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Diese
Erfindung betrifft neue Verbindungen und deren Verwendung als Medikamente,
insbesondere als Raf-Kinase-Inhibitoren zur Behandlung von neurotraumatischen
Erkrankungen.
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Raf-Proteinkinasen
sind Schlüsselkomponenten
von Signalübertragungswegen,
durch welche spezifische extrazelluläre Reize präzise zelluläre Antworten in Säugerzellen
auslösen.
Aktivierte Zelloberflächenrezeptoren
aktivieren ras/rap Proteine auf der inneren Seite der Plasmamembran,
welche wiederum Raf-Proteine rekrutieren und aktivieren. Aktivierte
Raf-Proteine phosphorylieren und aktivieren die intrazellulären Proteinkinasen
MEK1 und MEK2. Aktivierte MEK's
katalysieren wiederum die Phosphorylierung und Aktivierung von p42/p44
Mitogenaktivierter Proteinkinase (MAPK). Eine Vielzahl cytoplasmatischer
und nukleärer
Substrate von aktivierter MAPK, welche direkt oder indirekt zur
zellulären
Antwort auf Umweltänderungen
beitragen, ist bekannt. Drei verschiedene Gene sind in Säugern identifiziert
worden, welche Raf-Proteine
codieren; A-Raf, B-Raf und C-Raf (auch bekannt als Raf-1) und isoforme
Varianten, welche sich durch unterschiedliches Splicen der mRNA
ergeben, sind bekannt.
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Inhibitoren
von Raf-Kinasen sind für
die Verwendung in der Unterbrechung von Tumorzellwachstum und daher
für die
Behandlung von Krebs, z. B. histiozytärem Lymphom, Lungenadenocarcinom,
kleinzelligem Lungenkrebs und Bauchspeicheldrüsen- und Brustkrebs und auch
zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Störungen vorgeschlagen worden,
welche mit neuronaler Degeneration in Zusammenhang stehen, welche sich
aus ischämischen
Ereignissen ergeben, einschließlich
cerebraler Ischämie
nach Herzstillstand, Schlaganfall und Multi-Infarkt-Demenz und ebenso
nach cerebralen ischämischen
Ereignissen, wie jene, welche sich aus Kopfverletzung, Chirurgie
und/oder während
der Geburt ergeben.
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Wir
haben jetzt eine Gruppe neuer Verbindungen gefunden, welche Inhibitoren
von Raf-Kinasen,
insbesondere Inhibitoren von B-Raf-Kinase sind.
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Gemäß der Erfindung
werden Verbindungen der Formel (I) bereitgestellt:
wobei
X O, CH
2, S oder NH ist oder die Einheit X-R
1 ein Wasserstoffatom ist;
V CH oder
N ist;
R
1 ein Wasserstoffatom, C
1-6-Alkyl, C
3-7-Cycloalkyl,
Aryl, Aryl-C
1-6-alkyl, Heterocyclyl, Heterocyclyl-C
1-6-alkyl, Heteroaryl oder Heteroaryl-C
1-6-alkyl ist, wobei jedes von diesen mit
Ausnahme des Wasserstoffatoms gegebenenfalls substituiert sein kann;
R
2 und R
3 unabhängig voneinander
gegebenenfalls substituiertes C
1-6-Alkyl
sind;
R
4 und R
5 unabhängig voneinander
ein Wasserstoffatom, C
1-6-Alkyl, C
3-7-Cycloalkyl, Aryl, Aryl-C
1-6-alkyl,
Heteroaryl, Heteroaryl-C
1-6-alkyl, Heterocyclyl
oder Heterocyclyl-C
1-6-alkyl sind, wobei
jedes von diesen mit Ausnahme des Wasserstoffatoms gegebenenfalls
substituiert sein kann, oder R
4 und R
5 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das
sie gebunden sind, einen 4- bis
8-gliedrigen Ring bilden;
Ar ein Aryl- oder Heteroarylring
ist, wobei jeder von diesen gegebenenfalls substituiert sein kann;
entweder
X
1 oder X
2 N ist
und das andere NR
6 ist, wobei R
6 ein
Wasserstoffatom, C
1-6-Alkyl oder Aryl-C
1-6-alkyl ist;
oder pharmazeutisch verträgliche Salze
davon.
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Wie
hierin verwendet, stellt die Doppelbindung, angegeben durch die
gepunktete Linie in Formel (I), die möglichen tautomeren Ringformen
der Verbindungen, welche in den Umfang dieser Erfindung fallen,
dar, wobei die Doppelbindung zum unsubstituierten Stickstoffatom
erfolgt.
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Die
Alkyl- und Alkenylreste, welche hierin genannt werden, können einzeln
oder als Teil größerer Gruppen,
z. B. Alkoxy, gerade oder verzweigte Reste sein, welche bis zu sechs
Kohlenstoffatome enthalten und gegebenenfalls mit einem oder mehreren
Resten, ausgewählt
aus Aryl, Heteroaryl, Heterocyclyl, C1-6-Alkoxy, C1-6-Alkylthio, Aryl-C1-6-akoxy,
Aryl-C1-6-alkylthio, Amino, Mono- oder Di-C1-6-alkylamino, Cycloalkyl, Cycloalkenyl,
Carboxy und Estern davon, Amid, Sulfonamido, Ureido, Guanidino,
C1-6-Alkylguanidino, Amidino, C1-6-Alkylamidino, C1-6-Acyloxy, Azido, Hydroxy, Hydroxyimino
und Halogen substituiert sein. Vorzugsweise enthält der optionale Substituent
einen solubilisierenden Rest; geeignete Solubilisierungseinheiten
werden Fachleuten offensichtlich sein und schließen Hydroxy- und Amingruppen ein. Stärker bevorzugt
schließt
der optionale Substituent Heterocyclyl, Amino, Mono- oder Di-C1-6-alkylamino, Amid und Hydroxy oder eine
Kombination davon ein.
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Die
Cycloalkyl- und Cycloalkenylreste, welche hierin genannt werden,
schließen
Reste ein, welche drei bis sieben Kohlenstoffringatome aufweisen
und sind gegebenenfalls, wie hierin vorstehend für die Alkyl- und Alkenylreste
beschrieben wird, substituiert.
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Wenn
hierin verwendet, schließt
der Begriff "Aryl", außer es ist
anders definiert, einzelne und kondensierte Ringe ein, welche geeigneterweise
4 bis 7, vorzugsweise 5 oder 6 Ringatome in jedem Ring enthalten, wobei
die Ringe jeweils unsubstituiert oder mit zum Beispiel bis zu drei
Substituenten substituiert sein können.
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Geeignete
Arylreste schließen
Phenyl und Naphthyl, wie 1-Naphthyl oder 2-Naphthyl, ein.
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Wenn
hierin verwendet, schließt
der Begriff "Heterocyclyl", außer es ist
anders definiert, nichtaromatische, einzelne und kondensierte Ringe
ein, welche geeigneterweise bis zu vier Heteroatome in jedem Ring enthalten,
wobei jedes aus O, N und S ausgewählt ist, wobei die Ringe unsubstituiert
oder mit zum Beispiel bis zu drei Substituenten substituiert sein
können.
Geeigneterweise hat jeder heterocyclische Ring 4 bis 7, vorzugsweise
5 oder 6 Ringatome. Ein kondensiertes heterocyclisches Ringsystem
kann carbocyclische Ringe einschließen und muss nur einen heterocyclischen
Ring einschließen.
Beispiele für
heterocyclische Reste schließen
Pyrrolidin, Piperidin, Piperazin, Morpholin, Imidazolidin und Pyrazolidin
ein.
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Wenn
hierin verwendet, schließt
der Begriff "Heteroaryl", außer es ist
anders definiert, mono- und
bicyclische heteroaromatische Ringsysteme ein, umfassend bis zu
vier, vorzugsweise 1 oder 2 Heteroatome, wobei jedes aus O, N und
S ausgewählt
ist. Jeder Ring kann 4 bis 7, vorzugsweise 5 oder 6 Ringatome aufweisen.
Ein bicyclisches heteroaromatisches Ringsystem kann einen carbocyclischen
Ring einschließen.
Beispiele für
Heteroarylreste schließen
Pyrrol, Chinolin, Isochinolin, Pyridin, Pyrimidin, Oxazol, Thiazol,
Thiadiazol, Triazol, Imidazol und Benzimidazol ein.
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Aryl-,
Heterocyclyl- und Heteroarylreste können gegebenenfalls mit vorzugsweise
bis zu drei Substituenten substituiert sein. Geeignete Substituenten
schließen
Halogen, C1-6-Alkyl, Aryl, Aryl-C1-6-alkyl, C1-6-Alkoxy,
C1-6-Alkoxy-C1-6-alkyl,
Halogen-C1-6-alkyl, Aryl-C1-6-alkoxy,
Hydroxy, Nitro, Cyano, Azido, Amino, Mono- und Di-N-C1-6-alkylamino,
Acylamino, Arylcarbonylamino, Acyloxy, Carboxy, Carboxysalze, Carboxyester,
Carbamoyl, Mono- und Di-N-C1-6-alkylcarbamoyl,
C1-6-Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, Ureido,
Guanidino, C1-6-Alkylguanidino, Amidino, C1-6-Alkylamidino,
Sulfonylamino, Aminosulfonyl, C1-6-Alkylthio,
C1-6-Alkylsulfinyl, C1-6-Alkylsulfonyl,
Heterocyclyl, Heteroaryl, Heterocyclyl-C1-6-alkyl,
Hydroxyimino-C1-6-alkyl und Heteroaryl-C1-6-alkyl ein. Vorzugsweise enthält der optionale
Substituent einen solubilisierenden Rest; geeignete Solubilisierungseinheiten
werden Fachleuten offensichtlich sein und schließen Hydroxy- und Amingruppen
ein. Besonders bevorzugt schließt
der optionale Substituent Heterocyclyl, Amino, Mono- oder Di-C1-6-alkylamino, Amid und Hydroxy oder eine
Kombination davon ein.
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X
ist vorzugsweise NH oder X-R1 ist ein Wasserstoffatom
und falls X gleich NH ist, ist R1 vorzugsweise ein
C1-6-Alkyl oder ein Wasserstoffatom.
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Falls
V CH ist, ist X-R1 vorzugsweise ein Wasserstoffatom.
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Falls
V N ist, ist X-R1 vorzugsweise NH2.
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Am
meisten bevorzugt ist X-R1 ein Wasserstoffatom.
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Ar
ist vorzugsweise ein gegebenenfalls substituiertes Phenyl.
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Bevorzugte
Substituenten für
den Rest Ar schließen
Halogen, Hydroxy, Hydroxy-C1-6-alkyl, z.
B. Hydroxymethyl, Hydroxyimino-C1-6-alkyl
und C1-6-Alkoxy, z. B. Methoxy, ein, stärker bevorzugt
sind Halogen und Hydroxy. Wenn Ar Phenyl ist, sind die Substituenten
vorzugsweise an der 3-Position oder an den 3,4-Positionen vorhanden.
Wenn Ar Phenyl ist, weist es vorzugsweise einen 3-Hydroxysubstituenten
auf. Besondere Substitutionsmuster für Ar, falls es Phenyl ist,
sind 3-Hydroxy, 3-Hydroxy-4-halogen, z. B. ein 3-Hydroxy-4-chlor
oder 3-Hydroxy-4-brom,
3-Hydroxy-4-methyl und 3-Hydroxy-4-methoxy, ganz besonders 3-Hydroxy-4-chlor.
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Vorzugsweise
sind R2 und R3 unabhängig voneinander
C1-6-Alkyl.
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R2 und R3 sind unabhängig voneinander
ein gegebenenfalls substituiertes C1-6-Alkyl.
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Insbesondere
sind R2 und R3 Methyl.
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Vorzugsweise
sind R4 und R5 unabhängig voneinander
ein Wasserstoffatom, C1-6-Alkyl, Aryl-C1-6-alkyl, C3-7-Cycloalkyl, wobei jedes von diesen mit
Ausnahme des Wasserstoffatoms gegebenenfalls substituiert sein kann,
oder R4 und R5 bilden
zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen
gegebenenfalls substituierten 5 oder 6-gliedrigen Ring, welcher
gegebenenfalls bis zu 2 Heteroatome, ausgewählt aus N oder O enthält, zum
Beispiel Morpholin, Pyrrolidin oder Piperazin.
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Die
Verbindungen der Formel (I) weisen vorzugsweise ein Molekulargewicht
von weniger als 800 auf.
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Spezielle
erfindungsgemäße Verbindungen
schließen
die in den Beispielen erwähnten
und deren pharmazeutisch verträgliche
Salze ein. Es ist selbstverständlich,
dass die Erfindung pharmazeutisch verträgliche Derivate der Verbindungen
von Formel (I) einschließt
und dass diese im erfindungsgemäßen Umfang
eingeschlossen sind.
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Wie
hierin verwendet, schließt "pharmazeutisch verträgliches
Derivat" jedes pharmazeutisch
verträgliche
Salz, Ester oder Salz eines derartigen Esters einer Verbindung der
Formel (I) ein, welches nach Verabreichung an den Empfänger in
der Lage ist (direkt oder indirekt), eine Verbindung der Formel
(I) oder einen aktiven Metaboliten oder Rest davon bereitzustellen.
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Es
ist selbstverständlich,
dass für
die Verwendung in der Medizin die Salze der Verbindungen der Formel
(I) pharmazeutisch verträglich
sein sollten. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Salze werden Fachleuten
offensichtlich sein und schließen
jene in J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1–19, beschriebenen ein, wie
Säureadditionssalze,
welche mit anorganischen Säuren
gebildet werden, z. B. Salz-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-
oder Phosphorsäure
und welche mit organischen Säuren
gebildet werden, z. B. Bernstein-, Malein-, Essig-, Fumar-, Zitronen-,
Wein-, Benzoe-, p-Toluolsulfon-, Methansulfon- oder Naphthalinsulfonsäure. Andere Salze,
z. B. Oxalate, können
verwendet werden, zum Beispiel für
die Isolierung von Verbindungen der Formel (I) und sind innerhalb
des Umfangs dieser Erfindung eingeschlossen.
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Die
Verbindungen dieser Erfindung können
in kristalliner oder nicht-kristalliner Form sein und können, falls
kristallin, gegebenenfalls hydratisiert oder solvatisiert sein.
Diese Erfindung schließt
innerhalb ihres Umfangs stöchiometrische
Hydrate sowie Verbindungen, welche unterschiedliche Mengen Wasser
enthalten, ein.
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Die
Erfindung erstreckt sich auf alle isomeren Formen, einschließlich Stereoisomere
und geometrische Isomere der Verbindungen der Formel (I), einschließlich Enantiomere
und Gemische davon, z. B. Racemate. Die unterschiedlichen isomeren
Formen können
durch herkömmliche
Verfahren abgeschieden oder voneinander getrennt werden, oder jedes
gegebene Isomer kann durch herkömmliche
synthetische Verfahren oder durch stereospezifische oder asymmetrische
Synthesen erhalten werden.
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Weil
die Verbindungen der Formel (I) zur Verwendung in Arzneimitteln
bestimmt sind, ist es leicht zu verstehen, dass sie vorzugsweise
in im Wesentlichen reiner Form, zum Beispiel mindestens 60% rein,
geeigneter mindestens 75% rein und bevorzugt mindestens 85% rein
und speziell mindestens 98% rein (% bezogen auf Gewicht/Gewicht)
bereitgestellt werden. Unreine Präparationen der Verbindungen
können
für die
Herstellung reinerer Formen verwendet werden, welche bei Arzneimitteln
verwendet werden.
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Verbindungen
der Formel (I) sind Imidazolderivate, welche leicht aus Ausgangsmaterialien,
welche entweder im Handel erhältlich
sind oder aus solchen analog zu gut bekannten Verfahren hergestellt
werden können,
unter Verwendung von den Fachleuten gut bekannten Verfahren hergestellt
werden können
und welche beispielsweise in Comprehensive Heterocyclic Chemistry,
Herausgeber Katritzky und Rees, Pergamon Press, 1984, 5, 457–497, beschrieben
sind. Ein wichtiger Schritt in vielen derartigen Synthesen ist die
Bildung des zentralen Imidazolkerns. Geeignete Verfahren werden
unter anderem in US Patent Nr. 3,707,475 und 3,940,486 beschrieben,
welche hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden.
Diese Patente beschreiben die Synthese von α-Diketonen und α-Hydroxyketonen
(Benzoinen) und deren nachfolgende Verwendung bei der Herstellung
von Imidazolen und N-Hydroxylimidazolen.
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Bevorzugte
Verfahren für
das Herstellen von erfindungsgemäßen Verbindungen
sind wie in dem vorstehenden Schema umrissen, wobei Y COOH oder
ein C1-6-Alkyl oder Aryl-C1-6-alkylester
davon ist. α-Diketone werden
durch Kondensation des Anions von zum Beispiel einem 4-substituierten Pyridinderivat
(V = CH, R1-X = H) mit dem Weinreb-Amid
einer Arylsäure
oder eines Arylaldehyds, gefolgt von der Oxidation des Zwischenprodukts,
hergestellt. Erhitzen des Diketons mit einem Aldehyd und Ammoniumacetat
in Essigsäure
erlaubt den Zugang zum Imidazolkern. Danach kann der Rest Y1 unter Verwendung von herkömmlichen
Umwandlungsverfahren funktioneller Gruppen in einen Rest Y umgewandelt
werden.
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Umwandlungen
funktioneller Gruppen sind im Fachgebiet gut bekannt und sind zum
Beispiel in Comprehensive Organic Functional Group Transformations,
Herausgeber A. R. Katritzky, O. Meth-Cohn und C. W. Rees (Elsevier
Science Ltd., Oxford, 1995), Comprehensive Organic Chemistry, Herausgeber
D. Barton und W. D. Ollis (Pergamon Press, Oxford, 1979) und Comprehensive
Organic Transformations, R. C. Larock (VCH Publishers Inc., New
York, 1989) beschrieben. Der Rest Y1 ist
vorzugsweise COOCH3.
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Nicht-selektive
Alkylierung des Imidazolstickstoffs (unter Verwendung eines der
in N. J. Liverton et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 2180–2190 umrissenen
Verfahren) mit einer Verbindung der Formel L-R6,
wobei L eine Abgangsgruppe ist, z. B. Halogen, Sulfonat oder Triflat,
wird beide Isomere der Verbindungen der Formel (I) ergeben, wobei
X1 oder X2 NR6 ist, wobei R6 kein
Wasserstoffatom ist; die Isomere können mit chromatographischen
Verfahren abgetrennt werden.
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Während der
Synthese der Verbindungen der Formel (I) können labile funktionelle Gruppen
in den Zwischenprodukten, z. B. Hydroxy-, Carboxy- und Aminogruppen
geschützt
werden. Eine ausführliche
Diskussion der Wege durch welche verschiedene labile funktionelle
Gruppen geschützt
werden können
und Verfahren für das
Spalten der so erhaltenen, geschützten
Derivate, ist zum Beispiel in Protective Groups in Organic Chemistry,
T. W. Greene und P. G. M. Wuts, (Wiley-Interscience, New York, 2.
Ausgabe, 1991) zu finden.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
einzeln oder als Bibliotheken von Verbindungen, umfassend mindestens
2, zum Beispiel 5 bis 1000 Verbindungen und stärker bevorzugt 10 bis 100 Verbindungen
der Formel (I), hergestellt werden. Bibliotheken von Verbindungen
der Formel (I) können
durch einen kombinatorischen "split
and mix" Ansatz
oder durch vielfache Parallelsynthesen, unter Verwendung von entweder
Lösungsphasen-
oder Festphasenchemie, mit unter Fachleuten bekannten Verfahren
hergestellt werden.
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Danach
wird in einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform eine Verbindungsbibliothek,
umfassend mindestens 2 Verbindungen der Formel (I) oder pharmazeutisch
verträgliche
Salze davon, bereitgestellt.
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Pharmazeutisch
verträgliche
Salze können
auf herkömmliche
Weise durch Umsetzung mit der entsprechenden Säure oder dem entsprechenden
Säurederivat
hergestellt werden.
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Wie
vorstehend angegeben, sind die Verbindungen der Formel (I) und deren
pharmazeutisch verträglichen
Salze für
die Behandlung und/oder Prophylaxe von Störungen, in denen Raf-Kinasen, insbesondere B-Raf-Kinase,
einbezogen sind, nützlich.
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Gemäß einer
weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch
verträglichen
Salzes davon als Inhibitor der B-Raf-Kinase bereitgestellt.
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Wie
vorstehend angegeben, sind die Verbindungen der Formel (I) und deren
pharmazeutisch verträglichen
Salze für
die Behandlung und/oder Prophylaxe von mit neuronaler Degeneration,
welche sich aus ischämischen
Ereignissen ergeben, in Zusammenhang stehenden Störungen nützlich.
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Gemäß einer
weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe einer neurotraumatischen
Erkrankung in einem Säuger,
der derselben bedarf, bereitgestellt, welche das Verabreichen einer
wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch
verträglichen
Salzes davon an den Säuger
umfasst.
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Gemäß einer
weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch
verträglichen
Salzes davon bei der Herstellung eines Medikamentes für die prophylaktische
oder therapeutische Behandlung eines krankhaften Zustands bei einem
Menschen oder einem anderen Säuger,
welcher durch ein neurotraumatisches Ereignis verschlechtert oder
verursacht wird, bereitgestellt.
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Wie
hierin definiert, schließen
neurotraumatische Erkrankungen/Ereignisse sowohl offenes als auch penetrierendes
Schädeltrauma,
wie zum Beispiel ein durch Operation verursachtes, oder ein geschlossenes Schädelverletzungstrauma,
wie zum Beispiel eines durch eine Verletzung der Schädelregion
verursachtes, ein. Innerhalb dieser Definition sind auch der ischämische Schlaganfall,
insbesondere in der Gehirngegend, transitorisch-ischämische Attacke,
in Folge eines koronaren Bypasses und kognitiver Verfall, in Folge
anderer transitorisch-ischämischer
Zustände
eingeschlossen.
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Ein
ischämischer
Schlaganfall kann als eine fokale neurologische Störung, welche
sich aus ungenügender
Blutzufuhr zu einer besonderen Gehirngegend ergibt, üblicherweise
als Konsequenz eines Embolus, von Thromben oder lokalem atheromatösen Gefäßverschluss,
definiert werden. Rollen für
Stressreize (wie Anoxie), Verletzung vom Redox-Typ, übermäßige neuronale
Anregungsstimulierung und Entzündungs-Cyctokine in
dieser Gegend sind entstanden, und die vorliegende Erfindung stellt
ein Mittel zur potentiellen Behandlung dieser Verletzungen bereit.
Für eine
akute Verletzung wie diese sind relativ wenige Behandlungen erhältlich gewesen.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auch bei der Behandlung oder Prophylaxe von Krebs verwendet werden.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auch bei der Behandlung oder Prophylaxe von CSBP/p38 vermittelten
Erkrankungen, wie in WO 99/01131 und WO 99/01130 beschrieben wird,
von Nutzen sein.
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Für Fachleute
ist es selbstverständlich,
dass die Bezugnahme auf Behandlung hierin sich auf die Prophylaxe
ebenso wie die Behandlung etablierter Infektionen oder Symptome
erstreckt.
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Um
die Verbindungen der Formel (I) in der Therapie zu verwenden, werden
sie normalerweise zu einem Arzneimittel in Übereinstimmung mit pharmazeutischer
Standardpraxis formuliert.
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Gemäß einer
weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird ein Arzneimittel, umfassend eine Verbindung der Formel (I)
oder ein pharmazeutisch verträgliches
Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger bereitgestellt.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
zweckmäßigerweise
durch jeden in herkömmlicher
Weise verwendeten Weg der Arzneimittelverabreichung, beispielsweise
parenteral, oral, topisch oder durch Inhalation, verabreicht werden.
Die Verbindungen der Formel (I) können in herkömmlichen
Dosierungsformen, welche durch das Kombinieren mit pharmazeutischen
Standardträgern
gemäß herkömmlichen
Verfahren hergestellt werden, verabreicht werden. Die Verbindungen
der Formel (I) können
auch in herkömmlichen
Dosierungen in Kombination mit einer bekannten, zweiten therapeutisch
aktiven Verbindung verabreicht werden. Diese Verfahren können Mischen,
Granulieren und Verpressen oder Lösen der Inhaltsstoffe, wie
es für
die gewünschte Präparation
geeignet ist, einschließen.
Es ist selbstverständlich,
dass Form und Art des pharmazeutisch verträglichen Trägers durch die Menge der Verbindung
der Formel (I) mit welcher er kombiniert wird, dem Verabreichungsweg
und anderen gut bekannten Variablen bestimmt wird. Der/die Träger muss/müssen "verträglich" sein, im Sinne von
kompatibel mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung und nicht
schädlich
für den Empfänger davon.
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Der
verwendete pharmazeutische Träger
kann zum Beispiel entweder ein Feststoff oder eine Flüssigkeit
sein. Beispielhaft für
feste Träger
sind Lactose, Kaolin, Saccharose, Talk, Gelatine, Agar, Pektin,
Gummi arabicum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen. Beispielhaft
für flüssige Träger sind
Sirup, Erdnussöl,
Olivenöl,
Wasser und dergleichen. Gleichermaßen kann der Träger oder
das Verdünnungsmittel
ein im Fachgebiet gut bekanntes Zeitverzögerungsmaterial, wie zum Beispiel
Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder in Verbindung
mit einem Wachs, enthalten.
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Eine
große
Vielfalt pharmazeutischer Formen kann verwendet werden. Daher kann,
falls ein fester Träger
verwendet wird, die Präparation
tablettiert, in einer harten Gelatinekapsel in Pulver- oder Pelletform
untergebracht werden oder in Form einer Pastille oder einer Lutschtablette.
Die Menge an festem Träger
wird sehr schwanken, wird aber vorzugsweise etwa 25 mg bis etwa
1 g sein. Falls ein flüssiger
Träger
verwendet wird, wird die Präparation
in Form eines Sirups, einer Emulsion, einer weichen Gelatinekapsel,
einer sterilen injizierbaren Flüssigkeit,
wie zum Beispiel einer Ampulle, oder einer nicht-wässrigen,
flüssigen
Suspension sein.
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Die
Verbindungen der Formel (I) werden vorzugsweise parenteral verabreicht,
das heißt
durch intravenöse,
intramuskuläre,
subcutane, intranasale, intrarectale, intravaginale oder intraperitoneale
Verabreichung. Die intravenöse
Form der parenteralen Verabreichung wird im Allgemeinen bevorzugt.
Die Verbindungen können
als Bolus oder als kontinuierliche Infusion, z. B. über 3 Tage,
verabreicht werden. Geeignete Dosierungsformen für eine derartige Verabreichung
können
durch herkömmliche
Techniken hergestellt werden.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
auch oral verabreicht werden. Geeignete Dosierungsformen für eine derartige
Verabreichung können
durch herkömmliche
Techniken hergestellt werden.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
auch über
Inhalation verabreicht werden, das heißt durch intranasale oder orale
Inhalationsverabreichung. Geeignete Dosierungsformen für eine derartige
Verabreichung, wie zum Beispiel Aerosolformulierungen, können durch
herkömmliche
Techniken hergestellt werden.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
auch topisch verabreicht werden, dass heißt durch nicht-systemische
Verabreichung. Dies schließt
die externe Anwendung der Inhibitoren auf die Epidermis oder die Mundhöhle oder
das Einbringen einer derartigen Verbindung in das Ohr, Auge und
Nase ein, sodass die Verbindung nicht signifikant in die Blutbahn
eindringt.
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Für alle verwendeten
Verfahren, welche hierin offenbart werden, wird das tägliche orale
Dosierungsschema vorzugsweise von etwa 0,1 bis etwa 80 mg/kg Gesamtkörpergewicht,
vorzugsweise von etwa 0,2 bis 30 mg/kg, stärker bevorzugt etwa 0,5 mg
bis 15 mg, sein. Das tägliche
parenterale Dosierungsschema wird etwa 0,1 bis etwa 80 mg/kg Gesamtkörpergewicht,
vorzugsweise von etwa 0,2 bis 30 mg/kg, stärker bevorzugt von etwa 0,5
mg bis 15 mg/kg sein. Das tägliche
topische Dosierungsschema wird vorzugsweise von 0,1 mg bis 150 mg
sein, wobei es ein- bis viermal, vorzugsweise zwei- oder dreimal
täglich,
verabreicht wird. Das tägliche
Inhalations-Dosierungsschema wird vorzugsweise von etwa 0,01 mg/kg
bis etwa 1 mg/kg pro Tag sein. Es wird auch von Fachleuten anerkannt
werden, dass die optimale Menge und der Abstand einzelner Dosierungen
des Inhibitors von der Beschaffenheit und dem Ausmaß des zu
behandelnden Zustands, von der Form, dem Weg und Ort der Verabreichung
und dem speziellen zu behandelnden Patienten bestimmt wird, und
dass derartige Optima durch herkömmliche
Techniken bestimmt werden können.
Es ist für
Fachleute auch selbstverständlich,
dass der optimale Behandlungsplan, d. h. die Anzahl der Dosen des
Inhibitors, die pro Tag für eine
bestimmte Anzahl von Tagen verabreicht werden, von Fachleuten unter
Verwendung herkömmlicher
Bestimmungstests für
Behandlungspläne
ermittelt werden kann. Im Fall der pharmazeutisch verträglichen
Salze berechnen sich die vorstehenden Zahlenangaben aus den Stammverbindungen
der Formel (I).
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Keine
toxikologischen Effekte werden angegeben/erwartet, wenn eine Verbindung
der Formel (I) im vorstehend erwähnten
Dosierungsbereich verabreicht wird.
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Alle
Veröffentlichungen,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Patente und Patentanmeldungen, welche in dieser Beschreibung
zitiert werden, werden hierin durch Bezugnahme aufgenommen, so,
als ob für jede
einzelne Veröffentlichung
spezifisch und einzeln angegeben wäre, dass sie durch Bezugnahme
hierin aufgenommen sei, als ob sie zur Gänze dargelegt wären.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung der pharmazeutisch
aktiven erfindungsgemäßen Verbindungen
und die folgenden Beschreibungen veranschaulichen die Herstellung
von Zwischenprodukten, welche bei der Herstellung dieser Verbindungen
verwendet werden.
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Hierin
verwendete Abkürzungen
sind wie folgt: THF bedeutet Tetrahydrofuran.
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Beschreibung 1: 2-[4-(4-Chlor-3-methoxyphenyl)-5-pyridin-4-yl-1H-imidazol-2-yl]-2-methylpropionsäuremethylester
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Schritt 1. 4-Chlor-3,N-dimethoxy-N-methyl-benzamid
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Eine
Suspension aus 4-Chlor-3-methoxybenzoesäure (F. Claudi et al., J. Med.
Chem., 1992, 35, 4408) (37,2 g, 0,2 mol) in Dichlormethan (500 ml),
welche Oxalylchlorid (26 ml) enthält, wurde mit N,N-Dimethylforamid
(10 Tropfen) behandelt. Nach sechsstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde
die Lösung
unter reduziertem Druck konzentriert, zusätzliches Dichlormethan wurde
zum Rückstand
gegeben, und das Lösungsmittel
wurde eingedampft. Der Rückstand
wurde in Acetonitril (600 ml) gelöst und Methoxymethylaminhydrochlorid
(20,5 g, 0,21 mol) zugegeben. Das Gemisch wurde im Eisbad gekühlt, eine
Lösung
aus Pyridin (80 ml) in Acetonitril (150 ml) tropfenweise zugegeben
und das Gemisch 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die
Lösung
wurde konzentriert und der Rückstand
mit Ethylacetat und einer gesättigten
Kaliumcarbonatlösung ausgeschüttelt. Die
organische Phase wurde abgetrennt, mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet
(MgSO4) und unter reduziertem Druck konzentriert,
um die Titelverbindung (40,0 g, 87%) als ein farbloses Öl zu geben; MS(ES+)
m/e 230/232 [M + H]+.
-
Schritt 2. 1-(4-Chlor-3-methoxyphenyl)-2-pyridin-4-yl-ethanon
-
4-Picolin
(16,9 ml, 0,174 mol) wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung aus
Lithiumdiisopropylamid (110 ml, 0,22 mol, 2 M Lösung in Heptan, Ethylbenzol,
Tetrahydrofuran) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (150 ml) bei –78°C gegeben.
Nach 15 minütigem
Rühren
bei –78°C wurde tropfenweise
eine Lösung
des Produkts aus Schritt 1 (40,0 g, 0,174 mol) in Tetrahydrofuran
(100 ml) zugegeben. Man ließ die
Umsetzung über 3
Stunden auf Raumtemperatur erwärmen.
Die Lösung
wurde auf Eis gekühlt
und eine gesättigte Ammoniumchloridlösung wurde
zugegeben. Das wässrige
Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert, mit Kochsalzlösung gewaschen,
getrocknet (MgSO4), filtriert und unter
reduziertem Druck konzentriert. Der so erhaltene Gummi wurde mit
kaltem Diethylether/Hexan (1 : 1, 300 ml) verrieben und der Feststoff
gesammelt, um die Titelverbindung (29 g, 64%) als einen hellgelben
Feststoff zu geben; MS(ES+) m/e 262/264 [M + H]+.
-
Schritt 3. 1-(4-Chlor-3-methoxy-phenyl)-2-pyridin-4-yl-ethan-1,2-dion
-
Eine
Lösung
des Produkts aus Schritt 2 (22,5 g, 86 mmol) in Dimethylsulfoxid
(150 ml) wurde bei 55°C gerührt. Bromwasserstoff
(48% wässrig,
21 ml) wurden tropfenweise zugegeben und die Lösung 1 Stunde lang auf 55°C gehalten.
Nach dem Kühlen
auf Raumtemperatur wurde die Lösung
in eine Lösung
aus Natriumacetat (21 g) in Eiswasser (1 Liter) gegossen und die
so erhaltene Aufschlämmung
wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit
Ethylacetat extrahiert, und die organischen Phasen wurden vereinigt,
mit Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert
und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde mit Diethylether/Hexan
(1 : 4) verrieben und der Feststoff gesammelt, um die Titelverbindung
als einen gelben Feststoff zu geben; MS(EI) m/e 275/277 [M]+.
-
Schritt 4. 2-[4-(4-Chlor-3-methoxyphenyl)-5-pyridin-4-yl-1H-imidazol-2-yl]-2-methylpropionsäuremethylester
-
Das
Produkt aus Schritt 3 (11,03 g, 40 mmol), 2,2-Dimethyl-3-oxo-propionsäuremethylester
(6,77 g, 52 mmol) und Ammoniumacetat (30,8 g, 400 mmol) wurden in
Essigsäure
(100 ml) 1 Stunde lang bei 100°C erhitzt.
Die Lösung
wurde unter reduziertem Druck konzentriert und der Rückstand
auf eine Lösung
aus Eis: 0,880 Ammoniak gegossen. Die Lösung wurde mit Ethylacetat
extrahiert, mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet
(MgSO4) und zu einem Feststoff eingedampft.
Der Feststoff wurde mit Hexan verrieben, filtriert und getrocknet
um die Titelverbindung (11,02 g, 71%) als einen gelbbraunen Feststoff
zu ergeben; MS(AP+) m/e 386/388 [M + H]+.
-
Beschreibung 2: 2-[4-(4-Chlor-3-methoxyphenyl)-5-pyridin-4-yl-1H-imidazol-2-yl]-2-methyl-propionsäure
-
Das
Produkt von B1 (11,03 g, 28 mmol) wurde in Methanol (150 ml) suspendiert,
eine 2 M Natriumhydroxidlösung
(42 ml, 84 mmol) zugegeben und das Gemisch 3 Stunden lang auf 50°C erwärmt. Nach
der Konzentrierung bei reduziertem Druck wurde der Rückstand
in Wasser gelöst,
mit Ethylacetat gewaschen und dann mit Essigsäure auf pH 4–5 angesäuert. Der
so erhaltene weiße
Niederschlag wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und unter reduziertem
Druck über
Phoshorpentoxid getrocknet um die Titelverbindung (7,75 g, 74%)
als einen zitronengelben Feststoff zu ergeben; MS(AP+) m/e 372/374
[M + H]+.
-
Beschreibung 3: 2-[4-(3,4-Dichlorphenyl)-5-pyridin-4-yl-1H-imidazol-2-yl]-2-methylpropionsäure
-
Schritt 1. 1-(3,4-Dichlorphenyl)-2-pyridin-4-yl-ethan-1,2-diol
-
4-(tert-Butyldimethylsilyloxymethyl)-pyridin
(T. F. Gallagher et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 1997,
5, 49) (67 g, 0,3 mol) wurde in THF (250 ml) gelöst und auf –40°C gekühlt. Die Lösung wurde mit einer 2 M Lösung aus
Lithiumdiisopropylamid in THF (200 ml, 0,4 mol) behandelt und 45
Minuten lang gerührt,
wobei die Temperatur vor der tropfenweise Zugabe von 3,4-Dichlorbenzaldehyd
(55,13 g, 0,32 mol) in THF (250 ml) bei –40 bis –20°C gehalten wurde. Man ließ das Gemisch
sich auf Raumtemperatur erwärmen,
dann wurde es weitere 18 Stunden lang gerührt. Nach dem erneuten Kühlen auf
0°C wurde
die Umsetzung mit einer gesättigten
Ammoniumchloridlösung
(500 ml) gequencht und das so erhaltene Zweiphasen-Gemisch abgetrennt. Die
wässrige
Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten organischen
Phasen unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand
wurde in Ethylacetat gelöst,
mit gesättigter
Natriumbicarbonatlösung, Wasser
und Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (MgSO4), filtriert
und unter reduziertem Druck zu einem Öl (129 g) konzentriert. Das Öl wurde
in THF (300 ml) gelöst
und eine 1 M Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung (360 ml, 0,36 mol) tropfenweise
zugegeben. Die Lösung
wurde 45 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, dann unter reduziertem
Druck zu einem Öl
konzentriert. Das Öl
wurde in Ethylacetat gelöst
und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, Wasser
und Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (MgSO4) und unter
reduziertem Druck eingedampft. Das Öl wurde mit Hexan verrieben
und der so erhaltene Feststoff filtriert und mit Hexan gewaschen
um die Titelverbindung (67,58 g, 79%) als einen gelbbraunen Feststoff
zu ergeben; MS(AP+) m/e 284/286/288 [M + H]+.
-
Schritt 2. 1-(3,4-Dichlorphenyl)-2-pyridin-4-yl-ethan-1,2-dion
-
Dimethylsulfoxid
(37 ml, 0,53 mol) wurde in Dichlormethan (250 ml) gelöst und auf –78°C gekühlt. Oxalylchlorid
(34,5 ml, 0,40 mol) wurde tropfenweise zugegeben und die Lösung 20
Minuten lang gerührt.
Eine Lösung
des Produkts aus Schritt 1 (34 g, 0,12 mol) in Dimethylsulfoxid
(40 ml) und Dichlormethan (200 ml) wurde bei –78°C tropfenweise zugegeben und
die Lösung
30 Minuten lang gerührt.
Triethylamin (104 ml, 0,74 mol) wurde tropfenweise zugegeben und
die Lösung
wurde flockig, so dass es nötig
wurde, von oben zu rühren.
Man ließ die
Lösung über 2 Stunden
lang bei Raumtemperatur rühren,
dann wurde sie auf eine Eis/gesättigte
Natriumbicarbonatlösung
gegossen. Die wässrige
Schicht wurde abgetrennt und mit Dichlormethan wieder extrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen wurden unter reduziertem Druck
zu einem grün-gelben Feststoff
konzentriert. Der Feststoff wurde in Dichlormethan wieder gelöst, mit
Wasser und Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (MgSO4) und zu einem
Feststoff eingedampft. Der rohe Feststoff wurde durch Silicagelchromatographie
gereinigt, wobei mit Dichlormethan eluiert wurde, um die Titelverbindung
(28,6 g, 85%) als einen gelben Feststoff zu ergeben; MS(-ve ion)
m/e 279/281/283 [M – H]–.
-
Schritt 3. 2-[4-(3,4-Dichlorphenyl)-5-pyridin-4-yl-1H-imidazol-2-yl]-2-methylpropionsäuremethylester
-
Das
Produkt aus Schritt 2 (5,60 g, 20 mmol) wurde mit 2,2-Dimethyl-3-oxo-propionsäuremethylester (3,38
g, 26 mmol) und Ammoniumacetat (15,4 g, 200 mmol), wie in Beschreibung
1, Schritt 4 beschrieben, umgesetzt, um die Titelverbindung (5,06
g, 65%) als einen gelbbraunen Feststoff zu ergeben; MS(AP+) m/e 391/393/395
[M + H]+.
-
Schritt 4. 2-[4-(3,4-Dichlorphenyl)-5-pyridin-4-yl-1H-imidazol-2-yl]-2-methylpropionsäure
-
Das
Produkt aus Schritt 3 (5,26 g, 14 mmol) wurde mit einer 2 M Natriumhydroxidlösung (20
ml, 40 mmol) in Methanol, wie in Beschreibung 2 beschrieben, umgesetzt,
um die Titelverbindung (2,36 g, 45%) als einen beigen Feststoff
zu ergeben; MS(AP+) m/e 376/378/380 [M + H]+.
-
Beispiel 1: n-Butyl-2-[4-(4-chlor-3-methoxyphenyl)-5-pyridin-4-yl-1H-imidazol-2-yl]-isobutylamid
-
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid
(63 mg, 0,33 mmol) und 1-Hydroxybenzotriazolhydrat
(41 mg, 0,3 mmol) wurden zu einer Suspension aus dem Produkt der
Beschreibung 2 (111 mg, 0,3 mmol) in Dichlormethan (5 ml) gegeben.
Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur solange gerührt, bis eine klare gelbe Lösung erhalten
wurde, dann wurde n-Butylamin
(0,022 ml, 0,3 mmol) zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt,
dann unter reduziertem Druck zu einem Feststoff eingedampft. Der
Feststoff wurde in Ethylacetat gelöst, mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, Wasser
und Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (MgSO4) und unter
reduziertem Druck eingedampft um die Titelverbindung (113 mg, 88%)
als einen cremigen Feststoff zu ergeben; MS(AP-) m/e 425/427 [M – H]–.
-
Beispiel 2: n-Butyl-2-[4-(4-chlor-3-hydroxyphenyl)-5-pyridin-4-yl-1H-imidazol-2-yl]-isobutylamid
-
Das
Produkt aus Beispiel 1 (130 mg, 0,3 mmol) wurde in Dichlormethan
(5 ml) gelöst,
auf 0°C
gekühlt, dann
tropfenweise mit einer 1 M Lösung
Bortribromid in Dichlormethan (1,2 ml, 1,2 mmol) behandelt. Nach dem
18 Stunden langen Rühren
bei Raumtemperatur wurde das heterogene Gemisch mit Dichlormethan
(10 ml) verdünnt,
2 M Salzsäure
(1 ml) zugegeben und das Gemisch 30 Minuten lang unter Rückfluss
erhitzt. Nach dem Kühlen
auf Raumtemperatur wurde die Lösung
mit gesättigter
Natriumbicarbonatlösung
basisch gemacht und mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
organischen Extrakte wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen,
getrocknet (MgSO4) und unter reduziertem
Druck eingedampft, um die Titelverbindung (101 mg, 82%) als ein
gelbes Pulver zu ergeben; MS(AP-) m/e 411/413 [M – H]–.
-
Beispiel 3: 2-[4-(3,4-Dichlorphenyl)-5-pyridin-4-yl-1H-imidazol-2-yl]-2-methyl-1-morpholin-4-yl-propan-1-on
-
Das
Produkt aus Beschreibung 3 (113 mg, 0,3 mmol) wurde mit Morpholin
(0,027 ml, 0,3 mmol), wie in Beispiel 1 beschrieben, umgesetzt,
um die Titelverbindung (66 mg, 49%) als cremigen Feststoff zu ergeben; MS(AP+)
m/e 445/447/449 [M + H]+.
-
Die
folgenden Beispiele wurden aus dem Produkt der Beschreibung 2, durch
das allgemeine in Beispiel 1 beschriebene Verfahren hergestellt.
-
-
Die
folgenden Beispiele wurden mit dem in Beispiel 2 beschriebenen allgemeinen
Verfahren hergestellt.
-
-
-
Es
ist selbstverständlich,
dass die vorliegende Erfindung alle Kombinationen von hierin vorstehend
beschriebenen besonderen und bevorzugten Untergruppen abdeckt.
-
BIOLOGISCHE
BEISPIELE
-
Die
Aktivität
von Verbindungen der Formel (I) als B-Raf-Inhibitoren kann durch
die folgende in vitro Analyse bestimmt werden:
-
Analyse der
Raf-Kinase
-
Die
Aktivität
menschlicher rekombinanter B-Raf-Proteine wurde in vitro durch das
Analysieren der Aufnahme von radioaktiv-markiertem Phosphat in rekombinante
MAP-Kinase (MEK), einem bekannten physiologischen Substrat für B-Raf,
beurteilt. Katalytisch aktives menschliches rekombinantes B-Raf-Protein
wurde durch Reinigung aus sf9 Insektenzellen erhalten, welche mit
einem menschlichen B-Raf rekombinanten Baculovirus-Expressionvektor
infiziert waren. Um sicher zu stellen, dass die gesamte Substratphosphorylierung sich
aus der Raf-Aktivität
ergibt, wurde eine katalytisch inaktive Form von MEK verwendet.
Dieses Protein wurde aus Bakterienzellen, welche mutantes, inaktives
MEK als ein Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase exprimieren (GST-kdMEK),
gereinigt.
-
Verfahren:
Standard Analyse Bedingungen der katalytischen Aktivität von B-Raf
benutzten 3 μg GST-kdMEK,
10 μM ATP
und 2 μCi 33P-ATP, 50 mM MOPS, 0,1 mM EDTA, 0,1 M Saccharose,
10 mM MgCl2 plus 0,1% Dimethylsulfoxid (welches
die Verbindung enthält,
falls geeignet) in einem Gesamtumsetzungsvolumen von 30 μl. Umsetzungen
wurden 90 Minuten lang bei 25°C
inkubiert und die Umsetzungen durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration
von 50 μM
beendet. 10 μl
der Umsetzung wurden auf P30 Phosphocellulosepapier aufgebracht
und an der Luft getrocknet. Nach viermaligem Waschen in eiskalter
10% Trichloressigsäure,
0,5% Phosphorsäure
wurden die Papiere vor Zugabe eines flüssigen Szintillationsmittels
und Messung der Radioaktivität
in einem Szintillationszähler
an der Luft getrocknet.
-
Ergebnisse:
Für die
Verbindungen der Beispiele wurde festgestellt, dass sie die B-Raf
vermittelte Phosphorylierung von GST-kdMEK Substraten mit IC50-Werten < 3 μM inhibieren.
-
Die
Aktivität
der Verbindungen als Raf Inhibitoren kann auch durch die Analysen
bestimmt werden, welche in WO 99/10325; McDonald, O. B., Chen, W.
J., Ellis, B., Hoffman, C., Overton, L., Rink, M., Smith, A., Marshall,
C. J. and Wood, E. R. (1999) "A
scintillation proximity assay for theRaf/MEK/ERK kinase cascade: high
throughput screening and identification of selective enzyme inhibitors", Anal. Biochem.
268: 318–329
und AACR Meeting New Orleans, 1998, Poster 3793 beschrieben werden.
-
Die
neuro-schützenden
Eigenschaften von B-Raf-Inhibitoren können durch die folgende in
vitro Analyse bestimmt werden:
-
Neuro-schützende Eigenschaften
von B-Raf-Inhibitoren in Kulturen von Schnitten des Hippocampus
der Ratte
-
Organtypische
Kulturen stellen eine Zwischenform zwischen dissoziierten neuronalen
Zellkulturen und in vivo Modellen für den Sauerstoff- und Glucoseentzug
(OGD) bereit. Die Mehrheit der glia-neuronalen Wechselwirkungen
und des neuronalen Kreislaufs wird in kultivierten Schnitten des
Hippocampus aufrecht erhalten, welche so die Beobachtung der Muster
von Tod unter verschiedenen Zelltypen in einem Modell, dass der
in vivo Situation ähnelt,
ermöglichen.
Diese Kulturen ermöglichen
das Studium verzögerter
zellulärer
Schädigung und
Tod 24 Stunden oder mehr nach der Verletzung und erlauben eine Bewertung
der Auswirkungen von Langzeitveränderungen
unter Kulturbedingungen. Eine Anzahl von Laboratorien haben von
einer verzögerten
neuronalen Schädigung
als Antwort auf OGD in organtypischen Kulturen des Hippocampus berichtet
(Vornov et al., Stroke, 1994, 25, 57–465; Newell et al., Brain
Res., 1995, 676, 38–44).
Verschiedene Verbindungsklassen haben in diesem Modell schützende Aktivität gezeigt,
einschließlich
EAA Antagonisten (Strasser et al., Brain Res., 1995, 687, 167–174), Na-Kanalblocker
(Tasker et al., J. Neurosci., 1992, 12, 98–4308) und Ca-Kanalblocker
(Pringle et al., Stroke, 1996, 7, 2124–2130). Bis heute ist relativ
wenig über
die Rolle von durch intrazelluläre
Kinase vermittelten Signalwege beim neuronalen Zelltod in diesem
Modell bekannt.
-
Verfahren:
Organtypische Schnittkulturen des Hippocampus wurden unter Verwendung
des Verfahrens von Stoppini et al., J Neurosci. Methods, 1995, 37,
173–182,
hergestellt. Kurz gesagt werden 400 Micron Sektionen hergestellt,
aus Hippocampi von 7–8
Tage postnatalen Sprague Dawley Ratten, auf halbdurchlässigen Membranen
9–12 Tage
lang kultiviert. OGD wird anschließend durch Inkubation in serum-
und glucosefreiem Medium in einer anaeroben Kammer 45 Minuten lang
induziert. Vor der Untersuchung werden die Kulturen dann 23 Stunden
lang in einen Luft/CO2 Inkubator zurückgestellt.
Propidiumiodid (PI) wird als ein Indikator des Zelltods verwendet.
PI ist nicht toxisch für
Neuronen und ist in vielen Studien verwendet worden, um die Zelllebensfähigkeit
festzustellen. In beschädigte
Neuronen tritt PI ein und bindet an Nucleinsäuren. Gebundenes PI zeigt bei
Anregung bei 540 nm erhöhte
Emission bei 635 nm. Ein PI Fluoreszenzbild und ein Weißlichtbild
werden gemacht und der Anteil toter Zellen untersucht. Das Gebiet
der CA1 Region wird an Hand des Weißlichtbilds bestimmt und über das
PI-Bild gelegt. Der Hintergrund an PI Signal wird bestimmt und das
Gebiet der PI Schädigung
wird als ein Prozentsatz des CA1 Gebiets ausgedrückt. Die Korrelation der PI
Fluoreszenz und histologisch bestätigtem Zelltod ist vorher durch
Nissl-Färbung
mit Cresy-Fast-Violet
validiert worden (Newell et al., J. Neurosci., 1995, 15, 7702–7711).
-
Durch
die gesamte Beschreibung und die Ansprüche, welche folgen, werden
die Ausdrücke "umfassen" und Variationen,
wie zum Beispiel "umfasst" und "umfassend", so verstanden,
dass sie das Einbeziehen einer angegebenen ganzen Zahl oder eines
Schrittes oder Gruppen von ganzen Zahlen implizieren, aber nicht das
Ausschließen
von anderen ganzen Zahlen, Schritten oder Gruppen von ganzen Zahlen
oder Schritten, außer
es ist anders angegeben.