PL174430B1

PL174430B1 - Sposób wytwarzania filtra do filtrowania dymu tytoniowego posiadającego osnowę włóknistą

Info

Publication number: PL174430B1
Application number: PL94313224A
Authority: PL
Inventors: Ioannis Stavridis; George Deliconstantinos
Original assignee: George Deliconstantinos; Ioannis Stavridis
Priority date: 1994-06-27
Filing date: 1994-06-27
Publication date: 1998-07-31
Also published as: US5909736A; RO117412B1; DK0720434T3; KR100302955B1; MD1912C2; LV11520A; MD1912B2; DE69429726T2; AU6979394A; ES2171452T3; NO306595B1; ATE212196T1; FI960904A; NO960778D0; SK26196A3; JPH09504439A; NO960778L; BG100404A; FI960904A0; SI0720434T1

Abstract

1. Sposób wytwarzania filtra do filtrowania dymu tytoniowego posiadajacego osnowe wlóknista, znamienny tym, ze wzbogaca sie filtr w substancje biologiczna wybrana sposród jednej lub wiekszej liczby substancji zawierajacych zelazo, miedz i/lub magnez skomplekso wane z pierscieniem porfirynowym i zelazo stereospecyficznie zwiazane w czasteczkach bialka, przy czym material filtra impregnuje sie jedna lub kilkoma wymienionymi sub- stancjami i filtruje sie otrzymany material aby usunac niezaabsorbowane substancje biologiczne. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania filtra do filtrowania dymu tytoniowego posiadającego osnowę włóknistą, ograniczającego wdychanie szkodliwych związków, takich jak tlenki azotu, wolne rodniki, aldehydy, nadtlenek wodoru, tlenek węgla, pierwiastki śladowe i rakotwórcze lotne związki nitrozowe, podczas palenia papierosów. Dotychczas substancje te nie są skutecznie zatrzymywane przy użyciu znanych filtrów papierosowych.

W ogromnej ilości publikacji ogłaszanych w czasopismach międzynarodowych wykazuje się, że dym papierosowy rozdziela się na dwie fazy: a) fazę stałą (smołę) i b) fazę gazową. Rozdział taki następuje wówczas, gdy stosuje się typowy filtr z włókna szklanego typu Cambridge, zatrzymujący 99,9% cząstek o wielkości większej od 0,1 pm. Smoła papierosowa zawiera wyjątkowo wysokie stężenia bardzo trwałych wolnych rodników, które można zaklasyfikować do co najmniej czterech różnych kategorii. Semichinony w równowadze z chinonem i hydroksychinonami uważa się za wolne rodniki o najbardziej interesujących własnościach chemicznych. Układ chinonowy redukuje tlen cząsteczkowy z utworzeniem ponadtlenku (O2), który w wyniku samorzutnej dysmutacji tworzy nadtlenek wodoru (H2O2). W fazie gazowej występuje ponad 10¹⁵ rodników organicznych wdychanych w jednym pociągnięciu dymu o czasie półtrwania poniżej jednej sekundy. Pomimo tak krótkiego czasu półtrwania, paradoksalnie, rodniki te mogą utrzymywać wysokie poziomy aktywności w fazie gazowej w czasie dłuższym niż 10 minut. W rzeczywistości, stężenie tych rodników znacznie się zwiększa przy zbliżaniu się do końca filtra papierosowego. To paradoksalne zjawisko tłumaczy się utrzymywaniem się stanu ustalonego w wyniku ciągłego wytwarzania wolnych rodników (Pryor W. A., Stone K., Ann. N. Y. Acad. Sci. 686: 12-28, 1993).

174 430

Tlenek azotu (NO) jest najważniejszym wolnym rodnikiem występującym w fazie gazowej dymu papierosowego. Rodnik ten, podczas palenia uczestniczy w ciągu reakcji, w których kolejno powstają dwutlenek azotu, rodniki izoprenowe, rodniki nadtlenkowe i rodniki alkoksylowe. Dym papierosowy zawiera również znaczną ilość aldehydów mających swój udział w jego niszczącym działaniu toksycznym. Wykazano, że nawet bardzo małe ilości aldehydów ekstrahowanych z dymu papierosowego wywołują zarówno reakcje kataboliczne jak i utlenianie grup tiolowych w białkach osocza. Te właściwości aldehydów są wynikiem reakcji między grupą karbonylową tych aldehydów z grupami -SH i -NH 2 białek osocza. Przykładowo, akroleina z dymu papierosowego szybko reaguje z grupami -SH tworząc związki karbonylowe (Alving K., Forhem C. i Lundberg J. M., Br. J. Pharmacol. 111993). W smole z dymu papierosowego znajdują się pierwiastki śladowe, np. żelazo, miedź, mangan i kadm, zaangażowane w wiele reakcji, w których powstają wolne rodniki i prowadzące do tworzenia się wysoce aktywnych rodników drugorzędowych (np. rodników nadtlenkowych, rodników alkoksylowych, ponadtlenków, cytotoksycznych aldehydów i podobnych). Wprowadzenie pierwiastków śladowych do płuc podczas palenia papierosów prowadzi do serii reakcji oksydoredukcyjnych zarówno w płynach płuc jak i w makrofagach pęcherzyków płucnych, w wyniku czego powstają bardzo aktywne rodniki hydroksylowe ( -OH'). Te rodniki hydroksylowe tworzą się głównie w obecności żelaza w reakcji Fentona. Miedź może również tworzyć rodniki hydroksylowe na drodze reakcji z nadtlenkiem wodoru w płucach. Mangan, w niskich stężeniach (l0'⁷ M), stymuluje rozpuszczalną cyklazę guanylanową komórek śródbłonkowych płuc, wywołując powstawanie tlenku azotu i ponadtlenku na drodze reakcji przebiegającej według mechanizmu sprzężenia zwrotnego dodatniego (Youn Y. K., Lalonde C., Demling R., Free Rad. Biol. Med. 12: 409-415, 1992).

Podczas tlenia się papierosa powstaje tlenek węgla. Znaczna ilość CO pozostaje w płucach nawet po wydechu, w wyniku czego zachodzi stymulacja rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej po jej reakcji z resztą hemową enzymów komórek śródbłonkowych i innych komórek tkanki płucnej. Zwiększone poziomy cyklicznego GMP w komórkach w połączeniu z mechanizmem dodatniego sprzężenia zwrotnego dają wzrost produkcji tlenku azotu i ponadtlenku (Watson A., Joyce H., Hopper L. i Pride N. B., Thorax 48: 119-124, 1993). Gazowy NO, który może być wytwarzany przez wiele typów komórek włącznie z komórkami śródbłonka komórek naczyń krwionośnych i komórek śródbłonka układu siateczkowego, powoduje rozluźnienie mięśni gładkich (Lowenstein C. J., Dinerman J. L., Snyder S. H., Ann. Intern. Med. 120:227-237,1994). Istnieją również egzogenne źródła NO. Uważa się, że są one w podobny sposób odpowiedzialne za powodowanie uszkadzania naczyń krwionośnych i innych tkanek. Jednoznacznie ustalono, że drugorzędowe i trzeciorzędowe aminy mogą reagować z azotynem i z innymi środkami nitrozylującymi, w wyniku czego powstają N-nitrozoaminy (Lowenstem C. J., Dinerman J. L., Snynder S. H., Ann. Intern. Med. 120:227-237,1994). Począwszy od 1974 roku, w wielu pracach wykazano, że podczas zbioru i przerobu tytoniu, a następnie podczas jego palenia, obecne w nim alkaloidy ulegają nitrozowaniu do specyficznych dla tytoniu N-nitrozoamin (TSNA). Spośród związków zidentyfikowanych w tytoniu i/lub w dymie tytoniowym silnymi środkami rakotwórczymi dla zwierząt okazały się: N-nitrozonornikotyna(NNN), 4'-(metylonitrozoamino)-1-(3-pirydylo)-1-butanon(NNK) i 4-(metylonitrozoamino)-1-(3-pirydylo)-1-butanol(NNAL). NNN wywołuje raka płuc u myszy, raka tchawicy u chomików i nowotwory jamy nosowej i raka przełyku u szczurów. NNK powoduje nowotwory płuc u myszy, chomików i szczurów a także nowotwory wątroby, jamy nosowej i trzustki u szczurów. Pędzlowanie jamy ustnej mieszaniną NNN i NNK wywołuje nowotwory w jamie ustnej i w płucach szczurów. Typowa ilość NNK i NNN w strumieniu dymu papierosowego wynosi 200 ng/papieros (Hecht S. S., Spratt T. E. i Trushin N., Carcinogenesis 9: 161-165, 1988).

Nasze własne badania nad wpływem dymu papierosowego na tkankę płucną ujawniły, że NO reaguje z ponadtlenkiem tworząc silnie utleniający rodnik, nadtlenoazotyn (ONOo^_), powodujący wtórne, wyniszczające reakcje w kluczowych cząsteczkach biologicznych. Działanie metaboliczne i niszczące NO w komórkach było badane w naszym laboratorium w doświadczeniach in vitro i in vivo.

174 430

W obecności tlenu NO ulega utlenieniu do dwutlenku azotu (NO2). Szybkość tego utleniania zależy od stężenia tlenu i kwadratu stężenia NO. Dwutlenek azotu jest wyraźnie cytotoksyczny, w roztworach wodnych przechodzi w azotyn i w azotan. Ponadto, NO tworzy kompleksy z metalami śladowymi i/lub z metaloproteinami, np. z hemoglobiną (Wink D. A., Darbyshire J. F., Nims R. W., Saavedra J. E. i Ford P. E., Chem. Res. Toxicol. 6: 23-27, 1993).

NO, który reaguje z ponadtlenkiem z wytworzeniem szkodliwego związku ONOO' może tłumaczyć niektóre typy toksyczności ponadtlenków. Biorąc pod uwagę wysoki potencjał utleniający ONOO’ (+1,4 V), jest on nadzwyczaj stabilny. Podczas jego rozkładu powstają silnie utleniające pochodne, w tym rodnik hydroksylowy, dwutlenek azotu i jon nitroniowy. Wskutek tego, każda modyfikacja w powstawaniu NO i ponadtlenku w tkankach może prowadzić do tworzenia się rodników silnie utleniających wtórnie (Deliconstantinos G., Viliotou V., Stavrides J. C., Cancer Mol. Bol. 1: 77-86,1994). W końcu, ONOO’i jego estry (RO-ONO albo RO-ONO2) mają tendencję do powodowania inaktywacji inhibitora alfa-1-proteinazy (a1PI). Można to wytłumaczyć tym, że a) sam nadtlenek wodoru nie powoduje szybkiej inaktywacji inhibitora a1 PI a działajedynie w obecność i NO , prowadząc do powstawania ONOO ’ i szybkiej inaktywacj i a1PI, b) roztwory tert-butylonadtlenoazotynu (RO-O-O-NO2) albo ONOO’ wywołują same inaktywację a1PI i c) aminy i aminokwasy chronią a1PI-proteinazę przed szybką inaktywacją (Moreno J. J. i Pryor W. A., Chem. Res. Toxicol. 5: 425-431,1992). Oprócz wolnych rodników zawartych w dymie papierosowym, innym ważnym źródłem wytwarzania wolnych rodników u palaczy są aktywowane makrofagi pęcherzyków płucnych. Makrofagi pęcherzyków płucnych aktywowane dymem papierosowym ulegają rozrywaniu podczas oddychania, przez co zwiększa się wytwarzanie wolnych rodników tlenowych (głównie O2’, NO i H2O2).

Wykazano, że palacze mają zwiększoną ilość zarówno makrofagów pęcherzyków płucnych jak i krążących neutrofili. Wolne rodniki tlenu w dymie papierosowym również uczestniczą w procesie powstawania nowotworu płuc. Wdychany dym papierosowy powoduje zwiększone utlenianie w komórkach płuc, co powoduje zmniejszenie stężenia wewnątrzkomórkowych substancji antyutleniających. H2O2 reaguje z DNA komórek na drodze produkcji rodników hydroksylowych, powodując przerwanie podwójnej nici. Przerwaniu podwójnej nici DNA można zapobiec przez dodanie katalazy, co pośrednio potwierdza uszkadzające działanie H2O2 i rodników hydroksylowych na komórkowy DNA (Leanderson P., Ann. N. Y. Acad. Sci. 686: 249-261, 1993). Poza tym, H2O2 może powodować zmiany transformacyjne w warstwie śródbłonkowej tchawicy płuc i wiąże się go z rozwojem raka oskrzelopochodnego u palaczy. Tak więc, istnieją przypuszczenia, że H2O2 (zawarty w dymie z papierosów) wywiera niszczące działanie na komórki płuc i odgrywa rolę w rozwoju raka płuc. Smoła z dymu papierosowego zawiera zarówno rodniki semichinonowe jak i żelazo, co daje układ wytwarzania rodników hydroksylowych. Różne pierwiastki śladowe zawarte w smole z dymu papierosowego (Fe, Cu, Mn, Cd) mogą działać zarówno wewnątrzkomórkowo jak i poza komórką. Fe²⁺ w dobrze znanej reakcji Fentona:

Fe2+ + H2O 2-----------------» Fe³⁺ + OH + OH’ powoduje wiele reakcji utleniania przebiegających poprzez rodniki hydroksylowe. Podobne wytwarzanie rodników hydroksylowych można uzyskać stosując Cd2+. Jon Mn2+ jest charakterystycznym stymulatorem aktywności rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej. Cd2+ zawarty w dymie papierosowym jest wyjątkowo toksyczny w stosunku do płuc. W płucach palaczy występuje dwukrotnie większe w stosunku do normy stężenie Cd2+. Przypuszcza się, że Cd2+ wypiera Zn2+ w stanie prawidłowym w śródbłonku naczyń płucnych (Kostial K. w publikacji: Trace Elements in Human and Animal Nutrition, wyd. W. Mertz) wyd. V, tom 2: 319-345, Academic Press, Inc. Orlando, FI., 1986). Obecne w dymie papierosowym aldehydy reagują z grupami -SH i -NH2 białek, powodując, że stają się one obojętne. Aldehyd krotonowy (aldehyd α, β-nienasycony zawarty w dymie papierosowym obniża stężenie grup -SH i zwiększa stężenie białek z grupami karbonylowymi (Stadtman E. R., Science 257: 1220-1224, 1991).

Obecnie poleca się filtry do papierosów. Ostatecznym celem dodawania filtrów do papierosów jest uzyskanie maksymalnej retencji szkodliwych związków występujących żarów174 430 no w fazie gazowej jak i w smole z dymu papierosowego. Badania epidemiologiczne u palaczy wykazały, że istnieje zależna od dawki odpowiedź, niezależnie od tego, czy dym papierosowy był podawany w fazie gazowej, w fazie stałej, czy w fazach połączonych (Surgeon General of the U. S. Public Health Service. The health consequences of using smokeless tobacco, N. H. Publ. nr. 86-2874, Bethesda, MD, 1986). Udowodniono, że modyfikacja papierosa jest sama w sobie praktycznym podejściem do zmniejszenia ilości szkodliwych związków zawartych w dymie papierosowym. Początkowo uzyskano to stosując zwykłe filtry, następnie zmieniając skład tytoniu na drodze przetwarzania chemicznego. Dokonywano również zmiany w procesie wytwarzania papierosów, stosując porowaty papier lub papier sporządzony z liści tytoniowych. W ostatnich 15 latach czyniono wiele wysiłków w celu obniżenia niszczącego wpływu palenia na zdrowie palaczy poprzez: zmniejszenie ilości dymu w jednym papierosie; zmiany średnicy papierosa; przez stosowanie perforowanych filtrów. Filtry perforowane pozwalają na rozcieńczenie dymu papierosowego powietrzem do 50%. W połączeniu z perforowanymi filtrami stosowano również węgiel aktywowany. Było to związane ze znacznym obniżeniem ilości smoły i nikotyny w dymie. Techniki te stosuje się, zwłaszcza w krajach rozwiniętych, takich jak Austria, Kanada, Francja, Niemcy, Szwecja, Wielka Brytania i Stany Zjednoczone Ameryki. Średnią ilość smoły i nikotyny w papierosach amerykańskich obniżono odpowiednio z 38 mg i 2,7 mg w 1955 do 13 mg i 1 mg w 1991 r. W Unii Europejskiej ciągle kontynuuje się prace w kierunku zmniejszenia ilości smoły i nikotyny w dymie papierosowym. Górnym dopuszczalnym limitem dla smoły od stycznia 1993 r jest 15 mg. Ilość ta ma być obniżona do 12 mg do stycznia 1998 roku. Jednakże w innych krajach ilość smoły w dymie papierosowym wynosi 22 mg (Mitacek

E. J., Brun Neman K. D., Pollednak A. P., Hoffman D. i Suttajit M., Prev. Med. 20: 764-773, 1991). Zmiany dokonywane w produkcji papierosów prowadzą do specyficznego usunięcia z dymu papierosowego niektórych substancji toksycznych; wprowadzono zwłaszcza filtry z octanu celulozy, co pozwoliło na częściowe usunięcie trudno-lotnych fenoli i lotnych N-nitrozoamin (Brunnemann K. D., Hoffman D., Recent Adv. Tobacco Res. 17: 71-112, 1989). Tlenek węgla selektywnie redukuje się przez zastosowanie filtrów perforowanych. Stężenie rakotwórczych polijądrowych węglowodorów aromatycznych (PAH) selektywnie obniża się stosując tytoń wzbogacony w azotyn. Jednakże, obniżenie zawartości PAH w tytoniu przez użycie wysokich stężeń azotynu prowadzi do niepożądanego zwiększenia rakotwórczych N-nitrozoamin. Zaistniała więc potrzeba obniżenia stężenia PAH metodami alternatywnymi (Hoffman D., Hoffman I., Wynder E. I., Lung Cancer and the Changing Cigarette in Relevance to Human Cancer of N-nitroso-compounds, Tobacco Smoke and Mycotoxins (wyd. O'Neil, I. K., Chen J., Bartsch H, tom 105: 449-459, 1991).

Z powyższego opisu wyraźnie wynika, że istnieje potrzeba produkowania filtra umożliwiającego zatrzymanie szkodliwych tlenków azotu, wolnych rodników, nadtlenku wodoru, aldehydów i rakotwórczych związków nitrozowych, które są ciągle odpowiedzialne za niszczący wpływ dymu papierosowego na układ oddechowy i sercowo-naczyniowy. W celu identyfikacji tych szkodliwych związków zawartych w dymie papierosowym przeprowadzono badania eksperymentalne chemiczne i biologiczne. Do przeprowadzonych badań chemicznych należały:

a) identyfikacja i oznaczanie ilościowe NO i NOx z zastosowaniem nowej metody chemicznej i biologicznej (metoda ta została opracowana w naszym laboratorium).

b) identyfikacja wolnych rodników metodami chemiluminescencyjnymi wykorzystującymi reakcje zależne od lucygeniny.

c) identyfikacja aldehydów i chinonów przez stymulowanie układu enzymatycznego: lucyferyna - lucyferaza (ta metoda również została opracowana w naszym laboratorium).

d) identyfikacja i oznaczanie ilościowe pierwiastków śladowych metodą utleniania lucyferyny lucyferazą wobec ATP (metoda również opracowana w naszym laboratorium).

e) identyfikacja i oznaczanie ilościowe H2O2 metodą chemiluminescencyjną z wykorzystaniem reakcji zależnej od izoluminomikroperoksydazy.

f) identyfikacja i ilościowe oznaczanie ONOO’ metodą spektrofotometryczną oraz metodą chemiluminescencyjną ze wzmocnieniem luminolem.

g) identyfikacja rakotwórczego związku nitrozowego metodą chemiluminescencyjną ze wzmocnieniem luminolem.

174 430

Przeprowadzono również następujące badania biologiczne:

a) identyfikację NO z zastosowaniem jako parametru funkcji aktywności izolowanej rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej,

b) identyfikację ONOO' przez ocenę utleniania erytrocytów ludzkich indukowanych przez ONOO',

c) identyfikację CO z użyciem jako parametru funkcji aktywności izolowanej rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej.

Ponadto przeprowadzono następujące doświadczenia in vitro:

a) izolację makrofagów z pęcherzyków płucnych szczura,

b) ocenę utleniania makrofagów z pęcherzyków płucnych indukowanego tert-butylowodoronadtlenkiem (t-BHP),

c) oznaczenie NO/NO2^_/ONOO' wytwarzanych przez makrofagi pęcherzyków płucnych,

d) oznaczanie H2O2 wytwarzanego przez makrofagi pęcherzyków płucnych,

e) wpływ egzogennego H 2O2 na powstawanie NO w makrofagach pęcherzyków płucnych.

Doświadczenia in vivo przeprowadzono z udziałem ochotników, oznaczając następujące związki:

a) NO w wydychanym powietrzu nie-palaczy,

b) NO w wydychanym powietrzu palaczy,

c) NO w wydychanym dymie papierosowym,

d) ONOO w wydychanym dymie papierosowym,

e) wolne rodniki w wydychanym dymie papierosowym,

f) aldehydy w wydychanym dymie papierosowym.

W celu oznaczenia NO i NOx zawartych w a) dymie papierosowym, b) uwalnianych przez makrofagi pęcherzyków płucnych po prowokacji dymem papierosowym i c) w dymie papierosowym wydychanym przez ochotników, zaprojektowano i wykonano komorę ze stałych prętów o średnicy 2,5 cm z przezroczystego Plexiglasu. Na jednym końcu każdego pręta wykonano na tokarce otwór, uzyskując identyczne stożkowe wgłębienie w każdym pręcie. Pręty poddano dalszej obróbce maszynowej i polerowaniu na otwartych końcach, wykonując dopasowane połączenie na ucios, tworząc bardzo ścisłe łącze pomiędzy dwoma stożkowymi wgłębieniami. Pomiędzy tymi konstrukcjami umieszczono cienki arkusz teflonu (arkusz politetrafluoroetylenowy o grubości 0,00381 cm) i ściśnięto śrubami skrzydełkowymi. Zainstalowane rurkowe otwory, po dwa z każdej z obu stron membrany, pozwalają na wstrzykiwanie, usuwanie lub modyfikację próbek wykazujących aktywność biologiczną i substancji reaktywnych w przedziałach po obu stronach membrany (fig. 1).

A. Oznaczanie NO metodą chemiluminescencyjną

Standardowy roztwór NO przygotowano według przepisu z piśmiennictwa (Deliconstantinos G., Viliotou V., Fassitsas C., J. Cardiovasc. Pharmacol. 12, S63-S65, 1992 i Deliconstantinos G., Viliotou V., Stavrides J. C., w publikacji: Biology of Nitric Oxide, wyd. Feelish M., Busse R., Moncanda S., Portland Press, w druku). Roztwór reakcyjny składał się z roztworu soli zrównoważonego roztworem Hanka (HBSS) o wartości pH = 7,4, nadtlenku wodoru (500 pM) i luminolu (30 pM) a jego całkowita objętość wynosiła 500 pl. Fiolkę energicznie wytrząsano, po czym notowano emisję w luminometrze Bedrthold'a typu AutoLumat LB953.

B. Chemiczne oznaczanie NO/NO 2

Chemiczne oznaczanie NO oparto na dwuazowaniu sulfanilamidu przez NO w środowisku kwaśnym i następnym utlenieniu skopoletyny, którą można wykrywać fluorometrycznie w sposób opisany uprzednio (Deliconstantinos G., Viliotou V., Fassitsas C., J. Cardiovasc. Pharmacol, 12: S63-S65, 1992). Makrofagi pęcherzyków płucnych w HBSS (10⁶ komórek/ml) mieszano z ilością 100 pl odczynnika składającego się z 20% sulfanilamidu w 20% roztworze H3PO4 i 25 pM skopoletyny. Zanikanie fluorescencji monitorowano w temperaturze pokojowej (22°C) w spektrofotometrze fluorescencyjnym Aminco SPF-500. Fluorescencję monitorowano w sposób ciągły, w funkcji czasu, dopóki dawało się mierzyć nachylenie linii (przez około 8 minut). Wyniki pomiarów nachylenia krzywej przeliczano następnie na nonamole No, stosując do tego celu krzywą standardową sporządzoną na podstawie pomiarów dla różnych stężeń

174 430 czystego NO. Azotyn (NO2’), produkt końcowy syntezy NO, oznaczano wykorzystując jego kumulowanie się w supernatantach hodowanych komórek, prowadząc reakcję azotynu z odczynnikiem Griess'a.

C. Spektroskopowe oznaczanie nadtlenoazotynu (ONOO’)

ONOO' syntetyzowano, miareczkowano i przechowywano w sposób opisany poprzednio (Deliconstantinos G., Viliotou V., Stavrides J. C. w publikacji: Biology of nitric oxide, wyd. Feelish M., Busse R., Moneada S., Portland Press, w druku). Z powodu nietrwałości ONOO’ w środowisku o wartości pH 7,4, pomiary widm UV prowadzono bezpośrednio po zmieszaniu roztworu H2O2 i NO. Stężenie ONOO’ oznaczano w oparciu o wartość ekstrakcji ε302 nm równej 1670 M’¹ cm’¹. Widma UV przedstawiono po odjęciu bazowego widma UV nadtlenku wodoru przy odpowiednich stężeniach.

D. Oznaczanie wolnych rodników

Oznaczanie wolnych rodników prowadzono metodą chemiluminescencji, stosując lucygeninę z indukcją odczynnikiem DAMCO (1,4-diazabicyklo-[2,2,2]oktan), w sposób opisany uprzednio (Deliconstantinos G., Krueger G. R. F., J. Viral Dis. 1:22-27, 1993). Mieszanina reakcyjna zawierała HBSS (pH 7,4), lucygeninę (30 pM) i odczynnik DAMCO (100 pM). Fiolkę energicznie mieszano i notowano emisję w luminometrze Bedrtholda typu AutoLumat LB953. Jako utleniaczy wolnych rodników użyto SOD (dysmutazę ponadtlenkową), mannitol, histydynę i metioninę.

E. Oznaczanie pierwiastków śladowych i aldehydów

Oznaczenia oparto na katalizowanym lucyferazą utlenianiu D-lucyferyny wobec soli magnezowej ATP, przebiegającym według reakcji:

lucyferaza

LH2+ATPMg²⁺+O2------------------>Oksylucyfeiyna+ATP+O2+Ppi+Mg²⁺+światło

Pierwiastki śladowe Cd2+, Cu2+, Fe2+ zwiększają aktywność lucyferazy i zwiększa się maksymalna odpowiedź chemiluminescencyjna proporcjonalnie do stężeń pierwiastków śladowych aż do wartości 10 pg. Reakcje przebiegają w HBSS (pH 7,4) w całkowitej objętości 0,5 ml roztworu.

Do oznaczania aldehydów użyto taki sam układ enzymatyczny: lucyferyna/lucyferaza, ale reakcję prowadzono w nieobecności ATP. Aldehydy reagują z układem enzymatycznym powodując chemiłuminescencję bez obecności ATP. Użyte odczynniki pochodziły z zestawu do oznaczania ATP (Calbiochem-Novabiochem CA, Stany Zjednoczone).

F. Izolowanie makrofagów pęcherzyków płucnych

Pokrótce, szczury zabijano przez dożylną iniekcję soli sodowej pentobarbitalu, otwierano klatkę piersiową, z płuc wypłukiwano krew metodą perfuzji roztworem zimnej (4°C) soli fizjologicznej bez jonów Ca , buforowanej fosforanem (PBS; pH = 7,4) i usuwano je nienaruszone z klatki piersiowej. Homogenat z płuc szczura uzyskiwano przez wielokrotne przeciąganie tkanki przez strzykawkę i następne przepuszczanie jej przez siatki ze stali nierdzewnej o sukcesywnie zmniejszających się otworach, w zakresie wartości mesh 32, 62 i 68 porów/2,54 cm, przy stałym przepływie zrównoważonego roztworu soli Finkelstein'a (FBSS, pH 7,4). Końcową zawiesinę makrofagów pęcherzyków płucnych zebrano, przefiltrowano i wirowano przy 300 x g przez 10 minut. Otrzymaną peletkę komórek, składającą się z ponad 98% makrofagów przemyto i zawieszono w roztworze Ringera. Następnie procedurę tę powtórzono jeszcze dwa razy. Zjednego szczura wyizolowano około 10 x 10⁸ makrofagów. Żywotność tych komórek oceniano metodą wykluczenia błękitem trypanowym.

F. identyfikacja związków nitrozowych

Związki nitrozowe identyfikowano przez powolne uwalnianie tlenku azotu (NO) po działaniu na nie nadtlenkiem wodoru. Roztwór reakcyjny składał się z dimetylonitrozoaminy i/lub dietylonitrozoaminy (1 pM), H2O2 (500 pM) i luminolu (30 pM) w hBsS (pH 7,4) w całkowitej objętości 0,5 ml. Fiolkę energicznie mieszano i notowano emisję w luminometrze Bedrtholda typu AutoLumat LB953. Do identyfikacji tworzącego się ONOO’ użyto mannitol (100 mM), dMsO (100 mM) i cysteinę (3,0 mM).

174 430

G. Izolowanie makrofagów z pęcherzyków płucnych

Pokrótce, szczury zabijano przez dożylną iniekcję soli sodowej pentobarbitalu, otwierano klatkę piersiową, z płuc wypłukiwano krew metodą perfuzji roztworem zimnej (4°C) soli fizjologicznej bez jonów Ca, buforowanej fosforanem (PBS; pH 7,4) i usuwano je nienaruszone z klatki piersiowej. Homogenat z płuc szczura uzyskiwano przez wielokrotne przeciąganie tkanki przez strzykawkę i następne przepuszczanie jej przez siatki ze stali nierdzewnej o sukcesywnie zmniejszających się otworach, w zakresie wartości mesh 32,62 i 68 porów/2,54 cm, przy stałym przepływie zrównoważonego roztworu soli Finkelstein'a (FBSS, pH 7,4). Końcową zawiesinę makrofagów pęcherzyków płucnych zebrano, przefiltrowano i wirowano przy 300 x g przez 10 minut. Otrzymaną peletkę komórek, składającą się z ponad 98% makrofagów przemyto i zawieszono w roztworze Ringera. Następnie procedurę tę powtórzono jeszcze dwa razy. Z jednego szczura wyizolowano około 10 x 10⁸ makrofagów. Żywotność tych komórek oceniano metodą wykluczenia błękitem trypanowym.

H. Utlenianie makrofagów pęcherzyków płucnych indukowane tert-butylo-1 -wodoronadtlenkiem (t-BHP)

Generowanie wolnych rodników tlenowych przez makrofagi pęcherzyków płucnych indukowane przez t-BHP (2,5 mM) oznaczano metodą chemiluminescencji z użyciem luminolu. Odpowiedź chemiluminescencyjną rejestrowano w luminometrze Bedrthorda typu AutoLumat LB953 w sposób opisany powyżej (Deliconstantinos G., Krueger G. R. F., J. Viral Dis. 1,22-27, 1993).

I. Oznaczanie nadtlenku wodoru (H 2O2)

Przygotowano układ: izoluminol/mikroperoksydaza zawierający 100 mM boran sodowy, 1 mM izoluminol, 0,01 mM mikroperoksyckuza w mieszaninie 70% wody i 30% metanolu o wartości pH 8. Ilość 50 gl tego odczynnika mieszano z izolowanymi makrofagami pęcherzyków płucnych (10⁶ komórek) w HBSS, w całkowitej objętości 0,5 ml roztworu. Odpowiedź chemiluminescencyjną wyrażano w nanomolach H2O2, wykorzystując krzywą standardową sporządzoną na podstawie różnych stężeń czystego H2O2.

J. Przygotowanie i oczyszczanie rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej (sGC) do oznaczania CO

Oczyszczano sGC z ludzkich komórek śródbłonka metodą chromatografii na agarozie

GTP. Na kolumnę agarozową-GTP o wymiarach 1,8 x 9 cm, wstępnie zrównoważoną 25 mM buforem Tris-HCl (pH 7,6) zawierającym 250 mM sacharozy i 10 mM MnCh dodano cytosole (10 mg białka). Następnie z kolumny eluowano sGC ilością 5 ml buforu do równoważenia kolumny plus 10 mM GtP.

K. Oznaczanie cyklicznego GMP

Stężenia cGMP oznaczano metodą radioimmunologiczną po acetylacji próbek bezwodnikiem octowym (Delikonstantinos G., Kopeikina L., Anticancer Res. 9: 753-760, 1989). Próby prowadzono w mieszaninie reakcyjnej zawierającej chlorowodorek trójetanoloaminy (50 mM), fosforan kreatyny (5 mM), MgCh (3 mM), izobutylometyloksantynę (1 mM), kinazę kreatynową (0,6 jednostek), GTP (1 mM) i rozpuszczalną cyklazę guanylanową (1 gg białka) w całkowitej objętości 150 gl roztworu. Reakcje inicjowano dodaniem GTP i następnie mieszaniny reakcyjne inkubowano przez 10 minut w temperaturze 37°C. Mieszaninę inkubacyjną zasysano i ekstrahowano cGMP przez dodanie oziębionego na lodzie 0,1 M roztworu HCl. Po 10 minutach próbki przenoszono na nową płytkę, suszono i rekonstytuowano w 5 mM roztworze octanu sodowego (pH 4,75) w celu oznaczenia zawartości cGMP. Powstały cGMP oznaczano w zestawie do oznaczeń cGMP (Amersham).

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania filtra, w którym stosuje się substancje biologiczne reagujące swoiście i wiążące następujące związki:

a) NO i NOx,

b) CO,

c) H2O2,

d) wolne rodniki,

e) aldehydo-chinony,

f) rakotwórcze związki nitrozowe oraz przeprowadza się

174 430

g) zatrzymamemierwiastków śladowych, kadmu, miedzi, mangma, żalaza i ianych pierwiastków, które są wdychane podczas palenia.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania filtra do filtrowania dymu tytoniowego posiadającego osnowę włóknistą, polegający na tym, że wzbogaca się filtr w substancję biologiczną wybraną spośród jednej lub większej liczby substancji zawierających żelazo, miedź i/lub magnez skompleksowane z pierścieniem porfirynowym i żelazo stereospecyfirznie związane w cząsteczkach białka, przy czym materiał filtra impregnuje się jedną lub kilkoma wymienionymi substancjami i filtruje się otrzymany materiał aby usunąć niezaabsorbowane substancje biologiczne.

Substancję biologiczną dostarcza się korzystnie jako roztwór 1-10 mg/ml w roztworze solanki buforowanej fosforanem o pH 7,4.

Impregnację materiału filtra substancją biologiczną prowadzi się korzystnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Również korzystnie stosuje się węgiel aktywowany wzbogacony substancją biologiczną.

Korzystną substancją biologiczną jest hemoglobina i/lub lizat erytrocytów. Również korzystne substancje biologiczne wybrane są spośród jonów zelaza Fe²⁺ stereospecyfirznie związanych z jedną lub z większą liczbą substancji, takich jak transferyna, katalaza, protoporfiryna, cytochrom C i chlorofil.

Wzbogaconą osnowę włóknistą włącza się korzystnie do zwykłego filtra papierosowego, w którym jest ona flankowana przez osnowę włóknistą nie wzbogaconą substancją biologiczną.

Wynalazek w znacznej mierze opiera się na obserwacjach, że:

a) istnieje wybór odpowiednich związków wiążących, takich jak hemoglobina albo lizaty erytrocytów lub innych substancji zawierających stereosperefirznie związane żelazo,

b) istnieje wybór związków wiążących, które zawierają pierścień porfirynowy z żelazem (np. protoporfiryna),

c) istnieje wybór związków wiążących zawierających pierścień porfirynowy, które niekoniecznie zawierają żelazo,

d) istnieje wybór związków wiążących zawierających pierścień porfirenowe skompleksowany z innymi metalami, np. z Mg²⁺, Cu ,

e) na tej podstawie zaprojektowano proces biotechniczny służący do wzbogacania znanych, konwencjonalnych materiałów, które są obecnie stosowane do produkcji filtrów papierosowych, zawierających wyżej wymienione substancje biologiczne.

Kluczowa idea wynalazku polega na pomyśle wzbogacania impregnacji powszechnie stosowanych filtrów papierosowych i/lub filtrów zawierających węgiel aktywowany substancjami biologicznymi charakteryzującymi się obecnością jonów metali Fe²⁺, Cu²⁺ i Mg²⁺ skompleksowanych z pierścieniem porfirynowym, a także Fe²⁺ związanego stereospeceficznis z cząsteczkami białka, co pozwala na zatrzymanie szkodliwych związków zawartych w papierosie przed tym, zanim palacz zaciągnie się dymem papierosowym. Ten fakt jest główną cechą charakterystyczną wynalazku i stanowi niezaprzeczalną innowację o dużych możliwościach zastosowań przemysłowych.

Wynalazek wykonano w niżej opisany sposób, mając na względzie jego stosowalność w produkcji przemysłowej.

Przygotowano roztwór (1 mg/ml) hemoglobiny i/lub lizatu erytrocytów w buforowanym fosforanem roztworze soli (PBS) o wartości pH 7,4 i dodano go do 1 θ0 mg węgla aktywowanego. Mieszaninę inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej i przefiltrowano przez bibułę filtracyjną marki S&S Carl Schleicher & Schuell Co U. S. A. Ilość niezaabsorbowanej hemoglobiny oznaczano w przesączu metodą spektrofotometryczną. Węgiel aktywowany wzbogacony hemoglobiną pozostawiono do wysuszenia w temperaturze pokojowej. Ilość 200 mg suchego węgla aktywowanego wzbogaconego hemoglobiną umieszczono pomiędzy dwoma zwykłymi filtrami tak, aby ciągnięty przez nie dym papierosowy kontaktował się z grupami aktywnymi cząsteczek (Fe , Fe³*, -SH, -NH; fig. 2). Takie zgodne materiały są gotowe do użycia do wytwarzania nowych filtrów papierosowych, które od tej części niniejszego opisu nazywane są filtrami biologicznymi.

Alternatywnie, hemoglobinę można zastąpić substancjami biologicznymi charakteryzującymi się obecnością jonów metali Fe²⁺, Cu²⁺, Mg ²⁺ skompleksowanerh z pierścieniem porfiry10

174 430 nowym, a także jonem Fe²⁺ związanym stereospecyficznie z cząsteczkami białka, takimi jak transferyna, kataliza, protoporfiryna, cytochrom C, chlorofil.

Alternatywnie, przygotowano roztwór (5 mg/ml) hemoglobiny i/lub lizatu erytrocytów w buforowanym fosforanem roztworze soli (PBS) o wartości pH 7,4 i skanowano go w temperaturze 25°C stosując spektrofotometr rejestrujący typu Acta Beckman. Pik absorbancji obserwowano przy 540 nm i 575 nm, zgodnie z doniesieniem Smith'a R. P. i Kruszyma'y H. (J. Pharmacol. Exper. Ther. 191, 557-563, 1974). Tymi roztworami impregnowano powszechnie stosowane filtry papierosowe i suszono na powietrzu w temperaturze 25-35°C. Takie zgodne materiały są gotowe do użycia do wytwarzania nowych filtrów papierosowych, które od tej części niniejszego opisu nazywane są filtrami biologicznymi. Te nowe filtry biologiczne sprawiają, że dym, który jest wdychany, całkowicie wchodzi w kontakt z grupami aktywnymi cząsteczek hemoglobiny i/lub lizatów zawartymi w filtrze bez zmiany własności fizycznych i smaku dymu papierosowego. Ze względów estetycznych, do widocznego końca tego biologicznego filtra można dołączyć niewielką część (3 mm) zwykłego filtra.

Do alternatywnych sposobów produkcji przemysłowej należy następujący sposób:

Przygotowano roztwór 5 mg/ml protoporfiryny w roztworze buforu (PBS) o wartości pH 7,4 i analizowano go w temperaturze 25°C, stosując rejestrujący spektrofotometr typu Acta Beckman. Wzbudzenie protoporfiryny światłem ultrafioletowym (498-408 nm) dało pomarańczowo-czerwoną fluorescencję w zakresie 620-630 nm. Powyższym roztworem impregnowano (moczono w nim) powszechnie stosowane filtry i suszono je gorącym powietrzem (25-35°C).

Alternatywnie, roztwór (5 mg/ml) transferyny w buforze PBS o wartości pH 7,4 analizowano, stosując rejestrujący spektrofotometr typu Acta Beckman. Transferyna z żelazem wykazuje charakterystyczne widmo przy 470 nm. Do impregnacji filtrów będących obecnie w powszechnym użyciu zastosowano wyżej opisane sposoby.

Alternatywnie, przygotowano roztwór (5 mg/ml) katalazy w PBS o wartości pH 7,4. Do wytworzenia filtra biologicznego zastosowano wyżej opisany sposób.

Alternatywnie, przygotowano roztwór (5 mg/ml) cytochromu C w PBS o wartości pH 7,4. Do wytworzenia filtra biologicznego zastosowano wyżej opisany sposób.

Alternatywnie, przygotowano roztwór (5 mg/ml) chlorofilu w PBS o wartości pH 7,4. Do wytworzenia filtra biologicznego zastosowano wyżej opisany sposób.

Alternatywnie, wyżej wymienione substancje biologiczne w postaci stałej umieszczano pomiędzy dwoma zwykłymi filtrami tak, aby ciągnięty przez nie dym papierosowy kontaktował się z grupami aktywnymi cząsteczek (Fe2+, Fe³⁺, -SH, -NH2).

Z analizy wyników okazało się, że różne substancje biologiczne użyto do wzbogacenia powszechnie stosowanych filtrów zatrzymują toksyczne związki (NO, CO, wolne rodniki, H2O2, aldehydy, pierwiastki śladowe i związki nitrozowe) z dymu papierosowego w różnym stopniu, co jest przedstawione w poniższej tabeli:

Zmiatacze	NO %	CO %	wolne rodniki %	H2O2 %	Aldehydy %	Nitrozo związki %	Pierwiastki śladowe (%)
Hemoglobina	90	90	90	80	90	90	95
Transferyna	85	90	60	60	60	75	50
Katalaza	85	90	90	90	80	80	80
Protoporfiryna	85	90	70	80	70	75	80
Cytochrom C	85	80	70	80	60	60	70
Chlorofil	15	10	40	15	10	10	80

Uzyskano wysoki stopień zatrzymania wysoce wyniszczających organizm substancji z dymu papierosowego. Dym papierosowy (20 ml) filtrowany przez filtr biologiczny porównano

174 430 z dymem (20 ml) filtrowanym przez filtr konwencjonalny. Jedynie 1 ml dymu papierosowego przepuszczanego przez filtr konwencjonalny porównano z ilością 40 ml dymu papierosowego przepuszczanego przez filtr biologiczny. Okazało się, że filtry biologiczne mają 40-krotnie wyższą zdolność zatrzymywania pierwiastków śladowych w porównaniu z filtrami zwykłymi.

W celu lepszej prezentacji aktywności tych substancji biologicznych, poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki szczegółowo opisanych badań eksperymentalnych.

a) Identyfikacja NO zawartego w dymie papierosowym metodą chemiluminescencji:

NO identyfikowano stosując opisaną w części eksperymentalnej metodę chemiluminescencji ze wzmocnieniem luminolem. Fig. 3 i fig. 4 przedstawiają typowy eksperyment identyfikacji i oznaczania NO oraz jego wiązanie po przepuszczeniu dymu papierosowego przez filtr biologiczny. Okazało się, że powyżej 90% NO było zatrzymywane przez hemoglobinę. Skuteczność tego filtra biologicznego jest wyraźna zarówno w zatrzymywaniu jak i neutralizowaniu NO, który uczestniczy w toksycznych reakcjach w komórkach płuc i w płynach płucnych, a zwłaszczajest zaangażowany w tworzenie się silnego środka utleniającego, ONOO’.

b) Identyfikacja wolnych rodników zawartych w dymie papierosowym metodą chemiluminescencyjną:

Wolne rodniki w dymie papierosowym identyfikowano metodą odpowiedzi chemiluminescencyjnej wywołanej przez układ lucygenina/DAMCO po jego reakcji z wolnymi rodnikami. Fig. 5 przedstawia charakterystyczny pik występujący w ciągu 2 sekund odpowiedzi chemiluminescencyjnej, która była w 100% hamowana po przepuszczeniu dymu papierosowego przez filtr biologiczny. Zatrzymywanie wolnych rodników przez filtry biologiczne oznacza, że uzyska się zmniejszenie utleniania w makrofagach pęcherzyków płucnych, które jest powodowane przez zwykły dym papierosowy.

c) Identyfikacja H2O2 zawartego w dymie papierosowym metodą chemiluminescencji:

Nadtlenek wodoru oznaczano metodą odpowiedzi chemiluminescencyjnej wywoływanej przez układ: izoluminol/mikroperoksydaza. Na fig. 6 przedstawiony jest charakterystyczny pik chemiluminescencji oznaczający obecność H2O2 w dymie papierosowym. W obecności katalazy (100 jednostek/ml) odpowiedź ta jest hamowana w około 90%. Po przepuszczeniu dymu papierosowego przez filtr biologiczny obserwuje się 80% hamowanie odpowiedzi chemiluminescencyjnej. Układ: izoluminol/mikro peroksydaza jest specyficzny dla identyfikacji H2O2. Wolne rodniki zawarte w dymie papierosowym wywołują niewielką odpowiedź chemilummescencyjną po ich interakcji z izoluminolem. Ta niewielka chemiluminescencja stanowi około !0%o całkowitej chemiluminescencCi powodowanej przez H 2O 2 w obecności wolnych rodników, gdyż katalaza hamuje maksymalną odpowiedź chemiluminescencyjną w stopniu osiągającym wartość do 90%. Zatrzymanie H2O2 wyraźnie zmniejsza utlenianie i wytwarzanie No przez makrofagi pęcherzyków płucnych.

d) Identyfikacja pierwiastków śladowych i aldehydów zawartych w dymie papierosowym z użyciem układu enzymatycznego: lucyferyna/lucyferaza.

Pierwiastki śladowe zawarte w dymie papierosowym identyfikowano wykorzystując ich zdolność do stymulowania aktywności lucyferazy. Fig. 7 przedstawia:

1) odpowiedź chemiluminescencyjną wywołaną przez utlenienie lucyferyny w obecności ATP,

2) wzmocnioną odpowiedź chemiluminescencyjną w obecności jonów Cd2+ (0.5 mg),

3) wzmocnioną odpowiedź chemiluminescencyjną w obecności jonów Cu2+ (0.5 mg),

4) wzmocnioną odpowiedź chemiluminescencyjną spowodowaną dymem papierosowym (1 ml) i

5) hamowanie odpowiedzi chemiluminescencyjnej (w odniesieniu do odpowiedzi spowodowanej dymem papierosowym) wywołanej przez 40 ml dymu papierosowego po przepuszczeniu przez papierosowy filtr biologiczny. Odpowiedź chemiluminescencyjną powodowana przez pierwiastki śladowe zawarte w zwykłym dymie papierosowym jest ponad 40 krotnie wyższa od tej, jaką się obserwuje po przepuszczeniu dymu przez filtr biologiczny. Zatrzymywanie pierwiastków śladowych przez filtry biologiczne może dawać efekty krótko- i długoterminowe. Efekty krótkoterminowe obejmują hamowanie reakcji utleniania w płucach (Fe, Mn), a do efektów długotrwałych można zaliczyć hamowanie uszkadzania składników krwi i substancji zawartych w krwi (Cd).

174 430

Aldehydy zawarte w dymie papierosowym identyfikowano i oznaczano ilościowo, stosując ten sam układ enzymatyczny: lucyferyna/lucyferaza w nieobecności ATP. Aldehydy mają zdolność utleniania lucyferyny. Na fig. 8 przedstawiona jest charakterystyczna odpowiedź chemiluminescencyjną, która może trwać dłużej niż godzinę. Ta odpowiedź chemiluminescencyjną była hamowana w 100%, jeśli użyty do oznaczenia dym papierosowy był uprzednio przepuszczony przez filtr biologiczny, co wskazuje na fakt, że skuteczność tego biologicznego filtra pod względem zatrzymywania toksycznych aldehydów jest znacząca.

e) Identyfikacja związków nitrozowych w dymie papierosowym.

Związki nitrozowe zawarte w dymie papierosowym identyfikowano oznaczając powolne uwalnianie NO ze związków nitrozowych po działaniu nadtlenkiem wodoru. Jak to jest przedstawione na fig. 9, pik odpowiedzi chemiluminescencyjnej uzyskano w czasie około 900 sekund. Po przepuszczeniu dymu papierosowego przez filtr biologiczny zaobserwowano 90% hamowanie odpowiedzi chemiluminescencyjnej, a pik wystąpił po około 1200 sekundach. Przedstawione jest również powolne uwalnianie NO przez nitroprusydek sodu (SNP) po działaniu nadtlenkiem wodoru. Fig. 10 przedstawia powolne uwalnianie NO z obydwu związków nitrozowych, dietylonitrozoaminy i dimetylonitrozoaminy oraz z hemoglobiny wzbogaconej w związki nitrozowe pochodzące z dymu papierosowego traktowanego przez H2O2. Jest jasne, że uwalnianie NO przez związki nitrozowe zawarte w dymie papierosowym, które to związki tworzą addukty z hemoglobiną, podlegają tym samym zasadom uwalniania NO co związki nitrozowe, dietylonitrozoamina i dimetylonitrozoamina. Fig. 11 przedstawia uwalnianie NO przez związki nitrozowe dymu papierosowego, które to związki tworzą addukty z hemoglobiną po napromienianiu przez minutę tych adduktów: hemoglobina-związek nitrozowy dawką UVB wynoszącą 100 mJ/cm². Uwalnianie NO oznaczano w obecności H 2O 2, otrzymując odpowiedź chemiluminescencyjną w ciągu sekundy. Stopniowy wzrost obserwowany na fig. 11 wynika z działania H2O 2 na hemoglobinę (reakcja Fentona).

f) Wytwarzanie NO przez makrofagi płuc:

Przeprowadzono doświadczenia in vitro, wykorzystując specjalną komorę, skonstruowaną w naszym laboratorium. Komora ta jest przedstawiona na fig. 1. Membrana teflonowa rozdzielająca dwa przedziały komory jest przepuszczalna dla gazowego NO a nieprzepuszczalna dla NO2’ i ONOO’. Nieprowokowane makrofagi płuc izolowano w sposób podany w sekcji eksperymentalnej, w roztworze buforu HBSS (1 x 10⁶ komórek/ml) i umieszczano w przedziale A komory. W przedziale B umieszczano 2,5 ml odczynnika Griess'a albo odczynnika: sulfanilamid/skopoletyna. NO uwalniany przez makrofagi w przedziale A dyfunduje przez membranę teflonową do przedziału B i wiąże się z odczynnikami Griess'a i/lub sulfonamid/skopoletyna, gdzie jest wyłapywany. To wskazuje na fakt, że makrofagi płuc wytwarzają gazowy NO. Następnie wyliczano ilość NO obecnego w przedziale B metodą spektrofotometryczną lub fluorofotometryczną. Oznaczano również ilości ONOO’ i NO2' zawartych w przedziale A komory, stosując odczynniki Griess'a i/lub sulfanilamid/skopoletyna. Powyższe doświadczenia powtórzono po prowokacji makrofagów dymem papierosowym przed umieszczeniem ich w przedziale A. Wyniki doświadczenia przedstawione na fig. 12 wykazują, że dym papierosowy zmniejsza ilość wytwarzanego NO, zwiększając produkcję ONOO’ w makrofagach płuc, co pośrednio świadczy o olbrzymim wytwarzaniu zarówno NO jak i O2, które ze sobą reagują tworząc ONOO’.

Powtórzenie tych doświadczeń z użyciem filtrów biologicznych (to znaczy takich, w których dym papierosowy jest przepuszczany przez filtr biologiczny) wykazało, że użyte substancje biologiczne wytwarzają takie same ilości NO2’ oraz ONOO’ w przedziale A i podobne ilości NO w przedziale B, jakie wytwarzałyby makrofagi nie prowokowane dymem papierosowym. W tym kontekście, użyto również substancje biorące udział w reakcji Griess'a dla zbadania kinetyki nitrozowania przez produkt bądź produkty pośrednie generowane podczas reakcji NO/O 2 w roztworze wodnym przy pH fizjologicznym. Dodanie dymu papierosowego (50 ml) do 100 mM roztworu fosforanu (pH 7,4) zawierającego 25 mM sulfanilaminy i 2,5 mM dichlorowodorku N-(1-naftyloetylenodiaminy) (NEDD) generowało absorpcję przy długości fali X_max = 496 mm charakterystyczną dla azo-związku powstającego w reakcji nitrowania. Godne rozważenia są implikacje niniejszych obserwacji w odniesieniu do spodziewanych

174 430 reaktywności NO w odpowiednich warunkach fizjologicznych, gdzie maksymalne stężenia NO w mikrośrodowisku komórki szacuje się na wartości mieszczące się w zakresie 0,5 - 10 pM. Podczas palenia papierosów dramatycznie wzrastają stężenia NO z niszczącym działaniem na komórki płuc.

g) Utlenianie makrofagów płuc:

Wyniki badań wpływu dymu papierosowego na utlenianie makrofagów płuc są przedstawione na fig. 13. Oszacowania utleniania z użyciem t-BHP wykazały, że dym papierosowe powoduje dwukrotnie większy utleniania niż to, jakie występuje w makrofagach nie prowokowanych. Jeśli dym papierosowy przepuści się przez filtr biologiczny, wówczas obserwowany utlenianie jest podobne do tego, jaki występuje w makrofagach nie prowokowanych. Wykazano jednoznacznie wyeliminowanie utlenianie makrofagów wywoływanego przez dym papierosowy. Obecnie dym papierosowy jest wolny od substancji powodujących utlenianie makrofagów płuc.

h) H2O2 wytwarzany przez makrofagi płuc:

Makrofagi prowokowane dymem papierosowym wytwarzają H2O2 w ilości przeszło 10-krotnie większej niż makrofagi nie prowokowane. Użycie filtra biologicznego wykazało spadek wytwarzania H2O 2 o 90% (fig. 14) w porównaniu do filtrów powszechnie używanych. Jest oczywiste, że jeśli dym papierosowy wywołuje utlenianie w makrofagach, tym samym zwiększa wytwarzanie toksycznego H 2O 2 przez te komórki.

i) Doświadczenia z rekonstytuowaniem:

Oznaczano ilość cyklicznego GMP wytwarzanego przez NO uwalniany przez makrofagi pęcherzyków płucnych w komorze przedstawionej na fig. 1. Cyklazę guanylanową umieszczano w przedziale A, a makrofagi pęcherzyków płucnych umieszczano w przedziale B. Ilości NO wytwarzanego przez makrofagi oznaczano w czasie 50 minut, z udziałem i bez udziału komórek prowokowanych dymem papierosowym. Makrofagi prowokowane dymem papierosowym (10 ml) uwalniały około 10 razy mniejszą ilość NO w porównaniu z komórkami nietraktowanymi, co świadczy o 10-krotnie mniejszym wytwarzaniu cyklicznego GMP. Powyższe doświadczenie powtórzono stosując dym papierosowy przepuszczony przez filtr biologiczny. W odniesieniu do makrofagów nie prowokowanych (kontrola), wykazano różnicę nieznamienną statystycznie (fig. 15). Gromadzenie się NO w przedziale B wzrastało ponad 5-krotnie, jeśli makrofagi pęcherzyków płucnych traktowano 5 mM roztworem nadtlenku wodoru (fig. 16). To sugeruje, że H 2O2 zwiększa wytwarzanie NO według mechanizmu dodatniego sprzężenia zwrotnego. Szlak metaboliczny L-arginina/NO w makrofagach jest zgodny z założeniem, że dym papierosowy powoduje uwalnianie NO/ONOO’.

k) Identyfikacja tlenku węgla (CO) w dymie papierosowym:

Obecność CO w dymie papierosowym oznaczano metodą biologiczną opartą na stymulacj i rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej przez CO.

Wprowadzenie HBSS nasyconych dymem papierosowym do przedziału A komory, w obecności ponadtlenku w celu neutralizacji NO, oraz wprowadzenie rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej do przedziału B, powodowało wzrost wytwarzania cyklicznego GMP w wyniku dyfundowania CO z przedziału A do przedziału B. Przepuszczenie dymu papierosowego przez filtr biologiczny zmniejsza ilość wytwarzanego cyklicznego GMP o około 80% (fig. 17). Powyższe dane wskazują, że szkodliwe substancje, NOx i CO zawarte w dymie papierosowym, są zatrzymywane i neutralizowane przez filtry biologiczne.

Przeprowadzono następujące doświadczenia in vivo:

a) Na początku potwiercwono obecność NO 1 ONOO’ o wydychanym dymie papierosowym. Ochotnicy palący papierosy stosowali zwykłe filtry. NO obecny w wydychanym dymie papierosowym identyfikowano po wprowadzeniu wydychanego dymu do roztworu kwasu (50 ml, pH 4). Stężenie NO oznaczano metodą uhemiluminnscenuji ze wzmocnieniem luminolem, opisaną w części eksperymentalnej, stosując krzywe standardowe wykonane dla handlowego NO. Oznaczone stężenie NO wynosiło 0,045 mM. Badania powtórzono stosując filtry biologiczne. Stężenie NO w wydychanym dymie było około 70% niższe niż przy stosowaniu filtrów konwencjonalnych (fig. 18). Stężenie ONOO’ oznaczano stosując 1,2 M roztwór NaOH. Obserwowano (fig. 19) wzrost absorpcji przy 303 nm (8303 nm = 1670 M^cm’¹). Doświadczenia wykazały, że podczas palenia wydychany dym zawiera ogromne ilości ONOO’ (wprowadzenie

174 430 ml wydychanego dymu do 5 ml 1,2 M roztworu NaOH dawało 0,9 mM roztwór ONOO’). Oznaczony stosunek NO/ONOO' w wydychanym dymie wynosił 1:20.

Z powyższych doświadczeń wynika, że w płucach NOx jest przekształcany do ONOO' w reakcji z ponadtlenkiem. Ponadtlenek uwalnia się zarówno z makrofagów jak i w reakcjach oksydoredukcyjnych przebiegających w płucach podczas palenia. Dym papierosowy ciągnięty pompą nie zawiera ONOO’, jednak pewna ilość NOx reaguje z ponadtlenkiem albo z tlenem z utworzeniem jonów azotynowych (NO 2). ONOO’ powoduje tylko wówczas, gdy dym papierosowy dociera do płuc. Użycie filtrów biologicznych zmniejsza ilości wydychanych NO i ONOO’ o 70%.

b) ONOO' reaguje z jonami dwuwęglanowymi ludzkich erytrocytów według reakcji:

ONOO’ + HCO3----------> HCO3 + NO2 + OH’

Rodnik dwuwęglanowy utlenia luminol oraz cząsteczki aromatyczne i heterocykliczne. Alternatywnie, ONOO’ może utleniać dwuwęglan do nadtlenodwuwęglanu, innego środka silnie utleniającego. Z drugiej strony, dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) katalizuje w białkach nitrowanie przez ONOO’ i szeroki zakres związków fenolowych, włącznie z tyrozyną.

Tak więc, istnieje szereg potencjalnych mechanizmów, według których dwuwęglany i SOD mogą wywierać wpływ na ogólną reaktywność ONOO' w komórkach. Obecność ONOO’ powstającego w płucach na skutek wdychania dymu papierosowego powoduje gwałtowne zwiększenie utleniania w erytrocytach, co wykryto metodą odpowiedzi chemiluminescencyjnej pojawiającej się w ciągu 5 sekund. To samo doświadczenie przeprowadzone z użyciem filtra biologicznego wykazało prawie 100% zahamowanie utleniania w erytrocytach ludzkich (fig. 20). Ekspozycja hemoglobiny lub lizatów erytrocytów na ONOO' (zawarty w wydychanym dymie papierosowym) powodowała zanik dwu pików przy 540 i 575 nm, występujących normalnie w hemoglobinie. Wyniki reprezentatywnego doświadczenia, podobnego do opisanego powyżej, przeprowadzonego z udziałem 12 ochotników są przedstawione na fig. 21. Jeśli hemoglobinę i/lub lizat wystawiono na działanie małej ilości wydychanego dymu (10 ml), wówczas obserwowano przesunięcie pików z 540 i 575 nm do odpowiednio 525 i 555 nm, oznaczające powstanie nitrozylo-hemoglobiny. Doświadczenia powtórzono stosując filtry biologiczne. Obserwowane piki zachowały charakterystyczne dla nich długości fali.

d) Aldehydy identyfikowano w wydychanym przez ochotników dymie papierosowym w oparciu o charakterystyczny pik chemiluminescencji. Doświadczenia powtórzono stosując filtry biologiczne. Obserwowano 90% zmniejszenie się odpowiedzi chemiluminescencyjnej w porównaniu do maksymalnej odpowiedzi chemiluminescencyjnej obserwowanej przy stosowaniu zwykłych filtrów (fig. 22). Jest oczywiste, że filtry biologiczne zatrzymują i zobojętniają aldehydy w dymie papierosowym, zatrzymując środki utleniające, przez co w widoczny sposób hamują reakcje oksydoredukcyjne w płucach, co powodowałoby wytwarzanie endogennych aldehydów.

e) Wolne rodniki identyfikowano w wydychanym przez ochotników dymie papierosowym na podstawie ich charakterystycznego piku chemiluminescencji. Ochotnicy palili papierosy, stosując filtry zwykłe i biologiczne. Ochotnicy ci byli pouczeni, aby wydychali dym do roztworu kwasu (50 ml; 0,01 N HCl; pH 6). Odpowiedź chemiluminescencyjną oznaczano po 5 minutach i po 60 minutach. Przy wartości pH równej 6 wydychany ONOO’ ulegał samorzutnemu rozkładowi. W czasie 5 minut wystąpił 160% wzrost odpowiedzi chemiluminescencyjnej w wydychanym dymie przy stosowaniu zwykłego filtra w porównaniu z tą, jaką obserwowano przy stosowaniu filtra biologicznego (fig. 23). Jeśli ten nasycony dymem papierosowym roztwór kwasu pozostawiono na godzinę, wówczas różnica w odpowiedzi chemiluminescencyjnej wzrastała ze 160% do 250% (fig. 24). Obserwacje te są zgodne z koncepcją, że reakcje oksydoredukcyjne przebiegają w dymie papierosowym w sposób ciągły, poprzez rodniki chinonowe, z wytworzeniem serii aktywowanych związków tlenu, które mogą powodować niszczenie biologiczne.

Badania te wykazały, ze tak jak inne komórki, makrofagi pęcherzyków płucnych posiadają endogenną syntetazę NO i potrafią uwalniać NO/ONOO’ przez długie okresy czasu po ustaniu

174 430 ekspozycji na dym papierosowy. Ponadto, jeśli już komórki zaczną uwalniać NO, jego produkcja staje się samostymulująca, nawet po usunięciu bodźca. Na drodze tej reakcji, NO pochodzący z dymu papierosowego może stymulować makrofagi pęcherzyków płucnych tak, aby uwalniały NO i ONOO’ przez czas kilku godzin po usunięciu bodźca. Reakcja ta może być inicjowana przez wytwarzanie H2O2 w płucach w wyniku stymulowania makrofagów pęcherzyków płucnych przez dym papierosowy. Nadtlenek wodoru może stymulować aktywność syntetazy NO w komórkach płuc w kierunku produkcji NO i ONOO’ w czasie przekraczającym godzinę po usunięciu bodźca. Te badania wykazały, że przepuszczenie dymu papierosowego przez filtr biologiczny powoduje 90% obniżenie (w porównaniu z filtrem konwencjonalnym) utleniania w makrofagach pęcherzyków płucnych szczura. Rodnik ONOO’ tworzący się w płucach być może atakuje i inaktywuje inhibitor proteinazy a1 (a1PI). Hamowanie a1PI w płucach człowieka często powoduje rozedmę, w której zmniejsza się pojemność płuc. Istnieje dowód pochodzący z analiz statystycznych, wykazujący, że palenie papierosów daje skłonność do rozwoju rozedmy (Southon P. A., Pwis G., Free Radicals in Medicine. Involvement in human Disease. Mayo Clin. Proc. 63: 390-408, 1988). W doświadczeniach przeprowadzonych in vivo z udziałem 12 palaczyochotników wykazano 90% obniżenie ilości wydychanego NO/ONOO’ wówczas, gdy wciągany dym papierosowy przechodził przez filtr biologiczny.

Wolne rodniki tlenowe są również zaangażowane w patogenezie zapalenia pęcherzyków płucnych indukowanego kompleksem immunologicznym IgA. Wstępne podanie zwierzętom dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy, chelatorażelaza-desferioksaminy albo związku wiążącego wolne rodniki wodorotlenowe, DMSO, spowalnia postęp wyniszczenia płuc. Płuca meń-aktowanych zwierząt stanowiących kontrolę pozytywną charakteryzują się natomiast zwiększoną ilością makrofagów pęcherzykowych. Występują poza tym rozedma śródmiąższowa i krwawienia. Ponadto, w tym modelu niszczenia płuc wysoce ochronną rolę odgrywa L-arginina, co objawia się zmniejszoną przepuszczalnością naczyń, zmniejszonymi krwawieniami naczyniowymi i mniejszymi uszkodzeniami komórek śródbłonka naczyń i komórek nabłonka pęcherzyków. Te spostrzeżenia sugerują, że makrofagi stanowią źródło uszkodzeń powodowanych przez związki No, O2, H2O2 i OHO’ (Mullingan M. S., Jonhson K. J., Ward P. A. w publikacji: Biological Oxidants: Generation and Injurous Consequences (wyd. Cochrane C. G. i Gilbrone M. A., Ju., Academic Press 157-172, 1992).

Zatrzymywanie i neutralizacja środków utleniających zawartych w dymie papierosowym przez filtry biologiczne może odgrywać ważną rolę w zmniejszaniu aktywności enzymów oksydoredukcyjnych, które są bezpośrednio związane z utlenianiem w komórkach płucnych. Filtry biologiczne gwałtownie obniżają utlenianie powodowane przez wdychany dym papierosowy. Utlenianie w makrofagach płuc i w komórkach nabłonka naczyń płucnych może być indukowane przez NO, NOx, rodniki tlenowe i/lub aldehydy zawarte w dymie papierosowym. Ponadto, zatrzymywanie aldehydów i pierwiastków śladowych (zwłaszcza Cd) przez filtry biologiczne może mieć poważne długotrwałe znaczenie w zachowywaniu antyutleniających substancji osocza i w hamowaniu rozwoju miażdżycy. Hemoglobina zawiera wiele centrów obojętnochłonnych, które wchodzą w reakcje kowalencyjne z elektrofilami. Te centra indukują N-końcowe reszty waliny łańcucha α- i β-, atomy N1 i N3 reszt histydynowych i grupy sulfhydrylowe reszt cysteinowych. Rakotwórczy związek nitrozowy, 4-(metylonitrozoamino)l-(3-pirydylo)-1-butanon (NNK), występujący w tytoniu, przechodzi do dymu podczas palenia papierosa a jego poziomy w głównym strumieniu dymu mogą wynosić od 4 do 1700 ng na papieros. NNK może tworzyć addukty z hemoglobiną (Hecht S. S., Karan S., Carmella S. G. w publikacji Human carcinogen expose, wyd. Garmer R. C., Farmer P. B., Stell G. I. i Wncht A. S., IRI Press, str. 267-274, 1991). Oczywiście, jedną drogą uniknięcia chorób związanych z tytoniem jest powstrzymanie się od żucia i palenia tytoniu. Jednakże badania statystyczne wykonane na palaczach wskazują, że istnieje silna potrzeba zmniejszenia ekspozycji na substancje rakotwórcze zawarte w papierosach i modyfikowania mechanizmu ich działania. Głównymi podejściami do tego celu są: 1) modyfikowanie produktów tytoniowych, 2) hamowanie aktywacji metabolicznej środków rakotwórczych zawartych w tytoniu i ich endogennego wytwarzania przez mikro- i makroodżywki oraz chemiczne środki zapobiegawcze i 3) zatrzymanie tytoniowych środków rakotwórczych przez stosowanie odpowiednich filtrów, które będą dołączone do

174 430 tytoniu w papierosie. Wynalazek polegający na użyciu substancji biologicznych do produkcji filtrów biologicznych oparty jest na odkryciu, że związki nitrozowe zawarte we wdychanym dymie papierosowym są zatrzymywane przez substancje biologiczne, co chroni zdrowie nie tylko palaczy lecz również niepalaczy.

W oj

Ό M +J

OPH N-d U Ή

174 430

σ σ' α

α

FIG

ΥΓ0Ν3353ΝΙΜΩΊΙΝ3Η0

174 430

Tlenek azotu (NO) (nmole)

Dym papierosowy (ml)

FIG. 4

174 430 e>

α o

>1

C

N

O •H ζΡ

O rH

O •rd

Λ

ΛΓ in

FIG

Τ'

tfrottaosaNiwimwaHD

174 430 zawarty w dymie papierosowym (10 ml)

FIG

YroNaosauiwmiwaHO

174 430

ΙΛ

Ο

Ή

X !Λ α

σι>

1« ri

Η ο

Ο

tł c*i £

Ν

Ο ·ι-4 ζΓ

Ο γ-4

Ο

Ή /3 $4

4->

γΗ ·γ4

U-i

ο Ο
es
°	W
e	fO (SJ U

to ο V» ©2 * -!

ο ο co ϋ

κ

Uł

VJ?3N30S3NIWmiW3H3

174 430 (A)powolne uwalnianie NO ze związków nitrozowych po

CZAS

174 430 □

TJ

Powolne uwalnianie NO z:

(CpS X IG^ (A)dietylonitrozoaminy (1 jUM)

<1

I

I i

I

O in G3

C4 H Ή α

o ó

o in i d r--1 α tn o · . .a o o <1) z

o

N

O d

4J •d c

‘d

N S t» a_ •d

Ν'— ? S, tP n <D ω S c o o w o o

Λ i-i CPU Ο-Η Λ a N aj ? O.

c •d Λ O rd cn o £ ω a

'l <3

O

O o

* a

G in

I

I s

2.

r-1 >1

C •d e

O

N

O d

+J •d β

O rd

4-)

Φ s

•d

TJ

I

O co Kfl nf (U σ * O <$ φh a a s a □ d O o q

0.2·:

O.>

Vr0K30SaMIWniIW3H0

174 430 uwalnianie NO przez związki nitrozowe z dymu

O 01 O P Φ •rd a

<0 a

<u

i.

T o

o to o

Cn

Φ

S

O

O β

<D

O -H e a <3 ns oi a tr o

x

V» «

© *

s

Ό d

C ?

O +J ιϋ μ

ρ dl •H β

nj β

•H

Λ nj O ι-l l“)

O cn P O u e c <u o xt 94 —

S

Ό

P β

Φ

Cn <0 <U β

N

0)

Λ

U *3

O

FIG. 11 σ

MB

O tn «3 •T o

oj r i

I I <· P ωζ o/ /

η Ί

Q

O *

Ό

Vr0N30S 3NIWm IW3H3

174 430

Tlenek azotu (NO)(nanomole/10 komórek)

FIG. 12

Azotyn (NO )(nanomole/10 komórek)

174 430

CZAS

FIG. 13

CHEMILUMINESCENCJA

FIG. 14

174 430

FIG. 15

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 cykliczny GMP (nanomoli/mg białka/min)

174 430

Tlenek azotu (NO)(nanomole/10 komórek)

FIG. 16

174 430

Cykliczny GMP (nanomoli/mg białka/min)

FIG. 17

174 430

V

TU cn •r-ł i—ł

W

0) M •m 4-> r~ł * Ή < U-ł +J

O ω o p

OJ rH •r·) Ή ft Ή (6 ft (U A< •e £

	N
Ό
	N
E	Φ
>1	N
G	P
<ΰ	Ol
A
o	«Μ
^*1	Ή
TJ	U
	13
	0
	Λ
S	□
	<u
O	N
Ή	P
	Gi
flj
*n	£	•
O		>1
<a	TJ	G
Ai		N
•»-ł	>1	O
M-l	G	•H
>1	G	CP
•P	<G	0
G	o	Γ—1
Φ	>1	o
TJ	TJ	•H
H	5	Λ

! 1 / -i / ^{1 1}

Z p ·/O

V» tn

N

CJ

FIG. 18 (ft <£ .ή -/·

CQ · ©' 03

		'	—-i.____y				o
		l				Lj	o
«3	O	O	o	o	9
t··.		to	cr	rt	»		o

YroNaosaNiwOTiwaHD

174 430

Absorbancja

230 300 320 340 360 330

Długość fali (nm)

FIG. 19

174 430

Λ

Ο π5 +J ϋ

Ο

-Ρ

W

Φ

Λ υ

Ή

Αί.

Ν

Ό

X

5’.

cP α

σ >

Ο

W η

(0 ·<-ί

C

Ο

I^-)

4J

Ul

Ul dl

Μ +J

Ul

Z

I»

A <T •t f

O

T, o

o o

z o

N dl

N

G

G<

ί*ι C Π3 rM O 5 >1 nr n?

AL

7»

U n

α

O

r.

Tj '7

Ί.

>t

C

N ϋ

•H cn o

r—i O •H

Λ

M

P rH ♦H

W <

£S3

O a

o

H

Pm li

Ί,.

o (3

B u

Π u

* ?

a

U n

Jfl

Js

C

O o

o.

to fl·

ΊΙ

u			__ 1» -r	6»	BI <L c	o <3 •
es	co	«
—ł	6	* e>	α	, &	c	.O

vroNaosaNiwmiw3HO

174 430

Absorbancja

FIG. 2-1

174 430 in

Βίί(3 α

1* w

a a

a «

tó w

a u

H

W s

a flł

1>

ffi łf

XI a

a α

>, w

X >1

N

JM +J f—I •H 4-4 «

o α

a u

P a

e α

i u* u

Ϊ, m

FIG. 22 u

a π

i>

s

0»

H n

o i' n

m

M α

s n

ii

I» ,/³

-5.

ci

T⁴

Ό e>

YroNaosamwmiwaHO

174 430

4.

t ΐ i T i

i ]

T ,

I en

O o

» <*5 w

<

Ν

Ο

FIG. 23

In

Cl d

sA _A>

ICPS

Jn

..-fi· m

___>>.-_rr2

Φ <\ł x>

C k° .V

..•tt (α «

*+

ΙΛ ©

Q - ο °ό vroNaosaNiwmiwaHD

Seł·»

FIG. 24 tn

N

O

YroNaosaNiwmiwaHo

174 430

Membrana teflonowa

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania filtra do filtrowania dymu tytoniowego posiadającego osnowę włóknistą, znamienny tym, że wzbogaca się filtr w substancję biologiczną wybraną spośród jednej lub większej liczby substancji zawierających żelazo, miedź i/lub magnez skompleksowane z pierścieniem porfirynowym i żelazo stereospecyficznie związane w cząsteczkach białka, przy czym materiał filtra impregnuje się jedną lub kilkoma wymienionymi substancjami i filtruje się otrzymany materiał aby usunąć niezaabsorbowane substancje biologiczne.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że substancję biologiczną dostarcza się jako roztwór 1-10 mg/ml w roztworze solanki buforowanej fosforanem o pH 7,4.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że impregnację materiału filtra substancją biologiczną prowadzi się przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się węgiel aktywowany wzbogacony substancją biologiczną.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancję biologiczną stosuje się hemoglobinę i/lub lizat erytrocytów.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się substancje biologiczne wybrane spośród jonów żelaza Fe²⁺ stereospecyficznie związanych z jedną lub z większą liczbą substancji, takich jak transferyna, katalaza, protoporfiryna, cytochrom C i chlorofil.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 4, albo 5, znamienny tym, że wzbogaconą osnowę włóknistą włącza się do zwykłego filtra papierosowego, w którym jest ona flankowana przez osnowę włóknistą nie wzbogaconą substancją biologiczną.