DE69632876T2

DE69632876T2 - 2-Amino-Benzoxazinone zur Behandlung von viralen Infektionen

Info

Publication number: DE69632876T2
Application number: DE69632876T
Authority: DE
Inventors: Norman Morton Grove Abood; Daniel L. Mundelein Flynn; Daniel P. Glenview Becker; Brian M. Bax; Hui Vernon Hills Li; Roger A. Buffalo Grove Nosal; Lori A. Gurnee Schretzman; Clara I.. Glenview Villamil; Michael J. Morton Grove Bennett; John L. Mount Prospect Bedell; Kenneth Evanston Williams
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1995-05-24
Filing date: 1996-05-23
Publication date: 2005-03-03
Anticipated expiration: 2016-05-24
Also published as: TW455583B; ATE208765T1; DE69617005T2; BR9608506A; ATE270667T1; AU5803096A; DE69632876D1; DK0828721T3; CN1070480C; PT1122245E; CN1190963A; PT828721E; JPH11505849A; WO1996037485A1; NZ308398A; US20050032793A1; ES2169242T3; US6683077B2; AU711174B2; ES2225339T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung ist auf dem Gebiet antiviraler Mittel und betrifft speziell Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Herpes-Erkrankungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es besteht ein großer Bedarf an neuen Therapien zur Behandlung viraler Erkrankungen. Obgleich große Fortschritte bei der Entwicklung einer Vielzahl von Therapien zur Behandlung bakterieller Infektionen gemacht wurden, gibt es wenige brauchbare Therapien zur Behandlung viraler Erkrankungen. Zidovudin ist die wichtigste zugelassene Behandlung gegen das humane Immunschwächevirus. Ganciclovir, Aciclovir und Foscarnet werden derzeit zur Behandlung von Herpesvirus-Infektion verwendet. Diese Therapien können jedoch wegen ihrer schädlichen Wirkungen auf die Wirtszell-DNA-Replikation oder wegen ihrer Wirkung auf nur eine begrenzte Anzahl viraler Infektionen erhebliche Nebenwirkungen haben. Überdies ist bekannt, dass Viren Therapienresistenz entwickeln, was eine fortschreitende Abnahme der Wirksamkeit verursacht.
Viren können mit Bezug darauf, ob sie RNA oder DNA einbauen, in allgemeine Kategorien eingeteilt werden. Wichtige Virusfamilien vom DNA-Typ beinhalten die Adenoviren, Poxviren, Papovaviren und Herpesviren.
Herpesviren sind eine Familie von DNA-Viren, die unter anderem das Herpes simplex-Virus Typ-1 (HSV-1), Herpes simplex-Virus Typ 2 (HSV-2), Cytomegalovirus (CMV), Varicella zoster-Virus (VZV), Epstein-Barr-Virus, humanes Herpesvirus-6 (HHV6). humanes Herpesvirus-7 (HHV7), humanes Herpesvirus-8 (HHV8), Pseudorabies und Rhinotracheitisvirus beinhalten.
Es ist bekannt, das Herpesviren ihre genetische Information exprimieren, indem sie die Synthese einer Reihe von im Herpesvirus kodierten Proteinen in der Wirtszelle veranlassen. Eines der wichtigen viruskodierten Proteine wird aus einem Precursor hergestellt, der aus einer am Amino-Terminus gelegenen Protease und einem am Carboxy-Terminus gelegenen Assembly-Protein besteht. Dieser Precursor wird in autokatalytischer Weise proteolytisch an einer bestimmten, als "Freisetzungstelle" bekannten Aminosäuresequenz prozessiert, um die Protease und das Assembly-Protein separat zu ergeben. Das Assembly-Protein wird durch die Protease an einer weiteren spezifischen, als "Reifungs"-Schnittstelle bekannten Aminosäuresequenz gespalten. Unlängst ist in EP 514 830 , veröffentlicht am 25. November 1992, eine virusspezifische Seein-Protease beschrieben worden, die bei der Herpesvirus-Replikation eine Rolle spielt. Zusätzlich haben Lui und Roizman [J. Virol. 65, 5149 (1991)] die Sequenz und Aktivität einer Protease und des damit assoziierten, durch U_L26 von HSV-1 kodierten Assembly-Proteins beschrieben. A. R. Welch et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10792 (1991) und WO93/01291, veröffentlicht am 21. Januar 1993] beschreiben eine verwandte Protease (auch als „Assemblin" bekannt) und das durch U_L80 von CMV kodierte Assembly-Protein. Ein gegenwärtig auf seine potentielle Verwendung bei der Behandlung von Herpesvirus-Infektionen untersuchter Forschungsansatz ist die Entwicklung von Inhibitoren der Herpesvirus-Proteasen.
4H-3,1-Benzoxazinone sind der Literatur dahingehend beschrieben worden, dass sie unter anderem Serinprotease-Aktivität besitzen. Obwohl Verbindungen dieses Typs in der Literatur als mit Serinprotease-Hemmaktivität ausgestattet beschrieben wurden, wurde für keine eine Hemmung der viralen Assemblin-Protease berichtet. Zum Beispiel beschreiben Teshima et al. [J. Biol. Chem. 257, 5085–5091 (1982)] verschiedene 2-Alkyl-4H-3,1-benzoxazin-4-one als Enzyminhibitoren. Moorman und Abeles [J. Amer. Chem. Soc. 104, 6785–6786 (1982)] beschreiben 4H-3,1-Benzoxazin-2,4-dion als mit einer gewissen Enzymhemmaktivität ausgestattet. R. Stein et al. [Biochemistry 26, 4126–4130, (1987)] beschreiben 2-Alkyl-4H-benzoxazin-4-one mit weiterer Substitution in den Positionen 5, 6 und 7 als das Elastase-Enzym hemmend. Die WO-Publikation 92/18488 (veröffentlicht am 29. Oktober 1992) beschreibt 2-Alkyl-4H-3,1-benzoxazin-4-one mit Substitutionen in den Positionen 5 und 7 als selektive Inhibitoren der Elastase. Die europäische Patent anmeldung 206 323 (veröffentlicht am 30. Dezember 1985) beschreibt 2-Alkoxy-, 2-Anloxy- und 2-Aralkoxy-4H-3,1-benzoxazin-4-one mit Substitutionen in den Positionen 5, 6, 7 und 8 als Enzym-Inhibitoren. Das US-Patent 4 745 116 von A. Kranz et al. beschreibt 2-Alkoxy-, 2-Anloxy- und 2-Aralkoxy-4H-3,1-benzoxazin-4-one mit weiteren Substitutionen in den Positionen 5, 7 und 8 als Enzym-Inhibitoren. Das US-Patent 5 428 021 von C. Hiebert et al. beschreibt 6-(Aminosäure)amino-2-alkoxybenzoxazinone als Elastase-Inhibitoren. Die WO-Veröffentlichung 96/07648, veröffentlicht am 14. März 1996, beschreibt 2-Phenylaminobenzoxazinone zur Behandlung des Morbus Alzheimer und es wird speziell 6-Chlor-2-(2-iodphenylamino)benzo[d][1,3]oxazin-4-on beschrieben.
2-Amino-4H-3,1-benzoxazinone sind beschrieben worden. A. Krantz et al. (J. Med. Chem. 33, 464–479 (1990)] beschreiben mit Alkyl, Alkylamino, Alkoxy und Alkylthio in Position 2 substituiertes 4H-3,1-Benzoxazin-4-on mit weiteren Substitutionen in den Positionen 5, 6 und 7 als Elastase-Inhibitoren. Uejima et. al. [J. Pharm. Exp. Ther. 265, 516–522 (1993)] beschreiben 2-Alkylamino-5-methyl-7-acylamino-4H-3,1-benzoxazin-4-one als hochselektive Elastase-Inhibitoren mit erheblicher Plasmastabilität. Das US Patent 4 657 893 von A. Krantz et al. beschreibt 2-Alkylamino- und 2-Alkylurido-4H-3,1-benzoxazin-4-one mit weiteren Substitutionen in den Positionen 5, 7 und 8 als Enzym-Inhibitoren.
F. L. M. Alvarez [An. Quim. 79, 115–117 (1983)] beschreibt die Herstellung von 2-Sulfonylamino-4H-3,1-benzoxazinonen. J.G. Tercero et al. (An. Quim. 83, 247–250 (1987)] beschreiben die Herstellung von 2-Arylsulfonylamino-4H-3,1-benzoxazinonen.
I. Butula et al. [Croat. Chem. Acta 54, 105–108 (1981)] beschreiben die Synthese von 2-Alkylamino-4H-3,1-benzoxazinonen. H. Ulrich et al. [J. Org. Chem. 32, 4052–4053 (1967)] beschreiben die Synthese von 2-Alkylamino-4H-3,1-benzoxazinonen. E. Papadopoulos [J. Heterocyclic. Chem. 21, 1411–1414 (1984)] beschreibt die Verwendung von 2-Halogenalkylamino-4H-3,1-benzoxazin-4-on als Ausgangsmaterial bei der Synthese von Phenylharnstoffen. Die europäische Patentanmeldung 466 944 (veröffentlicht am 22. Januar 1992) beschreibt 2-Alkylamino-7-acylamino-5-alkyl-4H-benzoxazin-4-one als selektive Inhibitoren der Elastase.
M. Badawy et al. [J. Heterocyclic. Chem. 21, (1403–1404) (1984)] beschreiben die Verwendung von N-Phenyl-2-amino-4H-3,1-benzoxazin-4-on als Ausgangsmaterial bei der Synthese von Chinazolinen. R. Khan und R. Rastogi (J. Chem. Research (S) 342–343 (1992)] beschreiben die Synthese von 2-[5-Aryl-1,3,4-oxadiazol-2-yl]amino-4H-3,1-benzoxazin-4-onen.
4H-3,1-Benzoxazin-4-one sind unlängst als selektive Assemblin-Protease-Inhibitoren zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Virusinfektion beschrieben worden.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe spezifischer, substituierter, in der therapeutischen und prophylaktischen Behandlung viraler Erkrankungen nützlicher Benzoxazinone, die durch die allgemeine Formel I
definiert und aus der Gruppe von Verbindungen bestehend aus

5-Methyl-2[[(R)-1phenylethyl]amino]-4H-3,1-benzoxazin-4-on,
N^α-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-N^ε-[(phenylmethoxy)carbonyl]-L-lysin-1,1-dimethylethylester,
N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-phenylalaninmethylester,
N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-tryptophanmethylester,
N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-tryptophan-1,1-dimethylester,
2-[[2-Methoxy-(1S)-(1-phenylmethyl)ethyl]amino]-5-methyl-4H-3,1-benzoxazin-4-on, 3,5-Diiod-N-(5-methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-tyrosinmethylester,
N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-O-methyl-L-tyrosinmethylester,
N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-kihenylglycin-1,1-dimethylethylester,
αS-[(5-Methyl-4-oxo-4N-3,1-benzoxazin-2-yl)amino]-4-methoxy-N-methyl-N-(phenylmethyl]benzolpropanamid,
5-Methoxy-2-[[(1R)-1-phenylethyl]amino]-4H-3,1-benzoxazin-4-on und
N-[5-Methoxy-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl]-O-methyl-L-tyrosin-N-methyl-N-phenylmethylamid ausgewählt sind und die pharmazeutisch annehmbaren Salze dieser ausgewählten Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben sich als besonders wirksam gegen Herpetoviridae erwiesen. So sind sie insbesondere zur Behandlung von unter anderem Herpes simplex-Viren (HSV-1, HSV-2), Cytomegalovirus (CMV), Herpes varicella-zoster, Epstein-Barr, HHV6, HHV7, Pseudorabies und Rhinotracheitis wirksam.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Behandlung eines an einer viralen Infektion leidenden Patienten mit einer wirksamen Menge einer Verbindung, die eine virusspezifische Protease hemmen kann. Vorzugsweise wird der Patient mit einem Herpesvirus-Protease-Inhibitor behandelt. Stärker bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem der virale Protease-Inhibitor ein CMV-Protease-Inhibitor oder ein HSV-Protease-Inhibitor ist. Sogar noch stärker bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem der Patient mit einem Inhibitor der durch U_L80 kodierten CMV-Protease, der durch U_L26 kodierten HSV-1- oder HSV-2-Protease, wie zum Beispiel den erfindungsgemäßen 4H-3,1-Benzoxazin-4-on-Verbindungen, behandelt wird.
Diese Verbindungen sind neben ihrem Nutzen in der Humanbehandlung auch noch nützlich für die veterinärmedizinische Behandlung von Tieren, einschließlich Haus- und Nutztieren wie zum Beispiel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Pferden, Hunden, Katzen, Kühen, Schafen und Schweinen.
Die vorliegenden Verbindungen können auch ganz oder teilweise anstelle anderer herkömmlicher antiviraler Verbindungen in Co-Therapien zusammen mit, ohne auf diese beschränkt zu sein, antiviralen Mittel wie zum Beispiel Ganciclovir, Docosanol, Trifluridin, Foscarnet, Ribavirin, Epervudin, Interferon, Thymostimulin, Ciba-Geigy CGP-16056, Sprofen, Efalith, Ibuprofenpiconol, Ufenamat, Thymopentin, Aciclovir, Valaciclovir, Edoxudin, Famciclovir, Idoxuridin, Vidarabin, Epavir, Zinkacetat, Tromantadin, Riodoxol, Sorivudin, Yakult Honsha LC-9018, Cidofovir, Bromvinyldeoxyuridin, Lidakol, Stega Pharmaceutical Cytokin-Freisetzungsmittel, CSL ISCOM, Penciclovir, Viraplex, Pharmacia & Upjohn THF, Boehringer Ingelheim BIRR-4, NIH-Peptid T, Virend, Zinkglycerolat und Lobucavir verwendet werden.
Die Bezeichnung „therapeutisch wirksam" soll die Menge der Verbindung angeben, die das Ziel einer Verbesserung der Schwere und der Häufigkeit des Auftretens (viraler Erkrankungen) erreicht, wobei die mit alternativen Therapien typischerweise verbundenen schädlichen Nebenwirkungen vermieden werden. Die Bezeichnung "Kombinationstherapie" (oder "Co-Therapie") bei der Definition der Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung und einem weiteren Mittel soll die Verabreichung jedes Mittels nacheinander nach einem Dosierungsschema umfassen, das die vorteilhaften Wirkungen der Arzneimittelkombinationstherapie bereitstellt, und soll außerdem so verstanden werden, dass die im wesentlichen gleichzeitige Co-Verabreichung dieser Mittel sowohl in einer einzigen Kapsel mit einem festgelegten Verhältnis dieser Wirkstoffe als auch in mehreren, für jedes Mittel separaten Kapseln umfasst sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst eine therapeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel I zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Adjuvans oder Verdünnungsmittel.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur therapeutischen und prophylaktischen Behandlung viraler Infektionen, insbesondere Herpetoviridae-Infektionen bei einem Patienten, ein Verfahren umfassend die Behandlung eines an einer solchen Infektion leidenden Patienten mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Hemmung einer viralen Protease, wobei das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I umfasst.
Ebenfalls beinhaltet in der Familie von Verbindungen der Formel I sind pharmazeutisch annehmbare Salze davon. Der Begriff "pharmazeutisch annehmbare Salze" umfasst Salze, die üblicherweise zur Bildung von Alkalimetallsalzen und zur Bildung von Additionssalzen freier Säuren oder freien Basen verwendet werden. Die Beschaffenheit dieser Salze ist nicht kritisch, unter der Voraussetzung, dass sie pharmazeutisch akzeptabel sind. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Verbindungen der Formel I können aus anorganischen oder organischen Säuren hergestellt werden. Beispiele solcher anorganischen Salze sind Hydrochlor-, Hydrobrom-, Hydroiod-, Salpeter-, Kohlen-, Schwefel- und Phosphorsäure. Passende organische Säuren können aus aliphatischen, cycloaliphatischen, aromatischen, araliphatischen, heterocyclischen, Carbon- und Sulfon-Klassen organischer Säuren ausgewählt werden, Beispiele hierfür sind Ameisen-, Essig-, Propion-, Bernstein-, Glycol-, Glucon-, Milch-, Apfel-, Wein-, Zitronen-, Ascorbin-, Glucuron-, Malein-, Fumar-, Brenztrauben-, Asparagin-, Glutamin-, Benzoe-, Anthranil-, Mesyl-, Salicyl-, p-Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Mandel-, Embon (Pamoa)-, Methansulfon-, Ethylsulfon-, Benzolsulfon-, Pantothen-, Toluolsulfon-, 2-Hydroxyethansulfon-, Sulfanil-, Stearin-, Cyclohexylaminosulfon-, Algen-, p-Hydroxybutter-, Galactar- und Galacturonsäure. Geeignete pharmazeutisch annehmbare basische Additionssalze von Verbindungen der Formel I beinhalten mit Aluminum, Calcium, Lithium, Magnesium, Kalium, Natrium und Zink gebildete Metallsalze oder mit N,N'-Dibenzylethylendiamin, Cholin, Chlorprocain, Diethanolamin, Ethylendiamin, Meglumin (N- Methylglucamin) und Procain gebildete organische Salze. Alle diese Salze können mit herkömmlichen Mitteln aus der entsprechenden Verbindung der Formel I, zum Beispiel durch Umsetzen der passenden Säure oder Base mit der Verbindung der Formel I, hergestellt werden.
Allgemeine Syntheseverfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I sind in der früheren Anmeldung WO-A 96/37485 beschrieben.
Die folgenden Beispiele enthalten detaillierte Beschreibungen von Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I. Soweit nicht anders erwähnt, sind alle Teile als Gewichtsteile und die Temperaturen in °C angegeben.
Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

EtOAc – Ethylacetat
HCl – Hydrochlorsäure
DMSO – Dimethylsulfoxid
d₆-DMSO – deuteriertes Dimethylsulfoxid
CDCl₃ – deuteriertes Chlorform
CHCl₃ – Chlorform
CD₃OD – deuteriertes Methanol
Et₂O – Diethylether
MgSO₄ – Magnesiumsulfat
H₂SO₄ – Schwefelsäure
NaHCO₃ – Natriumbicarbonat
KHSO₄ – Kaliumhydrogensulfat
NMM – N-Methylmorpholin
DMF – Dimethylformamid
DMAP – 4-Dimethylaminopyridin
CDl – Carbonyldiimidazol
NaOH – Natriumhydroxid
KOH – Kaliumhydroxid
LiOH – Lithiumhydroxid
Pd(OH)₂/C – Palladiumhydroxid auf Kohlenstoff
Pd/C – Palladium auf Kohlenstoff
EDC – 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodümid · HCl
BOC – tert-Butyloxycarbonyl
TLC – Dünnschichtchromatographie
MeOH – Methanol
KI – Kaliumiodid
CH₂Cl₂ – Methylenchlorid

BEISPIEL 1
N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-alanin, tert-Butylester (nicht beansprucht)
Zu einer eiskalten Suspension von CDl (0,53 g, 3,27 mMol) in 5 ml Pyridin wurde L-Alanin-t-butylesterhydrochlorid (0,57 g, 3,13 mMol) gegeben. Nach Rühren bei 0°C während 30 min wurde 2-Amino-6-methylbenzoesäure (0,43 g, 2,85 mMol) zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und die Reaktion bei 65°C während 2 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit EtOAc verdünnt, mit 1 N HCl gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft. Das Rohprodukt (0,30 g) wurde in 5 ml CH₂Cl₂ gelöst. Triethylamin (0,15 g, 1,47 mMol) und EDC (0,28 g, 1,47 mMol) wurden nacheinander zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur während 2 h wurde die Reaktionsmischung mit EtOAc verdünnt, mit 1 N HCl gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft. Kieselgelsäulenchromatographie des Rückstands (1:1 EtOAc/Hexan) stellte 113 mg N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-alanin, t-Butylester bereit. Analyse: Berechnet für C₁₆H₂₀N₂O₄: C 63,14, H 6,62, N 9,21. Gefunden: C 62,90, H 6,97, N 9,11.¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1,49 (s, 9H), 1,50 (d, J = 7 Hz, 3H), 2,70 (s, 3H), 4,48 (pent, J = 7 Hz, 1H), 5,68 (br. s, 1H, austauschbar), 6,95 (d, J = 8 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,45 (t, J = 8 Hz, 1H).
Nach derselben Vorgehensweise, aber unter Ersetzen von L-Alanin-t-Butylesterhydrochlorid durch andere geeignet substituierte Amine oder Aminhydrochloride wurden die folgenden Verbindungen hergestellt;

(1i) N^α-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-N^ε-[(phenylmethoxy)carbonyl)-L-lysin, 1,1Dimethylethylester:¹N-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1,40-1,63 (m, 13H), 1,75 – 1,95 (m, 2H), 2,65 (s, 3H), 3,18 (m, 3H), 4,42 (m, 1H), 5,08 (s, 2H), 5,47 (br. t, J = 7 Hz, 1H, austauschbar), 6,25 (br. d, J = 7 Hz, 1H, austauschbar), 6,88 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,20 – 7,35 (m, 5H), 7,39 (t, J = 8 Hz, 1H).
(1k) N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-phenylalanin, Methylester: Analyse: Berechnet für C₁₉H₁₈N₂O₄: C 67,44, H 5,36, N 8,28. Gefunden: C 67,20, H 5,57, N 8,05.
(1m) N-(5-Methyl-4-oxo-4N-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-tryptophan, Methylester: ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 2,67 (s, 3H), 3,40 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 4,93 (m, 1H), 5,47 (br. d, J = 7 Hz, 1H, austauschbar), 6,90 – 7,20 (m, 5H), 7,30 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,43 (t, J = 8 Hz, 1H), 7,55 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,44 (s, 1H, austauschbar).
(1n) N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-tryptophan, 1,1-Dimethylethylester:¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1,38 (s, 9H), 2,63 (s, 3H), 3,33 (m, 2H), 4,78 (m, 1H), 5,68 (br. d, J = 7 Hz, 1H, austauschbar), 6,85 – 7,15 (m, 5H), 7,26 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,37 (t, J = 8 Hz, 1H), 7,60 (d, J =8 Hz, 1H), 8,65 (s, 1H, austauschbar).
(1o) N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-phenylglycin, 1,1-Dimethylethylester:¹H -NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1,42 (s, 9H), 2,62 (s, 3H), 5,50 (d, J = 7 Hz, 1H), 6,38 (br. s 1H, austauschbar), 6,86 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,25 – 7,38 (m, 4H), 7,47 (d, J = 8 Hz, 2H).
(1p) 2-[[2-Methoxy-(1S)-(1-phenylmethyl)ethyl]amino]-5-methyl-4H-3,1-benzoxazin-4-on: Analyse: Berechnet für C₁₉H₂₀N₂O₃: C 70,35, H 6,22, N 8,64. Gefunden: C 70,00, H 6,28, N 8,54.
(1q) 3,5-Diiod-N-(5-methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-tyrosin, Methylester: ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃), 2,72 (s, 3H), 3,09 (m, 2H), 3,79 (s, 3H), 4,86 (t, J = 7 Hz, 1H), 5,50 (br. s, 1H, austauschbar), 7,01 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,13 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,49 (t, J = 8 Hz, 1H), 7,52 (s, 2H).
(1r) N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-O-methyl-L-tyrosin, Methylester: ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 2,66 (s, 3H), 3,15 (m, 2H), 3,73 (s, 3H), 3,74 (s, 3H), 4,85 (br. m, 1H), 5,68 (br. s, 1H, austauschbar), 6,80 (d, J = 8 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,07 (m, 3H), 7,42 (t, J = 8 Hz, 1H).
(1s) αS-[(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)amino]-4-methoxy-N-methyl-N-(phenylmethyl)benzolpropanamid: Analyse: Berechnet für C₂₇H₂₇N₃O₄: C 70,88, H 5,95, H 9,18. Gefunden: C 70,65, H 6,03, N 9,06.

Nach derselben Vorgehensweise, aber unter Ersetzen von 2-Amino-6-methylbenzoesäure durch 2-Amino-6-methoxybenzoesäure (vgl. S. Gould und R. Eisenberg, J. Org. Chem. 56, 6666–6671 (1991)] und Ersetzen von L-Alanin-tert-butylesterhydrochlorid durch andere geeignete Amine oder Aminhydrochloride wurden die folgenden Verbindungen hergestellt:

(1t) 5-Methoxy-2-[[(1R)-1-phenylethyl]amino]-4H-3,1-benzoxazin-4-on und
(1u) N-[5-Methoxy-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl]-O-methyl-L-tyrosin, N-Methyl-N-phenylmethylamid.

BEISPIEL 3
2-Ethylamino-5-methyl-4H-3,1-benzoxazin-4-on (nicht beansprucht)
Zu einer bei Raumtemperatur gerührten Lösung von 2-(3-Ethylureido)-6-methylbenzoesäure (250 mg, 1,125 mMol) und Triethylamin (170 mg, 1,69 mMol) in 10 ml CH₂Cl₂ wurde EDC (501 mg, 1,69 mMol) gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur während 3 h wurde die Reaktion mit EtOAc verdünnt und nacheinander mit 1 N HCl und gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft. Kieselgelchromatographie des Rückstandes (1:1 EtOAc/Hexan) stellte 127 mg des Produktes bereit: Analyse: Berechnet für C₁₁H₁₂H₂O₂ · 0,25 H₂O: C 63,30, H 6,04, N 13,42. Gefunden: C 63,32, H 5,92, N 13,10. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-DMSO) δ 1,14 (t, J = 7 Hz, 3H), 2,60 (s, 3H), 3,27 (pent. J = 7 Hz, 2H), 6,95 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,50 (t, J = 8 Hz, 1H), 7,90 (br. t, J = 7 Hz, 1H, austauschbar).
Nach derselben Vorgehensweise, aber unter Ersetzen von 2-(3-Ethylureido)-6-methylbenzoesäure durch die geeignet substituierte Benzoesäure wurde die folgende Verbindung hergestellt:

(3c) 5-Methyl-2-[[(1R)-1-phenylethyl]amino]-4H-3,1-benzoxazin-4-on: Analyse: Berechnet für C₁₇H₆N₂O₂: C 72,84, H 5,75, N 9,99. Gefunden: C 72,51, H 5,88, N 9,97.

BIOLOGISCHE AUSWERTUNG
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wiesen antivirale Aktivität auf wie durch die in vitro Hemmung der Herpesvirus-Protease und der HCMV-Infektiosität angezeigt. Die in den folgenden Beispielen veranschaulichte antivirale Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wird durch die folgenden Verfahren bestimmt.
Enzymatischer Assay für HCMV-Protease (Assemblin)-Inhibitoren
Die Assemblin-Proteaseaktivität wurde unter Verwendung eines gefärbten para-Nitroanilid (pNA)-Substrats basierend auf der HCMV-Reifungsschnittstelle Succinyl-AGWNA-para-nitroanilid bestimmt. Die Inkubation dieses Substrats mit Assemblin führte zur Spaltung der Alanyl-para-nitroanilid-Aminbindung und damit zur Freisetzung von para-Nitroanilin, was durch die Absorption bei 405 nm bestimmt werden konnte. Potentielle Protease-Inhibitoren wurden in DMSO gelöst und 10 μl davon in die Cavitäten einer 96-Cavitäten-Platte (Dynatech, Immulon 1) gegeben. Das Enzym wurde in Assay-Puffer (Natriumphosphat, pH 7,4, 150 mM Natriumacetat, 0,1% CHAPS, 20% Glycerin) auf 4,8 μg/ml verdünnt und 100 μl in jede Cavität gegeben. Nach Inkubation während 30 min bei Raumtemperatur wurden 50 μl Substrat (1 Teil 20 mM Succinyl-AGWNA-para-nitroanilid (SEQID:1) in DMSO plus 9 Teile Assay-Puffer) zugegeben und anschließend periodische Ablesungen im Mikroplattenlesegerät bei 405 nm in Bezug zu 650 nm vorgenommen. Die Aktivitäten wurden als Änderung der Milliabsorptions-Einheit (mAU) pro Minute ausgedrückt. Die Inhibitorstärke wurde durch Vergleich mit Inkubationsansätzen ohne Inhibitor bestimmt, die unter diesen Bedingungen eine Zunahme von 0,5 bis 1 mAU/min zeigten. Es zeigte sich ein Anstieg, wenn das Enzym weggelassen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 enthalten.
Bestandteile des Assays:
Rekombinante HCMV-Protease:
HCMV-Protease wurde aus einer, ein für die Protease-Domäne des offenen Leserahmens von U_L80 des humanen Cytomegalovirusstamms AD169 kodierendes DNA-Konstrukt exprimierenden E. coli-Kultur gereinigt. Das Konstrukt kodierte ebenfalls für sechs zusätzliche Histidin-Reste am Amino-Terminus der Protease. Diese zusätzlichen Histidin-Reste stellen einen Affinitätsliganden bereit, durch den es unter Verwendung von Nickelnitriloessigsäure-Agarose (Qiagen) gereinigt wurde.
Die gereinigte Protease wurde als Stammlösung mit 1 bis 3 mg/ml in 20 mM, 20% (v/v) Glycerin enthaltendem HEPES-Puffer, pH 7,4, gelagert. Diese Stammlösung wurde mit Assay-Puffer auf 4,8 μg/ml verdünnt. Ein 100 μl Aliquot dieser Lösung wurde in der Enzymreaktion verwendet.
Ein spezifisches Substrat wurde synthetisiert, basierend auf der Spaltspezifität der HCMV-Protease an der "Reifungsstelle" des Assembly-Proteins (F. Liu und B. Roizman, J. Virol., 65, 5149 (1991) und A.R. Welch et al, J. Virol., 65, 4091 (1991)). Die Reifungsstelle des Assembly-Proteins hat die Sequenz ...AGWNA*SCRLATA...., das verwendete Substrat war Succinyl-AGWNA-PNA (SEQID:1), das nach einem, wie in Bodansky und Bodansky, "The Practice of Peptide Synthesis" (1984) beschriebenen Standardpeptid-Syntheseverfahren hergestellt und als 20 mM Stammlösung in Dimethylsulfoxid gelagert wurde. Diese wurde unmittelbar vor Gebrauch mit Assay-Puffer 10fach verdünnt, um eine Konzentration von 2 mM zu ergeben. Ein Aliquot von 50 μl wurde in der Reaktion verwendet.
Ein Assay-Puffer (10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,4, 150 mM Natriumacetat, 0,1% CHAPS und 20% (v/v) Glycerin) wurde zur Verdünnung der Stammlösung von Enzym und Substrat verwendet.
Antivirale Assays
Diese komplementären Assays untersuchten sowohl die Fähigkeit einer Verbindung, die Produktion neuer Viren zu hemmen und als auch deren Toxizität auf Wirtszellen. Es war entscheidend, beide Assays gleichzeitig durchzuführen, um die Ergebnisse direkt zu vergleichen, da Toxizität indirekt die Virus-Ausbeute mindern kann.
Abkürzungen:

DMEM – Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium
FBS – fötales Rinderserum, das handelsüblich erhältlich ist und bestimmte, unbekannte, für das Wachstum von Zellen in Gewebekultur erforderliche Faktoren enthält
PBS – Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung: 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 120 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid

Die Virus-Ausbeute wurde durch Messung der 4 Tage nach Infektion produzierten Menge an Virus-Antigen mit einem monoklonalen Antikörper gegen ein reichlich vorhandenes, unmittelbar nach Infektion produziertes, frühes (immediate early) Virus-Protein abgeschätzt. Ein Enzym-gebundener (Meerrettich-Peroxidase) sekundärer Antikörper mit Spezifität gegen einen primären (Maus) Antikörper wurde zur Messung der Menge an viralem Antigen verwendet. Die Testverbindungen wurden in DMEM plus 5% FBS bis zum zweifachen der gewünschten Endkonzentration verdünnt. 100 μl dieser Lösung wurden in jede Cavität der 96-Cavitäten-Platte eingebracht. Dies wurde einmal für jede der antiviralen 96-Cavitäten-Platten und noch einmal für eine Cytotoxizitätsplatte durchgeführt. Bei beiden Platten wurden zwei Kontrollen eingeschlossen, eine Kontrolle ohne Arzneimittel und eine ohne Virus. Ganciclovir wurde bei den antiviralen und Cytoxizitäts-Platten routinemäßig wegen seiner bekannten antiviralen Aktivität gegen HCMV als Referenzstandard mitgetestet. Alle Zellen wurden durch Ernten von Fibroblasten aus menschlicher Vorhaut gewonnen, mit Trypsin behandelt und in einer Konzentration von 5 × 10⁵ Zellen pro ml in DMEM resuspendiert. Infizierte Zellen wurden durch deren Infektion mit HCMV (Stamm AD169) mit einer Multiplizität von 0,2 hergestellt. 100 μl nicht infizierter Zellen (5 × 10⁴ Zellen) wurden in die entsprechenden Cavitäten der Cytotoxizitätsplatte gegeben. In gleicher Weise wurden 100 μl infizierte Zellen (5 × 10⁴ Zellen) in die entsprechenden Cavitäten der antiviralen Platte gegeben. Zusätzlich wurden nicht infizierte, nicht mit einer Testverbindung behandelte Zellen als Kontrolle bei der antiviralen Platte einbezogen.
Die Platten wurden während 96 h bei 37°C in 5% CO₂-Atmosphäre inkubiert und zur Messung der Menge an viralem Antigen und Toxizität weiterbehandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 enthalten.
ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) für HCMV Antigene:
Die folgenden Schritte wurden nur bei den antiviralen Platten durchgeführt. Das Medium wurde entfernt und die Zellen mit 1:1 Aceton : Methanol während 15 min bei –20°C fixiert. Die Fixierlösung wurde entfernt und die Zellen einmal mit 0,05% Tween 20 enthaltendes PBS gewaschen. Um unspezifische Bindung von Antikörpern zu blockieren, wurde jede Cavität mit 3% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) enthaltendem PBS während 1 h bei 22°C inkubiert. Die Blockierlösung wurde entfernt und die Zellen vor der Inkubation mit einer 1:100 Verdünnung des primären Antikörpers in 3% BSA enthaltendem PBS während 2 h bei 22 °C einmal mit 0,05% Tween 20 enthaltendes PBS gewaschen. Der primäre Antikörper war ein monoklonaler, für ein unmittelbar nach Infektion hergestelltes, frühes Kernantigen von HCMV spezifischer Antikörper (murinen Ursprungs) und war handelsüblich erhältlich (Dupont). Die primäre Antikörperlösung wurde entfernt und die Platte vor der Inkubation mit dem sekundären 3% BSA enthaltendes PBS 1:1000 verdünnten Antikörper während 2 h bei 22°C 5mal mit 1 % (v/v) Triton X-100 enthaltendes PBS (PBST) gespült. Der sekundäre Antikörper (Quelle: Ziege) erkannte die mausspezifischen Determinanten des primären Antikörpers und war mit der Meerrettich-Peroxidase (Sigma) kovalent vernetzt. Die Platte wurde vor Zugabe von 100 μl TMG-Substrat-Lösung fünfmal mit PBST und einmal mit entionisiertem Wasser gespült und danach während 30 min bei 22°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl Phosphorsäure beendet und die OD (optische Dichte) bei 450 nm aufgezeichnet. TBM (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) war das Substrat der an den sekundären Antikörper gebundenen Meerrettich-Peroxidase. Es wurde aus einem handelsüblich erhältlichen Kit (Kirkegaard & Perry, Laboratories, Inc.) hergestellt. Antivirale Aktivität wurde durch Vergleich der Mengen an produziertem viralen Antigen in den mit Arzneimittel behandelten Cavitäten zu denen ohne Arzneimittel berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 enthalten.
Antiviraler Assay mit rekombinantem humanen Cytomegalovirus
In diesem Assay wird die HCMV-Replikation durch die Bildung von E. coli β-Galactosidase durch ein gentechnisch verändertes Virus RC256 [Spaete und Mocarski, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 7213–7217 (1987)] überwacht. Ein antiviraler Assay und ein cytotoxischer Assay wurden für jede Verbindung durchgeführt. Die Verdünnungen der Testverbindungen und die Infektion von Zellen in den 96-Cavitäten-Platten waren im wesentlichen wie oben für den HCMV-ELISA beschrieben mit der folgenden Ausnahme: Humane Vorhaut-Fibroblasten mit einer Konzentration 3,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter wurden in Lösung mit RC256 durch 0,05 pfu pro Zelle infiziert. Die Verbindungen und die Zellen wurden 3 Tage inkubiert und 2 Tage nach Infektion weiterbehandelt. Zur Detektion der β-Galactosidase wurde der Überstand der antiviralen Platten abgedampft und 50 μl Reporter-Lysepuffer (Promega, einfach verdünnt mit Wasser) zu jeder Cavität gegeben. Die Platten wurden während mindestens 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend zur späteren Weiterbehandlung an diesem Punkt bei –20 °C eingefroren. 50 μl 2fach Assay-Puffer [120 mM Na₂HPO₄, 80 mM NaH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 100 mM 2-Mercaptoethanol, 4,4 mM ONPG (Sigma)] wurden in jede Cavität gegeben und während 30 bis 45 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl 1M CAPS-Puffer, pH = 11,0, pro Cavität beendet und die optische Dichte bei 410 nm abgelesen. Ganciclovir wurde als Positivkontrolle verwendet und die EC₅₀ wie oben für den HCMV-ELISA bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 enthalten.
Chymotrypsin-Assay
Der Chymotrypsin-Assay wurde nach dem Verfahren von Delmar et al [Anal. Biochem. 99, 316–320 (1979)] modifiziert. α-Chymotrypsin aus Rinderpankreas (Typ II, Sigma) wurde in 0,001 N HCl auf 1 mg/ml gelöst und vor Weiterverwendung auf 1:600 in Assay-Puffer (0,1 M Tris, pH 7,8, enthaltend 0,1 M CaCl₂) verdünnt. 20 μl Testverbindung in DMSO (oder DMSO allein), 100 μl Assay-Puffer und 30 μl Enzym wurden zu den 96 Cavitäten-Platten gegeben, gemischt und während 30 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 0,2 mM N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid (Sigma, 2 mM in DMSO, vor Verwendung 1:10 in Assay-Puffer verdünnt) in Gang gesetzt. Die Zunahme der Absorption bei 405 nm wurde während 10 min mit einem Biotek EL340 Platten-Lesegerät überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 enthalten.
Human Leukozyten Elastase-Assay
Human Leukozyten-Elastase (HLE) (Geschenk von R. Senior, Washington University) wurde auf eine Konzentration von 1 mg/ml in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und vor Verwendung in Assay-Puffer (0,2 M Tris, pH 8,0) 1:20 weiter verdünnt. 10 μl Testverbindung in DMSO (oder DMSO allein), 100 μl Assay-Puffer und 50 μl Enzym wurden zu den 96-Cavitäten-Platten gegeben, durchmischt und die Platten während 30 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 40 μl 2,5 mM Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilid (Sigma, 25 mM in DMSO, vor Verwendung 1:10 in Assay-Puffer verdünnt) in Gang gesetzt. Die Erhöhung der Absorption bei 405 nm wurde während 10 min mit einem Biotek EL340 Platten-Lesegerät überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 enthalten.
TABELLE 1
Der Schutzumfang dieser Erfindung umfasst ebenfalls eine Klasse pharmazeutischer Verbindungen umfassend eine oder mehrere Verbindungen der Formel I zusammen mit einem oder mehreren nicht-toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Trägern und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Adjuvantien (hierin kollektiv als "Träger"-Materialien bezeichnet) und, falls gewünscht, weitere aktive Bestandteile (Wirkstoffe). Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf jedem geeigneten Weg verabreicht werden, vorzugsweise in Form pharmazeutischer Zubereitungen, die an diesen Verabreichungsweg angepasst sind, und in einer Dosis, die bei der beabsichtigen Behandlung wirksam ist. Die Verbindungen und Zusammensetzungen können zum Beispiel oral, intravaskulär, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär oder topisch verabreicht werden.
Zur oralen Verabreichung kann die pharmazeutische Zusammensetzung zum Beispiel in Form einer Tablette, Kapsel, Suspension oder Flüssigkeit vorliegen. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird bevorzugt in Form einer eine bestimmte Wirkstoffmenge enthaltenden Einheitsdosis hergestellt. Beispiele einer solcher Einheitsdosis sind Tabletten oder Kapseln. Der Wirkstoff kann auch in einer Zusammensetzung, worin zum Beispiel Kochsalzlösung, Dextrose oder Wasser als geeignete Träger verwendet werden können, durch Injektion verabreicht werden.
Die Menge der verabreichten, therapeutisch wirksamen Verbindung und das Dosierungsschema zur Behandlung von Krankheiten mit den erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder Zusammensetzungen hängt von einer Vielzahl von Faktoren einschließlich des Alters, Gewichts, Geschlechts und der medizinischen Verfassung des Patienten, der Schwere der Erkrankung, dem Verabreichungsweg, der Häufigkeit der Verabreichung und der bestimmten eingesetzten Verbindung ab und kann daher stark variieren. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können Wirkstoffe im Bereich von 0,1 bis 2000 mg, vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 500 mg und am meisten bevorzugt zwischen 1 und 100 mg enthalten. Eine tägliche Dosis von etwa 0,01 bis 100 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise etwa 0,1 und 50 mg/kg Körpergewicht und am meisten bevorzugt zwischen etwa 1 bis 20 mg/kg Körpergewicht kann angemessen sein. Die tägliche Dosis kann in einer bis vier Dosis/Dosen pro Tag verabreicht werden.
Zu therapeutischen Zwecken werden die erfindungsgemäßen Verbindungen gewöhnlich mit einem oder mehren für den angegebenen Verabreichungsweg geeigneten Adjunvantien kombiniert. Falls per os verabreicht, können die Verbindungen mit Lactose, Saccharose, Stärkepulver, Celluloseestern von Alkansäuren, Cellulosealkylestern, Talkum, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Magnesiumoxid, Natrium- und Calciumsalzen von Phosphor- und Schwefelsäuren, Gelatine, Akaziengummi, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon und/oder Polyvinylalkohol vermischt und dann zur bequemen Verabreichung zu Tabletten gepresst oder in Kapseln gefüllt werden. Solche Kapseln oder Tabletten können eine Zubereitung zur kontrollierten Freisetzung enthalten, wie sie durch Dispersion des Wirkstoffs in Hydroxypropylmethylcellulose bereitgestellt werden kann. Zubereitungen zur parenteralen Verabreichung können in Form wässriger oder nichtwässriger, isotonischer, steriler Injektionslösungen oder Suspensionen vorliegen. Diese Lösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern oder Granula mit einem oder mehreren der zur Verwendung bei den Zubereitungen zur oralen Verwendung erwähnten Trägern oder Verdünnungsmittel hergestellt werden. Diese Verbindungen können in Wasser, Polyethylenglycol, Propylenglycol, Ethanol, Maisöl, Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Sesamöl, Benzylalkohol, Natriumchlorid und/oder verschiedenen Puffern gelöst sein. Weitere Adjuvantien und Verabreichungsverfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Pharmazie gut und hinreichend bekannt.
Bei Infektionen am Auge oder an anderen externen Gewerben, z.B. Mund oder Haut, werden die Zubereitungen vorzugsweise als topische, den/die Wirkstoff/e in einer Gesamtmenge von zum Beispiel 0,075 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 0,2 bis 20 Gew.-% und am meisten bevorzugt 0,4 bis 15 Gew-% des Wirkstoffs enthaltende Salben oder Cremes aufgetragen. Wird der Wirkstoff als Salbe zubereitet, kann entweder eine paraffinin- oder eine wassermischbare Salbengrundlage eingesetzt werden. Alternativ können die Wirkstoffe mit einer Öl-in-Wasser Cremegrundlage als Creme zubereitet werden. Falls gewünscht, kann die wässrige Phase der Cremegrundlage zum Beispiel mindestens 30 Gew.-% eines Polyalkohols wie zum Beispiel Propylenglycol, Butan-1,3-diol, Mannit, Sorbit, Glycerin, Polyethylenglycol und Mischungen davon beinhalten. Die topische Zubereitung kann wünschenswerterweise eine Verbindung beinhalten, die die Absorption durch oder das Eindringungsverstärker oder die betroffenen Regionen verstärkt. Beispiele für solche Verstärker des Eindringens in die Haut beinhalten Dimethylsulfoxid und verwandte Analoga. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch über ein transdermales Hilfsmittel verabreicht werden. Die bevorzugte topische Verabreichung ist durch die Verwendung eines Pflasters entweder vom Reservoir- oder vom porösen Membran-Typ oder als feste Matrixvariante zu erzielen. In jedem Fall wird der Wirkstoff kontinuierlich aus dem Reservoir oder den Mikrokapseln durch die Membran in einen für den Wirkstoff durchdringbaren, mit der Haut oder Schleimhaut des Empfängers in Kontakt befindlichem Klebstoff freigesetzt. Falls der Wirkstoff durch die Haut absorbiert wird, wird dem Empfänger ein kontrollierter und zuvor festgelegter Wirkstoffzustrom verabreicht. Im Fall von Mikrokapseln kann das eingekapselte Mittel auch als Membran wirken.
Die Ölphase der erfindungsgemäßen Emulsionen kann aus bekannten Inhaltsstoffen in bekannter Weise zusammengesetzt sein. Obwohl die Phase lediglich einen Emulgator umfassen kann, kann sie auch eine Mischung mit mindestens einem Emulgator mit einem Fett oder einem Öl oder sowohl mit einem Fett als auch mit einem Öl umfassen. Vorzugsweise ist ein hydrophiler Emulgator mit einem als Stabilisator wirkenden lipophilen Emulgator beinhaltet. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass sowohl ein Öl als auch ein Fett enthalten ist. Gemeinsam machen die/der Emulgator(en) mit oder ohne Stabilisatoren) das sogenannte Emulgierwachs aus und das Wachs zusammen mit dem Öl und dem Fett macht die sogenannte Emulgiersalbengrundlage aus, die die ölig dispergierte Phase der Cremeformulierung bildet. Zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Zubereitungen geeignete Emulgatoren und Emulsionsstabilisatoren beinhalten unter anderem Tween 60, Span 80, Cetostearylalkohol, Myristylalkohol, Glycerinmonostearat und Natriumlaurylsulfat.
Die Wahl der für die Zubereitung geeigneten Öle oder Fette basiert auf dem Erzielen der erwünschten kosmetischen Eigenschaften, da die Löslichkeit des Wirkstoffs in den meisten, üblicherweise in pharmazeutischen Emulsionszubereitungen verwendeten Ölen sehr niedrig ist. So sollte eine Creme vorzugsweise ein nicht fettiges, keine Flecken verursachendes und abwaschbares Produkt mit einer das Auslaufen aus Tuben oder anderen Behältern vermeidenden Konsistenz sein. Gerade- oder verzweigtkettige, mono- oder dibasische Aklylester wie zum Beispiel Diisoadipat, Isocetylstearat, Propylenglycoldiester von Kokosnussfettsäuren, Isopropylmyristat, Decyloleat, Isopropylpalmitat, Butylstearat, 2-Ethylhexylpalmitat oder eine Mischung von verzweigtkettigen Estern kann verwendet werden. Diese können in Abhängigkeit von den Erfordernissen allein oder in Kombination verwendet werden. Alternativ können Fette mit hohem Schmelzpunkt wie weiches Paraffin und/oder flüssiges Paraffin oder andere Mineralöle verwendet werden.
Geeignete Formulierungen für topische Anwendungen am Auge beinhalten weiterhin Augentropfen, worin die Wirkstoffe in einem geeigneten Träger, insbesondere einem wässrigen Träger, gelöst oder suspendiert sind. Die antiviralen Wirkstoffe liegen in solchen Formulierungen vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 bis 20 Gew.-%, vorteilhafterweise 0,5 bis 10 Gew.-%, und insbesondere bevorzugt von etwa 1,5 Gew.-% vor.

Claims

Verbindung der allgemeinen Formel
ausgewählt aus einer Gruppe von Verbindungen bestehend aus 5-Methyl-2[[(1R)-1phenylethyl]amino]-4H-3,1-benzoxazin-4-on, N^α-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-y1)-N^ε-[(phenylmethoxy)carbonyl]-L-lysin-1,1-dimethylethylester, N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-phenylalaninmethylester, N-(5-Methyl-4-oxo-4N-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-tryptophanmethylester, N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-tryptophan-1,1-dimethylethylester, 2-[[2-Methoxy-(1S)-(1-phenylmethyl)ethyl]amino]-5-methyl-4H-3,1-benzoxazin-4-on, 3,5-Diiodo-N-(5-methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-tyrosinmethylester, N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-O-methyl-L-tyrosinmethylester, N-(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)-L-phenylglycin-1,1-dimethylethylester, αS-[(5-Methyl-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl)amino]-4-methoxy-N-methyl-N-(phenylmethyl)benzolpropanamid, 5-Methoxy-2-[[(1R)-1-phenylethyl]amino]-4H-3,1-benzoxazin-4-on und N-(5-Methoxy-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl]-O-methyl-L-tyrosin-N-Methyl-N-phenyl-methylamid und den pharmazeutisch annehmbaren Salzen dieser ausgewählten Verbindungen.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein Verdünnungsmittel.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines viralen Infekts bei einem Patienten.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung einer viralen Protease.
Verwendung nach Anspruch 3, worin die virale Infektion durch ein Herpesvirus verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 5, worin die virale Infektion durch CV, HSV-1 oder HSV-2 verursacht wird.