SK26196A3

SK26196A3 - Removal of noxious oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds from cigarette smoke using biological substances

Info

Publication number: SK26196A3
Application number: SK261-96A
Authority: SK
Inventors: Ioannis Stavridis; George Deliconstantinos
Original assignee: Ioannis Stavridis; George Deliconstantinos
Priority date: 1994-06-27
Filing date: 1994-06-27
Publication date: 1996-09-04
Also published as: US5909736A; NO984748D0; CA2170610A1; PL174430B1; LV11520A; RO117412B1; CA2170610C; DE69429726D1; NO984748L; MD1912C2; LV11520B; NZ267484A; AU693099B2; JPH09504439A; NO960778L; PT720434E; EP0720434A1; ATE212196T1; MD1912B2; FI960904A

Description

Predložený vynález sa týka spôsobu odstraňovania škodlivých zlúčenín, t.j. oxidov dusíka, volných radikálov, aldehydov, peroxidu vodíka, oxidu uholnatého, stopových prvkov a karcinogénnych prchavých nitrózozlúčenín, ktoré sú inhalované pri fajčení cigariet, substancií, ktoré až doteraz nie sú dostatočne zadržiavané použitím bežných cigaretových filtrov.

Doterajší stav techniky

Rad publikácií v medzinárodných časopisoch potvrdzuje, že cigaretový dym sa delí do dvoch fáz: a) pevnej fázy (decht) a b) plynnej fázy. Táto separácia sa objavuje pri použití typického Cambridge filtra zo sklených vlákien, ktorý odstraňuje 99,9 % častíc, ktoré sú väčšie ako 0,1 μιη. Cigaretový decht obsahuje výrazne vysoké koncentrácie velmi stabilných volných radikálov, ktoré môžu byť klasifikované do najmenej štyroch odlišných kategórii. Semichinóny v rovnováhe s chinónom a hydroxychinónmi sú pokladané za volné radikály s najzaujímavejšími chemickými vlastnosťami. Chinónový systém redukuje molekulárny kyslík za vzniku superoxidu (O₂ ^-), ktorý potom spontánnou dismutáciou tvorí peroxid vodíka (H₂O₂). V plynnej fáze je tu viac ako 10¹⁵organických radikálov na zatiahnutie s polčasom životnosti menším ako 1 sekunda, ktoré sú inhalované. Je paradoxné, že však napriek ich okamihovému polčasu životnosti si tieto radikály môžu udržať vysoké hladiny aktivity viac ako 10 minút v plynnej fáze. V skutočnosti je koncentrácia týchto radikálov zodpovedajúcim spôsobom zvyšovaná pri približovaní sa ku koncu filtra cigarety. Vysvetlenie tohto paradoxu možno nájsť v udržaní trvalého stavu; vďaka pokračujúcej produkcii volných radikálov (Pryor, W. A.,

Stone, K., Ann. N. Y. Acad. Sci. 686, 12 - 28, 1993).

Oxid dusnatý (NO) je najdôležitejším volným radikálom v plynnej fáze cigaretového dymu, ktorý sa počas fajčenia zúčastňuje reakčného sledu, ktorým sú vytvárané oxid dusičitý, izoprénové radikály, peroxylové radikály a alkoxylové radikály. Cigaretový dym tiež obsahuje zodpovedajúci počet aldehydov, ktoré prispievajú k jeho toxickým účinkom. Bolo zistené, že okamžité množstvá aldehydov extrahovaných z cigaretového dymu spôsobujú ako proteínový katabolizmus, tak oxidáciu tiolových skupín plazmových proteinov. Tieto vlastnosti sú pripočítané aldehydom a sú výsledkom reakcií medzi karbonylovou skupinou aldehydov a -SH a -NH₂ skupinami plazmových proteinov. Napríklad akroleín z cigaretového dymu rýchlo reaguje s -SH skupinami za vzniku karbonylových zlúčenín (Alving, K., Forhem, C. a Lundberg, J. M., Br. J. Pharmacol. 110, 739 - 746, 1993). V dechte cigaretového dymu sú prítomné stopové prvky, napríklad železo, med, mangán a kadmium, ktoré sa zúčastňujú mnohých volné radikály produkujúcich reakcií a vedú k tvorbe velmi aktívnych sekundárnych radikálov (napr. peroxyradikálov, alkoxyradikálov, superoxidu, cytotoxických aldehydov atd.). Zavedenie stopových prvkov do plúc počas fajčenia cigarety vedie k sériám redox reakcií ako v plúcnych kvapalinách, tak alveolárnych makrofágoch, čo vedie k tvorbe velmi aktívnych hydroxylových radikálov (OH”). Tieto hydroxylové radikály sú väčšinou vytvárané za prítomnosti železa Fentonovou reakciou. Meď môže tiež tvorit hydroxylové radikály reakciou s peroxidom vodíka v plúcach. Mangán v nízkych koncentráciách (10”⁷ M), stimuluje rozpustnú guanylát cyklázu endoteliálnych buniek plúc vyvolaním produkcie oxidu dusnatého a superoxidu mechanizmom pozitívnej spätnej väzby (Youn, Y. K., Lalonde, C. Demling, R., Free Rad. Biol. Med., 12, 409 - 415, 1992). Oxid uholnatý je produkovaný počas spaľovania tabaku. Množstvo CO je zadržané v plúcach i po exhalácii, čo vedie k stimulácii rozpustnej guanylát cyklázy po jej interakcii s herne skupinou enzýmov endoteliálnych buniek a iných buniek v plúcnom tkanive. Zvýšené hladiny cyklického GMP v bunkách, spojené s mechanizmom pozitívnej spätnej väzby zvyšujú produkciu oxidu dusnatého a superoxidu (Watson, A., Joyce, H., Hopper, L. a Pride, N. B., Thorax 48, 119 - 124, 1993). NO plyn, ktorý môže byť produkovaný mnohými bunečnými typmi, zahrňujúcimi vaskulárne endoteliálne bunky a retikulárne endoteliálne bunky, spôsobí relaxáciu hladkých svalov (Lowenstein, C. J., Dinerman, J. L., Snynder, S. H., Ann. Intern. Med. 120, 227 - 237, 1994). Sú tu tiež exogénne zdroje NO, ktoré sú pokladané za podobne zodpovedné za vyvolanie poškodenia krvných ciev a iných tkanív. Je dobre známe, že sekundárne a terciárne amíny môžu reagovať s nitritmi a inými nitrozačnými činidlami za vzniku N-nitrózoamínov (Lowenstein, C. J., Dinerman, J. L., Snynder, S. H., Ann. Intern. Med. 120, 227 - 237, 1994). Od roku 1974 mnoho štúdií demonštrovalo, že počas zberu, lisovania tabaku a fajčenia sú alkaloidy nitrózované na tabakové špecifické N-nitrózoamíny (TSNA). Z TSNA identifikovaných v tabaku a/alebo jeho dyme sú N-nitrózonornikotín (NNN), 4-(metylnitrózoamino)-l- (3-pyridyl) -1-butanón (NNK) a 4-(metylnitrózoamino)-1-(3-pyridyl)-

1-butanol (NNAL) silné živočíšne karcinogény. NNN indukuje tumor v pľúcach myši, tumory trachey u škrečkov a tumory dutiny nosnej a ezofágu u krýs. NNK vyvoláva tumory pľúc u myší, škrečkov a krýs a tiež tumory pečene, nosnej dutiny a pankreasu u krýs. Orálne nanášanie zmesi NNN a NNK elicituje tumory v orálnej dutine a pľúcach krýs. Typické množstvo ako NNK tak NNN v hlavnom prúde cigarety je 200 ng/cigaretu (Hecht, S. S., Spratt, T. E. a Trushing, N., Carcinogenesis, 9, 161 - 165, 1988).

Náš súčasný výskum, týkajúci sa vplyvu cigaretového dymu na tkanivo pľúc zistil, že NO reaguje so superoxidom za vzniku silne oxidačného radikálu peroxynitrilu (0N00-), ktorý vyvoláva sekundárne poškodzujúce reakcie v kľúčových biomolekulách. Ako metabolické, tak škodlivé účinky NO v bunkách boli študované v našom laboratóriu v pokusoch in vitro a in vivo.

NO sa oxiduje za prítomnosti kyslíka na oxid dusičitý (NO₂). Rýchlosť tejto oxidácie závisí od koncentrácie kyslíka a druhej mocniny koncentrácie NO. Oxid dusičitý je jasne cytotoxický a je transformovaný na nitrit a nitrát vo vodných roztokoch. Naviac tvorí NO komplexy so stopovými prvkami a/alebo

s metaloproteínmi,	napríklad hemoglobínom	(Wink,	D. A. ,
Darbyshire, J. F.,	Nims,	R. W., Saavedra, J.	E. a Ford, P. E.,
Chem. Res. Toxicol.	6, 23	- 27, 1993).
NO, ktorý reaguje	so superoxidom za	vzniku	škodlivej
zlúčeniny ONOO”,	môže	spôsobiť určité	typy superoxidovej

toxicity. ONOO“ je nezvyčajne stabilný, čo je v súlade s jeho silným oxidačným potenciálom (+1,4 V). Počas rozkladu vytvára silne oxidačné deriváty, zahrňujúce hydroxylový radikál, oxid dusičitý a nitróniový ión. Následkom toho akákoľvek modifikácia v NO a superoxidovej produkcii tkanivami môže viest k tvorbe silných sekundárne oxidačných radikálov (Deliconstantinos, G.,

Villiotou, V., Stavrides, J. C., Cancer Mol. Biol., 1, 77 - 86,

1994). Konečne ONOO“ a jeho estery (RO-ONO alebo RP-ONO₂) majú sklon spôsobiť inaktiváciu alfa-l-proteinázového inhibítora (alPI). Toto môže byť pripočítané skutočnostiam, že: a) peroxid vodíka samotný nespôsobí rýchlu inaktiváciu aPU, ale pôsobí iba za prítomnosti NO, kedy sa tvorí ONOO“ a prebieha rýchla inaktivácia alPI, b) roztoky terc.-butylperoxynitritov (RO-O-O-NO₂) alebo ONOO amíny a aminokyseliny spôsobia inaktiváciu 1PI chránia 1PI protenázu samotnej a c) pred rýchlou inaktiváciou (Moreno, J.

J. a Pryor, W. A.,

Chem. Res. Toxicol.

5, 425 - 431,

1992). Okrem voľných radikálov obsiahnutých v cigaretovom dyme predstavujú aktivované alveolárne makrofágy dľalši dôležitý zdroj produkcie voľných radikálov fajčiarmi. Alveolárne makrofágy aktivované cigaretovým dymom pri dýchaní praskajú, čo vedie k zvýšenej produkcii kyslíkových voľných radikálov (hlavne O₂, ^{N0 a} H₂O₂). ^u fajčiarov sa objavuje zvýšené množstvo ako alveolárnych makrofágov, tak cirkulujúcich neutrofilov. Kyslíkové voľné radikály cigaretového dymu boli tiež zahrnuté do vývoja rakoviny pľúc. Inhalovaný cigaretový dym spôsobí zvýšený oxidačný stres v pľúcnych bunkách, vedúci k redukcii v koncentrácii nitracelulárnych antioxidantov, H₂0₂ reaguje, cez produkciu hydroxylových radikálov, z DNA buniek a spôsobí rozrušenie dvojitého reťazca. Pretože sa tomuto prerušeniu môže zabrániť prídavkom katalázy, sú tak nepriamo potvrdené škodlivé účinky H₂O₂ a hydroxylových radikálov na celulárnu DNA (Leanderson, P., Ann. N. Y. Acad. Sci. 686, 249 - 261, 1993). Naviac H₂O₂ môže spôsobil: transformáciu v tracheálnom epiteli plúc a boli spojené s vývojom bronchogénneho karcinómu u fajčiarov. Táto škodlivá úloha H₂O₂(obsiahnutého v cigaretovom dyme) v bunkách plúc a vývoji rakoviny plúc je tak silno naznačená.

Decht z cigaretového dymu obsahuje ako semichinónové radikály a železo, tak vytvorený systém pre produkciu hydroxylových radikálov. Rôzne stopové prvky obsiahnuté v dechte cigaretového dymu (Fe, Cu, Mn, Cd) môžu pôsobiť ako intracelulárne, tak extracelulárne. Fe²⁺ dobre známou

Fentonovou reakciou:

Fe²⁺ + H₂O₂ ------> Fe³⁺ + OH' a OH“ spôsobí pletoru oxidačnej reakcie hydroxylovými radikálmi. Podobne produkcia hydroxylových radikálov môže byť dosiahnutá u Cd²⁺. Mn²⁺ je charakteristický stimulátor rozpustnej guanylát cyklázovej aktivity. Cd²⁺ obsiahnutý v cigaretovom dyme je výnimočne toxický v plúcach. U fajčiarov sa objavuje dvojnásobok normálnej koncentrácie Cd²⁺ v ich plúcach. Toto naznačuje, že Cd²⁺ nahrádza Zn²⁺ za prítomnosti normálneho stavu v endoteliu plúcnych ciev (Kostial, K., v: Trace Elements in Human and Animal Nutrition (vyd. W. Mertz), 5. vyd., zv. 2, 319 - 345, Academic Press, Inc. Orlando, Fl. 1986). Aldehydy, prítomné v cigaretovom dyme, reagujú s -SH a -NH₂ skupinami proteínov ihneď a stávajú sa inertnými. Krotónaldehyd (α, β nenasýtený aldehyd obsiahnutý v cigaretovom dyme znižuje koncentráciu -SH skupín a zvyšuje koncentráciu karbonylproteínov (Stadtman, E. R., Science 257, 1220 - 1224, 1991).

V súčasnosti sú velmi odporúčané cigaretové filtre.

Okamžitým účinkom pridania filtrov k cigaretám je dosiahnutie maximálneho zadržania škodlivých zlúčenín prítomných ako v plynnej, tak v pevnej fáze v cigaretovom dyme. Epidemiologické štúdie u fajčiarov ukázali, že tu je dávkovo závislá bez ohladu na to, či je cigaretový dym podávaný v plynnej fáze, pevnej fáze alebo kombinovanej fáze (Surgeon Generál of U. S. Public Health Service. The health consequences of using smokeless tobacoo, N. H. Publ. No 86 - 2874, Bethesda, MD, 1986). Bolo zistené, že modifikácia cigarety je sama praktickým priblížením k redukcii škodlivých zlúčenín obsiahnutých v cigaretovom dyme. Toto bolo najprv dosiahnuté použitím bežných filtrov a potom zmenou zloženia tabaku chemickým spracovaním. Zmeny vo výrobe cigariet boli tiež vykonané s použitím porézneho papiera alebo papiera vyrobeného z tabakových listov. V posledných 15 rokoch bolo vynaložené mnoho úsilia na to, aby fajčenie menej poškodzovalo zdravie: znížením množstva dymu na cigaretu; zmenou priemeru cigarety; a použitím perforovaných filtrov. Perforované filtre umožňujú zriedenie cigaretového dymu vzduchom až na 50 %. V kombinácii s perforovanými filtrami bolo tiež použité aktívne uhlie. Toto bolo nasledované výraznou redukciou výťažkov dechtu a nikotínu v dyme. Takéto techniky sa používajú hlavne pre rozvinuté krajiny ako je Rakúsko, Kanada, Francúzsko, Nemecko, Švédsko, Anglicko a USA. Priemerný výťažok dechtu a nikotínu v americkej cigarete bol znížený z 39 mg a 2,7 mg v roku 1955 na 13 mg a 1 mg v roku 1991. V Európskom spoločenstve trend znižovania obsahu dechtu a nikotínu v cigaretovom dyme ešte pokračuje. Horná povolená hranica dechtu v januári 1993 je 15 mg a má byť znížená na 12 mg na začiatku januára 1998. Avšak v iných krajinách je obsah dechtu v cigaretovom dyme 22 mg (Mitacek, E. J., Brunneman, K. D., Polledank, A.P., Hoffman, D. a Suttajit,

M., Prev. Med. 20, 764 - 773, 1991). Zmeny vykonané vo výrobe cigariet viedli k špecifickému odstráneniu určitých toxických substancií z cigaretového dymu; špecifickejšie boli zavedené celulózoacetátové filtre, ktoré umožňujú parciálne odstránenie poloprchavých fenolov a prchavých N-nitrózoamínov (Brunnermann,

K. D., Hoffman, D., Recent Adv. Tobacco Res. 17, 71 - 112, 1989). Oxid uholnatý je selektívne redukovaný použitím perforovaných filtrov. Koncentrácia karcinogénnych polynukleárnych aromatických uhlovodíkov (PAH) bola selektívne redukovaná s použitím tabaku obohateného nitritmi. Avšak redukcia PAH v tabaku za použitia vysokých koncentrácií nitritu vedie k nežiaducemu zvýšeniu karcinogénnych N-nitrózoamínov, preto bolo nutné redukovať PAH alternatívnymi prostriedkami (Hoffman, D.,

Hoffman, I., Wynder, E. I., Lung Cancer and the Changing

Cigarette in Relevance to Human Cancer of N-Nitroso-compound,

Tobacco Smoke and Mycotoxins. (vyd. 0' Neill, I. K., Chen, J.

a Bartsch, H.), ZV. 105, 449 - 459, 1991).

Z vyššie uvedeného je zrejmé, že je nevyhnutné vyrobiť filter schopný odstránenia škodlivých oxidov dusíka, volných radikálov, peroxidu vodíka, aldehydov a karcinogénnych nitrózozlúčenín, ktoré sú všetky zodpovedné za škodlivé vplyvy cigaretového dymu na respiračný a kardiovaskulárny systém. Kvôli identifikácii škodlivých zlúčenín, obsiahnutých v cigaretovom dyme, boli vykonané chemické, biologické experimenty. Vykonané chemické experimenty sú nasledujúce:

a) Identifikácia a kvantitatívne stanovenie NO a NOx s použitím novej chemickej a biologickej metódy (táto metóda bola vyvinutá v našom laboratóriu).

b) Identifikácia volných radikálov s použitím lucigén - závislých chemiluminiscenčných metód.

c) Identifikácia aldehydov a chinónu stimuláciou enzymatického systému luciferín - luciferáza (táto metóda bola tiež vyvinutá v našom laboratóriu).

d) Identifikácia a kvantitatívne stanovenie stopových prvkov za použitia metódy oxidácie luciferínu luciferázou za prítomnosti ATP (táto metóda bola vyvinutá v našom laboratóriu).

e) Identifikácia a kvantitatívne stanovenie H₂O₂ za použitia izoluminol - mikroperoxidáza závislej chemiluminiscenčnej metódy.

f) Identifikácia a kvantitatívne stanovenie ONOO“ spektrofotometricky a luminolom posilnenej chemiluminiscenčnej metódy.

g) Identifikácia karcinogénnej nitrózozlúčeniny luminolom posilnenej chemiluminiscencie.

Biologické experimenty boli vykonané nasledovne:

a) Identifikácia NO použitím izolovanej rozpustenej guanylát cyklázovej aktivity ako funkčného parametra.

b) Identifikácia ONOO“ použitím hodnotenia oxidačného stresu ludských erytrocytov indukovaného ONOO“.

c) Identifikácia CO použitím izolovanej rozpustnej guanylát cyklázovej aktivity ako funkčného parametra.

Ďalej boli vykonané nasledujúce in vitro experimenty:

a) Izolácia alveolárnych makrofágov z krysích plúc.

b) Hodnotenie oxidačného stresu alveolárnych makrofágov indukovaného terc.-hutylhydroperoxidom (t-BHP).

c) stanovenie NO/NO₂ ^-/ONOO” produkovaného alveolárnymi makrofágmi.

d) Stanovenie H₂O₂ produkovaného alveolárnymi makrofágmi.

e) Vplyv exogénneho H₂O₂ na produkciu NO alveolárnymi makrofágmi.

Pokusy in vivo na ludských dobrovolníkoch boli vykonané kvôli stanoveniu nasledujúcich zlúčenín:

a) Stanovenie NO v exhalovanom vzduchu nefajčiarov.

b) Stanovenie NO v exhalovanom vzduchu fajčiarov.

c) Stanovenie NO v exhalovanom cigaretovom dyme.

d) Stanovenie ONOO v exhalovanom cigaretovom dyme.

e) Stanovenie volných radikálov v exhalovanom cigaretovom dyme.

f) Stanovenie aldehydov v exhalovanom cigaretovom dyme.

Kvôli stanoveniu NO, NOx obsiahnutých a) v cigaretovom dyme,

b) uvolnených alveolárnymi makrofágmi po podnete cigaretovým dymom a c) v exhalovanom cigaretovom dyme ludských dobrovoľníkov bola navrhnutá a vyrobená komora z pevných tyčí z číreho Plexiskla s priemerom 2,5 cm, ktoré boli z jedného konca vyvŕtané sústruhom kvôli vytvoreniu zhodnej kónickej dutiny v každej z tyčí z Plexiskla. Tieto boli ďalej spracované a leštené na otvorených koncoch, za vzniku spojenej skosenej oblasti, vytvárajúcej velmi tesné spojenie medzi dvoma kónickými dutinami. Tenký štvorec teflónovej vrstvy (polytetrafluóroetylén o sile 0,0015 palcov) bol umiestnený medzi zostavy, ktoré boli znova stlačené skrutkami uťahovanými prstami. Dve rúrkové časti na obidvoch stranách membrány umožňujú biologicky aktívnu vzorku a reaktívnu substanciu injektovať,· odobrať alebo modifikovať na ktorejkolvek strane membrány počas biologickej reakcie (obr. 1).

A. Stanovenie NO chemiluminiscenciou

Štandardný NO roztok bol pripravený podlá literatúry (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Fassitsas, C. (1992), J. Cardiovasc. Pharmacol. 12, str. 63 - 65) a (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J. C. (1994) v: Biology of Nitric Oxide, vyd. Feelish M., Busse, R., Moncada, s., Portland Press, v tlači). Reakčný roztok zložený z Hankovho vyváženého soľného roztoku (HBSS) pH 7,4, H₂O₂ (500 μΜ), luminol (30 μΜ a celkový objem bol 500 μΐ. Fľaštička bola intenzívne miešaná a emisia bola zaznamenávaná v Bedrthold AutoLumat LB953 luminometri.

B. Chemické stanovenie NO/NO₂“

Chemické stanovenie NO bolo založené na diazotácii sulfanolamidu NO v kyslom pH a následnou oxidáciou scopoletínu, ktorý môže byť detegovaný fluorometricky ako bolo popísané prv Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Fassitsas, C., J. Cardiovasc. Pharmacol. 12, str. 63 - 65, 1992). Alveolárne makrofágy v HBSS (10⁶ buniek/ml) boli zmiešané so 100 μΐ činidla, zloženého z: 20 % sulfanilamidu v 20 % H3PO4 a 25 μΜ scopoletínu. Rozklad fluorescencie bol sledovaný pri teplote miestnosti (22 “C) pomocou zariadenia Aminco SPF-500 Flurescence Spectrophotometer. Fluorescencia bola sledovaná kontinuálne po dobu, pokial mohla byť meraná strmosť priamky (pribi. 8 min.). Meranie strmosti bolo vykonané na nmól NO s použitím štandardnej krivky konštruovanej s rôznymi koncentráciami čistého NO. Nitritový (NO₂) koncový produkt NO syntézy bol meraný na báze svojej akumulácie v supernatantoch buniek kultivovaných jeho reakciou s Griessovým činidlom.

C. Spektroskopické stanovenie peroxynitritu (ONOO”)

ONOO“ bol syntetizovaný, titrovaný a uchovávaný ako je popísané prv (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J. C. v: Biology of nitric oxide (vyd. Feelisch, M., Busse, R. a Moncada, S.). Portland Press (v tlači). Vzhladom k nestabilite ONOO“ pri pH 7,4 boli UV spektrá zaznamenávané priamo po zmiešaní H₂O₂ a No roztoku. Koncentrácia ONOO” bola stanovená na základe e302 nm hodnoty 1 670 m“^x cm^-1. UV spektrá boli uvádzané po odpočítaní bazálneho UV H₂O₂ na zodpovedajúce koncentrácie.

D. Hodnotenie voľných radikálov

Hodnotenie volných radikálov bolo vykonané s použitím lucigenin/DAMCO (1,4-diazabicyklo[2,2,2]oktán)-indukovanéj chemiluminiscencie ako bolo prv popísané (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Krueger, G. R.F., J. Viral Dis. 1, 22 - 27, 1993). Reakčná zmes obsahuje HBSS pH 7,4, lucigenin (30 μΜ); DAMCO (100 μΜ). Fľaštička bola intenzívne premiešaná a emisia bola zaznamenaná na Bedrthold AutoLumat LB953 luminometri. Boli použité akceptory kyslíkových volných radikálov (SOD, manitol, histidín, metionín).

E. Hodnotenie stopových prvkov a aldehydov

Eseje boli založené na luciferázou katalyzovanej oxidácii D-luciferínu za prítomnosti ATP-magnéziovej soli podlá reakcie:

luciferáza

LH₂+ATPMG²⁺+O₂ -----------> 0xyluciferín+ATP+0₂aPPi+Mg²⁺+svetlo

Stopové prvky Cd²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺ zvyšujú aktivitu luciferázy a maximum chemiluminiscenčnej odozvy je úmerne zvýšené podlá koncentrácie stopových prvkov až na 10 μg. Reakcia sa vykonáva v HBSS pH 7,4 v celkovom objeme 0,5 ml.

Pre hodnotenie aldehydov bol použitý rovnaký enzymatický systém luciferín/luciferáza, ale za neprítomnosti ATP. Aldehydy reagujú s enzymatickým systémom za^- vzniku chemiluminiscencie bez prítomnosti ATP. Činidlá, ktoré boli použité, boli získané z ATP assay Kit (Calbiochem - Novabiochem CA, USA).

Fl. Izolácia alveolárnych makrofágov

Stručne, krysy boli usmrtené intravenóznou injekciou pentobarbitalu sodného, torax bol otvorený, plúca perfúziou zbavené krvi pomocou Ca²⁺, zbaveného studeného (4 ’C) fosfátom pufrovaného salinického roztoku (PBS, pH 7,4) a odstránené celé z dutiny hrudnej. Homogenát krysích pľúc bol získaný opakovaným priechodom tkaniva striekačkou a potom jej priechodom postupne stále jemnejšími ocelovými sitami s počtom pórov 32, 62 a 68 na palec - mesh - a za konštarftného prúdu Finkelsteinovho vyváženého soľného roztoku (FBSS, pH 7,4). Konečná suspenzia alveolárnych makrofágov bola zhromaždená, filtrovaná a odstreďovaná pri 300 x g po 10 minút na peletu buniek. Bunečná peleta, obsahujúca viac ako 98 % makrofágov, bola premytá a resuspendovaná v Ringerovom roztoku. Postup bol dvakrát opakovaný. Na krysu bolo získaných približne 10 x 10⁸ makrofágov. Viabilita bola hodnotená pomocou trypánovej modrej.

F2. Identifikácia nitrózozlúčenín

Nitrózozlúčeniny boli identifikované pomalým uvoľňovaním oxidu dusnatého (NO) po ich spracovaní s H₂O₂. Reakčný roztok obsahuje dimetylnitrózamín a/alebo diétylnitrózamín (1 μΜ); H₂O₂(500 μΜ); Luminol (30 μΜ) v HBSS pH 7,4, celkový objem 0,5 ml. Violka bola intenzívne miešaná a emisia bola zaznamenávaná pomocou Bedrthold AutoLumat LB953 luminometra. Manitol (100 mM), DMSO (100 mM) a cysteín (3,0 mM) boli použité na identifikáciu tvorby ONOO“.

G. Izolácia alveolárnych makrofágov

Stručne, krysy boli usmrtené intravenóznou injekciou pentobarbitalu sodného, torax bol otvorený, pľúca perfúziou zbavené krvi pomocou Ca²⁺, zbaveného studeného (4 ’C) fosfátom pufrovaného salinického roztoku (PBS, pH 7,4) a odstránené celé z dutiny hrudnej. Homogenát krysích pľúc bol získaný opakovaným priechodom tkaniva striekačkou a potom jeho priechodom postupne stále jemnejšími oceľovými sitami s počtom pórov 32, 62, 68 na palec - mesh - a za konštantného prúdu Finkelsteinovho vyváženého soľného roztoku (FBSS, pH 7,4). Konečná suspenzia alveolárnych makrofágov bola zhromaždená, filtrovaná a odstreďovaná pri 300 x g po 10 minút na peletu buniek. Bunečná peleta, obsahujúca viac ako 98 % makrofágov, bola premytá a resuspendovaná v Ringerovom roztoku. Postup bol dvakrát opakovaný. Na krysu bolo získaných približne 10 x 10⁸ makrofágov. Viabilita bola hodnotená pomocou trypánovej modrej.

H. Oxidačný stres alveolárnych makrofágov vyvolaný terc.-butyl-1-hydroperoxidom (t-BHP)

Tvorba kyslíkových voľných radikálov alveolárnymi makrofágmi vyvolaná pomocou t-BHP (2,5 mM) bola stanovená s použitím luminolovej chemiluminiscenčnej metódy. Chemiluminiscenčná odpoveď bola zaznamenaná ako prv uvedené pomocou zariadenia Bedrthold AutoLumat (Diliconstantinos, G., Krueger, G. R. F., J. Viral Dis. 1, 22-27, 1993).

I. Stanovenie peroxidu vodíka (H₂O₂)

Bol pripravený koktaj 1 izoluminol/mikroperoxidáza (100 mM boritan sodný, 1 nN izoluminol, 0,01 mM mikroperoxidáza y 70 % vody a 30 % etanolu pri pH 8). 50 μΐ tohto činidla bolo zmiešané s izolovanými alveolárnymi makrofágmi (10⁶ buniek) v HBSS v celkovom objeme 0,5 ml. Chemiluminiscenčná odozva bola prevedená na nmol H₂O₂ použitím štandardnej krivky vytvorenej pomocou rôznych koncentrácií čistého H₂O₂.

J. Príprava a čistenie rozpustnej guanylát cyklázy (SGC) pre CO hodnotenie ludských endoteliáIných chromatograf iou.

GTP

SGC Z agarózovou vložené na rovnováhy s 25 sacharóza a 10 rovnovážneho pufra

- agarózovú mM Tris-HCl

MnCl₂· sGC plus 10 mM mM buniek (10 (1,8

Cytosoli kolónu (1,8 x pufrom pH 7,6, bol čistený GTPmg proteínu) boli 9 sm), uvedené obsahujúcim 250 bola potom eluovaná z kolóny GTP.

do mM ml

K. Stanovenie cyklickej GMP

Koncentrácie cGMP boli stanovené rádioimunoesejou po acetylácii vzoriek acetanhydridom (Delikonstantinos, G. a Kopeikina, L, Anticancer Res. 9, 753 - 760, 1989). Reakčná zmes obsahuje trietanolamín/HCl (50 mM), ceratínfosfát (5 mM), MgCl₂(3 mM), izobutylmetylxantín (1 mM), kreatín kinázu (0,6 jednotiek), GTP (1 mM), rozpustnú guanylát cyklázu (1 gg proteínu) v celkovom objeme 150 μΐ. Reakcie boli iniciované prídavkom GTP a inkubované po 10 min. pri 37 °C. Inkubačné médium bolo odsaté a cGMP bola extrahovaná prídavkom ladovo studenej HC1 (0,1 M). Po 10 min. boli vzorky prenesené na novú platňu, sušené a rekonštituované v 5 mM octane sodnom (pH 4,75) pre stanovenie cGMP. Vytvorená cGMP bola stanovená použitím cGMP esejového gitu (Amersham).

Podstata vynálezu

Cielom predloženého vynálezu je vytvoriť a aplikovať metódy, v ktorých sa používajú biologické substancie, ktoré špecificky reagujú a zachytávajú nasledujúce:

a) NO a NOx,

b) co,

c) h₂o₂,

d) volné radikály,

e) aldehyd - chinóny,

f) karcinogénne nitrózozlúčeniny,

g) odstraňujú stopové prvky kadmium, meď, mangán, železo, atď., ktoré sú inhalované počas fajčenia.

Tento vynález je založený na predpoklade, že:

a) Existuje výber vhodných látok na zachytávanie, podobných hemoglobínu alebo lyzátom erytrocytov alebo akejkoľvek substancie, ktorá obsahuje stereošpecificky viazané železo.

b) Existuje výber akceptorov, ktoré obsahujú porfyrínový kruh so železom (napr. protoporfyrín).

c) Existuje výber akceptorov, ktoré obsahujú porfyrínový kruh, ktorý neobsahuje nevyhnutne železo.

d) Existuje výber akceptorov, ktoré obsahujú porfyrínový kruh komplexovaný s inými kovmi, napr. Mg²⁺, Cu²⁺.

e) Biotechnologický proces bude zriadený kvôli obohateniu materiálov, ktoré sa v súčasnosti používajú na výrobu cigaretových filtrov, ktoré budú obsahovať vyššie uvedené biologické substancie - akceptory.

Základná myšlienka tohto vynálezu spočíva v koncepte, že impregnácia bežných cigaretových filtrov a/alebo filtrov obsahujúcich aktívne uhlie, môže byť obohatená biologickými substanciami, vyznačujúcimi sa prítomnosťou kovových iónov Fe²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺ komplexovaných s porfyrínovým kruhom, ako i Fe²⁺špecificky naviazaným k molekulám proteínu, čo umožňuje, aby boli odstránené škodlivé zlúčeniny obsiahnuté v cigarete predtým, ako fajčiar inhaluje cigaretový dym. Táto skutočnosť je hlavnou charakteristikou predloženého vynálezu a tvorí nespornú inováciu s veľmi ľahkou priemyselnou využiteľnosťou.

Príklady vyhotovenia vynálezu

Spôsoby priemyselného využitia

Tento vynález bol uskutočnený nasledujúcim spôsobom, pokiaľ ide o jeho priemyselnú využiteľnosť:

Roztok 1 mg/ml hemoglobínu a/alebo lyzátu erytrocytov vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (PBS) s pH 7,4 bol pripravený a pridaný k 100 mg aktivovaného drevného uhlia. Zmes bola inkubovaná 30 min. pri teplote miestnosti a filtrovaná cez S&S Carl Schleier & Schuell Co. USA filtračný papier. Spektrofotometricky bolo stanovené množstvo neabsorbovaného hemoglobínu vo filtráte. Aktívne uhlie, obohatené hemoglobínom, bolo sušené pri teplote miestnosti. Množstvo 200 mg suchého aktívneho uhlia obohateného hemoglobínom bolo umiestnené medzi dva bežné filtre tak, že všetok nasávaný cigaretový dym prichádza do styku s aktívnymi skupinami molekúl (Fe²⁺, Fe³⁺, -SH, -NH₂) (obr. 2). Tieto kompatibilné materiály sú teraz schopné použitia na výrobu nových cigaretových filtrov, ktoré odteraz budú nazývané biologické filtre.

Alternatívne môže byť hemoglobín nahradený biologickými substanciami, charakterizovanými prítomnosťou kovových iónov Fe²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺, komplexovaných s porfyrínovým kruhom, ako i Fe²⁺, naviazaným stereošpecificky k proteínovým molekulám ako je transferín, kataláza, protoporfyrín, cytochróm C, chlorofyl.

Alternatívne bol pripravený roztok 5 mg/ml hemoglobínu a/alebo lyzátu erytrocytov vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (PBS) s pH 7,4 a skanovaný pri 25 C za použitia Acta Beckman záznamového spektrofotometra. Pík absorbancie bol konzistentne pozorovaný pri 540 nm a 575 nm (Smith, R. P., Kruzsyma, H., J. Pharmacol. Exper. Ther. 191, 557 - 563, 1974). Bežne dostupné cigaretové filtre boli impregnované týmito roztokmi a boli sušené pri 25 až 35 C. Tieto kompatibilné materiály sú teraz pripravené na použitie pri výrobe nových cigaretových filtrov, ktoré budeme označovať ako biologické filtre. Tieto nové biologické filtre zaisťujú, že sa dym, ktorý je inhalovaný, dostáva plne do kontaktu s aktívnymi skupinami hemoglobínových molekúl a/alebo lyzátu vo filtri bez zmeny fyzikálnych vlastností alebo chuti cigaretového dymu.

Z estetických dôvodov môže byť malá časť (3 mm) bežného filtra prispôsobená viditelnému koncu biologického filtra.

Alternatívne priemyselné metódy zahrňujú nasledujúce:

Bol pripravený roztok 5 mg/ml protoporfyrín v roztoku pufra (PBS) pH 7,3 záznamového ultrafialovým fluorescenciu impregnované horúcim vzduchom (25 - 35 “C).

a skanovaný pri 25 spektrofotometra.

žiarením (498 medzi 620 - 630 (namočením) vyššie “C za použitia Acta Beckman Excitácia protoporfyrínu 408) produkuje oranžovočervenú nm. Bežné filtre boli potom uvedeným roztokom a sušené

Alternatívne sa skanuje roztok 5 mg/ml transferínu v PBS pH

7,4 za použitia Acta Beckman záznamového spektrofotometra. Železitý transferín vykazuje charakteristické spektrum pri 470 nm. Boli použité v súčasnosti bežne používané metódy pre impregnáciu bežných filtrov.

Alternatívne sa pripraví roztok 5 mg/ml katalázy v PBS pH

7,4. Postupuje sa ďalej podlá vyššie uvedenej metódy na prípravu biologického filtra.

Alternatívne sa pripraví roztok 5 mg/ml cytochrómu C v PBS pH 7,4. Postupuje sa d’alej podlá vyššie uvedenej metódy pre prípravu biologického filtra.

Alternatívne sa vyššie uvedené biologické substancie umiestnia medzi dva bežné filtre v pevnej forme tak, že všetok cigaretový dym prechádzajúci filtrom prichádza do styku s aktívnymi skupinami molekúl (Fe²⁺, Fe³⁺, -SH, -NH₂).

Analýza výsledkov

Rôzne biologické substancie použité na obohatenie bežných filtrov boli pokladané za zadržiavajúce toxické zlúčeniny (NO, CO, volné radikály, H₂O₂, aldehydy a stopové prvky a nitrózo17 zlúčeniny) z cigaretového dymu v rôznych stupňoch, ako je zrejmé z ďalej uvedenej tabuľky.

Akceptor	NO %	CO %	Voľné radikály %	^H2°2	Aldehydy %	Nitrózozlúčeniny %	Stopové prvky %
hemoglobín	90	90	90	80	90	90	95
transferín	85	90	60	60	60	75	50
kataláza	85	90	90	90	80	80	80
protoporfyrín	85	90	70	80	70	75	80
cytochróm C	85	80	70	80	60	60	70
chlorofyl	15	10	40	15	10	10	80

Bol dosiahnutý vysoký stupeň zadržania vysoko škodlivých zložiek cigaretového dymu a dym z cigarety (20 ml) bol filtrovaný cez biologický filter a porovnávaný s dymom, ktorý bol filtrovaný cez bežný filter (20 ml). Iba 1 ml cigaretového dymu odobraný cez bežný filter bol porovnávaný so 40 ml cigaretového dymu odoberaného cez biologický filter. Je zrejmé, že biologické filtre majú 40-násobnú schopnosť zadržania stopových prvkov v porovnaní s bežnými filtrami.

V nasledujúcom podrobnom popise príkladov sú reprezentatívne výsledky uvedené kvôli lepšiemu pochopeniu aktivity týchto biologických substancií.

a) Identifikácia NO obsiahnutého v cigaretovom dyme s použitím metódy chemiluminiscencie

NO bol identifikovaný s použitím luminolom zosilnenej chemiluminiscenčnej metódy ako je popísané v príkladovej časti.

Obr. 3 a 4 ilustrujú typický experiment identifikácie a hodnotenia NO, ako i jeho zachytenie po priechode cigaretového dymu cez biologický filter. Zdá sa, že viac ako 90 % NO je zachytené hemoglobínom. Účinnosť, biologického filtra je zrejmá zo zachytenia a neutralizácie NO, ktorý bol zahrnutý v toxických reakciách ako buniek plúc, tak v kvapalinách plúc, hlavne ak bol vytvorený silne oxidačným 0N00“.

b) Identifikácia volných radikálov obsiahnutých v cigaretovom dyme za použitia chemiluminiscenčnej metódy

Volné radikály boli identifikované chemiluminiscenčnou odozvou vyvolanou systémom lucigenín/DAMCO po jeho reakcii s volnými radikálmi. Obr. 5 predstavuje charakteristický pík v 2 sekundách chemiluminiscenčnej odozvy, ktorá bola inhibovaná zo 100 % po priechode cigaretového dymu biologickým filtrom. Zachytenie volných radikálov biologickými filtrami naznačuje, že tu dôjde k zníženiu oxidačného stresu v alveolárnych makrofágoch, ktoré je spôsobené bežným cigaretovým dymom.

c) Identifikácia H₂O₂ obsiahnutého v cigaretovom dyme s použitím chemiluminiscenčnej metódy

H₂O₂ bol hodnotený chemiluminiscenčnou odozvou produkovanou systémom izoluminol/mikroperoxidáza. Obr. 6 ukazuje charakteristický pík chemiluminiscencie spôsobenej prítomnosťou H₂0_? v cigaretovom dyme. Za prítomnosti katalázy (100 jednotiek/ml) bola chemiluminiscenčná odozva inhibovaná približne z 90 %. Ak cigaretový dym prešiel biologickým filtrom, bola pozorovaná 80 % redukcia chemiluminiscencie. Systém izoluminol/ mikroperoxidáza je špecifický pre identifikáciu H₂O₂· Volné radikály obsiahnuté v cigaretovom dyme evokujú okamžitú chemiluminiscenciu po svojej reakcii s izoluminolom. Táto okamžitá chemiluminiscencia sa javí ako 10 % celkovej chemiluminiscencie vyvolanej H₂O₂ za prítomnosti volných radikálov, pretože kataláza inhibuje maximálnu chemiluminiscenčnú odozvu až asi 90 %. Retencia H₂O₂ zjavne redukuje ako oxidačný stres, tak produkciu NO alveolárnymi makrofágmi.

d) Identifikácia stopových prvkov a aldehydov obsiahnutých v cigaretovom dyme s použitím enzymatického systému luciferin/luciferáza

Stopové prvky obsiahnuté v cigaretovom dyme boli identifikované ich schopnosťou stimulovať luciferázovú aktivitu. Obr. 7 predstavuje:

1. chemiluminiscenčnú odozvu vyvolanú oxidáciou luciferínu za prítomnosti ATP,

2. zvýšenú chemiluminiscenčnú odozvu za prítomnosti Cd²⁺ iónov (0,5 mg),

3. zvýšenú chemiluminiscenčnú odozvu za prítomnosti Cu²⁺ iónov (0,5 mg),

4. zvýšenú chemiluminiscenčnú odozvu spôsobenú cigaretovým dymom (1 ml) a

5. inhibíciu chemiluminiscenčnej odpovede (s ohladom na odpoveď spôsobenú cigaretovým dymom) vyvolanej 40 ml cigaretového dymu po jeho priechode biologickým cigaretovým filtrom. Je zrejmé, že chemiluminiscenčné odozvy, spôsobené stopovými prvkami obsiahnutými v bežnom cigaretovom dyme, sú viac ako 40krát vyššie ako u dymov, ktoré prechádzajú biologickým filtrom. Odstránenie stopových prvkov biologickými filtrami môže mať ako krátkodobé, tak dlhodobé účinky. Krátkodobé účinky môžu vyvolať inhibíciu poškodenia zložiek a substancií v krvi (Cd).

Aldehydy obsiahnuté v cigaretovom dyme boli identifikované a hodnotené za použitia rovnakého enzymatického systému luciferín/luciferáza za neprítomnosti ATP. Aldehydy sú schopné spôsobiť oxidáciu luciferínu. Obr. 8 predstavuje charakteristickú chemiluminiscenčnú odozvu, ktorá by mala byť najmenej väčšia ako hodina. Chemiluminiscenčná odozva bola inhibovaná zo 100 %, ak použitý cigaretový dym prechádza biologickým filtrom, čo znamená, že účinnosť biologického filtra pre odstránenie toxických aldehydov je podstatná.

e) Identifikácia nitrózozlúčenín v cigaretovom dyme

Identifikácia nitrózozlúčenín obsiahnutých v cigaretovom dyme bola dosiahnutá hodnotením pomalého uvolňovania NO z nitrózozlúčenín po ich spracovaní s Η₂Ο₂· Ako je znázornené na obr. 9, bol pík chemiluminiscenčnej odpovede získaný za približne

900 sekúnd. Priechod cigaretového dymu biologickým filtrom ukazuje 90 % inhibiciu v pozorovanej chemiluminiscenčnej odpovedi a jej pík sa objavuje za približne 1 200 sekúnd. Pomalé uvolnenie

NO nitroprusidom sodným (SNP) po jeho spracovaní s H₂O₂ je rovnako znázornené. Obr. 10 predstavuje pomalé uvolňovanie NO ako z nitrózozlúčenin dietylnitrózoamínu a dimetylnitrózoamínu, tak hemoglobínom obohatených nitrózozlúčenin z cigaretového dymu spracovaného s H₂O₂. Je zrejmé, že NO uvoínený nitrózozlúčeninami z cigaretového dymu, ktoré vytvorili adukty s hemoglobínom, prebieha rovnako ako uvolnenie NO u nitrózozlúčenin dietylnitrózoamínu a dimetylnitrózoamínu. Obr. 11 predstavuje uvolnenie NO nitrózozlúčeninami cigaretového dymu, ktoré vytvorili adukty s hemoglobínom po - nitrózozlúčenina ožiarené UVB Uvolnenie NO bolo hodnotené za chemiluminiscenčnú odpoveď za 1 tom, čo boli adukty hemoglobín (100 mJ/cm²) jednu minútu, prítomnosti H₂O₂ a poskytlo sekundu. Postupné zvyšovanie, pozorované na obr. 11, je spôsobené pôsobením H₂O₂ na hemoglobín (Fenton reakcia).

f) Produkcia NO plúcnymi makrofágmi

Boli vykonané pokusy in vitro s pomocou špeciálnej komory, ktorá bola vytvorená v našom laboratóriu a ktorá je uvedená na obr. 1. Teflónová membrána, oddeľujúca dva priestory v komore, je priepustná pre plynný NO a nepriepustná pre N0₂” a ONOO“. Kludové plúcne makrofágy, izolované ako je popísané v príkladovej časti, boli suspendované v HBSS pufrovom roztoku (1 x 1 %⁶ buniek/ml) a umiestnené do priestoru A komory. Do priestoru B komory sa umiestni 2,5 ml Griessovho činidla alebo činidla sulfaniamid/scopoletín. NO uvoínený makrofágmi v priestore A difunduje cez teflónovú membránu do priestoru B a viaže sa s Griessovým a/alebo sulfamid/scopoletín činidlom, v ktorých sa zachytí. Toto znamená, že plúcne makrofágy produkujú plynný NO. Množstvo NO aktuálne prítomného v priestore B sa potom stanoví spektrofotometricky alebo fluorofotometricky. Množstvá ONOO“ a NO₂, obsiahnuté v priestore A komory, sa tiež stanovia za použitia Griessovho a/alebo sulfamid/scopoletín činidla. Vyššie uvedené pokusy boli opakované po podnete makrofágov cigaretovým dymom pred ich umiestnením do priestoru A. Výsledky, ako je znázornené- na obr. 12, ukazujú, že cigaretový dym znižuje množstvo produkovaného NO, zatial čo sa zvyšuje produkcia 0N00“ v plúcnych makrofágoch, čo nepriamo indikuje obrovskú produkciu ako NO, tak 0₂“, ktoré interagujú za vzniku 0N00“.

Opakovanie vyššie uvedených (t.j. v ktorých bol filter) ukazuje, sú filtrov biologický substancie, v priestore pokusov za použitia biologických cigaretový dym odoberaný cez že ak sú použité biologické produkované rovnaké množstvá N0₂” ^a 0N00

A a podobné množstvá NO v priestore B, ako by makrofágy neboli podnietené cigaretovým dymom. V tejto súvislosti boli tiež zložky Griessovho činidla použité na hodnotenie kinetík nitrozácie medziproduktom (mi) generovaným počas N0/0₂ reakcie vo vodnom roztoku pri fyziologickom pH. Prídavok cigaretového dymu (50 ml) k 100 mM fosfátovému roztoku pH 7,4, obsahujúcemu 25 mM sulfanilamidu a 2,5 mM N-(l-naftyletyléndiamín)-dihydrochlorid (NEDD) generuje absorpciu pri lambda_raax=496 indikujúcej charakteristiku azoproduktu vzniknutého z nitrácie. Za uváženie stoja dôsledky týchto pozorovaní vis-a-vis k očakávaným reaktivitám NO za podmienok, zodpovedajúcich fyziologickým, kde maximálne koncentrácie NO v bunečnom mikroprostredí sú predpokladané v rozmedzí 0,5 až 10 μΜ. NO koncentrácie sú výrazne zvýšené počas fajčenia cigarety so škodlivými vplyvmi na bunky plúc.

g) Oxidačný stres plúcnych makrofágov výsledky účinkov cigaretového dymu na oxidačný stres plúcnych makrofágov sú ilustrované na obr. 13. Hodnotenie oxidačného stresu s použitím t-BHP ukazujú, že cigaretový dym spôsobuje dvojnásobný oxidačný stres ako prebieha u nevystavených makrofágov. Ak cigaretový dym prešiel biologickým filtrom, bol pozorovaný oxidačný stres podobný stresu u nevystavených plúcnych makrofágov. Je tak jasne indikovaná eliminácia oxidačného stresu indukovaného cigaretovým dymom u makrofágov. Cigaretový dym je teraz zbavený substancií, ktoré spôsobujú oxidačný stres u pľúcnych makrofágov.

h) H₂O₂ produkovaný pľúcnymi makrofágmi

H₂O₂ produkovaný makrofágmi vystavenými cigaretovému dymu vykazujú viac ako 10-násobnú produkciu ako je to u nevystavených makrofágov. Použitie biologického filtra ukazuje zníženie produkcie H₂O₂ o 90 % (obr. 14) v porovnaní s bežnými filtrami. Je zrejmé, že ako cigaretový dym vyvoláva oxidačný stres u makrofágov, zvyšuje sa produkcia toxického H₂O₂ v týchto bunkách.

i) Rekonštitučné pokusy

Množstvo cyklickej GMP produkovanej NO uvolneným alveolárnymi makrofágmi bolo stanovené za použitia komory uvedenej na obr. 1, kde bola rozpustná guanylát cykláza umiestnená do priestoru A a alveolárne makrofágy boli umiestnené do priestoru B. Množstvá NO produkovaného makrofágmi boli stanovené počas 50 minút s a bez buniek vystavených cigaretovému dymu. Makrofágy vystavené cigaretovému dymu (10 ml) uvolňujú približne desaťkrát menšie množstvo NO vzhladom k neošetreným bunkám, čo predstavuje lOkrát menšiu produkciu cyklického GMP. Vyššie uvedený postup bol opakovaný s použitím cigaretového dymu prechádzajúceho biologickým filtrom. Ukazuje sa štatisticky nevýznamný rozdiel vzhladom k nevystaveným makrofágom (kontrola) (obr. 15). Akumulácia NO v priestore B bola zvýšená viac ako 5krát, ak alveolárne makrofágy boli spracované s H₂O₂ (5 mM) (obr. 6). Toto potvrdzuje, že H₂O₂ zvyšuje produkciu NO mechanizmom pozitívnej spätnej väzby. Dráha L-arginín/NO v makrofagoch je v súlade s myšlienkou, že cigaretový dym spôsobí uvoľnenie NO/ONOO.

k) Identifikácia oxidu uholnatého (CO) v cigaretovom dyme

Prítomnosť CO v cigaretovom dyme bola stanovená s použitím biologickej metódy založenej na stimulácii rozpustnej guanylát cyklázy pomocou CO.

Zavedenie HBSS nasýteného cigaretovým dymom do priestoru A komory, za prítomnosti superoxidu tak, že neutralizuje NO a zavedenie rozpustnej guanylát cyklázy do priestoru B vedie k zvýšeniu produkcie cyklickej GMP spôsobenej difúziou CO z priestoru A do priestoru B. Priechod cigaretového dymu biologickým filtrom redukuje množstvo produkovaného cyklického GMP približne o 80 % (obr. 17). Vyššie uvedené údaje naznačujú, že sú škodlivé zložky NOx a CO obsiahnuté v cigaretovom dyme zadržané a neutrálizované biologickými filtrami.

In vivo pokusy

a) Najprv bola potvrdená prítomnosť NO a ONOO“ v exhalovanom cigaretovom dyme. NO bol identifikovaný v exhalovanom cigaretovom dyme u ľudských dobrovoľníkov, fajčiacich cigaretu nesúcu bežný filter, po zavedení exhalovaného dymu do kyslého roztoku (50 ml) pH 4. NO koncentrácia bola hodnotená luminolom zvýšenou chemiluminiscenčnou metódou popísanou v pokusnej sekcii, za použitia štandardných kriviek pripravených s komerčným NO. Bola zistená NO koncentrácia 0,045 mM. Pokusy boli opakované za použitia biologických filtrov a NO koncentrácia v inhalovanom dyme bola približne o 70 % nižšia v porovnaní s bežným filtrom (obr. 18). Koncentrácia ONOO“ bola stanovená za použitia roztoku NaOH 1,2M a ukazuje zvýšenie v absorpcii pri 303 nm (obr. 19) (£3Q3_nm = 1670 m^-1cm^-1). Naše pokusy ukazujú, že počas fajčenia obsahuje exhalovaný dym veľké množstvá ONOO“ (priechod 50 ml exhalovaného dymu do 5 ml NaOH 1,2M, poskytne roztok 0,9 mM ONOO“). Pomer NO/ONOO“ v exhalovanom dyme bol stanovený 1 : 20.

Preto sa zdá, že NOx je v pľúcach transformovaný na ONOO“ pri reakcii so superoxidom v pľúcach. Superoxid je uvoľňovaný z obidvoch makrofágov a redox reakcie sa objavujú v pľúcach počas fajčenia. Cigaretový dym odoberaný pumpou, neobsahuje ONOO“, avšak mnoho NOx reaguje so superoxidom alebo kyslíkom za vzniku nitritových iónov (N02~). ONOO” sa tvorí iba vtedy, keď cigaretový dym vstupuje do pľúc. Použitie biologických filtrov redukuje exhalované množstvá NO a ONOO“ o 70 %.

b) ONOO“ reaguje s hydrogénuhličitanovými iónmi ľudských erytrocytov podľa rovnice

ONOO + HCO₃ -------> HCO₃ + NO₂ + OH

Hydrogénuhličitanové ióny oxidujú luminol, ako i aromatické a heterocyklické molekuly. Alternatívne môže ONOO“ peroxidovať hydrogénuhličitan na peroxyhydrogénuhličitan - ďalší silne oxidačný druh. Na druhej strane superoxid dismutáza (SOD) katalyzuje nitráciu ONOO a široký okruh fenolických zlúčenín vrátane tyrozínu v proteínoch.

Je tu teda niekoľko potenciálnych mechanizmov, ktorými hydrogénuhličitan a SOD by mohli ovplyvňovať celkovú reaktivitu ONOO v bunkách. Prítomnosť ONOO vytvoreného v pľúcach inhaláciou cigaretového dymu, vykazuje výrazné zvýšenie oxidačného stresu u erytrocytov, ktorý bol detegovaný chemiluminiscenčnou odozvou, objavujúcou sa v priebehu 5 sekúnd. Rovnako pokus vykonaný s použitím biologického filtra vedie väčšinou k 100 % inhibicii oxidačného stresu u ľudských erytrocytov (obr. 2). Hemoglobín alebo erytrocytové lyzáty, vystavené ONOO (obsiahnutý v exhalovanom cigaretovom dyme), vyvolávajú odstránenie dvoch píkov pri 540 a 575 nm, normálne pozorovaných u hemoglobínu. Výsledky podobné ako sú vyššie popísané, boli dosiahnuté u 12 dobrovoľníkov a sú uvedené na obr. 21. Ak hemoglobín a/alebo lyzát boli vystavené malému množstvu exhalovaného dymu (10 ml), bol pozorovaný posun píkov z 540 a 575 na 525 a 555 nm v súlade s tvorbou nitrozylhemoglobínu. Pokusy boli opakované za použitia biologických filtrov. Pozorované piky si zachovávajú svoje charakteristické vlnové dĺžky.

c) Aldehydy boli identifikované v exhalovanom dyme íudských dobrovolníkov pomocou ich charakteristických chemiluminiscenčných píkov. Pokusy boli opakované s použitím biologických filtrov a bola pozorovaná 90 % redukcia chemiluminiscenčnéj odpovede pozorovanej pri použití bežného filtra (obr. 22). Je zrejmé, že biologické filtre odstraňujú a neutralizujú aldehydy v cigaretovom dyme, pretože zadržiavajú oxidanty, a tak zjavne inhibujú iniciáciu redox reakcií, prebiehajúcich v píúcach, ktoré by mohli viesť k produkcii endogénnych aldehydov.

d) Volné radikály boli identifikované v cigaretovom dyme od ludských dobrovolníkov, pomocou charakteristických chemiluminiscenčných píkov týchto látok. Dobrovolníci použili cigarety s bežnými a biologickými filtrami. Boli požiadaní o vyfukovanie dymu (50 ml) do kyslého roztoku (0,01N HC1) (50 ml) pH 6 a po 5 min. a 60 min. bola stanovená chemiluminiscenčná odozva. Pri pH 6 sa vydychovaný ONOO“ spontánne rozkladá. V priebehu 5 min. vznikne 160 % zvýšenie chemiluminiscenčnej odozvy vo vydychovanom dyme prešlom cez bežný filter v porovnaní s cigaretovým dymom, prešlým cez biologický filter (obr. 23). Ak nasýtenie vydychovaným dymom bolo nechané jednu hodinu, zvýšil sa rozdiel v chemiluminiscenčnej odozve zo 160 % na 250 % (obr. 24). Toto je v súlade s myšlienkou, že redox reakcie prebiehajú kontinuálne v cigaretovom dyme cez chinónové radikály a produkujú série aktivovaných druhov kyslíka, ktoré spôsobujú biologické poškodenie.

Komentár

Naše štúdie ukázali, že alveolárne makrofágy umožňujú endogénnu NO syntézu, podobne ako iné bunky a sú schopné uvoľňovania NO/ONOO“ po predĺženú dobu po vystavení cigaretovému dymu. Ďalej, len čo sa týmito bunkami začne uvoíňovať NO, stáva sa produkcia NO samostatnou i po odstránení stimulu. Takáto reakcia je pripočítaná schopnosti NO z cigaretového dymu stimulovať alveolárne makrofágy pre uvolnenie NO a 0N00“ po dobu niekoľko hodín po odstránení stimulu. Reakcia môže byť iniciovaná produkciou H₂O₂ v pľúcach po stimulácii alveolárnych makrofágov cigaretovým dymom. H₂O₂ stimuluje NO syntázovú aktivitu pľúcnych buniek za vzniku NO a ONOO“ po dobu viac ako jednu hodinu po odstránení stimulu. Naše pokusy skutočne ukázali, že priechod cigaretového dymu cez biologický filter vedie k 90 % redukcii (v porovnaní s bežným filtrom) oxidačného stresu v krysích alveolárnych makrofágoch. ONOO“ radikál vytvorený v pľúcach môže umožniť atak a inaktivovať al-proteínazainhibítor (alPI). Inhibícia alPI v ľudských pľúcach často spôsobí émfyzém, pri ktorom je znížená kapacita pľúc. Štatistické údaje naznačujú, že fajčenie je predpokladom pre vývoj emfyzému (Southon, P.Ä., Pwis, G., Free Radicals in Medicíne, Involvment in Human Disease. Mayo Clin. Proc. 63, 390 - 408, 1988). V in vivo pokusoch, vykonaných na 12 dobrovoľníkoch fajčiaroch, bolo preukázané 90 % zníženie exhalovaného NO/ONOO“, ak inhalovaný cigaretový dym prešiel biologickým filtrom.

Kyslíkové voľné radikály boli tiež zahrnuté v patogenéze IgA imunitným komplexom vyvolanej alveolitis. Predchádzajúce ošetrenie zvierat superoxid dismutázou, katalázou, chelátorom železa desferioxaminom alebo akceptorom hydroxylových radikálov DMSO, potláča vývoj poškodenia pľúc. Naopak, sú pľúca neošetrených pozitívnych kontrolných zvierat charakterizované prítomnosťou zvýšeného počtu alveolárnych makrofágov. Intc-.rsticiálny edém a hemorágia sú rovnako prítomné. Ďalej v tomto modeli pľúc je tiež L-arginín vysoko protektívny, ako je demonštrované redukciou vaskulárnej permeability, vaskulárneho krvacania a poškodenia vaskulárnych endoteliálnych a alveolárnych epiteLiáIných buniek. Tieto zistenia naznačujú, že makrofágy sú zdrojom nebezpečenstva vyvolávaného NO, ®2~ t ^H2°2 ^{a 0H}zlúčeninami (Mullingan, M. S., Johnson, K. J., Ward, P.A. v Biological Oxidants: Generation and Injurious Consequences (vycl. Cochrane, C. G. a Gilbrone, M. A., Jr. Academic Press 157

- 172, 1992).

Retencia a neutralizácia oxidantov obsiahnutých v cigaretovom dyme biologickými filtrami môže hrať podstatnú úlohu v znížení aktivity redox enzýmov, ktoré sú v priamom vzťahu k oxidačnému stresu v pľúcnych bunkách.

Biologické filtre drasticky redukujú oxidačný stres spôsobený inhalovaným cigaretovým dymom. Oxidačný stres a endoteliálnych bunkách pľúcnych ciev v pľúcnych makrofagoch môže byť vyvolaný NO, NOx kyslíkovými radikálmi a/alebo aldehydmi obsiahnutými v cigaretovom dyme. Ďalej retencia aldehydov a stopových prvkov (hlavne Cd) biologickými filtrami môže mať žiaduce dlhodobé účinky pri ochrane plazmových antioxidantov a pri inhibícii vývoja aterosklerózy. Hemoglobín obsahuje niekoľko neutrofilných centier, ktoré podliehajú kovalentným reakciám s elektrofilmi. Tieto centrá indukujú N-koncové valínové zvyšky na aa β-reťazca, Ml a N3 atómy histidínových zvyškov a sulfhydrylové skupiny cysteínových zvyškov. Karcinogénna zlúčenina 4-(metylnitrózoamín)-1-(3-pyridyl)-1-butanón (NNK), prítomná v tabaku, je transferovaná do dymu počas horenia cigarety a jej hladiny v hlavnom prúde dymu sa môžu meniť od 4 do 1 700 ng na cigaretu. NNK môže tvoriť adukty s hemoglobínom (Hecht, S. S., Karan, S. a Carmella, S. G., v Human carcinogen expose, vyd. Garmer, R. C., Farmer, P. B., Steel, G. I. a Wricht A.l S., IRL Pre.¹, s, str. 267 - 274, 1991). Je jasné, že jedinou cestou k vylúčeniu tabakom vyvolávaných chorôb je zdržať sa žuvania tabaku a fajčenia. Avšak štatistiky súčasných fajčiarov naznačujú, že je treba urobiť veľa pre zníženie vystavenia tabakovým karcinogénom a pre modifikáciu ich spôsobu pôsobenia. Základné priblíženie k tomuto cieľu predstavujú: 1. modifikácia tabakových produktov, 2. inhibícia metabolickej aktivácie tabakových karcinogénov a ich endogénnej tvorby určitými mikroa makroživinami a chemopreventívnymi činidlami a 3. zadržanie tabakových karcinogénov použitím špecifických filtrov, ktoré budú obsiahnuté v tabaku cigariet. Náš vynález použitím biologických substancii pre výrobu biologických filtrov konečne zahrňuje objav, že nitrózozlúčeniny, prítomné v inhalovanom cigaretovom dyme·, sú odstránené biologickými substanciami, čo chráni zdravie nielen fajčiarov, ale i nefajčiarov.

Claims

1. Filter pre filtráciu tabakového dymu, ktorý obsahuje vláknitú matricu obohatenú biologickou substanciou, vybranou z jednej alebo viacerých substancii, zahrňujúcich železo, med a/alebo horčík, komplexovanú s porfyrínovým kruhom a železa naviazaného stereošpecificky v proteínových molekulách.

2. Filter podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aktívne uhlie obohatené biologickou substanciou.

3. Filter podlá nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že k uvedenej obohatenej vláknitej matrici prilieha vláknitá matrica, ktorá nie je obohatená uvedenou biologickou substanciou.

4. Filter podlá ktoréhokoľvek z sa tým, že biologická substancia lyzát erytrocytov.

5. Filter podlá ktoréhokoľvek z sa tým, že biologické substancie sú iónov naviazaných stereošpecificky nárokov 1 až 3, vyznačujúci zahrňuje hemoglobín a/alebo nárokov 1 až 3, vyznačujúci vybrané zo železnatých Fe²⁺k jednému alebo viacerým z transferínu, katalázy, protoporfyrinu, cytochrómu C a chloro fylu.

6. Filter podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že biologická substancia je v pevnej forme.

7. Cigareta, vyznačujúca sa tým, že je opatrená filtrom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6.

8. Spôsob výroby filtra tabakového dymu podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, zahrňujúci impregnáciu bežného filtra tabakového dymu jednou alebo viacerými uvedenými biologickými substanciami.

9. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že filter obsahuje aktívne uhlie.

10. Spôsob podlá nároku 8 alebo 9, vyznačujúci sa tým, že biologická substancia zahrňuje hemoglobín a/alebo lyzát erytrocytov.

11. Spôsob podlá ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10, vyznačujúci sa tým, že biologická substancia je poskytnutá ako

1-10 mg/ral roztok vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku, majúcom pH 7,4.

12. Spôsob filtrácie tabakového dymu, zahrňujúci poskytnutie filtra podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 6 a priechod tabakového dymu týmto filtrom.

13. Spôsob podlá nároku 12, vyznačujúci sa tým, že filter zadržiava od 15 do 90 % NO, 10 až 90 % CO, 40 až 90 % voľných radikálov, 10 až 90 % aldehydov, 10 až 90 % karcinogénnych nitrózozlúčenin, 15 až 90 % H₂O₂ a 50 až 95 % stopových prvkov prítomných v tabakovom dyme pred priechodom filtrom.

14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že filter zadržiava od 85 do 90 % NO, 80 až 90 % CO, 60 až 90 % volných radikálov, 60 až 90 % aldehydov, 60 až 90 % karcinogénnych nitrozozlúčenin, 60 až 90 % H₂O₂ a 70 až 95 % stopových prvkov prítomných v tabakovom dyme pred priechodom filtrom.