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Die
vorliegende Anmeldung betrifft neue, substituierte 2,3-Dihydro-1,2,3-triazol-4-on-Derivate,
Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder
Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung
von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten,
insbesondere von kardiovaskulären
und hämatologischen
Erkrankungen, von Nierenerkrankungen sowie zur Förderung der Wundheilung.
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Eine
mangelhafte Versorgung des menschlichen Organismus oder seiner Teile
mit Sauerstoff, die entweder durch ihre Dauer und/oder ihr Ausmaß eine regelrechte
Funktion des Organismus oder seiner Teile beeinträchtigt oder
ihre Funktion völlig
zum Erliegen bringt, wird als Hypoxie bezeichnet. Eine Hypoxie kann
verursacht werden durch eine Verminderung des verfügbaren Sauerstoffs
in der Atemluft (z.B. bei Aufenthalten in großer Höhe), durch Störungen der äußeren Atmung
(z.B. infolge gestörter
Funktion der Lungen oder Verlegung der Atemwege), durch eine Verminderung
des Herzzeitvolumens (z.B. bei einer Herzinsuffizienz, einer akuten
Rechtsherzüberlastung
bei Lungenembolie), durch eine zu geringe Sauerstoff-Transportkapazität des Blutes
(z.B. infolge einer Blutarmut (Anämie) oder Intoxikation z.B.
mit Kohlenmonoxid), örtlich
begrenzt durch eine Minderdurchblutung infolge von Gefäßverschlüssen (Ischämie-Zustände typischerweise
z.B. des Herzens, der unteren Extremitäten oder des Gehirns, diabetische
Makro- und Mikroangiopathie)
oder auch durch erhöhten
Sauerstoffbedarf des Gewebes (z.B. infolge erhöhter Muskelarbeit oder lokaler
Entzündungen)
[Eder, Gedigk (Hrsg.), Allgemeine Pathologie und pathologische
Anatomie, 33. Aufl., Springer Verlag, Berlin, 1990].
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Der
menschliche Organismus ist bedingt fähig, sich an Situationen verminderter
Sauerstoffversorgung akut und chronisch anzupassen. Neben einer
Sofortantwort, welche u.a. durch vegetativnervöse Kontrollmechanismen eine
Erhöhung
des Herzzeitvolumens und des Atemzeitvolumens sowie eine lokale
Erweiterung von Blutgefäßen einschließt, zieht
die Hypoxie eine Veränderung
der Transkription zahlreicher Gene nach sich. Die Funktion der Genprodukte
dient dabei der Kompensation des Sauerstoffmangels. So werden mehrere
Enzyme der Glykolyse und der Glukosetransporter 1 verstärkt exprimiert,
wodurch die anaerobe ATP-Gewinnung gesteigert und ein Überleben
des Sauerstoffmangels ermöglicht
wird [Schmidt, Thews (Hrsg.), Physiologie des Menschen,
27. Aufl., Springer Verlag, Berlin, 1997; Löffler, Petrides
(Hrsg.), Biochemie und Pathobiochemie, 7. Aufl., Springer Verlag,
Berlin, 2003].
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Ferner
führt Hypoxie
zur verstärkten
Expression des vaskulären
Endothelzellwachstumsfaktors, VEGF, wodurch in hypoxischen Geweben
die Neubildung von Blutgefäßen (Angiogenese)
angeregt wird. Hierdurch wird langfristig die Durchblutung ischämischer
Gewebe verbessert. Bei verschiedenen Herzkreislauferkrankungen und
Gefäßverschluß-Erkrankungen
erfolgt diese Gegen regulation offenbar nur sehr unzureichend [Übersicht
bei: Simon und Ware, Therapeutic angiogenesis in cardiovascular
disease, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (11), 863-71 (2003)].
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Ferner
wird bei systemischer Hypoxie das vorwiegend in den interstitiellen
Fibroblasten der Nieren gebildete Peptidhormon Erythropoietin verstärkt exprimiert.
Hierdurch wird die Bildung roter Blutzellen im Knochenmark angeregt
und damit die Sauerstoff-Transportkapazität des Blutes gesteigert. Dieser
Effekt wurde und wird von Leistungssportlern beim sogenannten Höhentraining
genutzt. Eine Abnahme der Sauerstoff-Transportkapazität des Blutes
z.B. infolge einer Blutungsanämie
verursacht normalerweise eine Zunahme der Erythropoietin-Produktion
in der Niere. Bei bestimmten Formen der Anämie kann dieser Regelmechanismus
gestört
oder sein Sollwert niedriger eingestellt sein. So wird z.B. bei
Patienten, die unter einer Niereninsuffizienz leiden, Erythropoietin
im Nierenparenchym zwar produziert, jedoch bezogen auf die Sauerstoff-Transportkapazität des Blutes
in deutlich verminderten Mengen, was eine sogenannte renale Anämie zur Folge
hat. Insbesondere die renale Anämie,
aber auch Tumor- und HIV-Infektion-bedingte Anämien werden üblicherweise
durch parenterale Verabfolgung von rekombinantem humanen Erythropoietin
(rhEPO) behandelt. Derzeit existiert zu dieser kostspieligen Therapie
keine alternative Therapie mit einem oral verfügbaren Arzneistoff [Übersichten
bei: Eckardt, The potential of erythropoietin and related
strategies to stimulate erythropoiesis, Curr. Opin. Investig. Drugs
2(8), 1081-5 (2001); Berns, Should the target hemoglobin
for patients with chronic kidney disease treated with erythropoietic
replacement therapy be changed?, Semin. Dial. 18 (1), 22-9 (2005)].
Jüngere
Untersuchungen belegen, dass Erythropoetin neben seiner die Erythropoese
steigernden Wirkung auch eine hiervon unabhängige, schützende (anti-apoptotische)
Wirkung auf hypoxische Gewebe, insbesondere das Herz und das Gehirn
ausübt.
Ferner mindert eine Therapie mit Erythropoetin neueren Studien zufolge
an herzinsuffizienten Patienten den durchschnittlichen Morbiditäts-Schweregrad [Übersichten bei: Caiola
und Cheng, Use of erythropoietin in heart failure management, Ann.
Pharmacother. 38 (12), 2145-9 (2004); Katz, Mechanisms
and treatment of anemia in chronic heart failure, Congest. Heart.
Fail. 10 (5), 243-7 (2004)].
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Den
oben beschriebenen durch Hypoxie induzierten Genen ist gemeinsam,
dass die Steigerung ihrer Expression unter Hypoxie durch den sogenannten
Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktor (HIF) hervorgerufen wird.
Bei HIF handelt es sich um einen heterodimeren Transkriptionsfaktor,
der aus einer alpha- und einer beta-Untereinheit besteht. Es wurden
drei HIF-alpha-Isoformen
beschrieben, von denen HIF-1 alpha und HIF-2 alpha hoch homolog
und von Bedeutung für
die Hypoxie-induzierte Genexpression sind. Während die auch als ARNT (aryl
hydrocarbon receptor nuclear translocator) bezeichnete beta-Untereinheit
(von der 2 Isoformen beschrieben wurden) konstitutiv exprimiert
ist, hängt
die Expression der alpha-Untereinheit vom Sauerstoffgehalt in der
Zelle ab. Unter Normoxie wird das HIF-alpha-Protein poly-ubiquitiniert
und an schließend proteasomal
degradiert. Unter Hypoxie ist diese Degradierung gehemmt, so dass
HIF-alpha mit ARNT
dimerisieren und seine Zielgene aktivieren kann. Das HIF-Dimer bindet
hierbei an sogenannte Hypoxie-responsible Elemente (HRE) in den
regulatorischen Sequenzen seiner Zielgene. Die HRE sind durch eine
Konsensus-Sequenz definiert. Funktionelle HRE wurden in den regulatorischen
Elementen zahlreicher Hypoxie-induzierter Gene nachgewiesen [Übersichten
bei: Semenza, Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis
and disease pathophysiology, Trends Mol. Med. 7 (8), 345-50 (2001); Wenger
und Gassmann, Oxygen(es) and the hypoxia-inducible factor-1, Biol.
Chem. 378 (7), 609-16 (1997)].
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Der
molekulare Mechanismus, der dieser Regulation von HIF-alpha zugrunde
liegt, wurde durch die Arbeiten mehrerer voneinander unabhängiger Forschergruppen
aufgeklärt.
Der Mechanismus ist Spezies-übergreifend
konserviert: HIF-alpha wird durch eine als PHD oder EGLN bezeichnete
Subklasse von Sauerstoff-abhängigen
Prolyl-4-Hydroxylasen an zwei spezifischen Prolyl-Resten hydroxyliert
(P402 und P564 der humanen HIF-1-alpha-Untereinheit). Bei den HIF-Prolyl-4-Hydroxylasen handelt
es sich um Eisen-abhängige, 2-Oxoglutarat-umsetzende
Dioxygenasen [Epstein et al., C. elegans EGL-9 and mammalian
homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl
hydroxylation, Cell 107 (1), 43-54 (2001); Bruick
und Mcknight, A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify
HIF, Science 294 (5545), 1337-40 (2001); Ivan et
al., Biochemical purification and pharmacological inhibition of
a mammalian prolyl hydroxylase acting an hypoxia-inducible factor,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (21), 13459-64 (2002)].
Die Enzyme wurden 2001 erstmals als Prolyl-Hydroxylasen annotiert
[Aravind und Koonin, The DNA-repair Protein AlkB, EGL-9,
and leprecan define new families of 2-oxoglutarate- and irondependent
dioxygenases, Genome Biol. 2 (3), research0007.1-0007.8, Epub 2001
Feb 19].
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An
die prolylhydroxylierte HIF-alpha-Untereinheit bindet das pVHL Tumor
Suppressor Protein, welches zusammen mit Elongin B und C den sogenannten
VBC-Komplex bildet, der die HIF-alpha-Untereinheit an
eine E3 Ubiquitin-Ligase adaptiert. Da die Prolyl-4-Hydroxylierung
der HIF-alpha-Untereinheit und ihre nachfolgende Degradierung in
Abhängigkeit
von der intrazellulären
Konzentration des Sauerstoffs erfolgt, wurden die HIF-Prolyl-4-Hydroxylasen
auch als zellulärer
Sauerstoffsensor bezeichnet. Es wurden drei Isoformen dieser Enzyme
identifiziert: EGLN1/PHD2, EGLN2/PHD1 und EGLN3/PHD3. Zwei dieser
Enzyme (EGLN2/PHD1 und EGLN3/PHD3) werden selbst unter Hypoxie transkriptionell
induziert und sind möglicherweise
für die
unter chronischer Hypoxie zu beobachtende Absenkung der HIF-alpha-Spiegel
verantwortlich [Übersicht
bei: Schofield und Ratcliffe, Oxygen sensing by HIF hydroxylases,
Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 5 (5), 343-54 (2004)].
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Eine
selektive pharmakologische Hemmung der HIF-Prolyl-4-Hydroxylasen
zieht die Steigerung der Genexpression HIF-abhängiger Zielgene nach sich und
ist damit für
die Therapie zahlreicher Krankheitsbilder von Nutzen. Insbesondere
bei Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems ist von der Induktion
neuer Blutgefäße sowie
der Änderung
der Stoffwechselsituation ischämischer
Organe von aerober hin zu anaerober ATP-Gewinnung eine Besserung
des Krankheitsverlaufs zu erwarten. Eine Verbesserung der Vaskularisierung
chronischer Wunden fördert
den Heilungsprozess, insbesondere bei schwer heilenden Ulcera cruris
und anderen chronischen Hautwunden. Die Induktion von körpereigenem
Erythropoietin bei bestimmten Krankheitsformen, insbesondere bei
Patienten mit renaler Anämie,
ist ebenfalls ein anzustrebendes therapeutisches Ziel.
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Die
bislang in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen HIF-Prolyl-4-Hydroxylase-Inhibitoren
erfüllen
nicht die an ein Arzneimittel zu stellenden Anforderungen. Es handelt
sich hierbei entweder um kompetitive Oxoglutarat-Analoga (wie z.B.
N-Oxalylglycin), die durch ihre sehr geringe Wirkstärke charakterisiert
sind und daher in in vivo-Modellen bislang keine Wirkung im Sinne
einer Induktion von HIF-Zielgenen gezeigt haben. Oder es handelt
sich um Eisen-Komplexbildner (Chelatoren) wie Desferroxamin, die
als unspezifische Hemmstoffe Eisen-haltiger Dioxygenasen wirken
und, obwohl sie eine Induktion der Zielgene wie z.B. Erythropoetin
in vivo herbeiführen,
durch Komplexierung des verfügbaren
Eisens offenbar der Erythropoese entgegenwirken.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Verbindungen,
die für
die Behandlung von Erkrankungen, insbesondere kardiovaskulärer und
hämatologischer
Erkrankungen, eingesetzt werden können.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung werden nunmehr Verbindungen beschrieben,
die als spezifische Hemmstoffe der HIF-Prolyl-4-Hydroxylasen wirken
und aufgrund dieses spezifischen Wirkmechanismus in vivo nach parenteraler
oder oraler Verabreichung die Induktion von HIF-Zielgenen, wie z.B.
Erythropoetin, und der hierdurch verursachten biologischen Prozesse,
wie z.B. Erythropoese, herbeiführen.
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In
WO 03/051315 und
WO 2004/089306 werden
Di(hetero)aryl-substituierte Triazol-Derivate als mG1uR5-Modulatoren
zur Behandlung psychiatrischer Erkrankungen offenbart.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel
(I)
in welcher
R
1 für
eine Heteroaryl-Gruppe der Formel
steht, worin
* die Verknüpfungsstelle
mit dem Dihydrotriazolon-Ring bedeutet,
A bei jedem einzelnen
Auftreten C-R
3 oder N bedeutet, wobei maximal
zwei Ringglieder A zugleich für
N stehen,
D O, S oder N-R
4 bedeutet
und
E
bei jedem einzelnen Auftreten C-R
5 oder
N bedeutet, wobei maximal zwei Ringglieder E zugleich für N stehen,
und
R
2 für
eine Heteroaryl-Gruppe der Formel
steht,
worin
# die Verknüpfungsstelle
mit dem Dihydrotriazolon-Ring bedeutet,
G bei jedem einzelnen
Auftreten C-R
6 oder N bedeutet, wobei maximal
zwei Ringglieder G zugleich für
N stehen,
J O, S oder N-R
7 bedeutet
und
L
bei jedem einzelnen Auftreten C-R
8 oder
N bedeutet, wobei maximal zwei Ringglieder L zugleich für N stehen,
worin
R
3, R
6 und R
8 gleich oder verschieden sind und in jedem
einzelnen Fall, unabhängig
voneinander, für
Wasserstoff oder einen Substituenten ausgewählt aus der Reihe Halogen,
Cyano, Nitro, (C
1-C
6)-Alkyl,
(C
3-C
7)-Cycloalkyl,
4- bis 7-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl, 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl, -C(=O)-R
9, -C(=O)-OR
10, -C(=O)-NR
11R
12, -O-C(=O)-R
13,
-O-C(=O)-NR
14R
15, -NR
16-C(=O)-R
17, -NR
18-C(=O)-OR
19, -NR
20-C(=O)-NR
21R
22, -NR
23-SO
2-R
24, -SO
2-R
25, -SO
2-NR
26R
27,
-OR
28, -SR
29 und
-NR
3R
31 stehen,
worin
- (i) (C1-C6)-Alkyl
seinerseits ein- bis dreifach, gleich oder verschieden, mit Resten
ausgewählt
aus der Reihe Halogen, Cyano, Oxo, (C3-C7)-Cycloalkyl,
4- bis 7-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl,
-C(=O)-R9, -C(=O)-OR10,
-C(=O)-NR11R12,
-O-C(=O)-R13, -O-C(=O)-NR14R15, -NR16-C(=O)-R17, -NR18-C(=O)-OR19,
-NR20-C(=O)-NR21R22, -NR23-SO2-R24, -SO2-R25, -SO2-NR26R27,
-OR28, -SR29 und -NR30R31 substituiert
sein kann,
wobei die letztgenannten Cycloalkyl-, Heterocycloalkyl-,
Phenyl- und Heteroaryl-Reste ihrerseits jeweils bis zu dreifach,
gleich oder verschieden, mit Halogen, Cyano, (C1-C4)-Alkyl, Trifluormethyl, Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy, Trifluormethoxy,
Oxo, Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino,
Di-(C1-C4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein können,
- (ii) (C3-C7)-Cycloalkyl,
4- bis 7-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl ihrerseits jeweils ein- bis dreifach, gleich oder verschieden,
mit Resten ausgewählt
aus der Reihe (C1-C6)-Alkyl, Halogen,
Cyano, Oxo, -C(=O)-R9, -C(=O)-OR10, -C(=O)-NR11R12, -O-C(=O)-R13,
-O-C(=O)-NR14R15, -NR16-C(=O)-R17, -NR18-C(=O)-OR19, -NR20-C(=O)-NR21R22, -NR23-SO2-R24,
-SO2-R25, -SO2-NR26R27, -OR28, -SR29 und -NR30R31 substituiert
sein können,
wobei
der letztgenannte Alkyl-Rest seinerseits bis zu dreifach, gleich
oder verschieden, mit Halogen, Cyano, Hydroxy, Trifluormethoxy,
(C1-C4)-Alkoxy,
Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino,
Di-(C1-C4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl, (C1-C4)-Alkoxycarbonyl,
(C3-C7)-Cycloalkyl,
4- bis 7-gliedrigem Heterocycloalkyl, Phenyl und/oder 5- oder 6-gliedrigem
Heteroaryl substituiert sein kann,
- (iii) R9, R10,
R11, R13, R14, R17, R19, R21, R24, R25, R26, R28, R29 und R30 unabhängig voneinander
bei jedem einzelnen Auftreten für
einen Rest ausgewählt
aus der Reihe Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl, (C3-C7)-Cycloalkyl, 4- bis 7-gliedriges Heterocycloalkyl,
Phenyl und 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl stehen, wobei
(C3-C7)-Cycloalkyl, 4- bis 7-gliedriges Heterocycloalkyl,
Phenyl und 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl ihrerseits jeweils bis
zu dreifach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Cyano, (C1-C4)-Alkyl, Trifluormethyl,
Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Oxo, Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino, Di-(C1-C4)-alkylamino, Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein können
und
(C1-C6)-Alkyl ein-
bis dreifach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Cyano, Hydroxy,
Trifluormethoxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino,
Di-(C1-C4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl, (C1-C4)-Alkoxycarbonyl,
(C3-C7)-Cycloalkyl,
4- bis 7-gliedrigem Heterocycloalkyl, Phenyl und/oder 5- oder 6-gliedrigem Heteroaryl
substituiert sein kann,
- (iv) R12, R15,
R16, R18, R20, R22, R23, R27 und R31 unabhängig
voneinander bei jedem einzelnen Auftreten für einen Rest ausgewählt aus
der Reihe Wasserstoff und (C1-C6)-Alkyl
stehen,
wobei (C1-C6)-Alkyl
ein- bis dreifach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Cyano,
Hydroxy, Trifluormethoxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino,
Di-(C1-C4)-allylamino,
Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein kann,
und/oder worin
- (v) R11 und R12,
R14 und R15, R16 und R17, R18 und R19, R20 und R21, R21 und R22, R23 und R24, R26 und R27 sowie R30 und R31 jeweils
paarweise zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen
5- oder 6-gliedrigen
Heterocycloalkyl-Ring bilden können,
welcher ein- bis dreifach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Cyano,
(C1-C4)-Alkyl, Trifluormethyl,
Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Oxo, Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino, Di-(C1-C4)-alkylamino, Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein kann,
R4 und
R7 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander
für Wasserstoff
oder einen Substituenten ausgewählt
aus der Reihe (C1-C6)-Alkyl,
(C3-C7)-Cycloalkyl,
4- bis 7-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl stehen, worin - (i) (C1-C6)-Alkyl seinerseits ein- bis dreifach, gleich
oder verschieden, mit Resten ausgewählt aus der Reihe Halogen,
Cyano, Oxo, (C3-C7)-Cycloalkyl, 4- bis
7-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, -C(=O)-R9, -C(=O)-OR10, -C(=O)-NR11R12, -O-C(=O)-R13, -O-C(=O)-NR14R15, -NR16-C(=O)-R17, -NR18-C(=O)-OR19,
-NR20-C(=O)-NR21R22, -NR23-SO2-R24, -SO2-R25, -SO2-NR26R27,
-OR28, -SR29 und -NR30R31 substituiert
sein kann,
wobei die letztgenannten Cycloalkyl-, Heterocycloalkyl-,
Phenyl- und Heteroaryl-Reste ihrerseits jeweils bis zu dreifach,
gleich oder verschieden, mit Halogen, Cyano, (C1-C4)-Alkyl, Trifluormethyl, Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy, Trifluormethoxy,
Oxo, Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino,
Di-(C1-C4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein können,
und
- (ii) (C3-C7)-Cycloalkyl,
4- bis 7-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl ihrerseits jeweils ein- bis dreifach, gleich oder verschieden,
mit Resten ausgewählt
aus der Reihe (C1-C6)-Alkyl, Halogen,
Cyano, Oxo, -C(=O)-R9, -C(=O)-OR10, -C(=O)-NR11R12, -O-C(=O)-R13,
-O-C(=O)-NR14R15, -NR16-C(=O)-R17, -NR18-C(=O)-OR19, -NR20-C(=O)-NR21R22, -NR23-SO2-R24,
-SO2-R25, -SO2-NR26R27, -OR28, -SR29 und -NR30R31 substituiert
sein können,
wobei
der letztgenannte Alkyl-Rest seinerseits bis zu dreifach, gleich
oder verschieden, mit Halogen, Cyano, Hydroxy, Trifluormethoxy,
(C1-C4)-Alkoxy,
Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino,
Di-(C1-C4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl, (C1-C4)-Alkoxycarbonyl,
(C3-C7)-Cyclo alkyl,
4- bis 7-gliedrigem Heterocycloalkyl, Phenyl und/oder 5- oder 6-gliedrigem
Heteroaryl substituiert sein kann,
worin
- (a) R9, R10,
R11, R13, R14, R17, R19, R21, R24, R25, R26, R28, R29 und Rio unabhängig voneinander bei jedem
einzelnen Auftreten für
einen Rest ausgewählt
aus der Reihe Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl, (C3-C7)-Cycloalkyl, 4- bis 7-gliedriges Heterocycloalkyl,
Phenyl und 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl stehen, wobei
(C3-C7)-Cycloalkyl, 4- bis 7-gliedriges Heterocycloalkyl,
Phenyl und 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl ihrerseits jeweils bis
zu dreifach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Cyano, (C1-C4)-Alkyl, Trifluormethyl,
Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Oxo, Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino, Di-(C1-C4)-alkylamino, Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein können
und
(C1-C6)-Alkyl ein-
bis dreifach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Cyano, Hydroxy,
Trifluormethoxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Amino, Mono(C1-C4)-alkylamino,
Di-(C1-C4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl, (C1-C4)-Alkoxycarbonyl,
(C3-C7)-Cycloalkyl,
4- bis 7-gliedrigem Heterocycloalkyl, Phenyl und/oder 5- oder 6-gliedrigem Heteroaryl
substituiert sein kann,
- (b) R12, R15,
R16, R18, R20, R22, R23, R27 und R31 unabhängig
voneinander bei jedem einzelnen Auftreten für einen Rest ausgewählt aus
der Reihe Wasserstoff und (C1-C6)-Alkyl
stehen,
wobei (C1-C6)-Alkyl
ein- bis dreifach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Cyano,
Hydroxy, Trifluormethoxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino,
Di-(C1-C4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein kann,
und/oder
- (c) R11 und R12,
R14 und R15, R16
und R77, R18 und
R19, R20 und R21, R21 und R22, R23 und R24, R26 und R27 sowie R30 und
R31 jeweils paarweise zusammen mit den Atomen,
an die sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyl-Ring bilden
können,
welcher ein- bis dreifach, gleich oder verschieden, mit Halogen,
Cyano, (C1-C4)-Alkyl,
Trifluormethyl, Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Oxo, Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino, Di-(C1-C4)-alkylamino, Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein kann,
und
R5 in
jedem einzelnen Fall, unabhängig
voneinander, für
Wasserstoff oder einen Substituenten ausgewählt aus der Reihe Halogen,
Cyano, Nitro, (C1-C6)-Alkyl, Trifluormethyl,
Hydroxy, (C1-C6)-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Amino, Mono-(C1-C6)-alkylamino, Di-(C1-C6)-alkylamino, Hydroxycarbonyl und (C1-C6)-Alkoxycarbonyl
steht,
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
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Erfindungsgemäße Verbindungen
sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate
der Salze, die von Formel (I) umfassten Verbindungen der nachfolgend
genannten Formeln und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze
sowie die von Formel (I) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiele
genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der
Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend
genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate
der Salze handelt.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in Abhängigkeit
von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere)
existieren. Die Erfindung umfasst deshalb die Enantiomeren oder
Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen
von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer
einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.
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Sofern
die erfindungsgemäßen Verbindungen
in tautomeren Formen vorkommen können,
umfasst die vorliegende Erfindung sämtliche tautomere Formen.
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Als
Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche
Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen
bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst
nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung
der erfindungsgemäßen Verbindungen
verwendet werden können.
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Physiologisch
unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze
von Mineralsäuren,
Carbonsäuren
und Sulfonsäuren,
z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure,
Bromwasserstoffsäure,
Schwefelsäure,
Phosphorsäure,
Methansulfonsäure,
Ethansulfonsäure,
Toluolsulfonsäure,
Benzolsulfonsäure,
Naphthalindisulfonsäure,
Essigsäure,
Trifluoressigsäure,
Propionsäure,
Milchsäure,
Weinsäure,
Apfelsäure,
Zitronensäure,
Fumarsäure,
Maleinsäure
und Benzoesäure.
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Physiologisch
unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch
Salze üblicher
Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B.
Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze)
und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen
mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin,
Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin,
Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain,
Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und
N-Methylpiperidin.
-
Als
Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet,
welche in festem oder flüssigem
Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex
bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen
die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen
der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.
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Außerdem umfasst
die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der
Begriff "Prodrugs" umfasst Verbindungen,
welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer
Verweilzeit im Körper
zu erfindungsgemäßen Verbindungen
umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit
nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:
(C1-C6)-Alkyl und (C1-C4)-A1kyl stehen
im Rahmen der Erfindung für
einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6 bzw.
1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder
verzweigter Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft
und vorzugsweise seien genannt: Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl,
n-Butyl, iso-Butyl, sec.-Butyl, tert.-Butyl, 1-Ethylpropyl, n-Pentyl
und n-Hexyl.
(C1-C6)-Alkoxy
und (C1-C4)-Alkoxy
stehen im Rahmen der Erfindung für
einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 6 bzw.
1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder
verzweigter Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft
und vorzugsweise seien genannt: Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy,
n-Butoxy, tert.-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.
Mono-(C1-C6)-alkylamino und Mono-(C1-C4)-alkylamino stehen im Rahmen der Erfindung
für eine
Amino-Gruppe mit einem geradkettigen oder verzweigten Alkylsubstituenten,
der 1 bis 6 bzw. 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist. Bevorzugt ist
ein geradkettiger oder verzweigter Monoalkylamino-Rest mit 1 bis
4 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt:
Methylamino, Ethylamino, n-Propylamino, Isopropylamino, n-Butylamino,
tert.-Butylamino, n-Pentylamino und n-Hexylamino.
Di-(C1-C6-alkylamino und
Di-(C1-C4)-alkylamino
stehen im Rahmen der Erfindung für
eine Amino-Gruppe mit zwei gleichen oder verschiedenen geradkettigen
oder verzweigten Alkylsubstituenten, die jeweils 1 bis 6 bzw. 1
bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen. Bevorzugt sind geradkettige oder
verzweigte Dialkylamino-Reste mit jeweils 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: N,N-Dimethylamino,
N,N-Diethylamino, N-Ethyl-N-methylamino, N-Methyl-N-n-propylamino, N-Isopropyl-N-n-propylamino,
N,N-Diisopropylamino, N-n-Butyl-N-methylamino, N-tert.-Butyl-N-methylamino,
N-Methyl-N-n-pentylamino und N-n-Hexyl-N-methylamino.
(C1-C6)-Alkoxycarbonyl
und (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
stehen im Rahmen der Erfindung für
einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 6 bzw.
1 bis 4 Kohlenstoffatomen, der über
eine Carbonylgruppe verknüpft
ist. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkoxycarbonyl-Rest
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkoxygruppe. Beispielhaft
und vorzugsweise seien genannt: Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl,
n-Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, n-Butoxycarbonyl und tert.-Butoxycarbonyl.
(C1-C7)-Cycloalkyl
und (C1-C6)-Cycloalkyl
stehen im Rahmen der Erfindung für
einen monocyclischen, gesättigten
Carbocyclus mit 3 bis 7 bzw. 3 bis 6 Ring-Kohlenstoffatomen. Beispielhaft
und vorzugsweise seien genannt: Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl,
Cyclohexyl und Cycloheptyl.
4- bis 7-gliedriges Heterocycloalkyl
steht im Rahmen der Erfindung für
einen monocyclischen, gesättigten
Heterocyclus mit insgesamt 4 bis 7 Ringatomen, der ein oder zwei
Ring-Heteroatome aus der Reihe N, O und/oder S enthält und über ein
Ring-Kohlenstoffatom oder gegebenenfalls ein Ring-Stickstoffatom
verknüpft ist.
Beispielhaft seien genannt: Azetidinyl, Oxetanyl, Thietanyl, Pyrrolidinyl,
Pyrazolidinyl, Tetrahydrofuranyl, Thiolanyl, 1,3-Oxazolidinyl, Piperidinyl,
Piperazinyl, Tetrahydropyranyl, Tetrahydrothiopyranyl, 1,3-Dioxanyl, 1,4-Dioxanyl,
Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Hexahydroazepinyl, Hexahydro-1,4-diazepinyl.
Bevorzugt ist ein 4- bis 6-gliedriger Heterocycloalkyl-Rest mit
insgesamt 4 bis 6 Ringatomen, der ein oder zwei Ring-Heteroatome
aus der Reihe N und/oder O enthält,
wie beispielsweise Pyrrolidinyl, Tetrahydrofuranyl, Piperidinyl,
Piperazinyl, Tetrahydropyranyl und Morpholinyl.
5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl steht im Rahmen der Erfindung für einen aromatischen Heterocyclus
(Heteroaromaten) mit insgesamt 5 bzw. 6 Ringatomen, der bis zu vier
gleiche oder verschiedene Ring-Heteroatome aus der Reihe N, O und/oder
S enthält
und über
ein Ring-Kohlenstoffatom oder gegebenenfalls über ein Ring-Stickstoffatom
verknüpft
ist. Beispielhaft seien genannt: Furyl, Pyrrolyl, Thienyl, Pyrazolyl,
Imidazolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, Triazolyl,
Oxadiazolyl, Thiadiazolyl, Tetrazolyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl,
Pyrazinyl, Triazinyl. Bevorzugt sind 5- oder 6-gliedrige Heteroaryl-Reste
mit bis zu drei Ring-Heteroatomen aus der Reihe N, O und/oder S,
wie beispielsweise Furyl, Thienyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Isothiazolyl,
Isoxazolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Triazolyl, Oxadiazolyl, Thiadiazolyl,
Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl.
Halogen schließt im Rahmen
der Erfindung Fluor, Chlor, Brom und Iod ein. Bevorzugt sind Fluor,
Chlor und Brom, besonders bevorzugt Fluor und Chlor.
-
Wenn
Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen
substituiert sind, können
die Reste, soweit nicht anders spezifiziert, ein- oder mehrfach
substituiert sein. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung gilt, dass für alle Reste,
die mehrfach auftreten, deren Bedeutung unabhängig voneinander ist. Eine
Substitution mit ein, zwei oder drei gleichen oder verschiedenen
Substituenten ist bevorzugt. Besonders bevorzugt ist die Substitution
mit einem oder zwei gleichen oder verschiedenen Substituenten.
-
Bevorzugt
im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel
(I), in welcher
R
1 für eine Heteroaryl-Gruppe
der Formel
steht, worin
* die Verknüpfungsstelle
mit dem Dihydrotriazolon-Ring bedeutet,
A bei jedem einzelnen
Auftreten C-R
3 oder N bedeutet, wobei maximal
zwei Ringglieder A zugleich für
N stehen,
R
3 in jedem einzelnen Fall,
unabhängig
voneinander, Wasserstoff oder einen Substituenten ausgewählt aus der
Reihe Fluor, Chlor, Brom, Cyano, (C
1-C
6)-Alkyl, Hydroxy, (C
1-C
6)-Alkoxy, Trifluormethoxy, Amino, Mono-(C
1-C
6)-alkylamino,
Di-(C
1-C
6)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl und (C
1-C
6)-Alkoxycarbonyl
bedeutet,
wobei der genannte (C
1-C
6)-Alkylrest seinerseits bis zu dreifach,
gleich oder verschieden, mit Fluor, Chlor, Brom, Cyano, Hydroxy,
(C
1-C
4)-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Amino, Mono-(C
1-C
4)-alkylamino, Di-(C
1-C
4)-alkylamino, Hydroxycarbonyl und/oder (C
1-C
4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein kann,
und
D O, S oder N-R
4 bedeutet,
worin
R
4 für Wasserstoff oder (C
1-C
6)-Alkyl steht,
und
R
2 für
eine Heteroaryl-Gruppe der Formel
steht, worin
# die Verknüpfungsstelle
mit dem Dihydrotriazolon-Ring bedeutet,
G jeweils C-R
6 oder N bedeutet, wobei nicht mehr als eines
der beiden Ringglieder G für
N steht, worin
R
6 in jedem einzelnen
Fall, unabhängig
voneinander, für
Wasserstoff oder einen Substituenten ausgewählt aus der Reihe Fluor, Chlor,
Brom, Cyano, (C
1-C
6)-Alkyl,
(C
3-C
6)-Cycloalkyl,
4- bis 6-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl, 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl, -C(=O)-OR
10, -C(=O)-NR
11R
12, -O-C(=O)-R
13, -O-C(=O)-NR
14R
15, -NR
16-C(=O)-R
17, -NR18-C(=O)-OR
19,
-NR
20-C(=O)-NR
21R
22, -NR
23-SO
2-R
24, -OR
28 und -NR
30R
31 steht, worin
- (i)
(C1-C6)-Alkyl seinerseits
ein- bis dreifach, gleich oder verschieden, mit Resten ausgewählt aus
der Reihe Fluor, Chlor, Brom, Cyano, (C3- C6)-Cycloalkyl,
4- bis 6-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl, 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl, -C(=O)-OR10, -C(=O)-NR11R12, -O-C(=O)-R13,
-O-C(=O)-NR14R15,
-NR16-C(=O)-R17, -NR18-C(=O)-OR19, -NR20-C(=O)-NR21R22, -NR23_SO2-R24,
-OR28 und -NR30R31 substituiert sein kann,
wobei die
letztgenannten Cycloalkyl-, Heterocycloalkyl-, Phenyl- und Heteroaryl-Reste
ihrerseits jeweils bis zu zweifach, gleich oder verschieden, mit
Fluor, Chlor, Brom, Cyano, (C1-C4)-Alkyl, Trifluormethyl, Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy, Trifluormethoxy,
Oxo, Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino,
Di-(C1-C4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein können,
- (ii) (C3-C6)-Cycloalkyl,
4- bis 6-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl ihrerseits jeweils ein- oder zweifach, gleich oder verschieden,
mit Fluor, Chlor, Brom, Cyano, (C1-C4)-Alkyl,
Trifluormethyl, Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Oxo, Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino, Di-(C1-C4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein können,
- (iii) R10, R11,
R13, R14, R17, R19, R21, R24, R28 und R30 unabhängig voneinander
bei jedem einzelnen Auftreten für
einen Rest ausgewählt
aus der Reihe Wasserstoff, (C1-C6)-Alkyl, (C3-C6)-Cycloalkyl, 4- bis 6-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl
und 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl stehen, wobei
(C3-C6)-Cycloalkyl,
4- bis 6-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl ihrerseits jeweils bis zu dreifach, gleich oder verschieden,
mit Fluor, Chlor, Brom, Cyano, (C1-C4)-Alkyl,
Trifluormethyl, Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Oxo, Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino, Di-(C1-C4)-alkylamino, Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein können
und
(C1-C6)-Alkyl ein-
bis dreifach, gleich oder verschieden, mit Fluor, Chlor, Brom, Cyano,
Hydroxy, Trifluormethoxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino,
Di-(C1-C4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl, (C1-C4)-Alkoxycarbonyl,
(C3-C6)-Cycloalkyl,
4- bis 6-gliedrigem Heterocycloalkyl, Phenyl und/oder 5- oder 6-gliedrigem
Heteroaryl substituiert sein kann,
- (iv) R12, R15,
R16, R18, R20, R22, R23 und R31 unabhängig voneinander
bei jedem einzelnen Auftreten für
einen Rest ausgewählt
aus der Reihe Wasserstoff und (C1-C6)-Alkyl stehen,
wobei (C1-C6)-Alkyl ein- oder zweifach, gleich oder
verschieden, mit Fluor, Chlor, Brom, Cyano, Hydroxy, Trifluormethoxy,
(C1-C4)-Alkoxy, Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino,
Di-(C1-C4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein kann,
und/oder worin
- (v) R11 und R12,
R14 und R15, R16 und R17, R18 und R19, R20 und R21, R21 und R22, R23 und R24 sowie
R30 und R31 jeweils
paarweise zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen
5- oder 6-gliedrigen Heterocycloalkyl-Ring bilden können, welcher
ein- oder zweifach, gleich oder verschieden, mit Fluor, Chlor, Brom,
Cyano, (C1-C4)-Alkyl, Trifluormethyl,
Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Oxo, Amino, Mono-(C1-C4)-alkylamino, Di-(C1-C4)-alkylamino, Hydroxycarbonyl und/oder (C1-C4)-Alkoxycarbonyl
substituiert sein kann,
und
J O oder S bedeutet,
sowie
ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
-
Besonders
bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen
der Formel (I), in welcher
R
1 für eine Heteroaryl-Gruppe
der Formel
steht, worin
* die Verknüpfungsstelle
mit dem Dihydrotriazolon-Ring
und
R
3 Wasserstoff,
Fluor, Cyano, Methyl, Ethyl, Trifluormethyl, Hydroxymethyl, Methoxy,
Trifluormethoxy, Hydroxycarbonyl, Methoxycarbonyl oder Ethoxycarbonyl
bedeutet,
und
R
2 für eine Heteroaryl-Gruppe
der Formel
steht,
worin
# die Verknüpfungsstelle
mit dem Dihydrotriazolon-Ring bedeutet
und
R
6,
R
6A und R
6B gleich
oder verschieden sind und unabhängig
voneinander Wasserstoff oder einen Substituenten ausgewählt aus
der Reihe Fluor, Cyano, (C
1-C
4)-Alkyl,
Trifluormethyl, Hydroxy, (C
1-C
4)-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Amino, Mono-(C
1-C
4)-alkylamino,
Di-(C
1-C
4)-alkylamino,
Hydroxycarbonyl, (C
1-C
4)-Alkoxycarbonyl,
4- bis 6-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl bedeuten, wobei
(C
1-C
4)-Alkyl seinerseits mit Hydroxy, (C
1-C
4)-Alkoxy oder
Amino
und
4- bis 6-gliedriges Heterocycloalkyl, Phenyl
und 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl ihrerseits jeweils ein- oder zweifach,
gleich oder verschieden, mit Fluor, Chlor, Brom, Cyano, (C
1-C
4)-Alkyl, Trifluormethyl,
Hydroxy, (C
1-C
4)-Alkoxy,
Trifluormethoxy, Oxo, Amino, Mono-(C
1-C
4)-alkylamino, Di-(C
1-C
4)-alkylamino, Hydroxycarbonyl und/oder (C
1-C
4)-Alkoxycarbonyl
substituiert
sein können,
sowie
ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
-
Die
in den jeweiligen Kombinationen bzw. bevorzugten Kombinationen von
Resten im einzelnen angegebenen Reste-Definitionen werden unabhängig von
den jeweiligen angegebenen Kombinationen der Reste beliebig auch
durch Reste-Definitionen anderer Kombinationen ersetzt.
-
Ganz
besonders bevorzugt sind Kombinationen von zwei oder mehreren der
oben genannten Vorzugsbereiche.
-
Die
erfindungsgemäßen 2,3-Dihydro-4H-1,2,3-triazol-4-on-Derivate
der Formel (I) können
auch in der tautomeren 1H-1,2,3-Triazol-5-ol-Form (P) vorliegen
(siehe nachfolgendes Schema 1); beide tautomeren Formen werden von
der vorliegenden Erfindung ausdrücklich
umfasst. Schema
1
-
Weiterer
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung
der Formel (II)
in welcher R
1 die
oben angegebene Bedeutung aufweist und
Z für Methyl oder Ethyl steht,
in
einem inerten Lösungsmittel
in Gegenwart einer Base mit einem Azid der Formel (III)
in welcher R
2 die
oben angegebene Bedeutung aufweist,
umsetzt
und die resultierenden
Verbindungen der Formel (I) gegebenenfalls mit den entsprechenden
(i) Lösungsmitteln und/oder
(ii) Basen oder Säuren
in ihre Solvate, Salze und/oder Solvate der Salze überführt.
-
Weitere
erfindungsgemäße Verbindungen
können
gegebenenfalls auch hergestellt werden durch Umwandlungen von funktionellen
Gruppen einzelner Substituenten, insbesondere den unter R1 und R2 aufgeführten, ausgehend
von den nach obigem Verfahren erhaltenen Verbindungen der Formel
(I). Diese Umwandlungen werden nach üblichen, dem Fachmann bekannten
Methoden durchgeführt
und umfassen beispielsweise Reaktionen wie nukleophile oder elektrophile
Substitution, Oxidation, Reduktion, Hydrierung, Übergangsmetall-katalysierte
Kupplungsreaktionen, Alkylierung, Acylierung, Aminierung, Veresterung,
Esterspaltung, Veretherung, Etherspaltung, Bildung von Carbonamiden,
Sulfonamiden, Carbamaten und Harnstoffen, sowie die Einführung und
Entfernung temporärer
Schutzgruppen.
-
Die
Umsetzung (II) + (III) → (I)
erfolgt im Allgemeinen in Analogie zu in der Literatur beschriebenen
Verfahren [vgl. z.B. G. Primofiore et al., J. Med. Chem.
48, 2936 (2005)]. Als inerte Lösungsmittel eignen sich insbesondere
Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol;
bevorzugt wird Ethanol verwendet. Die Reaktion wird im Allgemeinen
in einem Temperaturbereich von -20°C bis +120°C, bevorzugt bei 0°C bis +100°C durchgeführt. Der
Verfahrensschritt kann bei normalem, erhöhtem oder bei erniedrigtem
Druck erfolgen (z.B. von 0.5 bis 5 bar); im Allgemeinen arbeitet
man bei Normaldruck.
-
Als
Base für
die Umsetzung (II) + (III) → (I)
eignen sich übliche
anorganische oder organische Basen. Hierzu gehören insbesondere Aminbasen
wie Triethylamin oder Diisopropylamin, Alkali-Alkoholate wie Natrium- oder Kaliummethanolat,
Natrium- oder Kaliumethanolat oder Natrium- oder Kalium-tert.-butylat, oder Alkalihydride
wie Natriumhydrid; bevorzugt wird Natriumethanolat eingesetzt.
-
Die
Verbindungen der Formel (II) sind kommerziell erhältlich,
literaturbekannt oder können
in Analogie zu literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl.
z.B. R. Troschuetz et al., J. Heterocycl. Chem. 33, 1815
(1996)]. Die Verbindungen der Formel (III) können in
Analogie zu in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt
werden [vgl. z.B. R.A. Evans et al., J. Am. Chem. Soc. 118,
4009 (1996); A.S. Kiselyov et al., J. Heterocycl.
Chem. 30, 1361 (1993); D.M. Andrews et al., J.
Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1045 (1995)].
-
Die
Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen
kann durch das folgende Reaktionsschema 2 veranschaulicht werden: Schema
2
- [a): NaOEt, Ethanol, 0°C bis +100°C (Et = Ethyl)].
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches Wirkspektrum.
Sie eignen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung
und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
zeichnen sich als spezifische Hemmstoffe der HIF-Prolyl-4-Hydroxylasen aus.
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften zur Behandlung und/oder
Prophylaxe von kardiovaskulären
Krankheiten, insbesondere von Herzinsuffizienz, koronarer Herzkrankheit,
Angina pectoris, Myokardinfarkt, Schlaganfall, Arteriosklerose,
essentieller, pulmonaler und maligner Hypertonie sowie peripherer
arterieller Verschlusskrankheit eingesetzt werden. Die Verbindungen
eignen sich ferner zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Störungen der
Blutbildung, wie z.B. idiopathischen Anämien, renaler Anämie, Anämien in
Begleitung einer Tumor-Erkrankung, einer Infektion oder einer anderen
entzündlichen
Erkrankung wie z.B. rheumatoider Arthritis.
-
Die
Verbindungen sind ferner geeignet zur Steigerung des Hämatokrits
mit dem Ziel der Gewinnung von Blut zur Eigenblutspende vor Operationen.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
außerdem
zur Behandlung und/oder Prophylaxe von operationsbedingten Ischämiezuständen und
deren Folgeerscheinungen nach chirurgischen Eingriffen, insbesondere
Eingriffen am Herzen unter Verwendung einer Herz-Lungenmaschine
(z.B. Bypass-Operationen, Herzklappen-Implantationen), Eingriffen
an den Halsschlagadern, Eingriffen an der Körperschlagader (Aorta) und
Eingriffen mit instrumenteller Öffnung
oder Durch dringung der Schädelkalotte
verwendet werden. Die Verbindungen eignen sich ferner zur allgemeinen
Behandlung und/oder Prophylaxe bei chirurgischen Eingriffen mit
dem Ziel einer Beschleunigung der Wundheilung und Verkürzung der
Rekonvaleszenzzeit.
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Die
Verbindungen können
ferner zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krebs und zur Behandlung und/oder
Prophylaxe einer im Zuge der Behandlung von Krebs auftretenden Beeinträchtigung
des Gesundheitszustandes insbesondere nach Therapie mit Zytostatika,
Antibiotika und Bestrahlungen eingesetzt werden.
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Die
Verbindungen eignen sich ferner zur Behandlung und/oder Prophylaxe
von Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises und anderen den
Autoimmunerkrankungen zuzurechnenden Krankheitsformen und insbesondere
zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer im Zuge der medikamentösen Behandlung
derartiger Erkrankungen auftretenden Beeinträchtigung des Gesundheitszustandes.
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Weiterhin
können
die erfindungsgemäßen Verbindungen
eingesetzt werden zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen
des Auges (z.B. Glaukom), des Gehirns (z.B. Morbus Parkinson, Morbus
Alzheimer, Demenz, chronisches Schmerzempfinden), von chronischen
Nierenerkrankungen, Niereninsuffizienz und akutem Nierenversagen
sowie zur Förderung
der Wundheilung.
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Weiterhin
eignen sich die Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe
einer insbesondere im höheren
Lebensalter gehäuft
auftretenden allgemeinen körperlichen
Schwäche
bis hin zur Kachexie.
-
Ferner
eignen sich die Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe
sexueller Dysfunktion.
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Außerdem sind
die Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Diabetes
mellitus und seinen Folgeerkrankungen, wie z.B. diabetischer Makro-
und Mikroangiopathie, diabetischer Nephropathie und Neuropathie,
geeignet.
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Weiterhin
eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen
zur Behandlung und/oder Prophylaxe von fibrotischen Erkrankungen
z.B. des Herzens, der Lunge und der Leber.
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Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen
zur Behandlung und/oder Prävention
von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
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Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention
von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
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Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung
und/oder Prävention
von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen,
unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der
erfindungsgemäßen Verbindungen.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
allein oder bei Bedarf in Kombination mit anderen Wirkstoffen eingesetzt
werden. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel,
enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen
oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder
Prävention
der zuvor genannten Erkrankungen. Als geeignete Kombinationswirkstoffe
seien beispielhaft und vorzugsweise genannt: ACE-Inhibitoren, Angiotensin
II-Rezeptor-Antagonisten, Beta-Rezeptor-Blocker, Calcium-Antagonisten,
PDE-Inhibitoren, Mineralocorticoid-Rezeptor-Antagonisten, Diuretika,
Aspirin, Eisen-Supplements,
Vitamin B12- und Folsäure-Supplements,
Statine, Digitalis (Digoxin)-Derivate, Tumor-Chemotherapeutika sowie
Antibiotika.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination
mit einem ACE-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Enalapril,
Captopril, Lisinopril, Ramipril, Delapril, Fosinopril, Quinopril,
Perindopril oder Trandopril, verabreicht.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination
mit einem Angiotensin AII-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise
Losartan, Candesartan, Valsartan, Telmisartan oder Embusartan, verabreicht.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination
mit einem beta-Rezeptoren-Blocker, wie beispielhaft und vorzugsweise
Propranolol, Atenolol, Timolol, Pindolol, Alprenolol, Oxprenolol,
Penbutolol, Bupranolol, Metipranolol, Nadolol, Mepindolol, Carazalol, Sotalol,
Metoprolol, Betaxolol, Celiprolol, Bisoprolol, Carteolol, Esmolol,
Labetalol, Carvedilol, Adaprolol, Landiolol, Nebivolol, Epanolol
oder Bucindolol, verabreicht.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination
mit einem Calcium-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise
Nifedipin, Amlodipin, Verapamil oder Diltiazem, verabreicht.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination
mit einem Phosphodiesterase (PDE)-Inhibitor, wie beispielhaft und
vorzugsweise Milrinone, Amrinone, Pimobendan, Cilostazol, Sildenafil,
Vardenafil oder Tadalafil, verabreicht.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination
mit einem Mineralocorticoid-Rezeptor-Antagonisten, wie beispielhaft
und vorzugsweise Spironolacton, Eplerenon, Canrenon oder Kalium-Canrenoat,
verabreicht.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination
mit einem Diuretikum, wie beispielhaft und vorzugsweise Furosemid,
Bumetanid, Torsemid, Bendroflumethiazid, Chlorthiazid, Hydrochlorthiazid,
Hydroflumethiazid, Methyclothiazid, Polythiazid, Trichlormethiazid,
Chlorthalidon, Indapamid, Metolazon, Quinethazon, Acetazolamid,
Dichlorphenamid, Methazolamid, Glycerin, Isosorbid, Mannitol, Amilorid
oder Triamteren, verabreicht.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination
mit einem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor aus der Klasse der Statine,
wie beispielhaft und vorzugsweise Lovastatin, Simvastatin, Pravastatin,
Fluvastatin, Atorvastatin, Rosuvastatin, Cerivastatin oder Pitavastatin,
verabreicht.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination
mit einem Tumor-Chemotherapeutikum verabreicht, beispielhaft und
vorzugsweise aus der Gruppe der Platin-Komplexe, wie z.B. Cisplatin
und Carboplatin, der Alkylantien, wie z.B. Cyclophosphamid und Chlorambucil,
der Antimetabolite, wie z.B. 5-Fluoruracil und Methotrexat, der
Topoisomerase-Hemmer, wie z.B. Etoposid und Camptothecin, der Antibiotika,
wie z.B. Doxorubicin und Daunorubicin, oder der Kinase-Inhibitoren,
wie z.B. Sorafenib und Sunitinib.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination
mit einem Antibiotikum verabreicht, beispielhaft und vorzugsweise
aus der Gruppe der Penicilline, Cephalosporine oder Chinolone, wie
z.B. Ciprofloxacin und Moxifloxacin.
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Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens
eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise
zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch
geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den
zuvor genannten Zwecken.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie
auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral,
pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal,
conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.
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Für diese
Applikationswege können
die erfindungsgemäßen Verbindungen
in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
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Für die orale
Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende,
die erfindungsgemäßen Verbindungen
schnell und/oder modifiziert abgebende Applikationsformen, die die
erfindungsgemäßen Verbindungen
in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form
enthalten, wie z.B. Tabletten (nicht-überzogene oder überzogene
Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder
unlöslichen Überzügen, die
die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren),
in der Mundhöhle
schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate,
Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees,
Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder
Lösungen.
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Die
parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes
geschehen (z.B. intravenös,
intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder
unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan,
intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation
eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen
in Form von Lösungen,
Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
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Für die sonstigen
Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a.
Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen oder -sprays, lingual,
sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten
oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln,
wäßrige Suspensionen
(Lotionen, Schüttelmixturen),
lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische
Systeme (z.B. Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate
oder Stents.
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Bevorzugt
sind die orale oder parenterale Applikation, insbesondere die orale
Applikation.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in die angeführten
Applikationsformen überfuhrt
werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten,
nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen.
Zu diesen Hilfsstoffen zählen
u.a. Trägerstoffe
(beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Lactose, Mannitol),
Lösungsmittel
(z.B. flüssige
Poly ethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel
(beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel
(beispielsweise Polyvinylpyrolidon), synthetische und natürliche Polymere
(beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie
beispielsweise Ascorbinsäure),
Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide)
und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.
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Im
Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler
Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 1 mg/kg, vorzugsweise etwa
0.01 bis 0.5 mg/kg Körpergewicht
zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation
beträgt
die Dosierung etwa 0.01 bis 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis
20 mg/kg und ganz besonders bevorzugt 0.1 bis 10 mg/kg Körpergewicht.
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Trotzdem
kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen
abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit
von Körpergewicht,
Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der
Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation
erfolgt. So kann es in einigen Fällen
ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge
auszukommen, während
in anderen Fällen
die genannte obere Grenze überschritten
werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert
sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
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Die
nachfolgenden Ausführungsbeispiele
erläutern
die Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf die Beispiele beschränkt.
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Die
Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern
nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile.
Lösungsmittelverhältnisse,
Verdünnungsverhältnisse
und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen
sich jeweils auf das Volumen.
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A. Ausführungsbeispiele
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Nach
den zuvor beschriebenen Verfahren können die folgenden erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellt
werden: Beispiel
1 3-Pyridin-2-yl-5-pyridin-3-yl-2,3-dihydro-4H-1,2,3-triazol-4-on
Beispiel
2 3-[5-(4-Chlorphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-5-pyridin-3-yl-2,3-dihydro-4H-1,2,3-triazol-4-on
Beispiel
3 3-(4-Methoxypyridin-2-yl)-5-pyridin-3-yl-2,3-dihydro-4H-1,2,3-triazol-4-on
Beispiel
4 3-Pyridin-2-yl-5-[5-(trifluormethyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-2,
3-dihydro-4H--1,2,3-triazol-4-on
Beispiel
5 3-[5-(Hydroxymethyl)pyridin-2-yl]-5-pyridin-3-yl-2,3-dihydro-4H-1,2,3-triazol-4-on
Beispiel
6 3-[4-(Aminomethyl)pyridin-2-yl]-5-pyridin-3-yl-2,3-dihydro-4H-1,2,3-triazol-4-on
Beispiel
7 5-(5-Oxo-1-pyridin-2-yl-2,5-dihydro-1H-1,2,3-triazol-4-yl)pyridin-2-carbonitril
Beispiel
8 3-(6-Piperidin-1-ylpyrimidin-4-yl)-5-pyridin-3-yl-2,3-dihydro-4H-1,2,3-triazol-4-on
Beispiel
9 3-(4-Methylpyridin-2-yl)-5-pyridin-3-yl-2,3-dihydro-4H-1,2,3-triazol-4-on
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B. Bewertung der pharmakologischen Wirksamkeit
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Die
pharmakologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in folgenden Assays gezeigt werden:
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Abkürzungen:
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- DMEM
- Dulbecco's Modified Eagle
Medium
- FCS
- Fetal Calf Serum
- TMB
- 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
- Tris
- Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
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1. In vitro-Tests zur Bestimmung der Aktivität und Selektivität von HIF-Prolyl-4-Hvdroxylase-Inhibitoren
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1.a) Hemmung der Aktivität von HIF-Prolylhydroxylase:
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Hydroxylierter
HIF bindet spezifisch an den von Hippel-Lindau Protein-Elongin B-Elongin
C-Komplex (VBC-Komplex).
Diese Interaktion tritt nur auf, wenn HIF an einem konservierten
Prolylrest hydroxyliert ist. Sie ist die Grundlage für die biochemische
Bestimmung der HIF-Prolylhydroxylase-Aktivität. Der Test
wird wie beschrieben durchgeführt
[Oehme F., Jonghaus W., Narouz-Ott L., Huetter J., Flamme
I., Anal. Biochem. 330 (1), 74-80 (2004)]:
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Eine
klare, mit NeutrAvidin HBC beschichtete 96-Loch-Mikrotiterplatte
(Fa. Pierce) wird für
30 Minuten mit Blocker-Casein inkubiert. Anschließend wird
die Platte dreimal mit je 200 μl
Waschpuffer (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% (v/v) Blocker-Casein,
0.05% (v/v) Tween 20) pro Loch gewaschen. Das Peptid Biotin-DLDLEMLAPYIPMDDDFQL
(Fa. Eurogentec, 4102 Seraing, Belgien) wird in einer Konzentration
von 400 nM in 100 μl
Waschpuffer zugegeben. Dieses Peptid dient als Substrat für die Prolylhydroxylierung
und wird an die Mikrotiterplatte gebunden. Nach 60 Minuten Inkubation
wird die Platte dreimal mit Waschpuffer gewaschen, 30 Minuten mit
1 mM Biotin in Blocker-Casein inkubiert und dann erneut dreimal
mit Waschpuffer gewaschen.
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Zur
Durchführung
der Prolylhydroxylase-Reaktion wird das an die Platte gebundene
Peptidsubstrat 1 bis 60 Minuten mit einem Prolylhydroxylase-haltigen
Zelllysat inkubiert. Die Reaktion findet in 100 μl Reaktionspuffer (20 mM Tris,
pH 7.5, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 μM-1 mM 2-Oxoglutarat,
10 μM FeSO4, 2 mM Ascorbat) bei Raumtemperatur statt.
Die Reaktionsmischung enthält
außerdem
den zu testenden Hemmstoff der Prolylhydroxylase in verschiedenen
Konzentrationen.
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Die
Testsubstanz wird bevorzugt, aber nicht ausschließlich bei
Konzentrationen zwischen 1 nM und 100 μM eingesetzt. Durch dreimaliges
Waschen der Platte mit Waschpuffer wird die Reaktion gestoppt.
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Zur
quantitativen Bestimmung der Prolylhydroxylierung wird ein Fusionsprotein,
das sowohl Thioredoxin aus E. coli als auch den VBC-Komplex enthält, in 80 μl Bindungspuffer
(50 mM Tris, pH 7.5, 120 mM NaCl) zugegeben. Nach 15 Minuten werden
10 μl einer
Lösung
von polyklonalem Anti-Thioredoxin-Antikörper aus Kaninchen in Bindungspuffer
zugefügt.
Nach weiteren 30 Minuten setzt man 10 μl einer Lösung von mit Meerrettich-Peroxidase
gekoppeltem Anti-Kaninchen-Immunglobulin
in Bindungspuffer hinzu. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur
wird dreimal mit Waschpuffer gewaschen, um ungebundenen VBC-Komplex und
Antikörper
zu entfernen. Um die Menge an gebundenem VBC-Komplex zu bestimmen,
wird 15 Minuten mit TMB inkubiert. Die Farbreaktion wird durch Zugabe
von 100 μl
1 M Schwefelsäure
beendet. Durch Messung der optischen Dichte bei 450 nm wird die
Menge an gebundenem VBC-Komplex
bestimmt. Sie ist proportional zur Menge an hydroxyliertem Prolin
im Peptidsubstrat.
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Zur
Detektion der Prolylhydroxylierung kann alternativ ein mit Europium
(Fa. Perkin Elmer) gekoppelter VBC-Komplex verwendet werden. In
diesem Fall wird die Menge an gebundenem VBC-Komplex durch zeitaufgelöste Fluoreszenz
bestimmt. Außerdem
ist die Verwendung von mit [35S]-Methionin
markiertem VBC-Komplex möglich.
Hierfür
kann der radioaktiv markierte VBC-Komplex durch in vitro-Transkription-Translation
in Retikulozytenlysat hergestellt werden.
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1.b) Zellulärer, funktioneller in vitro-Test:
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Die
Quantifizierung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen
erfolgt mit Hilfe einer rekombinanten Zelllinie. Die Zelle leitet
sich ursprünglich
von einer humanen Lungencarcinom-Zelllinie
ab (A549, ATCC: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108,
USA). Die Testzelllinie wird stabil mit einem Vektor transfiziert,
der das Reportergen der Photinus pyralis-Luciferase (im folgenden Luciferase
genannt) unter der Kontrolle eines artifiziellen Minimalpromotors
enthält.
Der Minimalpromotor besteht aus zwei Hypoxie-responsiblen Elementen
stromaufwärts
einer TATA-Box [Oehme F., Ellinghaus P., Kolkhof P., Smith
T.J., Ramakrishnan S., Hütter
J., Schramm M., Flamme I., Biochem. Biophys. Res. Commun. 296 (2),
343-9 (2002)]. Unter Einwirkung von Hypoxie (z.B. Kultivierung
in Gegenwart von 1% Sauerstoff für
24 Stunden) oder unter Einwirkung unselektiver Dioxygenase-Inhibitoren
(z.B. Desferroxamin in einer Konzentration von 100 μM, Cobaltchlorid
in einer Konzentration von 100 μM
oder N-Oxalylglycindiethylester in einer Konzentration von 1 mM)
produziert die Testzelllinie Luciferase, die mit Hilfe geeigneter
Biolumineszenz-Reagenzien (z.B. Steady-Glo® Luciferase
Assay System, Promega Cor poration, Madison, WI 53711, USA) und eines
geeigneten Luminometers detektiert und quantifiziert werden kann.
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Testablauf:
Die Zellen werden am Tag vor dem Test in einer exakt bemessenen
Menge Kulturmedium (DMEM, 10% FCS, 2 mM Glutamin) in 384- oder 1536-Loch-Mikrotiterplatten
ausplattiert und in einem Zellinkubator (96% Luftfeuchtigkeit, 5%
v/v CO2, 37°C) gehalten. Am Testtag werden
dem Kulturmedium die Testsubstanzen in abgestuften Konzentrationen
zugesetzt. In als Negativkontrolle dienenden Ansätzen wird den Zellen keine
Testsubstanz zugesetzt. Als Positivkontrolle zur Bestimmung der
Empfindlichkeit der Zelle für
Inhibitoren wird z.B. Desferroxamin in einer Endkonzentration von
100 μM zugesetzt.
Sechs bis 24 Stunden nach Übertragung
der Testsubstanzen in die Löcher
der Mikrotiterplatten wird das resultierende Lichtsignal im Luminometer
gemessen. Anhand der Meßwerte
wird eine Dosiswirkungsbeziehung aufgestellt, die als Grundlage für die Ermittlung
der halbmaximalen Wirkkonzentration (im folgenden als EC50-Wert bezeichnet) dient.
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1.c) Zellulärer, funktioneller in vitro-Test
zur Veränderung
der Genexpression:
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Um
die Veränderung
der Expression spezifischer mRNAs in menschlichen Zelllinien nach
Behandlung mit Testsubstanzen zu untersuchen, werden folgende Zelllinien
auf 6- oder 24-Lochplatten kultiviert: humane Hepatomzellen (HUH,
JCRB Cell Bank, Japan), humane embryonale Nierenfibroblasten (HEK/293,
ATCC, Manassas, VA 20108, USA), humane Cervixcarcinomzellen (HeLa,
ATCC, Manassas, VA 20108, USA), humane Nabelschnurvenenendothelzellen
(HUVEC, Cambrex, East Rutherford, New Jersey 07073, USA). 24 Stunden nach
Zugabe der Testsubstanzen werden die Zellen mit Phosphat-gepufferter
Saline gewaschen und aus ihnen die Gesamt-RNA unter Verwendung einer
geeigneten Methode gewonnen (z.B. Trizo1®-Reagenz,
Invitrogen GmbH, 76131 Karlsruhe, Deutschland).
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Für ein typisches
Analyseexperiment wird je 1 μg
der so gewonnenen Gesamt-RNA mit DNase I verdaut und unter Verwendung
einer geeigneten Reversen-Transkriptase-Reaktion (ImProm-II Reverse
Transcription System, Promega Corporation, Madison, WI 53711, USA)
in eine komplementäre
DNA (cDNA) übersetzt.
2.5% des so gewonnenen cDNA-Ansatzes werden jeweils für die Polymerase-Kettenreaktion
verwendet. Das Expressionsniveau der mRNA der zu untersuchenden
Gene wird mittels der real time quantitative polymerase chain reaction
[TaqMan-PCR; Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams
P.M., Genome Res. 6 (10), 986-94 (1996)] unter Verwendung
eines ABI Prism 7700 Sequenz-Detektionsinstruments (Fa. Applied
Biosystems, Inc.) untersucht. Die hierbei benutzten Primer-Sonden-Kombinationen
werden mittels der Primer Express 1.5 Software (Fa. Applied Biosystems,
Inc.) generiert. Im einzelnen werden die mRNAs von Erythropoetin,
Carboanhydrase IX, Lactatdehydrogenase A und vaskulärem Endothelzellwachstumsfaktor
untersucht.
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Substanzen
gemäß der vorliegenden
Erfindung führen
zu einem signifikanten, dosisabhängigen
Anstieg der mRNA Hypoxie-induzierter Gene in Zellen menschlichen
Ursprungs.
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2. In vivo-Tests zum Nachweis
der Wirkung im Kardiovaskularsvstem
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2.a) In vivo-Test zur Veränderung
der Genexpression:
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Mäusen oder
Ratten werden die in geeigneten Lösungsmitteln gelösten Prüfverbindungen
entweder oral durch Schlundsonden-Applikation, intraperitoneal oder
intravenös
verabfolgt. Typische Dosierungen sind 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 50,
100 und 300 mg Substanz pro kg Körpergewicht
und Verabfolgung. Kontrolltiere erhalten nur Lösungsmittel. 4, 8 oder 24 Stunden
nach Gabe der Prüfsubstanz
werden die Tiere mit einer Überdosis
Isofluran und anschließendem
Genickbruch getötet
und die zu untersuchenden Organe entnommen. Teile der Organe werden
in flüssigem
Stickstoff schockgefroren. Aus den Organteilen wird wie unter B.1.a)
beschrieben Gesamt-RNA gewonnen und diese in eine cDNA übersetzt.
Das Expressionsniveau der mRNA der zu untersuchenden Gene wird mittels
der real time quantitative polymerase chain reaction [TaqMan-PCR;
Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M., Genome Res. 6
(10), 986-94 (1996)] unter Verwendung eines ABI Prism 7700
Sequenz-Detektionsinstruments (Fa. Applied Biosystems, Inc.) untersucht.
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Substanzen
gemäß der vorliegenden
Erfindung führen
im Vergleich mit der Placebo-Kontrolle nach oraler oder parenteraler
Verabreichung zu einem signifikanten, dosisabhängigen Anstieg der mRNA des
Erythropoetins in der Niere.
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2.b) Bestimmung des Erythropoetin-Spiegels
im Serum:
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Mäusen oder
Ratten wird die Prüfsubstanz
in einem geeigneten Lösungsmittel
entweder intraperitoneal oder oral einmal oder zweimal täglich verabreicht.
Typische Dosierungen sind 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 und 300
mg Substanz pro kg Körpergewicht
und Verabfolgung. Placebo-Kontrolltiere
erhalten nur Lösungsmittel.
Vor der Applikation und vier Stunden nach der letzten Substanzgabe
wird den Tieren in Kurznarkose aus dem retroorbitalen Venenplexus
oder der Schwanzvene 50 μl
Blut entnommen. Das Blut wird durch Zusatz von Lithium-Heparin ungerinnbar
gemacht. Durch Zentrifugieren wird das Blutplasma gewonnen. In dem
Blutplasma wird mit Hilfe eines Erythropoetin-ELISA (Quantikine® mouse
Epo Immunoassay, R&D
Systems, Inc., Minneapolis, USA) entsprechend der Anleitung des
Herstellers der Gehalt an Erythropoetin bestimmt. Die Meßwerte werden
anhand einer für
Maus-Erythropoetin erhobenen Referenzmessung in pg/ml umgerechnet.
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Substanzen
gemäß der vorliegenden
Erfindung führen
nach oraler und parenteraler Verabreichung zu einem signifikanten,
dosisabhängigen
Anstieg des Plasma-Erythropoetins gegenüber dem Ausgangswert und der
Placebo-Kontrolle.
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2.c) Bestimmung der zellulären Zusammensetzung
des peripheren Blutes:
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Mäusen oder
Ratten wird die Prüfsubstanz
in einem geeigneten Lösungsmittel
entweder intraperitoneal oder oral einmal oder zweimal täglich über mehrere
Tage verabreicht. Typische Dosierungen sind z.B. 0.1, 0.5, 1, 5,
10, 20, 50, 100 und 300 mg Substanz pro kg Körpergewicht und Verabfolgung.
Kontrolltiere erhalten nur Lösungsmittel.
Am Versuchsende wird den Tieren in Kurznarkose aus dem Venenplexus
des Augenwinkels oder der Schwanzvene Blut entnommen und durch Zusatz
von Natriumcitrat ungerinnbar gemacht. In einem geeigneten elektronischen
Messgerät
werden in den Blutproben die Konzentrationen von Erythrozyten, Leukozyten
und Thrombozyten bestimmt. Die Konzentration der Retikulozyten wird
anhand von Blutausstrichen, die mit einer dafür geeigneten Farblösung (Fa.
KABE Labortechnik, Nümbrecht)
gefärbt
werden, durch mikroskopische Durchmusterung von je 1000 Erythrozyten
bestimmt. Für
die Bestimmung des Hämatokrits
wird Blut aus dem retroorbitalen Venenplexus mittels einer Hämatokritkapillare
entnommen und der Hämatokritwert nach
Zentrifugieren der Kapillare in einer dafür geeigneten Zentrifuge manuell
abgelesen.
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Substanzen
gemäß der vorliegenden
Erfindung führen
nach oraler und parenteraler Verabreichung zu einem signifikanten,
dosisabhängigen
Anstieg des Hämatokrits,
der Erythrozytenzahl und der Retikulozyten gegenüber dem Ausgangswert und der
Placebo-Kontrolle.
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C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische
Zusammensetzungen
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
folgendermaßen
in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:
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Tablette:
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Zusammensetzung:
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- 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung,
50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrrolidon
(PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
Tablettengewicht
212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius
12 mm.
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Herstellung:
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Die
Mischung aus erfindungsgemäßer Verbindung,
Lactose und Stärke
wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m)
des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen
mit dem Magnesiumstearat 5 Minuten gemischt. Diese Mischung wird
mit einer üblichen
Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als
Richtwert für
die Verpressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.
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Oral applizierbare Suspension:
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Zusammensetzung:
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- 1000 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 1000 mg Ethanol
(96%), 400 mg Rhodigel® (Xanthan gum der Fa.
FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser.
Einer Einzeldosis
von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung
entsprechen 10 ml orale Suspension.
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Herstellung:
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Das
Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die erfindungsgemäße Verbindung
wird der Suspension zugefügt.
Unter Rühren
erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluß der Quellung des Rhodigels
wird ca. 6 h gerührt.
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Oral applizierbare Lösung:
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Zusammensetzung:
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- 500 mg der erfindungsgemäßen Verbindung,
2.5 g Polysorbat und 97 g Polyethylenglycol 400. Einer Einzeldosis
von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung
entsprechen 20 g orale Lösung.
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Herstellung:
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Die
erfindungsgemäße Verbindung
wird in der Mischung aus Polyethylenglycol und Polysorbat unter Rühren suspendiert.
Der Rührvorgang
wird bis zur vollständigen
Auflösung
der erfindungsgemäßen Verbindung
fortgesetzt.
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i.v.-Lösung:
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Die
erfindungsgemäße Verbindung
wird in einer Konzentration unterhalb der Sättigungslöslichkeit in einem physiologisch
verträglichen
Lösungsmittel
(z.B. isotonische Kochsalzlösung,
Glucoselösung
5% und/oder PEG 400-Lösung
30%) gelöst.
Die Lösung
wird steril filtriert und in sterile und pyrogenfreie Injektionsbehältnisse
abgefüllt.