DE69620473T2

DE69620473T2 - Strahlungsschützende phospholipiden

Info

Publication number: DE69620473T2
Application number: DE69620473T
Authority: DE
Inventors: Yechezkel Barenholz; Joshua Katzhendler; Ron Kohen; Oren Tirosh
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1995-12-11
Filing date: 1996-12-10
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2016-12-11
Also published as: EP0900075B1; US6165501A; ES2175152T3; WO1997021429A1; AU7707596A; US5817856A; AU705529B2; ATE215360T1; EP0900075A1; IL124732A0; DE69620473D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige, strahlungsschützende Phospholipide, kosmetische Zusammensetzungen, die diese Phospholipide enthalten und ein Verfahren, Lipidzusammensetzungen vor einer oxidativen Schädigung zu schützen.

Referenzen

Barenholz, Y., and Amselem, S., in Liposome Technology, 2. Aufl. Gregoriadis, G. Hrsg, CRC Press, Boca Raton, 1993, S. 501-525.
Barenholz, Y., Freire, E., Thompson, T.E., Correa-Freire, M.C., Bach, D., and Miller, I.R., Biochemistry 22: 3497-3501 (1933).
Haran, G., Cohen, R, Bar, L.K., and Barenholz, Y., Biochim. Biophys. Actta. 1151: 201-215 (1993).
Johnson, R.M. and Siddiqi, I.W., in The Determination of Organic Peroxides, Pergamon Press, 1966, S. 50-52.
Kates, M., Chan, T.H., and Stanacev, N.Z., Biochemistry 2: 394-396 (1963).
Lindh, I., and Stawinski, J., J. Org. Chem. 54: 1333-1342 (1989).
Miyazaki, H. et al., U.S. Pat. Nr. 5,428.030 (6/1995).
Nishida, T. et al., U.S. Pat. Nr. 5,433,944 (7/1995).
Sears, B.D., U.S. Pat. Nr. 4,426,330 (1/1984).
Sears, B.D., U.S. Pat. Nr. 4,534,399 (8/1985).
Szoka, F., Jr., et al., U.S. Pat. Nr. 4,235,871 (11/1980).
Szoka, F., Jr., et. al., Ann. Re. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980).
Woodle, M.C., Martin, F.J., Yau-Young, A., and Redemann, C.T., U.S. Pat. Nr. 5,013,556 (5/1991).

Hintergrund der Erfindung

Kosmetische Formulierungen, die Lipide enthalten, sind gut bekannt. Lipide können dazu dienen, die gewünschte Konsistenz und Viskosität in einer Formulierung zu erzeugen und, noch wichtiger, können helfen, die Lipide in der Haut wieder aufzufüllen.
Da die meisten der gewöhnlich in kosmetischen Formulierungen verwendeten Lipide ungesättigte Ketten enthalten, sind solche Formulierungen empfindlich gegenüber einer Oxidation. Oxidative Schädigung kann zum Verlust von Alkylketten führen, was einen Verlust an Fluidität und lipophilen Eigenschaften, z. B. der Fähigkeit, Lipide in der Haut wieder aufzufüllen und ihr dadurch Geschmeidigkeit und jugendliches Erscheinen zu verleihen, zur Folge hat. Oxidation kann auch zur Entfärbung und zur Entwicklung unangenehmer Gerüche führen. Oxidative Schädigung kann insbesondere auf Reaktionen strahlungsinduzierter freier Radikale zurückzuführen sein.
Abgesehen von der Minimierung der Oxidation ist es wünschenswert, feuchtigkeitsregulierende Eigenschaften in kosmetischen Formulierungen zu verstärken; z. B. den Gehalt an Feuchtigkeit, der von der Haut bewahrt werden kann, wenn die Formulierung aufgetragen wird. Erhöhte Wirksamkeit bei der Feuchtigkeitsspende ist auch bei örtlich aufgetragenen therapeutischen Lipidformulierungen wichtig, wie sie etwa bei der Behandlung von trockenen Augen verwendet werden.
Schliesslich ist es wünschenswert, dass die Lipide selbst stabil sind, dass sie z. B. nicht so leicht oxidiert oder hydrolylsiert werden.
EP-A-0 370 481 betrifft kleine Liposomen, die bestimmte Monophosphat- und Diphosphat- Verbindungen enthalten. EP-A-0 370 481 befasst sich nicht mit dem Problem, oxidative und hydrolytische Stabilität der Lipidmoleküle bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Dialkylether-verknüpftes Phospholipd mit einer Phosphat enthaltenden polaren Kopfgruppe. Die polare Kopfgruppe ist mit einer Polyethylenglycol (PEG)-Kette derivatisiert, die ein Molekulargewicht zwischen 2.000 und 10.000, und vorzugsweise zwischen 2.000 und 5.000 Dalton hat. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Phospholipid Ether-verknüpfte C&sub1;&sub6; bis C&sub2;&sub4; Alkyl- oder Alkenyl- Ketten. Die Alkenyl-Ketten sind bevorzugt Monoalkenyl-Ketten.
Das Phospholipd kann eine negativ geladene polare Kopfgruppe haben, etwa eine Phosphatgruppe. Alternativ kann die Kopfgruppe auch neutral sein, z. B. bei einem Niederalkylphosphatester, oder positiv geladen seit z. B. bei einem Niederalkylphosphatester, dessen Alkylbestandteil mit einem geladenen Amin endet.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst eine kosmetische Zusammensetzung, die liposomale oder mizellare Lipidteilchen in wässrigem Medium suspendiert enthält. Die Partikel enthalten 1-25 Molprozent eines Ether-verknüpften PEG-derivatisierten Phospholipids und der Rest ist Vesikel bildende Lipide, im Fall von Liposomteilchen. Die mizellaren Teilchen enthalten mehr als 25 Molprozent eines Ether-verknüpften PEG- derivatisierten Phospholipids und der Rest ist Vesikel bildende Lipide.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Dialkylether-verknüpfte Phospholipd der Zusammensetzung eine PEG-Kette, deren Molekulargewicht zwischen 2.000 und 5.000 Dalton liegt.
In einer anderen Ausführungsform, die hohe Viskosität mit geringer Lipidkonzentration verbindet, ist die Ionenstärke des wässrigen Mediums der Zusammensetzung geringer als etwa 10 mM Salz, und die Gesamt-Lipidkonzentration ist zwischen etwa 5 mM und etwa 200 mM, und bevorzugt zwischen etwa 50 mM und etwa 150 mM.
Die kosmetische Zusammensetzung kann zusätzlich einen oder mehrere kosmetisch sinnvolle Bestandteile enthalten, wie etwa Antioxidantien, Konservierungsmittel, Verdickungsmittel, Feuchtigkeitsspender, Farbstoffe, Düfte, Emollentien, Konditionierer, Kollagen, Elastin, Vitamine, Enzyme, Antibiotika, Bakterizide oder UV-absorbierende Bestandteile.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die kosmetische Zusammensetzung einen UV- absorbierenden Bestandteil ein und ist zum Gebrauch als Sonnenschutz-Zusammensetzung geeignet.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die kosmetische Lipidzusammensetzung eine oder mehrere der folgenden Bestandteile: isotonisierende Agenzien, Konservierungsmittel, Pufferagenzien, Viskosität erhöhende Agenzien, solubilisierende Agenzien und Stabilisatoren und hat einen pH-Wert zwischen etwa 5,0 und 8,0. Eine solche Ausführungsform ist für den Gebrauch in Augentropfen geeignet.
Als einen weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren, die Haut gegen Strahlungsschäden zu schützen, indem eine kosmetische Zusammensetzung auf die Haut aufgetragen wird, die liposomale oder mizellare Lipidteilchen in einem wässrigen Medium suspendiert enthält. Die Teilchen enthalten 1-25 Molprozent eines PEG-derivatisierten Lipids und der Rest ist Vesikel bildende Lipide, im Fall von Liposomteilchen. Die mizellaren Teilchen enthalten mehr als 25 Molprozent eines PEG-derivatisierten Lipids und der Rest ist Vesikel bildende Lipide. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die PEG-derivatisierten Lipide Dialkylether-verknüpfte Phospholipide.
Ebenfalls in die Erfindung eingeschlossen ist ein Verfahren zur Verbesserung der oxidativen Stabilität der Lipidbestandteile in einer örtlich anzuwendenden Liposomenzusammensetzung, indem etwa 1-10 Molprozent eines Dialkylether-verknüpften PEG-derivatisierten Phospholipids in die Liposomen eingebaut wird. Die PEG-Kette hat ein Molekulargewicht zwischen etwa 2.000 und 10.000 Dalton und vorzugsweise zwischen etwa 2.000 und 5.000 Dalton.
Diese und andere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden besser ersichtlich, wenn die folgende genaue Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die allgemeine Struktur eines Dialkylether-verknüpften Phospholipids der Erfindung;
Fig. 2 A-B zeigen ein Reaktionsschema zur Herstellung von Dihexadecyl-phosphatidylpolyethylenglycol (DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;) und verwandten Verbindungen mit neutralen und positiv geladenen Kopfgruppen;
Fig. 3 ist eine schematische Zeichnung eines PEG-Lipd beinhaltenden Liposoms, die Lipid- Doppelschicht, die verlängerten PEG-Ketten und die Hydratationsschicht zeigend.
Fig. 4 zeigt eine Kalibrierungskurve von ΔHfu von freiem Wasser aufgetragen gegen die PEG- Konzentration, verwendet zur Bestimmung von gebundenen Wassermolekülen pro PEG- Molekül;
Fig. 5A-5C zeigen Verhältnisse von ungesättigten zu gesättigten Acylketten in Ei-PC- Liposomen aufgetragen gegen DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;/Ei-PC-Liposomen vor und nach Gamma- Bestahlung für drei Stufen von Ungesättigtheit in den Ei-PC-Acylketten;
Fig. 6A-B zeigen Verhältnisse von ungesättigten zu gesättigten Acylketten in Ei-PC- Liposomen aufgetragen gegen DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;/Ei-pC-Liposomen vor und nach ausgedehnter Lagerung bei 4ºC für zwei Stufen von Ungesättigtheit in den Ei-PC-Acylketten; und
Fig. 7 zeigt die Höhe des weiteren Verlustes von ungesättigten Acylketten in Ei-PC- Liposomen aufgetragen gegen DHP PEG²&sup0;&sup0;&sup0;/Ei-PC-Liposomen, wenn die bei 4ºC gelagerten Liposomen anschliessend für 4 Tage bei 37ºC gelagert wurden, für zwei Stufen von Ungesättigtheit in den Ei-PC-Acylketten.

Genaue Beschreibung der Erfindung

I. Definitionen

Wenn nicht anders erwähnt, haben die nachstehenden Bezeichnungen folgenden Bedeutung:
Ein "Dialkylether-verknüpftes Phospholipid" (oder Ether-verknüpftes Phospholipid) ist ein Phospholipid, in dem die Kohlenwasserstoffketten über eine Etherbindung an einen Glycerylabschnitt gebunden sind.
Ein "PEG-derivatisiertes Phospholipid" (oder PEG-Phospholipid) ist ein Phospholipid, wie etwa Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidsäure, Phosphatidylinositol oder Sphingomyelin, dessen Kopfgruppe mit einer Polyethylenglycol-(PEG-)Kette verknüpft ist. Die Kohlenwasserstoffketten des Lipids können über Ether- oder Esterbindungen an ein Glyceryl-Grundgerüst oder über eine Amidbindung an ein 2-Amino-1,3-propandiol- Grundgerüst gebunden sein.
Ein "PEG-derivatisiertes Lipid" (oder PEG-Lipid) umfasst, in Ergänzung zu PEG- derivatisierten Phospholipiden, auch andere PEG-derivatisierte Dialkylkettenlipide, wie vorstehend definiert. Diese anderen Lipide umfassen Sphingolipide und Glycolipide, die mit PEG über die Kopfgruppe oder die C1-Hydroxylgruppe derivatisiert sind.
"Vesikel bildende Lipide" bezieht sich auf amphipatische Lipide, die hydrophobe und polare Kopfgruppenabschnitte haben und die (a) spontan im Wasser Doppelschicht-Vesikel bilden können, wie durch Phospholipide veranschaulicht, oder (b) stabil in Lipiddoppelschichten eingelagert sind, mit dem hydrophoben Abschnitt im Kontakt mit der inneren, hydrophoben Region der Doppelschichtmembran und dem polaren Kopfgruppenabschnitt auf die äussere polare Oberfläche der Membran gerichtet.
Die Vesikel-bildenden Lipide dieses Typs besitzen typischerweise eine oder zwei Acyl- Kohlenwasserstoffketten oder eine Steroidgruppe und können eine chemisch reaktive Gruppe wie ein Amin, Säure, Ester, Aldehyd oder Alkohol in der polaren Kopfgruppe enthalten. Zu dieser Klasse gehören Phospholipide, wie Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol (PI) und Sphingomyelin (SM), bei dem die zwei Kohlenwasserstoffketten typischerweise eine Länge zwischen etwa 14 und 22 Kohlenstoffatomen haben und in unterschiedlichem Grad ungesättigt sind. Andere Vesikelbildende Lipide enthalten Glycolipide, wie Cerebroside und Ganglioside und Sterole wie Cholesterol.
"Alkyl" bezeichnet einen vollständig gesättigten, monovalenten Rest, enthaltend Kohlenstoff und Wasserstoff, der verzweigt oder eine gerade Kette sein kann.
"Alkenyl" bezeichnet einen monovalenten Rest, bestehend aus Kohlenstoff und Wasserstoff, der verzweigt oder eine gerade Kette sein kann, und der eine oder mehrere Doppelbindungen enthält.
"Niederalkyl" bezeichnet einen Alkylrest mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, und bevorzugt mit einem oder zwei Kohlenstoffatomen.

II Herstellung von PEG-derivatisierten Phospholipiden

Dieser Abschnitt beschreibt Verfahren zur Herstellung von PEG-derivatisierten Lipiden, die gemäß der Erfindung verwendet werden können. Nachfolgende Abschnitte beschreiben den Gebrauch eines Ether-verknüpften PEG-Phospholipids zum oxidativen Schutz von Lipiden in einer Lipid-Doppelschicht und die Verwendung der PEG-Lipide in kosmetischen Zusammensetzungen.
Fig. 1 zeigt die allgemeine Struktur eines Dialkyl-Ether-verknüpften PEG-derivatisierten Phospholipids der Erfindung, bei dem R&sub1; und R&sub2; Kohlenwasserstoffketten mit mindestens zehn Kohlenstoffatomen sind, und PEG eine Polyethylenglykolkette ist, mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 750 und 10.000 Dalton, und bevorzugt zwischen etwa 2.000 und 5.000 Dalton.
Die Kopfgruppe des Phospholipids kann eine insgesamt negative, neutrale oder positive Ladung haben. Negativ geladenen Kopfgruppen enthalten Phosphat, wobei X in Fig. 1 ein -O&supmin; ist, z. B. Verbindung (F) in Fig. 2B. Die Bildung eines Phosphatesters (X = Alkoxy), wie in Verbindung (G) in Fig. 2B, ergibt eine neutrale Kopfgruppe. Positiv geladene Kopfgruppen enthalten einen Phosphatester, dessen Alkylbestandteil mit einem Amin ersetzt ist, das positiv geladen ist (X = Amino- oder Ammonium-Alkoxy), wie in Verbindung (H) in Fig. 2B. Die Verknüpfungsgruppe L, die die Phosphatgruppe des Phospholipids mit der PEG-Kette verbindet, kann eine direkte kovalente Bindung sein, in diesem Fall ist die PEG-Kette an die Phosphatidsäure-Kopfgruppe gebunden. Zahlreiche andere Bindungen sind möglich; zum Beispiel können Lipide mit einem Phosphatidylethanolamin (PE) oder anderen Amino- Kopfgruppen einfach über eine Reaktion mit bromiertem PEG an aktivierte PEG-Ketten gebunden werden. Woodle et al. (1991) beschreibt andere Verfahren zur Bindung eines Lipidamins (besonders PE) an PEG, einschliesslich der Aktivierung von Hydroxyterminiertem PEG mit einem Carbonyldiimidazol-Bindungsreagenz, gefolgt von der Reaktion mit dem Lipidamin, wobei eine Carbamat-Bindung gebildet wird. Ein mit einer Carboxylgruppe versehenes PEG-Ende kann mit einem Lipidamin unter Bildung einer Amidbindung reagieren (Sears).
Es können unterschiedlich geladene Kopfgruppen hergestellt werden; z. B. liefert die Alkylierung eines mit einem tertiären Amin substituierten Lipids mit PEG ein positiv geladenes quartäres Amin. Derivate von Phosphatidylcholin können mit PEG am Phosphat- Sauerstoff substituiert werden, um Lipide mit einer positiven Gesamtladung zu erhalten, ähnlich wie bei Verbindung (H) wie in Fig. 2B gezeigt.
Lipide, die eine funktionelle Hydroxyl-Gruppe enthalten, können ebenfalls mit bromiertem PEG unter Bildung von Etherbindungen reagieren. Stammlipide umfassen in diesem Fall Phosphatidylglycerin und Phosphatidylinositol, ebenso Sphingolipide wie Ceramid, Glycolipide und Sterole. Phosphatidylglycerin kann auch mit Periodat oxidiert werden, um dann mit Amino-PEG unter Bildung eines Imins zu reagieren, das dann zu dem stabilen Amin-Addukt reduziert wird.
Das Syntheseschema von Fig. 2 (Lindh et al., Kates et al.) zeigt die Herstellung eines Etherverknüpften Lipids mit einer Phosphat-Kopfgruppe, Dihexadecyl-phosphatidylpolyethylenglykol (DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;) und verwandte Verbindungen. Wie in Fig. 2 gezeigt, wurde 3-O-Benzylsolketal (A) durch Reaktion mit Benzylchlorid aus Solketal hergestellt, und dann die Schutzgruppe abgespalten, wobei 3-O-Benzylglycerin (B) erhalten wurde. Die Glyceryl-Hydroxylgruppen wurden mit 1-Bromhexadecan alkyliert, gefolgt von einer Hydrierung, wobei Verbindung (D), 1,2-Di-O-hexadecylglycerin, erhalten wurde. Diese Verbindung wurde phosphoryliert zu Verbindung (E), gefolgt von einer Kondensation mit PEG-Monomethylether, und der Oxidation des H-Phosphats, wobei 1,2-Di-O-hexadecyl-sn- glycero-3-phospho-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;, Natriumsalz (Verbindung F) erhalten wurde. Alternativ ergab die Oxidation mit I&sub2;/ROH/Pyridin den neutralen Phosphatester (Verbindung G), und die Oxidation mit I&sub2;/HO-R'-NR"&sub3;&spplus;/Pyridin ergab den positiv geladenen Ammoniumalkylphosphatester, Verbindung H. Experimentelle Einzelheiten werden in Beispiel 1, nachfolgend, beschrieben.
Verbindung (E) kann vor der Derivatisierung mit PEG verändert werden, um Dietherverknüpfte Analoga anderer Amine, z. B. Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin etc. wie vorstehend besprochen, nach dem Verfahren von Lindh et al. herzustellen. Obwohl in dem vorstehenden Herstellungsverfahren ein PEG mit einem Methylether-Ende verwendet wurde, ist es klar, dass andere Endgruppen wie Hydroxyl- oder Carboxylgruppen ebenfalls verwendet werden können. Es ist ebenfalls klar, dass eine Vielzahl von Lipiden und Bindungsgruppen zusätzlich zu den beschriebenen für den Gebrauch zur Herstellung PEG- derivatisierter Lipide zur Verwendung in den Zusammensetzungen der Erfindung geeignet sind.

II. Schutz der Lipid-Doppelschicht in Liposomen, die DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; enthalten

Gemäß einem Aspekt der Erfindung genügt ein relativ geringer Mol-Anteil von DBIP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; in einer Lipid-Doppelschicht, z. B. einem Liposom, um eine Barriere von gebundenem Wasser zu bilden, die die Diffusion von oxidierenden Bestandteilen in die Doppelschicht verlangsamt und damit die Empfindlichkeit für oxidative Schädigung vermindert, wie im folgenden und in den Experimenten beschrieben.
Die Anwesenheit von gebundenem Wasser wurde durch DSC-Untersuchungen gezeigt, die darauf hinweisen, dass jedes Molekül DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; anähernd die 20fache Menge an Wasser bindet, die ein Molekül Dimeristoyl-phosphatidylcholin bindet, das eine nicht-derivatisierte Cholin-Kopfgruppe hat (Beispiel 2, nachstehend). Fig. 3 ist eine schematische Zeichnung eines PEG-Lipide enthaltenden Liposoms, die die Lipid-Doppelschicht 2, die verlängerten PEG-Ketten 4 und die Hydrationsschicht 6 zeigt.
Oxidative Belastungstests wurden an Ei-PC-Liposomen durchgeführt, die 3 Mol % DHP- PEG²&sup0;&sup0;&sup0; enthielten; es wurden zwei Oxidierungsarten eingesetzt: (i) ionisierende γ-Strahlung und (ii) Langzeit-Einwirkung von Luft und/oder hohen Temperaturen. Liposomen, die nur Ei- PC enthielten, wurden den gleichen Bedingungen ausgesetzt. Wie in den nachstehenden Beispielen 3-6 beschrieben, zeigten die Liposomen mit den Ether-verknüpften PEG- Phospholipiden einen wesentlich reduzierten Verlust von ungesättigten Acylketten in den Ei- PC, verglichen mit jenen mit Ei-PC allein.

III. Herstellung von liposomalen oder mizellaren Suspensionen, die PEG-Lipide enthalten

Bei der Verwendung in kosmetischen Zusammensetzungen können die PEG-Lipide als Liposomen, als mizellare Suspensionen mit unterschiedlicher Konsistenz oder in Emulsionen oder Mikroemulsionen formuliert sein. Der Anteil von PEG-Lipid an den gesamten Lipidbestandteilen kann zwischen 0,5 Mol% und 100% variieren, wobei der Rest vorzugsweise Vesikel bildende Lipide umfasst, wie im folgenden beschrieben. Die Bildung von Liposomen ist bei Gehalten von PEG-Lipid bis zu 25 Mol% am meisten begünstigt. Bei Gehalten von 25 Mol% oder mehr PEG-Lipid wird die Bildung von Mizellen begünstigt.
Vesikel bildende Lipide enthalten nach vorstehend gegebener Definition Phospholipide wie Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidyethanolamin (PE), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol (PI) und Sphingomyelin (SM). Andere Lipide, die in der Erfindung mit eingeschlossen sein können, sind Glycolipide wie Cerebroside und Ganglioside und Sterole wie Cholesterol. Die Verwendung von natürlich vorkommenden Lipidgemischen wie Soja- Lecithin oder Ei-Lecithin wird in zahlreichen der folgenden Beispiele beschrieben.
Die folgenden Abschnitte beschreiben Verfahren zur Herstellung von liposomalen und milzellaren Suspensionen gemäss der Erfindung und Verfahren zur Einbringung zusätzlicher Bestandteile in diese Zusammensetzungen.

A. Liposomen

Liposomen können mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt werden, etwa mit jenen, die bei Szoka et al. genau beschrieben werden. Um multilamellare Vesikel (MLVs) zu erzeugen, wird ein Gemisch von Liposomen bildenden Lipiden, die in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst sind, in einem Gefäß eingedampft, um einen dünnen Film zu bilden, der dann mit einem wässrigen Medium bedeckt wird. Der Lipidfilm hydratisiert und bildet MLVs, typischerweise in Grössen zwischen etwa 0,1 und 10 Microns. Die MLVs können dann auf einen gewünschten Grössenbereich von 1,0 Micron oder weniger verkleinert werden, indem eine wässrige Lösung der Liposomen durch eine Polycarbonatmembran mit einer gewählten einheitlichen Porengrösse, typischerweise 0,05, 0,08, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6 oder 1,0 Micron, gedrückt wird. Die Porengrösse der Membran stimmt grob mit den grössten Grössen der Liposomen, die durch Extrusion durch diese Membran hergestellt wurden, überein, besonders wenn das Präparat zwei oder mehrere Male durch die selbe Membran gedrückt wird. Liposomen, in denen andere Agenzien, wie Arzneistoffe oder kosmetische Bestandteile eingeschlossen sind, können durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren, beschrieben von Szoka et al. in dem U.S. -Patent Nr. 4,235,871, hergestellt werden. Bei diesem Verfahren wird eine Lösung mit Liposomen bildenden Lipiden mit einem kleineren Volumen einer wässrigen Lösung gemischt, und das Gemisch wird dispergiert, um eine Wasser-in-Öl- Emulsion zu bilden, vorzugsweise verwendet man Pyrogen-freie Bestandteile. Jedes kosmetische oder pharmazeutische Agens, das eingebracht werden soll, wird entweder zur Lipidlösung hinzugegeben, im Fall eines lipophilen Agens, oderzum wässrigen Medium, im Fall eines wasserlöslichen Agens. Nach Entfernung des Lipid-Lösungsmittels wird das erhaltene Gel zu Liposomen umgewandelt. Die Vesikel aus dem Umkehrphasen- Verdampfungsverfahren (REVs) haben eine typische Durchschnittsgrösse von etwa 2-4 Micron und sind überwiegend oligolamellar, das heisst, sie enthalten eine oder einige Lipiddoppelschicht-Lagen. Die Grösse der REVs kann, wie vorstehend angeführt, durch Extrusion bemessen werden, um oligolamellare Vesikel mit einer maximalen ausgewählten Grösse vorzugsweise zwischen etwa 0,05 und 1,0 Micron zu erhalten.
Die REV- oder MLV-Präparate können z. B. mit Extrusions-, Schall- oder Homogenisierungsverfahren behandelt werden, um kleine unilamellare Vesikel (SUVs) herzustellen, die durch Grössen im Bereich von 0,04-0,08 Micron charakterisiert sind. Alternativ können SUVs direkt durch Homogenisieren einer wässrigen Dispersion von Lipiden gebildet werden, wie in den nachstehenden Beispielen 7 und 9.
Liposomenzusammensetzungen, die ein eingeschlossenes Agens enthalten, können nach der endgültigen Grössenbestimmung, wenn nötig, behandelt werden, um freies (nicht eingeschlossenes) Agens zu entfernen. Herkömmliche Trennverfahren wie Zentrifugation, Diafiltration und Molekularsieb-Chromatographie sind für diesen Zweck geeignet. Die Zusammensetzung kann auch durch die Filtration durch einen herkömmlichen 0,45 Microntiefen Filter sterilisiert werden.
Hohe Viskosität in äusserlich angewendeten Präparaten ist oft erwünscht, um einen Verbleib am Ort der Verabreichung zu gewährleisten. Liposomenpräparate mit hoher Viskosität können durch Konzentration von verdünnten Liposomenpräparaten, durch Zugabe von Verdickungsmitteln wie Carboxymethylcellulose etc. oder durch Suspendieren der Liposomen in gelförmigen kolloiden Materialien wie Hydrogel, Collagen, synthetischen Polymeren und ähnlichem, gebildet werden, wie in den nachstehenden Beispielen 11 und 14.
Ein Verfahren zur Bildung von gelartigen Liposomenzusammensetzungen bei einer relativ geringen Lipidkonzentration ist bei Uster et al. beschrieben. Es können Lipidkonzentrationen von vorzugsweise weniger als 200 mM und besser von 50-150 mM verwendet werden. Die Gewichtsprozente des Lipids hängen von den Molekulargewichten und dem Prozentsatz des verwendeten PEG-Lipids ab. Zum Beispiel entsprechen 50-150 mM annähernd 3,5 bis 10 Gewichtsprozenten PE oder annähernd 4 bis 12 Gewichtsprozenten eines 4 : 1 Mol/Mol Gemisches von PE und PE-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;.
Das Verfahren umfasst Hydratation der Vesikel-bildenden Lipide mit einer vorgegebenen Zusammensetzung in einem wässrigen Medium mit geringer Leitfähigkeit. Die Zusammensetzung umfasst eine Kombination von etwa 50-95 Gewichtsprozent neutralen Vesikel-bildenden Lipiden und etwa 5-50 Gewichtsprozent geladenen Vesikel-formenden Lipiden, die der Liposomoberfläche eine insgesamt negative oder insgesamt positive Ladung verleihen. Negativ geladene Phospholipide enthalten Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinositol und Phosphatidylserin. Beispiele für neutrale Lipide sind Phosphatidylcholin, Sphingomyelin, Glycolipide wie Cerebroside und Ganglioside und Sterole wie Cholesterol.
Die Lipide können direkt in das Medium mit geringer Leitfähigkeit gegeben werden, so dass, wenn die gewählte endgültige Lipidkonzentration erreicht ist, die Suspension einen Gelzustand bei Raumtemperatur einnimmt. Alternativ können die Lipide zu einem wässrigen Medium gegeben werden, das etwa 20 mM einer zwitterionischen Verbindung enthält, bei einem pH-Wert, der eindeutig von dem isoelektrischen Punkt der Verbindung verschieden ist. In diesem Fall ist die gebildete Liposomensuspension relativ flüssig und kann leicht weiterverarbeitet, z. B. verkleinert oder sterilisiert werden. Nach der Bearbeitung wird die nicht-viskose Liposomensuspension durch Titration des pH-Wertes der Suspension auf einen isoelektrischen Punkt der zwitterionischen Art in die gewünschte Gelform umgewandelt.

B. Mizellen

Mizellare Suspensionen von PEG-Lipiden können einfach durch Dispersion der Lipide in destilliertem Wasser oder in einem Puffermedium oder in anderen wässrigen Lösungen gebildet werden. Wie vorstehend bemerkt, bevorzugt der Einschluss von mehr als 25 Mol% PEG-Molekülen in einem Lipidgemisch die Bildung von Mizellen gegenüber der Bildung von Liposomen. Die Viskosität kann durch Konzentration oder Hinzufügen von Verdickungsmitteln oder Gel-bildenden kolloidalen Materialien, wie vorstehend für die Liposomen angegeben und in den nachstehenden Beispielen gezeigt, nach Wunsch erhöht werden.

IV. Formulierung von kosmetischen Zusammensetzungen

Die Dialkylether-verknüpften Phospholipide der Erfindung sind nützlich in kosmetischen Formulierungen, denen das gebundene Wasser der Hydratation der PEG-Ketten Feuchtigkeit spendende, hydratisierende und strahlungsschützende Eigenschaften verleiht, wie im vorstehenden Abschnitt 11 beschrieben. Die Verbindungen besitzen auch die Vorteile einer hohen hydrolytischen Stabilität durch die Alkyletherbindungen, und hoher Lipophilität, verliehen durch die zwei Fettsäure-Alkylketten. Nützliche Verabreichungen schliessen äusserliche Feuchtigkeitsspender ein, die auch Schutz gegen Strahlungsschäden gewähren, oder Agenzien zur Hydratation, z. B. in Augentropfen, aufgrund der hohen Rückhaltung von gebundenem Wasser durch die PEG-Ketten.
Für den Gebrauch von Hautcremes oder Feuchtigkeitsspendern kann die Gesamtkonzentration an Lipid zwischen 0,05 und 40 Gewichtsprozenten liegen, abhängig von der gewünschten Konsistenz, und beträgt vorzugsweise 3 bis 25 Gewichtsprozent. Wie vorstehend beschrieben, kann das Verfahren nach Uster et al. auch verwendet werden, um hohe Viskosität bei relativ geringer Lipidkonzentration zu erhalten.
Vorzugsweise werden bei der Formulierung der kosmetischen Zusammensetzungen zusätzliche Bestandteile in die liposomalen oder mizellaren Suspensionen der Erfindung eingeschlossen. Für den Gebrauch als eine Feuchtigkeit spendende und Strahlung blockierende Zusammensetzung für die Haut wird vorzugsweise eine UV-blockierende Verbindung eingeschlossen, um den antioxidierenden Schutz, der von den hydratisierten PEG- Lipiden bewirkt wird, zu unterstützen. UV-blockende Agenzien, die gewöhnlich in Sonnenschutzmitteln verwendet werden, enthalten Ester von p-Methoxyzimtsäure und p- Dimethylaminobenzosäure, Benzotriazole, Hydroxybenzophenone, Vitamin E, Beta-Carotin, und Pigmente wie Titandioxid. Andere Bestandteile, die vorteilhafte Wirkungen auf die menschliche Haut haben, wie Eigenschaften der Zellregeneration oder Reiz lindernde, weichmachende, reinigende, beruhigende etc. Eigenschaften, können eingeschlossen werden. Beispiele sind essentielle Fettsäuren, Pflanzenöle, tierische Öle wie Squalen, Glycosaminoglycane wie Hyaluronsäure und Proteine wie Collagen, Elastin etc. Verdickungsmittel wie Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Veegum K können ebenfalls, wie vorstehend bemerkt, hinzugefügt werden, um die gewünschte Viskosität zu erhalten.
Für den Gebrauch als ein hydratisierendes Agens in Augentropfen sind die Ether-verknüpften PEG-Lipide der Erfindung vorzugsweise in einer Formulierung enthalten, bei der die Konzentrationen 0,1 bis 40 Gewichtsprozent betragen und vorzugsweise 3 bis 15 Gewichtsprozent. Um Augentropfen herzustellen, die isotonisch mit der Tränenflüssigkeit sind, können isotonische Agenzien wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Glycerin hinzugegeben werden, falls nötig. Andere Zusätze, die bei der Formulierung von Augentropfen verwendet werden können, umfassen Konservierungsstoffe, Pufferagenzien, die Viskosität erhöhende Agenzien, solubilizierende Agenzien und Stabilisatoren. Der pH-Wert der Formulierung kann jeden Wert innerhalb eines ophthalmologisch vertretbaren Bereiches haben und liegt vorzugsweise zwischen pH 5,0 und pH 8. Solche Formulierungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und sind zum Beispiel bei Nishido et al. und Miyazaki et al. beschrieben.
Konservierungsmittel oder antiseptische Mittel werden oft verwendet, um kosmetische Formulierungen insbesondere vor mikrobiellem Angriff zu schützen und enthalten Parabene wie Methylparahydroxybenzoat (Methylparaben) und Propylparaben, Imidazolidinylharnstoff etc. Andere typische aktive pharmazeutische Substanzen, die gewöhnlich in solchen Formulierungen eingeschlossen sind, umfassen Vitamine, Hormone, Enzyme wie Superoxid- Dismutase, Impfstoffe, entzündungshemmende Agenzien wie Hydrocortison, Antibiotika und Bakterizide.
Verschiedene Verfahren, wie jene in Abschnitt III besprochenen, können verwendet werden, um zusätzliche Bestandteile zu liposomalen oder mizellaren Zusammensetzungen hinzuzufügen. Solche Bestandteile können den Liposomen mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Umkehrphasen-Verdampfungsverfahrens, wie in Beispiel 8, hinzugefügt werden oder einer wässrigen Dispersion von Lipiden vor der Homogenisation zugegeben werden, um SUVs zu bilden, wie in Beispiel 9.
Wässrige Liposom-Dispersionen können ebenfalls mit anderen Bestandteilen angereichert werden, und der erhaltene Feststoff kann redispergiert werden, um MLVs zu erhalten, die dann durch Extrusion oder Homogenisieren verkleinert werden können, wie in Beispiel 14 beschrieben. Diese Technik kann auch bei mizellaren Dispersionen angewendet werden, wie in Beispiel 15.
Verdickungsmittel oder andere Bestandteile können allgemein direkt zu einer mizellaren Dispersion gegeben werden, wie in Beispiel 12. Alternativ können Lipide zusammen mit den gewünschten Bestandteilen in einer alkoholischen Lösung gelöst werden, die dann unter Umrühren in Wasser injiziert wird, wie im nachstehenden Beispiel 13.

BEISPIELE

Untersuchungen, die zur Unterstützung der gegenwärtigen Erfindung durchgeführt wurden, zeigten an, dass, wenn man in oxidativen Belastungstests PEG-Lipide verwendete, die oxidative Schädigung am PEG-Rest selbst vernachlässigbar war, und dass sie keine Hydroperoxide ansammelte. Diese Untersuchungen sind in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Diese Beispiele zeigen darüber hinaus den Schutz von Lipid-Doppelschichten gegen oxidative Belastung durch den Einschluss von DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; und die Formulierung von PEG-Lipiden in zahlreichen kosmetischen Zusammenstellungen, die Feuchtigkeit spendend und zum Schutz gegen oxidative Schädigung durch Strahlung verwendet werden können.
Die Beispiele sollen besondere Zusammenstellungen und Verfahren der Erfindung erläutern, sie sollen aber keinesfalls deren Umfang einschränken.

MATERIAL UND METHODEN

NMR-Spektren wurden mit einem Varian Vxr 300S Spektrometer aufgenommen. Ein Prozent H&sub3;PO&sub4; in D&sub2;O wurde als ein externer Standard für ³¹P-Spektren verwendet. TLC wurde auf Merck (Darmstadt, Deutschland)-Silicagel 60 F254-beschichteten Platten unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems bestehend aus Chloroform : Methanol : Wasser 74 : 25 : 4 als Eluent durchgeführt. Die Flecken wurden mit Molybdänblau Sprayreagenz (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA) für die Phosphor enthaltenden Bestandteile sichtbar gemacht, und Jod diente als allgemeines Agens zum Nachweis.
Alle Reagenzien für die Synthese waren von analytischer Reinheit oder besser und wurden von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA. bezogen.
Bestimmung von PL-Acylketten-Zusammensetzung bei oxidativer Belastung (Barenholz et al., 1993): Auf die oxidative Belastung folgend wurden 100 ul von 8 mM Liposomen mit 900 ul Wasser verdünnt. Die Lipide wurden durch Zugabe von 1 ml Ethanol und 1 ml Chloroform aus der wässrigen Phase extrahiert. Es wurden zwei Phasen gebildet, und die organische Phase wurde abgetrennt und das Lösungsmittel durch einen Stickstoffstrom entfernt; gefolgt von einer Lyophilisation über 2 h (um alles Wasser zu entfernen). Das trockene Lipid wurde in 50 ul Toluol, 10 ul Methanol und 20 ul Meth-Prep Alltech (Methanol Veresterungsreagenz) wieder gelöst. Das Lipid-Gemisch wurde per Gaschromatographie unter Verwendung von Perkin Elmer 1020 Plus GC mit einer Silar 10C Alltech Reagenz- Chromatographie-Säule analysiert; es wurde ein Temperaturgradient von 5ºC/min von 140ºC bis 240ºC verwendet. Gesättigte 16 : 0-Palmitinsäure, die unter oxidativer Belastung unberührt bleibt, wurde als interner Standard eingesetzt.

Beispiel 1: Synthese von Dihexadecylphosphatidsäure-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; (DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;)

Synthese der Verbindung (A), 3-O-Benzylsolketal (Fig. 2A-B): 10 g Solketal (0,075 Mol) und 13 g Benzylchlorid (0,092 Mol) wurden in 500 ml Toluol gelöst. Pulverisiertes KOH (100 g) wurde zum Reaktionsgemisch gegeben. Das Gemisch wurde für 16 Stunden unter Rühren unter Rückfluss gekocht, und das gebildete Wasser wurde mit Hilfe einer Dean Stark-Falle entfernt. Nach Beendigung wurde 500 ml Wasser zugegeben, um das KOH zu lösen. Die Toluol-Phase wurde dreimal mit Wasser gewaschen, getrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und bei verringertem Druck konzentriert. Die Destillation des Restes ergab 14,6 g (0,066 Mol) (88%) Solketalbenzylether, Kp.89ºC/0,15 mm.
Synthese der Verbindung (B), 3-O-Benzylglycerin (Fig. 2A): Verbindung (A) (10 g) wurde in 100 ml Ethanol und 10 ml konzentrierter HCl gelöst, und die Lösung wurde 1 h unter Rückfluss gekocht. Die Reaktion wurde mit TLC überwacht, bis die Isopropyliden-Gruppe abgespalten war. Das Ethanol wurde verdampft, 200 ml Wasser wurden zugegeben, und das Gemisch wurde durch Gefriertrocknung getrocknet.
Synthese der Verbindung (C), 1,2-Di-O-hexadecyl-3-O-benzylglycerin (Fig. 2A): ein Gemisch von 3,46 g (0,019 Mol) Verbindung (B), 24,4 g (0,08 Mol) 1-Bromhexadecan und 11,2 g KOH wurde in 200 ml Toluol gelöst und 16 h unter Rühren unter Rückfluss gekocht, das sich bildende Wasser wurde mit Hilfe einer Dean Stark-Falle entfernt. Das gekühlte Gemisch wurde dreimal mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde einer Vakuumdestillation unterzogen um das Hexadecylbromid, das nicht reagiert hatte, zu entfernen (Kp. 105ºC/0,15 mm). Das zurückbleibende Öl (9 g, 0,014 Mol, 75%) wurde nicht weiter gereinigt.
Synthese der Verbindung (D), 1,2-di-O-Hexadecylglycerin (Fig. 2B): Verbindung (C) (5 g) in 200 ml warmem Butanol wurde mit 1 g 10%igem Palladium-auf-Holzkohle unter Wasserstoffdruck von 45 psi 10 h geschüttelt. Das Gemisch wurde dann mit 300 ml Chloroform verdünnt und filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Das vereinigte Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und der feste Rückstand wurde aus 40 ml Aceton kristallisiert, wobei 4 g (0,0074 Mol), 93% Ausbeute erhalten wurden.
Synthese der Verbindung (E), 1,2-di-O-Hexadecyl-sn-glycero3-H-phosphonatpyridiniumsalz (Fig. 2B): Eine Lösung von 1 g (0,0018 Mol) Verbindung (D) und 1 g (0,0099 Mol) Triethylamin in 20 ml Dichlormethan wurde tropfenweise über 20 min unter Rühren zu einer Lösung von 1,25 g PCl&sub3; (0,00925 Mol) in 100 ml Dichlormethan gegeben. Das Rühren wurde 30 min fortgeführt, und das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von Wasser/Pyridin (1 : 4, v/v, 100 ml) gequencht. Nach 15 min wurde Chloroform zugegeben (300 ml), und die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen (2 · 100 ml), mit Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Der feste Rückstand wurde aus Aceton kristallisiert, wobei 1 g (1,46 mMol, 81%) von (E) erhalten wurde.
Synthese der Verbindung (F), 1,2-Di-O-hexadecyl-sn-glycero3-phospho-PEG-DW-Natrium (Fig. 2B): Verbindung (E), 1 g (1,46 mMol), wurde in 50 ml Dichlormethan gelöst, und 3,5 g lyophilisierter Polyethylenglycolmonomethylether (CH3 2000 PEG-OH), 0,35 g (0,0029 Mol) Pivaloylchlorid (Kondensationsreagenz) und 1 ml Pyridin wurden hinzugegeben. Nach zehnminütigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch bis zur Trockenheit unter vermindertem Druck eingedampft. Es wurde eine Lösung von 0,8 g I&sub2; in 15 ml 1 : 1 Wasser/Pyridin zugegeben, um das H-Phosphonat zu oxidieren. Nach 10 min wurde die Oxidation durch Zugabe von 5% (100 ml) Natriumthiosulfat gestoppt. Das Lipid wurde mit 200 ml Chloroform aus der wässrigen Phase extrahiert. Die organische Schicht wurde vom Wasser getrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck eingedampft. Der feste Rückstand wurde aus Aceton kristallisiert, wobei 3,5 g (1,29 mMol, 88 %) erhalten wurden. ¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3; 6 0,7-0,8 (t, 6H), 6 1,2-1,4 (s, 52H), 6 1,45- 1,6 (m, 4H), 6 2,3-2,5 (m, 9H), 3,5-3,8 (s, 181H). ³¹P NMR ein Peak 2,8 ppm. Elementaranalyse: C % ber. 57,17%, gefunden 58,17%; H % ber. 9,6%, gefunden 10,07%. TLC: Rf = 0,7 wurde für DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;, verglichen mit Rf für PEG und DHPA von 0,75 bzw. 0,4, erhalten.

Beispiel 2: Quantifizierung des gebundenen Wassers in PEG, DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; und Dimeristoylphosphatidylcholin (DMPC)

Der Grad von gebundenem Wasser wurde mittels Wärmefluss-DSC-(Differential Scanning Calorimetry) unter Verwendung eines Mettler-Thermoanalysegerätes, Model 4000, bestimmt (Barenholz et al., 1983). Es wurde der Bereich von -30ºC bis 10ºC bei einer Rate von 2 ºC/min gescannt. Die Menge von an PEG²&sup0;&sup0;&sup0; und DTIP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; wurde aus dem Absinken der Fusionsschmelzwärme der Salzlösungen, die die zu analysierenden Stoffe enthielten, im Vergleich zu freiem Wasser und freier Salzlösung berechnet:
% an PEG gebundenem Wasser in Salzlösung = [100(ΔHfu Salzlösung - ΔHfu PEG : Salzlösung)]/ΔHfu Wasser
Ein typischer Durchlauf der Salzlösung ergab einen einzigen Peak für das Schmelzen des Wassers bei 0ºC. ΔHfu (Eis-Wasser Fusionswärme-Enthalpie) wurde aus dem Bereich des Peaks mit 275 j/gm für das Wasser in Salzlösung berechnet. Es wurden Durchläufe für reine Salzlösung und Salzlösung, die ansteigende Konzentrationen von PEG²&sup0;&sup0;&sup0; enthielten, aufgenommen. Vierzig Gewichtsprozent Polyethylenglycol 2000 bewirkten eine fast vollständiges Verschwinden des Peaks von freiem Wasser, was anzeigt, dass das Wasser fest an das PEG gebunden wird. ΔHfu des freien Wassers wurde mit 49 j/gm berechnet.
Aus der Kalibrierungskurve von ΔHfu des freien Wassers gegen PEG-Konzentrationen (Fig. 4) wurde berechnet, dass jedes PEG-Molekül 136 Moleküle Wasser bindet. Ähnliche Untersuchungen wurden mit DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;-Mizellen, mit einer Endkonzentration von 10% Gew./Gew. in Salzlösung gelöst, durchgeführt. Das ΔHfu des freien Wassers bei dieser DHP- PEG²&sup0;&sup0;&sup0;-Konzentration wurde auf 210 j/gm bestimmt, und die Berechnung der Menge gebundenen Wassers an jedes DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;-Molekül in der Mizellen-Lösung ergab 197 Moleküle. Im Vergleich zu DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; betrug der ΔHfu-Wert von freiem Wasser bei 4 mg Dimeristyrolphosphatidylcholin (DMPC) in 3,2 mg Salzlösung 165 j/gm, mit 10 Molekülen gebundenen Wassers pro Lipid-Molekül.

Beispiel 3: Bereitstellung von Liposomen für Untersuchungen zur oxidativen Belastung

Die Herstellung von kleinen, unilamellaren Liposomen erfolgte aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC 2 Lipoid KG, Ludwigshafen, Deutschland) mit einer Lipidkonzentration von 8 mM in 50 ml HEPES (20 mM) mit Salzlösungspuffer (0,09%), ph = 7,2, unter Verwendung eines Ranie 8,30 min lab. Hochdruck-Homogenisators nach einem veröffentlichten Verfahren (Haran et al.). Es wurden zwei Ansätze gemacht, der eine enthielt nur Ei-PC (Ei-PC SUV) und der zweite Ei-PC mit 3 Mol % DHP PEG²&sup0;&sup0;&sup0; (DHP PEG²&sup0;&sup0;&sup0; SUV).

Beispiel 4: Wirkung von γ-Strahlen auf die PEG-Hälfte von DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;: Untersuchungen auf Abbau und/oder Peroxid-Ansammlung

Liposomen, die 3 Mol% DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; enthielten, wurden 18 h mit 1 Mrad Strahlung bestrahlt. Die Lipide und das DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; wurden dann mit 1 ml Ethanol/1 ml Chloroform aus der wässrigen Phase extrahiert. Es wurde erwartet, dass die hydrophilen Abbauprodukte des PEG, die auf die Bestrahlung mit Gamma-Strahlung zurückzuführen waren, sich in die wässrige Phase abscheiden würden, während das DHP-PEG mit dem EPC in der organischen Phase extrahiert würde. Mehr als 95% des Phosphors (Phosphor-Bestimmung) und des PEG²&sup0;&sup0;&sup0; (¹H NMR) wurden in der Chloroform-reichen Phase wiedergefunden, was anzeigt, dass das PEG immer noch ein Teil des Lipidmoleküls war.
Die Chloroform-Phase wurde dann 2 h in einem Stickstoffstrom getrocknet und anschliessend lyophilisiert. Die getrockneten Lipide wurden in CDCl&sub3; wieder gelöst und ¹H NMR-Spektren wurden aufgenommen, um den Grad des PEG-Anteils zu bestimmen. Die ¹H NMR zeigte, dass die Schädigung des DEA-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; minimal war. Der Vergleich zwischen der Integration von Peaks bei 3,35 ppm (Methyl-Kopfgruppe vom Cholin) und bei 3,7 ppm (Polyethylengllycolmethylen-Gruppen) vor und nach der Bestrahlung zeigten, dass sich der Integrationsanteil von 1,41 auf 1,40% änderte, was anzeigt, dass der Verlust von PEG verglichen mit der Cholin-Gruppe 4,7% betrug (die Standardabweichung einer NMR- Untersuchung beträgt 3%).
Um festzustellen ob das PEG Peroxide akkumuliert, wurde DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; (6 Mol %) in Liposomen eingeschlossen, die nur aus Phospholipiden mit gesättigten Acylketten bestanden; es wurde ein 1 : 1-Gemisch aus Dimeristoyl-Phosphatidylcholin und Dimeristoyl- Phosphatidylglycerin verwendet. Die Liposomen wurden mit einer Dosis von 2,75 Mrad (54 h) bestrahlt und dann mit einem abgewandelten, mikromolar-empfindlichen spektroskopischen Verfahren (Johnson et al.) untersucht: fünfzig ul Lipide wurden in 1 ml Ethanol gelöst. Fünfzig ul einer 50%igen KI-Lösung wurden hinzugegeben, und das Gemisch wurde 30 min bei Dunkelheit inkubiert. Die Absorption bei 400 nm wurde mit einem Spektrophotometer gemessen. Es wurde keine Anhäufung von Peroxiden bei den PEG-Lipid- Molekülen nach der Bestrahlung gefunden.

Beispiel 5: Wirkung von γ-Strahlen auf Liposomen mit und ohne DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;

Liposomen mit und ohne DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; wurden ionisierender γ-Strahlung ausgesetzt. Die Liposomen wurden auf ihre Acylketten-Zusammensetzung nach der Bestrahlung untersucht wie in Material und Methoden beschrieben. Drei Arten von mehrfach ungesättigten Fettsäuren wurden überwacht (18 : 2, 20 : 4, 22 : 6). Die Fig. 5A-C zeigen das Verhältnis von ungesättigten Lipiden zum gesättigten inneren Standard, Palmitinsäure (16 : 0), die durch die Bestrahlung nicht verändert wird. Die Acylketten-Zusammensetzung vor der Bestrahlung zeigt nur einen kleinen oder keinen Unterschied in der Fettsäurenzusammensetzung zwischen den beiden Liposom-Arten, wie in Fig. 5A-C in den Kontroll-Säulen gezeigt ist.
Ionisierende Bestrahlung mit einer Dosis von 1 Mrad verursacht einen, signifikanten Verlust der PUFA in allen Liposomen; jedoch war der Verlust von Acylketten in Liposomen, die DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; enthielten, signifikant geringer als in den Liposomen, die nur Ei- Phosphatidylcholin enthielten (Fig. 5A-C). Jedes Experiment wurde sechsmal wiederholt. Der durchschnittliche Verlust von 18 : 2, 22 : 4, 22 : 6 Acylketten in den EPC-Liposomen betrug 15%, 45% bzw. 56%, während der Verlust in den PEG-Lipiden 9%, 19% bzw. 29% betrug. Wie erwartet stieg der Verlust von Acylketten mit steigendem Grad an ungesättigten Phospholipd-Acylketten in Liposomen ohne und mit DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;. Der Grad der oxidativen Schädigung war jedoch in den Vesikeln ohne das PEG-Lipid wesentlich höher.

Beispiel 6: Stabilität von Liposomen mit und ohne DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; bei Lagerung an der Luft

Liposomen mit und ohne DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; wurden für einen Zeitraum von 6 Monaten bei 4ºC inkubiert. Der Grad der Oxidation des Liposomenpräparats wurde durch die Lagerungszeitabhängige Änderung in der Acylketten-Zusammensetzung gemessen. Die Fig. 6A-B zeigen das Verhältnis von ungesättigtem Lipid zum gesättigten inneren Standard, Palmitinsäure (16 : 0), die oxidativ stabil ist. Es zeigte sich, dass die mehrfach ungesättigten Acylketten des PEG-Liposomenpräparats stabiler gegenüber einer Oxidation waren als in den Liposomen, die nur aus EPC bestanden. Liposomen mit PEG im Zeitraum von 6 Monaten 16 % bzw. 33% ihrer 20 : 4 bzw. 22 : 6 Acylketten, verglichen mit Verlusten von 27% bzw. 45% in Liposomen, denen Polyethylenglycol fehlte (Fig. 6A-B).
Liposomen mit und ohne DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0;, die für 4 Monate gelagert worden waren, wurden dann für 4 Tage bei 37ºC inkubiert, um den Abbau zu beschleunigen. Fig. 7 zeigt den Betrag zusätzlichen Verlustes von PUFA unter dieser beschleunigten Oxidation. Der Verlust betrug 19% bzw. 27% für die 20 : 4 bzw. 22 : 6 Acylketten bei Vesikeln, denen DHP-PEG²&sup0;&sup0;&sup0; fehlte, während der Verlust in den PEG-Liposomen geringer war (5% bzw. 6% für die 20 : 4 bzw. 22 : 6 Fettsäuren).

Beispiel 7: Bildung von SUVs, die PEG-Lipide enthalten

Ein Gemisch von 10 g Sojabohnen-Lecithin und 2,5 g PEG-Lipid wurde in 100 ml sterilem destilliertem Wasser dispergiert, anschliessend 5 min unter hohem Druck bei 10000 psi homogenisiert. Die gebildeten Liposomen sind fast alle unilamellar mit Grössen < 100 nm. Diese Liposomen wurden als Basis für die Feuchtigkeit spendenden Präparate für die Haut verwendet, wie in den nachstehenden Beispielen 13 und 14 beschrieben.

Beispiel 8: Bildung und Verkleinerung von Liposomen, die ein Antioxidans und/oder ein UV- blockierendes Agens eingeschlossen haben

Ein Gemisch von 10 g Ei-Lecithin und 2,5 g PEG-Lipid, enthaltend ein Antioxidans, wie 0,2 Mol% Vitamin E, butyliertes Hydroxytoluol oder Ascrobylpalmitat, und/oder ein UVblockierendes Agens, wie 2-Ethylhexyl-p-methoxycinnamat, 2- Hydroxy-4-methoxy-4'- methylbenzophenon oder 2-Ethylhexyl-p-dimethylaminbenzoat, enthält, wurde in 30 ml Chloroform gelöst. Das Lösungsmittel wurde mit Blitz-Verdampfung entfernt. Durch Zugabe von 100 ml destilliertem Wasser, das einen Chelafor, wie EDTA oder DTPA enthielt, und Schütteln der wässrigen Phase mit der Lipidschicht wurden grosse, multilamellare Liposomen hergestellt. Die Verkleinerung der Liposomen auf eine gewünschte Grösse wurde durch Extrusion (3 Mal) der multilamellaren Liposomen durch einen Polycarbonatfilter mit der Porengrösse von 1 Micron, 600 nm, 400 nm, 200 nm, 100 nm und 50 nm erreicht. Der Druck wurde der Grösse der Filterporen angepasst. Die unterschiedlich grossen Liposomen wurden in Feuchtigkeit spendenden Formulierungen verwendet, wie in den nachstehenden Beispielen 13 und 14 beschrieben.

Beispiel 9: Bildung und Verkleinerung von Liposomen, die ein Konservierungsmittel eingeschlossen haben

Ein Gemisch von 100 g Sojabohnen-Lecithin und 25 g PEG-Lipid wurde in 1,01 destilliertem Wasser dispergiert. Ein Konservierungsmittel wie etwa Bronopol, Paraben oder Germall oder ein Gemisch von Konservierungsstoffen in bakteriostatischer Konzentration wurde hinzugegeben. Die Liposomenverkleinerung wurde mittels Hochdruck-Homogenisation, wie in Beispiel 7 beschrieben, durchgeführt, wobei Liposomen mit einer durchschnittlichen Grösse < 100 nm erhalten wurden. Gummen wie Natriumalginat, Acacia oder Chondrus wurden gegebenenfalls zu der liposomalen Dispersion hinzugegeben.

Beispiel 10: Bildung einer mizellaren Dispersion

5 g PEG-Lipid wurden in destilliertem Wasser dispergiert, um eine mizellare Dispersion als eine Basis für ein Feuchtigkeit spendendes Hydrogel oder eine Feuchtigkeit spendende Creme zu erhalten.

Beispiel 11: Bildung eines liposomalen Hydrogels

Ein Verdickungsmittel wie Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Veegum K wurde zu der liposomalen Dispersion, die in Beispiel 9 hergestellt wurde, hinzugegeben, um die gewünschte Viskosität zu erhalten. Das liposomale Hydrogel wird Feuchtigkeit spendend auf der Haut von Gesicht und Körper angewendet.

Beispiel 12: Bildung eines mizellaren Hydrogels

Ein Verdickungsmittel wie Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Veegum K wurde zu der mizellaren Dispersion, die in Beispiel 9 hergestellt wurde, hinzugegeben, um die gewünschte Viskosität zu erhalten. Das mizellare Hydrogel wird Feuchtigkeit spendend auf der Haut von Gesicht und Körper angewendet.

Beispiel 13: Herstellung eines liposomalen Feuchtigkeit spendenden Hydrogels für die Anwendung auf Gesicht oder Körper

Das Gemisch der Lipide aus Beispiel 7 wurde in 50 ml Ethanol zusammen mit einem Antioxidans (Beispiel 8), einem Konservierungsmittel (Beispiel 9) und einem Pflanzenextrakt wie etwa Rosenextrakt zur Reinigung und Stärkung, Kampherextrakt für die Anregung und Belebung der Haut, Kamillenextrakt für die Glättung oder einem Kräuterextrakt. Die ethanolische Lösung wurde mit einer Rate von 0,1 ml/min in 1 Liter gerührtes bidestilliertes Wasser injiziert. Die gebildeten Liopsomen (durchschnittliche Grösse < 100 nm) wurden in einem Hydrogel wie in Beispiel 12 beschrieben verwendet. Diese Herstellung wird verwendet, um dem Gesicht und anderen Körperteilen Feuchtigkeit zu spenden.

Beispiel 14: Bildung einer liposomalen Dispersion, die Kollagen/Elastin eingeschlossen hat, zur Anwendung als Hautlotion

100 ml kleine unilamellare Liposomen (Grösse < 50 nm) mit 10 Gew.-% Sojabohnen-Lipid/2,5 Gew.-% PEG-Lipid wurden in sterilem, bidestilliertem Wasser hergestellt. Diese Liposomen wurden mit einer 100 ml Lösung aus einem Gemisch von Kollagen und Elastin bei einer Proteinkonzentration im Bereich von 0,05 bis 2,0% colyophilisiert. Das trockene Pulver wurde in einem endgültigen Volumen von 100 ml Wasser oder Puffer bei dem gewünschten pH-Wert dispergiert. Die gebildeten multilamellaren Liposomen wurden entweder durch Hochdruck-Homogenisation wie in Beispiel 7 beschrieben oder durch serielle Extrusion wie in Beispiel 8 beschrieben verkleinert. Diese liposomalen Feuchtigkeitsspender werden verwendet, um Hautlotionen zu ersetzen.

Beispiel 15: Bildung einer mizellaren Dispersion, die Kollagen/Elastin eingeschlossen hat, zur Anwendung als Hautlotion

100 ml mizellare Dispersion wurden in bidestilliertem Wasser hergestellt, wie in vorstehendem Beispiel 10. Diese mizellare Dispersion wurde mit 100 ml einer Lösung, die ein Gemisch aus Kollagen und Elastin bei einer Proteinkonzentration im Bereich von 0,05 bis 2,0% enthielt, colyophilisiert. Das trockene Pulver wurde in einem endgültigen Volumen von 100 ml Wasser oder Puffer bei dem gewünschten pH-Wert dispergiert. Das Feuchtigkeit spendende Hydrogel wurde verwendet, um Hautlotionen zu ersetzen.

Claims

1. Dialkylether-verknüpftes Phospholipid mit einer Phosphat enthaltenden polaren Kopfgruppe, die mit einer Polyethylenglycol (PEG)-Kette mit einem Molekulargewicht zwischen 2.000 und 10.000 Dalton derivatisiert ist.

2. Phospholipid nach Anspruch 1, umfassend Ether-verknüpfte C&sub1;&sub6; bis C&sub2;&sub4;- Alkyl- oder -Alkenyl-Ketten.

3. Phospholipid nach Anspruch 1 oder 2, wobei die polare Kopfgruppe neutral geladen ist.

4. Phospholipid nach Anspruch 3, wobei die polare Kopfgruppe einen Niederalkylphosphatester enthält.

5. Phospholipid nach Anspruch 1 oder 2, wobei die polare Kopfgruppe negativ geladen ist.

6. Phospholipid nach Anspruch 5, wobei die polare Kopfgruppe eine Phosphatgruppe enthält.

7. Phospholipid nach Anspruch 1 oder 2, wobei die polare Kopfgruppe positiv geladen ist.

8. Phospholipid nach Anspruch 7, wobei die polare Kopfgruppe einen Niederalkylphosphatester enthält, der mit einem geladenen Amin endet.

9. Phospholipid nach einem Ansprüche 1 bis 8, wobei die PEG-Kette ein Molekulargewicht zwischen 2.000 und 5.000 Dalton besitzt.

10. Kosmetische Zusammensetzung, umfassend ein wässriges Suspensionsmedium und in dem Medium suspendierte liposomale oder mizellare Teilchen, umfassend

1 bis 25 Molprozent des Ether-verknüpften Phospholipids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und der Rest Vesikel bildende Lipide, im Fall der liposomalen Teilchen und

mehr als 25 Molprozent des Ether-verknüpften Phospholipids und der Rest Vesikel bildende Lipide, im Fall der mizellaren Teilchen.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Ionenstärke des wässrigen Trägers weniger als etwa 10 mM Salz beträgt und die Lipidkonzentration zwischen etwa 5 mM und etwa 200 mM liegt.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Lipidkonzentration zwischen etwa 50 mM und etwa 150 mM liegt.

13. Zusammensetzung nach einem den Ansprüche 10 bis 12, darüber hinaus umfassend eine oder mehrere Komponenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus UV-absorbierenden Verbindungen, Antioxidantien, Konservierungsmitteln, Verdickungsmitteln, Befeuchtungsmitteln, Farben, Düften, Emollientia, Füllstoffen, Kollagen, Elastin, Vitaminen, Enzymen, Antibiotika und Bakteriziden.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13 zur Verwendung als Sonnenschutz-Zusammensetzung, umfassend eine UV-absorbierende Verbindung.

15. Kosmetische Zusammensetzung nach Anspruch 10 zur Verwendung in Augentropfen, darüber hinaus umfassend eine oder mehrere funktionelle Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: isotonisierenden Agenzien, Konservierungsmitteln, Pufferagenzien, die Viskosität erhöhenden Agenzien, solubilizierenden Agenzien, und Stabilisatoren wobei die Zusammensetzung einen pH-Wert zwischen etwa 5,0 und etwa 8,0 besitzt.

16. Verwendung einer wässrigen Suspension von liposomalen oder mizellaren Teilchen, umfassend

1 bis 25 Molprozent eines- Dialkylkettenlipids, das mit einer Polyethylenglykol (PEG)-Kette mit einem Molekulargewicht zwischen 750 und 10.000 Dalton derivatisiert ist und der Rest Vesikel bildende Lipide, im Fall der liposomalen Teilchen und

mehr als 25 Molprozent des Dialkylkettenlipids und der Rest Vesikelbildende Lipide, im Fall der mizellaren Teilchen,

zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung zum Schutz der Haut gegen Strahlungschäden.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Dialkylkettenlipid ein Dialkylether-verknüpftes Phospholipid ist.

18. Topische Liposomenzusammensetzung, umfassend etwa 1 bis 10 Molprozent eines Dialkylether-verknüpften Phospholipids, das eine polare Kopfgruppe besitzt, die derivatisiert ist mit einer Polyethylenglykolkette, die ein Molekulargewicht von etwa 2.000 bis 10.000 Dalton besitzt, und der Rest Vesikel bildende Lipide, wobei das derivatisierte Ether-verknüpfte Phospholipid die Lipidbestandteile in der Liposomenzusammensetzung vor oxidativer Schädigung schützt.