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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung eines oral
verabreichbaren Medikaments für
die Behandlung von Krebs.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Inzidenz vieler Formen von Krebs steigt vermutlich an, wenn die
Population altert. Prostatakrebs ist z. B. der am häufigsten
diagnostizierte Krebs bei Männern
in den Vereinigten Staaten wie auch der zweite Hauptgrund für Krebstote
bei Männern.
Es wird vorhergesagt, dass es 1994 200.000 neue Fälle von
diagnostiziertem Prostatakrebs geben wird, wie auch 38.000 Prostatakrebstote
und es wird angenommen, dass diese Zahlen weiter ansteigen werden,
wenn die Population altert. Ungefähr 50% der mit Prostatakrebs
diagnostizierten Patienten haben eine Krankheit, die aus der Prostata
ausgebrochen ist oder ausbrechen wird. Prostatakrebs metastasiert
ins Skelettsystem und Patienten sterben typischerweise mit einer überwältigenden
Knochen-Metastasen-Erkrankung. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt gibt es keine
effektive heilende Therapie und eine sehr geringe Palliativtherapie
für Patienten
mit metastatischen Erkrankungen.
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Der
Prozess der Tumorzell-Metastase erfordert, dass Zellen sich vom
primären
Tumor entfernen, in die Grundmembran eindringen, Blutstrom von Tumorzellembolie überqueren,
mit dem vaskulären Endothel
des Zielorgans in Wechselwirkung treten, aus dem Blutgefäß austreten
und proliferieren, um sekundäre
Tumorkolonien zu bilden, wie beschrieben von E. C. Kohn, Anticancer
Re., 13, 2553 (1993); und L. A. Kiotta, P. S. Steeg, W. G. Stettler-Stevenson, Cell 64,
327 (1991).
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Es
wird allgemein akzeptiert, dass viele Stufen der Metastasenkaskade
zelluläre
Wechselwirkungen involvieren, die durch Zelloberflächenbestandteile
vermittelt werden, wie z. B. Kohlehydrat-Bindungsproteine, die Galactosidbindungslectine (Galectine)
beinhalten, wie beschrieben von A. Raz, R. Lotan, Cancer Metastasis
Rev. 6, 433 (1987); und H. J. Gabius, Biochim Biophys Acta 1071,
1 (1991). Die Behandlung von B16-Melanom und uv-2237- Fibrosarcomzellen
in vitro mit Anti-Galectin-monoklonalen Antikörpern vor ihrer intravenösen (i.
v.) Injektion in die Schwanzvene von syngenen Mäusen führte zu einer deutlichen Inhibition
der Tumor-Lungen-Kolonie-Entwicklung, wie beschrieben von L. Meromsky, R.
Lotan, A. Raz, Cancer Res. 46, 5270 (1991). Die Transfektion von
niedrig-metastatischen wenig Galectin-3 exprimierenden uv-2237-c115-Fibrosarcomzellen
mit Galectin-3 cDNA führte
zu einem Anstieg des metastatischen Phänotyps der transfizierten Zellen,
wie beschrieben von A. Raz, D. Zhu, V. Hogan, J. Shah, T. Raz, R.
Karkash, G. Pazerini, P. Carmi, Int. J Cancer 46, 871 (1990). Weiterhin
wurde eine Korrelation zwischen dem Niveau der Galectin-3-Expression
in menschlichem Papillär-Thyroid-Karzinom und
der Tumorstufe von menschlichen Colorectal- und Magenkarzinomen
etabliert, wie beschrieben von L. Chiariotti, M. T. Berlinjieri,
P. DeRosa, C. Battaglia, N. Berger, C. B. Bruni, A. Fusco, Omeogene
7, 2507 (1992); L. Irimura, Y. Matsushite, R. C. Sutton, D. Carralero,
D. W. Ohanesian, K. R. Cleary, D. M. Ota, Int J Cancer 51, 387 (1991);
R. Lotan, H. Ito, W. Yasui, H. Yokozak, D. Lotan, E. Tahara, Int
J Cancer 56, 474 (1994); und M. M. Lotz, C. W. Andrews, C. A. Korzelius,
E. C. Lee, G. D. Steele, A. Clarke, A. M. Mercurio, PNAS, U.S.A.
90, 3466 (1993).
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Einfache
Zucker, wie z. B. Methyl-α-D-Lactosid
und Lacto-N-Tetrose haben nachgewiesenermaßen die Metastase von B16-Melanomzellen
inhibiert, während
D-Galactose und Arabinogalactose die Lebermetastasen von L-1-Sarcomzellen
inhibierten, wie beschrieben von J. Beauth et al., J Cancer Res Clin
Oncol 113, 51 (1987).
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Es
ist bekannt, dass die intravenöse
Injektion von B16-F1 murinen Melanomzellen mit Zitruspektin oder
modifiziertem Zitruspektin in syngene Mäuse zu einem signifikanten
Anstieg bzw. einer Abnahme der Lungenkolonisierung führte, beschrieben
in D. Platt und A. Raz, J. Natl Cancer Inst. 84: 438–42 (1992).
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Im
Journal of the National Cancer Institute, Band 84(6) 1992, Seiten
438–442
wird ein modifiziertes Pektin für
eine intravenöse
Verabreichung offenbart. Dieser Artikel schlägt keinen Einbau des Pektins in
eine Zusammensetzung vor, die oral aufnehmbar ist.
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US-A-4,950,655
offenbart pharmazeutische Zusammensetzungen für die Behandlung oder Verhinderung
von Durchfall, enthaltend Zitruspektin. Dieses Dokument umfasst
keine Offenbarung, die ein modifiziertes Pektin betrifft oder die
Möglichkeit,
Pektin oder ein modifiziertes Pektin oral zu verdauen. Vor der hier
offenbarten Entdeckung existierte keine effektive Behand lung für die Inhibition
einer Krebsmetastase unter Verwendung eines nicht-zytotoxischen Mittels
durch orale Verabreichung. Daher besteht ein Bedarf an einer Therapie,
die auf der oralen Verabreichung eines nicht-zytotoxischen Mittels basiert.
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Zusammenfassung der Erfindung
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines
modifizierten Zitruspektins für
die Herstellung eines oral verabreichbaren Medikaments für die Behandlung
von Krebs bereit, vorzugsweise wasserlösliches, pH-modifiziertes Zitruspektin,
wie hier beschrieben, um Metastasen zu inhibieren.
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In
einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische
Zusammensetzung bereit, die eine Mischung eines modifizierten Zitruspektins
umfasst, vorzugsweise pH-modifiziertes Zitruspektin und einen pharmazeutisch
akzeptablen, verdaubaren Träger
für die
orale Verabreichung.
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Gemäß noch einem
weiteren Aspekt werden die Verwendung und Zusammensetzungen der
vorliegenden Erfindung für
die therapeutische Behandlung von Prostatakrebs beim Menschen sowie
bei anderen Säugern
verwendet, um Metastasen von Primärtumoren zu inhibieren.
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Dementsprechend
stellt die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform
eine neue Verwendung bereit, worin die orale Aufnahme eines nichtzytotoxischen
natürlichen
komplexen Kohlenhydrats, das reich an Galactosidresten ist, d. h. modifiziertes
Zitruspektin (MCP), vorzugsweise pH-modifiziertes CP, als potenter Inhibitor
von spontanen Prostata-Karzinom-Metastasen
wirkt.
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Wenn
gemäß der vorliegenden
Erfindung behandelt wird, konnten 7 von 16 tumortragenden Ratten
bei der Autopsie als krankheitsfrei beobachtet werden (keine sichtbaren
Metastasen in Lymphknoten oder Lungen), folgend auf die Entfernung
des Primärtumors
am Tag 14 nach einer Inokulation von 106 Dunning-Ratten-Prostata-Adenokarzinom-MLL-Zellen,
während
16 von 16 der Ratten in der Kontrollgruppe Metastasen aufwiesen.
Die Anzahl von Tumor-Lungen-Kolonien
in den verbleibenden Tieren war deutlich durch orale Aufnahme von
1% (G/V) MCP im Vergleich mit der Kontrollgruppe (Kontrolle 9 ± 4; 1%
MCP, 1 ± 1)
reduziert, ohne Wirkung auf das Wachstum der primären Tumore.
In vitro inhibierte MCP die MLL-Zelladhäsion an Ratten-Endothelzellen
in einer zeit- und dosisabhängigen
Weise wie auch ihre Koloniebildung in halbfestem Medium. Der mögliche Wirkungsmechanismus
von MCP scheint Tumorzelloberflächen-Kohlenhydrat-Bindungsproteine
zu involvieren.
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So
stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung von MCP bereit,
eines nicht-toxischen Arzneimittels mit einem einzigartigen Wirkungsmechanismus,
der in der erfolgreichen Inhibition der Tumorzellverteilung resultiert,
für die
Behandlung von Krebs durch orale Verabreichung. Zusätzlich stellt
die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung für die Behandlung von Säugerkrebs
bereit, umfassend MCP in Kombination mit einem oralen pharmazeutischen
Träger.
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1A ist
eine Grafik, die illustriert, dass die Anzahl von Ratten, die an
Lungenmetastasen litten, im Vergleich mit einer Kontrolle bei 0,1%
MCP und 1,0% MCP deutlich reduziert waren.
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1B ist
eine Grafik, die illustriert, dass die Lungen der 1,0% MCP-behandelten
Tiere deutlich weniger metastatische Kolonien als die Kontrollgruppen
aufwiesen.
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1C ist
eine Mikrofotografie von Lungen von Kontrollratten.
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1D ist
eine Mikrofotografie von Lungen von 1,0% MCP-Ratten.
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2 ist
ein Auftrag einer Zelloberflächenfärbung und
einer Westernblot-Analyse (Inset) für die Expression von Ratten-Galectin-3
in MLL-Zellen.
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3A ist
eine Grafik, die die Anbindung von MLL-Zellen in Abwesenheit oder
Gegenwart verschiedener Konzentrationen von MCP für 90 Minuten bei
4°C illustriert.
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3B ist
eine Grafik, die den Zeitverlauf für die Anbindung von MLL-Zellen
an einen konfluente Monolayer von RAEC in Abwesenheit (-----) oder
Gegenwart von 0,03% G/V MCP illustriert.
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3C ist
eine Mikrofotografie von fluoreszierenden MLL-Zelladhäsionen an RAEC-Zellen in Abwesenheit
von MCP.
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3D ist
eine Mikrofotografie von fluoreszierenden MLL-Zellenadhäsionen an RAEC-Zellen in Gegenwart
von 0,1% G/V MCP.
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4A ist
eine Grafik, die die Wirkung von MCP auf die MLL-Koloniebildung in 0,5% Agarose illustriert.
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4B ist
eine Phasenkontrast-Mikrofotografie von MLL-Zellen, gezüchtet ohne
MCP.
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4C ist
eine Phasenkontrast-Mikrofotografie von MLL-Zellen, gezüchtet mit
0,1% (G/V) MCP.
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5 ist
eine Mikrofotografie von menschlichem primärem Prostata-Adenokarzinomgewebe, die
die Gegenwart von Galectin-3 illustriert.
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6 ist
eine Grafik, die die Wirkungen von CP und MCP auf die B16F1-Adhäsion an
Laminin in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von CP (0)
oder MCP (0) illustriert. Vertikale Säulen zeigen die mittlere ± Standardabweichung,
berechnet von der t-Verteilung des Mittels.
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7A ist
eine Phasenkontrast-Mikrofotografie von B16F1-Zellen, plattiert
auf Laminin. Die Zellen wurden nur in DMEM kultiviert.
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7B ist
eine Phasenkontrast-Mikrofotografie von B16F1-Zellen, plattiert
auf Laminin, kultiviert in Gegenwart von 0,5% CP und DMEM.
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7C ist
eine Phasenkontrast-Mikrofotografie von B16F1-Zellen, plattiert
auf Laminin, kultiviert in Gegenwart von 0,5% MCP und DMEM.
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8 ist
eine Grafik, die die Wirkungen von CP und MCP auf die Asialofetuin-induzierte
homotypische Aggregation in Gegenwart von 20 μg/ml Asialofetuin allein (A)
oder mit zugefügtem
0,5% CP (B) oder 0,5% MCP (C) illustriert. Vertikale Säulen zeigen die
mittlere Standardabweichung, berechnet von der t-Verteilung des
Mittels.
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9A ist
eine Phasenkontrast-Mikrofotografie einer homotypischen Aggregation
von B16-F1-Zellen in Gegenwart von nur 20 μg/ml Asialofetuin.
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9B ist
eine Phasenkontrast-Mikrofotografie einer homotypischen Aggregation
von B16-F2-Zellen in Gegenwart von 0,5% CP und Asialofetuin.
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9C ist
eine Phasenkontrast-Mikrofotografie einer homotypischen Aggregation
von B16-F2-Zellen in Gegenwart von 0,5% MCP und Asialofetuin.
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10 ist
eine Grafik, die die Bindung von Galectin-3 an MCP-beschichtete Vertiefungen
illustriert.
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11 ist
eine Grafik, die die Wirkungen von CP und MCP auf die Fähigkeit
von B16F1-Zellen zur Bildung von Kolonien in 0,5% Agarose (CP 0
MCP 0) illustriert.
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Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Wie
hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "therapeutische" Behandlung eine orale Verabreichung
einer bestimmten Menge an modifiziertem Zitruspektin an ein Subjekt,
nachdem bei dem Subjekt Krebs diagnostiziert wurde, wobei diese
effektiv ist, um das Überleben
des Subjekts zu verlängern.
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Wie
hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "Krebs" jede neoplastische Störung, einschließlich zellulärer Störungen,
wie z. B. Nierenzellkrebs, Kaposi-Sarkom, chronischer Leukämie, Brustkrebs, Sarkom,
Krebs der Eierstöcke,
Rektalkrebs, Kehlkopfkrebs, Melanom, Colonkrebs, Blasenkrebs, Mastocytom,
Lungenkrebs, Brustadenokarzinom, squamöses Zellpharynxkarzinom und
Gastrointestinal- oder Magenkrebs. Vorzugsweise ist der Krebs, der
in der vorliegenden Erfindung behandelt wird, menschlicher Prostatakrebs,
besonders bevorzugt Adenokarzinom der menschlichen Prostata.
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Die
hier verwendeten Abkürzungen
sind: CP: natürliches
Zitruspektin; MCP: pH-modifiziertes CP; EHS: Englebreth-Holm Swarm;
DMEM: Dulbecco's modifiziertes
Eagle-Minimal-Essential-Medium; CMF-PBS: Ca2+-
und MG2+-freie phosphatgepufferte Salzlösung, pH
7,2; BSA: bovines Serumalbumin.
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Früher wurde
die Wirkung von Zitruspektin (CP), einem komplexen Polysaccharid,
das reich an Galactosylresten ist und seines pH-modifizierten Derivats
(MCP) auf die experimentelle Metastase von B16-Melanom, wie in dem
Artikel Modulation of the Lung Colonization of B16-F1 Melanoma Cells
by Citrus Pectin, Journal of the National Cancer Institute, Band
84, Nr. 6, 18. März
1992, beschrieben, dessen gesamte Offenbarung hier durch Inbezugnahme
inkorporiert ist, analysiert. Es wurde festgestellt, dass die gleichzeitige
Injektion von MCP mit den B16-F1-Zellen intravenös zu einer deutlichen Inhibition
ihrer Fähigkeit
zur Kolonisierung der Lungen der injizierten Mäuse führte. Eine pH-Modifikation
von CP, wie hiernach genauer beschrieben werden wird, führt zu der
Erzeugung von kleineren, nicht-verzweigten
Kohlenhydratketten von ähnlicher
Zuckerzusammensetzung, wie das nicht-modifizierte CP. MCP scheint
sowohl in vitro als auch in vivo nicht toxisch zu sein.
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Das
in der vorliegenden Erfindung verwendete modifizierte Pektin wird
durch teilweise Depolymerisation von Zitruspektin, vorzugsweise
durch pH-Modifikation
hergestellt.
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Wie
der Fachmann verstehen wird, hat unmodifiziertes Pektin einen Molekulargewichtsbereich von
ungefähr
20.000 bis 400.000. Es handelt sich um eine Polysaccharidsubstanz,
die in den Zellwänden aller
Pflanzengewebe vorliegt, und dort als interzelluläres Zementmaterial
wirkt. Eine der reichsten Quellen von Pektin ist die Rinde (Schale)
von Zitronen oder Orangen, die ungefähr 30% dieses Polysaccharids
enthält.
Es tritt natürlich
als Teil-Methylester von a-(1-4) verbundenen
D-Polygalacturonatsequenzen auf, unterbrochen durch (1-2)-L-Rhamnosereste.
Die neutralen Zucker, D-Galactose, L-Arabinose, D-Xylose und L-Fucose
bilden Seitenketten an dem Pektinmolekül. Strukturstudien wurden von
D. A. Rees, A. W. Wight, J. Chem. Soc. B, 1971, 1366 durchgeführt. Die
Sekundär-
und Tertiärstruktur
in Lösung
und in den Gelen wird beschrieben von D. A. Rees, E. J. Welsh, Angew.
Chem. Int. Ed. 16, 214 (1977). Ein Überblick und eine Bibliografie
sind von Towle, Christensen, in Industrial Gums, R. L. Whistler,
Ed. (Academic Press, New York, 2. Auflage, 1973) Seiten 429–461 erhältlich.
Ein besonders interessantes Buch über Pektine ist dasjenige von
Z. I. Kertesz, The Pectic Substances (Interscience, New York, 1951).
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Pektin
tritt als grobes oder feines Pulver mit einer gelblich weißen Farbe
auf, ist im wesentlichen geruchsfrei und hat einen schleimigen Geschmack. Es
ist in 20 Teilen Wasser fast vollständig löslich, bildet eine viskose
Lösung,
die negativ geladene, sehr hydratisierte Teilchen enthält. Es ist
gegenüber
Litmus sauer und unlöslich
in Alkohol oder in verdünntem
Alkohol und in anderen organischen Lösungsmitteln. In Wasser löst es sich
einfacher, wenn es zunächst
mit Alkohol, Glycerin oder Zuckersirup angefeuchtet wird oder wenn
es zunächst
mit drei oder mehr Teilen Saccharose vermischt wird. Unter schwach
sauren Bedingungen ist es stabil; stärker saure oder basische Bedingungen
führen
zu einer Depolymerisation.
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Ein
bevorzugtes Pektin zur Verwendung als Ausgangsmaterial für die Herstellung
eines pH-modifizierten Zitruspektins zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung kann von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, erhalten
werden. Dieses Material weist eine Molekularmasse von 70 bis 100
kd auf, sowie ungefähr
85 Gew.-% Galacturonsäure
und 9,5 Gew.-% Methoxylgruppen und enthält weniger als ungefähr 10 Gew.-%
Feuchtigkeit. Es ist als Pulver erhältlich. Zitruspektin ist auch
von ICN Biomedicals als Pektin 102587 RT erhältlich.
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Eine
0,5%ige und noch bevorzugter eine 1,0%ige G/V wässrige Lösung (alle hier angegebenen
Lösungskonzentrationen
werden als G/V ausgedrückt,
wenn nicht: anders angegeben) des Zitruspektins wird hergestellt
und unter UV-Bestrahlung für ungefähr 48 Stunden
sterilisiert. Um das Pektin teilweise zu depolymerisieren, wird
die Pektinlösung durch
Anheben des pH's
auf 10,0 durch NaOH (3 N) für
30 Minuten modifiziert und dann Vermindern des pH's auf 3,0 mit HCl
(3 N) gemäß dem von
Alberscheim et al. beschriebenen Verfahren "A Method for Analysis of Sugars in Plant
Cell Wall Polysaccharides by Gas Liquid Chromatography", Carbohydrate Research,
5: 340–346,
1967, dessen gesaamte Offenbarung hier durch Inbezugnahme inkorporiert
ist. Nach ungefähr
10 bis 24 Stunden wird der pH der Lösung auf ungefähr 6,3 äquilibriert.
Die Lösung
wird dann mit Ethanol (705) gewaschen und mit Aceton (100) getrocknet.
Dies führt
zu im wesentlichen demethoxylierten Pektinfragmenten mit einer durchschnittlichen
molekularen Masse von ungefähr
10 kd, bestimmt durch Viskositätsmessungen
bei 25°C
in einem Ubbelohde Nr. 1 Viskometer mit Natriumhexametalphosphat
bei 20 mM (pH 4,5), 0,2% EDTA und (0,9%) NaCl gemäß dem Verfahren
von Christensen in dem Artikel "Methods
of Grading Pectin in Relation to the Molecular Weight (intrinsic
viscosity of pectin)", Food
Research 19: 163–165
(1954), dessen gesamte Offenbarung hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist.
Wie hier verwendet, soll "modifiziertes
Pektin" und "MCP" depolymerisiertes
Pektin bezeichnen. Besonders bevorzugt weist das in der vorliegenden
Erfindung verwendete modifizierte Pektin eine Molekularmasse von
ungefähr
1 bis 15 kd und noch bevorzugter ungefähr 10 kd auf und wird vorzugsweise
gemäß dem oben
dargestellten Protokoll hergestellt und ist vorzugsweise wasserlöslich. Die
getrockneten MCP-Fragmente können
dann mit Ca2+- und Mg2+-freier
phosphatgepufferter Salzlösung
(pH 7,2) (CMF-PBS) zu einer schließlichen Lagerlösung von 0,5%
(G/V) rehydratisiert werden.
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Wie
festgehalten, wird MCP in der vorliegenden Erfindung oral verabreicht
und daher stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung
bereit, die MCP und einen verdaubaren pharmazeutischen Träger enthält. Geeignete
verdaubare pharmazeutische Träger
beinhalten Gelatinekapseln, worin das MCP in trockener Form verkapselt
wird oder Tabletten, worin MCP mit Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose,
Magnesiumstearat, mikrokristalliner Cellulose, Propylenglykol, Zinkstearat
und Titandioxid und ähnlichen
vermischt ist. Die Zusammensetzung kann unter Verwendung von gereinigtem
Wasser als Flüssigkeit
formuliert sein sowie mit Geschmacksmitteln und Saccharose als verdaubarem
Träger,
um eine angenehm schmeckende Zusammensetzung zu ergeben, wenn sie
von dem Subjekt konsumiert wird.
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Die
präzise
Dosis und die Behandlungsvorschrift sind eine Funktion von Variablen,
wie z. B. dem Alter, Gewicht, der Anamnese und ähnlichen des betroffenen Subjekts.
Die bevorzugte Dosis und die bevorzugte Behandlungsvorschrift, basierend
auf dem Gewicht des MCP-Bestandteils (d. h. ohne Einbeziehung des
verdaubaren Trägers),
effektiv für
die Behandlung von Krebs, ist eine tägliche Dosis von ungefähr 10 bis
ungefähr
1.000 mg pro kg Körpergewicht
des Betroffenen. Das MCP wird oral in gleichen Abständen verabreicht,
d. h. von ungefähr
10 bis ungefähr
1.000 mg/kg alle 24 Stunden und/oder 2,5 bis 250 mg/kg alle 6 Stunden.
Dieselbe Dosierung und dieselbe Behandlungsvorschrift wird für die Verwendung
bei der Behandlung von Prostatakrebs bei Säugern, einschließlich menschlichem
Prostatakrebs, bevorzugt, um die Metastasen zu reduzieren oder zu inhibieren.
Es wird angenommen, dass dieselbe Dosis und dieselbe Behandlungsvorschrift
für die
Verhinderung von Krebs bei Säugersubjekten
mit hohem Risiko effektiv sein wird, wenn sie als orale prophylaktische
Zusammensetzung verabreicht wird.
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Beispiele
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Die
verschiedenen Aspekte der Erfindung werden weiter durch die folgenden
Beispiele beschrieben, die die Erfindung in keiner Weise begrenzen
sollen.
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Das
Dunning (R3327)-Ratten-Prostata-Adenokarzinom-Modell für Prostatakrebs
wurde von Dunning aus spontan auftretenden Adenokarzinomen entwickelt,
die bei männlichen
Ratten angetroffen wurden, wie beschrieben von W. F. Dunning, Natl Cancer
Inst Mono 12, 351 (1963). Etliche Unterlinien wurden von dem primären Tumor
entwickelt, die verschiedene Differenzierungs- und metastatische Eigenschaften aufweisen,
wie beschrieben von J. T. Isaacs, W. D. W. Heston, R. M. Weissman,
D. S. Coffey, Cancer Res 38, 4353 (1978). Die MAT-LyLu (MLL)-Subzellinie
ist eine schnell wachsende, schlecht differenzierte Adenokarzinomzellinie,
die bei Injektion von 1 × 106 MLL-Zellen
in die Oberschenkel von Ratten zum Tod des Tiers innerhalb von ungefähr 25 Tagen
sekundär
zu überwältigenden
primären
Tumoren führt,
wie beschrieben von J. T. Isaacs, W. B. Isaacs, W. F. J. Feitz,
J. Scheres, The Prostate 9, 261 (1986); und K. J. Pienta, B. C.
Murphy, W. B. Isaacs, J. T. Isaacs, D. S. Coffey, The Prostate 20,
233 (1992). Der primäre
MLL-Tumor beginnt mit den Metastasen ungefähr 12 Tage nach der Tumorzellinokulation
und die Entfernung des primären
Tumors durch Amputation der Gliedmaßen vor diesem Zeitpunkt führt zu einer
Heilung des Tiers. Wenn die Amputation nach Tag 12 durchgeführt wird,
sterben die meisten der Tiere innerhalb von 40 Tagen an Lungen-
und Lymphknotenmetastasen, wie beschrieben von K. J. Pienta, B.
C. Murphy, W. B. Isaacs, J. T. Isaacs, D. S. Coffey, The Prostate
20, 233 (1992).
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In
der vorliegenden Erfindung beeinflusst lösliches MCP, das oral im Trinkwasser
auf chronischer Basis verabreicht wird, die Fähigkeit des MLL-Tumors, spontane
Metastasen zu bilden.
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Um
die vorliegende Erfindung deutlicher zu illustrieren und unter Bezugnahme
auf 1A der Zeichnungen wurden Ratten 1 × 106 MLL-Zellen in das Hinterbein am Tag 0 injiziert.
Am Tag 4, wenn die primären
Tumoren eine Größe von ungefähr 1 cm3 aufwiesen, wurde 0,01%, 0,1% oder 1,0%
(G : V) MCP dem Trinkwasser der Ratten zugefügt (N = 8 pro Gruppe, Experimente
wurden zweimal durchgeführt)
und zwar auf kontinuierlicher Basis. Am Tag 14 wurden die Ratten
anästhesiert
und die primären
Tumore wurden durch Amputation des Hinterbeins entfernt. Die Zugabe
von MCP zum Trinkwasser beeinflußte das primäre Tumorzellwachstum
in keiner Konzentration (durchschnittliches Tumorgewicht: Kontrolle:
4,2 ± 0,26
g; 0,01%: 4,7 ± 0,7
g; 0,1%: 4,3 ± 0,37
g; 1,0%: 5,0 ± 0,25
g). Die Ratten wurden dann bis zum Tag 30 überwacht, an dem alle Gruppen
geopfert und einer Autopsie unterzogen wurden. Die Tiere verdauten
während
dieser Zeitspanne in ihrem Trinkwasser kontinuierlich MCP. Kontroll-
wie auch behandelte Tiere gewannen in übli cher Weise Gewicht und es
gab keine beobachtbare Toxizität
bei MCP-behandelten
Tieren. Die Lungen wurden entfernt, in Wasser gespült und über Nacht
in Bouin's-Lösung fixiert.
Die Zahl der Ratten, die an Lungenmetastasen litten, war im Vergleich
zur Kontrolle (15/16 Ratten mit Metastasen) bei den 0,1% (P < 0,03) MCP (7/14
Ratten Metastasen) (p < 0,001) Gruppen
(1A) Ratten signifikant reduziert, die 30 ± 4 ml
Wasser pro Tag in allen Gruppen konsumierten. Die Anzahl der MLL-Tumorkolonien
wurde durch Auszählung
unter einem Dissektionsmikroskop bestimmt. Die Lungen der 1,0% MCP-behandelten Tiere
hatten im Durchschnitt signifikant weniger Metastasenkolonien als
die Kontrollgruppen (9 ± 4
bei der Kontrolle im Vergleich mit 1 ± 1 bei der behandelten Gruppe
(p < 0,05) (1B)
(Mann-Whitney Test). Die Wirkung von MCP schien von der Konzentration im
Trinkwasser abzuhängen.
Die 1C und 1D zeigen
außerdem
Lungen von tumortragenden Tieren (C: Kontrolle, D: 1,0% MCP) und
betonen die Wirkung von MCP auf die Reduktion der Zahl der entwickelten
Oberflächen
MLL-Lungenkolonien. 1% MCP reduzierte außerdem signifikant die Anzahl
von Tieren mit positiver Lymphknotenerkrankung (55% bei der Kontrolle,
13% bei MCP-behandelten Tieren, p < 0,01).
Die behandelten Tiere litten durch die MCP-Behandlung an keiner
ins Auge fallenden Toxizität.
Die Tiere gewannen mit derselben Rate wie die Kontrollen Gewicht.
Die tägliche
Wasseraufnahme betrug 30 ± 4
ml pro Ratte bei den Kontroll- und behandelten Gruppen. Die Haartextur,
das Gesamtverhalten und die Stuhlfarbe waren unverändert.
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Da
früher
bereits demonstriert wurde, dass MCP in Zell-Zell-Wechselwirkungen,
vermittelt durch Zelloberflächen-Kohlenhydrat
bindende Galectin-3-Moleküle
eingreifen kann, wurde die Frage untersucht, ob MLL-Zellen Galectin-3
exprimierten. MLL-Zellen, wie viele andere Krebszellen, exprimieren
Galectin-3 auf ihrer Zelloberfläche,
wie bestimmt durch quantitative Fluoreszenz-Flusszytometrische Analyse,
wie dargestellt in 2 und durch Immunoblotting von
Gesamtzellen, extrahiert mit monospezifischen Anti-Galectin-3-Peptidantikörpern von
Kaninchen, wie dargestellt in 2 (Blot
Einsatz).
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Die
Tumor-Endothelzell-Adhäsion
ist vermutlich ein Schlüsselereignis
im metastatischen Prozess und daher wurde die Wirkung von MCP auf
die MLL-Endothelzell-Interaktion
untersucht. Die Adhäsion
von Cr-markierten MLL-Zellen
an konfluenten Monolayern von Aorta-Endothelzellen von Ratten (RAEC)
in Gegenwart oder Abwesenheit von MCP ist in 3A demonstriert.
Es wurde festgestellt, dass MCP ein potenter Inhibitor der MLL-Zelladhäsion an Endothelzellen
ist (3A und 3B).
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MLL-
und RAEC-Zellen wurden in RPMI 1640-Medien, supplementiert mit 10%igem
fötalem bovinem
Serum angezüchtet.
RAEC wurden zur Konfluenz in Gewebskulturvertiefungen gezüchtet. 2,4 × 106 MLL-Zellen wurden 30 Minuten mit 5 μCi Na2CrO4 bei 37°C in 2 ml
serumfreien Medien mit 0,5% bovinem Serumalbumin inkubiert. Folgend
auf ein extensives Waschen wurden dann 105 MLL-Zellen pro Vertiefung
zu den RAEC-Monolayern in Quadruplikat zugefügt. Wie aus 3A ablesbar,
wurde die Anhaftung von MLL-Zellen in Abwesenheit oder Gegenwart
verschiedener Konzentrationen von MCP für 90 Minuten bei 4°C überprüft. Die
Zellen wurden dreimal in kalter phosphatgepufferter Salzlösung zur Entfernung
nicht gebundener Zellen gewaschen. Die Zellen wurden dann mit 0,1
NaOH 30 Minuten bei 37°C
löslich
gemacht und die Radioaktivität
wurde in einem beta-Counter bestimmt. Jeder Punkt repräsentiert
das Mittel von vier Vertiefungen und die Experimente wurden im Duplikat
durchgeführt.
Säulen repräsentieren
Standardfehler. Wie in 3B ablesbar, wurde der Zeitverlauf
für die
Anbindung von MLL-Zellen an einen konfluenten Monolayer von RAEC
in Abwesenheit (-----) oder Gegenwart von 0,03% (G/V) MCP bestimmt.
Die Gegenwart von 0,03% MCP inhibierte die Anbindung von MLL-Zellen an
RAEC. Für
eine Fluoreszenz-MLL-Zelladhäsion an
RAEC wurden 105 MLL-Zellen 30 Minuten in 0,1% FITC inkubiert, folgend
auf ein extensives Waschen der Zellen, woraufhin die Zellen zu RAEC-Monolayern
zugefügt
wurden. Die Bindung der MLL-Zellen in Abwesenheit (3C)
oder Gegenwart (3D) von 0,1% (G/V) MCP (dargestellt
bei × 160).
Es wird deutlich, dass MLL-Zellen schnell an die RAEC-Monolayer
anhafteten, während
nur ein begrenzter Grad der Zellanhaftung in Gegenwart von MCP beobachtet wurde.
Eine bildliche Darstellung der Wirkung von MCP auf den Adhäsionsprozess
ist in 3C und 3D dargestellt.
MLL-Zellen wurden in Suspension mit FITC fluoreszent markiert, konfluenten
Monolayern von Ratten-Endothelzellen
in 0,5%igem bovinem Serumalbumin ohne (3C) oder
mit 0,1% MCP (3D) für 60 Minuten exponiert. Die
Kulturen wurden gewaschen, um die nicht adhärenten Zellen zu entfernen
und dann fotografiert. Bei den nicht behandelten Kulturen haften
die fluoreszenten MLL-Zellen fast einheitlich gebunden an der Endothel-Monolayerschicht
(3C), während
in Gegenwart von 0,1% MCP fast keine fluoreszenten Zellen in Assoziation
mit dem RAEC-Monolayer im mikroskopischen Feld nachgewiesen werden
können (3D).
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Die
Fähigkeit
von Zellen, auf halbfestem Medium zu wachsen, d. h. Anhaftungs-unabhängig (anchorage
independent), kann als Kriterium für die Zelltransformation verwendet
werden und die Inhibition eines solchen Pro zesses durch Arzneimittel
oder Antikörper
wird verwendet, um ihre Effizienz zu etablieren. Das Wachstum von
Zellen in halbfestem Medium macht es notwendig, dass sie wandern,
eindringen und neue Tumorstellen in einem Prozess etablieren, der
die Stufen einer in-vivo-Metastase nachzuahmen scheint. Es wurde
früher
vorgeschlagen, dass die Fähigkeit
von Tumorzellen zur Interaktion mit Kohlenhydratresten von Glycoproteinen über Zelloberflächen-Galectin-3
mit ihrer Fähigkeit
zur Interaktion mit den Galactoseresten von Agarose (einem Polymer aus
D-Galactose und L-Anhydrogalactose) in Beziehung steht und die minimale
Stütze
bereitzustellen, die für
die Zellproliferation in diesem halbfesten Medium benötigt wird.
Daher wurde demonstriert, dass Anti-Galectin-3-monoklonale Antikörper das
Wachstum von Tumorzellen in Agarose inhibieren können. Weiterhin führt die
Transfektion normaler Maus-Fibroblasten
mit der Maus-Galectin-3-cDNA zu der Annahme von Anhaftungs-unabhängigem Wachstum.
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Um
die Wirkung von MCP auf die MLL-Koloniebildung in 0,5% Agarose zu
bestimmen, wurden MLL-Zellen von kultivierten Monolayern abgespalten, mit
0,02% EDTA in calcium- und magnesiumfreiem (CMF)-PBS und mit 4 × 103 Zellen/ml in komplettem RPMI mit oder ohne
MCP in variierenden Konzentrationen suspendiert. Die Zellen wurden
30 Minuten bei 37°C
inkubiert und dann 1 : 1 (V/V) mit einer Lösung von 1% Agarose in RPMI
1 : 4 (V/V), vorher erwärmt auf
45°C vermischt.
2 ml Aliquots der Mischung wurden auf eine vorher gegossene Schicht
von 1% Agarose in Schalen mit 6 cm Durchmesser platziert. Die Zellen
wurden 8 Tage bei 37°C
inkubiert, dann fixiert, gezählt
und fotografiert. 4A illustriert die Zahl der gebildeten
Kolonien, die durch einen blinden Beobachter unter Verwendung eines
inversen Mikroskops bestimmt wurde. Die Gegenwart von 0,1% MCP inhibierte
die Zahl von vorliegenden MLL-Kolonien gegenüber der Kontrolle (p < 0,01 durch Mann-Whitney) signifikant.
Säulen
repräsentieren
Mittel und S. E. von Triplikat-Experimenten. Phasenkontrast-Mikrofotografien
von MLL-Zellen, gezüchtet
ohne (4B) oder mit (4C)
0,1% (G/V) MCP × 160.
Wie in 4A dargestellt, inhibiert MCP
die MLL-Zellkoloniebildung in Agarose in dosisabhängiger Weise. MCP
inhibierte sowohl die Zahl der MLL-Kolonien als auch ihre Größe (4B und 4C).
Die inhibitorische Wirkung von MCP scheint zytostatisch anstatt zytotoxisch
zu sein, da sie keine Wirkung auf die Rate des MLL-Zellwachstums
in kultivierten Monolayern in vitro aufweist (Daten nicht dargestellt).
MCP hat ähnliche
Wirkungen auf die Fähigkeit
anderer Tumorzellen-Kolonien in Weichagar zu bilden, einschließlich B16-F-Melanom,
UV-2237-Fibrosarcom, HT-1080
menschlichem Fibrosarcom und A375 menschlichem Melanom. Es ist nicht
bekannt, ob MCP die Bindung der MLL-Zellen an die Galactosereste
von Agar blockiert oder mit der Bindung eines kohlenhydrathaltigen
Wachstumsfaktors (faktoren) mit dem Zelloberflächen-Galectin-3 kompetitiert. Ähnlich ist
nicht bekannt, ob die MCP-Inhibition der Tumorzell-Lungenkoloniebildung
in vivo durch die Inhibition der Koloniebildung in vitro nachgeahmt
wird, obwohl eine solche Korrelation zu existieren scheint (1 und 4).
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Die
hier präsentierten
Ergebnisse stellen ein neues, nicht-toxisches orales Verfahren zur
Verhinderung einer spontanen Prostatakrebs-Metastase bereit. In
vorläufigen
Experimenten haben wir festgestellt, dass Galectin-3 in menschlichen
Prostatakrebs-pathologischen Gewebsproben, wie auch der menschlichen
Prostata-Adenokarzinomzellinie PC 3 vorliegt. Für die Immunohistochemie wurden
in 5 μm Formalin
fixierte Paraffin-eingebettete primäre Prostata-Adenokarzinomsektionen
von Paraffin befreit, rehydratisiert und in der Mikrowelle behandelt
(Mittel bis Hoch) und zwar für
10 Minuten in 1 mM Natriumcitratpuffer. Nach Waschen in PBS wurden
die Sektionen in normalem Ziegenserum 30 Minuten blockiert und dann
mit dem primären
Antikörper
Ratten-Anti-Galectin-3-TIB-166 monoklonalen Antikörper inkubiert.
Die Sektionen wurden dann in DPBS für 30 Minuten gewaschen und
mit biotinyliertem Anti-Ratten-IgG inkubiert, gewaschen und mit
Avidin biotinylierter Meerrettichperoxidase inkubiert, gefolgt von
einem Peroxidasesubstrat 3'-3'-Diaminobenzidin.
Die Sektionen wurden mit 3% Methylgrün gegengefärbt und mit Gelatine-Glycerin
aufgestellt. Die Sektion, demonstriert in 5, stammt
von einem Patienten mit invasivem Prostatakrebs. Der PC-3-Zellextrakt wurde
immunogeblottet und im Hinblick auf die Gegenwart von menschlichem
Galectin-3, wie beschrieben in der Legende zu 2,
analysiert. Die Expression von Galectin-3 in Proben der menschlichen
Prostata wurde durch Immunohistochemie mit T1B-166-anti-Galectin-3
monoklonalen Antikörpern überprüft. Das
Galectin-3 wurde im wesentlichen in den Prostatakarzinomzellen mit
wenig Stromafärbung
und variabler normaler Epithelfärbung
exprimiert (5). Die Galectin-3-Färbung mit
diesem Antikörper
war mit intensiver nuklearer, zytoplasmatischer und Zelloberflächenfärbung assoziiert.
Weitere Untersuchungen werden die Rolle von Galectin-3 in normalem
und Krebs-Prostatagewebe bestimmen wie auch die Fähigkeit
von MCP, die menschliche Prostata-Metastase bei nackten Mäusen zu
inhibieren. MCP-Moleküle
scheinen nach oraler Verabreichung in den Blutstrom absorbiert zu
werden und kompetitieren mit der natürlichen Ligandenerkennung von
Tumorzelloberflächengalectinen,
die für
die erfolgreiche Etablierung sekundärer Tumorzellkolonien essenziell ist.
Es werden weitere Arbeiten unternommen, um die aktiven Bestandteile
von MCP zu charakterisieren, wie auch ihre Serumniveaus, da wenig über die
molekularen Merkmale der Peptide bekannt ist. Es scheint, dass die
Wirkung von MCP in den frühen
Phasen der Metastase auftritt, möglicherweise
die Bildung von Tumorzellemboli wie auch die Wechselwirkung von
Krebszellen mit dem Endothel des Zielorgans inhibiert, anstelle
von späten
Ereignissen, wie dem metastatischen Zellwachstum, da MCP keine Wirkung
auf das primäre
MLL Tumorwachstum oder die Angiogenese ausübt.
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Da
natürliches
Zitruspektin (CP) und pH-modifiziertes Zitruspektin (MCP) hoch verzweigte
bzw. nicht-verzweigte komplexe Polysaccharide sind, die reich an
Galactosidresten sind, und in der Lage sind zu einer Bindung an
die Kohlenhydrat-Bindungsdomäne
von Galectin-3, untersuchten wir die Wirkungen von CP und MCP auf
Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen, vermittelt durch eine
Kohlenhydraterkennung. MCP, jedoch nicht CP, inhibierte die B16-F1-Melanomzelladhäsion an
Laminin und die Asialofetuin-induzierte
homotypische Aggregation. Sowohl MCP als auch CP inhibierten das
Anhaftungs-unabhängige
Wachstum von B16-F1-Zellen in halbfestem Medium, d. h. Agarose.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Kohlenhydraterkennung durch das
Zelloberflächen-Galectin-3
an der Zell-extrazellulären
Matrix-Interaktion
beteiligt sein kann und eine Rolle beim Anhaftungs-unabhängigen Wachstum
wie auch bei der in-vivo-Embolibildung von Tumorzellen spielen kann.
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Genauer
ausgedrückt
wurden endogene Galactosid-bindende Lectine von Vertebraten identifiziert
und in eine Vielzahl von Geweben und Zellen charakterisiert. Die
Lectine sind in zwei große
Klassen, basierend auf ihren Größen, unterteilt,
wobei die Molekularmassen ungefähr
14 kDa und 30 kDa betragen und diese kürzlich als Galectin-1 bzw.
Galectin-3 bezeichnet wurden. Galectin-3 repräsentiert einen großen Bereich
von Molekülen,
d. h. die murinen 34 kDa (mL-34) und menschlichen 31 kDa (hL-31) Tumor-assoziierten
Galactosid-Bindungslectine, das 35 kDa Fibroblasten-Kohlenhydrat-Bindungsprotein (CBP35),
das IgE-Bindungsprotein (ε-BP),
das 32 kDa Makrophagennon-Integrin-Laminin-Bindungsprotein (Mac-2)
und die Ratten-, Maus- und menschlichen Formen des 29 kDa Galactosid-Bindungslectin (L-29).
Molekulare Klonierungsstudien haben ergeben, dass die Polypeptide
identisch sind. Das Galectin-3 enthält zwei Strukturdomänen, eine
aminoterminale Domäne,
enthaltend eine Collagen-ähnliche
Sequenz und eine globuläre
carboxyterminale Domäne, umfassend
die Galactosid-Bindungsstelle. Ob sich alle oben erwähnten Galactosid-Bindungslectine denselben
natürlichen
Liganden (die Ligan den) teilen, ist noch nicht bekannt. Obwohl angenommen wurde,
dass Galectin-3 ein S-Typ-Lectin ist, das reduzierende Bedingungen
für die
Kohlenhydrat-Bindungsaktivität
benötigt,
haben kürzliche
Studien Beweise gezeigt, die auf das Gegenteil hindeuten. Etliche
Analyseansätze
haben demonstriert, dass die Galectine an Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen teilnehmen,
indem sie komplementäre
Glycokonjugate erkennen und binden und dadurch eine grundlegende
Rolle in verschiedenen normalen und pathologischen Prozessen spielen.
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Galectin-3
wird durch aktivierte Makrophagen und onkogenetisch transformierte
und metastatische Zellen hoch exprimiert. Die erhöhte Expression des
Polypeptids ist mit einer erhöhten
Kapazität
für ein
Anhaftungs-unabhängiges
Wachstum, homotypische Aggregation und Tumorzell-Lungenkolonisation assoziiert,
was nahelegt, dass Galectin-3 die Tumorzell-Embolibildung in dem
Kreislauf unterstützt
und Metastasen verstärkt.
Wir haben früher
berichtet, dass die intravenöse
Injektion von CP die Lungenkolonisierung der B16-F1 murinen Melanomzellen
erhöht,
während
MCP die Lungenkolonisierung erniedrigt. Obwohl die erhöhte Lungenkolonisierung
durch CP vermutlich an seiner Fähigkeit
zur Unterstützung der
homotypischen Aggregation liegt, verbleibt der Mechanismus, durch
den MCP die Lungenkolonisierung verhindert, weniger gut etabliert.
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Laminin,
der Haupt-, nicht-collagenartige Bestandteil von Grundmembranen
ist ein N-gebundenes Glycoprotein, das Poly-N-Acetyllactosaminsequenzen
trägt und
ist an Zelladhäsion,
Migration, Wachstum, Differenzierung, Invasion und Metastase beteiligt.
Galectine, die mit hoher Affinität
an Oligosaccharide binden, enthaltend Poly-N-Acetyllactosaminsequenzen,
binden auch an die Kohlenhydrat-Seitenketten von Laminin in spezifischer,
zuckerabhängiger
Weise.
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Um
die funktionalen Eigenschaften von Galectin-3 weiter zu untersuchen,
verwendeten wir CP und MCP und untersuchten, ob sie Galectin-3-bezogene
Eigenschaften von B16-F1 murinen Melanomzellen beeinflussen würden. Wir
haben festgestellt, dass: (a) MCP, jedoch nicht CP, die Zelladhäsion an Laminin
inhibiert; (b) MCP die Asialofetuin-induzierte homotypische Aggregation
inhibiert, während
CP diese verstärkt
und (c) sowohl CP als auch MCP das Anhaftungs-unabhängige Wachstum
in halbfesten Medien inhibieren.
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CP
und EHS-Laminin wurde von Sigma, St. Louis, Missouri erworben. MCP
wurde aus CP durch pH-Modifikation gemäß dem oben beschriebenen Verfahren
von Albersheim et al. hergestellt. Asialofetuin wurde durch milde
saure Hydrolyse von Fetuin hergestellt (Spiroverfahren, Grand Island
Biological Co., Grand Island, N. Y.) und zwar in 0,05 M H2SO4 bei 80°C für 1 Stunde.
Rekombinantes Galectin-3 wurde aus Bakterienzellen durch eine einzelstufige Reinigung
durch eine Asialofetuin-Affinitätssäule, wie woanders
beschrieben, extrahiert. Rekombinantes Galectin-3, eluiert durch
Lactose, wurde extensiv gegen CMF-PBS vor der Verwendung dialysiert.
Anti-Galectin-3-monoklonaler
Antikörper
wurde von Dr. R. Lotan, University of Texas, M. D. Anderson erhalten.
Der Meerrettichperoxidase(HRP)-konjugierte Kaninchen-Anti-Ratten-IgG +
IgM und 2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) (ABTS)-Substratkit
wurden von Zymed, South San Francisco, Californien, erworben. B16-F1
murine Melanomzellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagles' Minimal-Essenzial-Medium
(DMEM), supplementiert mit 10% wärmeinaktiviertem
fötalem
Rinderserum, nicht-essenziellen Aminosäuren, 2 mM Glutamin und Antibiotika
kultiviert. Die Zellen wurden bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 7%
CO2 und 93% Luft gehalten.
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Die
Zelladhäsion
an Laminin: Gewebskulturvertiefungen von Platten mit 96 Vertiefungen
wurden über
Nacht bei 4°C
mit EHS-Laminin (2 μg/Vertiefung)
in Ca2+- und Mg2+-freier
phosphatgepufferter Salzlösung,
pH 7,2 (CMF-PBS) vorbeschichtet und die verbliebenen Protein-Bindungsstellen
wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 1%igem Rinderserumalbumin
(BSA) in CMF-PBS blockiert. Die Zellen wurden mit 0,02% EDTA in
CMF-PBS geerntet und mit serumfreiem DMEM suspendiert. 5 × 104 Zellen wurden jeder Vertiefung in DMEM
mit oder ohne CP oder MCP in variierenden Konzentrationen zugefügt. Nach
Inkubation für
2 Stunden bei 37°C
wurden nicht-adhärente
Zellen mit CMF-PBS abgewaschen. Adhärente Zellen wurden mit Methanol
fixiert und fotografiert. Die relative Zahl der adhärenten Zellen wurde
gemäß dem Verfahren
von Olier et al. bestimmt. Kurz gefasst, wurden die Zellen mit Methylenblau
gefärbt,
gefolgt von der Zugabe von HCl-Ethanol zur Freisetzung des Farbstoffs.
Die optische Dichte (650 nm) wurde durch eine Platten-Ablesevorrichtung
gemessen.
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Asialofetuin-induzierte
homotypische Aggregation: die Zellen wurden mit 0,02% EDTA in CMF-PBS
abgelöst
und mit 1 × 106
Zellen/ml in CMF-PBS mit oder ohne 20 μg/ml Asialofetuin und 0,5% CP
oder 0,5% MCP suspendiert. Aliquots, die 0,5 ml der Zellsuspension
enthielten, wurden in silikonisierten Glasröhrchen platziert und bei 80
Upm 60 Minuten bei 37°C
bewegt. Die Aggregation wurde dann durch Fixieren der Zellen mit
1% Formaldehyd in CMF-PBS beendet. Proben wurden zum Auszählen der
Zahl der Einzelzellen verwendet und die resultierende Aggregation
wurde gemäß der folgen den Gleichung
berechnet: (1 – Nt/Nc) × 100, worin
Nt und Nc die Anzahl der einzelnen Zellen in Gegenwart der getesteten
Verbindungen bzw. des Kontrollpuffers (CMF-PBS) bedeuten.
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Galectin-3-Bindung
an MCP: Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit CMF-PBS, enthaltend
0,5% MCP und 1% BSA beschichtet und über Nacht getrocknet. Rekombinantes
Galectin-3, seriell in CMF-PBS verdünnt, enthaltend 0,5% BSA und 0,05%
Tween-20 (Lösung
A) in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 mM Lactose wurde zugefügt und 120
Minuten inkubiert, woraufhin die Vertiefungen abgelassen und mit
CMF-PBS, enthaltend 0,1% BSA und 0,05% Tween-20 (Lösung B)
gewaschen wurden. Ratten-Anti-Galectin-3 in Lösung A wurde zugefügt und 60
Minuten kubiert, gefolgt von einem Waschen mit Lösung B und Inkubation mit HRP-konjugierten
Kaninchen-anti-Ratten-IgG – IgM
in Lösung
A für 30
Minuten. Nach einem Waschen wurden relative Mengen von gebundenem
Enzym, konjugiert in jeder Vertiefung, durch Zugabe von ABTS bestimmt. Das
Ausmaß der
Hydrolyse wurde bei 405 nm gemessen.
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Koloniebildung
in halbfestem Medium: Zellen wurden mit 0,02% EDTA in CMF-PBS abgelöst und mit
1 × 103 Zellen/ml in komplettem DMEM mit oder ohne
CP oder MCP variierender Konzentrationen suspendiert. Die Zellen
wurden 30 Minuten bei 37°C inkubiert
und dann 1 : 1 (V/V) mit einer Lösung
von 1% Agarose in destilliertem Wasser-komplettem DMEM (1 : 4, V/V),
vorher erwärmt
auf 45°C,
vermischt. 2 ml Aliquots der Mischung wurden auf eine vorher gegossene
Schicht von 1% Agarose in Schalen mit 6 cm Durchmesser platziert.
Die Zellen wurden 14 Tage bei 37°C
inkubiert und die Zahl der gebildeten Kolonien wurde unter Verwendung
eines Invers-Mikroskops nach Fixierung durch Zugabe von 2,6% Glutaraldehyd
in CMF-PBS bestimmt.
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Es
wurde früher
gezeigt, dass Laminin als Ligand für lösliches Galectin-3 dienen kann
und die B16-F1-Zellen Galectin-3-Moleküle auf ihrer Zelloberfläche exprimieren.
Diese Ergebnisse zusammen mit den Wirkungen von CP und MCP auf die
Lungenkolonisierung von i. v. injizierten B16-F1-Zellen führten dazu,
dass wir anfänglich
ihre Wirkungen auf die B16-F1-Zelladhäsion an
Laminin untersuchten, um die mögliche
Rolle von Zelloberflächen-Galectin-3
in einem solchen Prozess zu untersuchen. Wie in den 6 und 7A–C dargestellt, inhibierte MCP signifikant
die Zelladhäsion
an Laminin in dosisabhängiger
Weise, während
CP keine offensichtliche Wirkung entweder auf die Zellbindung oder
auf das Verteilen auf Laminin aufwies. Der einfache Zuckerinhibitor
von Galectin-3 Lactose inhibierte die Zelladhäsion an Laminin bei so hohen
Konzentrationen wie 100 mM nicht (Daten nicht dargestellt). Ein
kompetitiver Bindungsassay unter Verwendung von löslichem
rekombinantem Galectin-3 führte
nicht zu einer Blockierung der Zelladhäsion an Laminin und die Anti-Mac-2-monoklonalen
Antikörper
versagten in diesem Hinblick ebenfalls (Daten nicht dargestellt),
was nahelegt, dass die inhibitorische Wirkung von MCP nicht nur
seiner Unterbrechung der Wechselwirkung zwischen Galectin-3 und
N-Acetyllactosaminyl-Seitenketten am Laminin zugeschrieben werden
kann, da die Zellen die Integrine für die Bindung an den Proteinkern
von Laminin verwenden können.
Weiterhin ist der Anti-Mac-2-monoklonale Antikörper nicht gegen die Kohlenhydratbindungsdomäne von Galectin-3,
sondern gegen das N-terminale Ende gerichtet, so dass der exakte
Mechanismus, durch den MCP die Adhäsion gegenüber CP und Lactose blockiert, unklar
bleibt. Die inhibitorische Wirkung von MCP liegt nicht an einer
Zytotoxizität,
da MCP (0,5%) weder die Lebensfähigkeit,
noch das in-vitro-Wachstum der
Zellen beeinflusste.
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Eine
gute Korrelation wurde zwischen der Wahrscheinlichkeit, dass Tumorzellen
eine homotypische Aggregation in vitro durchliefen und ihrem metastatischem
Potenzial in vivo etabliert. B16-Melanomzellenklumpen erzeugen mehr
Lungenkolonien nach intravenöser
Injektion als Einzelzellen. Weiterhin wurde gezeigt, dass der Anti-Galectin-3-Antikörper die
Asialofetuin-induzierte homotypische Aggregation inhibierte, was
nahelegt, dass die Zelloberflächen
Galectin-3-Polypeptide die Bildung von homotypischen Aggregaten
auslösen,
folgend auf ihre Wechselwirkung mit den Seitenketten von Glycoproteinen.
Wie in den 8 und 9A–C dargestellt, reduzierte MCP die Bildung
von homotypischen Aggregaten signifikant, während CP sie verstärkte. Höchstwahrscheinlich
ahmt das nicht-verzweigte MCP das Verhalten des spezifischen Zuckerinhibitors,
d. h. Lactose nach, so dass es die Wechselwirkung der Zelloberflächen-Galectin-3-Moleküle mit Galactosidresten
von Asialofetuin maskiert, was zu einer reduzierten homotypischen
Aggregation führt. Demgegenüber ist
es auch möglich
anzunehmen, dass die strukturellen Eigenschaften eines verzweigten
Kohlenhydratpolymers dem CP ermöglichen,
als Kreuz-Vernetzungsbrücke
zwischen benachbarten Zellen zu dienen, was zur verstärkten Bildung
von homotypischen Aggregaten führt.
Zusammengenommen kann vorgeschlagen werden, dass MCP eine Metastase
verhindern könnte,
indem es Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen stört, die
für die
Tumorzellen zur Bildung metastatischer Läsionen notwendig sind.
-
Die
vorstehenden Wirkungen von MCP zur Inhibition der B16-F1-Zelladhäsion an
Laminin und der homotypischen Aggregation können an seiner Wechselwirkung
mit Galectin-3 auf der Zelloberfläche liegen, da von CP bereits
früher
gezeigt wurde, dass es die B16-F1-Zelloberfläche in lactoseab hängiger Weise
bindet. Um diese Bindung von Galectin-3 an MCP zu untersuchen, verwendeten
wir einen enzymgebundenen Immunosorbentassay, wobei wir feststellten,
dass rekombinantes Galectin-3 immobilisiertes MCP in dosisabhängiger Weise
band und die Bindung wurde vollständig durch Lactose blockiert (9). Diese Resultate ermöglichen
uns, die inhibitorischen Wirkungen von MCP auf die homotypische Aggregation
seiner Bindung an die Zelloberflächen-Galectin-3-Moleküle zuzuschreiben.
Andererseits wissen wir nicht, wie MCP, jedoch nicht CP, die B16-F1-Zelladhäsion an
Laminin beeinflusst. Da die pH-Modifikation von CP, wobei es sich
um ein verzweigtes komplexes Polysaccharidpolymer handelt, zu einer
Erzeugung nicht-verzweigter
Kohlenhydrat ketten derselben Zuckerzusammensetzung führt, ist es
wahrscheinlich, dass MCP stärker
an die Zelloberflächen-Galectin-3-Moleküle als CP
bindet. Zusammengenommen mit der Tatsache, dass Anti-Integrin-Antikörper die
murine B16-Melanomzelleanhaftung an Lamininsubstrate inhibieren
nehmen wir an, dass MCP die Lamininerkennung durch die Integrinklasse
von Lamininrezeptoren sterisch inhibiert oder dass die Wechselwirkung
von Zelloberflächen-Galectin-3
mit Poly-N-Acetyllactosaminsequenzen auf Laminin zusammen mit den
Integrinen für
die Zelladhäsion
an Laminin wirken kann. Die Möglichkeit,
dass die Wechselwirkung von MCP mit Galectin-1 mit derselben Zuckerspezifität wie Galectin-3
seine Prozesse beeinflussen könnten,
um die B16-F1-Zelladhäsion
an Laminin und die homotypische Aggregation zu beeinflussen, kann
vermutlich ausgeschlossen werden, da Galectin-1 ein sezerniertes
Protein ist.
-
Die
Fähigkeit
von Zellen, in halbfestem Medium zu wachsen, d. h. "Anhaftungs-unabhängig" wird als Kriterium
für die
Zelltransformation verwendet, da diese Eigenschaft in der Regel
nur von transformierten und tumorigenen Zellen ausgeübt werden.
Früher wurde
vorgeschlagen, dass die Fähigkeit
von Tumorzellen zur Wechselwirkung mit Glycoprotein-Kohlenhydratresten über Zelloberflächen-Galectin-3
mit ihrer Fähigkeit
zur Interaktion mit den Galactoseresten von Agarose (einem Polymer
von D-Galactose und L-Anhydrogalactose) in Beziehung steht und der
Effizienz der Koloniebildung in diesem halbfesten Medium. Es wurde
auch gezeigt, dass Anti-Galectin-3-monoklonale Antikörper das Wachstum von Tumorzellen
in Agarose inhibieren und dass es eine inverse Beziehung zwischen
der Expression von Galectin-3 und der Unterdrückung des transformierten Phänotyps gibt.
Die Transfektion normaler Maus-Fibroblasten mit der Maus-Galectin-3-cDNA
führte
zu der Annahme von Anhaftungs-unabhängigen Wachstumseigenschaften.
Um die Möglichkeit
weiter zu verifizieren, dass Zelloberflächen-Galectin-3 eine Schlüs selrolle
für Zellen
zum Wachstum in halbfestem Medium spielt, untersuchten wir die Wirkungen von
CP und MCP auf das Anhaftungs-unabhängige Wachstum von B16-F1-Melanomzellen.
Wie in 11 dargestellt, inhibierten
CP und MCP das Wachstum von B16-F1-Zellkolonien in der halbfesten Matrix
in dosisabhängiger
Weise. Ähnlich
inhibierte Lactose das Anhaftungs-unabhängige Wachstum in dosisabhängiger Weise
ebenfalls (Daten nicht dargestellt). Die dosisabhängige inhibitorische
Wirkung von CP und MCP war nicht auf B16-F1-Melanomzellen begrenzt. Das Wachstum
in Weichagar von UV-2237-10-3 murinen Fibrosarkomzellen, HT1080 humanen
Fibrosarkomzellen und A375C1.49 menschlichen Melanomzellen wurde
ebenfalls in ähnlicher
Weise inhibiert. Es ist möglich,
dass lösliches
CP und MCP mit den Galactoseresten von Agarose um die Galectin-3-Bindung
kompetieren, was einer anscheinenden Wachstumsinhibition führt, indem den
Zellen die minimale Stütze
der Matrix, die für
die Zellproliferation benötigt
wird, entzogen wird. Es kann auch argumentiert werden, dass CP und
MCP wie auch die Anti-Galectin-3-Antikörper möglicherweise wie ein Antagonist
eines noch unerkannten Glycokonjugat-Wachstumsfaktors wirken, der
mit Galectin-3 interagiert oder dass sie den Zugang bekannter Wachstumsfaktoren
zu den Membranrezeptoren sterisch behindern. Die Tatsache jedoch,
dass das in-vitro-Anhaftungs-abhängige
Wachstum und die Tumorigenität
von B16-F1-Zellen in syngenen Mäusen
durch MCP (0,5%) nicht nachteilig beeinflusst wurde, ermöglicht jedoch
in plausibler Weise, dass wir die vorstehende Möglichkeiten ausschließen können. Da
die Fähigkeit
von Zellen zum Wachstum auf halbfestem Medium als Kriterium für die Zelltransformation
verwendet wird, kann die Akquisition des Zelloberflächen-Galectin-3
ein früher
Schritt der posttransformierten Kaskade sein.