DE69429726T2

DE69429726T2 - Entfernung von schadstoffoxiden und carcinogenen, flüchtigennitrosoverbindungen aus zigarettenrauch mittels biologischer substanzen

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Publication number: DE69429726T2
Application number: DE69429726T
Authority: DE
Inventors: George Deliconstantinos; Ioannis Stavridis
Original assignee: Golden Filter S A
Current assignee: Golden Filter S A
Priority date: 1994-06-27
Filing date: 1994-06-27
Publication date: 2002-10-10
Anticipated expiration: 2014-06-28
Also published as: LV11520A; RO117412B1; NZ267484A; JPH09504439A; NO960778L; PL174430B1; SK26196A3; BR9407632A; MD1912C2; WO1996000019A1; FI960904A0; ATE212196T1; NO306595B1; FI960904A; MD1912B2; SI0720434T1; PT720434E; CA2170610C; AU693099B2; BG100404A

Description

Die vorliegende Erfindung schafft eine Methode zum Zurückhalten der schädlichen Verbindungen, d. h. der Stickstoffoxide, der freien Radikale, der Aldehyde, des Wasserstoffperoxids, des Kohlenstoffmonoxids, der Spurenelemente und der karzinogenen flüchtigen Nitrosoverbindungen, so dass sie beim Zigarettenrauchen nicht eingeatmet werden, wobei diese Substanzen bis heute durch die Verwendung herkömmlicher Zigarettenfilter in nicht ausreichendem Maß zurückgehalten werden.

THEORETISCHER HINTERGRUND DES STANDES DER TECHNIK

Eine Überfülle von Veröffentlichungen in internationalen Zeitschriften schlägt vor, den Zigarettenrauch in zwei Phasen zu trennen: a) eine feste Phase (Teer) und b) eine Gasphase. Diese Trennung tritt bei der Verwendung eines typischen Cambridge-Glasfiber- Filters auf, der 99,9% der Teilchen zurückhält, die größer sind als 0,1 um. Der Teer der Zigarette enthält dramatisch hohe Konzentrationen von sehr stabilen freien Radikalen, die zumindest in vier verschiedene Kategorien eingeteilt werden können. Halbchinone in Gleichgewicht mit Chinon und Hydroxichinone werden als freie Radikale mit den interessantesten chemischen Eigenschaften betrachtet. Das Chinon-System reduziert den molekularen Sauerstoff und bildet Superoxid (O2&supmin;), das dann nach einer spontanen Dismutation Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;) bildet. In der Gasphase befinden sich mehr als 10¹&sup5; organische Radikale pro Blasluft mit Halbwertzeiten von weniger als 1 Sekunde, die inhaliert werden. Es ist paradox, dass diese Radikale trotz ihrer winzigen Halbwertzeit hohe Aktivitätspegel über mehr als 10 Minuten in der Gasphase aufrechterhalten können. Tatsächlich wird die Konzentration dieser Radikale beträchtlich erhöht, wenn man sich dem Filterende der Zigarette nähert. Eine Erklärung für dieses Paradoxon findet sich in der Aufrechterhaltung der Situation eines stationären Zustandes aufgrund der andauernden Produktion von freien Radikalen (Pryor, W.A., Stone, K., Ann. N.Y. Acad. Sci. 686: 12-28, 1993).
Stickoxid (NO) ist das wichtigste freie Radikal in der Gasphase des Zigarettenrauchs, das während des Rauchens an einer Folge von Reaktionen beteiligt ist, durch welche Stickstoffdioxid, Isopren-Radikale, Peroxyl-Radikale und Alkoxyl-Radikale gebildet werden. Zigarettenrauch enthält auch eine beträchtliche Anzahl von Aldehyden, die zu seinen schädigenden, toxischen Effekten beitragen. Es wurde gezeigt, dass winzige Mengen von Aldehyden, die aus dem Zigarettenrauch extrahiert wurden, sowohl Protein- Catabolismus als auch eine Oxidation der Thiol-Gruppen des Plasmaproteins bewirken. Diese den Aldehyden zugeordneten Eigenschaften sind das Ergebnis von Reaktionen zwischen der Carbonylgruppe der Aldehyde und den -SH- und -NH2-Gruppen der Plasmaproteine. Beispielsweise reagiert Acrolein aus dem Zigarettenrauch schnell mit den -SH-Gruppen zur Bildung von Carbonyl-Verbindungen (Alving, K., Forhem, C., und Die vorliegende Erfindung schafft eine Methode zum Zurückhalten der schädlichen Verbindungen, d. h. der Stickstoffoxide, der freien Radikale, der Aldehyde, des Wasserstoffperoxids, des Kohlenstoffmonoxids, der Spurenelemente und der karzinogenen flüchtigen Nitrosoverbindungen, so dass sie beim Zigarettenrauchen nicht eingeatmet werden, wobei diese Substanzen bis heute durch die Verwendung herkömmlicher Zigarettenfilter in nicht ausreichendem Maß zurückgehalten werden.

THEORETISCHER HINTERGRUND DES STANDES DER TECHNIK

Eine Überfülle von Veröffentlichungen in internationalen Zeitschriften schlägt vor, den Zigarettenrauch in zwei Phasen zu trennen: a) eine feste Phase (Teer) und b) eine Gasphase. Diese Trennung tritt beider Verwendung eines typischen Cambridge-Glasfiber- Filters auf, der 99,9% der Teilchen zurückhält, die größer sind als 0,1 um. Der Teer der Zigarette enthält dramatisch hohe Konzentrationen von sehr stabilen freien Radikalen, die zumindest in vier verschiedene Kategorien eingeteilt werden können. Halbchinone in Gleichgewicht mit Chinon und Hydroxichinone werden als freie Radikale mit den interessantesten chemischen Eigenschäften betrachtet. Das Chinon-System reduziert den molekularen Sauerstoff und bildet Superoxid (O2&supmin;), das dann nach einer spontanen Dismutation Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;) bildet. In der Gasphase befinden sich mehr als 10¹&sup5; organische Radikale pro Blasluft mit Halbwertzeiten von weniger als 1 Sekunde, die inhaliert werden. Es ist paradox, dass diese Radikale trotz ihrer winzigen Halbwertzeit hohe Aktivitätspegel über mehr als 10 Minuten in der Gasphase aufrechterhalten können. Tatsächlich wird die Konzentration dieser Radikale beträchtlich erhöht, wenn man sich dem Filterende der Zigarette nähert. Eine Erklärung für dieses Paradoxon findet sich in der Aufrechterhaltung der Situation eines stationären Zustandes aufgrund der andauernden Produktion von freien Radikalen (Pryor, W.A., Stone, K., Ann. N.Y. Acad. Sci. 686: 12-28, 1993).
Stickoxid (NO) ist das wichtigste freie Radikal in der Gasphase des Zigarettenrauchs, das während des Rauchens an einer Folge von Reaktionen beteiligt ist, durch welche Stickstoffdioxid, Isopren-Radikale, Peroxyl-Radikale und Alkoxyl-Radikale gebildet werden. Zigarettenrauch enthält auch eine beträchtliche Anzahl von Aldehyden, die zu seinen schädigenden, toxischen Effekten beitragen. Es wurde gezeigt, dass winzige Mengen von Aldehyden, die aus dem Zigarettenrauch extrahiert wurden, sowohl Protein- Catabolismus als auch eine Oxidation der Thiol-Gruppen des Plasmaproteins bewirken. Diese den Aldehyden zugeordneten Eigenschaften sind das Ergebnis von Reaktionen zwischen der Carbonylgruppe der Aldehyde und den -SH- und -NH2-Gruppen der Plasmaproteine. Beispielsweise reagiert Acrolein aus dem Zigarettenrauch schnell mit den -SH-Gruppen zur Bildung von Carbonyl-Verbindungen (Alving, K., Forhem, C., und Lundberg, J M., Br. J. Pharmacol. 110: 739-746, 1993). Im Teer des Zigarettenrauchs befinden sich Spurenelemente, beispielsweise Eisen, Kupfer, Mangan und Kadmium, die bei vielen Erzeugungsreaktionen von freien Radikalen eine Rolle spielen und zur Bildung von äußerst aktiven Sekundärradikalen führen (beispielsweise von Peroxy-Radikalen, Alkoxy-Radikalen, Superoxid, cytotoxischen Aldehyden usw.). Das Einbringen der Spurenelemente in die Lunge während des Rauchens einer Zigarette führt zu einer Reihe von Redox-Reaktionen sowohl in den Lungen-Fluiden als auch den alveolaren Makrophagen, die zur Ausbildung der äußerst aktiven Hydroxyl-Radikale (OH&supmin;) führen. Diese Hydroxyl-Radikale werden hauptsächlich beim Vorhandensein von Eisen über die Fenton-Reaktion gebildet. Kupfer kann ebenfalls Hydroxyl-Radikale durch eine Reaktion mit Wasserstoffperoxyd in der Lunge bilden. Mangan stimuliert in niedrigen Konzentrationen (10&supmin;&sup7; M) die lösliche Guanylatzyklase der endothelen Zellen, der Lunge und bewirkt die Produktion von Stickoxid und Superoxid vermittels eines positiven Rückkopplungsmechanismus (Youn, Y.K., Lalonde, C., und Demling, R., Free Rad. Biol. Med. 12: 409-415, 1992). Kohlenstoffmonoxid wird beim Verbrennen von Tabak erzeugt. Eine gewisse Menge von CO wird sogar nach dem Ausatmen in der Lunge zurückgehalten, was zur Stimulation der löslichen Guanylatzyklase nach seiner Wechselwirkung mit dem Häm-Bestandteil der Enzyme der endothelen Zellen und anderer Zellen des Lungengewebes führt. Die erhöhten Pegel von zyklischen GMP in den Zellen gekoppelt mit einem positiven Rückkopplungsmechanismus erhöhen die Produktion von Stickoxid und Superoxid (Watson, A., Joyce, H., Hopper, L., und Pride, N.B., Thorax 48: 119-124, 1993). Stickoxidgas, das von zahlreichen Zellenarten einschließlich der vaskulären Endotelialzellen und der rektikularen Endotelialzellen erzeugt werden kann, bewirkt eine Entspannung der glatten Muskulatur (Lowenstein, C.J., Dinerman, J.L., Snynder, S.H. Ann. Intern. Med. 120: 227-237, 1994). Es gibt auch exogene Quellen von NO, die in ähnlicher Weise für die Verursachung von Schäden an den Blutgefäßen und anderen Geweben verantwortlich gehalten werden. Es ist klar nachgewiesen, dass sekundäre und tertiäre Amine mit Nitrit und anderen nitrosierenden Wirkstoffen zur Bildung von N-Nitrosoaminen reagieren können (Lowenstein, C.J., Dinerman, J.L., Snynder, S.H. Ann. Intern. Med. 120: 227-237, 1994). Seit 1974 hat eine Reihe von Studien gezeigt, dass während des Erntens, der Tabakverarbeitung und des Rauchens die Alkaloide in tabakspezifische N-Nitrosamine (TSNA) nitrosiert werden. Von den TSNA, die im Tabak und/oder seinem Rauch identifiziert werden, sind N-Nitrosonornikotin (NNN), 4-(Methylnitrosoamino)-1-(3-pyridil)-1-butanon (NNK) und 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridil)-1-butanol (NNAL) starke Tier-Karzinogene. NNN führt zu Lungentumor bei Mäusen, Luftröhrentumoren bei Hamstern und Tumoren des Nasenhohlraums und des Esophagus bei Ratten. NNK führt zu Lungentumoren bei Mäusen, Hamstern und Ratten und ebenso auch zu Tumoren der Leber, des Nasenhohlraums und der Bauchspeicheldrüse bei Raffen. Orales Auftupfen einer Mischung von NNN und NNK führt zu Tumoren des Rachenraums und der Lungen von Ratten. Die typische Menge von sowohl NNK als auch NNN in den üblichen Zigaretten beträgt 200 ng/Zigarette. (Hecht, S.S., Spratt, T.E., und Trushin, N. Carcinogenesis, 9: 161-165, 1988).
Unsere vorliegende Untersuchung bezüglich der Wirkung von Zigarettenrauch auf das Lungengewebe hat gezeigt, dass NO mit Superoxid reagiert, um das stark oxidierende Radikal Peroxinitrit (ONOO-) zu bilden, das sekundäre Schädigungsreaktionen in Schlüssel-Biomolekülen bewirkt. Sowohl die metabolischen als auch die schädigenden Effekte des NO in den Zellen wurden in unserem Labor sowohl in In-vitro- als auch in In- vivo-Experimenten untersucht.
NO wird in der Gegenwart von Sauerstoff zu Stickstoffdioxid (NO&sub2;) oxidiert. Die Rate dieser Oxidation hängt von der Konzentration des Sauerstoffs und dem Quadrat, der NO-Konzentration ab. Stickstoffdioxid ist deutlich cytotoxisch und wird in Nitrit und Nitrat umgewandelt, wenn es sich in wässrigen Lösungen befindet. Darüber hinaus bildet NO Komplexe mit Spurenelementen und/oder mit Metalloproteinen, beispielsweise Hämoglobin (Wink, D.A., Darbyhsire, J.F., Nims, R.W., Saavedra, J.E., und Ford, P.E., Chem. Res. Toxicol. 6: 23-27, 1993).
NO, das mit Superoxid zur Bildung der Stickverbindungen ONOO&supmin; reagiert, kann gewisse Arten der Superoxid-Toxität begründen. ONOO&supmin; ist in unüblicher Weise stabil, wenn man sein starkes oxidatives Potential (+1,4 V) berücksichtigt. Während seines Zerfalls bildet es stark oxidierende Derivate einschließlich des Hydroxyl-Radikals, des Stickstoffdioxids und des Nitroniumions. Folglich kann jede Abwandlung der NO- und Superoxid-Produktion durch die Gewebe zur Ausbildung von starken, sekundären, oxidierenden Radikalen führen (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J.C., Cancer Mol. Biol. 1: 77-86, 1994). Schließlich haben ONOO&supmin; und seine Ester (RO-ONO oder RO-ONO&sub2;) die Tendenz, den Alpha-1-Proteinase-Hemmer (a1PI) zu deaktivieren. Dies kann durch die Tatsachen begründet werden, dass a) Wasserstoffperoxid für sich allein keine schnelle Deaktivierung des a1PI bewirkt sondern nur in Anwesenheit von NO aktiv ist, bei der ONOO&supmin; gebildet wird und eine schnelle Deaktivierung von a1PI auftritt, b) dass Lösungen von Tert-boutylperoxinitrit (RO-O-O-NO&sub2;) oder ONOO&supmin; selbst eine Deaktivierung von a1PI bewirken und, c) Amine und Aminosäuren die a1PI-Proteinase gegen eine schnelle Deaktivierung schützen (Moreno, J.J., und Pryor, W.A., Chem. Res. Toxicol. 5: 425-431, 1992). Neben den freien Radikalen, die im Zigarettenrauch enthalten sind, stellen die aktivierten alveolaren Makrophagen eine weitere wichtige Quelle für die Erzeugung von freien Radikalen bei Rauchern dar. Die durch den Zigarettenrauch aktivierten alveolaren Makrophagen erleiden ein Atmungs-Zerplatzen, das zu einer erhöhten Erzeugung von freien Sauerstoff-Radikalen (hauptsächlich O&sub2;&supmin;, NO und H&sub2;O&sub2;) führt. Raucher scheinen eine erhöhte Anzahl sowohl von alveolaren Makrophagen als auch von zirkulierenden Neutrophilen zu besitzen. Es wurde gefunden, dass die freien Sauerstoff-Radikale des Zigarettenrauchs auch bei der Entwicklung von Lungenkrebs eine Rolle spielen. Der inhalierte Zigarettenrauch bewirkt einen erhöhten oxidativen Stress in den Lungenzellen, der zur Verminderung der Konzentration der intrazellularen Antioxidantien führt. H&sub2;O&sub2; reagiert vermittels der Erzeugung von Hydroxyl-Radikalen mit der DNA der Zellen und bewirkt ein Brechen des Doppelfadens. Die Tatsache, dass dieses Brechen durch die Hinzufügung von Katalase verhindert werden kann, bestätigt indirekt die schädigenden Wirkungen von H&sub2;O&sub2; und der Hydroyl-Radikale auf die Zell-DNA (Leanderson, P., Ann. N.Y. Acad. Sci. 686: 249-261, 1993). Darüber hinaus kann H&sub2;O&sub2; eine Transformation im trachealen Epithel der Lunge bewirken und wurde mit der Entwicklung von Bronchialcarcinomen bei Rauchern in Verbindung gebracht. Somit existiert ein deutlicher Hinweis auf die schädliche Rolle von H&sub2;O&sub2; (das im Zigarettenrauch enthalten ist) in den Lungenzellen und bei der Entwicklung von Lungenkrebs. Der Teer aus Zigarettenrauch enthält sowohl Semichinon-Radikale als auch Eisen und erzeugt somit ein System für die Produktion von Hydroxyl-Radikalen. Die verschiedenen Spurenelemente, die im Teer von Zigarettenrauch enthalten sind (Fe, Cu, Mn, Cd) können sowohl intrazellulär als auch extrazellulär wirken. Das Fe²&spplus; mit der allgemein bekannten Fenton- Reaktion:
Fe²&spplus; + H&sub2;O&sub2; → Fe³&spplus; + OH&supmin; + OH&supmin;
verursacht eine überaus große Zahl von oxidativen Reaktionen vermittels der Hydroxyl- Radikale. Eine ähnliche Produktion von Hydroxyl-Radikalen kann durch Cd²&spplus; erreicht werden. Mn²&spplus; ist ein charakteristischer Stimulator der Aktivität der löslichen Guanylatcyclase. Cd²&spplus;, das im Zigarettenrauch enthalten ist, ist in der Lunge außerordentlich giftig. Raucher scheinen das zweifache der normalen Konzentration von Cd²&spplus; in ihren Lungen zu haben. Man vermutet, dass Cd²&spplus; im Endotelium der Lungengefäße das normalerweise vorhandene Zn²&spplus; verdrängt (Kostial, K., in: "Trace Elements in Human and Animal Nutrition" (Herausgeber: W. Mertz) 5. Ausgabe, Band 2: 319-345, Academic Press, Inc. Orlando, FL, 1986). Aldehyde, die in Zigarettenrauch vorhanden sind, reagieren mit den -SH- und -NH&sub2;-Gruppen der Proteine um schließlich reaktionsträge zu werden. Crotonaldehyd (α, β ungesättigtes Aldehyd), das im Zigarettenrauch enthalten ist, vermindert die Konzentration der -SH-Gruppen und erhöht die Konzentration der Carbonylproteine (Stadtman, E.R., Science 257: 1220-1224, 1991).
Heutigen Tags werden Filter an Zigaretten in starkem Maße empfohlen. Letztendlich besteht das Ziel des Anbringens von Filtern an Zigaretten darin, ein maximales Zurückhalten der schädlichen Verbindungen zu erzielen, die sowohl in der Gas- als auch in der Festkörperphase des Zigarettenrauchs enthalten sind. Epidemiologische Studien an Rauchern haben gezeigt, dass es eine dosisabhängige Reaktion unabhängig davon gab, ob der Zigarettenrauch in der Gasphase, der festen Phase oder in der kombinierten Phase verabreicht wurde (Surgeon General of the U.S. Public Health Service: The Health consequences of using smokeless tobacco, N.H. Publ. No. 86-2874, Bethesda, MD, 1986). Es wurde bewiesen, dass eine Modifikation der Zigarette als solche eine praktische Möglichkeit zur Verminderung der schädlichen Verbindungen darstellt, die im Zigarettenrauch enthalten sind. Dies wurde zunächst durch die Verwendung herkömmlicher Filter und dann durch eine Änderung der Zusammensetzung des Tabaks durch eine chemische Bearbeitung erreicht. Änderungen bei der Herstellung der Zigaretten wurden ebenso unter Verwendung von porösem Papier oder Papier durchgeführt, das aus Tabakblättern hergestellt war. In den letzten 15 Jahren wurden viele Versuche unternommen, um das Rauchen dadurch für die Gesundheit weniger schädlich zu machen, dass die Menge des Rauchs pro Zigarette vermindert, der Durchmesser der Zigarette verändert und perforierte Filter verwendet wurden. Perforierte Filter ermöglichen eine Verdünnung des Zigarettenrauchs mit Luft bis zu 50%. Auch wurde aktivierte Holzkohle in Verbindung mit perforierten Filtern verwendet. Dies hat zu einer drastischen Verminderung des Gehalts an Teer und Nikotin im Rauch geführt. Solche Verfahrensweisen werden insbesondere in den entwickelten Ländern wie Österreich, Kanada, Frankreich, Deutschland, Schweden, England und den USA angewandt. Der mittlere Gehalt an Teer und Nikotin in einer amerikanischen Zigarette wurde von 38 mg bzw. 2,7 mg in 1955 auf 13 mg bzw. 1 mg in 1991 vermindert. In der Europäischen Gemeinschaft wird diese Tendenz zu einer Verminderung des Gehalts an Teer und Nikotin im Zigarettenrauch weiter fortgesetzt. Die obere zulässige Grenze für Teer im Januar 1993 war 15 mg, die zum Anfang Januar 1998 auf 12 mg reduziert werden musste. In anderen Ländern liegt jedoch der Gehalt von Teer im Zigarettenrauch bei 22 mg (Mitacek, E.J., Brunneman, K.D. Pollednak, A.P., Hoffman, D., und Suttajit, M., Prev. Med. 20: 764- 773, 1991). Die Veränderungen, die bei der Herstellung von Zigaretten durchgeführt wurden, führten zu einer spezifischen Beseitigung bestimmter toxischer Substanzen aus dem Zigarettenrauch; insbesondere wurden die Zellulose-Acetat-Filter eingeführt, die eine partielle Beseitigung der halbflüchtigen Phenole und der flüchtigen N-Nitrosamine ermöglichten (Brunnemann, K.D., Hoffman, D., Recent. Adv. Tobacco Res. 17: 71-112, 1989). Kohlenstoffmonoxid wird selektiv durch die Verwendung von perforierten Filtern vermindert. Die Konzentration von karzinogenen polynuklearen aromatischen Hydrocarbonen (PAH) wurde selektiv durch die Verwendung von mit Nitrit angereichertem Tabak vermindert. Die Verminderung von PAH im Tabak unter Verwendung hoher Konzentrationen von Nitrit führte jedoch zu unerwünschten Steigerungen von karzinogenen N-Nitrosaminen und es war daher nötig, das PAH durch andere Mittel zu vermindern (Hoffman, D., Hoffman, L, Wynder, E.1., Lung Cancer and the Changing Cigarette in Relevance to Human Cancer of N-Nitroso-compounds, Tobacco Smoke and Mycotoxins. (Herausgeber: O'Neil, I.K., Chen, J., und Bartsch, H.), Band 105: 449-459, 1991).
Die schweizerische Patentanmeldung Nr. 609 217 offenbart ein Filter zum Entfernen der schädlichen Komponenten von Tabakrauch. Das Filter umfasst eine Tetrapyrol-Verbindung, wie z. B. Hämoglobin, gemischt mit aktivierter Kohle. Das Filter kann durch Imprägnieren eines Filtermaterials mit der Tetrapyrol-Verbindung gebildet werden.
Aus dem oben Gesagten wird klar, dass eine Notwendigkeit zur Herstellung eines Filters besteht, das in der Lage ist, die schädlichen Stickstoffoxide, die freien Radikale, die Wasserstoffperoxide, die Aldehyde und die karzinogenen Nitroso-Verbindungen zurückzuhalten, die alle für die schädigenden Wirkungen des Zigarettenrauchs auf das Atmungssystem und das kardiovaskuläre System verantwortlich sind. Zur Identifizierung der schädlichen Verbindungen, die im Zigarettenrauch enthalten sind, haben wir chemische und biologische Experimente durchgeführt. Die durchgeführten chemischen Experimente sind die folgenden:
a) Identifizierung und quantitative Bestimmung von NO und NOx unter Verwendung einer neuen chemischen und biologischen Methode (diese Methode wurde in unserem Labor entwickelt).
b) Identifizierung der freien Radikale unter Verwendung von lucigenin-abhängigen Chemolumineszenz-Verfahren.
c) Identifizierung der Aldehyde und Chinone durch Stimulation des enzymatischen Systems Luciferin-Luciferase (dieses Verfahren wurde ebenfalls in unserem Labor entwickelt).
d) Identifizierung und quantitative Erfassung der Spurenelemente unter Verwendung des Verfahrens der Oxidation von Luciferin durch Luciferase in Anwesenheit von ATP (dieses Verfahren wurde in unserem Labor entwickelt).
e) Identifizierung und quantitative Erfassung von H&sub2;O&sub2; unter Verwendung des von Isoluminolmikroperoxidase abhängigen Chemolumineszenz-Verfahrens.
f) Identifizierung und quantitative Erfassung von ONOO&supmin; spektrophotometrisch und durch ein durch Luminol verstärktes Chemolumineszenz-Verfahren.
g) Identifizierung der karzinogenen Nitroso-Verbindung durch durch Luminol verstärkte Chemolumineszenz.
Die durchgeführten biologischen Experimente waren die folgenden:
a) Identifizierung von NO unter Verwendung der Aktivität von isolierter löslicher Guanylatcyclase als funktionalem Parameter.
b) Identifizierung von ONOO&supmin; unter Verwendung der Abschätzung des oxidativen Stresses von menschlichen Erythrocyten induziert durch ONOO&supmin;.
c) Identifizierung von CO unter Verwendung der Aktivität von isolierter löslicher Guanylatcyclase als funktionalem Parameter.
Darüber hinaus wurden die folgenden in vitro-Experimente durchgeführt:
a) Isolation von alveolaren Makrophagen aus Rattenlungen.
b) Abschätzung des oxidativen Stresses von alveolaren Makrophagen induziert durch Tert-Butyl-Hydroperoxid (t-BHP).
c) Bestimmung von NO/NO&sub2;&supmin;/ONOO&supmin; erzeugt durch alveolare Makrophagen.
d) Ermittlung von H&sub2;O&sub2; erzeugt durch alveolare Makrophagen.
e) Wirkung von exogenem H&sub2;O&sub2; auf die NO-Produktion durch alveolare Makrophagen.
An menschlichen Freiwilligen wurden Experimente für die Ermittlung der folgenden Verbindungen durchgeführt.
a) Ermittlung von NO in der ausgeatmeten Luft von Nichtrauchern.
b) Ermittlung von NO in der ausgeatmeten Luft von Rauchern.
c) Ermittlung von NO im ausgeatmeten Zigarettenrauch.
d) Ermittlung von ONOO&supmin; im ausgeatmeten Zigarettenrauch.
e) Ermittlung der freien Radikale im ausgeatmeten Zigarettenrauch.
f) Ermittlung der Aldehyde im ausgeatmeten Zigarettenrauch.
Zur Ermittlung von NO, NOx die a) im Zigarettenrauch enthalten sind, b) durch alveolare Makrophagen nach einer Reizung mit Zigarettenrauch freigesetzt werden und c) im ausgeatmeten Zigarettenrauch von menschlichen Freiwilligen wurde eine Kammer aus festen Stäben von klarem Plexiglas mit 2,5 cm Durchmesser entwickelt und hergestellt, die von einem Ende her mit Hilfe einer Drehmaschine ausgehöhlt worden waren, um in jedem Plexiglasstab einen identischen konischen Hohlraum zu erzeugen. Sie wurden weiterhin an den offenen Enden bearbeitet und poliert, um eine doppelkegelige Einheit zu schaffen, indem eine sehr dichte Passung zwischen den beiden konischen Hohlräumen erzeugt wurde. Ein dünnes quadratisches Plättchen aus Teflon (Polytetrafluorethylen mit einer Dicke von 0,038 mm (0,0015 Inch)) wurde zwischen den zusammengebauten Einheiten sandwichartig eingeschlossen, die mit Flügelschrauben zusammengedrückt wurden. Die beiden Zugangsröhrchen auf beiden Seiten der Membran ermöglichen es, biologisch aktive Proben und reaktive Substanzen auf beiden Seiten der Membran während biologischer Reaktionen zu injizieren, abzuziehen oder abzuwandeln (Fig. 1).

A. Ermittlung von NO durch Chemolumineszenz

Es wurde eine Standard-NO-Lösung gemäß der Literatur zubereitet (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Fassitsas, C., (1992) J. Cardiovasc. Pharmacol. 12, S63-S65) und (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J.C., (1994) in: "Biology of Nitric Oxide", Herausgeber: Feelish, M., Busse, R., Moncanda, S., Portland Press in Druck). Die Reaktionslösung bestand aus Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), pH-Wert 7,4; H&sub2;O&sub2; (500 uM); Luminol (30 uM) und das Gesamtvolumen betrug 500 ul. Das Vial wurde heftig gerührt und die Emission wurde in einem Berthold AutoLumat LB953 Luminometer aufgezeichnet.

B. Chemische Bestimmung von NO/NO&sub2;&supmin;

Die chemische Bestimmung von NO basierte auf der Diazotierung von Sulfonamid durch NO bei einem sauren pH-Wert und nachfolgende Oxidation von Scopoletin, das fluorometrisch detektiert werden kann, wie dies bereits früher beschrieben wurde (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Fassitsas, C., J. Cadriovasc. Pharmacol 12: S63-S65, 1992). Alveolare Makrophagen in HBSS (10&sup6; Zellen/ml) wurden mit 100 ul eines Reaktionsmittels gemischt, das aus 20% Sulfanilamid in 20% H&sub3;PO&sub4; und 25 uM Scopoletin bestand. Der Abfall der Fluoreszenz wurde bei Zimmertemperatur (22ºC) mit einem Aminco SPF-500 Fluoreszenz-Spektrophotometer überwacht. Die Fluoreszenz wurde zeitlich kontinuierlich überwacht, bis das Gefälle der Linie gemessen werden konnte (ungefähr 8 min). Gefällemessungen wurden dann in nMol von NO unter Verwendung einer Standardkurve umgewandelt, die mit verschiedenen Konzentrationen von reinem NO erstellt worden war. Nitrit (NO&sub2;&supmin;), das Endprodukt der NO-Synthese, wurde auf der Basis seiner Akkumulation in den darüber stehenden Schichten der kultivierten Zellen durch seine Reaktion mit Griess-Reaktionsmittel gemessen.

C: Spektroskopische Ermittlung von Peroxinitrit (ONOO&supmin;)

ONOO&supmin; wurde synthetisiert, titriert und wie bereits früher beschrieben gespeichert (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J.C., in: "Biology of nitric oxide" (Herausgeber: Feelisch, M., Busse, R., und Moncada, S.) Portland Press (in Druck)). Wegen der Instabilität von ONOO&supmin; bei einem pH-Wert von 7,4 wurden die UV-Spektren unmittelbar nach dem Mischen der H&sub2;O&sub2;- und NO-Lösung aufgezeichnet. Die Konzentration von ONOO&supmin; wurde basierend auf einen &epsi;302 nm-Wert von 1670 M&supmin;¹cm&supmin;¹ ermittelt. Die UV-Spektren wurden nach Subtraktion der Basis-UV-Spektren von H&sub2;O&sub2; bei entsprechenden Konzentrationen dargestellt.

D. Abschätzung der freien Radikale

Die Abschätzung der freien Radikale wurde unter Verwendung der Lucigenin/DAMCO (1,4-Diazabicyclo-[2,2,2]octan)-induzierten Chemolumineszenz wie bereits früher beschrieben durchgeführt (Deliconstantinos, G., Krueger, G.R.F., J. Viral Dis. 1: 22-27, 1993). Die Reaktionsmischung bestand aus HBSS mit einem pH-Wert 7,4, Lucigenin (30 uM) und DAMCO (100 uM). Das Vial wurde heftig gerührt und die Emission wurde in einem Berthold-Autolumat LB953-Luminometer aufgezeichnet. Es wurden Radikalfänger für freie Sauerstoff-Radikale verwendet (SOD, Mannitol, Histidin, Methionin).

E. Abschätzung der Spurenelemente und Aldehyde

Die Untersuchungen basierten auf der durch Luciferase katalysierten Oxidation von D- Luciferin in Anwesenheit eines ATP-Magnesiumsalzes gemäß der Reaktion Luciferase
LH&sub2; + ATPMg²&spplus; + O&sub2; Oxiluciferin + ATP + O&sub2; + PPi + Mg²&spplus; + Licht
Die Spurenelemente Cd²&spplus;, Cu²&spplus;, Fe²&spplus; erhöhen die Luciferaseaktivität und die maximale Chemolumineszenz-Reaktion wird proportional zu den Konzentrationen des Spurenelementes bis zu 10 ug erhöht. Die Reaktionen finden in HBSS mit einem pH-Wert 7,4 in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml statt.
Für die Abschätzung der Aldehyde wurde das gleiche enzymatische System Luciferin/Luciferase jedoch in Abwesenheit von ATP verwendet. Aldehyde reagieren mit dem enzymatischen System und erzeugen Chemolumineszenz, ohne dass ATP vorhanden ist. Die verwendeten Reagenzien wurden aus einem ATP-Versuchs-Kit (Calbiochem- Novablochem CA,U.S.A.) genommen.

F. Isolation von alveolaren Makrophagen

Kurzgesagt wurden Ratten durch eine intravenöse Injektion von Natriumpentobarbital getötet, der Thorax würde geöffnet, die Lungen wurden mit Ca²&spplus;-freier, kalter (4ºC), mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH-Wert 7,4) blutfrei gespült und dann unversehrt aus dem Brusthohlraum entnommen. Das Homogenat der Rattenlunge wurde dadurch erhalten, dass das Gewebe wiederholte Male durch eine Spritze gezogen und dann unter einem konstanten Strom von Finkelstein Balanced Salt Solution (FBSS; pH- Wert 7,4) durch immer feinere Edelstahl-Gitter passiert wurde, die 32, 62 und 68 Poren bzw. Maschen pro Zoll aufwiesen. Die endgültige Suspension von alveolaren Makrophagen wurde gesammelt, gefiltert und bei 300 g 10 Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die pelletierten Zellen, die zu mehr als 98% aus Makrophagen bestanden, wurden gewaschen und in Ringer'scher Lösung erneut suspendiert. Dann wurde das Verfahren zwei Mal wiederholt. Es wurden ungefähr 10 · 10&sup8; Makrophagen je Ratte isoliert. Die Wachstumsfähigkeit wurde durch Trypanblau-Exclusion sichergestellt.

F. Identifizierung der Nitroso-Verbindungen

Nitroso-Verbindungen wurden durch die langsame Freisetzung von Stickoxid (NO) nach ihrer Behandlung mit H&sub2;O&sub2; identifiziert. Die Reaktionslösung bestand aus Dimethylnitrosamin und/oder Diethylnitrosamin (1 uM), H&sub2;O&sub2; (500 uM) und Luminol (30 uM) in HBSS mit einem pH-Wert von 7,4 und einem Gesamtvolumen von 0,5 ml. Das Vial wurde heftig gerührt und die Emission wurde in einem Berthold-Autolumat LB953 Luminometer aufgezeichnet. Mannitol (100 mM), DMSO (100 mM) und Cystein (3,0 mM) wurden verwendet, um die Ausbildung von ONOO&supmin; zu identifizieren.

G. Isolation von alveolaren Makrophagen

Kurzgesagt wurden Ratten mit einer intravenösen Injektion von Natriumpentobarbital getötet, der Thorax wurde geöffnet, die Lungen wurden mit Ca² freier, kalter (4ºC), mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH-Wert 7,4) blutfrei gespült und dann unversehrt aus dem Brusthohlraum entnommen. Das Homogenat der Rattenlunge wurde dadurch erhalten, dass das Gewebe wiederholte Male durch eine Spritze gezogen und dann unter einem konstanten Strom von Finkelstein Balanced Salt Solution (FBSS; pH- Wert 7,4) durch nach und nach feiner werdende Edelstahl-Gitter passiert wurde, die 32, 62 und 68 Poren bzw. Maschen pro Inch aufwiesen,. Die endgültige Suspension von alveolaren Makrophagen wurden gesammelt, gefiltert und mit 300 g 10 Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die pelletierten Zellen, die zu mehr als 98% aus Makrophargen bestanden, wurden gewaschen und in Ringer'scher Lösung wieder suspendiert. Dann wurde das Verfahren zwei Mal wiederholt. Es wurden ungefähr 10 · 10$ Makrophargen pro Ratte isoliert. Die Wachstumsfähigkeit wurde durch Trybanblau-Exclusion sichergestellt.

H. Oxidativer Stress von alveolaren Makrophargen induziert durch t-Butyl1-hydroperoxid (t-BHP)

Die durch t-BHP (2,5 mM) induzierte Erzeugung von freien Sauerstoff-Radikalen durch alveolare Makrophargen wurde durch Verwendung eines Luminol-Chemolumineszenz- Verfahrens bestimmt. Die Chemolumineszenz-Reaktion wurde in einem Berthold-Autolurnat LB953 Luminometer aufgezeichnet, wie bereits früher beschrieben (Deliconstantinos, G., Krueger, G.R.F., J. Viral Dis. 1, 22-27, 1993).

I. Ermittlung von Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;)

Eine Isoluminol/Microperoxidase-Mischung (100 mM Natriumborat, 1 mM Isoluminol, 0,01 mM Microperoxidase in 70% Wasser und 30% Methanol bei einem pH-Wert 8) wurde zubereitet. 50 ul dieser Mischung wurden dann mit den isolierten alveolaren Makrophargen (10&sup6; Zellen) in HBSS in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml gemischt. Die Chemolumineszenz-Reaktion wurde in mMol Von H&sub2;O&sub2; unter Verwendung einer Standardkurve konvertiert, die mit verschiedenen Konzentrationen von reinem H&sub2;O&sub2; konstruiert worden war.

J. Zubereitung und Reinigung von löslicher Guanylatcyclase (sGC) zur Abschätzung von CO

sGC wurde aus menschlichen Endothelialzellen durch GTP-.Agarose-Chromatographie gereinigt. Cytosole (10 mg Protein) wurden einer GTP-Agarose-Säule (1,8 · 9 cm) hinzugefügt, die mit 25 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert 7,6 vorabgeglichen war, wobei 250 mM Sucrose und 10 mM MnCl&sub2; enthalten waren. sGC wurde dann aus der Säule mit 5 ml Abgleichpuffer plus 10 mM GTP entzogen.

K. Ermittlung von zyklischem GMP

Die Konzentrationen von cGMP wurden durch Radioimmuno-Untersuchung nach einer Acetylierung der Proben mit Essigsäureanhydrid ermittelt (Deliconstantinos, G., und Kopeikina, L., Anticancer Res. 9: 753-760, 1989) ermittelt. Die Reaktionsmischung enthielt Triethanolamin/HCl (50 mM), Creatinphosphat (5 mM), MgCl&sub2; (3 mM), Isobutylmethylxantin (1 mM), Creatinkinase (0,6 Einheiten), GTP (1 mM), lösliche Guanylatcyclase (1 ug Protein) in einem Gesamtvolumen von 150 ul. Die Reaktionen wurden durch das Hinzufügen von GTP eingeleitet und 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Inkubationsmedium wurde angesaugt und cGMP wurde durch das Hinzufügen von eiskalter HOI (0,1 M) extrahiert. Nach 10 Minuten wurden die Proben auf eine neue Platte übertragen, getrocknet und in 5 mM (pH-Wert 4,75) für die cGMP-Ermittelung wiederhergestellt. Das ausgebildete cGMP wurde unter Verwendung eines cGMP-Untersuchungs-Kits (Amersham) ermittelt.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zu schaffen und anzuwenden, bei denen biologische Substanzen verwendet werden, die mit folgenden Verbindungen spezifisch reagieren und diese einfangen:
a) NO und Nox,
b) CO,
c) H&sub2;O&sub2;,
d) freie Radikale,
e) Aldehyd-Chinone,
f) karzinogene Nitroso-Verbindungen, und die
g) die Spurenelemente Kadmium, Kupfer, Mangan, Eisen usw. zurückhalten, die während des Rauchens inhaliert werden.
Die Erfindung beruht im wesentlichen auf der Erkenntnis, dass
a) eine Reihe von geeigneten Radikalfängern existiert, wie z. B. Hämoglobin oder Lysate oder Erythocyten oder irgend eine andere Substanz, die stereospezifisch gebundenes Eisen enthält,
b) eine Reihe von Radikalfängern existiert, die einen Porphyrinring mit Eisen enthalten (beispielsweise Protoporphyrin),
c) eine Reihe von Radikalfängern existiert, die einen Porphyrinring enthalten, der nicht notwendigerweise Eisen enthält,
d) eine Reihe von Radikalfängern existiert, die einen Porpyhrinring enthalten, der mit anderen Metallen, beispielsweise Mg²&spplus;, Cu²&spplus; einen Komplex bildet, und
e) ein biotechnisches Verfahren für die Anreicherung von allgemein herkömmlichen Materialien geschaffen werden kann, die gegenwärtig bei der Herstellung von Zigarettenfiltern verwendet werden und die oben erwähnten biologischen Substanzen bzw. Radikalfänger enthalten.
Die Grundidee der Erfindung besteht in dem Konzept, dass die Imprägnation von allgemein herkömmlichen Zigarettenfiltern und/oder Filtern, die aktivierte Holzkohle enthalten, mit biologischen Substanzen angereichert werden kann, die durch das Vorhandensein von Metallionen Fe²&spplus;, Cu²&spplus;, Mg²&spplus; in Komplexverbindung mit dem Porphyrinring sowie von Fe²&spplus;, das stereospezifisch an Proteinmoleküle gebunden ist, gekennzeichnet ist, wodurch es möglich wird, die schädlichen Verbindungen, die in der Zigarette enthalten sind, zurückzuhalten, bevor der Raucher den Zigarettenrauch inhaliert. Dies ist das Hauptmerkmal der vorliegenden Erfindung und bildet eine zweifelsfreie Neuerung mit weitreichenden industriellen Anwendungsmöglichkeiten.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Tabakrauchfilters gemäß Anspruch 1.
Das Filter wurde nach folgendem Verfahren unter dem Gesichtspunkt seiner Anwendbarkeit auf industrielle Produktionsniveaus zubereitet:
Eine Lösung von 1 mg/ml von Hämoglobin und/oder Lysat von Erythrocyten in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 wurde zubereitet und zu 100 mg aktivierter Holzkohle hinzugefügt. Diese Mischung wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert und durch ein S&S Carl Schleicher & Schuell Co. U.S.A. Filterpapier gefiltert. Die Menge des nicht absorbierten Hämoglobins wurde im Filtrat spektrophotometrisch abgeschätzt. Die mit Hämoglobin angereicherte Holzkohle wurde bei Zimmertemperatur trocknen gelassen. Eine Menge von 200 mg der trocknen, mit Hämoglobin angereicherten Holzkohle wurde zwischen zwei herkömmlichen Filtern sandwichartig eingeschlossen, so dass der gesamte hindurch gezogene Zigarettenrauch mit den aktiven Gruppen der Moleküle (Fe²&spplus;, Fe³&spplus;, -SH, -NH&sub2;) in Berührung kam (Fig. 2). Diese kompatiblen Materialien sind nun bereit, um bei der Herstellung von neuen Zigarettenfiltern verwendet zu werden, die wir von nun an als biologische Filter bezeichnen.
Alternativ kann Hämoglobin durch biologische Substanzen ersetzt werden, die durch das Vorhandensein von Metallionen Fe²&spplus;, Cu²&spplus;, Mg²&spplus; in Komplexverbindung mit dem Porpyhrinring sowie von Fe²&spplus; charakterisiert sind, das stereospezifisch an Proteinmoleküle wie z. B. Transferin, Catalase, Protoporphyrin, Cytochrom C, Chlorophyll gebunden ist.
Alternativ wurde eine Lösung von 5 mg/ml von Hämoglobin und/oder Lysat von Erythrocyten in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH- Wert von 7,4 zubereitet und bei 25ºC unter Verwendung eines Acta-Beckmann-Aufzeichnungs-Spektrophotometers gescannt. Es wurde ständig eine Absorptionsspitze bei 540 nm und 575 nm beobachtet (Smith, R.P., Kruszyma, H.J. Pharmacol Exper. Ther. 191, 557-563, 1974). Allgemein übliche Zigarettenfilter wurden mit diesen Lösungen imprägniert und bei 25ºC-35ºC an Luft getrocknet. Diese kompatiblen Materialien sind dann fertig, um bei der Herstellung der neuen Zigarettenfilter verwendet zu werden, die wir von jetzt an als biologische Filter bezeichnen. Diese neuen biologischen Filter stellen sicher, dass der Rauch, der inhaliert wird, vollständig mit den aktiven Gruppen der Hämoglobinmoleküle und/oder Lysate des Filters in Berührung kommt, ohne dass die physikalischen Eigenschaften oder der Geschmack des Zigarettenrauchs verändert wird. Aus ästhetischen Gründen kann ein kleiner Teil (3 mm) eines herkömmlichen Filters am sichtbaren Ende des biologischen Filters angebracht werden.
Alternative industrielle Herstellungsverfahren umfassen die folgenden:
Eine Lösung von 5 mg/ml von Protoporphyrin in einer Pufferlösung (BPS) mit einem pH- Wert von 7,4 wurde zubereitet und bei 25ºC unter Verwendung eines Acta-Beckmann- Aufzeichnungs-Spektrophotometers gescannt. Die Anregung von Protoporphyrin mit ultraviolettem Licht (498-408) erzeugte eine orangrote Fluoreszenz zwischen 620-630 nm. Die herkömmlichen Filter wurden dann mit der obigen Lösung imprägniert (vollgesaugt) und mit heißer Luft (25ºC-35ºC) getrocknet.
Alternativ wurde eine 5 mg/ml Lösung von Transferin in PBS mit einem pH-Wert von 7,4 unter Verwendung des Acta-Beckmann-Aufzeichnungs-Spektrophotometers gescannt. Das Ferri-Transferin zeigt ein charakteristisches Spektrum von 470 nm. Die obigen Verfahren zum Imprägnieren von zur Zeit verwendeten herkömmlichen Filtern wurde angewendet.
Alternativ wurde eine 5 mg/ml Lösung von Catalyse in PBS mit einem pH-Wert von 7,4 zubereitet. Hierauf folgt das obige Verfahren für die Herstellung des biologischen Filters.
Alternativ wurde eine 5 mg/ml Lösung von Cytochrom C in PBS mit einem pH-Wert von 7,4 zubereitet. Hierauf folgt das obige Verfahren zur Herstellung des biologischen Filters.
Alternativ wurde eine 5 mg/ml Lösung von Chlorophyll in PBS mit einem pH-Wert von 7,4 zubereitet. Hierauf folgt das obige Verfahren zur Herstellung des biologischen Filters.
Alternativ werden die oben erwähnten biologischen Substanzen zwischen zwei herkömmlichen Filtern in fester Form so sandwichartig eingeschlossen, dass der gesamte Zigarettenrauch, der durch das Filter gesaugt wird, mit den aktiven Gruppen der Moleküle (Fe²&spplus;, Fe³&spplus;, -SH, -NH&sub2;) in Berührung kommt.
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Filtern von Tabakrauch nach Anspruch 7.

ANALYSE DER ERGEBNISSE

Wie man der folgenden Tabelle entnehmen kann, wurde gezeigt, dass die verschiedenen biologischen Substanzen, die zur Anreicherung der herkömmlichen Filter verwendet werden, die toxischen Verbindungen (NO, CO, freie Radikale, H&sub2;O&sub2;, Aldehyde und Spurenelemente und Nitroso-Verbindungen) aus dem Zigarettenrauch in unterschiedlichem Ausmaß zurückhalten:
Die stark schädigenden Substanzen des Zigarettenrauchs wurden in starkem Maß zurückgehalten und der durch ein biologisches Filter gefilterte Zigarettenrauch (20 ml) wurde mit einem durch ein herkömmliches Filter gefilterten Zigarettenrauch (20 ml) verglichen. Nur 1 ml Zigarettenrauch, der durch das herkömmliche Filter gezogen worden war, wurde mit 40 ml Zigarettenrauch verglichen, der durch ein biologisches Filter gezogen worden war. Es ergibt sich, dass die biologischen Filter im Vergleich zu herkömmlichen Filtern eine 40-fach bessere Fähigkeit besitzen, die Spurenelemente zurückzuhalten.
In der folgenden detaillierten Experimentalbeschreibung werden repräsentative Ergebnisse dargestellt, um so die Aktivität der biologischen Substanzen besser verständlich zu machen.

a) Identifizierung von in Zigarettenrauch enthaltenem NO unter Verwendung des Chemolumineszenz-Verfahrens:

NO wurde unter Verwendung des luminol-verstärkten Chemolumineszenz-Verfahrens identifiziert, wie dies im experimentalen Abschnitt beschrieben ist. Die Fig. 3 und 4 zeigen ein typisches Experiment der NO-Identifizierung und -Abschätzung sowie das Einfangen seiner Radikale nach dem Hindurchtreten des Zigarettenrauchs durch das biologische Filter. Es zeigt sich, dass durch das Hämoglobin mehr als 90% des NO zurückgehalten werden. Die Wirksamkeit des biologischen Filters beim Zurückhalten und Neutralisieren des NO ist offensichtlich, das bei toxischen Reaktionen sowohl in den Lungenzellen als auch den Lungen-Flüssigkeiten insbesondere dann eine Rolle spielt, wenn es bei der Ausbildung des stark oxidierenden ONOO&supmin; involviert ist.

b) Identifizierung der im Zigarettenrauch enthaltenen freien Radikale unter Verwendung des Chemolumineszenz-Verfahrens:

Die freien Radikale im Zigarettenrauch wurden durch die Chemolumineszenz-Reaktion identifiziert, die durch das System Lucigenin/DAMCO nach seiner Reaktion mit den freien Radikalen verursacht wird. Fig. 5 zeigt eine charakteristische Spitze die innerhalb von 2 Sekunden der Chemolumineszenz-Reaktion auftritt, die zu 100% nach dem Hindurchtreten des Zigarettenrauchs durch ein biologisches Filter gehemmt wurde. Das Zurückhalten der freien Radikale durch die biologischen Filter führt zu einer Verminderung des oxidativen Stresses in den alveolaren Makrophagen, der durch herkömmlichen Zigarettenrauch verursacht wird.

c) Identifizierung des im Zigarettenrauch enthaltenen H&sub2;O&sub2; unter Verwendung des Chemolumineszenz-Verfahrens:

H&sub2;O&sub2; wurde durch die Chemolumineszenz-Reaktion abgeschätzt, die durch das Isoluminol/Microperoxidase-System erzeugt wird. Fig. 6 zeigt die charakteristische Spitze der Chemolumineszenz aufgrund des Vorhandenseins von H&sub2;O&sub2; im Zigarettenrauch. In Anwesenheit von Catalase (100 Einheiten/ml) wurde die Chemolumineszenz-Reaktion zu ungefähr 90% gehemmt. Wenn der Zigarettenrauch durch ein biologisches Filter hindurchgetreten war, wurde eine 80%-ige Hemmung der Chemolumineszenz-Reaktion beobachtet. Das Isoluminol/Microperoxidase-System ist spezifisch für die Identifizierung von H&sub2;O&sub2;. Die im Zigarettenrauch enthaltenen freien Radikale rufen eine geringe Chemolumineszenz-Reaktion nach ihrer Wechselwirkung mit Isoluminol hervor. Diese geringe Chemolumineszenz scheint ungefähr 10% der Gesamt-Chemolumineszenz zu betragen, die von H&sub2;O&sub2; in Anwesenheit von freien Radikalen verursacht wird, da Catalase die maximale Chemolumineszenz-Reaktion bis zu 90% hemmt. Das Zurückhalten des H&sub2;O&sub2; vermindert offensichtlich sowohl den oxidativen Stress als auch die Produktion von NO durch die alveolaren Makrophagen.

d) Identifizierung der im Zigarettenrauch enthaltenen Spurenelemente und Aldehyde unter Verwendung des enzymatischen Systems Luciferin/Luciferase:

Die im Zigarettenrauch enthaltenen Spurenelemente wurden durch ihre Fähigkeit identifiziert, die Luciferase-Aktivität zu stimulieren. Fig. 7 zeigt:
1) Die Chemolumineszenz-Reaktion, die durch die Oxidation von Luciferin in Anwesenheit von ATP verursacht wurde,
2) die verstärkte Chemolumineszenz-Reaktion in Anwesenheit von Cd²&spplus;-Ionen (0,5 mg),
3) die verstärkte Chemolumineszenz-Reaktion in Anwesenheit von Cu2+-Ionen (0,5 mg),
4) die verstärkte Chemolumineszenz-Reaktion, die durch Zigarettenrauch (1 ml) verursacht wurde, und
5) die Hemmung der Chemolumineszenz-Reaktion (bezüglich der Reaktion, die durch den Zigarettenrauch verursacht wurde), die durch 40 ml Zigarettenrauch verursacht wurde, nachdem dieser durch das biologische Zigarettenfilter hindurch geströmt war.
Es ist offensichtlich, dass die Chemolumineszenz-Reaktion, die von in herkömmlichem Zigarettenrauch enthaltenen Spurenelementen verursacht wird, mehr als 40 mal höher ist, als die von Rauch, der durch ein biologisches Filter geströmt ist. Das Zurückhalten von Spurenelementen durch die biologischen Filter kann sowohl Kurzzeit- als auch Langzeiteffekte haben. Kurzzeiteffekte können die Hemmung des Auftretens von Redox-Reaktionen in der Lunge (Fe, Mn) nach sich ziehen und Langzeiteffekte können die Hemmung von Schäden an den Bestandteilen und Substanzen im Blut (Cd) mit sich bringen.
Die im Zigarettenrauch enthaltenen Aldehyde wurden identifiziert und unter Verwendung desselben enzymatischen Systems Luciferin/Luciferase in Abwesenheit von ATP abgeschätzt. Aldehyde sind in der Lage, Oxidation von Luciferin zu bewirken. Fig. 8 zeigt eine charakteristische Chemolumineszenz-Reaktion, die für mehr als eine Stunde anhalten kann. Diese Chemolumineszenz-Reaktion wurde zu 100% gehemmt, wenn der verwendete Zigarettenrauch durch das biologische Filter hindurch geströmt war, was zeigt, dass die Wirksamkeit des biologischen Filters beim Zurückhalten der toxischen Aldehyde beträchtlich ist.

e) Identifizierung der Nitroso-Verbindungen im Zigarettenrauch:

Die Identifizierung der im Zigarettenrauch enthaltenen Nitroso-Verbindungen wurde durch Abschätzung der langsamen Freisetzung von NO aus den Nitroso-Verbindungen nach ihrer Behandlung mit H&sub2;O&sub2; erzielt. Wie in Fig. 9 gezeigt, wurde bei ungefähr 900 Sekunden eine Spitze der Chemolumineszenz-Reaktion erhalten. Das Hindurchströmen des Zigarettenrauchs durch ein biologisches Filter zeigte eine 90%-ige Hemmung der beobachteten Chemolumineszenz-Reaktion und ihr Scheitel trat bei ungefähr 1200 Sekunden auf. Die langsame Freisetzung von NO durch Natriumnitroprussid (SNP) nach der Behandlung mit H&sub2;O&sub2; ist ebenfalls dargestellt. Fig. 10 zeigt die langsame Freisetzung von NO aus den beiden Nitroso-Verbindungen Diethylnitrosamin und Dimethylnitrosamin sowie aus Hämoglobin, das mit Nitroso-Verbindungen aus Zigarettenrauch angereichert ist, das mit H&sub2;O&sub2; behandelt wird. Es ist klar, dass die NO-Freisetzung durch die Nitroso-Verbindungen des Zigarettenrauchs, die mit Hämoglobin Addukte gebildet haben, dem gleichen Muster der NO-Freisetzung wie bei den Nitroso-Verbindungen Diethylnitrosamin und Dimethylnitrosamin folgt. Fig. 11 zeigt die Freisetzung von NO durch die Nitroso-Verbindungen des Zigarettenrauchs, die Addukte mit Hämoglobin gebildet haben, nachdem die Hämoglobin-Nitroso-Verbindungs-Addukte mit UVB (100 mJ/cm²) eine Minute lang bestrahlt worden waren. Die NO-Freisetzung wurde in Anwesenheit von H&sub2;O&sub2; abgeschätzt und gab bei einer Sekunde eine Chemolumineszenz-Reaktion. Der graduelle Anstieg, der in Fig. 11 beobachtet wird, beruht auf der Wirkung von H&sub2;O&sub2; auf Hämoglobin (Fenton-Reaktion).

f) Produktion von NO durch Lungen-Makrophagen:

Es wurden In-vitro-Experimente mit Hilfe einer speziellen Kammer durchgeführt, die in unserem Labor entwickelt wurde und die in Fig. 1 dargestellt ist. Die Teflon-Membran, die die beiden Abteilungen der Kammer voneinander trennt, ist für das Gas NO durchlässig und für NO&sub2;- und ONOO- undurchlässig. Nicht gereizte Lungen-Makrophagen, die in der im experimentellen Abschnitt beschriebenen Weise isoliert worden waren, wurden in einer HBSS-Pufferlösung (1 · 10&sup6; Zellen/ml) suspendiert und in das A-Abteil der Kammer eingebracht. In das Abteil B der Kammer werden 2,5 ml Griess-Reagenz oder Sulfanilamid/Scopoletin-Reagenz eingebracht. Das NO, das von den Makrophagen im Abteil A freigesetzt wird, diffundiert durch die Teflon-Membran in das Abteil B und bindet sich an das Griess- und/oder Sulfamid/Scopoletin-Reagenz, an dem es gefangen bleibt. Dies zeigt an, dass die Lungen-Makrophagen NO-Gas erzeugen. Die jetzt im Abteil B vorhandene NO-Menge wurde dann spektrophotometrisch oder fluorophotometrisch ermittelt. Die im Abteil A der Kammer enthaltenen Mengen von ONOO- und NO&sub2;- wurden ebenfalls unter Verwendung des Griess- und/oder Sulfanilamid/Scopoletin-Reagenz ermittelt. Die obigen Experimente wurden nach einer Reizung bzw. Belastung der Makrophagen mit Zigarettenrauch wiederholt, bevor sie in das Abteil A eingebracht wurden. Die Ergebnisse, wie sie in Fig. 12 dargestellt sind, zeigen, dass der Zigarettenrauch die erzeugte NO-Menge vermindert, während er die Produktion von ONOO- in Lungen-Makrophagen erhöht, was indirekt die enorme Erzeugung sowohl von NO als NO&sub2;- anzeigt, die miteinander wechselwirken, um ONOO- zu bilden.
Eine Wiederholung der obigen Experimente unter Verwendung von biologischen Filtern (d. h. mit Zigarettenrauch, der durch ein biologisches Filter gesaugt worden war) zeigte, dass die verwendeten biologischen Substanzen die selben Mengen von NO&sub2;- und ONOO- im Abteil A und ähnliche Mengen von NO im Abteil B erzeugen, als dies Makrophagen tun würden, die nicht durch Zigarettenrauch belastet worden sind. In diesem Zusammenhang wurden die Komponenten der Griess-Reaktion auch verwendet, um die Kinetik der Nitrosation durch ein oder mehrere Zwischenprodukte zu überprüfen, die während der NO/O&sub2;-Reaktion in einer wässrigen Lösung bei physiologischem pH-Wert erzeugt werden. Das Hinzufügen von Zigarettenrauch (50 ml) zu einer 100 mM Phosphat-Lösung mit einem pH-Wert von 7,4, die 25 mM Sulfanilamin und 2,5 mM N-(1- naphtyl-ethylendiamin-dihydrochlorid (NEDD) enthielt, erzeugte eine Absorption bei λmax = 496 mm, was für das charakteristische Azo-Produkt kennzeichnend ist, das sich aus der Nitration ergibt. Es lohnt sich, die Implikationen der vorliegenden Beobachtungen gegenüber den erwarteten Reaktivitäten von NO unter physiologisch relevanten Bedingungen zu betrachten, wobei geschätzt wird, dass die maximalen Konzentrationen von NO in der zellulären Mikroumgebung im Bereich von 0,5 bis 10 um liegen. Die NO-Konzentrationen werden während des Zigarettenrauchens dramatisch erhöht, was nachteilige Wirkungen auf die Lungenzellen hat.

g) Oxidativer Stress von Lungen-Makrophagen:

Die Ergebnisse der Wirkungen von Zigarettenrauch auf den oxidativen Stress von Lungen-Makrophagen sind in Fig. 13 dargestellt. Abschätzungen des oxidativen Stresses unter Verwendung von t-BHP zeigten, dass Zigarettenrauch im Vergleich zu nicht belasteten Makrophagen den doppelten oxidativen Stress erzeugt. Wenn der Zigarettenrauch durch ein biologisches Filter geleitet wurde, war der beobachtete oxidative Stress ähnlich demjenigen von nicht belasteten Lungen-Makrophagen. Die Beseitigung des oxidativen Stresses der durch Zigarettenrauch auf Makrophagen ausgeübt wird, wird somit klar nachgewiesen. Der Zigarettenrauch ist jetzt frei von Substanzen, die einen oxidativen Stress auf Lungen-Makrophagen ausüben.

h) Von Lungen-Makrophagen erzeugtes H&sub2;O&sub2;:

H&sub2;O&sub2;, das von Makrophagen erzeugt wird, die durch Zigarettenrauch belastet sind, zeigt mehr als das zehnfache der Produktionsrate im Vergleich zu Makrophagen, die nicht belastet sind. Die Verwendung eines biologischen Filters zeigt eine Abnahme der H&sub2;O&sub2;- Produktion um 90% (Fig. 14) im Vergleich zu herkömmlichen Filtern. Es ist offensichtlich, dass Zigarettenrauch dadurch, dass er auf die Makrophagen oxidativen Stress ausübt, die Erzeugung von giftigem H&sub2;O&sub2; durch diese Zellen erhöht.

i) Wiederherstellungsexperimente:

Es wurde die Menge von zyklischem GMP, das durch das von alveolaren Makrophagen freigesetzte NO erzeugt wurde, unter Verwendung der in Fig. 1 gezeigten Kammer ermittelt, indem lösliche Guanylatcyclase in das Abteil A und alveolare Makrophagen in das Abteil B eingebracht wurden. Die Mengen des durch die Makrophagen erzeugten NO wurden über einen Zeitraum von 50 Minuten mit und ohne durch Zigarettenrauch belasteten Zellen ermittelt. Durch Zigarettenrauch (10 ml) belastete Makrophagen gaben ungefähr 10 mal weniger NO im Vergleich zu unbehandelten Zellen ab und zeigten somit eine 10-fach kleinere Produktion von zyklischem GMP. Das obige Verfahren wurde unter Verwendung von Zigarettenrauch wiederholt, der durch ein biologisches Filter geleitet worden war. Es zeigte sich eine statistisch nicht signifikante Differenz bezüglich der nicht belasteten Makrophagen (Vergleich) (Fig. 15). Die Akkumulation von NO im Abteil B war mehr als 5-fach erhöht, wenn die alveolaren Makrophagen mit H&sub2;O&sub2; (5 mM) behandelt wurden (Fig. 16). Dies weist darauf hin, dass H&sub2;O&sub2; die Produktion von NO durch einen positiven Rückkopplungsmechanismus erhöht. Der L-Arginin/NO-Weg in Makrophagen ist konsistent mit dem Konzept, dass Zigarettenrauch die Freisetzung von NO/ONOO- bewirkt.

k) Identifizierung von Kohlenmonoxid (CO) in Zigarettenrauch:

Das Vorhandensein von CO im Zigarettenrauch wurde unter Verwendung des biologischen Verfahrens ermittelt, das auf der Stimulation von löslicher Guanylatcyclase durch CO basiert.
Das Einbringen von HBSS, das mit Zigarettenrauch gesättigt war, in das Abteil A der Kammer in Anwesenheit von Superoxid, um NO zu neutralisieren, und das Einbringen von löslicher Guanylatcyclase in das Abteil B führte zu einer Erhöhung der zyklischen GMP-Produktion aufgrund von CO, das aus dem Abteil A in das Abteil B diffundierte. Das Hindurchleiten von Zigarettenrauch durch ein biologisches Filter vermindert die Menge des erzeugten zyklischen GMP um ungefähr 80% (Fig. 17). Die obigen Daten zeigen an, dass die im Zigarettenrauch enthaltenen schädlichen Substanzen NOx und CO durch die biologischen Filter zurückgehalten und neutralisiert werden.

IN VIVO-EXPERIMENTE

a) Wir bestätigten zunächst das Vorhandensein von NO und ONOO- im ausgeatmeten Zigarettenrauch. Bei menschlichen Freiwilligen, die eine Zigarette mit einem herkömmlichen Filter rauchten, wurde das im ausgeatmeten Zigarettenrauch enthaltene NO nach der Einführung des ausgeatmeten Rauchs in eine Säurelösung (50 ml) mit einem pH- Wert 4 identifiziert. Die NO-Konzentration wurde mit Hilfe des im experimentellen Abschnitt beschriebenen durch Luminol verstärkten Chemolumineszenz-Verfahrens unter Verwendung von Standardkurven abgeschätzt, die mit handelsüblichem NO erzeugt worden waren. Es zeigte sich, dass die NO-Konzentration 0,045 mM betrug. Die Experimente wurden unter Verwendung von biologischen Filtern wiederholt und die NO-Konzentration im eingeatmeten Rauch war ungefähr 70% niedriger im Vergleich zu herkömmlichen Filtern (Fig. 18). Die Konzentration von ONOO- wurde unter Verwendung einer Lösung von NaOH 1,2 M ermittelt, die eine Erhöhung in der Absorption bei 303 nm zeigte (Fig. 19) (&epsi;303nm = 1670 M&supmin;¹ cm&supmin;¹). Unsere Experimente zeigten, dass während des Rauchens der ausgeatmete Rauch große Mengen von ONOO- enthält (Einleiten von 50 ml ausgeatmetem Rauch in 5 ml NaOH 1,2 M liefert eine Lösung von 0,9 mM ONOO-). Es wurde ermittelt, dass das Verhältnis von NO/ONOO- im ausgeatmeten Rauch 1 : 20 betrug.
Es scheint daher so zu sein, dass NOx in der Lunge in ONOO- transformiert wird, wenn es mit Superoxid in der Lunge reagiert. Superoxid wird sowohl von Makrophagen als auch Redox-Reaktionen freigesetzt, die in der Lunge während des Rauchens auftreten. Mit einer Pumpe angesaugter Zigarettenrauch enthält kein ONOO-, doch reagiert eine Menge des NOx mit Superoxid oder Sauerstoff und bildet Nitritionen (NO&sub2;-). ONOO- wird nur dann gebildet, wenn Zigarettenrauch in die Lungen eintritt. Die Verwendung von biologischen Filtern vermindert die ausgeatmeten Mengen von NO und ONOO- um 70%.
b) ONOO- reagiert mit Bicarbonationen der menschlichen Erythrozyten gemäß der Gleichung
ONOO- + HCO&sub3;- → HCO&sub3; + NO&sub2; + OH&supmin;
Das Bicarbonat-Radikal oxidiert Luminol ebenso wie aromatische und heterozyklische Moleküle. Alternativ kann ONOO- Bicarbonat zu Peroxibicarbonat peroxidieren, bei dem es sich um eine weitere stark oxidierende Substanz handelt. Andererseits katalysiert Superoxiddismutase (SOD) die Nitration durch ONOO- und einen weiten Bereich von phenolhaltigen Substanzen einschließlich Tyrosin in Proteinen.
Somit gibt es mehrere mögliche Mechanismen, durch die Bicarbonat und SOD die Gesamtreaktivität von ONOO- in den Zellen beeinflussen können. Das Vorhandensein von in den Lungen durch eingeatmeten Zigarettenrauch erzeugtem ONOO- zeigt eine dramatische Erhöhung im oxidativen Stress in Erythrocyten, der durch eine Chemolumineszenz-Reaktion entdeckt wurde, die innerhalb von 5 Sekunden auftrat. Das gleiche Experiment, das unter Verwendung eines biologischen Filters durchgeführt wurde, führte zu einer nahezu 100%-igen Hemmung des oxidativen Stresses in menschlichen Erythrocyten (Fig. 20). Hämoglobin oder Erythrocytlysate, die ONOO- ausgesetzt wurden (, das im ausgeatmeten Zigarettenrauch enthalten war) bewirkten das Verschwinden der beiden Spitzen bei 540 und 575 nm, die normalerweise in Hämoglobin beobachtet werden. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experimentes, das ähnlich dem oben beschriebenen mit 12 Freiwilligen durchgeführt wurde, sind in Fig. 21 dargestellt. Wenn Hämoglobin und/oder Lysat einer kleinen Menge von ausgeatmetem Rauch (10 ml) ausgesetzt wurden, wurde eine Verschiebung der Scheitel von 540 und 575 auf 525 und 555 nm beobachtet, was mit der Ausbildung von Nitrosylhämoglobin konsistent ist. Die Experimente wurden unter Verwendung von biologischen Filtern wiederholt. Die beobachteten Scheitel behielten ihre charakteristischen Wellenlängen bei.
d) Aldehyde wurden in dem von menschlichen Freiwilligen ausgeatmeten Zigarettenrauch durch ihren charakteristischen Chemolumineszenz-Scheitel identifiziert. Die Experimente wurden unter Verwendung von biologischen Filtern wiederholt und es wurde eine 90%-ige Verminderung der Chemolumineszenz-Reaktion im Vergleich zu einer maximalen Chemolumineszenz-Reaktion beobachtet, die auftrat, wenn ein herkömmliches Filter verwendet wurde (Fig. 22). Es ist offensichtlich, dass die biologischen Filter die Aldehyde im Zigarettenrauch zurückhalten und neutralisieren, während sie die Oxidantien zurückhalten und somit offensichtlich die Auslösung der Redox-Reaktionen in der Lunge daran hindern, stattzufinden, die zu der Erzeugung von endogenen Aldehyden führen würden.
e) Es wurden freie Radikale in dem von menschlichen Freiwilligen ausgeatmetem Zigarettenrauch durch ihren charakteristischen Chemolumineszenz-Scheitel identifiziert. Die menschlichen Freiwilligen verwendeten Zigaretten mit herkömmlichen und mit biologischen Filtern. Sie wurden angewiesen, den Zigarettenrauch (50 ml) in eine Säurelösung (0,01 N HCl) (50 ml) pH-Wert 6 auszuatmen und die Chemolumineszenz-Reaktion wurde nach 5 Minuten und nach 60 Minuten erfasst. Bei einem pH-Wert 6 wird das ausgeatmete ONOO- spontan zersetzt. Innerhalb von 5 Minuten erfolgte eine 160%-ige Erhöhung der Chemolumineszenz-Reaktion in dem durch ein herkömmliches Filter geleiteten, ausgeatmeten Rauch im Vergleich zu Zigarettenrauch, der durch ein biologisches Filter geströmt war (Fig. 23). Wenn man die durch den ausgeatmeten Rauch gesättigte Säurelösung eine Stunde stehen ließ, erhöhte sich der Unterschied in der Chemolumineszenz-Reaktion von 160% auf 250% (Fig. 24). Dies entspricht dem Konzept, das Redox-Reaktionen im Zigarettenrauch kontinuierlich durch die Chinon-Radikale stattfinden und eine Reihe von aktivierten Sauerstoffarten erzeugen, die einen biologischen Schaden verursachen können.

KOMMENTAR

Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass alveolare Makrophagen wie andere Zellen eine endogene NO-Synthase besitzen und in der Lage sind, über lange, auf eine Zigarettenrauch-Exposition folgende Zeiträume NO/ONOO- abzugeben. Darüber hinaus wird, sobald die Abgabe von NO durch diese Zellen begonnen hat, die Produktion von NO selbst dann selbsttragend, wenn der Reiz beseitigt worden ist. Eine solche Reaktion beruht auf der Fähigkeit des aus dem Zigarettenrauch abgeleiteten NO die alveolaren Makrophagen zur Freisetzung von NO und ONOO- über einen Zeitraum von mehreren Stunden nach Entfernung des Stimulus zu stimulieren. Eine solche Reaktion kann durch die Produktion von H&sub2;O&sub2; in den Lungen bei einer Stimulation der alveolaren Makrophagen durch Zigarettenrauch eingeleitet werden. H&sub2;O&sub2; kann die NO-Synthase-Aktivität in den Lungenzellen stimulieren, um NO und ONOO- über einen Zeitraum von mehr als einer Stunde nach Wegnahme des Stimulus zu erzeugen. Unsere Experimente zeigen tatsächlich, dass das Hindurchströmen von Zigarettenrauch durch ein biologisches Filter zu einer 90%-igen Verminderung (im Vergleich zu einem herkömmlichen Filter) des oxidativen Stresses in den alveolaren Makrophagen von Ratten führte. Ein ONOO-Radikal, das in den Lungen gebildet wird, kann möglicherweise den a1-Proteinase-Inhibitor (a1PI) angreifen und deaktivieren. Die Hemmung des a1PI in menschlichen Lungen bewirkt häufig Emphyseme, durch welche die Lungenkapazität vermindert wird. Eine statistische Evidenz zeigt, dass Rauchen eine Prädisposition für die Entwicklung von Emphysemen schafft (Southon, P.A., Pwis, G., Free Radicals in Medicine. Involvement in human Disease. Mayo Clin. Proc. 63: 390-408, 1988). An 12 freiwilligen Rauchern durchgeführte In-vivo-Experimente zeigten eine 90%-ige Verminderung des ausgeatmeten NO/ONOO- wenn der eingeatmete Zigarettenrauch durch ein biologisches Filter geströmt war.
Freie Sauerstoff-Radikale spielen auch bei der Pathogenese der durch den IgA-Imun- Komplex induzierten Alveolitis eine Rolle. Eine Vorbehandlung von Tieren mit Superoxiddismutase, Catalase, dem Eisen-Chelator-Desferioxamin oder dem Hydroxyl-Radikal- Radikalfänger DMSO unterdrückt die Ausbildung von Lungenschäden. Im Gegensatz hierzu sind die Lungen von nicht behandelten positiven Kontrolltieren durch das Vorhandensein einer erhöhten Anzahl von alveolaren Makrophagen gekennzeichnet. Interstitiale Edeme und Hämorrhage sind ebenfalls vorhanden. Weiterhin ist bei diesem Modell der Lungenschädigung das L-Arginin sehr stark schützend, wie dies durch die Verminderungen folgender Effekte gezeigt wird: Vaskularpermeabilität, Vaskularhämorrhage, und Schäden an vaskulären Endothelial- und alveolaren Epithelial-Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Makrophagen die Quelle der Schäden sind, die NO, O2-, H&sub2;O&sub2; und OH-Verbindungen bewirken (Mullingan, M.S., Jonhson, K.J., Ward, P.A., in: "Biological Oxidants: Generation and Injurious Consequences"; Herausgeber: Cochrane, C.G., und Gilbrone, M.A., Jr. Academic Press 157-172, 1992).
Das Zurückhalten und die Neutralisierung der im Zigarettenrauch enthaltenen Oxidantien durch die biologischen Filter kann eine signifikante Rolle bei der Verminderung der Aktivität der Redox-Enzyme spielen, die direkt mit dem oxidativen Stress in den Lungenzellen in Zusammenhang stehen. Biologische Filter vermindern den durch den eingeatmeten Zigarettenrauch ausgeübten oxidativen Stress drastisch. Der oxidative Stress in den Lungen-Makrophagen und Endothelial-Zellen der Lungengefäße kann durch NO, NOx, Sauerstoff-Radikale und/oder Aldehyde induziert werden, die im Zigarettenrauch enthalten sind. Darüber hinaus kann das Zurückhalten der Aldehyde und Spurenelemente (insbesondere von Cd) durch die biologischen Filter beträchtliche Langzeiteffekte bei der Schonung der Plasma-Antioxidantien und beim Hemmen der Entwicklung von Artherosclerose haben. Hämoglobin enthält mehrere neutrophile Zentren, die mit Elektrophilen kovalenten Reaktionen unterliegen. Diese Zentren induzieren die N-Terminal-Valin-Residuen der α- und β-Kette, die N1- und N3-Atome der Histidin- Residuen und die Sulphydryl-Gruppe der Cystein-Residuen. Die in Tabak vorhandene karzinogene Nitroso-Verbindung 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK) wird beim Brennen der Zigarette in den Rauch übertragen und ihre Pegel im üblichen Rauch können von 4 bis 1700 ng pro Zigarette variieren. NNK kann mit Hämoglobin Addukte bilden (Hecht, S.S., Karan, S., und Carmella, S.G., in: "Human carcinogen expose"; Herausgeber: Garmer, R.C., Farmer, P.B., Steel, G.I., und Wricht, A.S., IRL Press Seiten 267-274, 1991). Es ist klar, dass der einzige Weg zur Vermeidung von tabakbezogenen Krankheiten darin besteht, auf das Kauen und Rauchen von Tabak zu verzichten. Die Statistiken von gegenwärtigen Rauchern zeigen jedoch, dass ein starker Bedarf dafür besteht, die Tabak-Karzinogen-Exposition zu vermindern und ihre Wirkungsweise zu modifizieren. Die Hauptmöglichkeiten zu diesem Ziel zu gelangen sind:
1) Abwandlung der Tabakprodukte,
2) Hemmung der metabolischen Aktivierung von Tabak-Karzinogenen und ihrer endogenen Bildung durch gewisse Mikro- und Makro-Nährstoffe und Chemopreventing- Mittel und
3) Zurückhalten der Tabak-Karzinogene unter Verwendung von speziellen Filtern, die an den Tabak in den Zigaretten angepasst sind.
Unsere Erfindung, biologische Substanzen für die Herstellung von biologischen Filtern zu verwenden, betrifft schließlich die Entdeckung, dass die im eingeatmeten Zigarettenrauch vorhandenen Nitroso-Verbindungen durch die biologischen Substanzen zurückgehalten werden und dadurch nicht nur die Gesundheit der Raucher sondern auch der Nichtraucher schützen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Tabakrauchfilters, der eine Fasermatrix umfaßt, welche mit einer biologischen Substanz angereichert ist, die aus einer oder mehreren biologischen Substanzen ausgewählt ist, die Eisen, Kupfer, und/oder Magnesium in einer Komplexverbindung mit einem Porphyrin-Ring und Eisen, das stereospezifisch in Proteinmolekülen gebunden ist, umfassen, wobei das Verfahren den Schritt umfaßt, daß ein Filtermaterial mit einer oder mehreren der genannten biologischen Substanzen imprägniert und das sich ergebende Material gefiltert wird, um jegliche nicht absorbierte biologische Substanz zu entfernen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter aktivierte Holzkohle umfaßt, die mit der biologischen Substanz angereichert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Substanz Hämoglobin und/oder Erythrozyten-Lysate umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die biologischen Substanzen aus der Gruppe ausgewählt sind, bei der Eisen Fe²&spplus;-Ionen stereospezifisch an eine oder mehrere der folgenden Substanzen gebunden sind: Transferrin, Katalase, Protoporphyrin, Cytochrom C und Chlorophyll.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Substanz als eine 1 mg/ml-10 mg/ml Lösung in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung mit einem PH-Wert 7,4 vorgesehen ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das angereicherte Filtermaterial in eine Tabakrauch-Filteranordnung aufgenommen ist, in welcher es von einer Fasermatrix flankiert wird, die nicht mit der biologischen Substanz angereichert ist.

7. Verfahren zum Filtern von Tabakrauch, bei dem ein Filter verwendet wird, der nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhalten wurde, und durch den Tabakrauch geleitet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter 15% bis 90% NO, 10% bis 90% CO, 40% bis 90% freie Radikale, 10% bis 90% Aldehyde, 10% bis 90% carcinogene Stickstoffverbindungen, 15% bis 90% H&sub2;O&sub2; und 50% bis 95% Spurenelemente zurückhält, die im Tabakrauch enthalten sind, bevor er durch den Filter hindurchtritt.