deswegen ist die Verbesserung der Funktionen der Endothelzellen während des Regulierens der endogenen NO-Funktion als einer der idealsten therapeutischen Wege zur Verhinderung des Auftretens, der Verzögerung oder Verschlechterung oder dem Voranschreiten und der Langzeitprognose dieser Erkrankungen vorgeschlagen worden.
Die spontane NO-Produktion in vivo oder die Aktivierung von NOS scheint das beste therapeutische Verfahren zu sein. Ein Substrat für NOS, L-Arginin, ist auf seine Wirkung gegen Erkrankungen wie beispielsweise Hypertension (Higashi, Y. et al., Hypertension 1995, 25, 898–902) Angina (Egashira, K. et al., Circulation 1996, 94, 130–134), Herzversagen (Rector T.S. et al., Circulation 1996, 93, 2135–2141) oder ähnliche untersucht worden.
Es wurde jedoch berichtet, daß eine Vasodilatierungsreaktion, die vom Endothel abhängig ist und eine Nieren-NO-Produktion nur teilweise durch Langzeitverabreichung von L-Arginin (Hayakawa H., Hirata Y., Omata M. et al., Hypertension 1994: 23: 752–756) bei DOCA-Salz-Hypertentionsratten wieder hergestellt wurden, einem gutbekannten Hyptertensionsmodell, bei dem die endothelabhängige Vasodilatationreaktion durch Acetylcholin und die Nieren-NO-Produktion zum Ausgangspunkt und durch die Stimulierung von Endotheliun-Rezeptoren (ETB) gesenkt sind (Hirata Y., Hayakawa H., Omata M. et al., Circulation 1995: 91: 1229–1235). Es wurde auch berichtet, daß L-Arginin-Verabreichung zu einem Absinken des Blutdruckes in Hypertensionspatienten führt, ähnlich wie bei gesunden Personen, aber es brachte keinen Anstieg beim renalen Blutfluß und kein Absinken der Filtrationsfraktionierung und Resistenz der Nierengefäße, die bei gesunden Personen gefunden wird, und eine signifikante Abnahme von cGMP im Blut wurde bei Hyptertensionspatienten beobachtet (Higashi Y., Ohshima T. Kajiyama G. et al., Hypertension 1996: 25: 898–902). Diese Tatsachen legen nahe, daß eine unzureichende NO-Produktion in der Nierenzirkulation weder aus dem Mangel des Substrates L-Arginin noch nur durch das Abnehmen der enzymatischen Aktivität von NOS resultiert. Demgemäß kann die Beteiligung des L-Arginin-NO-Systems bei der Kontrolle der renalen Zirkulation und beim Mechanismus der Abnahme der endothelabhängigen Vasodilatationsreaktion nicht durch unzureichende Verwendung oder Mangel des Substrates L-Arginin erklärt werden. Deswegen sollte weiter untersucht werden, ob die Veränderung der NOS-Aktivität oder Quantität an diesem Phänomen beteiligt ist.
Der Zweck der antihypertensiven Therapie liegt darin, daß Leben der Patienten in einem zufriedenstellenden Zustand durch das Verhindern kardiovaskulärer Komplikationen aufgrund der Hypertension zu verlängern. Zu diesem Zweck muß der Blutdruck über eine lange Lebensdauer durch Mittel gegen Hypertension zusätzlich zu allgemeinen Therapien wie beispielsweise Salzreduzierung, Verbesserung der Obesität, Kinesetherapie etc. kontrolliert werden.
Heutzutage am häufigsten verwendeten therapeutische Mittel gegen Hypertension schließen Thiazide, β-Blocker, Ca-Antagonisten, Angiotensin-Converting-Enzyme (ACE)-Inhibitoren und α₁-Blocker ein. Keines davon befriedigt jedoch die folgenden Bedingungen, die für Antihypertensiva wünschenswert sind:

1. Milde Wirkweise und stabile Wirkungen;
2. Weniger Nebeneffekte in einem frühen Verwendungsstadium;
3. Wünschenswerter Einfluß auf die Zirkulationssysteme und die organischen Funktionen;
4. Keine unerwünschten Wirkungen auf Faktoren, die für kardiovaskuläre Systeme nachteilig sind, sondern eher eine Verbesserung bei Langzeitverwendung;
5. Bessere Compliance der Patienten mit der Therapie;
6. Keine Gegenanzeigen aufgrund verschiedener Komplikation und zufälliger Symptome;
7. Ein zufriedeneres Leben, das als Ergebnis der Therapie erwartet werden kann.

Gegenwärtig verwendete Antihypertensiva haben die folgenden Probleme. Auf Thiazid basierende Diuretika werden vorzugsweise angewendet, wenn einer Salzbegrenzung schwierig zu folgen ist oder eine Neigung zur Flüssigkeitsretention beobachtet wird, aber sie sind nicht Patienten mit einer abnormalen Glucosetoleranz, Hyperurikämie, Nierenfehlfunktion, Hyperlipämie oder Hypokalämie zu empfehlen.
β-Blocker werden vorzugsweise bei jungen oder tachykardischen Patienten angewendet, aber sie werden nicht bei Patienten mit Bronchialasthma, chronisch obstruktiver Pulmonarerkrankung, obstruktiven Läsionen der peripheren Arterien oder Raynoud's-Symptomen empfohlen. Sie sind aufgrund des Einflusses auf die Insulinsekretion ebenfalls für Hypertensionspatienten mit Diabetes ungeeignet.
Dihydropyridin-Derivate unter den Ca-Antagonisten haben die folgenden Nebeneffekte, d.h. ihre vasodilatorische Wirkung kann Gesichtsrötungen und Kopfschmerzen hervorrufen, und ihre stark hypotensive Wirkung kann Hypotension, Schwindel und Tachykardie oder Palpitation aufgrund von Hypertonus des Sympathicusreflexes verursachen.
ACE-Inhibitoren haben Nebeneffekte wie beispielsweise orthostatische Hypotension, trockenen Husten, vaskuläre Ödeme, Hyerkalämie etc. Bei Fällen von Nierendysfunktion, sollte auf die Dosierung und die Hyperkalämie geachtet werden, da sie hauptsächlich aus den Nieren exkretiert werden. Von einigen wurde berichtet, daß sie schädliche Wirkungen auf den Fetus haben und deswegen sind sie für schwangere Frauen kontraindiziert.
α₁-Blocker sollten vorsichtig angewendet werden, so daß sie keine Nebeneffekte, wie beispielsweise orthostatische Hypotension, verursachen.
Das bedeutet, daß hinsichtlich der Nebenwirkungen, der Sicherheit bei der Langzeitanwendung und Verbesserung der QOL gegenwärtig kein Medikament vollständig zufriedenstellend ist, obwohl viele Mittel gegen Hypotension mit verschiedenen Wirkungen vorhanden sind. Zusätzlich ist das vorherrschende Ziel einer antihypertensiven Therapie darin bestehend, daß Voranschreiten der Hypertensions-induzierten organischen Störungen zu verhindern und die Häufigkeit von Herzversagen, Nierenversagen und Zerebralapoplex und die daraus entstehende Mortalität zu senken. Antihypertensive Therapie kann einen Anstieg in der Anzahl an Patienten mit Hpyertensions-induziertem Nierenversagen nicht verhindern, obwohl berichtet wurde, daß eine antihypertensive Therapie die Mortalität bei Herzversagen und Zerebralapoplex verbessert. Bei der akuten oder chronischen Glomerulonephritis oder ähnlichen wird die Hypertension durch eine glomeruläre Störung verursacht. Es ist gezeigt worden, daß eine chronische Glomerulonephritis mit Hypertension eine schlechte Prognose hat, und die Hypertension ist einer der unabhängigen prognostischen Verschlechterungsfaktoren bei der chronischen Glomerulonephritis.
Es wurde jedoch keine Therapie für die Hypertension bei der chronischen Glomerulonephritis etabliert.
Deswegen sind therapeutische Mittel benötigt, die wirklich wünschenswerte Wirkweisen zur Verfügung stellen, und insbesondere die Entwicklung von Mitteln mit einer Schutzwirkung für die Nieren sind sehr gefragt.
Die Verbindung der Formel (I) als wirksamer Inhaltsstoff in den erfindungsgemäßen therapeutischen Mitteln ist eine bekannte Verbindung zur Verwendung in therapeutischen Mitteln. Siehe z.B. die japanische Patentveröffentlichungsoffenbarung (KOKAI) Nrn. 25323/84, 267781/88 ( JP 63267781 ).
Zusammenfassung der Erfindung
Das Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein sicheres therapeutisches Mittel, das die zirkulatorischen und organischen Funktionen verbessert, das Voranschreiten von Komplikationen verzögert und die Lebensqualität von Patienten durch das Verhindern des Absinkens der endogenen NO-Produktion und das Regulieren der Funktionen der Endothelzellen, bei Erkrankungen die mit einer NOS-Fehlfunktion assoziiert sind, zur Verfügung zu stellen.
Basierend auf den Ergebnissen zahlreicher Studien wurde hypothetisch angenommen, daß das BH4-Niveau bei Erkrankungen, die mit einer NOS-Fehlfunktion assoziiert sind, auch gesenkt sein können. Daher wurde BH4 DOCA-salt hypertension rats und DOCA-salt SHRs verabreicht, um die Hypothese zu testen. Es wurden gefunden, daß das BH4-Niveau, und noch überraschender das Expressionsniveau von NOS, tatsächlich in DOCA-salt hypertension rats gesenkt war. Bei der BH4-Verabreichung wurde eine Abnahme der endogenen NO-Produktion verhindert und physiologisch natürliche antihypertensive Wirkungen wurden erreicht. DOCA-salt SHRs wiesen ebenfalls eine tatsächliche Abnahme des BH4-Niveaus wie auch histopathologische Befunde wie beispielsweise nekrotisierende Glomerulitis und nekrotisierende Angiitis auf. Bei einer BH4-Verabreichung wurden antihypertensive Wirkungen wie auch bemerkenswerte Verbesserungswirkungen auf die histopathologischen Befunde durch das Regulieren der Funktionen der Endothelzellen erreicht. Daher wurde die vorliegende Erfindung auf der Grundlage vollendet, daß BH4 eine Wirkungsweise hat, die die gesenkte NOS-Funktion aktiviert. Demgemäß ist die vorliegende Erfindung auf eine wirksame Therapie mit BH4-Präparaten bei Erkrankungen ausgerichtet, die mit einer NOS-Fehlfunktion assoziiert sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den zeitlichen Verlauf der Blutdruckveränderung bei einer Kontrollgruppe (-O-), der DOCA-Gruppe (-Δ-) und einer Gruppe von DOCA salt hypertension rats, denen oral BH4 verabreicht wurde (DOCA + BH4-Gruppe, -⎕-).
2 zeigt den zeitlichen Verlauf der Veränderung des NO₂/NO₃-Gehalts im Urin in einer Kontrollgruppe (-O-), der DOCA-Gruppe (-Δ-) und einer Gruppe von DOCA salt hypertension rats, denen oral BH4 verabreicht wurde (DOCA + BH4-Gruppe, -⎕-).
3 zeigt den zeitlichen Verlauf der Veränderung der BP-Gehalts in dem Urin einer Kontroll-Gruppe (-O-), der DOCA-Gruppe (-Δ-) und einer Gruppe von DOCA salt hypertension rats, denen oral BH4 verabreicht wurde (DOCA + BH4-Gruppe, -⎕-).
4 zeigt die Ergebnisse der Messung der E-NOS-mRNA-Expression in Nierengeweben.
5 zeigt den zeitlichen Verlauf der Blutdruckveränderung in einer Kontrollgruppe (-•-), der DOCA-Gruppe (-Δ-) und einer Gruppe von DOCA salt hypertension rats, denen oral BH4 verabreicht wurde (DOCA + BH4-Gruppe, -⎕-).
6 zeigt den zeitlichen Verlauf der Veränderung des BP-Gehaltes im Urin einer Kontroll-Gruppe (-•-), der DOCA-Gruppe (-Δ-) und einer Gruppe von DOCA salt hypertension rats, denen oral BH4 verabreicht wurde (DOCA + BH4-Gruppe, -⎕-).
7 zeigt die Häufigkeiten histopathologischer Befunde bei der nekrotisierenden Glomerulitis und der nekrotisierenden Angiitis in einer Kontrollgruppe, COCA-Gruppe und COCA + BH4-Gruppe in Nierengewebeproben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Verhindern und/oder Behandeln von Erkrankungen, die mit einer NOS-Fehlfunktion assoziiert sind, umfassend als wirksamen Inhaltsstoff, eine Verbindung der Formel (I):
wobei R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom darstellen und R³ (6R)-L-Erythro-CH(OH)CH(OH)CH₃ darstellt, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Nach der hier gemachten Verwendung bedeutet NOS-Fehlfunktion, das die Expression von NOS, die im Gefäßendothel, Nervensystem, Niere, Plättchen, Myokard, glatten Muskeln und anderen Organen umfassend auftritt, aus irgendeinem Grund reduziert ist oder, daß die NOS-Wirkung aufgrund der Fehlfunktion dieser Zellen, selbst wenn sie exprimiert wird, nicht gezeigt wird. Ein typisches Beispiel der NOS-Fehlfunktion ist ein Absinken der endogenen NO-Niveaus. Erkrankungen, die mit einer NOS-Fehlfunktion assoziiert sind, schließen solche ein, die durch eine NOS-Fehlfunktion induziert, verschlimmert oder an der Heilung verhindert werden, wie beispielsweise Hypertension, Hyperlipämie, Arteriosklerose, koronare Gefäßspasmen, ischämische Herzerkrankung, Herzversagen, Thrombose, pulmonäre Hypertension, zerebrovaskuläres Versage, zerebrale Gefäßspasmen, Glomerulonephritis, chronisches Nierenversagen, Diabetes, postoperative Restenose, Achalasie, Portalhypertension, Leberstörungen, Störungen der Gastrointestinalschleimhaut, hypertrophe pylorische Stenose, Enteritis, Impotenz, Chorioretinopathie, etc. ein.
Wenn es an Patienten mit diesen Erkrankungen verabreicht wird, kann BH4 diese Erkrankungen verhindern oder behandeln, indem die NOS-Funktionen durch die stimulierende Wirkung auf die NOS-Produktion in vivo oder durch das Wiederherstellen der gesenkten Funktion der Endothelzellen normalisiert werden.
Demgemäß wird die vorliegende Erfindung zum Behandeln oder Verhindern von Erkrankungen angewendet, die durch die stimulierende Wirkung von BH4, um die NOS-Funktion zu aktivieren, behandelt werden.
Die Verbindung der Formel (I) als wirksamer Inhaltsstoff der vorliegenden Erfindung ist die folgende und pharmazeutisch akzeptable Salze davon: (6R)-L-Erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (BH4)
Die Verbindung der Formel (I), die als wirksamer Inhaltsstoff der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine bekannte Verbindung. Siehe beispielsweise die japanische Patentveröffentlichungsoffenbarung (KOKAI) Nrn. 25323/84, 267781/88 ( JP 63267781 ). Diese Verbindung kann als geeignetes Salz mit pharmakologisch nicht-toxischen Säuren, einschließlich Mineralsäuren wie beispielsweise Salzsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Borsäure und organischen Säuren wie beispielsweise Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Mesylsäure verwendet werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist gegen die oben genannten Erkrankungen wirksam, die mit einer NOS-Dysfunktion zusammenhängen. Z.B. ist sie gegen Hypertension, einschließlich nicht nur der Hypertension im wesentlichen sondern auch der malignen Hypertension mit einer Nekrose der arteriolen Wände in der Niere und Retina wirksam, welche nach einer kurzen Zeit auftritt und bei renaler Hypertension, die von Nierenstörungen begleitet wird. Genauer ist sie gegen alle Arten von Hypertension wie essential Hypertension, Nierenhypertension, renovaskulärer Hypertension, schwangerschaftsinduzierter Hypertension, seniler Hypertension und adrenaler Hypertension wirksam, sofern sie mit einer NOS-Dysfunktion zusammenhängen.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird durch das Formulieren einer Verbindung der Formel (I) mit allgemeinen verwendeten Trägerstoffen durch konventionelle Verfahren in einer Dosierung, die für orale, rektale oder parenterale Verabreichung (einschließlich der Verabreichung in die Vene und die zerebrospinale Flüssigkeit) geeignet ist.
Der Träger, der für diese pharmazeutischen Formulierungen verwendet wird, schließt im allgemeinen Arzneiträger, Bindemittel, Desintegratoren, etc. in Abhängigkeit von der gewählten Dosierungsform ein.
Typische Beispiele für Arzneiträger schließen Stärke, Lactose, Sucrose, Glucose, Mannitol und Cellulose ein, und Beispiele für Bindemittel schließen Polyvinylpyrrolidon, Stärke, Sucrose, Hydroxypropylcellulose, Gummi arabicum ein. Beispiele für Desintegratoren schließen Stärke, Agar, Gelatinepulver, Cellulose, CMC ein, aber jegliche weitere konventionelle Arzneiträger, Bindemittel und Desintegratoren können ebenfalls verwendet werden.
Zusätzlich zu solchen Trägerstoffen kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ebenfalls Antioxidationsmittel zur Stabilisierung der wirksamen Inhaltsstoffe enthalten. Antioxidationsmittel können aus solchen, die konventionell für pharmazeutische Präparate verwendet werden, passend ausgewählt werden, wie beispielsweise aus Ascorbinsäure, N-Acetylcystein, L-Cystein, dl-α-Tocopherol, natürlichem Tocopherol etc. Sie werden in einer Menge verwendet, die den aktiven Inhaltsstoff stabilisiert und im allgemeinen beträgt das Verhältnis eines Antioxidationsmittels zwischen 0,2 und 2 Gew.-Teilen gegenüber 1 Teil des aktiven Inhaltsstoffs.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können in Form von Tabletten, Lutschtabletten, Kapseln, Pulvern, Körnern oder feinen Körnern oder Suspensionen in einer nicht-wäßrigen Flüssigkeit wie beispielsweise Sirupen, Emulsionen oder Schluckmitteln (draft) (pro re nata-Präparat), das die vorgeschriebene Menge des aktiven Inhaltsstoffs enthält, zur Verfügung gestellt werden.
Körner werden z.B. durch homogenes Mischen des aktiven Inhaltsstoffs mit einem oder mehreren zusätzlichen Inhaltsstoffen wie beispielsweise Trägerstoffen und Antioxidationsmitteln, wie oben erwähnt, hergestellt, gefolgt von der Granulierung und dem Sieden in eine gleichmäßige Körnergröße. Tabletten können durch das Komprimieren oder Formen des aktiven Inhaltsstoffs gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren zusätzlichen Inhaltsstoffen hergestellt werden. Kapseln werden durch das Einfüllen von Pulver oder Körnern des aktiven Inhaltsstoffs gegebenenfalls homogen mit einem zusätzlichen Inhaltsstoff (einem oder mehreren) in geeignete Kapseln unter Verwendung einer Kapselfüllmaschine oder ähnlicher hergestellt. Formulierungen für die rektale Verabreichung können als Zäpfchen unter Verwendung konventioneller Trägerstoffe, wie beispielsweise Kakaobutter zur Verfügung gestellt werden. Parenterale Formulierungen können als trockene Feststoffe des aktiven Inhaltsstoffs, die in stickstoffgefüllten sterilisierten Behältern versiegelt sind, zur Verfügung gestellt werden. Solche trockenen festen Präparate können dem Patienten nach dem Dispergieren oder Lösen davon in einer vorherbestimmten Mengen sterilisierten Wassers direkt vor der Verabreichung verabreicht werden.
Beim Herstellen dieser Formulierungen können bevorzugt Antioxidationsmittel wie oben erwähnt zu dem Gemisch des wirksamen Inhaltsstoffs und den konventionellen Trägerstoffen hinzugegeben werden, und gegebenenfalls kann auch einer oder mehrere zusätzliche Inhaltsstoffe ausgewählt aus Puffern, Geschmacksstoffen, Tensiden, Viskosemitteln, Schmiermitteln etc., falls notwendig, hinzugegeben werden.
Die Dosierung des aktiven Inhaltsstoffs, d.h. der Verbindung der Formel (I) kann mit der Verabreichungsroute, dem zu behandelnden Symptom und dem Zustand des Patienten variieren, und die schlußendliche Bestimmung der Dosierung sollte durch den aufgesuchten Arzt erfolgen.
Eine geeignete Dosierung zur Behandlung von Hypertension reicht beispielsweise von 0,1 bis 50 mg/kg (b.w.)/Tag, und die repräsentative optimale Dosierung beträgt 0,5 bis 10 mg/kg (b.w.)/Tag.
Die gewünschte Dosis dieses wirksamen Inhaltsstoffs kann einmal täglich oder in Teildosierungen zu zwei- bis viermal pro Tag in einem geeigneten Intervall verabreicht werden.
Der wirksame Inhaltsstoff kann alleine oder in Kombination mit pharmazeutischen Formulierungen die andere wirksame Inhaltsstoffe, die für die zu behandelnde Erkrankung geeignet sind, beispielsweise zur Erleichterung der Kontrolle der Dosierung verabreicht werden.
Zusätzlich zu der Verbindung der Formel (I) als wirksamer Inhaltsstoff können Formulierungen der vorliegenden Erfindung mindestens einen zusätzlichen wirksamen Inhaltsstoff enthalten, der ausgewählt ist aus den Substraten oder einen Co-Enzym oder Co-Faktor für NOS, wie beispielsweise L-Argininflavinen, z.B. FAD, FMN, etc. oder Calcium. Bessere therapeutische Wirkungen können erwartet werden, wenn die Verbindung der Formel (I) mit diesen wirksamen Inhaltsstoffen gemischt wird, als wenn sie alleine verwendet wird. Der Anteil eines jeden dieser zusätzlichen Inhaltsstoffe in Formulierungen der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders beschränkt. Das Gewichtsverhältnis von mindestens einen ausgewählt aus L-Arginin, Flavinen und Calcium zu 1 Teil der Verbindungen der Formel (I) kann beispielsweise innerhalb eines Bereichs von 0,1 bis 10, bevorzugt von 0,5 bis 2 sein.
Eine geeignete Dosierung solcher gemischten Formulierungen zur Behandlung von Hypertension reicht beispielsweise von 0,1 bis 50 mg/kg (b.w.)/Tag, bevorzugt 0,5 bis 10 mg/kg (b.w.)/Tag hinsichtlich der Gesamtmenge der aktiven Inhaltsstoffe.
Ein Arzt kann Formulierungen, die die Verbindung der Formel (I) alleine oder in Kombination mit weiteren aktiven Inhaltsstoffen in Abhängigkeit vom Alter, dem Zustand und weiteren Faktoren des Patienten auswählen.
Der wirksame Inhaltsstoff, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist (6R)-L-Erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (BH4) und Salze davon. Es ist überflüssig zu sagen; daß BH4, der natürlich vorkommenden Bestandteil am meisten bevorzugt ist. BH4-Dihydrochlorid hat geringe Toxizität gegenüber Ratten, was aus der Tatsache beurteilt wird, daß die akute Toxizität mehr als 2 g/kg (b.w.) betrug. Ein optisch inaktives (6R,S)-5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin ist ebenfalls. nur leicht toxisch wie in der japanischen Patentveröffentlichungsoffenbarung Nr. 25323/84 zur Behandlung der Parkinsonschen Erkrankung berichtet wurde, so daß es ebenfalls für die Therapie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Die folgenden Beispiele erklären die vorliegende Erfindung im Detail, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Beispiele begrenzt.
Beispiele
Beispiel 1: Körnchen und feine Körnchen
Zu 1 Teil (in Gewicht) Polyvinylpyrrolidon (Kollidon 30), das in sterilisiertem gereinigten Wasser gelöst war, wurden 10 Teile Ascorbinsäure und 5 Teile L-Cysteinhydrochlorid hinzugegeben, um eine homogene Lösung zu ergeben, und dann wurden 10 Teile BH4-Dihydrochlorid hinzugegeben, um eine homogene Lösung herzustellen.
Diese Lösung wurde zu 59 Teilen eines Trägerstoffes (Mannitol oder Lactose) und 15 Teilen eines Desintegrationsmittels [Maisstärke oder Hydroxypropylcellulose (LH-22)] hinzugegeben, und das Gemisch wurde geknetet, granuliert, getrocknet und dann gesiebt.
Beispiel 2: Tabletten
Die homogene Lösung des aktiven Inhaltsstoffs, das in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde mit 58 Teilen Lactose und 15 Teilen mikrokristalliner Cellulose gemischt, dann mit 1 Teil Magnesiumstearat und tablettiert.
Beispiel 3: Kapseln
Die in Beispiel 1 hergestellte Dosierungsform wurde in Kapseln gefüllt, wobei die Formulierung 0,2 % Magnesiumstearat als Gleitmittel einschließt. Beispiel 4: Injektion

BH4-Dihydrochlorid 1,5 g

Ascorbinsäure 1,5 g

L-Cysteinhydrochlorid 0,5 g

Mannitol 6,5 g
Die oben genannten Inhaltsstoffe wurden in sterilem gereinigten Wasser gelöst, um 100 ml zu ergeben und dann sterilisiert, und 1 ml oder 2 ml Aliquots wurden jeweils in ein Gefäß oder eine Ampulle verteilt, dann lyophilisiert und versiegelt.
Beispiel 5: Injektion
2,0 g BH4-Dihydrochlorid wurden in sterilen gereinigten Wasser gelöst, um 100 ml in einer anaeroben Atmosphäre zu ergeben und dann sterilisiert und auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 versiegelt. Beispiel 6: Zäpfchen

BH4-Dihydrochlorid 150 Teile

Ascorbinsäure 150 Teile

L-Cysteinhydrochlorid 50 Teile
Die oben genannten Inhaltsstoffe wurden homogen gemahlen und in 9950 Teilen Kakaobutter dispergiert. Beispiel 7: Körnchen

BH4-Dihydrochlorid 5 Teile

Ascorbinsäure 5 Teile

L-Cysteinhydrochlorid 2 Teile
Die oben genannten Inhaltsstoffe wurden verwendet, um eine homogene Lösung herzustellen.

Diese Lösung wurde zu einem homogenen Gemisch aus 55 Teilen Mannitol, 1 Teil Polyvinylpyrrolidon, 14 Teilen Hydroxypropylcellulose und 5 Teilen L-Arginin oder Calcium hinzugegeben, und das Gemisch wurde geknetet, granuliert, getrocknet und dann gesiebt. Beispiel 8: Körnchen

BH4-Dihydrochlorid	5 Teile
Ascorbinsäure	5 Teile
L-Cysteinhydrochlorid	5 Teile
Mannit	52 Teile
Polyvinylpyrrolidon (Kollidon 30)	1 Teil
Hydroxypropylcellulose (LH-22)	12 Teile
L-Arginin oder Calcium	10 Teile

Die oben genannten Inhaltsstoffe wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 granuliert und gesiebt. Beispiel 9: Körner

BH4-Dihydrochlorid 5 Teile

Ascorbinsäure 5 Teile

L-Cysteinhydrochlorid 2 Teile
Die oben genannten Inhaltsstoffe wurden verwendet, um eine homogene Lösung herzustellen.
Diese Lösung wurde zu einem homogenen Gemisch aus 10 Teilen L-Arginin oder Calcium, 50 Teilen Mannit, 1 Teil Polyvinylpyrrolidon (Kollidon 30) und 9 Teilen Hydroxypropylcellulose (LH-22) gegeben, und das Gemisch wurde geknetet, granuliert, getrocknet und dann gesiebt.
Beispiel 10: Herstellung von DOCA-salt hypertension rats
Aus jeder 8-Wochen alten Sprague-Dawley-Ratte (bezogen von Charles River) wurde eine Niere entfernt, außer in einer Kontrollgruppe. Dann wurden die Tiere in die folgenden drei experimentellen Gruppen geteilt.

1) Eine Gruppe, der nur Wasser zu trinken gegeben wurde (Kontrollgruppe); Probengröße n = 3;
2) Eine Gruppe von DOCA-salt hypertension-Ratten, die hergestellt wurden, indem einmal wöchentlich subkutan 30 mg/kg b.w. Desoxycorticosteronacetat (DOCA) verabreicht wurde, und die 1 % Kochsalzlösung als Trinkwasser eine Woche nach der Nephrektomie bekamen (DOCA-Gruppe); n = 6;
3) Eine Gruppe DOCA-salt hyptertension-Ratten, der BH4 (10 mg/kg b.w./Tag) oral verabreicht wurde (DOCA + BH4-Gruppe); n = 5.

Zu Beginn des Experiments und nach 2, 4 und 5 Wochen (am Ende der Beobachtungsdauer) wurde Urin über 24 Stunden unter Verwendung eines Stoffwechselkäfigs gesammelt. Am Ende der Beobachtungsdauer, wurde unter Anästhesie mit Phenobarbital eine Blutprobe aus der Abdominalaorta abgenommen. Die Niere wurde isoliert, nachdem mit physiologischer Kochsalzlösung perfundiert wurde, und histologisch und immunohistologisch untersucht.
Messung des Blutdrucks
Der Blutdruck wurde durch den Schwanzschlag-Test zu Beginn des Experimentes und nach 2, 4 und 5 Wochen gemessen.
Messung von NO₂/NO₃ im Urin
Die Messung wurde unter Verwendung eines Nitrat-Nitrit-Assay-Kits (Kit Nr. 780001, Cyman Chemical Company) nach dem Griess-Verfahren durchgeführt.
Die NO₂/NO₃-Werte im Urin bezeichnen die NOS-Aktivität, insbesondere je höher der Wert, desto höher die Aktivität.
BP-Messung im Urin
Biopterin (BP), ein BH4-Stoffwechselprodukt, wurde mittels HPLC entsprechend dem Verfahren von Fukushima und Nixon (Anal. Biochem. 102: 176–188, 1980) gemessen. Die Wirkungen der BH4-Verabreichung wurden auf der Grundlage einer Veränderung des BP-Niveaus im Urin untersucht.
Immunfärbung der Nierengewebe NOS
Die Expression von endothelialer NOS (e-NOS) und Hirn-NOS (b-NOS) in Nierengeweben wurde in den Schnitten der eingefrorenen isolierten Nierengewebe durch Immunfärbung mit anti-e-NO5- und anti-b-NOS-Antikörpern (Affinity Bioreagents) untersucht.
Messung der NOS-mRNA-Expression
a) Extraktion der Gesamt-RNA aus Nierengeweben
Die Extraktion der RNA aus Nierengeweben wurden mit Hilfe des Guanidinium/Cäsiumchlorid-Extraktionsverfahrens durchgeführt.
D.h., daß eine geringe Menge an Geweben, die aus dem Nierencotex der isolierten Niere entnommen wurde, direkt in eine Lyselösung von 4 M Guanidiniumthiocyanat gegeben wurde und mit einem Glas/Teflon-Homogenisator homogenisiert wurde. Dieses Lysat wurde auf 5,7 M Cäsiumchlorid geschichtet und bei 80 000 Upm für 2 Stunden zentrifugiert, dann wurde das Präzipitat in 0,1 % Diethylpyrocarbonat (DEP)-Lösung gelöst. Diese Lösung wurde mit 2,5 M Ammoniumacetat und Ethanol bei –20°C für eine Stunde präzipitiert und bei 10 000 Upm bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert, um ein Präzipitat zu ergeben. Das Präzipitat wurde in 0,1 % DEP-Lösung bei einer Konzentration von ungefähr 1 μg/μl gelöst und bei –20°C vor der Verwendung gelagert.
b) Reverse Transkriptase (RT)-Reaktion
Aus der gesamten RNA wurde unter Verwendung von MoMLV reverse Transkriptase cDNA synthetisiert.
Zusammengefaßt wurde ein Gemisch aus Gesamt-RNA, Primern, Puffer und H₂O bei 95°C für 2 Minuten erwärmt und dann eisgekühlt. Dann wurde das Gemisch bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, um die Primer an die RNA anzulagern. Dann wurde eine Lösung, die 0,2 M Dithiothreitol (DTT), und 5 mM Desoxyribonukleotid (dNTP), RNAsin und MoMLV Reverse Transkriptase zu dem Gemisch hinzugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde für 5 Minuten auf 90°C erwärmt und die Reaktion wurde durch Eiskühlen gestoppt.
c) PCR
Eine PCR wurde unter Verwendung der in der RT-Reaktion synthetisierten cDNA als Matrize durchgeführt
Genau gesagt, wurde die RT-Reaktionslösung zu einem Gemisch aus 5'- und 3'-Primern jeweils für die zu detektierende e-NOS und für Malatdehyadrogenase (MDH) hinzugegeben, welcher als interner Standard verwendet wurde, PCR-Puffer, 2,5 mM dNTP Mischlösung und Taq-DNA-Polymerase. Das Reaktionsgemisch wurde mit Mineralöl bedeckt und zentrifugiert, worauf die Reaktion in einem automatischen PCR-Apparat gestartet wurde. Die PCR-Produkte wurden durch das Durchführen von 30 Zyklen erhalten, wobei jeder Zyklus aus 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden besteht. Die für die Detektion von e-NOS und MDH verwendeten Primer wurden aus Grundlage des Berichts von Ujiie, Kl. et al., Am. J. Physiol. 267 (Renal Fluid Elektrolyte Physiol. 36): F296–F302, 1994 ausgewählt. Genauer gesagt waren die Basensequenzen der Primer, die für die Detektion von e-NOS verwendet wurden TACGGAGCAGCAAATCCAC (SEQ ID NO: 1) für den 5'-Primer und CAGGCTGCAGTCCTTTGATC (SEQ ID NO: 2) für den 3'-Primer. Die Basensequenzen der Primer, die für die Detektion von MDH verwendet wurden, waren CAAGAAGCATGGCGTATACAACCC (SEQ ID NO: 3) für den 5'-Primer und TTTCAGCTCAGGGATGGCCTCG (SEQ ID NO: 4) für den 3'-Primer.
d) Messung von NOS mRNA-Expression mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Hybridisierung nach Southern.
Die PCR-Produkte wurden auf einem 5%igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und die NOS-mRNA-Expression wurde mit Hilfe einer Hybridisierung nach Southern gemessen.
Genauer gesagt wurde die PCR-Reaktionslösung auf einem 5%igen Polyacrylamid elektrophoretisch aufgetrennt und dann wurde das Gel auf Membranfilter überführt. Eine Hybridisierung wurde auf den Membranfiltern unter Verwendung von Proben durchgeführt, die mit γ³²P-ATP am 5'-Ende zur Detektion von e-NOS und MDH markiert waren (Ujiie, K. et al., 1994, supra). Die Basensequenz der Probe war CTGGAACAATTTCCATCCG (SEQ ID NO: 5) zur Detektion von e-NOS und TTTGTCTTCTCCCTGGTGGA (SEQ ID NO: 6) zur Detektion von MDH. Dann wurde eine Autoradiographie bei –70°C für einige Stunden durchgeführt und die belichteten Autoradiogramme wurden mit Hilfe eines Densitometers analysiert. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Auf Grundlage der Ergebnisse der Autoradiographie wurde die Menge der e-NOS PCR-Produkte gegen die Menge des Housekeeping-Gens MDH PCR-Produkt normalisiert, um die e-NOS-Genexpression halbquantitativ zu ermitteln.
Statistik
Die gemessenen Werte wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung ausgedrückt und statistisch unter Verwendung des zweiteiligen ANOVA-Tests untersucht. In den folgenden Analysen waren die Signifikantniveaus auf p <0,05 eingestellt.
Die Veränderung des Blutdrucks ist in Tabelle 1 und 1 gezeigt. Die DOCA-Gruppe entwickelte eine Hypertension in der Woche 4 nach dem Beginn der Beobachtung. Der Anstieg des Blutdrucks in der COCA-Gruppe war, verglichen mit den zwei anderen Gruppen, signifikant. Die DOCA + BH4-Gruppe blieb ähnlich der Kontrollgruppe bis zum Ende des Beobachtungszeitraums auf Normalwert.
Tabelle 1 Blutdruck (mmHg)
Die Veränderung von NO₂/NO₃ im Urin ist in Tabelle 2 und 2 gezeigt. In der DOCA-Gruppe sank der Wert von NO₂/NO₃ im Urin mit der Zeit und fiel zum Ende des Beobachtungszeitraums unter die Meßbarkeitsgrenze. Die DOCA + BH4-Gruppe zeigte jedoch einen Anstieg in dem Wert. Das Absinken in der DOCA-Gruppe war, verglichen mit den zwei anderen Gruppen, signifikant, und kein signifikanter Unterschied wurde zwischen der Kontrollgruppe und der DOCA + BH4-Gruppe gesehen.
Tabelle 2 NO₂/NO₃ im Urin (mmol/Tag)
Die Veränderung von BP im Urin ist in Tabelle 3 und 3 gezeigt.
In der DOCA-Gruppe sank der BP-Wert mit der Zeit. Die DOCA + BH4-Gruppe zeigte jedoch einen Anstieg im BP-Wert mit der Zeit. Das Absinken in der DOCA-Gruppe war signifikant verglichen mit den zwei anderen Gruppen, und es wurde keine signifikante Differenz zwischen der Kontrollgruppe und der DOCA + BH4-Gruppe gefunden.
Tabelle 3 BP im Urin (nmol/Tag)
Wie in Tabelle 4 gezeigt wird, stieg das Körpergewicht in allen Gruppen mit der Zeit an, und es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den drei Gruppen gefunden.
Tabelle 4 Körpergewicht (g)
Die Ergebnisse der Immunfärbung zeigten, daß die Expression von e-NOS in kleinen Gefäßen und die Expression von b-NOS in der Macula densa in der DOCA-Gruppe jeweils sanken, während diese Expression in der DOCA + BH4-Gruppe vergleichbar mit der Kontrollgruppe oder leicht erhöht waren.
(Ergebnisse der Messung der NOS-mRNA-Expression)
Wie in 4 gezeigt ist, zeigten die Messungsergebnisse, daß die e-NOS mRNA-Expression in der DOCA + BH-Gruppe, verglichen mit DOCA-Gruppe signifikant erhöht war.
Wie oben beschrieben wurde, wiesen DOCA-salt hypertension-Ratten einen Anstieg im Blutdruck an, ein Sinken des NO₂/NO₃ im Urin und ein Sinken der NOS-Expression in Nierengeweben auf, was darauf hindeutet, daß eine Fehlfunktion der vasoendothelialen Zellen in diesem Rattenmodell auftrat. Das Absinken von BP in dem Urin wurde ebenfalls in diesem Rattenmodell beobachtet. Andererseits unterdrückte die orale Verabreichung von BH4 den Anstieg im Blutdruck und führte zu einem Anstieg von NO₂/NO₃ im Urin und einem Anstieg der NOS-Expression in Nierengeweben, was darauf hindeutet, daß BH4 zur Behandlung von Erkrankungen nützlich ist, die durch eine gesenkte endogene NO-Produktion verursacht werden, indem die NOS-Funktion aktiviert wird (durch Regulierung des NOS-Niveaus/der NOS-Aktivität).
Beispiel 11: Herstellung von DOCA-salt SHR
Aus 8 Wochen alten SHRs (bezogen von Charles River) wurde außer in einer Kontrollgruppe eine Niere entfernt. Dann wurden die Tiere in die folgenden drei experimentellen Gruppen geteilt.

1) Eine Gruppe, der nur Trinkwasser gegeben wurde (Kontrollgruppe); Probengröße 8 = 8;
2) Eine Gruppe DOCA-salt SHRs, die durch das Verabreichen von 30 mg/kg b.w. Desoxycorticostereonacetat (DOCA) subkutan einmal pro Woche und durch 1 % Kochsalzlösung als Trinkwasser eine Woche nach der Nephrektomie (DOCA-Gruppe) hergestellt wurden; n = 4;
3) Eine Gruppe DOCA-salt SHRs, denen BH4 (10 mg/kg b.w./Tag) oral verabreicht wurde (DOCA + BH4-Gruppe); n = 6.

Der Urin wurde für 24 Stunden unter Verwendung eines Stoffwechselkäfigs zu Beginn des Experiments und nach 2, 3, 4, 5 und 6 (bei Beendigung des Beobachtungszeitraums) Wochen gesammelt. Bei Beendigung des Beobachtungszeitraums, wurden Blutproben aus der Abdominalaorta unter Anästhesie mit Phenobarbital gesammelt. Die Niere wurde nach Perfundieren mit physiologischer Kochsalzlösung isoliert und histologisch untersucht.
Messung des Blutdrucks
Der Blutdruck wurde durch den Schwanzschlag-Test beim Beginn des Experiments und nach 2, 3, 4, 5 und 6 Wochen gemessen.
Messung von BP im Urin
Biopterin (BP), ein Metabolit von BH4 wurde gemäß dem Verfahren von Fukushima und Nixon mittels HPLC gemessen. Die Wirkung der BH4-Verabreichung werden auf der Grundlage der Veränderung des BP-Niveaus im Urin untersucht.
Histopatholgische Befunde
Nach dem Einsammeln des Urins und dem Messen des Blutdrucks nach 6 Wochen, wurden die Tiere unter Anästhesie aufgeschnitten, aus der Abdominalaorta verbluten gelassen und mit physiologischer Kochsalzlösung über diese Stelle perfundiert. Die isolierte Niere wurde in einer 10%igen Formaldehyd-Lösung fixiert, in Paraffin eingebettet, dann in einer Dicke von 4 μm mit Hilfe eines Mikrotoms geschnitten. Die Proben wurden mit Hematoxylin/Eosin (HE) und Periodsäure-Schiff gefärbt. Die Häufigkeiten histopathologischer Befunde einer nekrotisierenden Glomerulitis und nekrotisierenden Arteriolitis wurden zwischen den Gruppen verglichen.
Statistik
Die gemessenen Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt und statistisch unter Verwendung des zweiteiligen ANOVA-Tests untersucht. In den folgenden Analysen wurde das Signifikantsniveau auf p <0,05 festgesetzt.
Die Veränderung des Blutdrucks ist in der Tabelle 5 und 5 gezeigt. Die DOCA-Gruppe entwickelte eine bemerkenswerte Hypertension in der 3. Woche nach dem Beginn der Beobachtung. Der Anstieg des Blutdrucks in der DOCA-Gruppe war verglichen mit den zweianderen Gruppen signifikant. Die DOCA + BH4-Gruppe zeigte jedoch die gleichen Blutdruckniveaus wie die der Kontrollgruppe, bis zum Ende der Beobachtungsperiode.
Tabelle 5 Blutdruck (mmHg)
Die Veränderung des BPs im Urin ist in Tabelle 6 und 6 gezeigt. In der Doca-Gruppe sank der BP-Wert mit der Zeit. In der DOCA + BH4-Gruppe zeigte sich jedoch ein Anstieg des BP-Wertes über die Zeit. Der Abfall in der DOCA-Gruppe war verglichen mit den zwei anderen Gruppen signifikant und kein signifikanter Unterschied wurde zwischen der Kontrollgruppe und der DOCA + BH4-Gruppe gefunden.
Tabelle 6 BP im Urin (nmol/Tag)
Die Häufigkeit histopathologischer Befunde in Nierengewebeproben werden in Tabelle 7 und 7 gezeigt. Die DOCA-Gruppe zeigte signifikant höhere Häufigkeiten nekrotisierender Glomerulitis und nekrotisierender Angiitis, verglichen mit den zwei anderen Gruppen.
Tabelle 7 Prozentsatz (%) der Häufigkeiten histopathologischer Befunde in Nierengeweben
Wie oben beschrieben wurde, wiesen DOCA-salt SHRs einen Anstieg im Blutdruck und den histopathologischen Befunden der nekrotisierenden Glomerulitis und nekrotisierenden Angiitis auf. Ein Absinken des BPs im Urin wurde ebenfalls in diesen Modellratten beobachtet. Andererseits unterdrückte die orale Verabreichung von BH4 den Anstieg des Blutdrucks und verbesserte die histopathologischen Befunde bemerkenswert, was darauf hindeutet, daß BH4 zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Fehlfunktion der Endothelzellen assoziiert sind, durch das Aktivieren der NOS-Funktion nützlich ist.
Wie erklärt wurde, stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die wirksam Erkrankungen verhindert und/oder verbessert, die mit einer NOS-Fehlfunktion assoziiert sind. Zusätzlich hat der wirksame Inhaltsstoff des therapeutischen Mittels der vorliegenden Erfindung bei Langzeitverwendung keine Nebenwirkungen oder ähnliches, da er eine Substanz ist, die in vivo inhärent existiert.

Claims

Verwendung einer Verbindung der Formel (I):
worin R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom darstellen und R³ (6R)-L-Erythro-CH(OH)CH(OH)CH₃ darstellt, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Dysfunktion von NOS assoziiert sind.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Erkrankung, die mit einer Dysfunktion von NOS assoziiert ist, eine Erkrankung ist, die von einer verminderten endogenen NO-Produktion begleitet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Erkrankung, die mit einer Dysfunktion von NOS assoziiert ist, eine Erkrankung ist, die von einer Dysfunktion der Endothelzellen begleitet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Erkrankung, die mit einer Dysfunktion von NOS assoziiert ist, mit einer Abnahme der NOS-Expression assoziiert ist.
Verwendung einer Verbindung der Formel (I):
worin R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom darstellen und R³ (6R)-L-Erythro-CH(OH)CH(OH)CH₃ darstellt, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, zur Herstellung eines prophylaktischen oder therapeutischen Mittels für Bluthochdruck, der mit einer Dysfunktion von NOS assoziiert ist.
Verwendung einer Verbindung der Formel (1):
worin R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom darstellen und R³ (6R)-L-Erythro-CH(OH)CH(OH)CH₃ darstellt, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, zur Herstellung eines prophylaktischen oder therapeutischen Mittels für Nierenstörungen, die mit einer Dysfunktion von NOS assoziiert ist.