DE69934805T2

DE69934805T2 - Substituierte imidazole mit cytokin-inhibierender wirkung

Info

Publication number: DE69934805T2
Application number: DE69934805T
Authority: DE
Inventors: F. Christopher Rahway CLAIBORNE; A. David Rahway CLAREMON; J. Nigel Rahway LIVERTON
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1999-07-27
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2019-07-28
Also published as: CA2338220A1; ES2278454T3; AU747755B2; JP2002521479A; US6207687B1; US6767908B2; WO2000006563A1; US20020026056A1; EP1109803B1; DE69934805D1; EP1109803A1; EP1109803A4; CA2338220C; AU5234799A

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung betrifft substituierte Imidazolverbindungen mit Zytokin-inhibierender Wirkung. Zytokin-vermittelte Erkrankungen und Zytokininhibition, -suppression und -antagonismus werden im Kontext von Erkrankungen oder Leiden verwendet, bei denen eine übermäßige oder unregulierte Produktion oder Aktivität eines oder mehrerer Zytokine auftritt. Beispiele für Zytokine, die typischerweise betroffen sind, beinhalten Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8) und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF).
Interleukin-1 (IL-1) und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) werden von einer Vielzahl von Zellen produziert, die an der Immunregulierung und anderen physiologischen Bedingungen involviert sind.
Es gibt viele Erkrankungszustände, die mit IL-1 in Verbindung gebracht werden. Beispiele sind rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Endotoxinämie, Toxic-Shock-Syndrom, akute und chronische Entzündungserkrankungen, wie etwa die Entzündungsreaktion, die von Endotoxin oder entzündlicher Darmerkrankung induziert wird; Tuberkulose, Atherosklerose, Muskeldegeneration, Kachexie, psoriatische Arthritis, Reiter-Syndrom, rheumatoide Arthritis, Gicht, traumatische Arthritis, Rötel-assoziierte Arthritis und akute Synovitis. Jüngste Evidenz verbindet IL-1-Aktivität auch mit Diabetes.
Es wurde bewiesen, dass Interleukin-1 eine Vielzahl biologischer Aktivitäten vermittelt, von denen angenommen wird, dass sie für die Immunregulation und andere physiologische Bedingungen wichtig sind. [Vgl. z. B. Dinarello et al., Rev. Infect. Disease, 6,51 (1984)]. Die bekannten biologischen Aktivitäten von IL-1 beinhalten die Aktivierung von T-Helferzellen, Induktion von Fieber, Stimulation der Prostaglandin- oder Collagenaseproduktion, neutrophile Chemotaxis, Induktion akuter Phasenproteine und die Suppression von Eisenspiegeln im Plasma.
Übermäßige oder unregulierte Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)produktion oder -Aktivität wurde mit der Vermittlung oder Verschlimmerung von rheumatoider Arthritis, rheumatoider Spondylitis, Osteoarthritis, gichtartiger Arthritis und anderer arthritischer Zustände, Sepsis, septischem Schock, Endotoxinschock, gram-negativer Sepsis, Toxic-Shock-Syndrom, Atemnotsyndrom der Erwachsenen, zerebraler Malaria, chronischer Lungenentzündungserkrankung, Silikose, Lungensarkoidose, Knochenresorptionserkrankung, Reperfusionsverletzung, Graft-versus-Host-Abstoßung, Allograftabstoßungen, Fieber und Myalgie aufgrund einer Infektion, Kachexie aus einer Infektion oder einem bösartigen Tumor, Kachexie aus erworbenem Immunschwächesyndrom (AIDS), AIDS-bezogenem Komplex (ARC), Keloidbildung, Narbengewebebildung, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa oder Pyrese in Verbindung gebracht.
Es wurde ebenfalls gezeigt, dass Monokine, wie etwa TNF die HIV-Replikation in Monozyten und/oder Makrophagen aktivieren [Vgl. Poli et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 782-784 (1990)], daher hilft die Inhibition der Monokinproduktion oder -aktivität bei der Begrenzung der HIV-Progression. TNF wurde in verschiedenen Rollen auch mit anderen viralen Infektionen, wie etwa dem Zytomegalovirus (ZMV), Influenzavirus und dem Herpesvirus, in Verbindung gebracht.
Interleukin-6 (IL-6) ist ein Zytokin, das sich auf das Immunsystem und die Blutbildung auswirkt. Es wird von mehreren Säugetierzelltypen als Antwort auf Wirkstoffe, wie etwa IL-1 produziert, und ist mit Erkrankungszuständen, wie etwa angiofollikulärer lymphoider Hyperplasie korreliert.
Interleukin-8 (IL-8) ist ein chemotaktischer Faktor, der 1987 zum ersten Mal identifiziert und charakterisiert wurde. Auf IL-8 wurden viele verschiedene Namen angewendet, wie etwa Neutrophile anziehendes/aktivierendes Protein-1 (NAP-1), Monozyten abgeleiteter neutrophiler chemotaktischer Faktor (MDNCF), Neutrophile aktivierender Faktor (NAF) und chemotaktischer Faktor für T-Lymphozyten. Wie IL-1 wird IL-8 von mehreren Zelltypen produziert, einschließlich Mononuklearzellen, Fibroblasten, Endothelzellen und Ketainozyten. Seine Produktion wird von IL-1, TNF und von Lipopolysaccharid (LPS) induziert. IL-8 stimuliert in vitro eine Anzahl zellulärer Funktionen. Es ist ein chemischer Lockstoff für Neutrophile, T-Lymphozyten und Basophile. Es induziert die Histaminfreisetzung aus Basophilen. Es verursacht die lysosomale Enzymfreisetzung und die plötzliche Ausschüttung freier Sauerstoffradikale („respiratory burst") der Neutrophilen, und es wurde gezeigt, dass es die Oberflächenexpression von Mac-1 (CD11b/CD 18) auf Neutrophilen ohne De-Novo-Proteinsynthese erhöht.
Es besteht weiterhin ein Bedarf an Verbindungen, die für die Behandlung von Zytokin-vermittelten Erkrankungen nützlich sind, und als solche die Produktion oder Aktivität von Zytokinen, wie etwa IL-1, IL-6, IL-8 und TNF, inhibieren, supprimieren oder antagonisieren. Die veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO 96/40143 (SmithKline Beecham Corporation) offenbart 1,4,5-substituierte Imidazolverbindungen und -zusammensetzungen für die therapeutische Verwendung als Zytokininhibitoren. Die US-Patentschrift Nr. 5717100 (Selnick et al.) offenbart substituierte Imidazolverbindungen mit einer gegen Krebs gerichteten Aktivität.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung, dargestellt durch Formel I:
wobei
R₁ C_1-6-Alkyl ist,
R₂ H, C_1-6-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, OC_1-6-Alkyl oder C(O)C_1-6-Alkyl ist,
R₃ H, C_1-6-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, OC_1-6-Alkyl oder C(O)C₁₆-Alkyl oder Aralkyl ist,
X C oder N ist,
Y H, Halogen, C_1-6-Alkyl, CN oder CF₃ ist;
Z NHR₃ oder F ist,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Additionssalz und/oder Hydrat davon oder, wo zutreffend, ein geometrisches oder optisches Isomer oder eine racemische Mischung davon.
Die hier beschriebene Erfindung beinhaltet ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel I, wie oben definiert, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Die Erfindung beinhaltet ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung dieser pharmazeutischen Zusammensetzung.
Die Erfindung beinhaltet ebenfalls die Verwendung einer Verbindung der Formel I zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung Zytokin-vermittelter Erkrankungen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird hier, wenn nicht anders spezifiziert, unter Verwendung von Begriffen, die im Folgenden definiert werden, ausführlich beschrieben.
Der Begriff "Alkyl" bezieht sich, wenn nicht anders definiert, auf ein monovalentes Alkan(Kohlenwasserstoff)-abgeleitetes Radikal, das 1 bis 15 Kohlenstoffatome enthält. Es kann geradkettig, verzweigtkettig oder cyclisch sein. Bevorzugte geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppen beinhalten Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl- und t-Butylgruppen. Bevorzugte Cycloalkylgruppen beinhalten Cyclopentyl- und Cyclohexylgruppen.
Alkyl beinhaltet ebenfalls eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe, die einen Cycloalkylenabschnitt enthält oder von diesem unterbrochen wird. Beispiele beinhalten folgende Gruppen:
wobei:
x und y = von 0 bis 10, und w und z = von 0 bis 9 sind.
Das Alkylen und der (die) monovalente(n) Alkylabschnitt(e) der Alkylgruppe kann (können) an jedem verfügbaren Anheftungspunkt an den Cycloalkylenabschnitt angehängt werden.
Wenn ein substituiertes Alkyl vorhanden ist, bezieht es sich auf eine geradkettige, verzweigtkettige oder cyclische Alkylgruppe, wie oben definiert, die mit 1 bis 3 Gruppen, wie bezogen auf jede Variable definiert, substituiert ist.
Der Begriff "Alkenyl" bezieht sich auf ein geradkettiges, verzweigtkettiges oder cyclisches Kohlenwasserstoffradikal, das 2 bis 15 Kohlenstoffatome und mindestens eine Kohlenstoff Kohlenstoff-Doppelbindung enthält. Bevorzugt ist eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung vorhanden, und es können bis zu vier nichtaromatische (keine Resonanz) Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen vorhanden sein. Bevorzugte Alkenylgruppen beinhalten Ethenyl, Propenyl, Butenyl und Cyclohexenyl. Wie oben bezogen auf das Alkyl beschrieben, kann der geradkettige, verzweigtkettige oder cyclische Abschnitt der Alkenylgruppe Doppelbindungen enthalten und kann substituiert werden, wenn eine substituierte Alkenylgruppe bereitgestellt wird.
Aryl bezieht sich auf aromatische Ringe, z. B. Phenyl, substitutiertes Phenyl und ähnliche Gruppen sowie Ringe, die kondensiert sind, z. B. Naphthyl und ähnliche. Aryl enthält somit mindestens einen Ring mit mindestens 6 Atomen, wobei bis zu zwei solcher Ringe vorhanden sein können, die darin bis zu 10 Atome enthalten, mit alternierenden (Resonanz) Doppelbindungen zwischen benachbarten Kohlenstoffatomen. Die bevorzugten Arylgruppen sind Phenyl und Naphthyl. Arylgruppen können genauso substituiert werden wie oben definiert. Bevorzugte substituierte Aryle beinhalten Phenyl und Naphthyl, die mit einer oder zwei Gruppen substituiert sind.
Substituiertes Alkyl und Aryl und die substituierten Abschnitte von Aralkyl, Aralkoxy und ähnlichen Gruppen werden mit 1 bis 3 Gruppen substituiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Halo, Hydroxy, Cyano, Acyl, Acylamino, Aralkoxy, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Alkylsulfonylamino, Arylsulfonylamino, Alkylaminocarbonyl, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Aralkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino und Sulfonylamino.
Aralkyl bezieht sich auf die C_1-6-Alkylarylgruppe.
Halo bedeutet Cl, F, Br und I, ausgewählt auf unabhängiger Basis.
Wie hier verwendet, ist beabsichtigt, dass der Begriff "Zusammensetzung" ein Produkt umfasst, das die spezifizierten Inhaltsstoffe in den spezifizierten Mengen enthält, sowie jedes Produkt, das, direkt oder indirekt, aus der Kombination der spezifizierten Inhaltstoffe in den spezifizierten Mengen resultiert.
Der Begriff "TNF-vermittelte Erkrankung oder -Erkrankungszustand" bezieht sich auf die Erkrankungszustände, in denen TNF eine Rolle spielt, entweder durch die Produktion oder erhöhten Aktivitätslevel von TNF selbst, oder indem die Freigabe eines anderen Monokins verursacht wird, wie etwa, aber nicht beschränkt auf IL-1 oder IL-6. Ein Erkrankungszustand, bei dem zum Beispiel IL-1 eine Hauptkomponente ist, und dessen Produktion oder Aktion als Antwort auf TNF verschlimmert oder sekretiert wird, würde daher als ein Erkrankungszustand betrachtet, der von TNF vermittelt ist.
Der Begriff "Zytokin", wie hier verwendet, bedeutet jedes sekretierte Polypeptid, das auf die Funktionen von Zellen einwirkt und ein Molekül ist, das Interaktionen zwischen Zellen in der Immun-, Entzündungs- oder hämapoetischen Antwort moduliert. Ein Zytokin beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf Monokine und Lymphokine, unabhängig davon, von welchen Zellen sie produziert werden. Beispiele für Zytokine, die typischerweise betroffen sind, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8) und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF).
Mit dem Begriff "Zytokin-störende oder Zytokin-supprimierende Menge" ist eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel I gemeint, die eine Abnahme der In-vivo-Aktivität oder des Zytokinlevels auf normale oder subnormale Level verursachen wird, wenn sie dem Patienten zur Prophylaxe oder therapeutischen Behandlung eines Erkrankungszustandes gegeben wird, der von übermäßiger oder unregulierter Zytokinproduktion oder -aktivität verschlimmert oder verursacht wird.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffatome enthalten und können in racemischer und optisch aktiver Form vorliegen. Alle sind innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Eine Untermenge an Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die von Interesse ist, betrifft Verbindungen der Formel I, wobei R₂ gleich C_3-8-Cycloalkyl mit Cyclopentyl eine besonders bevorzugte Cycloalkylgruppe ist.
Repräsentative Beispiele für Verbindungen der vorliegenden Erfindung beinhalten die folgenden Spezies:
1-(S)-Phenyl-N-{4-[3-cyclopentyl-2-methyl-5-(3-trifluormethyl-phenyl)-3H-imidazol-4-yl]pyridin-2-yl}-ethylamin; sowie pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen durch Prozeduren hergestellt, die in dem beiliegenden Schema illustriert sind.
Insbesondere wird eine bevorzugte Verbindung der Erfindung hergestellt, wie nachfolgend in Schema 1 illustriert.
REAKTIONSSCHEMA 1
Reaktionsmittel und Bedingungen:

a) n-BuLi (1,05 äquiv.), 1, THF bei –78°C, dann 2 (80%);
b) t-BuNitrit, HCl, 3, Ethanol bei –5°C für 1 Std., dann 2 Std. bei 23°C (95%);
c) 10% Pd/C (30 Gew.-% des Teilzustands), 4, H₂ (1 Atm) in Ethanol für 12 Std. (91%);
d) 5, Na(OAc)3BH (2,0 äquiv.), Cyclopentanon (1,5 äquiv.) in 1,2-Dichlorethan bei 25°C für 15 Std. (92%);
e) 6 (1,0 äquiv.), DIPEA (2,0 äquiv.) in Methylenchlorid bei –10°C, 7 (1,1 äquiv.), 2 Std.(95%);
f) DMSO (3 äquiv.) und Oxalylchlorid (2,5 äquiv.) in Methylenchlorid bei –78°C, dann 8. Nach 2 Std. Triethylamin (5,0 äquiv.) und erwärmen auf 23°C; Ungereinigtes Keton aus 8 in Ammoniumtrifluoracetat (als Lösemittel) bei 150°C für 5 Min. (53%);
g) 9 in(S)-(–)-α-Methylbenzylamin (10 äquiv.) bei 150°C für 15 Std. (76%).

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in verschiedenen pharmazeutisch annehmbaren Salzformen nützlich. Der Begriff "pharmazeutisch annehmbares Salz" bezieht sich auf jene Salzformen, die für den Arzneimittelchemiker offensichtlich sind, d. h. jene, die im Wesentlichen nicht toxisch sind und die gewünschten pharmakokinetischen Eigenschaften, Schmackhaftigkeit, Absorption, Distribution, Metabolismus oder Exkretion bereitstellen. Andere Faktoren von mehr praktischer Natur, die ebenfalls für die Auswahl wichtig sind, sind Kosten des Rohmaterials, Leichtigkeit der Kristallisation, Ausbeute, Stabilität, Hygroskopizität und Fließverhalten des resultierenden Bulk-Arzneimittels. Zweckmäßigerweise werden pharmazeutische Zusammensetzungen aus den aktiven Inhaltsstoffen in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern hergestellt.
Die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Verbindungen der Formel I beinhalten herkömmliche nicht toxische Salze oder quartäre Ammoniumsalze der Verbindungen der Formel I, die z. B. aus nicht toxischen anorganischen oder organischen Säuren gebildet werden. Zum Beispiel beinhalten nicht toxische Salze jene, die aus anorganischen Säuren abgeleitet sind, wie etwa Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Sulfamidsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und ähnliche; und die Salze, die aus organischen Säuren hergestellt werden, wie etwa Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Glycolsäure, Stearinsäure, Milchsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Ascorbinsäure, Pamoasäure, Sulfanilsäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Fumarsäure, Toluensulfonsäure, Methansulfonsäure, Ethandisulfonsäure, Oxalsäure, Isethionsäure, Trifluoressigsäure und ähnliche.
Die pharmazeutisch annehmbaren Salze der vorliegenden Erfindung können durch herkömmliche chemische Methoden synthetisiert werden. Im Allgemeinen werden die Salze hergestellt, indem die freie Base oder Säure mit stöchiometrischen Mengen oder mit einem Überschuss der gewünschten salzbildenden anorganischen oder organischen Säure oder Base in einem geeigneten Lösemittel oder einer Lösemittelkombination umgesetzt wird.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können Asymmetriezentren haben und als Racemate, racemische Mischungen und als einzelne Diastereomere auftreten. Die vorliegende Erfindung beinhaltet alle derartigen Isomere, einschließlich optischer Isomere.
Die hier beschriebene Erfindung beinhaltet ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine hier beschriebene Verbindung enthält, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die hier beschriebene Erfindung beinhaltet ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung dieser pharmazeutischen Zusammensetzung.
Die hier beschriebene Erfindung beinhaltet ebenfalls die Verwendung einer Verbindung, wie hier beschrieben, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Zytokin-vermittelten Erkrankung.
Von besonderem Interesse ist die Verwendung einer Verbindung, wie hier beschrieben, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündung.
Eine andere Verwendung, die von besonderem Interesse ist, ist die Verwendung einer Verbindung, wie hier beschrieben, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Zytokin-vermittelten Erkrankung, wie hier beschrieben, wobei die Erkrankung Osteoporose ist.
Eine andere Verwendung, die von besonderem Interesse ist, ist die Verwendung einer Verbindung, wie hier beschrieben, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Zytokin-vermittelten Erkrankung, wie hier beschrieben, wobei die Erkrankung rheumatoide Arthritis oder Osteoarthritis ist.
Eine andere Verwendung, die von besonderem Interesse ist, ist die Verwendung einer Verbindung, wie hier beschrieben, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Zytokin-vermittelten Erkrankung, wie hier beschrieben, wobei die Erkrankung nicht Osteoporose-assoziierte Knochenresorption ist.
Noch eine andere Verwendung, die von besonderem Interesse ist, ist die Verwendung einer Verbindung, wie hier beschrieben, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Zytokin-vermittelten Erkrankung, wie hier beschrieben, wobei die Erkrankung Morbus Crohn ist.
Ebenfalls offenbart wird eine Methode zur Inhibition eines Zytokins oder von Zytokinen in einem Säugetier, das dies benötigt, die die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I an das Säugetier enthält, um das Zytokin oder die Zytokine auf normale Level oder in einigen Fällen auf subnormale Level zu inhibieren, um den Erkrankungszustand zu verbessern, ihm vorzubeugen oder ihn zu behandeln.
Die Verbindungen der Formel I können in der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungszuständen bei Säugetieren verwendet werden, die durch übermäßige oder unregulierte Zytokine, spezifischer IL-1, IL-6, IL-8 oder TNF, verschlimmert oder verursacht werden.
Weil die Verbindungen der Formel I Zytokine, wie etwa IL-1, IL-6, IL-8 und TNF inhibieren, sind die Verbindungen für die Behandlung von Erkrankungen nützlich, die mit der Gegenwart oder Aktivität eines Zytokins in Verbindung gebracht werden, wie etwa rheumatoide Arthritis, rheumatoide Spondylitis, Osteoarthritis, gichtartige Arthritis und andere arthritische Leiden.
Die Verbindungen der Formel I sind ebenfalls nützlich, um andere Erkrankungszustände zu behandeln, die durch übermäßige oder unregulierte TNF-Produktion oder -Aktivität vermittelt werden. Solche Erkrankungen beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Sepsis, septischen Schock, Endotoxinschock, gram-negative Sepsis, Toxic-Shock-Syndrom, Atemnotsyndrom der Erwachsenen, zerebrale Malaria, chronische Lungenentzündungserkrankung, Silikose, Lungensarkoidose, Knochenresorptionserkrankungen, wie etwa Osteoporose, Reperfusionsverletzung, Graft-versus-Host-Abstoßung, Allograftabstoßung, Fieber, Myalgie aufgrund einer Infektion, Kachexie aus einer Infektion oder einem bösartigen Tumor, Kachexie aus erworbenem Immunschwächesyndrom (AIDS), ARC (AIDS-bezogenem Komplex), Keloidbildung, Narbengewebebildung, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Pyrese AIDS und andere virale Infektionen, wie etwa Cytomegalovirus (CMV), Influenzavirus und die Herpesfamilie von Viren, wie etwa Herpes Zoster oder Simplex I und II.
Die Verbindungen der Formel I sind ebenfalls topisch nützlich bei der Behandlung von Entzündung, wie etwa bei der Behandlung rheumatoider Arthritis, rheumatoider Spondylitis, Osteoarthritis, gichtartiger Arthritis und anderen arthritischen Leiden; entzündeten Gelenken, Ekzem, Psoriasis oder anderen entzündlichen Hautbedingungen, wie etwa Sonnenbrand; entzündlichen Augenleiden, einschließlich Konjunktivitis; Pyrese, Schmerz und anderen mit Entzündung assoziierte Leiden.
Die Verbindungen der Formel I sind ebenfalls nützlich bei der Behandlung von Erkrankungen, die durch eine übermäßige IL-8-Aktivität charakterisiert sind. Diese Erkrankungszustände beinhalten Psoriasis, entzündliche Darmerkrankung, Asthma, kardiale und renale Reperfusionsverletzung, Atemnotsyndrom der Erwachsenen, Thrombose und Glomerulonephritis.
Die Erfindung beinhaltet somit die Verwendung einer Verbindung der Formel I für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Psoriasis, entzündlicher Darmerkrankung, Asthma, kardialer und renaler Reperfusionsverletzung, Atemnotsyndrom der Erwachsenen, Thrombose und Glomerulonephritis.
Bei der Verabreichung an einen Patienten zur Behandlung einer Erkrankung, die mit einem Zytokin oder Zytokinen in Verbindung gebracht werden, kann die verwendete Dosierung in Abhängigkeit von der Art der Erkrankung, dem Alter und dem Allgemeinzustand des Patienten, der speziellen verabreichten Verbindung, der Gegenwart oder dem Level an Toxizität oder der mit dem Arzneimittel erfahrenen Nebenwirkungen und andere Faktoren, abgeändert werden. Ein repräsentatives Beispiel für einen geeigneten Dosierungsbereich reicht von etwa 0,01 mg/kg bis zu etwa 100 mg/kg. Jedoch bleibt die verabreichte Dosierung im Allgemeinen dem Ermessen des Arztes überlassen.
Die Verbindungen der Erfindung werden bevorzugt verwendet, indem die Verbindung der Formel I parenteral zugeführt wird. Der Begriff 'parenteral', wie hier verwendet, beinhaltet intravenöse, intramuskuläre oder intraperitoneale Verabreichung. Die subkutanen und intramuskulären Formen der parenteralen Verabreichung werden im Allgemeinen bevorzugt. Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls ausgeführt werden, indem die Verbindung der Formel I subkutan, intranasal, intrarektal, transdermal oder intravaginal zugeführt wird.
Die Verbindungen der Formel I können ebenfalls durch Inhalation verabreicht werden. Mit 'Inhalation' ist intranasale und orale Inhalationsverabreichung gemeint. Passende Dosierungsformen für solche Verabreichungen, wie etwa eine Aerosolformulierung oder ein Dosieraerosol, können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel I und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Pharmazeutische Zusammensetzungen können ebenfalls Verbindungen der Formel I in Kombination mit einer zweiten therapeutisch aktiven Verbindung beinhalten.
Der benutzte pharmazeutische Träger kann zum Beispiel entweder ein Feststoff, eine Flüssigkeit oder ein Gas sein. Beispiele für Feststoffträger beinhalten Lactose, Kaolin, Saccharose, Talk, Gelatine, Altar, Pektin, Akaziengummi, Magnesiumstearat, Stearinsäure und ähnliche. Beispiele für flüssige Träger sind Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Wasser und ähnliche. Beispiele für gasförmige Träger beinhalten Kohlendioxid und Stickstoff.
Entsprechend kann der Träger oder das Verdünnungsmittel Zeitverzögerungsmaterial, das dem Fachmann gut bekannt ist, beinhalten, wie etwa Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder mit einem Wachs.
Es kann ein breites Spektrum pharmazeutischer Dosierungsformen benutzt werden. Wenn eine Feststoffdosierung zur oralen Verabreichung verwendet wird, kann die Herstellung in Form einer Tablette, einer harten Gelatinekapsel, eines Trochiscus oder einer Pastille erfolgen. Die Menge an Feststoffträger wird stark variieren, wird aber im Allgemeinen von etwa 0,025 mg bis etwa 1 g reichen. Wenn eine flüssige Dosierungsform zur oralen Verabreichung gewünscht wird, erfolgt die Herstellung typischerweise in Form eines Sirups, einer Emulsion, einer weichen Gelatinekapsel, einer Suspension oder einer Lösung. Wenn eine parenterale Dosierungsform benutzt werden soll, kann das Arzneimittel feste oder flüssige Form haben, und kann für die direkte Verabreichung formuliert sein oder kann für die Rekonstitution geeignet sein.
Topische Dosierungsformen sind ebenfalls beinhaltet. Beispiele topischer Dosierungsformen sind Feststoffe, Flüssigkeiten und Halbfeststoffe. Feststoffe würden Streupuder, Breiumschläge und ähnliche beinhalten. Flüssigkeiten beinhalten Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Halbfeststoffe beinhalten Cremes, Salben, Gele und ähnliche.
Die Menge einer Verbindung der Formel I, die topisch verwendet wird, wird natürlich mit der gewählten Verbindung, der Natur und Schwere des Leidens variieren, und kann gemäß dem Ermessen des Arztes variiert werden. Eine repräsentative, topische Dosis einer Verbindung der Formel I liegt zwischen etwa 0,01 mg bis zu etwa 2,0 g, die ein bis vier, bevorzugt ein bis zwei Mal täglich verabreicht wird.
Der aktive Inhaltsstoff kann für topische Verabreichung von etwa 0,001% bis etwa 10% w/w enthalten.
Tropfen gemäß der vorliegenden Erfindung können sterile oder nicht-sterile wässrige oder Öllösungen oder Suspensionen enthalten, und können hergestellt werden, indem der aktive Inhaltsstoff in einer geeigneten wässrigen Lösung gelöst wird, optional einschließlich einem bakteriziden und/oder fungiziden Wirkstoff und/oder jedem anderen geeigneten Konservierungsstoff und optional einschließlich einer oberflächenaktiven Substanz. Die resultierende Lösung kann dann durch Filtration geklärt, in einen geeigneten Behälter übertagen werden, der dann versiegelt und sterilisiert wird durch Autoklavieren oder indem er für eine halbe Stunde auf 98 bis 100°C gehalten wird. Alternativ kann die Lösung durch Filtration sterilisiert und aseptisch in einen Behälter übertragen werden. Beispiele für bakterizide und fungizide Wirkstoffe, die für den Einschluss in die Tropfen geeignet sind, sind Phenylquecksilbernitrat oder -acetat (0,002%), Benzalkoniumchlorid (0,01%) und Chlorhexidinacetat (0,01%). Geeignete Lösemittel für die Herstellung einer öligen Lösung beinhalten Glycerol, verdünnten Alkohol und Propylenglycol.
Lotionen gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten jene, die für die Anwendung auf Haut oder Auge geeignet sind. Eine Augenlotion kann eine sterile wässrige Lösung enthalten, die optional ein Bakterizid enthält, und kann durch Methoden, ähnlich jenen, für die Herstellung von Tropfen, hergestellt werden. Lotionen oder Einreibemittel für die Anwendung auf der Haut können ebenfalls einen Wirkstoff beinhalten, um das Trocknen zu beschleunigen und die Haut zu kühlen, wie etwa ein Alkohol oder Aceton, und/oder ein Feuchthaltemittel, wie etwa Glycerol oder ein Öl, wie etwa Rizinusöl oder Erdnussöl.
Cremes, Salben oder Pasten gemäß der vorliegenden Erfindung sind halbfeste Formulierungen eines aktiven Inhaltsstoffs für externe Anwendung. Sie können erstellt werden durch Mischen des aktiven Inhaltsstoffs in feinzerteilter oder pulverisierter Form, allein oder in Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht wässrigen Flüssigkeit, mit einer fettigen oder nicht fettigen Basis. Die Basis kann Kohlenwasserstoffe enthalten, wie etwa hartes, weiches oder flüssiges Paraffin, Glycerol, Bienenwachs, eine Metallseife; einen Schleimstoff; ein Öl natürlichen Ursprungs, wie etwa Mandel-, Mais-, Erdnuss-, Rizinus- oder Olivenöl; Wollfett oder dessen Derivate, oder eine Fettsäure, wie etwa Stearinsäure oder Ölsäure, zusammen mit einem Alkohol, wie etwa Propylenglycol oder Makrogele. Die Formulierung kann jede geeignete oberflächenaktive Substanz einschließen, wie etwa ein anionisches, kationisches oder nichtionisches Tensid, wie etwa Sorbitanester oder Polyoxyethylenderivate davon. Suspendiermittel, wie etwa natürliche Gummis, Cellulosederivate oder anorganische Materialien, wie etwa Kieselerden und andere Inhaltsstoffe, wie etwa Lanolin können ebenfalls beigefügt werden.
BEISPIEL 1
Schritt A: Herstellung von N-Methyl-N-methoxy-(3-trifluor-methyl)phenyl-carboxamid (2) und Herstellung von 2-(2-Fluorpyridin-4-yl)-1-(3-trifluormethylphenyl)-ethanon (3)
Einer Suspension von N,O-Dimethylhydroxylaminhydrochlorid (58,2 g, 0,60 Mol) in Dichlormethan (1 l) bei 0°C, unter Argon, wurde 3-Trifluormethylbenzoylchlorid (104,0 g, 0,50 Mol) zugefügt, gefolgt von einer langsamen Zugabe (≤ +5°C) von Triethylamin (152,3 ml, 1,09 Mol). Die Reaktion wurde 30 Min. bei +5°C gealtert und konnte sich dann auf Raumtemperatur erwärmen. TLC (1:1, Ethylacetat/Hexan) zeigte, dass die Reaktion abgeschlossen war. Die Reaktion wurde dann mit 5% wässriger Citronensäure (500 ml) und 5% wässrigem Natriumbicarbonat gewaschen. Die wässrigen Extrakte wurden mit Methylenchlorid (100 ml) zurückextrahiert und die kombinierten Methylenchloridextrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und zu einem Öl konzentriert. Das Öl wurde in Toluen (2 × 100 ml) wiederaufgelöst und im Vakuum verdampft, um das Weinrebamid (114,7 g, 98%) zu erbringen. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 7,98 (s, 1 H, Ar), 7,89 (d, J = 7,8 Hz, 1 H, Ar), 7,72 (d, J = 7,8 Hz, 1 H, Ar), 7,55 (t, J = 7,8 Hz, 1 H, Ar), 3,55 (s, 3 H, CH₃O), 3,39 (s, 3 H, CH₃N).
Einer Rührlösung aus Diisopropylamin (17,69 ml, 0,135 Mol) in wasserfreier THF (200 ml) bei – 78°C, unter Argon, wurde n-Butyllithium (54,0 ml, 2,5 M in Hexan, 0,135 Mol) zugefügt, nach 5 Min. gefolgt von einer Lösung aus 2-Fluor-4-methylpyridin (10 g, 0,090 Mol) in wasserfreier THF (20 ml). Nach Rühren für 15 Min. bei –78°C wurde eine Lösung aus N-Methoxy-N-methyl-3-trifluormethylbenzamid (2) (23,08 g, 0,099 Mol) in wasserfreier THF (10 ml) der Reaktionsmischung zugefügt, die dann für 5 Min. gerührt wurde und sich auf 0°C erwärmen konnte. Die Reaktion wurde mit Wasser (400 ml) gequenscht und mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert. Die Ethylacetatextrakte wurden kombiniert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und zu einem Öl konzentriert, das auf Silicagel (1 kg) chromatographiert wurde, wobei es mit 20% Ethylacetat in Hexan eluierte, um 21,6 g (85%) der Titelverbindung zu ergeben. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8,25 (s, 1 H, Pyr), 8,20 (d, J = 5,1 Hz, 1 H, Pyr), 8,18 (d, J = 9,3 Hz, 1 H, Pyr), 7,88 (d, J = 7,8 Hz, Ar), 7,67 (t, J = 7,8 Hz, 1 H, Ar), 7,09 (d, J = 5,1 Hz, 1 H, Ar), 6,86 (s, 1 H, Ar), 4,37 (s, 2 H, Pyr CH₂C).
Schritt B: Herstellung von 1-(2-Fluorpyridin-4-yl-2-(3-trifluormethylphenyl)-ethan-1,2-dion-oxim (4)
Einer Mischung aus 2-(2-Fluorpyridin-4-yl)-1-(3-trifluormethyl-phenyl)ethanon (3) (10,80 g, 0,038 Mol) in Ethanol (200 ml), bei –10°C, unter Argon, wurde tert-Butylnitrit (5,0 ml, 0,042 Mol) und Salzsäure (12,2 ml, 2,5 M in Ethanol, 0,031 Mol) tropfenweise zugefügt, wobei die Temperatur unter –5°C gehalten wurde. Nach Abschluss der Zugaben konnte sich die Reaktion auf 2 Std. lang auf Raumtemperatur erwärmen. Die Reaktionsmischung wurde dann im Vakuum konzentriert, mit Wasser (100 ml) verdünnt, mit gesättigtem Natriumbicarbonat (200 ml) basisch gemacht und mit Ethylacetat (3 × 400 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser (300 ml) gewaschen, mit Salzlake (300 ml) und wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und zu einem Öl konzentriert, das 11,4 g (95%) wog. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8,31 (s, 1 H, Pyr), 8,29 (d, J = 5,3 Hz, 1 H, Pyr), 8,24 (d, J = 7,8 Hz, 1 H, Ar), 7,92 (d, J = 8,1 Hz, 1 H, Ar), 7,71 (t, J = 7,8 Hz, 1 H, Ar), 7,40 (d, J = 5,1 Hz, 1 H, Pyr), 7,23 (s, 1 H, Pyr).
Schritt C: Herstellung von 2-Amino-2-(2-fluor-pyridin-4-yl)-1-(3-trifluormethyl-phenyl)-ethanol (5)
10% Palladium auf Kohlenstoff (3,0 g) wurde einer Lösung aus dem 1-(2-Fluorpyridin-4-yl)-2-(3-trifluormethylphenyl)-ethan-1,2-dion-1-oxim (4) (8,0 g, 27 mmol) in Ethanol (400 ml) bei Umgebungstemperatur zugefügt.
Das Reaktionsgefäß wurde mit Wasserstoff im Vakuum gereinigt und kräftig gerührt für 10 Std. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Lösung durch ein Celitepad gefiltert und konzentriert, um einen gelben Feststoff zu ergeben. Der Rückstand könnte durch Rekristallisation aus Methylenchlorid und Hexan gereinigt werden. Alternativ könnten polare Verunreinigungen durch Filtration durch Silicagel entfernt werden, beginnend mit 5% Methanol in Methylenchlorid zu 5% Methanol, 0,5% Ammoniumhydroxid in Methylenchlorid. Farbloser Feststoff (91%): mp 128-129°C; ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) d 8,01 (d, J = 5,0 Hz, 1 H, Ar), 7,53 (m, 1 H, Ar), 7,49 (m, 2 H, Ar), 7,43 (s, 1 H, Ar), 7,06 (d, J = 5,0 Hz, 1 H, Ar), 6,86 (s, 1 H, Ar), 4,96 (d, J = 5,0 Hz, 1 H, CH), 4,12 (d, J = 5,0 Hz, 1 H, CH).
Schritt D: Herstellung von 2-(2-Fluor-pyridin-4-yl)-2-cyclo-pentylamino-1-(3-trifluormethyl-phenyl-ethanol (6)
Das 2-Amino-2-(2-fluor-pyridin-4-yl)-1-(3-trifluormethyl-phenyl)-ethanol (5) (1,0 g, 3,3 mmol), Cyclopentanon (0,42 g, 5,0 mmol) und Na(OAc)₃BH (1,4 g, 6,7 mmol) in 1,2-Dichlorethan (20 ml) wurden unter Argon bei Raumtemperatur für 15 Std. gerührt. Die resultierende Mischung wurde mit gesättigtem wässrigem NaHCO₃ (50 ml) behandelt, mit Ethylacetat (3 × 75 ml) extrahiert, getrocknet (Natriumsulfat) und konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde mittels Silicagelchromatographie unter Verwendung von 50% Ethylacetat in Methylenchlorid gereinigt, um das Titelprodukt (1,1 g, 92%) zu ergeben. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8,05 (d, J = 4,9 Hz, 1 H, Pyr), 7,51 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, Ar), 7,36 (t, J = 7,8 Hz, 1 H, Ar), 7,32 (s, 1 H, Ar), 7,22 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, Ar), 6,81 (d, J = 4,9 Hz, 1 H, Pyr), 6,64 (s, 1 H, Pyr), 5,00 (d, J = 4,6 Hz, 1 H, PhCHOH), 4,01 (d, J = 4,9 Hz, 1 H, CHCHNH), 2,99 (quin, J = 3,0 Hz, 1 H, CH2CHCH2), 1,85 – 1,25 (m, 8 H, CH₂).
Schritt E: Herstellung von 2-(2-Fluor-pyridin-4-yl)-2-(N-acetyl-cyclopentylamino)-1-(3-trifluormethyl-phenyl)-ethanol (8)
Eine Rührlösung aus 2-(2-Fluor-pyridin-4-yl)-2-cyclopentylamino-1-(3-trifluormethyl-phenyl)-ethanol (6) (1,0 g, 2,7 mmol) und Diisopropylamin (0,95 ml, 5,4 mmol) in Methylenchlorid (10 ml) wurde unter Argon gesetzt und auf –10°C abgekühlt. Acetylchlorid (0,21 ml, 3,0 mmol) in Methylenchlorid (1,0 ml) wurde der Reaktionsmischung langsam zugefügt. Nach 2 Std. wurde Ethylacetat zugefügt (200 ml), gefolgt von wässriger Citronensäure (50 ml einer 10%-igen Lösung). Die organische Schicht wurde dann mit wässrigem Natriumbicarbonat (50 ml einer gesättigten Lösung) und Wasser (50 ml) gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat), gefiltert und konzentriert. Der rohre Rückstand wurde durch ein Pad aus Silicagel (50% Ethylacetat in Hexan) gegeben, um geringfügige Verunreinigungen zu entfernen und zum nächsten Schritt gebracht. Farbloses Öl (95%): ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8,54 (d, J = 5,1 Hz, 1 H, Pyr), 7,49 (in, 4 H, Ar), 6,81 (d, J = 5,0 Hz, 1 H, Pyr), 6,72 (s, 1 H, Pyr), 5,63 (s, 1 H, OH), 5,46 (s, 1 H, PhCHOH), 4,34 (s, 1 H, CHCHN), 4,16 (m, 1 H, CH₂CHCH₂), 2,32 (s, 3 H, COCH₃), 1,90 (m, 1 H, CH₂), 1,60(m, 7 H, CH₂).
Schritt F: Herstellung von 1-Cyclopentyl-5-(2-fluor-pyridin-4-yl)-2-methyl-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-1H-imidazol (9)
Oxalylchlorid (0,53 ml, 6,1 mmol) wurde einer Lösung aus Dimethylsulfoxid (0,52 ml, 7,3 mmol) in Methylenchlorid (10 ml) bei –78°C zugefügt. Nach 20 Min. wurde 2-(2-Fluor-pyridin-4-yl)-2-(N-acetylcyclopentyl-amino)-1-(3-trifluormethyl-phenyl)-ethanol (8) (1,0 g, 2,4 mmol) in Methylenchlorid (1,0 ml) zugefügt und die Reaktionslösung wurde bei –78°C für 2 Std. gerührt. Triethylamin (1,7 ml, 12,2 mmol) wurde zugefügt und das Kühlbad wurde entfernt. Die Lösung wurde mit Ethylacetat (150 ml) verdünnt, mit wässrigem Ammoniumchlorid (75 ml) und Salzlauge (75ml) gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat) und konzentriert, um das Keton zu ergeben. Dieses Keton wurde dann in einen Kolben übertragen, der wasserfreies Ammoniumtrifluoracetat (4 g) enthält, unter Verwendung einer Mindestmenge an Ether-Methylenchlorid. Die Mischung wurde unter Vakuum gesetzt, um das Lösemittel zu entfernen, und dann in ein vorgewärmtes Ölbad (150°C) gesetzt. Sobald der gesamte Feststoff geschmolzen war, und ein wirksames Rühren erreicht worden war (ungefähr 10 Min.), wurde festgestellt, dass die Bildung des Imidazols abgeschlossen war. Das Heizbad wurde entfernt und die Feststoffe wurden zwischen Ethylacetat und Wasser (150/50 ml) partitioniert. Die organische Schicht wurde getrocknet (Natriumsulfat), gefiltert und konzentriert. Das Produkt wurde mittels Silicagelchromatographie unter Verwendung von 75% Ethylacetat in Methylenchlorid gereinigt.
Farbloser Feststoff (53%): ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8,32 (d, J = 5,2 Hz, 1 H, Pyr), 7,71 (s, 1 H, Ar), 7,42 (d, J = 7,3 Hz, 1 H, Ar), 7,36 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, Ar), 7,29 (t, J = 7,6 Hz, 1 H, Ar), 7,13 (d, J = 5,2 Hz, 1 H, Pyr), 6,88 (s, 1 H, Pyr), 4,30 (quin, J = 9,0 Hz, 1 H CH), 2,62 (s, 3 H, CH;), 2,09 – 1,62 (m, 8 H, CH₂).
Schritt G: Herstellung von 1-(S)-Phenyl-N-{4-[-3-cyclopentyl-2-methyl-5-(3-trifluormethyl-phenyl)-3H-imidazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-ethylamin (10) (L-845,722)
Eine Rührlösung aus 1-Cyclopentyl-5-(2-fluor-pyridin-4-yl)-2-methyl-4-(3-trifluormethyl-phenyl)-1H-imidazol (9) (0,25 g, 0,64 mmol) in S-(–)-a-Methylbenzylamin (0,78 g, 6,4 mmol) wurde auf 150°C erwärmt für 15 Std. Das Heizbad wurde entfernt und die Inhalte des Kolbens wurden zwischen Ethylacetat (100 ml) und pH-4,5-Puffer (50 ml, zusammengesetzt aus 10% Citronensäure, die mit 10 N Natriumhydroxid behandelt worden war, um einen pH-Wert von 4,5 zu erreichen) partitioniert. Die organische Schicht wurde getrocknet (Natriumsulfat), gefiltert und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Silicagelchromatographie gereinigt, um das gewünschte Produkt (73%) zu erhalten. Weißer Schaum: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8,16 (d, J = 5,2 Hz, 1 H, Pyr), 7,76 (s, 1 H, Ar), 7,38 – 7,19 (m, 8 H, Ar), 6,49 (d, J = 5,2 Hz, 1 H, Pyr), 5,17 (d, J = 5,8 Hz, 1 H, NH), 4,61 (quin, J = 6,4 Hz, 1 H, CH₂CHN), 4,07 (q, J = 8,6 Hz, 1 H, PhCHCH₃), 2,53 (s, 3 H, NCCH₃), 1,54 (d, J = 6,7 Hz, 3 H, PhCHCH₃), 1,82 – 1,44 (m, 8 H, CH₂).
BIOLOGISCHE ASSAYS
Lipopolysaccharid-vermittelte Produktion von Zytokinen
Menschliche periphere mononukleäre Zellen des Blutes (PBMC) werden aus frischem menschlichem Blut gemäß der Prozedur von Chin and Kostura, J. Immunol. 151, 5574-5585 (1993) isoliert. Das Vollblut wird mittels steriler Venenpunktion in 60-ml-Spritzen gesammelt, die mit 1,0 ml Natriumheparin (Upjohn, 1.000 U/ml) beschichtet sind, und 1:1 in Hanks Balanced Salt Solution (Gibco) verdünnt. Die Erythrozyten werden aus den PBMCs mittels Zentrifugation auf einem Ficoll-Hypaque-Lymphoryten-Separationsmedium separiert. Die PBMCs werden drei Mal in Hanks Balanced Salt Solution gewaschen und dann auf eine Endkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI resuspendiert, das 10% frisches autologes menschliches Serum, Penizillin-Streptomycin (10 U/ml) und 0,05% DMSO enthält. Lipopolysaccharid (Salmonella Typ Re545; Sigma Chemicals) wird den Zellen auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml zugefügt. Ein Aliquot (0,1 ml) der Zellen wird schnell in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt, die 0,1 ml der Testverbindung in einer passenden Verdünnung enthält, und werden für 24 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Am Ende des Kulturzeitraums werden die Zellkulturüberstände auf die Produktion von IL-1b, TNF-a, IL-6 und PGE, unter Verwendung eines spezifischen ELISA getestet.
IL-1-vermittelte Zytokinproduktion
Menschliche periphere mononukleäre Zellen des Blutes werden aus frischem menschlichem Blut gemäß der Prozedur von Chin and Kostura, J. Immunol. 151, 5574-5585 (1993) isoliert. Das Vollblut wird mittels steriler Venenpunktion in 60-ml-Spritzen gesammelt, die mit 1,0 ml Natriumheparin (Upjohn, 1.000 U/ml) beschichtet sind, und 1:1 in Hanks Balanced Salt Solution (Gibco) verdünnt. Die Erythrozyten werden aus den PBMCs mittels Zentrifugation auf einem Ficoll-Hypaque-Lymphozyten-Separationsmedium separiert. Die PBMCs werden drei Mal in Hanks Balanced Salt Solution gewaschen und dann auf eine Endkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI resuspendiert, das 10% frisches autologes menschliches Serum, Penizillin-Streptomycin (10 U/ml) und 0,05% DMSO enthält. Endotoxinfreies rekombinantes menschliches IL-1b wird dann auf eine Endkonzentration von 50 pMolar zugefügt. Ein Aliquot (0,1 ml) der Zellen wird schnell in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt, die 0,1 ml der Verbindung in einer passenden Verdünnung enthält, und werden für 24 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Am Ende des Kulturzeitraums werden die Zellkulturüberstände auf die Synthese von TNF-a, IL-6 und PGE2 unter Verwendung eines spezifischen ELISA getestet.
Bestimmung von IL-1b, TNF-a, IL-6 und Prostanoidproduktion aus LPS- oder IL-1-stimulierten PBMCs IL-1b ELISA
Menschliches IL-1b kann in Zellkulturüberständen oder Vollblut mit dem folgenden spezifisch abfangenden ELISA nachgewiesen werden. Plastikplatten mit sechsundneunzig Vertiefungen (Immulon 4; Dynatech) werden für 12 Stunden bei 4°C mit 1 mg/ml Protein-A-Affinitätschromatographie-gereinigtem Maus-anti-humanem IL-1b-monoklonalem Antikörper (erworben als Azites-Präparation von LAO Enterprise, Gaithersburg Maryland.), verdünnt in Dulbeccos Phosphat-gepufferter Salzlösung (-MgCl₂, -CaCl₂) beschichtet. Die Platten wurden mit PBS-Tween (Kirkegaard and Perry) gewaschen, anschließend mit 1% BSA Verdünnungs- und Blockierlösung (Kirkegaard and Penny) für 60 Minuten bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt von einer Wäsche mit PBS-Tween. II-1b-Standards werden aus gereinigtem rekombinantem IL-1b, produziert aus E. coli, hergestellt. Die höchste Konzentration beginnt bei 10 ng/ml, gefolgt von 11 zweifachen Reihenverdünnungen. Zum Nachweis von IL-1b aus den Zellkulturüberständen oder Blutplasma, werden 10 bis 25 ml Überstand jeder Testvertiefung mit 75 bis 90 ml PBS Tween zugefügt. Proben werden bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert, dann 6 Mal mit PBS-Tween auf einem automatischen Plattenwascher (Dennly) gewaschen. Kaninchen-anti-humane IL-1b polyklonale Antisera, verdünnt 1:500 in PBS-Tween, wird der Platte zugefügt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von sechs Wäschen mit PBS-Tween. Nachweis von gebundenem Kaninchen-anti-IL-1b-IgG wird erreicht mit Fab'-Fragmenten von Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Merrettichperoxidasekonjugat (Accurate Scientific), verdünnt 1:10.000 in PBS-Tween. Peroxidaseaktivität wurde bestimmt unter Verwendung von TMB-Peroxidasesubstratkit (Kirkegaard and Perry) mit quantitativer Bestimmung der Farbintensität auf einem Spektrophotometerset von Molecular Devices mit einer Platte mit 96 Vertiefungen, um die Absorbanz bei 450 nM zu bestimmen. Proben wurden unter Verwendung einer Standardkurve der Absorbanz gegen die Konzentration bewertet. Four-parameter-logistics-Analyse wird im Allgemeinen verwendet, um die Daten anzupassen und die Konzentrationen unbekannter Verbindungen zu erhalten.
TNF-a ELISA
Plastikplatten mit 96 Vertiefungen von Immulon 4 (Dynatech) werden mit einer 0,5 mg/ml-Lösung von Maus-anti-human-TNF-a-monoklonalem Antikörper beschichtet. Der sekundäre Antikörper ist eine 1:2.500-Verdünnung eines Kaninchen-anti-human-TNF-a-polyklonalen Serums, erworben von Genzyme. Alle anderen Arbeiten sind mit denen identisch, die oben für IL-1b beschrieben wurden. Die Standards werden in PBS-Tween + 10% FBS oder HS hergestellt. Elf 2-fach-Verdünnungen werden beginnend bei 20 ng/ml TNF-a durchgeführt.
IL-6 ELISA
Level von sekretiertem menschlichem IL-6 werden ebenfalls durch einen spezifisch abfangenden ELISA, wie zuvor in Chin and Kostura, J. Immunol. 151, 5574-5585 (1993) beschrieben, bestimmt. ELISA-Platten (Dynatech) werden mit Maus-anti-human-IL-6-monoklonalem Antikörper, verdünnt auf 0,5 mg/ml in PBS beschichtet. Der sekundäre Antikörper, ein Kaninchen-anti-human-IL-6-polyklonales Antiserum wird 1:5.000 mit PBS-Tween verdünnt. Alle anderen Arbeiten sind mit denen identisch, die oben für IL-1b beschrieben wurden. Die Standards werden in PBS-Tween + 10% FBS oder HS hergestellt. Elf 2-fach-Verdünnungen werden beginnend bei 50 ng/ml 1L-6 durchgeführt.
PGE₂-Produktion
Prostaglandin E2 wird in Zellkulturüberständen aus LPS- oder IL-1- stimulierten PBMCs unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Enzym-Immunoassays nachgewiesen. Der Assay wird von Cayman Chemical (Katalognummer 514010) erworben und wird exakt nach den Anweisungen des Herstellers ausgeführt.
Interleukin 8 (IL-8)
Die vorliegenden Verbindungen können ebenfalls auf IL-8-inhibierende Aktivität getestet werden, wie nachfolgend diskutiert. Primäre humane Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) (Cell Systems, Kirland, Wa) werden im Kulturmedium, das mit 15% fötalem Rinderserum und 1% CS-HBGF, bestehend aus aFGF und Heparin, angereichert ist, gehalten. Die Zellen werden dann 20-fach verdünnt, bevor sie in gelatinebeschichtete Platten mit 96 Vertiefungen plattiert werden (250 μl). Vor der Verwendung wird das Kulturmedium mit frischem Medium (200 μ1) ersetzt. Puffer oder Testverbindung (25 μl, in passenden Konzentrationen) wird dann jeder Vertiefung in Vierfach-Vertiefungen zugefügt, und die Platten werden für 6 Std. in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C in einer Atmosphäre aus 5% CO₂ inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraums wird der Überstand entfernt und auf IL-8-Konzentration unter Verwendung eines IL-8-ELISA-Kits, erhalten von R&D Systems (Minneapolis, MN), getestet. Alle Daten werden, basierend auf der Standardkurve, als Mittelwert (ng/ml) mehrfacher Proben dargestellt. IC₅₀-Werte werden gegebenenfalls durch nichtlineare Regressionsanalyse generiert.

Claims

Eine Verbindung, dargestellt durch Formel I:
wobei R₁ C_1-6-Alkyl ist, R₂ H, C_1-6-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, OC_1-6-Alkyl oder C(O)C_1-6-Alkyl ist, R₃ H, C_1-6-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, OC_1-6-Alkyl oder C(O)C_1-6-Alkyl oder Aralkyl ist, X C oder N ist, Y H, Halogen, C_1-6-Alkyl, CN oder CF₃ ist, Z NHR₃ oder F ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Additionssalz und/oder Hydrat davon oder, wo zutreffend, ein geometrisches oder optisches Isomer oder eine racemische Mischung davon.
Eine wie in Anspruch 1 definierte Verbindung, wobei X N ist.
Eine wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definierte Verbindung, wobei R, C_3-8-Cycloalkyl ist.
Eine durch die Formel
dargestellte Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Additionssalz und/oder Hydrat davon oder, wo zutreffend, ein geometrisches oder optisches Isomer oder eine racemische Mischung davon.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
Ein Verfahren zur Herstellung der wie in Anspruch 5 beanspruchten pharmazeutischen Zusammensetzung durch Kombination einer Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers.
Die Verwendung einer wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 beanspruchten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Zytokinvermittelten Erkrankung.
Die Verwendung einer wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 beanspruchten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündung.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Zytokin-vermittelte Erkrankung rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Endotoxinämie, Toxic-Shock-Syndrom, entzündliche Darmerkrankung, Tuberkulose, Atherosklerose, Muskeldegeneration, Kachexie, psoriatische Arthritis, Reiter-Syndrom, rheumatoide Arthritis, Gicht, traumatische Arthritis, Rötel-assoziierte Arthritis oder akute Synovitis ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Zytokin-vermittelte Erkrankung rheumatoide Arthritis, rheumatoide Spondylitis, Osteoarthritis, gichtartige Arthritis, Sepsis, septischer Schock, Endotoxinschock, gram-negative Sepsis, Toxic-Shock-Syndrom, Atemnotsyndrom der Erwachsenen, zerebrale Malaria, chronische Lungenentzündungserkrankung, Silikose, Lungensarkoidose, Knochenresorptionserkrankung, Reperfusionsverletzung, Grafi-versus-Host-Abstoßung, Allografiabstoßung, Fieber, Myalgie aufgrund einer Infektion, Kachexie aus einer Infektion oder einem bösartigen Tumor, Kachexie aus erworbenem Immunschwächesyndrom (AIDS), AIDSbezogener Komplex (ARC), Keloidbildung, Narbengewebebildung, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa oder Pyrese ist.
Die Verwendung einer wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 beanspruchten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Osteoporose.
Die Verwendung einer wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 beanspruchten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Knochenresorption.
Die Verwendung einer wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 beanspruchten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Morbus Crohn.