DE69433501T2

DE69433501T2 - Oxazole zur behandlung von zytokinvermittelten erkrankungen

Info

Publication number: DE69433501T2
Application number: DE69433501T
Authority: DE
Inventors: Jerry Leroy Adams; Timothy Francis Gallagher; Jeffrey Charles Boehm; Susan Mary Thompson
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1993-11-08
Filing date: 1994-11-08
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2014-11-09
Also published as: WO1995013067A1; EP1306377A2; EP0727998A4; JPH09505055A; DE69433501D1; EP1306377A3; US6288062B1; EP0727998B1; EP0727998A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft eine neue Gruppe von Oxazolverbindungen, Verfahren für deren Herstellung, deren Verwendung zur Behandlung zytokinvermittelter Erkrankungen und. Arzneimittel zur Verwendung bei einer solchen Therapie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Interleukin-1 (IL-1) und der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) sind biologische Stoffe, die von einer Vielzahl an Zellen, wie Monozyten oder Makrophagen, erzeugt werden. Es ist gezeigt worden, dass IL-1 eine Vielzahl an biologischen Wirkungen vermittelt, von denen man annimmt, dass sie bei der Immunregulation und anderen physiologischen Zuständen, wie einer Entzündung, wichtig sind [Siehe z. B. Dinarello et al., Rev. Infect. Disease, 6, 51 (1984)]. Die Myriaden bekannter biologischer Wirkungen von IL-1 schließen die Aktivierung von T-Helferzellen, Induktion von Fieber, Stimulation der Prostaglandin- oder Kollagenaseerzeugung, Neutrophilenchemotaxis, Induktion von Akute-Phase-Proteinen und die Suppression von Plasmaeisenspiegeln ein.
Es gibt viele Erkrankungszustände, bei denen eine übermäßige oder unregulierte IL-1-Erzeugung an einer Verschlimmerung und/oder Verursachung der Erkrankung beteiligt ist. Diese schließen rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Endotoxämie und/oder toxisches Schocksyndrom, andere akute oder chronische entzündliche Erkrankungszustände, wie die durch Endotoxin induzierte entzündliche Reaktion oder entzündliche Darmerkrankung, Tuberkulose, Atherosklerose, Muskeldegeneration, Kachexie, psoriatische Arthritis, Reiter-Syndrom, rheumatoide Arthritis, Gicht, traumatische Arthritis, Rötelnarthritis und akute Synovitis ein. Neue Anzeichen verbinden die IL-1-Aktivität auch mit Diabetes und pankreatischen β-Zellen.
Dinarello, J. Clinical Immunology, 5 (5), 287–297 (1985), bespricht die biologischen Wirkungen, die IL-1 zugeschrieben worden sind. Es sollte beachtet werden, dass einige dieser Wirkungen von anderen als indirekte Wirkungen von IL-1 beschrieben worden sind.
Eine übermäßige oder unregulierte TNF-Erzeugung ist bei der Vermittlung oder Verschlimmerung einer Zahl von Erkrankungen impliziert worden, einschließlich rheumatoider Arthritis, rheumatoider Spondylitis, Osteoarthritis, Gichtarthritis und anderen arthritischen Zuständen, Sepsis, septischem Schock, Endotoxinschock, Gram-negativer Sepsis, toxischem Schocksyndrom, Schocklunge (ARDS), zerebraler Malaria, chronischer entzündlicher Lungenerkrankung, Silikose, pulmonaler Sarkoidose, Knochenresorptionserkrankungen, Reperfusionsverletzung, Transplantat-Wirt-Reaktion, Allotransplantatabstoßungsreaktionen, Fieber und Myalgien aufgrund einer Infektion, wie Influenza, Kachexie an zweiter Stelle nach einer Infektion oder Malignität, Kachexie an zweiter Stelle nach einem erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS), AIDS, ARC (AIDS-verwandter Komplex), Keloidbildung, Narbengewebebildung, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa oder Pyrese.
AIDS resultiert aus der Infektion von T-Lymphozyten mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV). Mindestens drei Typen oder Stämme des HIV sind identifiziert worden, d. h. HIV-1, HIV-2 und HIV-3. Als Folge einer HIV-Infektion wird die T-Zellenvermittelte Immunität beeinträchtigt und infizierte Personen zeigen schlimme opportunistische Infektionen und/oder ungewöhnliche Neoplasmen. Ein HIV-Eintritt in den T-Lymphozyten erfordert eine T-Lymphozytenaktivierung. Andere Viren, wie HIV-1 und HIV-2, infizieren T-Lymphozyten nach T-Zellenaktivierung und eine solche Virusproteinexpression und/oder -replikation wird durch eine solche T-Zellenaktivierung vermittelt oder aufrechterhalten. Wenn ein aktivierter T-Lymphozyt einmal mit HIV infiziert ist, muss der T-Lymphozyt weiter in einem aktivierten Zustand aufrechterhalten werden, um eine HIV-Genexpression und/oder HIV-Replikation zuzulassen. Monokine, speziell TNF, sind an einer durch aktivierte T-Zellen vermittelten HIV-Proteinexpression und/oder Virusreplikation dadurch beteiligt, dass sie bei der Aufrechterhaltung der T-Lymphozytenaktivierung eine Rolle spielen. Deshalb hilft eine Störung der Monokinaktivität, wie durch Hemmung der Monokinerzeugung, vor allem TNF, bei einer HIV-infizierten Person beim Beschränken der Aufrechterhaltung der T-Zellenaktivierung, wodurch das Fortschreiten der HIV-Infektiosität auf vorher nicht infizierte Zellen verringert wird, was zu einer Verlangsamung oder Eliminierung des Fortschreitens der durch die HIV-Infektion verursachten Immunfunktionsstörung führt. Monozyten, Makrophagen und verwandte Zellen, wie Kupffer- und Gliazellen, sind auch an der Aufrechterhaltung der HIV-Infektion beteiligt worden. Diese Zellen, wie T-Zellen, sind Ziele für die Virusreplikation und der Anteil der Virusreplikation ist vom Aktivierungszustand der Zellen abhängig. [Siehe Rosenberg et al., The Immunopathogenesis of HIV Infection, Advances in Immunology, Bd. 57, (1989)]. Es ist gezeigt worden, dass Monokine, wie TNF, die HIV-Replikation in Monozyten und/oder Makrophagen aktivieren [Siehe Poli et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 782–784 (1990)]; deshalb hilft eine Hemmung der Monokinerzeugung oder -aktivität bei der Beschränkung des HIV-Fortschreitens, wie es vorstehend für T-Zellen angegeben ist.
TNF ist auch an verschiedenen Rollen mit anderen Virusinfektionen, wie dem Cytomegalievirus (CMV), Influenzavirus und dem Herpesvirus, aus ähnlichen Gründen wie den genannten beteiligt worden.
Interleukin-8 (IL-8) ist ein chemotaktischer Faktor, der zuerst 1987 identifiziert und charakterisiert wurde. IL-8 wird durch verschiedene Zelltypen erzeugt, die einkernige Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen und Keratinozyten einschließen. Seine Erzeugung aus Endothelzellen wird durch IL-1, TNF oder Lipopolysaccharid (LPS) induziert. Es ist gezeigt worden, dass menschliches IL-8 auf Neutrophile von Maus, Meerschweinchen, Ratte und Kaninchen wirkt. Viele verschiedene Namen sind für IL-8 verwendet worden, wie neutrophiles Attraktivstoff/Aktivierungs-Protein-1 (NAP-1), monozytenabgeleiteter neutrophiler chemotaktischer Faktor (MDNCF), neutrophiler aktivierender Faktor (NAF) und T-Zell-Lymphozyten chemotaktischer Faktor.
IL-8 stimuliert eine Zahl von Funktionen in vitro. Es ist gezeigt worden, dass es chemisch anziehende Eigenschaften für Neutrophile, T-Lymphozyten und Basophile aufweist. Außerdem induziert es die Histaminfreisetzung aus Basophilen sowohl aus normalen als auch atopischen Individuen sowie lysosomale Enzymfreisetzung und respiratorisches Platzen aus Neutrophilen. Es ist auch gezeigt worden, dass IL-8 die Oberflächenexpression von Mac-1 (CD11b/CD18) an Neutrophilen ohne de novo-Proteinsynthese erhöht; dies kann zu einer erhöhten Adhäsion der Neutrophilen an Gefäßendothelzellen beitragen. Viele Erkrankungen sind durch eine massive Neutrophileninfiltration charakterisiert. Beschwerden, die mit einer Zunahme der IL-8-Erzeugung (die für Chemotaxis von Neutrophilen am Entzündungsort verantwortlich ist) verbunden sind, würden von Verbindungen profitieren, die für die IL-8-Erzeugung suppressiv sind.
IL-1 und TNF beeinflussen eine breite Vielfalt an Zellen und Geweben und diese Zytokine sowie andere von Leukozyten abgeleitete Zytokine sind wichtige und entscheidende Entzündungsmediatoren einer breiten Vielfalt an Erkrankungszuständen und Beschwerden. Die Hemmung dieser Zytokine ist von Vorteil beim Kontrollieren, Verringern und Lindern vieler dieser Erkrankungszustände.
Die internationale Anmeldung Veröffentlichungsnummer WO 83/02613 offenbart bestimmte trisubstituierte Oxazoverbindungen, von denen angegeben wird, dass sie einen möglichen Nutzen als epidermale antiphlogistische Verbindungen aufweisen.
Es bleibt ein Bedarf für eine Behandlung in diesem Gebiet für Verbindungen, die zytokinsuppressive entzündungshemmende Arzneistoffe sind, d. h. Verbindungen, die Zytokine, wie IL-1, IL-6, IL-8 und TNF hemmen können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die neuen Verbindungen der Formel (I) und Arzneimittel, die eine Verbindung der Formel (I) und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel oder einen Träger umfassen.
Diese Erfindung betrifft auch eine Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Asthma, Schocklunge (ARDS), Schlaganfall, Knochenresorptionserkrankungen oder arthritischen Gelenkbeschwerden und anderen entzündlichen Erkrankungen bei einem Säuger, der dessen bedarf.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die neuen Verbindungen dieser Erfindung werden durch die nachstehende Struktur dargestellt:
in der:
R₁ eine 4-Pyridylgruppe darstellt und R₂ eine 4-Fluorphenyl-, 3,4-Dichlorphenyl- oder 3-Chlorphenylphenylgruppe darstellt; oder
R₁ eine 2-Methylpyrid-4-ylgruppe darstellt und R₂ eine 4-Fluorphenylgruppe darstellt; und
R₃ ein Wasserstoffatom darstellt;
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
So bestehen die Verbindungen der Erfindung aus:
4-(4-Fluorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol;
4-(4-Fluorphenyl)-5-(2-methylpyrid-4-yl)oxazol;
4-(3,4-Dichlorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol;
4-(3-Chlorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol;
oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon.
Geeignete pharmazeutisch verträgliche Salze sind Fachleuten bekannt und umfassen basische Salze anorganischer und organischer Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Essigsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Milchsäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Phenylessigsäure und Mandelsäure.
Außerdem können pharmazeutisch verträgliche Salze von Verbindungen der Formel (I) auch mit einem pharmazeutisch verträglichen Kation gebildet werden. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Kationen sind Fachleuten bekannt und schließen Alkali-, Erdalkali-, Ammonium- und quaternäre Ammoniumkationen ein.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffatome enthalten und können in racemischer und optisch aktiven Formen vorliegen. Alle diese Verbindungen sind im Bereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Verbindungen der Formel (I) sind Oxazolderivate, die leicht unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden können und die durch Verfahren, die denjenigen, die hier nachstehend angegeben sind, analog sind, hergestellt werden können.
Schema I
Schema I veranschaulicht die Herstellung von Oxazolen, die nur durch ein Wasserstoffatom an C-2 (R₃ = H) substituiert sind. Die erforderlichen Aldehyde, bei denen R₂ und R₁ wie in Formel (I) definiert sind, oder geeignet geschützte Vorstufen davon können aus leicht erhältlichen Materialien unter Verwendung von Standardumwandlungen, die einem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Das Isonitril (I) wird aus einem Aldehyd (R₂COH), Formamid und einem Thiol oder einer Sulfinsäure (vorzugsweise als Arylverbindungen) in einer Dreikomponenten-Kondensation hergestellt. Eine ausführlichere Beschreibung siehe hier in Beispiel 1. Die Umsetzung von I mit Aldehyd II wird mit einer geeigneten Base, zum Beispiel einer Guanidinbase wie 1,5,7-Triazobicyclo[4.4.0]dec-5-en, in einem inerten Lösungsmittel, wie Methylenchlorid oder DME, initiiert, wobei Oxazol III erhalten wird.
Schema II
Schema II veranschaulicht die Herstellung von Oxazolen (VIII), die eine Alkylgruppe an C-2 besitzen, durch Cyclisierung eines geeigneten Acyloxyketons VII mit NH₄OAc/HOAc. Verbindung VII kann, wie veranschaulicht, in drei Schritten aus dem gewünschten metallorganischen Derivat IV hergestellt werden. Ein einschlägiges Beispiel des ersten Schrittes, Herstellung von Keton V, ist im Schema II von PCT/US93/00674, Adams et al., veröffentlicht als WO93/14081, umrissen. Verbindung V kann bromiert werden, wobei Bromketon VI bereitgestellt wird. Ersatz des Bromids durch das Natriumsalz einer Carbonsäure ergibt Acyloxyketon VII.
Schema III
Schema III veranschaulicht einen alternativen Weg für die Herstellung von Oxazolen (XIII), die einen Alkylsubstituenten an C-2 besitzen. Das Verfahren schließt das Cyclisieren des entsprechenden Acylaminoketons XI unter Dehydratisierungsbedingungen ein. Drei Verfahren zur Herstellung der Verbindung XI sind gezeigt. Zwei der Verfahren beginnen mit Keton V. Bei einem Verfahren kann Verbindung V entweder unter Verwendung saurer Bedingungen mit einer wässrigen Lösung eines Alkalinitritsalzes oder unter Verwendung basischer Bedingungen in alkoholischen Lösungsmitteln mit einem Alkylnitrit, zum Beispiel Kalium-t-butoxid in t-Butanol plus Amylnitrit, in das Oximinoketon IX überführt werden. Nachfolgende Reduktion des Oximinoketons IX, vorzugsweise mit Wasserstoff und einem Metallkatalysator, liefert ein Aminoketon, das unter sauren Bedingungen hergestellt und isoliert werden kann, wobei anfangs das Hydrohalogenidsalz bereitgestellt wird, das in einem separaten Schritt acyliert wird, wobei Verbindung XI hergestellt wird, oder in situ acyliert wird, wobei Verbindung XI direkt geliefert wird. Bei dem anderen Verfahren kann das entsprechende Oxim (X) von V über eine Neber-Reaktion in ein Aminoketon überführt werden, das nach Acylierung XI bereitstellt. Das dritte Verfahren erzeugt XI durch die Zugabe eines metallorganischen Derivats von R₂ zum acylierten und aktivierten Derivat der α-Aminosäure von R₁.
Schema IV
Schema IV veranschaulicht die Herstellung von 2-Aminooxazolen XV. Sie können aus dem Silyloxyketon XIV und dem gewünschten Cyanamid unter Verwendung des Verfahrens, das von A. F. Cockerill, et al., Syn., 1976, 591, beschrieben ist, hergestellt werden. Die Herstellung von Verbindung XIV ist in Schema I aus Adams et al., PCT/US93/00674, vorstehend, umrissen.
Schema V
Der in Schema V veranschaulichte Weg ermöglicht die Herstellung von 2-substituierten Oxazolen, bei denen der Rest R₃ entweder die direkte Anlagerung eines Kohlenstoffatoms (Alkyl- oder Arylrest) oder ein Sauerstoff- oder Schwefelheteroatomlinker sein kann. Die Synthese der Tosylamide (XVI) und die nachfolgende Dehydratisierung zum Isonitril (I) ist der, die in Schema I umrissen ist, analog, aber liefert Produkte mit der Schwefelabgangsgruppe im Sulfon- statt Sulfidoxidationszustand. Jeder Oxidationszustand des Schwefels ist für die in den Schemata I und V umrissenen Verfahren anwendbar. Alkylierung des Amids XVI am Sauerstoff oder Schwefel (falls ein Thioamid verwendet wird) unter Verwendung eines Oxoniumsalzes oder unter anderen bekannten Bedingungen, um Heteroatom- gegenüber Kohlenstoffatomalkylierung zu begünstigen, liefert das Imin XVII. Umsetzung von XVII mit Aldehyd II unter den basischen Bedingungen, die erforderlich sind, um eine Cycloaddition einzuleiten, erzeugt das Oxazol XIX. In einer anderen Ausführungsform kann das Isonitril I verwendet werden, um Chlorimidate (XVIII) herzustellen, die auch der baseninduzierten Cyclisierung mit Aldehyd II unterzogen werden. Experimentelle Verfahren für die Cyclisierung zum Oxazol und die Herstellung der Zwischenprodukte sind in den folgenden Artikeln umrissen: A. M. van Leuson et al. in Tet. Let., S. 143 (1976); J. Heterocyclic Chem., 18, S. 1127 & S. 1133 (1981).
Wenn der Oxazolkern einmal hergestellt worden ist, können durch Anwendung von Standardverfahren zur wechselseitigen Umwandlung funktioneller Gruppen weitere Verbindungen der Formel (I) hergestellt werden.
Geeignete Schutzgruppen zur Verwendung bei Hydroxylgruppen zum Beispiel sind im Fachgebiet bekannt und in vielen Literaturangaben, zum Beispiel Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene, Wiley-Interscience, New York, 1981 beschrieben. Geeignete Beispiele von Hydroxylschutzgruppen umfassen Silylether, wie t-Butyldimethyl- oder t-Butyldiphenylether, und Alkylether, wie Methylether, verknüpft durch eine Alkylkette variabler Kettenglieder.
Pharmazeutische Säureadditionssalze von Verbindungen der Formel (I) können in bekannter Weise erhalten werden, zum Beispiel durch deren Behandlung mit einer geeigneten Menge Säure in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben werden, die lediglich veranschaulichend sind und nicht als Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung gedacht sind.
Synthesebeispiele
Referenzbeispiel 1
5-(3-Methoxyphenyl)-2-methyl-4-(4-pyridyl)oxazol

(a) 2-Amino-1-(3-methoxyphenyl)-2-(4-pyridyl)acetophenonhydrochlorid – Die Titelverbindung wurde dem Verfahren von J. G. Murphy, J. Org. Chem., 1961, 26, 3104 folgend hergestellt, doch unter Verwendung von 2-Hydroxyimino-1-(3-methoxyphenyl)-2-(4-pyridyl)acetophenon [siehe PCT/UTS93/00674, Adams et al., veröffentlicht als WO93/14081].
(b) 2-Acetamido-1-(3-methoxyphenyl)-2-(4-pyridyl)ethanon – Einer Lösung aus 2-Amino-3-methoxy-2-(4-pyridyl)acetophenonhydrochlorid (0,5 g, 1,8 mmol) in Pyridin (8 ml) wurde Acetanhydrid (1 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 45 min gerührt, dann in H₂O gegossen. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, dann über MgSO₄ getrocknet. Abdampfen des Lösungsmittels ergab ein rotes Öl, das durch Flash-Chromatographie unter Elution mit einem Lösungsmittelgradienten von 0–4% MeOH/CHCl₃ gereinigt wurde. Die Titelverbindung wurde als gelbes Öl (0,21 g) isoliert.
(c) 5-(3-Methoxyphenyl)-2-methyl-4-(4-pyridyl)oxazol – Die Titelverbindung wurde unter Verwendung des Verfahrens von F. N. Hayes et al., J. Amer. Chem Soc., 1955, 77, 1850, doch unter Verwendung von 2-Acetamido-1-(3-methoxyphenyl)-2-(4-pyridyl)ethanon hergestellt: ESMS (m/z): 267 (M⁺ + H).

Referenzbeispiel 2
5-(4-Fluorphenyl)-2-methyl-4-(4-pyridyl)oxazol

(a) 1-(4-Fluorphenyl)-2-(4-pyridyl)ethanonoxim – Einer Lösung aus 4-Fluorphenyl-2-(4-pyridyl)acetophenon (8,08 g, 37,6 mmol) [Siehe PCT/US93/00674, Adams et al., WO93/14081] in EtOH (80 ml) wurden Hydroxylaminhydrochlorid (4,12 g, 59,7 mmol) und Pyridin (4,8 ml, 59,7 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 60°C 1 h gerührt, dann in H₂O gegossen und eine weitere Minute gerührt. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert und mit H₂O gewaschen. Der Niederschlag wurde aus EtOH/H₂O umkristallisiert, wobei die Titelverbindung als weißer Feststoff (6,29 g) erhalten wurde: Schmp. 135–136°C.
(b) 2-Acetamido-1-(4-fluorphenyl)-2-(4-pyridyl)ethanon – Die Titelverbindung wurde durch das Verfahren von S. C. Shilcrat, et al., J. Heterocyclic Chem., 1991, 28, 1181, doch unter Verwendung von 1-(4-Fluorphenyl)-2-(4-pyridyl)ethanonoxim und Acetanhydrid hergestellt.
(c) 5-(4-Fluorphenyl)-2-methyl-4-(4-pyridyl)oxazol – Die Titelverbindung wurde unter Verwendung des Verfahrens von F. N. Hayes et al., J. Amer. Chem. Soc., 1955, 77, 1850, doch unter Verwendung von 2-Acetamido-1-(4-fluorphenyl)-2-(4-pyridyl)ethanon hergestellt: ESMS (m/z): 255 (M⁺ + H).

Referenzbeispiel 3
2-Methyl-4-phenyl-5-(4-pyridyl)oxazol

(a) 2-Phenyl-1-(4-pyridyl)acetophenon – Eine Suspension aus Isonicotinoylchlorid (0,58 g, 3,26 mmol) in trockenem THF (7,0 ml) wurde auf –78°C abgekühlt, und Benzylmagnesiumchlorid (3,4 ml, 6,85 mmol; 2,0 M Lösung in THF) wurde tropfenweise zugesetzt. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde das Eisbad entfernt und das Umsetzungsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Nach 3 h wurde das Umsetzungsgemisch in gesättigte NH₄Cl-Lösung gegossen und die Phasen wurden getrennt. Das wässrige Gemisch wurde mit THF extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Abdampfen des Lösungsmittels ergab einen gelben Feststoff, der durch Flash-Chromatographie unter Elution mit einem Lösungsmittelgradienten von 0–3% MeOH/CH₂Cl₂ gereinigt wurde. Die Titelverbindung wurde als gelber Feststoff (0,50 g) isoliert.
(b) 1-Hydroxyimino-1-phenyl-1-(4-pyridyl)ethanon – Einer Lösung aus 2-Phenyl-1-(4-pyridyl)acetophenon (0,50 g, 2,53 mmol) in Pyridin (7,5 ml) wurde Hydroxylaminhydrochlorid (0,65 g, 9,36 mmol) zugesetzt. Nach 20 stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Pyridin abgedampft und der Rückstand wurde in H₂O aufgenommen und filtriert. Der Niederschlag wurde mit H₂O gewaschen und luftgetrocknet, wobei die Titelverbindung als gelber Feststoff (0,529 g) erhalten wurde.
(c) 2-Acetamido-2-(4-phenyl-1-(4-pyridyl)ethanon – Natrium (0,08 g, 3,50 mmol) wurde absolutem EtOH (16 ml) zugesetzt und gerührt. Nach Abschluss der Umsetzung und Abkühlen auf Umgebungstemperatur wurde 1-Hydroxyimino-2-phenyl-1-(4-pyridyl)ethanon (0,53 g, 2,50 mmol) portionsweise zugesetzt. Nach 15 min wurde das gelbe Umsetzungsgemisch in einem Eisbad abgekühlt und p-Toluolsulfonylchlorid (0,59 g, 3,07 mmol) wurde in einer einzigen Portion zugesetzt. Das Gemisch wurde bei –5°C 2 h gerührt und dann wurde eine Lösung aus NaOEt [aus Natrium (0,07 g, 5,18 mmol) und absolutem EtOH (3,3 ml)] tropfenweise zugesetzt. Nach 45 min wurde Et₂O (9 ml) zugesetzt und das Rühren wurde fortgesetzt. Nach 30 min wurde das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand wurde mit Et₂O und 3 N HCl ausgeschüttelt. Die Phasen wurden getrennt und die Et₂O-Phase wurde mit HCl extrahiert. Die wässrige Phase wurde eingedampft, wobei ein gelbes Öl (1,52 g) erhalten wurde, das in Pyridin (10 ml) gelöst wurde. Acetanhydrid (1 ml) wurde zugesetzt und das Umsetzungsgemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 19 h wurde das Gemisch in H₂O gegossen und CH₂Cl₂ wurde zugesetzt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Abdampfen des Lösungsmittels ergab ein rotes Öl, das durch Flash-Chromatographie unter Elution mit 0–3% MeOH/CHCl₃ gereinigt wurde. Die Titelverbindung wurde als goldfarbenes Öl (0,238 g) erhalten.
(d) 2-Methyl-4-phenyl-5-(4-pyridyl)oxazol – Ein Gemisch aus 2-Acetamido-2-phenyl-1-(4-pyridyl)ethanon (0,101 g, 0,397 mmol) in konz. H₂SO₄ (1 ml) wurde bei 100°C 18 h erhitzt. Nach Abkühlen wurde das Gemisch auf Eis gegossen und mit 2,5 N NaOH neutralisiert. Das wässrige Gemisch wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert und die vereinten organischen Extrakte wurden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Abdampfen des Lösungsmittels ergab ein Öl, das durch Flash-Chromatographie unter Elution mit 0–2% MeOH/CHCl₃ gereinigt wurde. Die Titelverbindung wurde als goldfarbenes Öl (3,0 mg) erhalten: MS (DCl/NH₃) (m/z): 237 (M⁺ + H).

Referenzbeispiel 4
4-(4-Fluorphenyl)-2-methyl-5-(4-pyridyl)oxazol
Einer Lösung aus 4-Fluorphenyl-2-(4-pyridyl)acetophenon [Siehe PCT/US93/00674, Adams et al., veröffentlicht als WO93/14081] (0,167 g, 0,76 mmol) in CH₂Cl₂ (5 ml) wurde Brom (7,8 ml, 0,78 mmol; 0,1 M Lösung in CH₂Cl₂) zugesetzt. Nach 30 minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Feststoff wurde in Eisessig (10 ml) aufgenommen. Natriumacetat (0,192 g, 2,34 mmol) und Ammoniumacetat (0,301 g, 3,9 mmol) wurden zugesetzt und das Umsetzungsgemisch wurde 19 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen wurde das Gemisch in H₂O gegossen, mit konz. NH₄OH neutralisiert, dann gründlich mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Abdampfen des Lösungsmittels lieferte einen gelben Feststoff, der durch Flash-Chromatographie unter Elution mit 100% CHCl₃ gereinigt wurde. Die Titelverbindung wurde als gelber wachsartiger Feststoff (0,067 g) erhalten: ESMS (m/z): 255 (M⁺ + H).
Referenzbeispiel 5
4-(4-Fluorphenyl)-2-phenyl-5-(4-pyridyl)oxazol

(a) 2-Benzoyloxy-1-(4-fluorphenyl)-2-(4-pyridyl)ethanon – Einer Lösung aus 4-Fluorphenyl-2-(4-pyridyl)acetophenon [Siehe PCT/US93/00674, Adams et al., veröffentlicht als WO93/14081] (0,356 g, 1,65 mmol) in CH₂Cl₂ (5 ml) wurde Brom (18,1 ml, 1,81 mmol; 0,1 M Lösung in CH₂Cl₂) zugesetzt. Nach 30 minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Feststoff wurde in EtOH (5 ml) aufgenommen. Natriumbenzoat (0,635 g, 4,4 mmol) und konz. H₂SO₄ (3 Tropfen) wurden zugesetzt und das Gemisch wurde 18 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen wurde das Gemisch in H₂O gegossen, mit konz. NH₄OH neutralisiert, dann mit EtOAc extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Abdampfen des Lösungsmittels ergab ein rotes Öl, das durch einen Ballen aus Kieselgel unter Elution mit einem Lösungsmittelgradienten von 100 : 0 bis 50 : 1 CHCl₃/MeOH filtriert wurde. Die Titelverbindung wurde als gelbes Öl (0,131 g) isoliert.
(b) 4-(4-Fluorphenyl)-2-phenyl-5-(4-pyridyl)oxazol – Eine Lösung aus 2-Benzoyloxy-1-(4-fluorphenyl)-2-(4-pyridyl)ethanon (0,131 g, 0,391 mmol) und Ammoniumacetat (0,28 g, 3,63 mmol) in Eisessig (3 ml) wurde 1,5 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen wurde das Gemisch mit konz. NH₄OH neutralisiert und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei ein gelbes Öl erhalten wurde. Reinigung durch Flash-Chromatographie (15–25% EtOAc/Hex) lieferte die Titelverbindung als weißen Feststoff (9,0 mg): ESMS (m/z): 317 (M⁺ + H).

Referenzbeispiel 6
2-Amino-4-(4-fluorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol
Ein Gemisch aus 1-(t-Butyldimethylsilyloxy)-2-(4-fluorphenyl)-1-(4-pyridyl)ethanon [Siehe Bsp. 79 (a) aus Adams et al., WO93/14081] (5,16 g, 15,0 mmol), Cyanamid (0,95 g, 22,5 mmol) und KOH (0,55 g, 9,8 mmol) in EtOH (20 ml) wurde unter Rückfluss 1 h erhitzt. Nach Abkühlen wurde der Niederschlag abfiltriert und mit EtOH gewaschen. Umkristallisation aus CH₂Cl₂/MeOH lieferte die Titelverbindung als gelben Feststoff (0,38 g): ESMS (m/z): 256 (M⁺ + H).
Beispiel 1
4-(4-Fluorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol
a) 4'-Fluorphenyl(tolylthio)methylformamid
Eine Lösung aus p-Fluorbenzaldehyd (13,1 ml, 122 mmol), Thiokresol (16,64 g, 122 mmol), Formamid (15,0 ml, 445 mmol) und Toluol (300 ml) wurden vereint und 18 h unter Toluolrückfluss unter azeotroper Entfernung von H₂O erhitzt. Das abgekühlte Umsetzungsgemisch wurde mit EtOAc (500 ml) verdünnt und mit gesättigter wässriger Na₂CO₃-Lösung (3 × 100 ml) und gesättigter wässriger NaCl-Lösung (100 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und eingeengt. Der Rückstand wurde mit Petrolether verrieben, filtriert und im Vakuum getrocknet, wobei 28,50 g der Titelverbindung als weißer Feststoff (85%) bereitgestellt wurden. Schmp.: 119–120°C.
b) 4'-Fluorphenyl(tolylthio)methylisocyanid
4'-Fluorphenyl(tolylthio)methylformamid (25 g, 91 mmol) in CH₂Cl₂ (300 ml) wurde auf –30°C abgekühlt und unter mechanischem Rühren wurde tropfenweise POCl₃ (11 ml, 110 mmol) zugesetzt, worauf tropfenweise Zugabe von Et₃N (45 ml, 320 mmol) folgte, wobei die Temperatur unter –30°C gehalten wurde. Es wurde 30 min bei –30°C und 2 h bei 5°C gerührt, mit CH₂Cl₂ (300 ml) verdünnt und mit 5%iger wässriger Na₂CO₃-Lösung (3 × 100 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und auf 500 ml eingeengt. Diese Lösung wurde durch einen 12 × 16 cm Zylinder aus Siliciumdioxid in einem großen Sinterglastrichter mit CH₂Cl₂ filtriert, wobei 12,5 g (53%) gereinigtes Isonitril als hellbrauner, wachsartiger Feststoff bereitgestellt werden. IR (CH₂Cl₂) 2130 cm^–1.
c) 4-(4-Fluorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol
4-Fluorphenyl(tolylthio)methylisocyanid (2,57 g, 10 mmol), Pyridin-4-carboxaldehyd (1,07 g, 10 mmol) und CH₂Cl₂ (20 ml) wurden unter Ar bei –15°C (Eis-Methanol-Bad) gerührt und TBD (1,39 g, 10 mmol) wurde portionsweise zugesetzt. Die Umsetzungstemperatur stieg auf 5°C an, bevor wieder auf –15°C abgekühlt wurde. Das Umsetzungsgemisch wurde auf 4°C erwärmen gelassen und wurde bei dieser Temperatur 18 h gehalten, mit EtOAc (100 ml) verdünnt und mit 10%iger wässriger Na₂CO₃-Lösung (3 × 25 ml) gewaschen. Die EtOAc-Phase wurde dann mit 1 N HCl (3 × 15 ml) extrahiert und Kristalle bildeten sich aus der wässrigen Phase. Nach einstündigem Stehen bei 23°C wurden die Kristalle abfiltriert, mit absolutem EtOH (25 ml) und Et₂O (2 × 25 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei 1,47 g (53%) der Titelverbindung als Hydrochlorid bereitgestellt wurden. Das wässrige Filtrat wurde mit EtOAc (2 × 40 ml) gewaschen und durch vorsichtige Zugabe von festem K₂CO₃ basisch gemacht. Extraktion der wässrigen Phase mit EtOAc (3 × 40 ml), Trocknen (Na₂SO₄), Einengen und Kristallisation des Rückstands (Hexan/Aceton) lieferte weitere 0,426 g (18%) der Titelverbindung als freie Base, Schmp. (freie Base): 110–111°C.
Beispiel 2
4-(4-Fluorphenyl)-5-(2-methylpyrid-4-yl)oxazol
Die Verbindung aus Beispiel 7(b) (0,599 g, 2,33 mmol) und 2-Methylpyridin-4-carboxaldehyd (257 mg, 2,12 mmol) und CH₂Cl₂ (4 ml) wurden durch das Verfahren aus Beispiel 7 umgesetzt. Das erhaltene Umsetzungsgemisch wurde durch Verdünnen mit EtOAc (40 ml), Waschen mit gesättigter wässriger Na₂CO₃-Lösung (2 × 15 ml) und Extraktion der EtOAc-Phase mit 1 N HCl (3 × 15 ml) aufgearbeitet. Die vereinten wässrigen Phasen wurden mit EtOAc (3 × 25 ml) gewaschen und dann durch vorsichtige Zugabe von K₂CO₃ basisch gemacht. Extraktion der wässrigen Phase mit EtOAc (4 × 40 ml), Trocknen (Na₂SO₄) und Einengen lieferte ein gelbbraunes Öl, das nicht zur Verfestigung gebracht werden konnte. Der Rückstand wurde in 9 : 1 Et₂O/Aceton (20 ml) gelöst und 1 N etherische HCl (3 ml) wurde zugesetzt. Der ausgefallene Feststoff wurde mit Et₂O gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei 471 mg (79%) der Titelverbindung als Hydrochlorid bereitgestellt wurden; Schmp.: 198–200°C (Zers.).
Beispiel 3
4-(3,4-Dichlorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol
Unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 7(a, b, c), wobei 4-Fluorbenzaldehyd durch 3,4-Dichlorbenzaldehyd ersetzt wurde, wurde die Titelverbindung hergestellt. Schmp.: 142°C.
Beispiel 4
4-(3-Chlorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol
Unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 7(a, b, c), wobei 4-Fluorbenzaldehyd durch 3-Chlorbenzaldehyd ersetzt wurde, wurde die Titelverbindung hergestellt. Schmp.: 125–126°C.
Referenzbeispiel 7
4-(4-Fluorphenyl)-2-(4-methylthiophenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol

(a) 2-(4-Fluorphenyl)-1-(4-pyridyl)-2-oxoethyl-4-methylthiobenzoat und 1-(4-Fluorphenyl)-2-(4-pyridyl)-2-oxoethyl-4-methylthiobenzoat – Die Titelverbindungen wurden unter Verwendung desselben Verfahrens von Lantos et al. (J. Med. Chem. 1984, 27, 72), dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist, hergestellt und verwendet, um 1-(4-Fluorphenyl)-2-(4-pyridyl)-2-oxoethylbenzoat und 2-(4-Fluorphenyl)-1-(4-pyridyl)-2-oxoethylbenzoat herzustellen, doch unter Verwendung von 1-Cyano-1-(4-pyridyl)methyl-4-methylthiobenzoat.
(b) 4-(4-Fluorphenyl)-2-(4-methylthiophenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol – Einer ein Gemisch aus 2-(4-Fluorphenyl)-1-(4-pyridyl)-2-oxoethyl-4-methylthiobenzoat und 1-(4-Fluorphenyl)-2-(4-pyridyl)-2-oxoethyl-4-methylthiobenzoat (1,0 g, 2,62 mmol) enthaltenden Lösung in Eisessig (50 ml) wurde Ammoniumacetat (2,0 g, 26,2 mmol) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 1,5 h unter Rückfluss erhitzt und dann abkühlen gelassen. Das Gemisch wurde in H₂O gegossen, mit konz. NH₄OH neutralisiert und mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Reinigung durch Säulenchromatographie unter Elution mit 5 : 1 bis 1 : 1 Hex/EtOAc lieferte die Titelverbindung (77,6 mg) als gelben Feststoff: ESMS (m/z): 363,0 (M⁺ + H).

Referenzbeispiel 8
4-(4-Fluorphenyl)-2-[4-(methylsulfinyl)phenyl]-5-(4-pyridyl)oxazol
Einem Gemisch aus 4-(4-Fluorphenyl)-2-(4-methylthiophenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol (0,056 g, 0,15 mmol) in Eisessig (12 ml) wurde eine Lösung aus K₂S₂O₈ (0,07 g, 0,24 mmol) in H₂O (2 ml) zugesetzt. Nach 48 stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde der Niederschlag abfiltriert. Reinigung durch Säulenchromatographie (25 : 1 CH₂Cl₂/MeOH), gefolgt von Verreiben mit Et₂O lieferte die Titelverbindung (0,014 g) als weißen Feststoff: ESMS (m/z) = 379,0 (M⁺ + H).
Referenzbeispiel 9
2-Acetamido-4-(4-fluorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol
Ein Gemisch aus 2-Amino-4-(4-fluorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol (0,090 g, 0,353 mmol) in Acetanhydrid (4 ml) wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 72 h wurde das Gemisch in H₂O gegossen und mit konz. NH₄OH neutralisiert. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert und mit H₂O gewaschen. Reinigung durch Säulenchromatographie (0,5% MeOH/CHCl₃), gefolgt von Umkristallisation aus MeOH lieferte die Titelverbindung als weißen Feststoff (30,0 mg): ESMS (m/z): 298,0 (M⁺ + H).
Referenzbeispiel 10
4-(4-Fluorphenyl)-5-(2-amino-4-pyrimidinyl)oxazol
a) 1-N,N-Dimethylamino-(4,4-dimethoxy)buten-3-on
Pyruvinaldehyddimethylacetal (50 ml, 0,4106 mol) und N,N-Dimethylformamiddimethylacetal (54,5 ml, 0,4106 mol) wurden unverdünnt gemischt und achtzehn Stunden auf 80°C erhitzt. Das Rohprodukt (95,0 g) wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
b) 2-Amino-4-(dimethoxymethyl)pyrimidin
Guanidinhydrochlorid (43 g) wurde in Wasser (150 ml) gemischt und bei Raumtemperatur zu 1-N,N-Dimethylamino-(4,4-dimethoxy)buten-3-on (95,0 g, roh) zugesetzt. Natriumhydroxid wurde in Wasser gemischt und bei Raumtemperatur dem Umsetzungsgemisch zugesetzt. Das Umsetzungsgemisch wurde dann achtzehn Stunden auf 60°C erhitzt. Ein Niederschlag bildete sich und wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Rohprodukt (32,5 g) wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
c) 2-Amino(pyrimidinyl)aldehyd
2-Amino-4-(dimethoxymethyl)pyrimidin (6,6 g, 0,0390 mol) wurde in 3 N HCl (29,96 ml, 0,0858 mol) unverdünnt gemischt und sechzehn Stunden auf 47°C erhitzt. Das Umsetzungsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und Ethylacetat (150 ml) wurde zugesetzt. NaHCO₃ (16,17 g, 0,1716 mol) wurde dann langsam zugesetzt. Das Gemisch wurde gerührt und die organische Phase abdekantiert; dies wurde insgesamt fünfmal wiederholt. Die organischen Phasen wurden vereint und eingedampft, wobei das Produkt als gelber Feststoff (2,33 g, 48%) erhalten wurde. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9,80 (s, 1H), 8,50 (d, 1H), 7,08 (d, 1H), 5,25 (s breit, 2H).
d) 2-Aminopyrimidin-[2,2,6,6-tetramethylpiperidinyl]imin
2-Amino(pyrimidin-4-yl)aldehyd (2,33 g, 0,0189 mol) und 4-Amino-(2,2,6,6-tetramethyl)piperidin (3,24 ml, 0,0189 mol) wurden in CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur acht Stunden gemischt, wobei das Rohprodukt (welches das Imin und eine große, etwa gleiche Menge an nicht umgesetztem 2-Amino(pyrimidin-4-yl)aldehyd enthält) (4,92 g) erhalten wurde, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8,38 (d, 1H), 8,20 (s, 1H), 7,25 (d, 1H), 5,10 (s breit, 2H), 1,79 (m, 1H), 1,70 (m, 1H), 1,40 (t, 2H), 1,30–1,00 (m, 12H), 0,85 (t, 2H).
e) 4-(4-Fluorphenyl)-5-(2-amino-4-pyrimidinyl)oxazol
Das rohe Gemisch aus dem vorstehenden Schritt (d) (4,92 g) wurde in CH₂Cl₂ gemischt und auf 0°C abgekühlt. 4'-Fluorphenyl(tolythio)methylisocyanid (4,86 g, 0,0189 mol – man schaue beim vorstehenden Beispiel 7a) und 7b) nach) und 1,5,7-Triazabicyclo[4.4.0]dec-5-en (2,63 g, 0,0189 mol) wurden in CH₂Cl₂ gemischt und dem kalten Umsetzungsgemisch tropfenweise zugesetzt. Das Umsetzungsgemisch wurde achtundvierzig Stunden kalt gehalten. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und das rohe Gemisch durch Flash-Chromatographie (Kieselgel, CH₂Cl₂/Methanol) gereinigt, wobei zwei Produkte erhalten wurden; ein Imidazolderivat [4-(4-Fluorphenyl)-5-(2-amino-4-pyrimidinyl)pyrazol] und die Titelverbindung (550 mg). ¹H-NMR δ 8,36 (d, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,95 (m, 2H), 7,15 (m, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,10 (s breit, 2H).
BEHANDLUNGSVERFAHREN
Die Verbindungen der Formel (I) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon können bei der Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines beliebigen Erkrankungszustands bei einem Menschen oder anderen Säuger, der durch übermäßige oder unregulierte Zytokin-Erzeugung durch solche Säugerzellen, wie Monozyten und/oder Makrophagen, aber nicht darauf beschränkt, verschlimmert oder verursacht wird, verwendet werden.
Folglich stellt die Erfindung eine Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Asthma, Schocklunge (ARDS), Schlaganfall, Knochenresorptionserkrankungen oder arthritischen Gelenkbeschwerden und anderen entzündlichen Erkrankungen bei einem Säuger, der der Behandlung bedarf, bereit.
Die Verbindungen der Formel (I) werden in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die Zytokin-, insbesondere IL-1-, IL-8- oder TNF-Erzeugung so zu hemmen, dass sie auf normale Anteile oder in einigen Fällen auf unterdurchschnittliche Anteile herunterreguliert wird, so dass der Erkrankungszustand verbessert oder verhindert wird. Anormale Anteile von IL-1, IL-8 oder TNF, zum Beispiel im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung, stellen dar: (i) Anteile an freiem (nicht zellgebundenem) IL-1, IL-8 oder TNF größer als oder gleich 1 Picogramm pro ml; (ii) beliebiges zellassoziiertes IL-1, IL-8 oder TNF oder (iii) die Anwesenheit von IL-1-, IL-8- oder TNF-mRNA über den Grundanteilen in Zellen oder Geweben, in denen IL-1, IL-8 bzw. TNF erzeugt werden.
Die Feststellung, dass die Verbindungen der Formel (I) Hemmstoffe von Zytokinen, speziell IL-1, IL-8 und TNF, sind, basiert auf den Wirkungen der Verbindungen der Formel (I) auf die Erzeugung von IL-1, IL-8 und TNF in in vitro-Assays, die hier beschrieben sind.
Wie er hier verwendet wird, betrifft der Begriff "Hemmen der Erzeugung von IL-1 (IL-8 oder TNF)":

a) eine Abnahme übermäßiger in vivo-Anteile des Zytokins (IL-1, IL-8 oder TNF) bei einem Menschen auf normale oder subnormale Anteile durch Hemmung der in vivo-Freisetzung des Zytokins durch alle Zellen, die Monozyten oder Makrophagen einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind;
b) auf dem Genomlevel eine Herunterregulierung übermäßiger in vivo-Anteile des Zytokins (IL-1, IL-8 oder TNF) bei einem Menschen auf normale oder subnormale Anteile;
c) eine Herunterregulierung durch Hemmung der direkten Synthese des Zytokins (IL-1, IL-8 oder TNF) als Posttranslationsereignis; oder
d) auf dem Translationslevel eine Herunterregulierung übermäßiger in vivo-Anteile des Zytokins (IL-1, IL-8 oder TNF) bei einem Menschen auf normale oder subnormale Anteile.

Wie er hier verwendet wird, betrifft der Begriff "TNF-vermittelte(r) Erkrankung oder Erkrankungszustand" beliebige und alle Erkrankungszustände, bei denen TNF eine Rolle spielt, entweder durch Erzeugung von TNF selbst oder dadurch, dass TNF verursacht, dass ein anderes Monokin, wie IL-1, IL-6 oder IL-8, aber nicht darauf beschränkt, freigesetzt wird. Ein Erkrankungszustand, bei dem zum Beispiel IL-1 eine Hauptkomponente ist, und dessen Erzeugung oder Wirkung als Antwort auf TNF verschlimmert oder sezerniert wird, würde deshalb als durch TNF vermittelter Erkrankungszustand betrachtet werden.
Wie er hier verwendet wird, betrifft der Begriff "Zytokin" ein beliebiges sezerniertes Polypeptid, das die Funktionen von Zellen beeinflusst und ein Molekül ist, das Wechselwirkungen zwischen Zellen bei der Immun-, Entzündungs- oder hämopoetischen Reaktion moduliert. Ein Zytokin schließt ungeachtet dessen, welche Zellen sie erzeugen, Monokine und Lymphokine ein, aber ist nicht darauf beschränkt. Zum Beispiel gilt im Allgemeinen für ein Monokin, dass es durch eine einkernige Zelle, wie einen Makrophagen und/oder Monozyten, erzeugt und sezerniert wird. Viele andere Zellen erzeugen jedoch auch Monokine, wie natürliche Killerzellen, Fibroblasten, Basophile, Neutrophile, Endothelzellen, Hirnastrozyten, Knochenmarkstromazellen, epidermale Keratinozyten und B-Lymphozyten. Im Allgemeinen gilt für Lymphokine, dass sie durch Lymphozytenzellen erzeugt werden. Beispiele von Zytokinen schließen, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8), den Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) und den Tumor-Nekrose-Faktor-β (TNF-β) ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Wie er hier verwendet wird, betrifft der Begriff "Zytokin störende" oder "Zytokin unterdrückende Menge" eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel (I), die eine Abnahme der in vivo-Anteile des Zytokins auf normale oder subnormale Anteile verursachen wird, wenn sie einem Patienten zur Prophylaxe oder Behandlung eines Erkrankungszustands gegeben wird, der durch eine übermäßige oder unregulierte Zytokin-Erzeugung verschlimmert oder dadurch verursacht wird.
Wie es hier verwendet wird, ist das Zytokin, das in dem Ausdruck "Hemmung eines Zytokins zur Verwendung bei der Behandlung eines HIV-infizierten Menschen" erwähnt wird, ein Zytokin, das an (a) der Einleitung und/oder Aufrechterhaltung der T-Zellenaktivierung und/oder der durch aktivierte T-Zellen vermittelten HIV-Genexpression und/oder -replikation und/oder (b) einem beliebigen mit einer Zytokin-vermittelten Erkrankung verbundenen Problem, wie Kachexie oder Muskeldegeneration, beteiligt ist.
Ein TNF-β (auch bekannt als Lymphotoxin) weist starke strukturelle Homologie mit TNF-α (auch bekannt als Kachektin) auf und, da jeder ähnliche biologische Reaktionen induziert und an denselben Zellrezeptor bindet, werden sowohl TNF-α als auch TNF-β durch die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gehemmt und werden hier folglich gemeinsam als "TNF" erwähnt, sofern nicht speziell etwas anderes dargestellt ist.
Um eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon bei einer Therapie zu verwenden, wird sie normalerweise gemäß üblicher pharmazeutischer Praxis in ein Arzneimittel formuliert werden. Diese Erfindung betrifft deshalb auch ein Arzneimittel, das eine wirksame, ungiftige Menge einer Verbindung der Formel (I) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Verbindungen der Formel (I), pharmazeutisch verträgliche Salze davon und Arzneimittel, die solche einschließen, können zweckmäßigerweise durch beliebige Wege, die herkömmlicherweise zur Arzneistoffverabreichung verwendet werden, zum Beispiel oral, topisch, parenteral oder durch Inhalation verabreicht werden. Die Verbindungen der Formel (I) können in herkömmlichen Dosierungsformen verabreicht werden, die durch Kombinieren einer Verbindung der Formel (I) mit üblichen pharmazeutischen Trägern gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Die Verbindungen der Formel (I) können auch in herkömmlichen Dosierungen in Kombination mit einer bekannten, zweiten therapeutisch wirksamen Verbindung verabreicht werden. Diese Verfahren können Mischen, Granulieren und Komprimieren oder Auflösen der Bestandteile umfassen, wie es für die gewünschte Herstellung zweckmäßig ist. Selbstverständlich wird die Form und Eigenschaft des pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Verdünnungsmittels durch die Menge an Wirkstoff, mit der er zu kombinieren ist, den Verabreichungsweg und andere bekannte Variablen diktiert. Der/die Träger muss/müssen in dem Sinn "verträglich" sein, dass er/sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung vereinbar und für deren Empfänger nicht schädlich ist/sind.
Die verwendeten pharmazeutischen Träger können zum Beispiel entweder ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Beispielhaft für feste Träger sind Lactose, Terra alba, Saccharose, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Gummi arabicum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen. Beispielhaft für flüssige Träger sind Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Wasser und dergleichen. Ebenso kann der Träger oder das Verdünnungsmittel im Fachgebiet bekanntes Zeitverzögerungsmaterial, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat allein oder mit einem Wachs, einschließen.
Eine breite Vielfalt an pharmazeutischen Formen kann verwendet werden. So kann die Zubereitung, falls ein fester Träger verwendet wird, tablettiert werden, in Pulver- oder Körnchenform in eine Hartgelatinekapsel oder in die Form einer Lutschpastille oder Pastille gebracht werden. Die Menge an festem Träger wird breit variieren, aber vorzugsweise wird sie etwa 25 mg bis etwa 1 g sein. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, wird die Zubereitung in Form eines Sirups, einer Emulsion, einer Weichgelatinekapsel, einer sterilen injizierbaren Flüssigkeit, wie in einer Ampulle, oder in einer nichtwässrigen flüssigen Suspension vorliegen.
Verbindungen der Formel (I) können topisch verabreicht werden, das heißt durch nichtsystemische Verabreichung. Diese umfasst das Aufbringen einer Verbindung der Formel (I) äußerlich auf die Epidermis oder das Vestibulum oris und die Einträufelung solch einer Verbindung in das Ohr, das Auge und die Nase, so dass die Verbindung nicht wesentlich in den Blutstrom eintritt. Im Gegensatz dazu betrifft die systemische Verabreichung orale, intravenöse, intraperitoneale und intramuskuläre Verabreichung.
Zur topischen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen flüssige oder halbflüssige Zubereitungen ein, die zum Eindringen durch die Haut an den Entzündungsort geeignet sind, wie Linimenta, Lotionen, Cremes, Salben oder Pasten und Tropfen, die zur Verabreichung an das Auge, das Ohr oder die Nase geeignet sind. Der Wirkstoff kann für topische Verabreichung von 0,001 Gew./Gew.-% bis 10 Gew./Gew.-%, zum Beispiel von 1 Gew.-% bis 2 Gew.-% der Formulierung umfassen. Er kann jedoch so viel wie 10 Gew./Gew.-% umfassen, aber wird vorzugsweise weniger als 5 Gew./Gew.-%, stärker bevorzugt von 0,1 Gew./Gew.-% bis 1 Gew./Gew.-% der Formulierung umfassen.
Lotionen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen diejenigen ein, die zum Auftragen auf die Haut oder am Auge geeignet sind. Eine Augenlotion kann eine sterile wässrige Lösung, die gegebenenfalls ein Bakterizid enthält, umfassen und kann durch Verfahren hergestellt werden, die denen zur Herstellung von Tropfen ähnlich sind. Lotionen oder Linimenta zum Auftragen auf die Haut können auch ein Mittel, um die Trocknung zu beschleunigen und die Haut zu kühlen, wie einen Alkohol oder Aceton, und/oder ein Feuchthaltemittel, wie Glycerin, oder ein Öl, wie Rizinusöl oder Erdnussöl, einschließen.
Cremes, Salben oder Pasten gemäß der vorliegenden Erfindung sind halbfeste Formulierungen des Wirkstoffs zur äußerlichen Anwendung. Sie können durch Mischen des Wirkstoffs in fein verteilter oder pulverisierter Form, allein oder in Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nichtwässrigen Flüssigkeit mit Hilfe geeigneter Maschinen mit einer fetten oder nichtfetten Grundlage hergestellt werden. Die Grundlage kann Kohlenwasserstoffe wie, hartes, weiches oder flüssiges Paraffin, Glycerin, Bienenwachs, eine Metallseife, einen Leim, ein Öl natürlichen Ursprungs, wie Mandel-, Mais-, Erdnuss-, Rizinus- oder Olivenöl, Wollfett oder seine Derivate oder eine Fettsäure, wie Sterin- oder Ölsäure, zusammen mit einem Alkohol, wie Propylenglykol, oder einem Makrogel umfassen. Die Formulierung kann ein beliebiges geeignetes oberflächenaktives Mittel, wie ein anionisches, kationisches oder nichtionisches oberflächenaktives Mittel, wie einen Sorbitanester oder ein Polyoxyethylenderivat davon, einschließen. Suspensionsmittel, wie natürliche Gummis, Cellulosederivate oder anorganische Materialien, wie kieselerdehaltige Silicamaterialien, und andere Bestandteile, wie Lanolin, können auch eingeschlossen sein.
Tropfen gemäß der vorliegenden Erfindung können sterile wässrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen umfassen und können durch Auflösen des Wirkstoffs in einer geeigneten wässrigen Lösung eines bakteriziden und/oder fungiziden Mittels und/oder eines beliebigen anderen geeigneten Konservierungsmittels und vorzugsweise einschließlich eines oberflächenaktiven Stoffs hergestellt werden. Die erhaltene Lösung kann dann durch Filtration geklärt, in einen geeigneten Behälter, der dann versiegelt wird, überführt und durch Behandlung im Autoklaven oder halbstündiges Halten bei 98–100°C sterilisiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Lösung durch Filtration sterilisiert und durch eine aseptische Technik in den Behälter überführt werden. Beispiele bakterizider und fungizider Mittel, die zum Einschluss in die Tropfen geeignet sind, sind Phenylquecksilbernitrat oder -acetat (0,002%), Benzalkoniumchlorid (0,01%) und Chlorhexidinacetat (0,01%). Geeignete Lösungsmittel zur Herstellung einer öligen Lösung schließen Glycerin, verdünnten Alkohol und Propylenglykol ein.
Verbindungen der Formel (I) können parenteral, das heißt durch intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intranasale, intrarektale, intravaginale oder intraperitoneale Verabreichung verabreicht werden. Die subkutanen und intramuskulären Formen der parenteralen Verabreichung sind im Allgemeinen bevorzugt. Zweckmäßige Dosierungsformen für eine solche Verabreichung können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden. Verbindungen der Formel (I) können auch durch Inhalation verabreicht werden, das heißt durch intranasale und orale Inhalationsverabreichung. Zweckmäßige Dosierungsformen für eine solche Verabreichung, wie eine Aerosolformulierung oder ein Inhalator mit abgemessener Dosis, können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
Für alle hier offenbarten Anwendungsverfahren für die Verbindungen der Formel (I) wird die tägliche orale Dosierungsvorschrift vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 80 mg/kg Gesamtkörpergewicht, vorzugsweise etwa 0,2 bis 30 mg/kg, stärker bevorzugt etwa 0,5 mg bis 15 mg/kg sein. Die tägliche parenterale Dosierungsvorschrift ist etwa 0,1 bis etwa 80 mg/kg Gesamtkörpergewicht, vorzugsweise etwa 0,2 bis etwa 30 mg/kg und stärker bevorzugt etwa 0,5 mg bis 15 mg/kg. Die tägliche topische Dosierungsvorschrift wird vorzugsweise 0,1 mg bis 150 mg sein, die ein- bis vier-, vorzugsweise zwei- oder dreimal täglich verabreicht werden. Die tägliche Inhalationsdosierungsvorschrift wird vorzugsweise etwa 0,01 mg/kg bis etwa 1 mg/kg pro Tag sein. Es wird von einem Fachmann auch erkannt werden, dass die optimale Menge und Einteilung der einzelnen Dosierungen einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon durch die Beschaffenheit und das Ausmaß des zu behandelnden Zustands, die Form, den Weg und den Ort der Verabreichung und den einzelnen zu behandelnden Patienten bestimmt werden wird und dass solche Optimalwerte durch herkömmliche Verfahren bestimmt werden können. Für einen Fachmann wird auch selbstverständlich sein, dass der optimale Behandlungsverlauf, d. h. die Zahl an Dosen einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, die über eine definierte Zahl von Tagen pro Tag gegeben wird, die durch Fachleute unter Verwendung herkömmlicher Tests zur Bestimmung des Behandlungsverlaufs ermittelt werden kann.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die lediglich veranschaulichend sind und nicht als Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung gedacht sind, beschrieben werden.
BIOLOGISCHE BEISPIELE
Die Zytokin-hemmenden Wirkungen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden in vitro-Assays bestimmt:
Interleukin 1 (IL-1)
Monozyten aus peripherem Menschenblut wurden entweder aus frischen Blutpräparaten von freiwilligen Spendern oder aus Blutbankleukozytenmanschetten gemäß dem Verfahren von Colotta et al., J. Immunol., 132, 936 (1984), isoliert und gereinigt. Diese Monozyten (1 × 10⁶) wurden auf Platten mit 24 Vertiefungen bei einer Konzentration von 1–2 Millionen/ml pro Vertiefung aufgebracht. Die Zellen wurden 2 Stunden anhaften gelassen; nach dieser Zeit wurden die nicht fest haftenden Zellen durch vorsichtiges Waschen entfernt. Testverbindungen wurden den Zellen dann 1 h vor Zugabe von Lipopolysaccharid (50 ng/ml) zugesetzt, und die Kulturen wurden bei 37°C weitere 24 h inkubiert. Am Ende dieser Zeitspanne wurden die Kulturüberstände entfernt und von Zellen und allem Abfall geklärt. Die Kulturüberstände wurden dann entweder durch das Verfahren von Simon et al., J. Immunol. Methods, 84, 85, (1985) (basierend auf der Fähigkeit von IL-1, eine Interleukin 2 erzeugende Zelllinie (EL-4) anzuregen, um gemeinsam mit dem A23187-Ionophor IL-2 zu sezernieren) oder das Verfahren von Lee et al., J. Immunotherapy, 6 (1), 1–12 (1990) (ELISA-Assay) sofort auf IL-1 biologische Aktivität untersucht. Es wurde gezeigt, dass Verbindungen der Formel (I), wie sie hier durch Beispiel 1 veranschaulicht werden, Hemmstoffe von in vitro-IL-1, das durch menschliche Monozyten erzeugt wird, sind.
Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)
Monozyten aus peripherem Menschenblut werden entweder aus Blutbankleukozytenmanschetten oder Thrombozytenphereserückständen gemäß dem Verfahren von R. Colotta et al., J. Immunol, 132 (2), 936 (1984) isoliert und gereinigt. Die Monozyten werden bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml Medium/Vertiefung in Mehrfachschalen mit 24 Vertiefungen aufgebracht. Die Zellen werden 1 Stunde anhaften gelassen; nach dieser Zeit wird der Überstand abgesaugt und frisches Medium (1 ml, RPMI-1640, Whitaker Biomedical Products, Whitaker, CA), das 1% fetales Kalbsserum plus Penicillin und Streptomycin (10 Einheiten/ml) enthält, zugesetzt. Die Zellen werden 45 Minuten in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung in 1 nM–10 mM Dosisbereichen inkubiert (die Verbindungen wurden in Dimethylsulfoxid/Ethanol löslich gemacht, so dass die Endlösungsmittelkonzentration in dem Kulturmedium 0,5% Dimethylsulfoxid/0,5% Ethanol ist). Bakterienlipopolysaccharid (E. coli 055:B5 [LPS] von Sigma Chemicals Co.) wird dann zugesetzt (100 ng/ml in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung) und die Kulturen werden 16–18 Stunden bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO₂ inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraums werden die Kulturüberstände von den Zellen entfernt und bei 3000 U/min zentrifugiert, um Zellabfall zu entfernen. Der Überstand wird dann unter Verwendung entweder eines Radioimmun- oder eines ELISA-Assays, wie in WO 92/10190 und von Becker et al., J. Immunol., 1991, 147, 4307 beschrieben, auf TNF-Aktivität untersucht.
Interleukin 8 (IL-8)
Primäre menschliche Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) (Cell Systems, Kirland, Wa) werden in Kulturmedium erhalten, das mit 15% fetalem Rinderserum und 1% CS-HBGF, bestehend aus aFGF und Heparin, ergänzt ist. Die Zellen werden dann zwanzigfach verdünnt, bevor sie (250 μl) auf gelatinebeschichtete Platten mit 96 Vertiefungen aufgebracht werden. Vor der Verwendung wird das Kulturmedium mit frischem Medium (200 μl) ersetzt. Puffer oder Testverbindung (25 μl, bei Konzentrationen zwischen 1 und 10 μM) wird dann jeder Vertiefung in vierfacher Ausfertigung den Vertiefungen zugesetzt und die Platten werden 6 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraums wird der Überstand entfernt und unter Verwendung einer IL-8-ELISA-Ausrüstung, die von R&D Systems (Minneapolis, MN) erhalten wird, auf IL-8-Konzentration untersucht. Alle Daten sind als Mittelwert (ng/ml) mehrfacher Proben bezogen auf die Standardkurve vorgelegt. Die IC₅₀-Werte werden, wo es zweckmäßig ist, durch nichtlineare Regressionsanalyse erzeugt.
Proteinassay auf Zytokin-spezifische Bindung
Ein radiokompetitiver Bindungsassay wurde entwickelt, um einen höchst reproduzierbaren primären Screen für Struktur-Wirkungs-Untersuchungen bereitzustellen. Dieser Assay stellt viele Vorteile gegenüber den herkömmlichen Bioassays bereit, die frisch isolierte menschliche Monozyten als Quelle von Zytokinen und ELISA-Assays, um sie quantitativ zu bestimmen, verwenden. Abgesehen davon, dass er ein viel leichterer Assay ist, ist der Bindungsassay ausführlich bestätigt worden, um sehr mit den Ergebnissen des Bioassays zu korrelieren. Ein spezifischer und reproduzierbarer Bindungsassay wurde entwickelt, um Verbindungen, die zur CSAID^TM-Klasse von Verbindungen gehören, unter Verwendung einer löslichen zytosolischen Fraktion aus THP.1-Zellen und einer radiomarkierten Verbindung zu prüfen. Zum Beispiel ist eine geeignete radiomarkierte Verbindung der CSAID^TM-Klasse von Verbindungen 4-(Fluorphenyl)-2-(4-hydroxyphenyl-3,5-t₂)-5-(4-pyridyl)imidazol, das in einem analogen Verfahren, wie es bei Adams et al., WO93/14081 gezeigt ist, oder wie nachstehend veranschaulicht hergestellt werden kann.
Kurz, das THP.1-Zytosol wurde routinemäßig aus Zelllysat hergestellt, das durch Stickstoffaushöhlung, gefolgt von einer Zentrifugation bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 10 K × g und einer hohen Geschwindigkeit von 100 K × g erhalten wurde, deren Überstand als zytosolische Fraktion bezeichnet wurde. THP.1-Zytosol wurde mit entsprechend verdünntem Radioliganden bei Raumtemperatur über einen vorher festgelegten Zeitraum inkubiert, um der Bindung zu gestatten, ein Gleichgewicht zu erreichen. Die Probe wurde einer G-10-Säule zugesetzt und mit 20 mm TRN, 50 mM 2-Mercaptoethanol, NaN₃ eluiert. Die das Hohlraumvolumen umfassende Fraktion wurde gesammelt und die Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationszählung bewertet. Diese wurde bestimmt, um gebundenen Radioliganden zu reflektieren, da das radioaktive Signal durch die Anwesenheit von überschüssigem nicht radioaktiven Liganden im Inkubationsgemisch außer Kraft gesetzt wurde oder wenn keine zytosolische Fraktion anwesend war. Verbindungen der Formel (I) bei verschiedenen Dosen wurden für den Bindungsassay zugesetzt, um eine Hemmung der Bindung der Radiomarkierung zu erreichen. Die IC₅₀- sowie Ki-Werte wurden durch Regressionsanalyse bzw. "Scatchard"-Plotanalyse bestimmt. Es gibt im Allgemeinen eine ausgezeichnete Korrelation zwischen den IC₅₀-Werten der geprüften Verbindungen sowohl im Bindungsassay als auch im Bioassay und sie können in vielen Fällen ausgetauscht werden. Es wurde gezeigt, dass die Verbindungen der Formel (I), wie sie hier durch die Beispiele 1 bis 4 veranschaulicht werden, Aktivität im CSBP-Assay aufweisen.
Die Patentanmeldung WO95/07922, Lee et al., eingereicht im September 1993, beschreibt auch das vorstehend angemerkte Verfahren zum Screening von Arzneistoffen, um Verbindungen zu identifizieren, die mit dem CSBP wechselwirken und daran binden. Jedoch für die Zwecke hier kann das Bindungsprotein in isolierter Form in Lösung oder in immobilisierter Form vorliegen oder kann genmanipuliert sein, um auf der Oberfläche rekombinanter Wirtszellen, wie im Phagendisplaysystem, oder als Fusionsproteine exprimiert zu werden. In einer anderen Ausführungsform können ganze Zellen oder zytosolische Fraktionen, die das CSBP umfassen, im Screeningprotokoll verwendet werden. Ungeachtet der Form des Bindungsproteins wird eine Vielzahl von Verbindungen mit dem Bindungsprotein unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die ausreichen, um einen Komplex aus Verbindung/Bindungsprotein zu bilden, und Verbindungen, die die Komplexe bilden, verbessern oder stören können, werden nachgewiesen.
Spezieller wird der Zytokin-spezifische Bindungsassay folgendermaßen durchgeführt:
MATERIALIEN
Inkubationspuffer: 20 mM Tris, 1 mM MgCl₂, 20 mM Hepes, 0,02% NaN₃, gelagert bei 4°C.
Elutionspuffer: 20 mM Tris, 50 mM 2-Mercaptoethanol, NaN₃, gelagert bei 4°C.
G-10 Sephadex: 100 g Sephadex G-10 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) werden 400 ml doppelt destilliertem H₂O zugesetzt und bei Raumtemperatur 2 Stunden quellen gelassen.
Die Feinanteile werden dekantiert und dreimal gewaschen. NaN₃ wird zugesetzt und mit ausreichend doppelt destilliertem H₂O auf 500 ml aufgefüllt und bei 4°C gelagert.
Zusammenbau der Säulen: Strohsäule, Filterfritte und Spitze (Kontes, SP 420160-000, 420162-002). Schwachsorbierende Röhren (Nunc), verwendet in Bindungsreaktion. THP.1-Zytosol-Zentrifugieren bei 15000 U/min für 5 min zum Klären. THP.1-Zytosol hergestellt durch hypnotische Behandlung von Zellen und Lyse durch Dekompression in Stickstoff. Kerne und Membranfragmente entfernt durch differentielle Zentrifugation (über eine Stunde bei 10000 g und über eine Stunde bei 100000 g).
Verbindungen: Nichtradioaktive Verbindung I mit entsprechender EtOH-Kontrolle (Verdünnungen hergestellt in Inkubationspuffer) und ³H-Verbindung I (Verdünnungen in Inkubationspuffer).
VERFAHREN
A. Säulenherstellung
1) Man beginnt 30 min vor der erwarteten Elution des Umsetzungsgemisches; 2) 3 ml G-10-Aufschlämmung werden der Säule für ein Bettvolumen von 1,5 ml zugesetzt; 3) es wird mit 7 ml Elutionspuffer (eingefüllt am Säulenkopf) gespült; 4) die Säulen werden zur Größe heruntergeschnitten.
B. Probeninkubation
1) 15 min Inkubation bei 4°C; 2) Bindungsreaktionsgemisch: 100 μl Zytosol, 10 μl nichtradioaktive Verbindung I oder EtOH-Kontrolle, 10 μl ³H-Verbindung I (molare Konzentration hängt von Art der Untersuchung ab); 3) "Freie" Kontrolle: 100 μl Inkubationspuffer an Stelle der Zytosolzubereitung.
C. Probenelution
1) Es wird bei 4°C eluiert; 2) das gesamte Umsetzungsvolumen wird der G-10-Säule zugesetzt; 3) 400 μl Elutionspuffer werden der Säule zugesetzt und das Eluat wird verworfen; 4) 500 μl Elutionspuffer werden der Säule zugesetzt, wobei das eluierte Volumen in 20 ml Szintillationsfläschchen gesammelt wird; 5) 15 ml Ready Safe-Szintillationsflüssigkeit werden zugesetzt; 6) Es wird verwirbelt und in einem Flüssigszintillationszähler 5 Minuten gezählt. Es wird eine "Kontrolle der insgesamt eingegebenen Zählimpulse" (10 μl markierter Ligand) eingeschlossen.
D. Datenanalyse
1) DPMS wird als Ausgabe in graphischer Form aufgezeichnet und es wird durch Regressionsanalyse und "Lundon-Ligandenbindungs"-Software zur Bestimmung der IC₅₀- bzw. Kd/Ki-Werte analysiert; 2) die Reihenfolge der IC₅₀-Werte der geprüften Verbindungen in dem CSAID-Bioassay wird geordnet und mit der verglichen, die durch den CSAID-Bindungsassay erzeugt wird, und eine Korrelationskurve wird aufgestellt.
Der Bindungsassay wurde weiter durch die folgenden Kriterien bestätigt, d. h. THP.1-Zytosol zeigte sättigende und spezifische Bindung der radiomarkierten Verbindung.
Herstellung von 4-(Fluorphenyl)-2-(4-hydroxyphenyl-3,5-t₂)-5-(4-pyridyl)imidazol (Verbindung I)
Eine 2,9 mg (0,0059 mmol) Portion von 2-(3,5-Dibrom-4-hydroxyphenyl)-4-(4-fluorphenyl)-5-(4-pyridyl)imidazol, Verbindung I, wurde in 0,95 ml trockenem DMF und 0,05 ml Triethylamin in einem 2,4 ml Rundkolben, der mit einem kleinen magnetischen Rührstab ausgerüstet war, gelöst. Eine 1,7 mg Portion von 5% Pd/C (Engelhard Partie 28845) wurde zugesetzt, und der Kolben wurde am Edelstahltritiumverteilerstück befestigt. Das Gemisch wurde durch vier Frost/Tau-Pumpenzyklen entgast, dann wurde Tritiumgas (5,3 Ci, 0,091 mmol) eingeleitet. Das Umsetzungsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und 20 h kräftig gerührt. Das Gemisch wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren, das zurückbleibende Tritiumgas (2,4 Ci) wurde entfernt, und der Kolben wurde von dem Verteilerstück entfernt. Das Umsetzungsgemisch wurde unter Verwendung von 3 × 1 ml Methanol als Spülflüssigkeiten in einen 10 ml Rundkolben überführt, und die Lösungsmittel wurden durch statischen Vakuumtransport entfernt. Eine 1,5 ml Portion Methanol wurde dem Rückstand zugesetzt und dann durch statischen Vakuumtransport entfernt. Der letztere Vorgang wurde wiederholt. Schließlich wurde der Rückstand in 1,5 ml Ethanol suspendiert und durch ein Spritzenspitzen-Millipore-Filter (0,45 Mikrometer) zusammen mit 3 × ca. 1 ml Ethanol-Spülflüssigkeiten filtriert. Das Gesamtfiltratvolumen wurde zu 3,9 ml bestimmt und die Gesamtradioaktivität zu 94,2 mCi. Die Lösung wurde zu 3,9 ml bestimmt und die Gesamtradioaktivität zu 94,2 mCi. HPLC-Analyse des Filtrats (Partisil 5 ODS-3, 4,6 mm Innendurchmesser × 25 cm, 1 ml/min von 70 : 30 : 0,1 Wasser/Acetonitril/Trifluoressigsäure, Radiomatic Flo-One Beta-Radiodetektor mit 3 ml/min von Ecoscint-H-Cocktail durch eine 0,75 ml Zelle) zeigte die Anwesenheit von Verbindung I (R_t = 60 min, ca. 37% der Gesamtradioaktivität) und ein bestimmtes Zwischenprodukt, das wahrscheinlich die Monobromderivatverbindung Ia (R_t = 11,8 min, ca. 9%) ist.

Die Filtratlösung wurde mit einem Stickstoffstrom fast zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in etwa 1,2 ml der mobilen HPLC-Phase gelöst. Die Lösung wurde durch HPLC, wie es nachstehend gezeigt ist, getrennt, und die den Verbindungen I und Ia und SB entsprechenden Peaks wurden getrennt gesammelt. HPLC-Verfahren

Säule	Altex Ultrasphere 10 mm Innendurchmesser × 25 cm
Mobile Phase	70 : 30 : 0,1 Wasser/Acetonitril/Trifluoressigsäure
Durchflussgeschwindigkeit	5 ml/min
UV-Nachweis	210 nm
Einspritzvolumina	0,05–0,4 ml
Retentionszeiten	7,8 min Verbindung I 24 min Verbindung Ia

Die vereinten Fraktionen der Verbindung I summierten sich zu einem Volumen von 32 ml und die radioaktive Konzentration war 1,52 mCi/ml (insgesamt 48,6 mCi). Die vereinten Fraktionen der SB-Verbindung Ia [³H] (insgesamt 10,1 mCi ausmachend) wurden zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde zur weiteren Analyse unter Verwendung von 3,8 ml absolutem Ethanol quantitativ in ein Glasfläschchen überführt.

Eine 8 ml (12,2 mCi) Portion der Verbindung I wurde im Vakuum bei < 35°C zur Trockne eingedampft, dann wieder in 0,5 ml der mobilen Phase gelöst. Das Gesamtvolumen wurde in das vorstehend beschriebene HPLC-System eingespritzt, und der entsprechende Peak wurde gesammelt. Eindampfen des gesammelten Eluats im Vakuum bei < 35°C und Überführen des gelben Rückstands mit absolutem Ethanol in ein Fläschchen stellte eine Lösung der Verbindung I (3,8 ml, 2,44 mCi/ml) bereit. Der für NMR-Analysen verwendete Teil dieser Lösung wurde zuerst unter Verwendung eines Stickstoffstroms zur Trockne eingedampft, dann in CD₃OD aufgenommen. Analyse von 4-(4-Fluorphenyl)-2-(4-hydroxyphenyl-3,5-t₂)-5-(4-pyridyl)imidazol, Verbindung I Radiochemische Reinheit durch HPLC Verfahren

Säule	Ultrasphere Octyl, 5 mm, 4,6 mm Innendurchmesser × 25 cm, Beckman
Mobile Phase	350 : 150 : 0,5 (V/V/V) Wasser/Acetonitril/Trifluoressigsäure
Durchflussgeschwindigkeit	1,0 ml/min
Massennachweis	UV bei 210 nm
Radioaktivitätsnachweis	Ramona-D Radioaktivitätsdurchflussdetektor
Szintillator	Tru-Count (Tru-Lab Supply Co.)
Durchflussgeschwindigkeit	5,0 ml/min
Zellvolumen	0,75 ml
Retentionszeit	7,7 min
Ergebnis	98,7%

Radioaktive Konzentration durch Szintillationszählung Verfahren

Szintillator	Ready Safe (Beckman Instruments, Inc.)
Gerät	TM Analytic model 6881
Effizienz	Automatisierte DPM-Berechnung aus Quenchkurve
Ergebnis	2,44 mCi/ml

Spezifische Aktivität durch Massenspektrometrie

Verfahren	CI-MS, NH₃ Reagensgas
Ergebnis	20,0 Ci/mmol ³H-Verteilung: Unmarkiert 44% Einmalige Markierung 43% Doppelte Markierung 13%

³H-NMR Verfahren

Instrument	Bruker AM 400
Experiment	Protonenentkoppeltes ³H-NMR Nicht protonenentkoppeltes ³H-NMR
Bezugspeak	Lösungsmittelpeak von Methanol 3,3
Lösungsmittel	Methanol-d₄
Ergebnis	Tritium wird ausschließlich an den Kohlenstoffatomatomen in ortho-Position zur aromatischen Hydroxylgruppe eingebaut

Analysenzusammenfassung

Assay	Ergebnis
Radiochemische Reinheit, bestimmt durch HPLC	98,7%
Radioaktivitätskonzentration, bestimmt durch Szintillationszählung	2,44 mCi/ml
Spezifische Aktivität, bestimmt durch Massenspektrometrie	20,0 Ci/mmol
³H-NMR	stimmt mit der vorgeschlagenen Struktur überein

Die vorstehende Beschreibung offenbart die Erfindung einschließlich bevorzugter Ausführungsformen davon vollständig. Abänderungen und Verbesserungen der hier speziell offenbarten Ausführungsformen liegen im Bereich der folgenden Ansprüche. Ohne weitere nähere Ausführung sollte ein Fachmann unter Verwendung der vorstehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem vollsten Ausmaß anwenden können. Deshalb sind die Beispiele hier bloß als Veranschaulichung und in keinerlei Weise als Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung gedacht. Die Ausführungsformen der Erfindung, bei denen eine ausschließliche Eigenschaft oder ein Vorrecht beansprucht wird, sind folgendermaßen definiert.

Claims

Eine Verbindung aus der Gruppe: 4-(4-Fluorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol; 4-(4-Fluorphenyl)-5-(2-methylpyrid-4-yl)oxazol; 4-(3,4-Dichlorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol; 4-(3-Chlorphenyl)-5-(4-pyridyl)oxazol; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Arzneimittel, das einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel umfasst, und eine Verbindung gemäß Anspruch 1.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Asthma, Schocklunge (ARDS), Schlaganfall, Knochenresorptionserkrankungen oder arthritischen Gelenkbeschwerden, und anderen entzündlichen Krankheiten bei einem Säuger, der der Behandlung bedarf.