RO117412B1

RO117412B1 - Procedeu de realizare a unui filtru pentru fumul de tutun

Info

Publication number: RO117412B1
Application number: RO96-00405A
Authority: RO
Inventors: Ioannis Stavridis; George Deliconstantinos
Original assignee: Ioannis Stavridis; George Deliconstantinos
Priority date: 1994-06-27
Filing date: 1994-06-27
Publication date: 2002-03-29
Also published as: US5909736A; NO984748D0; CA2170610A1; PL174430B1; LV11520A; CA2170610C; DE69429726D1; NO984748L; MD1912C2; LV11520B; NZ267484A; AU693099B2; JPH09504439A; NO960778L; PT720434E; EP0720434A1; ATE212196T1; MD1912B2; FI960904A; ES2171452T3

Abstract

Inventia se refera la un filtru pentru fumul de tutun, care are o matrice de fibra imbogatita cu o substanta biologica, alesa dintre una sau mai multe substante biologice care contin fier, cupru si/sau magneziu complexat cu un ciclu porfirinic si fier legat stereospecific in molecule de proteina, care cuprinde impregnarea, in mod cunoscut, a unui material de filtru, cu una sau mai multe din respectivele substante biologice, filtrarea materialului rezultat pentru a indeparta orice substanta biologica neabsorbita si lasarea materialului astfel filtrat sa se usuce. Filtrele pentru fumul de tutun, destinate fabricarii tigaretelor si realizate prin procedeul conform inventiei, permit reducerea substantelor nocive, continute in fumul de tutun, intr-un procent mai mare decat filtrele obtinute printr-un procedeu conventional, fara etapa de filtrare.

Description

Invenția se referă la un procedeu de realizare a unui filtru de țigaretă, pentru reținerea compușilor nocivi, respectiv, oxizi de azot, radicali liberi, apă oxigenată, monoxid de carbon, urme de elemente și nitrozocompuși carcinogeni volatili, de a fi inhalați în timpul fumatului țigaretei, substanțe care până în prezent sunt insuficient reținute prin folosirea filtrelor convenționale pentru țigarete.

O serie de publicații în jurnale internaționale sugerează că fumul de țigară este separat în două faze: a) o fază solidă (gurdon) și b) o fază gazoasă. Această separare are loc folosind un filtru tipic Cambridge, din fibră de sticlă, care reține 99,9% din particulele care au o mărime mai mare decât 0,1 pm. Gurdonul țigaretei conține concentrații foarte înalte de radicali liberi foarte stabili, care pot fi clasificați în cel puțin 4 categorii diferite. Semichinonele în echilibru cu chinonă și hidrochinonă sunt considerate a fi radicalii liberi cu proprietățile chimice cele mai interesante. Sistemul chinonă reduce oxigenul molecular la forma superoxid (0‘² ₂), care apoi, prin dismutație spontană, formează apa oxigenată (H₂O₂). în faza gazoasă există mai mult de 10¹⁵ radicali organici per pufăit, cu timp de înjumătățire mai mic de 1 s, și care sunt inhalați. Totuși, este paradoxal că în ciuda timpului lor scurt de înjumătățire, acești radicali pot păstra niveluri ridicate ale activității pentru mai mult de 10 min, în faza gazoasă. De fapt, concentrația acestor radicali este considerabil crescută pe măsură ce țigareta se apropie de capătul cu filtru. O explicație pentru acest paradox s-ar găsi în menținerea unei situații de stare stabilă, datorată continuării producerii de radicali liberi (Pryer, W. A., Stone, K„ Ann. N. Y. Acad. Sci. 686: 12-28, 1993).

Oxidul de azot (NO) este cel mai important radical din faza gazoasă a fumului de țigaretă, care, în timpul fumatului, participă într-o succesiune de reacții prin care se formează dioxid de azot, radicali izopren, radicali peroxil și radicali alcoxil. Fumul de țigară conține, de asemenea, un număr considerabil de aldehide care contribuie la efectele sale toxice dăunătoare. S-a demonstrat că mici cantități de aldehide extrase din fumul de țigaretă produc atât catabolismul proteinei, cât și oxidarea grupărilor tiol ale proteinelor plasmatice. Aceste proprietăți atribuite aldehidelor sunt urmarea reacțiilor dintre gruparea carbonil a aldehidelor și grupările -SH și -NH₂ ale proteinelor plasmatice. De exemplu, acroleina din fumul de țigară reacționează repede cu grupările -SH pentru a forma compuși carbonil (Alving, K., Forhem, C. și Lundberg J.M., Br. J. Pharmacol 110: 739-746, 1993). în gudronul fumului de țigară există urme de elemente ca, de exemplu, fier, cupru, mangan și cadmiu, care sunt implicate în numeroase reacții producătoare de radicali liberi și duc la formarea de radicali secundari foarte activi (de exemplu, radicali peroxi, superoxid, aldehide citotoxice etc.). Introducerea urmelor de elemente în plămân, în timpul fumării țigaretei, duce la o serie de reacții redox atât în fluidele pulmonare, cât și în macrofagele alveolare, care au ca urmare formarea de radicali hidroxil (OH-) foarte activi. Acești radicali hidroxil sunt formați în principal în prezența fierului, pe calea reacției Fenton. De asemenea, cuprul poate forma radicali hidroxil în plămân, prin reacționarea cu apa oxigenată. Manganul, în concentrații scăzute (10'⁷M), stimulează guanilat-ciclaza solubilă a celulelor endoteliale ale plămânului, cauzând producerea oxidului de azot și superoxidului, printr-un mecanism de feedback pozitiv (Youn, Y. K., Lalonde C. și Demling R., Free Rad. Biol. Med. 12: 409-415, 1992).

Monoxidul de carbon se produce în timpul arderii tutunului. O cantitate de CO este reținută în plămân chiar după exhalare, rezultând stimularea guanilat-ciclazei solubile după interacțiunea sa cu jumătatea hem a enzimelor celulelor endoteliale și a altor celule ale țesutului pulmonar. Creșterea nivelurilor de GMP ciclic din celule, cuplată cu un mecanism de feedback pozitiv, crește producerea oxidului de azot și superoxidului (Watson A., Joyce H., Hopper L. și Fride N. B., Thorax 48: 119-124, 1993). Oxidul de azot gazos, care poate fi produs de numeroase tipuri de celule, incluzând celulele endoteliale vasculare și celulele endoteliale reticulare, produce relaxarea musculaturii netede (Lowenstein C.J., Dinerman J. L„ SnyderS. H„ Ann. Intern. Med. 120: 227-237, 1994).

RO 117412 Β1

De asemenea, există surse exogene de NO care sunt considerate responsabile în mod similar de producerea alterării vaselor de sânge și a altor țesuturi. Este bine stabilit că aminele secundare și terțiare pot reacționa cu nitrit și alți agenți de nitronizare, pentru a forma N-nitrozoamine (Lowenstein C.J., Dineman J.L., SnyderS.H., Ann. Intern. Med. 120: 227-237, 1994). încă din 1974, un număr de studii au demonstrat că în timpul recoltării, 55 prelucrării și fumării tutunului, alcaloizii sunt nitrozați la N-nitrozoamine specifice tutunului (TSNA). TSNA identificate în tutun și/sau fumul său, N-nitrozonornicotina (NNN), 4(metilnitrozoamino) -1 -(3-piridil) -1- butanona (NNK) și 4-(metilnitrozoamino) -1- (3-piridil) -1butanol (NNAL) sunt carcinogeni puternici pentru animale. NNN induce tumori ale plămânului la șoareci, tumori ale traheei la hamsteri și tumori ale cavității nazale și ale esofagului la 60 șobolani. NNK induce tumori ale plămânului la șoareci, hamsteri și șobolani, și de asemenea, tumori ale ficatului, cavității nazale și pancreasului, la șobolani. Tamponarea orală cu un amestec de NNN și NNK provoacă tumori în cavitatea orală și în plămânul șobolanilor.

Cantitatea tipică a ambelor NNK și NNN în emanația principală a țigaretei este 200 ng/țigaretă. (Hecht S.S., Spratt, T.E. și Trushin N. Carcinogenesis, 9: 161-165, 1988). 65

Cercetarea privind efectul fumului de țigară asupra țesutului pulmonar a arătat că NO reacționează cu superoxid pentru a forma radicalul peroxinitrit puternic oxidant (ONOO-), care produce reacții secundare dăunătoare în biomoleculele cheie. Ambele efecte metabolic și dăunătoare ale NO în celule s-au studiat in laborator în experimente in vitro și in vivo.

NO se oxidează în prezența oxigenului la dioxid de azot (NO₂). Rata acestei oxidări 70 depinde de concentrația oxigenului și pătratul concentrației NO. Dioxidul de azot este evident ciclotoxic și este transformat în nitrit și nitrat, când este în soluție apoasă. Mai mult, NO formează complexe cu urmele de elemente și/sau cu metaloproteine cum ar fi hemoglobina (Wink. D. A., Darbyshire, J. F. Nims, Saavddra, J.E. și Ford, P. E., Chem. Res. Toxicol. 6:

23-27, 1993). 75

NO care reacționează cu superoxidul pentru a forma compusul nociv ONOO- poate justifica anumite tipuri ale toxicității superoxidului. ONOO- este neobișnuit de stabil luând în considerare potențialul său oxidativ puternic (+ 1,4 V). în timpul descompunerii sale el formează derivați puternic oxidativi, inclusiv radicalul hidroxil, dioxidul de azot și ionul nitroniu. Ca urmare, orice modificare în producerea NO și superoxidului de către țesuturi 80 poate duce la formarea de radicali secundari puternic oxidativi (Deliconstantinos, G., Villioutou, V., Stavrides, J.C., Camcel Mol. B ol. 1:77-86,1994). în final, ONOO- și esterii săi (RO-ONO sau RO-ONO₂) tind să producă in activarea inhibitorului a/fa-1-proteinazei (a1p1). Aceasta de se poate justifica astfel:

a) apa oxigenată singură nu produce nactivarea rapidă a a1 p1, dar acționează numai 85 în prezență de NO, după care se formează ONOO- și are loc inactivarea rapidă a lui a1p1;

b) soluțiile de tert-butil peroxinitrit (RO-O-O-NO₂) sau ONOO-produc inactivarea prin ele însele a lui a1p1, și

c) aminele și aminoacizii protejează a1p1 proteinaza de inactivarea rapidă (Moreno

J.J. și Pryor, W.A., Chem. Res. Toxicol. 5: 425-431, 1992). 90

Separat de radicalii liberi conținuți în fumul de țigară, macrofagele alveolare activate reprezintă altă sursă importantă de producție de radicali liberi de către fumători. Macrofagele alveolare activate prin fumul de țigară suferă o explozie a respirației, rezultând producerea crescută de radicali de oxigen liber (în principal 0‘₂, NO și H₂O₂). Fumătorii par a avea un număr crescut atât de macrofage alveolare, cât și de neutrofile circulatorii. Radicalii liberi de 95 oxigen ai fumului de țigară au fost implicați, de asemenea, în dezvoltarea cancerului pulmonar. Fumul de țigară inhalat produce stress oxidativ crescut în celulele pulmonare, rezultând reducerea în concentrație a antioxidanților intracelulari. H₂O₂ reacționează, prin producerea de radicali hidroxil cu ADN-ul celulelor și produce o întrerupere în catena dublă.

RO 117412 Β1

Deși această întrerupere poate fi evitată, prin adăugarea catalazei, aceasta conformă indirect efectele dăunătoare ale H₂O₂ și radicalilor hidroxil asupra ADN-ului celular (Leanderson, P., Ann. N.Y. Acad. Sci. 686: 249-261, 1993). Mai mult, H₂O₂ poate cauza transformarea în epiteliul traheal al pământului și aceast fapt a fost legat de dezvoltarea carcinomului bronhogenic la fumători. Astfel, rolul dăunător al H₂O₂ (conținută în fumul de țigară) în celulele pulmonare și dezvoltarea cancerului pulmonar sunt puternic sugerate. Gudronul din fumul de țigară conține atât radicali semichinonă, cât și fier, creând astfel un sistem pentru producerea radicalului hidroxil. Diversele urme de elemente conținute în gudronul fumului de țigară (Fe, Cu, MN, Cd) pot acționa atât intracelular, cât și extracelular. Ionii Fe²⁺ cu binecunoscuta reacție Fenton:

Fe²⁺ + H₂O₂ Fe³⁺ + OH ' + OH ’ produc o multitudine de reacții oxidative prin radicalii hidroxil.

Producerea similară de radical hidroxil poate fi obținută prin Cd²⁺. Ionul Mn²⁺ este un stimulator caracteristic al activității guanilat ciclazei solubile. Cd²⁺ conținut în fumul de țigară este deosebit de toxic pentru plămân. Fumătorii par a avea de două ori concentrația normală de Cd²⁺ în plămânii lor. Aceasta sugerează că Cd²⁺ înlocuiește Zn²⁺ în prezentarea aspectului de normalitate din endoteliul vaselor pulmonare (Kostial, K., în: “Trace Elements in Human and Animal Nutrition”(ed. W. Mertz) Fifth edit. Voi.2:319-345, Academic Press, Inc. Orlando, FI., 1986).

Aldehidele prezente în fumul de țigară reacționează cu grupările -SH și -NH₂ ale proteinelor cele din urmă devenind inerte. Crotonaldehida (aldehidă nesaturată α, β) conținută în fumul de țigară descrește concentrația grupărilor -SH și crește concentrația carbonilproteinelor (Stadtman, E.R., Science 257: 1220-1224, 1991).

Până în prezent s-au recomandat insistent țigaretele cu filtre. Ultima tendință în ceea ce privește adăugarea de filtre la țigară este de a se atinge reținerea maximă a compușilor nocivi prezenți atât în faza gazoasă, cât și în cea solidă a fumului de țigară. Studiile epidemiologice la fumători au arătat că există un răspuns dependent de doză, indiferent dacă fumul de țigară s-a administrat în faza gazoasă, fază solidă sau fază combinată (Surgeon General of the U.S. Public Health Service, The health consequences of using smokeless tobacco, N.H. Publ. No.86-2874, Bethesda, MD, 1986). S-a dovedit că modificarea țigaretei este ea însăși o abordare practică pentru reducerea compușilor nocivi conținuți în fumul de țigară. Aceasta s-a obținut inițial folosind filtre obișnuite și apoi prin schimbarea compoziției tutunului prin prelucrare chimică. Schimbările în fabricarea țigaretelor s-au făcut, de asemenea, prin folosirea hârtiei poroase sau a hârtiei de frunze de tutun. în ultimii 15 ani sau făcut numeroase încercări pentru a face fumatul mai puțin dăunător asupra sănătății, reducând cantitatea de fum/țigară, schimbând diametrul țigaretei și folosind filtre perforate. Filtrele perforate permit diluarea fumului de țigară cu până la 50% aer. Cărbunele activ a fost, de asemenea, folosit în combinație cu filtre preferate. Aceasta a contribuit la reducerea drastică a cantităților de gudron și nicotină din fum. Astfel de tehnici sunt folosite în mod deosebit în țările dezvoltate precum Austria, Canada, Germania, Suedia, Anglia și SUA. Media cantității de gudron și nicotină într-o țigaretă americană s-a redus de la 38 mg și 2,7 mg în 1955, la 13 mg și respectiv 1 mg în 1991. în Uniunea Europeană această tendință, alături de reducerea cantităților de gudron și nicotină din fumul de țigară, este continuată. Limita superioară admisă pentru gudron, în ianuarie 1993, era de 15 mg, și aceasta trebuie să fie redusă până la 12 mg începând cu ianuarie 1998. Cu toate acestea, în alte țări conținutul de gudron în fumul de țigară este de 22 mg (Mitacek E.J., Brunneman, K.D., Pollednak, A.P., Hoffman, D. și Suttajit M., Prev. Med. 20: 764-773, 1991). Modificările făcute în procesul de fabricare a țigaretelor au dus la îndepărtarea specifică a unor

RO 117412 Β1 substanțe toxice din fumul de țigară. Mai precis, s-au introdus filtre de acetat de celuloză, permițând astfel îndepărtarea parțială a fenolilor semivolatili și N-nitrozaminelor volatile (Brunnemann, K.D., Hoffman, D., Recent Adv. Tabacco Res. 17: 71-112, 1989). Monoxidul de carbon este redus selectiv, prin folosirea filtrelor perforate. Concentrația hidrocarburilor aromate polinucleare carcinogenice (PAH) s-a redus selectiv, prin folosirea tutunului îmbogățit cu nitrit. Cu toate acestea, reducerea PAH în tutun folosind concentrații ridicate de nitrit, duce la creșteri nedorite a N-nitrozaminelor carcinogene, fiind astfel necesar să se reducă PAH prin mijloace alternative (Hoffman, D., Hoffman, I., Wynder, E, 1., Lung Cencer and the Changing Cigarette in Relevance to Human Cancer of N-nitroso- compounds, Tobacco Smocke and Mycotoxins. (Ed. O’Neil, I.K., Chen, J., and Bartsch, H) voi. 105: 449-459, 1991).

în brevetul US 4414988 se prezintă un filtru pentru fumul de tutun, filtru care conține o soluție apoasă a unui compus care are un ion metalic sau, în special, ion feric, care se leagă de structura ciclică protoporfirină, drept agent de îndepărtare a substanțelor carcinogene din fumul de tutun și un purtător poros al acestuia.

Cererea de brevet CH 609217 prezintă un filtru pentru îndepărtarea compușilor nocivi din fumul de tutun. Filtrul cuprinde un compus tetrapirolic cum ar fi hemoglobina, în amestec cu cărbune activ. Filtrul poate fi format prin impregnarea unui material de filtru cu compusul tetrapirolic.

Din cele menționate mai sus reiese clar că există o necesitate de a produce un filtru capabil să rețină oxizii de azot nocivi, radicalii liberi, apa oxigenată, aldehidele și nitrozocompușii carcinogeni, care sunt responsabili centru efectele dăunătoare ale fumului de țigară asupra sistemelor respirator și cardiovascular.

în mod corespunzător, prezenta invenție asigură un procedeu de realizare a unui filtru pentru fumul de tutun, care are o matrice îmbogățită cu o substanță biologică aleasă dintre una sau mai multe substanțe biologice care conțin fier, cupru și/sau magneziu complexat cu un ciclu porfirinic și fier legat stereospecific în molecule de proteină, care cuprinde impregnarea în mod cunoscut a unui material de filtru cu una sau mai multe din respectivele substanțe biologice, filtrarea materialului rezultat, pentru a îndepărta orice substanță biologică neabsorbită, și lăsarea materialului astfel filtrat să se usuce.

Filtrele de fum de tutun produse prin procedeul conform prezentei invenții cuprind substanțe biologice care conțin fier, cupru și/sau magneziu complexat cu un ciclu porfirinic și fier legat stereospecific în molecule de proteină, care în mod caracteristic, realizează în mod specific și elimină următoarele:

a) NO și NO_X,

b) Co,

c) H₂O₂

d) radicali liberi,

e) aldehide-chinone,

f) nitrozocompuși carcinogeni,

g) microelementele cadmiu, cupru, mangan, fier etc. care sunt inhalate în timpul fumatului.

Avantajul major al procedeului conform invenției constă în aceea că filtrele produse prin acest procedeu sunt mult mai eficiente în îndepărtarea compușilor nocivi din fumul de țigară, decât filtrele de referință sau filtrele obținute prin procedeul fără etapa de filtrare.

Se dă în continuare un exemplu concret de realizare a invenției în legătură și cu fig.1...28, care reprezintă:

- fig.1, schema instalației pentru determinarea compușilor, N, NO_X;

- fig.2, secțiune printr-un filtru de țigară realizat prin procedeul conform invenției;

150

155

160

165

170

175

180

185

190

195

RO 117412 Β1

- fig.3 și 4, diagramele variației conținutului de NO în fumul de țigară, determinate prin chemiluminescentă;

- fig.5, diagrama variației conținutului de radicali liberi în fumul de țigară, determinat prin chemiluminescență;

- fig.6, diagrama variației conținutului de apă oxigenată în fumul de țigară, determinat prin chemiluminescență;

- fig.7, diagrama variației conținutului de microelemente din fumul de țigară, determinat prin capacitatea acestora de a stimula activitatea luciferazei;

- fig.8, diagrama răspunsului de chemiluminescență în timp, comparativ pentru un filtru convențional și un filtru biologic;

- fig.9, diagrama variației eliberării NO din nitrozocompuși;

- fig. 10, diagrama variației eliberării NO din dietilnitrozamină;

- fig.11, diagrama variației spontane a NO de către nitrozocompușii din fumul de țigară;

- fig. 12, diagrama variației NO și NO₂' în macrofagele pulmonare;

- fig. 13, diagrama stressului oxidativ al macrofagelor pulmonare;

- fig. 14, diagrama cantității de apă oxigenată produsă de macrofagele alveolare;

- fig. 15, diagrama variației GMP ciclic;

- fig. 16, diagrama variației cantității de NO în funcție de H₂O₂ în macrofagele alveolare;

- fig. 17, diagrama variației GMP ciclic într-un filtru biologic și într-un filtru martor;

- fig. 18, diagrama variației concentrației NO în fumul de țigară trecut printr-un filtru convențional și printr-un filtru biologic;

- fig. 19, diagrama variației lungimii de undă a ONO₂‘ cu gradul de absorbție într-un filtru convențional și un filtru biologic;

- fig.20, diagrama variației stressului oxidativ indus de ONOO' în eritrocitele umane;

- fig.21, diagrama variației concentrațiilor de hemoglobină și/sau lizat în fumul de țigară trecut printr-un filtru convențional și un filtru biologic;

- fig.22, diagrama variației curbei de chemiluminescență pentru aldehide, comparativ într-un filtru biologic și un filtru convențional;

- fig.23, 24, diagramele variației curbei de chemiluminescență pentru radicali liberi, comparativ într-un filtru biologic și un filtru convențional, după 5 min și după 1 h;

- fig.25, 26a, 26 b, diagramele rezultatelor comparative în faza gazoasă a fumului de țigară;

- fig.27, 28, cromatogramele pe GC/U'/ ISCAN pentru probe cu filtru din cărbune activ impregnat, fără și cu etapă de filtrare, conform invenției.

Pentru identificarea compușilor nocivi, conținuți în fumul de țigară, s-au efectuat experimente chimice și biologice. Experimentele chimice realizate sunt cele care urmează:

a) identificarea și determinarea cantitativă a NO și No_x folosind o nouă metodă chimică și biologică;

b) identificarea radicalilor liberi foloxind metode chemiluminescente dependente de lucigenină;

c) identificarea aldehidelor și chinonei prin stimularea sistemului enzimatic luciferinăluciferază;

d) identificarea și determinarea cantitativă a urmelor de elemente folosind metoda oxidării luciferinei prin luciferază, în prezență de ATP;

e) identificarea și determinarea cantitativă a H₂O₂ folosind metoda chemiluminescenței dependentă de izoluminolmicroperoxidază;

f) identificarea și determinarea cantitativă spectrofotometric a ONOO' și prin metoda chemiluminescenței luminolului sporit;

g) identificarea nitrozocompusului carcinogen prin chemiluminescență luminolului sporit.

RO 117412 Β1

Experimentele biologice realizate sunt cele care urmează:

- identificarea de NO folosind activitatea guanilat ciclazei solubile izolate ca parametru funcțional;

- identificarea de ONOO’ folosind estimarea stressului oxidativ al eritrocitelor umane, indus prin ONOO';

- identificarea de CO folosind activitatea guanilatciclazei solubile izolate ca parametru funcțional.

Suplimentar s-au realizat următoarele experimente in vitro;

- izolarea macrofagelor alveolare din plămân de șobolan;

- estimarea stressului oxidativ al macrofagelor alveolare indus prin terî-butil-hidroperoxid (t-BHP);

- determinarea de NO/NO₂7ONOO‘ produs de către macrofage alveolare;

- determinarea de H₂O₂ produsă de către macrofage alveolare;

- efectul H₂O₂ exogene asupra producerii NO de către macrofage alveolare.

Experimente in vivo asupra voluntarilor umani s-au realizat pentru determinarea următorilor compuși:

a) determinarea NO în aerul exhalat de nefumători;

b) determinarea NO în aerul exhalat de fumători;

c) determinarea NO în fumul de țigară exhalat;

d) determinarea ONOO' în fumul de țigară exhalat;

e) determinarea radicalilor liberi în fumul de țigară exhalat;

f) determinarea aldehidelor în fumul de țigară exhalat.

Pentru determinarea NO, NO_X conținut a) în fum de țigară, b) eliberat de către macrofage alveolare după provocare cu fum de țigară și c) în fumul de țigară exhalat de voluntari umani, s-a utilizat o instalație constând dintr-o incintă de 2,5 cm în diametru, care a fost prevăzută cu tije solide din plexiglas transparent, care s-au scobit la un capăt cu o mașină de strunjit, pentru a crea o cavitate conică identică, în fiecare tijă de plexiglas. Ele au fost apoi prelucrate suplimentar și șlefuite la capetele deschise pentru a forma o joncțiune oblică, creând o legătură foarte strânsă între cele două cavități conice. S-a presat o fâșie subțire, pătrată, de teflon (politetrafluoretilenă 0,0015 inch (3,8 mm) în grosime) între ansambluri care s-au strâns cu șuruburi. Cele două părți ale tuburilor de acces, pe fiecare parte a membranei, permit ca probe biologic active și substanțe reactive să fie injectate în, să se scoată din, sau să se modifice pe fiecare parte a membranei, în timpul reacțiilor biologice (fig.1).

A. Determinarea NO prin chemilumiaescență

Soluția NO standard s-a preparat conform literaturii (Deliconstantinos, G., Villotou, V., Fassitsas, C., (1992) J. Cardiovasc. Pharmacol. 12, S63-S65) și (Deliconstantionos, G., Villiotou, V., Stavrides, J.C., (1994) m;”Biology ofNitric Oxide”, eds. Feelish, M., Busse, R., Moncanda, S., Portland Press, sub tipar). Soluția de reacție a constat din soluție salină echilibrată Hank (HBSS) pH 7,4; H₂O₂ (500 μΜ); luminol (30 μΜ) și volumul total a fost 500 pl. Fiola s-a agitat puternic și emisia s-a înregistrat într-un luminometru Berthold Auto Lumat LB 953.

B. Determinarea chimică a NO/NO₂

Determinarea chimică a NO s-a bazat pe diazotarea sulfanolamidei de către NO la pH acid și oxidarea ulterioară a scopoletinei, care poate fi determinată fluorometric cum s-a descris anterior (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Fassitsas, C., Cardiovasc. Pharmacol. 12; S63S65, 1992). Macrofage alveolare în HBSS (10⁶ celule/ml) s-au amestecat cu 100 pl dintr-un reactiv constând din: 20% sulfanilamidă în 20% H₃PO₄ și 25 μΜ scopoletină. Diminuarea fluorescenței s-a mărit la temperatura camerei (22°C) cu un spectrofotometru de

250

255

260

265

270

275

280

285

290

295

RO 117412 Β1 fluorescentă Aminco SPF-500. Fluorescența s-a mărit continuu în timp, până când panta liniei a putut fi măsurată (aproximativ 8 min). Măsurătorile pantei s-au transformat apoi la nmoli de NO folosind o curbă standard construită cu diferite concentrații de NO pur. Produsul final nitrit (ai NO₂) al sintezei NO s-a măsurat pe baza acumulării lui în supernatantele celulei cultivate prin reacția sa cu reactiv Griess.

C. Determinarea spectroscopică a peroxinitritului (ONOO)

S-a sintetizat ONOO’, s-a titrat și s-a stocat așa cum s-a descris anterior (Deliconstantionos, G., Villiotou, V., Stavrides, J.C., m:’’Biology of Nitric Oxide, (editori Feelish, M., Busse, R., Moncanda, S.), Portland Press (sub tipar). Datorită instabilității ONOO' la pH 7,4, spectrele UV s-au înregistrat imediat după amestecarea H₂O₂ și soluției NO. Concentrația de ONOO' s-a determinat pe baza unei valori ε 302 nm de 1670 M'¹ cm'¹. Spectrele UV s-au prezentat după scăderea spectrelor UV de bază ale H₂O₂ la concentrații corespunzătoare.

D. Estimarea radicalilor liberi

Estimarea radicalilor liberi s-a realizat folosind chemiluminescența indusă folosind lucigenină/DAMCO (1,4-diazabiciclo-[2,2,2]octan) așa cum s-a descris anterior (Deliconstantinos, G., Krueger, G.R.F., J. Vitrat Dis. 1:22-27, 1993). Amestecul de reacție a constat din HBSS pH 7,4; lucigenină (100 μΜ); DAMCO (100 μΜ). Fiola s-a agitat puternic și emisia s-a înregistrat într-un luminometru Bedrthold AutoLumat LB853. Pentru eliminarea radicalilor de oxigen liberi s-au folosit substanțe (SOD, manitol, histidină, metionină).

E. Estimarea microelementelor și aldehidelor

Analizele s-au bazat pe oxidarea D-luciferinei catalizată de luciferază în prezența unei sări ATP magneziu, conform invenției:

LH₂+ATPMg²⁺+O2^!y£MOxiluciferină+ATP+O2+PPi+Mg²⁺+lumină

Microelementele Cd²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺ cresc activitatea luciferazei și răspunsul maxim de chemiluminescență este crescut proporțional la concentrația microelementelor de până la 10 pg. Reacțiile au loc în HBSS pH 7,4 într-un volum total de 0,5 ml.

Pentru estimarea aldehidelor, s-a folosit același sistem enzimatic luciferină/luciferază, dar în absență de ATP. Aldehidele reacționează cu sistemul enzimatic pentru a produce chemiluminescență fără prezență de ATP. Reactivii folosiți s-au luat dintr-o trusă de analiză ATP (Calbiochem-Novabiochem CA. SUA).

F. Izolarea macrofagelor alveolare

Pe scurt, ia șobolani, s-a injectat letal, intravenos, pentobarbital de sodiu, s-a deschis toracele, plămânii s-au perfuzat liber, fără sânge, cu soluție salină de fosfat tamponat fără Ca²⁺, rece (4°C) (PSB; pH 7,4) și s-au recuperat intacți din cavitatea toracică.

S-a obținut omogenat din plămâni de șobolan, trăgând repetat țesutul printr-o seringă și apoi acesta a fost trecut prin site succesiv mai fine, din oțel inoxidabil, având pori în domeniul de la 32, 62 și 68 pori/inch (respectiv meshi), sub un curent constant de soluție salină echilibrată Finkelstein (FBSS, pH 7,4). Suspensia finală de macrofage alveolare s-a strâns, s-a filtrat și s-a centrifugat 10 min la 300 x g pentru peletarea celulelor. Peletarea de celule constând în mai mult de 98% macrofage s-a spălat și s-a resuspendat în soluția Ringer. Apoi, procedura s-a repetat de 2 ori. S-au izolat aproximativ 10 x 10® macrofage/șobolan. S-a testat viabilitatea prin excludere tripan blue.

G. Identificarea nitrozocompușilor

Nitrozocompușii s-au identificat prin eliberare lentă de oxid de azot (NO) după tratamentul lor cu H₂O₂. Soluția de reacție a constat din dimetilnitrozamină și/sau dietilnitrozamină (1μΜ); H₂O₂ (500 μΜ); luminol (30 μΜ) în HBSS pH 7,4 într-un volum total de 0,5 ml.

Fiola s-a agitat puternic și emisia s-a înregistrat într-un luminometru Bedrthold AutoLumat

LB 965. Pentru identificarea formării de ONOO’ s-au folosit manitol, (100 mM); DMSO (100 mM) și cisteină (3 omM).

RO 117412 Β1

H. Izolarea macrofagelor alveolare

Pe scurt, s-au injectat letal, intravenos, șobolani, cu pentabarbital de sodiu, s-a deschis toracele, plămânii s-au perfuzat liberi, fără sânge, cu o soluție salină de fosfat tamponat fără Ca²⁺, rece (4°C) (PBS; pH 7,4) și s-au recuperat intacți din cavitatea toracică. S-a obținut omogenat din plămâni de șobolani, trăgând repetat țesutul printr-o seringă și apoi acesta a fost trecut lui prin site succesiv mai fine, din oțel inoxidabil, având pori în domeniul de la 32, 62 și 68 pori/inch (respectiv meshi), sub un curent constant de soluție salină echilibrată Finkelstein (FBSS, pH 7,4). Suspensia finală de macrofage alveolare s-a strâns, s-a filtrat și s-a centrifugat 10 min la 300 x g pentru peletarea celulelor. Peletarea de celule constând în mai mult de 98% macrofage s-a spălat și s-a resuspendat în soluția Ringer. Apoi, procedura s-a repetat de 2 ori. S-au izolat aproximativ 10x10® macrofage/șobolan. S-a testat viabilitatea prin excludere tripan blue.

/. Stressul oxidativ al macrofagelor alveolare indus prin t-butil-hidroxiperoxid (t-BHP) Generarea radicalilor de oxigen liberi de către macrofage alveolare indus prin i-BHP (2,5 mM) s-a determinat folosind o metodă de chemiluminescență a luminolului. Răspunsul chemiluminescent s-a înregistrat într-un luminometru Bedrthord AutoLumat LB 953 așa cum s-a descris anterior (Deliconstantinos, G., Krueger, G.R.F., J. Viral. Dis. 1, 22-27, 1993).

J. Determinarea apei oxigenate (HzOJ

S-a preparat un amestec izoluminol/microperoxidază (100 mM borat de sodiu, 1mM izoluminol, 0,01 mM microperoxidază în 70% apă și 30% metanol la pH 8). S-au amestecat 50 pl din acest reactiv cu macrofage alveolare izolate (10® celule) în HBSS într-un volum total de 0,5 ml. Răspunsul chemiluminescent s-a transformat la nmol de H₂O₂ folosind o curbă standard construită cu diverse concentrații de H₂O₂ pură.

K. Prepararea și purificarea guanilatciclazei solubile (sGC) pentru estimarea CO

S-a purificat sGC din celule endoteliale umane, prin cromatografie GTP-agaroză. Sau adăugat citosoli (10 mg proteină) la o coloană GTP-agaroză (1,8 x 9 cm) preechilibrată cu 25 mM tampon Tris-HCI pH 7,6 care conține 250 mM sucroză și 10 mM MnCI₂. Apoi s-a eluat sGC din coloană cu 5 ml tampon de echilibru plus 10 mM GTP.

L. Determinarea GMP ciclic

Concentrațiile de cGMP s-au determinat prin radioimunotest, după acetilarea probelor cu anihidridă acetică (Deliconstantinos, G. și Kopeokona, L., Anticancer Res. 9: 753-760, 1989). Amestecul de reacție a conținut trietanolamină/HCI (50 mM); creatin fosfat (5 mM); MgCI₂ (3mM); izobutilmetilxantină (1 mM); guanilat ciclază solubilă (1 pg proteină) într-un volum total de 150 pl. Reacțiile s-au inițiat pnn adăugare de GTP și s-au incubat timp de 10 min la 37°C. Mediul de incubare a fost aspirat, iar cGMP a fost extrasă prin adăugare de HCI (0,1 M) răcit cu gheață. După 10 min, probele au fost transferate pe o placă nouă uscată și s-au reconstituit în 5 mM acetat de sodiu (pH 4,75) pentru determinarea cGMP. cGMP formată s-a determinat folosind trusa de analiză cGMP (Amersham).

Invenția se bazează, în principal, pe următoarele considerente:

a) Există substanțe pentru eliminarea corespunzătoare a compușilor nocivi, cum ar fi hemoglobina sau lizate de eritrocite, sau orice substanță care conține fier legat stereospecific

b) Se aleg substanțe de eliminare, care conțin ciclul porfirinic cu fier (de exemplu, protoporfirina)

c) Se aleg substanțe de eliminare, care conțin ciclul porfirinic care nu conține în mod necesar fier

d) Se aleg substanțe de eliminare, care conțin ciclul porfirinic complexat cu alte metale, de exemplu, Mg²⁺, Cu²⁺

350

355

360

365

370

375

380

385

390

395

RO 117412 Β1

e) Se alege un procedeu biotehnologic pentru îmbunătățirea materialelor convenționale comune, care sunt folosite în prezent în producerea de filtre de țigarete care vor conține substanțele de eliminare biologice, menționate mai sus.

Modul concret de realizare a invenției în lumina aplicabilității sale la nivele industriale de producție a fost următorul.

S-a preparat o soluție de 1 mg/ml hemoglobină și/sau lizat de eritrocite în soluție salină de fosfat tamponat (PBS) cu un pH de 7,4 și s-a adăugat la 100 mg cărbune activ. Ele au fost incubate 30 min la temperatura camerei și infiltrate printr-o hârtie de filtru S & S Cari Schleicher & Schuell Co SUA. Cantitatea de hemoglobină neabsorbită din filtrat s-a estimat spectrofotometric. Cărbunele îmbogățit cu hemoglobina a fost lăsat să se usuce la temperatura camerei. O cantitate de 200 mg de cărbune uscat îmbogățit cu hemoglobina a fost introdusă între două filtre comune, astfel încât tot fumul țigaretei să poată veni în contact cu grupările active ale moleculelor (Fe²⁺, Fe³⁺, -HS -NH₂) (fig.2). Aceste materiale compatibile au fost, astfel, pregătite pentru a fi folosite la fabricarea de noi filtre de țigaretă, denumite în continuare filtre biologice.

Alternativ, hemoglobina poate fi înlocuită prin substanțe biologice caracterizate prin prezența ionilor metalici Fe²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺ complexați cu inelul porfirinei, tot așa cum Fe²⁺ se leagă stereospecific la moleculele proteinelor precum transferina, catalaza, protoporfirina, citocrom C, clorofila.

într-o altă variantă, o soluție de 5 mg/ml hemoglobină și/sau lizat de eritrocite în soluție salină de fosfat tamponat (PBS) cu pH de 7,4 s-a preparat și s-a examinat la 25°C folosind un specofotometru cu înregistrare Acata Beckman. S-a observat un maxim de absorbanță pronunțat la 540 nm și 575 nm (Smith, R.P., Kruszyma, H., J. Pharmacol. Exper. Ther 191, 557-563, 1974). Filtre de țigarete convenționale comune s-au impregnat cu aceste soluții și s-au uscat la aer la 25-35°C. Aceste materiale compatibile sunt pregătite de a fi folosite pentru fabricarea noilor filtre de țigarete la care se va face referire în continuare ca filtre biologice. Aceste noi filtre fiologice permit ca fumul care este inhalat să vină complet în contact cu grupările acide ale moleculelor hemoglobinei și/sau lizatele filtrului, fără schimbarea proprietăților fizice sau gustului fumului de tutun al țigaretei. Pentru motive estetice, o mică porțiune (3 mm) a unui filtru convențional se poate adapta la capătul vizibil al filtrului biologic.

Alte variante de producere la scară industrială includ următoarele.

S-a preparat o soluție de 5 mg/ml de protoporfirină în soluție tampon (PBS) pH 7,4 și s-a analizat la 25°C folosind un spectrofotometru cu înregistrare Acta Beckman. Excitarea protoporfirinei cu lumină ultra violetă (498-408) a produs o fulorescență roșie-portocalie între 620-630 nm. Apoi, filtrele convenționale s-au impregnat (îmbibat) cu soluția de mai sus și s-au uscat cu aer cald (25-35°C).

Alternativ, s-a examinat o soluție de 5 mg/ml de transferină în PBS pH 7,4 folosind un spectrofotometru cu înregistrare Acta Beckman. Transferina ferică prezintă un spectru caracteristic de 470 nm. Metodele de mai sus s-au folosit pentru impregnarea filtrelor convenționale folosite în mod curent.

Alternativ, se prepară o soluție de 5 mg/ml de catalază în PBS pH 7,4. S-a procedat identic ca mai sus pentru prepararea filtrului biologic.

Alternativ, se prepară o soluție 5 mg/ml de citocrom C în PBS pH 7,4.

S-a procedat ca mai sus pentru prepararea filtrului biologic.

Alternativ, se prepară o soluție 5 mg/ml de clorofilă în PBS pH 7,4.

S-a procedat ca mai sus, pentru pregătirea filtrului biologic.

Alternativ, substanțele biologice menționate mai sus se introduc între două filtre comune, în formă solidă, astfel încât tot fumul de țigară care trece prin filtru să vină în contact cu grupările active ale moleculelor (Fe²⁺, Fe³⁺, -SH, -NH₂).

RO 117412 Β1

Analiza rezultatelor

Diversele substanțe biologice folosite pentru îmbogățirea filtrelor convenționale s-au dovedit a reține în diverse grade compușii toxici (NO, CO, radicali liberi, H₂O₂, aldehidele și microelementele și nitrozocompușii) din fumul de țigară, așa cum se poate observa din tabelul 1 de mai jos.

450

Tabelul 1

Substanțe . eliminatoare	NO %	CO %	Radical i liberi %	H₂O₂ %	Aldehide %	Nitrozocompuși %	Microelemente %.
hemoglobină	90	90	90	80	90	90	95
transferină	75	90	60	60	60	75	50
catalază	85	90	90	90	80	80	80
protoporfirină	85	90	70	80	70	75	80
citocrom C	85	80	70	80	60	60	70
clorofilă	15	10	40	15	10	10	80

455

460

S-a obținut gradul de reținere al substanțelor strict dăunătoare din fumul de țigaretă, și fumul de țigaretă (20 ml) s-a filtrat printr-un filtru biologic și s-a comparat cu cel filtrat printr-un filtru convențional (20 ml). Numai 1 ml fum de țigaretă trecut prin filtrul convențional s-a comparat cu 40 ml fum de țigaretă trecut printr-un filtru biologic. S-a constatat că filtrele biologice au o capacitate de 40 de ori mai mare de reținere a microelementelor, comparativ cu filtrele convenționale.

în cele ce urmează se prezintă descrierea detaliată a rezultatelor experimentale reprezentative, astfel încât să fie înțeleasă mai bine activitatea acestor substanțe biologice.

a) Identificarea NO conținut în fumul de țigaretă metoda chemiluminescenței

S-a identificat NO folosind metoda chemiluminescenței sporite a luminolului, așa cum s-a descris în secțiunea experimentală. Fig.3 și 4 ilustrează un experiment tipic de identificare și exprimare a NO, precum și îndepărtarea sa după trecerea fumului de țigară prin filtrul biologic. Se constată că peste 90% din NO este reținut de către hemoglobină. Eficacitatea filtrului biologic este evidentă în reținerea și neutralizarea NO care a fost implicat în reacții toxice atât în celulele pulmonare, cât și în fluidele pulmonare în special, când el este implicat în formarea puternicului oxidant ONO'O’.

b) Identificarea radicalilor liberi conținuți în fumul de țigară, folosind metoda chemiluminescenței

Radicalii liberi din fumul de țigară au fost identificați prin răspunsul de chemiluminescență produs prin sistemul lucigenică/DAMCO după reacția sa cu radicalii liberi. Fig.5 prezintă un maxim caracteristic care a avut loc în 2 s de răspuns chemiluminescent care s-a inhibat 100% după trecerea fumului de țigară printr-un filtru biologic. Reținerea radicalilor liberi de către filtrele biologice implică o reducere a stressului oxidativ din macrofagele alveolare, care se produce prin fumul țigaretei convenționale.

c) Identificarea H₂O₂ conținute în fumul de țigară, folosind metoda chemiluminescenței

Conținutul de H₂O₂ s-a estimat prin răspunsul de chemiluminescență produsă de către sistemul izoluminol/microperoxidază. Fig.6 arată maximul caracteristic al chemiluminescenței datorat prezentei H₂O₂ în fum de țigară. în prezența catalazei (100 unități/ml)

465

470

475

480

485

490

RO 117412 Β1 chemiluminiscența a fost inhibată aproximativ 90%. Când fumul de țigară a trecut printr-un filtru biologic s-a observat o inhibare de 80% a răspunsului chemiluminescent. Sistemul izoluminol/microperoxidază este specific pentru identificarea H₂O₂. Radicalii liberi conținuți în fumul de țigară arată un răspuns mic de chemiluminescență după interacțiunea lor cu izoluminol. Această chemiluminescență mică pare a fi aproximativ 10% din chemiluminiscența totală, produsă de H₂O₂ în prezența radicalilor liberi, deoarece catalaza inhibă maximul răspunsului chemiluminescent de până la 90%. Reținerea H₂O₂ reduce aparent atât stressul oxidativ, cât și producerea de NO de către macrofagele alveolare.

d) Identificarea microelementelor și aldehidelor conținute în fumul de țigară folosind sistemul enzimatic luciferină/luciferază

Microelementele conținute în fumul de țigară au fost identificate prin capacitatea lor de a stimula activitatea luciferazei. Fig.7 ilustrează:

- răspunsul de chemiluminescență produs prin oxidarea luciferinei în prezență de ATP;

- răspunsul sporit al chemiluminescenței în prezența ionilor Cd²⁺ (0,5 mg);

- răspunsul sporit de chemiluminescență în prezența ionilor Cu²⁺ (0,5 mg);

- răspunsul sporit de chemiluminesceniă produs de către fum de țigară (1 ml) și

- inhibarea răspunsului de chemiluminescență (conform cu cel produs de către fumul de țigară) produs de către 40 ml fum de țigară când a trecut prin filtrul biologic de țigară. Este evident că răspunsul de chemiluminescență produs de către microelementele conținute în fumul de țigară convențională este mai mult decât 40 de ori mai ridicat decât cel trecut printr-un filtru biologic. Reținerea microelementelor de către filtrele biologice poate avea efecte atât pe termen scurt, cât și pe termen lung. Efectele pe termen scurt ar putea atrage după ele inhibarea reacțiilor redox care au loc îri plămân (Fe, Mn) și efectele pe termen lung ar putea atrage după sine inhibarea deteriorărilor constituenților și substanțelor din sânge (Cd).

Aldehidele conținute în fumul de țigară au fost identificate și estimate folosind același sistem enzimatic luciferină/luciferază în absența ATP-ului. Aldehidele sunt capabile să provoace oxidarea luciferinei. Fig.8 arată un răspuns caracteristic de chemiluminescență, care ar putea să dureze mai mult de 1 h. Acest răspuns de chemiluminescență a fost inhibat 100% când fumul de țigară folosit a fost trecut prin filtrul biologic, arătând că eficacitatea de reținere a aldehidelor de către filtrul biologic este importantă.

e) Identificarea nitrozocompușilor în fum de țigară

Identificarea nitrozocompușilor conținuți în fum de țigară s-a obținut prin estimarea eliberării lente a NO din nitrocompuși, după tratamentul lor cu H₂O₂ Așa cum arată fig.9, s-a obținut un maxim al răspunsului de chemiluminescență la aproximativ 900 s. Trecerea fumului de țigară printr-un filtru biologic a arătat o inhibare de 90% din răspunsul de chemiluminescență observată; maximul său a avut loc la aproximativ 1200 s. Eliberarea lentă a NO de către nitroprusitul de sodiu (SNP), după tratamentul său cu H₂O₂ este, de asemenea, prezentată. Fig. 10 arată eliberarea lentă a NO din nitrozocompușii dietilnitrozamină și dimetilnitrozamină și din hemoglobină îmbogățită cu nitrozocompușii din fumul de țigară tratat cu H₂O₂. Este clar că eliberarea NO de către nitrozocompușii fumului de țigară, care formează aducți de hemoglobină, urmează aceeași imagine a eliberării NO ca și nitrozocompușii dietilnitroamină și dimetilnitrozamină. Fig. 11 prezintă eliberarea NO de către nitrozocompușii fumului de țigară, care au format aducți cu hemoglobină după ce aducții nitrozocompus-hemoglobină s-au iradiat cu UVB (100 mJ/cm²) timp de 1 min. Eliberarea NO s-a estimat în prezență de H₂O₂ și a dat un răspuns de chemiluminescență la 1 s. Creșterea treptată, observată în fig.11, este datorată efectului H₂O₂ asupra hemoglobinei (reacția Fenton).

RO 117412 Β1

540

f) Producerea de NO de către macrofagele pulmonare

Cu ajutorul unei camere speciale, creată în laborator, prezentată în fig. 1, s-au realizat experimentele in vitro. Membrana de teflon, care separă cele două compartimente ale camerei, este permeabilă pentru NO gazos și impermeabilă pentru NO₂' și ONOO'. Macrofage pulmonare neprovocate, izolate așa cum s-a descris în secțiunea experimentală, au fost suspendate în soluție tampon HBSS (1 χ 10⁶ celule/ml) și plasate în compartimentul A al camerei. în compartimentul B al camerei, s-au plasat 2,5 ml reactiv Griess sau reactiv sulfanilamidă/scopoletină. Oxidul de azot NO, eliberat de către macrofage în compartimentul

A, difuzează în membrana de teflon în compartimentul B și se leagă cu reactivii Griess și/sau sulfanilamidă/scopoletină unde rămâne prins. Aceasta arată că macrofagele pulmonare produc NO gazos. Cantitatea de NO prezentă acum în compartimentul B s-a determinat apoi spectrofotometric sau fluorofotometric. Cantitățile de ONOO și NO₂’ conținute în compartimentul A al camerei s-au determinat folosino, de asemenea, reactivii Griess și/sau sulfanilamidă/scopoletină. Experimentele de mai sus s-au repetat după provocarea macrofagelor cu fum de țigară, înaintea plasării lor în compartimentul A. Rezultatele, așa cum s-a ilustrat în fig. 12, arată că în fumul de țigară descrește cantitatea de NO produsă, crescând în același timp producerea de ONOO' în macrofagele pulmonare și indicând indirect producerea masivă atât a NO, cât și a O₂' care interacționează pentru a forma ONOO.

Repetarea experimentelor de mai sus folosind filtre biologice (în care fumul de țigară s-a trecut printr-un filtru biologic) a arătat că substanțele biologice folosite produc aceleași cantități ale NO₂’ și ONOO în compartimentul A și cantități similare ale NO în compartimentul

B, ca și cum macrofagele nu ar fi fost provocate cu fum de țigară. în acest context, pentru examinarea cineticilor nitrozării prin intermediar(i) generați în timpul reacției NO/O₂ în soluție apoasă la pH fiziologic, s-au folosit, de asemenea, componentele reacției Greiss. Adăugarea fumului de țigară (50 ml) la o soluție fosfat 100 mM pH 7,4, care conține 25 mM sulfanilamină și 2,5 mM N-(1-naftil)-etilendiamină dihidroclorică (NEDD), a generat o absorbție la λ max=496 mm, indicatoare a produsului azo caracteristic, rezultat din nitrare. Merită să fie avute în vedere implicațiile prezentelor observații față de reactivitățile așteptate ale NO în condiții fiziologice relevante, când concentrațiile maxime ale NO în micromediul celular sunt estimate a fi în domeniul de 0,5-10 μΜ. Concentrațiile NO sunt crescute dramatic în timpul fumării țigaretei, cu efecte dăunătoare asupra celulelor pulmonare.

g) Stresul oxidativ al macrofagelor pulmonare

Rezultatele efectelor fumului de țigară asupra stresului oxidativ al macrofagelor pulmonare sunt ilustrate în fig. 18. Estimările stresului oxidativ folosind t-BHP au arătat că fumul de țigară produce de 2 ori mai mult stres oxidativ decât o fac macrofagele neprovocate.

Când fumul de țigară trece printr-ur: filtru biologic, stresul oxidativ observat a fost similar celui al macrofagelor pulmonare neprovocate. Astfel, este clar indicată eliminarea stresului oxidativ indus de fumul de țigară asupra macrofagelor. Fumul de țigară este, în aceste condiții, lipsit de substanțele care produc stresul oxidativ asupra macrofagelor pulmonare.

h) Apa oxigenată (H₂O₂) produsă de către macrofage pulmonare

Cantitatea de H₂O₂ produsă de către macrofagele provocate prin fum de țigară este de 10 ori mai mare față de rata producerii macrofagelor neprvocate. Folosirea unui filtru biologic arată o scădere de 90% a producerii H₂O₂ (fig. 14), comparată cu cea produsă folosind filtre convenționale. Este evident că fumul de țigară induce stresul oxidativ în macrofage; el crește producerea de H₂O₂ de către aceste celule.

545

550

555

560

565

570

575

580

585

RO 117412 Β1

i) Reconstituirea experimentelor

Cantitatea de GMP ciclic produsă de către NO eliberat de către macrofagele alveolare s-a determinat folosind camera arătată în fig.1, în care guanilat-ciclaza solubilă s-a plasat în compartimentul A, iar macrofagele alveolare s-au plasat în compartimentul B. Cantitățile de NO produse de macrofage s-au determinat pe o perioadă de 50 min, cu și fără celule provocate cu fum de țigară. Macrofagele provocate prin fum de țigară (10 ml) au eliberat aproximativ o cantitate de 10 ori mai mică de NO față de celule netratate, arătând astfel o producere de 10 ori mai mică de GMP ciclic. Procedura de mai sus s-a repetat folosind fum de țigară trecut printr-un filtru biologic. S-a pus în evidență o diferență semnificativă, nestatistică, față de macrofagele neprovocate (martor) (fig. 15). Acumularea de NO în compartimentul B a crescut de mai mult de 5 ori când macrofagele alveolare au fost tratate cu H₂O₂ (5 mM) (fig. 16). Acesta sugerează că H₂O₂ crește producerea de NO printrun mecanism de feedback pozitiv. Calea metabolică L-arginină/NO din macrofage este în concordanță cu ideea că fumul de țigară produce eliberarea de NO/ONOO'.

k) Identificarea monoxidului de carbon (CO) în fum de țigară

Prezența CO în fum de țigară s-a determinat folosind metoda biologică bazată pe stimularea guanilatciclazei solubile prin CO.

Introducerea de HBSS saturat cu fum de țigară în compartimentul A al camerei, în prezența superoxidului, astfel încât să neutralizeze NO, și introducerea de guanilat ciclază solubilă în compartimentul B au avut ca urmare o creștere a producerii de GMP ciclic, datorată difuzării CO în compartimentul A spre compartimentul B. Trecerea fumului de țigară printr-un filtru biologic reduce cantitatea de GMP ciclic produsă, cu aproximativ 80% (fig.17). Datele de mai sus arată că substanțele nocive NO_X și CO conținute în fumul de țigară sunt reținute și neutralizate de filtrele biologice.

Experimente in vivo

a) Inițial, s-a confirmat prezența NO și ONOO' în fum de țigară exhalat. La voluntari umani, care fumează o țigară prevăzută cu filtru convențional, s-a pus în evidență prezența NO în fumul de țigară exhalat și s-a identificat după introducerea fumului exhalat într-o soluție acidă (50 ml) pH 4. Concentrația NO s-a estimat prin metoda chemoluminescenței luminorului sporit, descrisă în secțiunea experimentală, folosind curbe standard, făcute prin NO comercial. Concentrația NO s-a dovedit a fi 0,045 mM. S-au repetat experimentele, folosind filtre biologice, și concentrația NO din fumul inhalat a fost cu aproximativ 70% mai scăzută comparativ cu filtrul convențional (fig. I8). Concentrația de ONOO' s-a determinat folosind o soluție de NaOH 1,2 M care a arătat o creștere în absorbție la 300 nm (fig.19) de 1670 M'¹cm'¹. Experimentele au arătat că în timpul fumatului, fumul exhalat conține cantități mari de ONOO' (prin trecerea a 50 ml de fum exhalat în 5 ml NaOH 1,2 M a rezultat o soluție de 0,9mM ONOO ). Raportul NO/ONOO' în fumul exhalat s-a determinat a fi 1:20.

Prin urmare, rezultă că NO_X în plămân se transformă în ONOO' când el reacționează cu superoxidul din plămân. Superoxidul este eliberat atât din macrofage, cât și din reacțiile redox care au loc în plămâni, în timpul fumatului. Fumul de țigară trecut printr-o pompă nu conține ONOO', totuși, o cantitate de NO_X reacționează cu superoxid sau oxigen pentru a forma ioninitrit (NO'₂). ONOO' se formează numai când fumul de țigară intră în plămâni. Folosirea filtrelor biologice reduce cantitățile exhalate de NO și ONOO' cu 70%.

b) ONOO' reacționează cu ionii bicarbonat ai eritrocitelor umane conform reacției: ONOO' + HCO‘₃^ HCO₃ + NO₂ + OH'

Radicalul bicarbonat oxidează luminolul, precum și moleculele aromatice și heterociclice. Alternativ, ONOO' poate peroxida bicarbonatul la peroxibicarbonat, alte combinații puternic oxidante. Pe de altă parte, superoxid-dismutaza (SOD) catalizează nitrarea prin

ONOO', a unei game largi de fenoli, inclusiv a tirozinei din proteine.

RO 117412 Β1

Astfel, există câteva mecanisme potențiale prin care bicarbonatul și SOD ar putea influența reactivitatea totală a ONOO’ din celule. Prezența ONOO', format în plămâni de către fumul de țigară inhalat, manifestă o creștere dramatică în eritrocite, care s-a detectat printr-un răspuns de chemiluminescență care se întâlnește în 5 s.

Același experiment s-a dirijat folosind un filtru biologic și a rezultat o inhibare de aproape 100% a stressului oxidativ din eritrocitele umane (fig.20). Hemoglobina sau lizatele eritrocitare expuse la ONOO' (conținut în fumul de țigară exhalat) au produs îndepărtarea celor două maxime la 540 și 575 nm, observate în mod normal în hemoglobină.

Un experiment similar, reprezentativ, s-a realizat pe 12 voluntari și este prezentat în fig.21. Când s-au expus hemoglobină și/sau lizat la o cantitate mică de fum exhalat (10 ml), s-a observat o deplasare a maximelor de la 540 și 575 la 525 și 555 nm conformă cu formarea de nitrozil hemoglobină. S-au repetat experimentele folosind filtre biologice. Maximele observate și-au menținut lungimile lor de undă caracteristice.

d) Aldehidele s-au identificat în fum de țigară exhalat de la voluntari umani, prin maximul lor caracteristic de chemiluminescență. Experimentele s-au repetat folosind filtre biologice și s-a observat o reducere de 90% a răspunsului chemiluminescenței comparat cu un răspuns de chemiluminescență maximă, observat când s-a folosit un filtru convențional (fig.22). Este evident că filtrele biologice rețin și neutralizează aldehidele din fumul de țigară, reținând în același timp oxidanții, inhibând astfel, aparent, inițierea reacțiilor redox în plămâni, fapt care ar putea avea ca rezultat producerea de aldehide endogene.

e) în fumul de țigară exhalat de voluntari umani au fost identificați radicalii liberi, prin maximul lor caracteristic de chemiluminescență.

Voluntari umani au folosit țigarete prevăzute cu filtre convenționale și biologice. Ei au fost avertizați să elimine fum de țigară într-o soluție acidă (0,01 N HCI) (50 ml) pH 6 și răspunsul de chemiluminescență s-a evaluat după 5 min și 60 min. La pH 6 ONOO’ se descompune spontan. în 5 min s-a constantat o creștere de 160% a răspunsului de chemiluminescență din fumul exhalat, trecut printr-un filtru convențional, comparat cu fumul de țigară trecut printr-un filtru biologic (fig.23). Când soluția acidă, saturată prin fumul exhalat, s-a lăsat să stea 1 h, diferența în răspunsul chemiluminescenței a crescut de la 160% la 250% (fig.24). Aceasta este în concordanță cu ideea că reacțiile redox au loc continuu în fumul de țigară, prin radicalii chinonă, și produc o serie de specii de oxigen activate, care pot provoca deteriorări biolog ce.

Comentariu în cadrul prezentei invenții, studiile efectuate au dovedit că macrofagele alveolare posedă o NO sintază endogenă, asemenea altor celule, și sunt capabile să elibereze NO/ONOO’ perioade lungi de timp după expunere la fum de țigară. Mai mult, o dată ce începe să fie eliberat NO de aceste celule, producerea de NO ajunge să sprijine singură producerea de NO chiar după ce stimulul este îndepărtat. O asemenea reacție măsoară capacitatea NO, derivat din fumul de țigară, de a stimula macrofagele alveolare să elibereze NO și ONOO' pentru o perioadă de câteva ore după îndepărtarea stimulului. O astfel de reacție poate fi inițiată prin producerea de H₂O₂ în plămâni, la stimularea macrofagelor alveolare prin fum de țigară. H₂O₂ poate stimula activitatea NO sintazei de a produce NO și ONOO^- pentru o perioadă de timp mai mare de 1 h, după îndepărtarea stimulilor. Experimentele au arătat într-adevăr că trecerea fumului de țigară printr-un filtru biologic duce la o reducere de 90% (comparativ cu un filtru convențional) a stresului oxidativ în macrofagele alveolare de șobolan. Un radical ONOO' format în plămâni poate ataca posibil și inactiva inhibitorul a1-proteinază (a1p1). Inhibarea a1p1 în plămânii umani produce adesea enfizeme în care se reduce capacitatea pulmonară. Evidențele statistice arată că fumatul predispune la dezvoltarea enfizemelor (Southon, P.A., Pwis, G., Free Radicals in Medicine. Involvement

640

645

650

655

660

665

670

675

680

RO 117412 Β1 in human Disease. Mayo Clin. Proc. 63:390-408, 1988). Experimentele in vivo, care s-au efectuat pe 12 fumători voluntari, au arătat o reducere de 90% a NO/ONOO' exhalat când fumul de țigară inhalat a trecut printr-un filtru biologic.

Radicalii de oxigen, liberi, au fost, de asemenea, implicați în patogeneza alveolitelor induse de complexul imun IgA. Pretratamentul animalelor cu superoxid dismutază, catalază, chelatorul fierului de sferioxamină sau DMSO ca substanță de eliminare a radicalului hidroxil !

suprimă dezvoltarea leziunii pulmonare. în contrast, plămânii animalelor martor pozitiv, netratate, sunt caracterizați prin prezența unui număr crescut de macrofage alveolare. De asemenea, sunt prezentate edeme interstițiale și hemoragie. Mai mult, în acest model de leziune pulmonară, L-arginina este, de asemenea, puternic protectoare, așa cum s-a demonstrat prin reducerea: permeabilității vasculare, hemoragiei vasculare și leziunii celulelor endoteliale vasculare și celulelor epiteliale alveolare. Acestea sugerează că macrofagele sunt sursa deteriorărilor provocate de NO, O'₂, H₂O₂ și compușilor OH (Mullingan, M. S., Jonhson, K. J., Ward, P.A., In: “Biologica! Oxidants: Generation and Injurious Consequences (editori Cochrane, C.G., și Gilbrone, M.A., Jr. Academic Press 157-172, 1992).

Reținerea și neutralizarea oxidanților conținuți în fumul de țigară, de către filtrele biologice, poate juca un rol semnificativ în reducerea activității enzimelor redox, care sunt legate direct de stresul oxidativ din celulele pulmonare. Filtrele biologice reduc drastic stresul oxidativ produs prin fumul de țigară inhalat. Stresul oxidativ din macrofagele pulmonare și din celulele endoteliale ale vaselor pulmonare poate fi indus de către NO, NO_X, radicali de oxigen, și/sau aldehidele conținute în fumul de țigară. Mai mult, reținerea aldehidelor și macroelementelor (în special Cd) de către filtrele biologice poate avea efecte considerabile pe termen lung, în protejarea antioxidanților plasmatici și în inhibarea dezvoltării arteriosclerozei.

Hemoglobina conține câțiva centri neutrofili, care suferă reacții covalente cu electrofili. Acești centri induc resturile valinei N-terminale ale lanțului a- și β-, atomii N1 și N3 ai resturilor histidinei, și grupul sulfhidril al resturilor de cisteină. Nitrozocompusul carcinogen 4-(metilnitrozamino)-1-(3-piridil)-1-butanonă (NNK), prezent în tutun, este transferat fumului în timpul arderii țigaretei, și nivelurile sale în curentul principal de fum pot varia de la 4 până la 1700 ng/țigaretă. NNK poate forma aducți cu hemoglobina Hecht, S.S., Karan, S., și Carmell, S.G., în “Human carcinogen expose”, editori Garmer, R.C., Farmer, P.B., Steel, G.l. și Wricht, A.S.) IRL Press, pp. 267-274,1991). Este clar că numai evitarea tutunului elimină bolile legate de acesta, prin abținere de la mestecare și fumare de tutun. Totuși, statisticile asupra fumătorilor obișnuiți arată că se poate face caz de necesitatea reducerii expunerii la carcinogenii din tutun și pentru modificarea modului lor de acțiune. Se au în vedere în acest sens:

1) modificarea produselor de tutun,

2) inhibarea activității metabolice a carcinogenilor din tutun și a formării lor endogene prin anumiți micro- și macro-nutrienți și agenți de chemoprevenire și

3) reținerea carcinogenilor din tutun folosind filtre specifice, care vor fi adaptate în tutunul țigărilor.

Filtrele pentru fum de tutun produse prin procedeul conform invenției pot proteja sănătatea nu numai a fumătorilor, dar la fel de bine și a nefumătorilor.

în tabelul 2 sunt prezentate rezultatele obținute în zece cicluri de fumare, care s-au repetat într-o perioadă de 3 luni. Fiecare ciclu cuprinde fumarea a 8 țigarete, folosind dispozitivul de fumare cu 8 canale conform procedeului ISO. Datele s-au obținut pe un analizor

GC/UV INSCAN de mare sensibilitate. în coloana intitulată “referință” sunt prezentate rezultatele obținute cu filtre convenționale din acetat; în coloana “fără etapă filtrare” sunt prezentate rezultatele obținute cu filtre îmbogățite cu aceeași substanță ca cea folosită în

RO 117412 Β1 prezenta invenție, cu deosebirea că filtrele s-au obținut prin procedeul de impregnare a materialului de filtrare fără etapa de filtrare. Coloana “cu etapă filtrare” prezintă rezultatele obținute cu filtre conform invenției, care se obțin printr-un procedeu care cuprinde impregnarea materialului filtrant cu substanța biologică și filtrarea materialului rezultat pentru a îndepărta substanța biologică neabsorbită.

Din datele prezentate în tabelul 2, rezultă în mod evident că filtrele obținute prin procedeul conform invenției sunt mult mai eficiente în îndepărtarea compușilor nocivi din fumul de țigară, atât față de filtrele de referință, cât și față de filtrele obținute prin procedeul care nu cuprinde etapa de filtrare.

Rezultatele sunt foarte clar ilustrate și prin diagramele din fig.25, 26a, 26b, 27 și 28, care prezintă grafic rezultatele tabelului.

Se observă că filtrele obținute prin procedeul conform invenției determină reducerea substanțelor nocive într-un procent mai mare pentru fiecare din compușii testați decât filtrele obținute prin procedeul fără etapa de filtrare.·.

Datele prezentate dovedesc rezultatele neașteptate, obținute prin utilizarea filtrelor realizate prin procedeul conform invenției, procedeu care cuprinde suplimentar etapa menționată de filtrare și îndepărtare, ceea ce conferă filtrelor proprietăți îmbunătățite în mod semnificativ.

Tabelul 2

735

740

745

750

Valorile medii ale compușilor îr> fază gazoasă din fumul de țigară

Compusul	Referință mg/țigare	Fără etapa de filtrare	Cu etapa de filtrare	Diferență (%) ’
mg/țigare	% reducere	mg/țigare 8	'^reducere
acetaldehidă	834,3	426,3	48,9	310,2	62,8	13,9
izopren	520,2	299,8	42,4	196,5	62,2	19,9
acetonă	369,3	149,6	59,6	99,8	73	13,5
metanol	346,6	92,8	73,2	46,8	86,5	13,5
2-butanonă	108,5	49,7	54,2	33,8	68,9	14,7
toluen	89,1	39,6	55,7	20,6	79,9	21,2
propanal	85,0	35,8	57,9	20,4	76,0	18,1
furan	85,1	27,5	67,7	18,9	77,8	10,1
benzen	59,8	31,9	46,7	20,3	66,1	19,4
acroleină	92,8	26,5	71,4	11,1	88,0	16,6
2,5-DMF	58,6	22,3	62,0	12,5	78,7	16,7
izobutiraldehidă	36,0	9,2	74,4	5,2	85,5	11,1
1,3-pentadienă	14,1	6,8	51,8	3,3	75,6	24,8
m-xilen	30,2	5,2	82,8	2,1	93,1	10,2
etilbenzen	14,2	9,8	30,9	6,7	52,8	21,9
	pg/țigară	pg/țigară		pg/țigară
NO	418,8	340,4	18,7	292,6	30,1	11,4

755

Claims

1. Procedeu de realizare a unui filtru pentru fumul de tutun, care cuprinde o matrice de fibră îmbogățită cu o substanță biologică aleasă dintre una sau mai multe substanțe biologice care conțin fier, cupru și/sau magneziu complexat cu un ciclu porfirinic și fier legat stereospecific în moleculele de proteină, caracterizat prin aceea că, cuprinde impregnarea, în mod cunoscut, a unui material de filtru cu una sau mai multe din respectivele substanțe biologice, filtrarea materialului rezultat pentru a îndepărta orice substanță biologică neabsorbită și lăsarea materialului astfel filtrat să se usuce.

2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că impregnarea materialului de filtru cu substanța biologică se efectuează timp de 30 min la temperatura camerei.

3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că filtrul cuprinde cărbune activ.

4. Procedeu conform cu oricare dintre revendicările 1 la 3, caracterizat prin aceea că substanța biologică cuprinde hemoglobina și/sau lizat de eritrocite.

5. Procedeu conform cu oricare dintre revendicările 1 la 3, caracterizat prin aceea că substanțele biologice sunt alese dintre substanțe care conțin ioni de Fe²⁺ legați stereospecific de una sau mai multe molecule ae proteine alese dintre transferină, catalază, protopofirină, citocrom C și clorofilă.

6. Procedeu conform cu revendicările 4 sau 5, caracterizat prin aceea că substanța biologică este sub formă de soluție 1-10 mg/ml intr-o soluție salină tamponată cu fosfat care are un pH de 7,4.

7. Procedeu conform cu oricare dintre revendicările 1 la 6, caracterizat prin aceea că, cuprinde etapa de încorporare a respectivei matrici de fibre, îmbogățită într-un aranjament de filtru pentru fumul de tutun, în care acesta este flancat de o matrice de fibre care nu este îmbogățită cu substanța biologică.