BG100404A

BG100404A - Метод за изработване на филтър за тютюнев дим

Info

Publication number: BG100404A
Application number: BG100404A
Authority: BG
Inventors: Ioannis Stavridis; George Deliconstantinos
Original assignee: Ioannis Stavridis; George Deliconstantinos
Priority date: 1994-06-27
Filing date: 1996-03-06
Publication date: 1996-08-30
Also published as: FI960904A; AU6979394A; NO960778D0; EP0720434A1; DE69429726T2; PL313224A1; AU693099B2; ES2171452T3; BG63797B1; PT720434E; ATE212196T1; LV11520A; NO984748D0; NZ267484A; LV11520B; CA2170610C; BR9407632A; US5909736A; JPH09504439A; NO984748L

Abstract

Изобретението се отнася до метод за изработване на филтър за задържане на токсични съединения, съдържащи се в цигарения дим, като NO, NОx, канцерогенни азотисти съединения, свободни радикали, H2O2, CO, алдехиди и микроелементи. По метода филтрите се импрегнират с биологични субстанции от метални йони като Fe2+, Cu2+, Mg2+, свързани с порфиринов пръстен, а също и Fе2+ йони, свързани стереоспецифично с протеинови молекули поотделно или в комбинации с последващо филтриране. Обогатяването на конвенционалните филтри не изменя нито свойствата на цигарения дим, като аромат, вкус и външен вид, нитосвойствата на самия филтър.

Description

Настоящото изобретение предлага методология за улавяне на отровни съединения, примерно азотни окиси, свободни радикали, алдехиди, водороден прекис, въглероден окис, микроелементи й£канцерогенни летливи азотисти съединенйя, за да не бъдат вдишвани при пушенето на цигари субстанции, които и досега не могат да бъдат задържани в задоволителна степен от конвенционалните цигарени филтри.

ТЕОРЕТИЧНО РАВНИЩЕ НА ИЗПОЛЗВАНИТЕ

ДОСЕГА ТЕХНОЛОГИИ

В многобройни публикации в международните списания се посочва, че цигареният дим е разделен на две фази: а) твърда фаза (катран) и б) газообразна фаза. Разделянето на тези фази става с помощта на класически т.н. Кембриджски филтър със стъклени влакна, който задържа 99,9% от частиците с големина над 0,1/Пт.Катранът от цигарата съдържа драстично високи концентрации от извънредно стабилни свободни радикали, които могат да бъдат класифицирани най-малко в четири различни категории. Семихиноните в равновесие с хинона и хидроксихиноните се считат за свободни радикали , чиито химически свойства представляват най-голям интерес. Хиноновата система /00015

редуцира молекулния кислород до суперокис(02 ), който след това вследствие на спонтанна дисмутация образува водороден прекис (Н2О2). В газообразната фаза има повече от 10^ органични радикали само в едно дръпване от цигарата, с период на полуразпадане по-малко от 1 секунда. Парадоксално е обаче, че въпреки това много кратко време на полуразпадане, тези радикали са в·състояние да поддържат високо ниво на активност в продължение на повече от 10 минути в газообразната фаза. Фактически концентрацията на тези радикали нараства значително, колкото повече се отива към края на ци гарения филтър. Обяснението на този парадокс може да се търси в поддържането на устойчиво динамично равновесие, дължащо се на продължаващото се образуване на свободни радикали ( Pryor ,W.A., Stone,К., Ann.Ν.Y.Acad.Sci.686:12-28,1993).

Азотният окис (NO)e най-значимият свободен радикал в газообразната фаза на цигарения дим, който по време на пушенето участва в поредица от реакции, в резултат на които се образуват азотен двуокис, изопренни радикали, пероксилни радикали и алкоксилни радикали. Следователно, цигареният дим съдържа значителен брой алдехиди, които допринасят за него вия увреждащ токсичен ефект. Доказано е, че и минимални количества от алдехиди, извлечени от цигарения дим, причиняват както катаболизъм на протеините, така и окисляване на тиоловите групи в плазмените протеини. Тези свойства на алдехидите се явяват резултат от реакциите между карбонилната гру па на алдехидите и -SH и -NH2 групите на плазмените протеини. Така например, акролеинът от цигарения дим влиза бързо в реакция с -SH групите и образува карбонилни съединения (Alving , К. , Forhem,C. , amf Lundberg,J.М. Br.J.Pharmacol. 110 : 739-746,1993).

В катрана от цигарения дим има микроелементи, например желязо, мед, манган и кадмий, които участват в множест во реакции и водят до образуването на силно активни вторичц ни радикали (например перокси радикали, алокси радикали, су.........4~

/00015

- 3 перокиси, цитотоксични алдехиди и др.). Внасянето на микроелементи в белите дробове пр време на пушене предизвиква серия редокс реакции както в белодробната течност, така и в алвеоларните макрофаги, което води до образуването на силно активни хидроксилни радикали (ОН*). Тези хидроксилни радика ли се образуват най-вече в присъствието на желязо по пътя на реакцията на Fenton. Медта също може да образува хидроксилни радикали чрез влизане в реакция с водородния прекис в белите дробове. Магнезият, в малки концентрации (10 ?М)стиму

лира разтворимата гуанилат циклаза в ендотелиалните клетки на белия дроб, предизвиквайки образуването на азотен окис и суперокис посредством положителен механизъм за обратна връз ка (Youn,Y.K.,Lalonde,С.,and Demling,R., Free Rad.Biol.Med.

12:409 ят окис се получава при изгарянето на тютюна. Известно количество С0 остава в белия дроб дори и след издишването, в резултат на което се стимулира разтворимата гуаналат циклаза след влизането му в реакция с хема на ен зимите в ендотелните клетки и други клетки от белодробната тъкан. Повишените нива на цикличен гуанозин монофосфат (cGMP) съчетани с позитивния пмеханизъм за обратна връзка, увеличават образуването на азотен окис и суперокис (Watson, A., Joyce,Н., Hopper,L., and Pride,N.В., Thorax 48: 119 124, 1993). Газообразният азотен окис, който може да бъде произведен от най-различни видове клетки, включително от ендотелните клетки на съдовете и от ретикуло-ендотелните клетки, причинява отпускане на гладката мускулатура (Lowenstein, С. J., Dinerman, J.L. , Snyder,S.H. ,Αηη. Intern.Med. 120:227-237,1994)

Съществуват също и външни източници на азотен окис, които също се смятат отговорни за причиняването на увреждания на кръвоносните съдове и други тъкани. Установено е със сигурност, че вторични и третични амини могат да влизат в реакция с нитрити и други азотизиращи агенти, за да образуват N-нитрозамини (Lowenstein,С.J., Dinerman,J.L., Snyder, ·· • · ·· ···· • · ·· • ··· • · · • ··· • · /Ό0015

S.H., Ann. Intern.Med. 120:227-237,1994). редица изследвания от 1974 г. насам доказват, че по време на брането, обработването и пушенето на тютюна алкалоидите се азотират в специфични за тютюна N-нитрозамини (Т5ИА).Измежду TSNA , идентифицирани в тютюна и/или в тютюневия дим, силно канцерогенни са N- нитрозонорникотинът (NNN), 4-(метилинникрозоамино)-1-(3-пирдил)-1-бутанонът (NNK) и 4-(метилнитрозамино)-1(3-пиридил)-1-бутанолът (NNAL).NNN предизвиква тумори на белия дроб при мишки, тумори на трахеата при хамстери и тумори на носната кухина и азофагуса при плъхове. NNK предизвиква тумори на белите дробове при мишки, хамстери и плъхове, а така също и тумори на черния дроб, носната кухина и пан креаса у плъхове. Орални промивки със смес от NNN и NNK водят до образуване на тумори на устната кухина и белите дробове у плъхове. Типичното количество на двете съединения NNK и NNN в една нормална цигара е 200, _ng /цигара (Hecht,S.S., Spratt,Т.Е., and Trushin,N. Carcinogenesis ,9: 161-165,1988).

Нашего изследване , отнасящо се до въздействието на цигарения дим върху белодробната тъкан, установи, че N0 влиза в реакция със суперокиса и образува силния окисляващ радикал пероксинитрит (0N00^-), който причинява вторични увреждащи реакции в основните биомолекули. Както метаболичният , така и увреждащият ефекти на N0 ^в клетките бяха изследвани в нашата лаборатория в експерименти ин витро и ин виво.

N0 се окислява в присъствието на кислород до азотен двуокис (NO2).Скоростта на това окисляване зависи от концентрацията на кислорода и от квадрата на концентрацията на N0. Азотният двуокис е ясноизразено цитотоксичен и се трансформира в нитрит и нитрат, когато е във воден разтвор. Нещо повече, N0 образува комплекси с някои микроелементи и/или с металопротеините, като хемоглобина например ( Wink,D.А., Darbyshire,J.F., Nims, R.W., Saavedra, J.Е., and Ford, P.E., Chem. Res. Toxicol. 6: 23-27, 1993).

·· ···· ··

/00015

- 5 N0 при взаимодействие със суперокиса образува отровното съединение 0N00 , което може да обясни някои видове токсичност на суперокиса. 0N00 е необикновено стабилен, като се има предвид неговия силно окислителен потенциал (+1,4V). По време на своето разпадане той образува силно окисляващи производни, включително хидроксилни радикали, азотен двуокис и нитрониев йон. В резултат на това , следователно, всяка една модификация в произвеждането на N0 и образуването на суперокис от тъканите може да доведе до образуването на силни вторични окислителни радикали. (Deliconstantinos, G., Villiotou,V., Stavrides,J.С., Cancer Mol. Biol. 1:77-86, 1994). И на последно място, ONOO и неговите естери (RO-ONO или RO-ONO₂) са склонни да инактивират инхибитора на алфа - 1 - протеиназата (а1Р1). Това може да се обясни с факта, че:

а) сам по себе си водородният прекис не причинява бърза инактивация на а1Р1 , ала действа само в присъствието на N0 ₍при което се образува 0N00 и настъпва бърза инактивация на а1Р1; б) разтвори от терт-бутил пероксинитрит(Р0-0-0-ДО₂) или 0N00 причиняват инактивация на а1Р1 сами по себе си,

в) амините и аминокиселините предпазват а1Р1 от бърза инактивация (Moreno,J.J. and Pryor,W.A., Chem.Res.Toxicol. 5: 425-431, 1992). Освен свободните радикали, съдържащи се в цигарения дим, активираните алвеоларни макрофаги представ ляват друг важен източник за възникването на свободни радикали у пушачите. Алвеоларните макрофаги, активирани от цигарения дим, са подложени нареспираторен взрив”, водещ до повишеното образуване на кислородни свободни радикали (главно 0₂ , N0 и Н₂О₂). У пушачите се констатира увеличен брой както на алвеоларните макрофаги, така и на циркулиращи неут рофили. Кислородните свободни радикали в циг· рения дим също биват посочвани като фактор за развиването на рак на белия дроб. Вдишваният цигарен дим причинява повишен окислителен стрес в белодробните клетки и води до намаляване на концентрацията на вътреклетъчни антиоксиданти. Н₂О₂ вслед -

/00015

ствие на производството на хидроксилни радикали влиза в реакция с ДНК на клетките и причинява прекъсване на двойната спирала. Тъй като това прекъсване може да бъде избегнато чрез добавянето на каталаза, имаме косвено потвърждение за увреждащото въздействие на Н2О2 и на хидроксилните радикали върху клетъчната ДНК (Leanderson,P.,Ann.N.Y.Acad.Sci.686:249,1993). Освен това H2O2 може да предизвиква трансформация в трахеалния епител на белите дробове и бива свързван с развиването на белодробен рак и бронхогенни карциноми у пушачите. Следователно , има сериозни основания да се твърди, че ^02, съдържащ се в цигарения дим, играе съществена роля за увреждането на белодробните клетки и за развиването на белодробен рак. Катранът от цигарения дим съдържа както семихинонови радикали, така и желязо, създавайки по този начин система за произвеждането на хидроксилни радикали. Различните мик роелементи, съдържащи се в катрана от цигарения дим (Fe, Си, Mn,Cd) могат да въздействат както интрацелуларно, така и екс- +

трацелуларно. Fe чрез добре известната реакция на Fenton: Fe²⁺ + H₂F₂ ----> Fe³⁺ + OH’ + OH

причинява множество окислителни реакции вследствие на хид роксилните радикали. Подобно образуване на хидроксилни ради2+ 2 + кали може да се получи от Cd . Μη е характер.ен стимулатор на активността на разтворимата гуанилат циклаза. Съдър2+ жащият се в цигарения дим Cd е извънредно токсичен за белите дробове. Оказва се, че пушачите имат в дробовете си два 2+ пъти по-висока концентрация на cd от нормалната концентрата. 2+ ция. Предполага се, че Cd измества Zn , при положе ние че е налице нормално състояние на ендотелия на белодробните съдове (Kostial,K. In:Trace Elements in Human and Animal Nutrition”(ed. W.Mertz) Fitth edit.,Vol.2:319-345, Academic Press, Inc. Orlando, Fl., 1986).

Алдехидите, съдържащи се в цигарения дим, влизат във взаимодействие с и ^на протеините, за да се превърнат в химически инертни в крайна сметка. Кротоналде

-/-00015 хидът (алфа ₍бета ненаситен алдехид), съдържащ се в цигарения дим, намалява концентрацията на -SH- групите и повишава концентрацията на карбонилните протеини (Stadtman,E.R., Science 257: 1220-1224, 1991).

В наше време се препоръчва горещо поставянето на филтри на цигарите. Крайната цел за поставянето на такива фил-

три е да се постигне максимално задържане на токсичните компоненти, съдържащи се както в газообразната, така и в твърдата фаза на цигарения дим. Епидемиологичните изследвания при пушачи показват, че съществува доза-зависещ отговор, независимо от това, дали цигареният дим е приет в газообраз на фаза, в твърда фаза или в комбинирана фаза (Surgeon General of the U.S.A. Public Health Service. The health con sequences of using smokeless tobacco, D.H. Publ. No 86-2874, Bethesda, MD, 1986). Доказано е, че измененията, внасяни

в самата цигара, представляват на практика опит да се на малят вредните съединения, съдържащи се в цигарения дим. Първоначално това е било постигнато чрез поставянето на известните досега филтри, а по-късно и чрез изменения в състава на тютюна посредством химична обработка. Внасяни са изменения и в изработването на цигарите, като са били използвани порьозна хартия или хартия, изготвена от тютюневи листа. През последните петнадесет години са правени много опи ти все с цел , да стане пушенето по-малко вредно за здра вето на човека, а именно чрез: намаляване на количеството на дима от една цигара, намаляване на диаметъра на цигарата и чрез използване на перфорирани филтри. Перфорираните филтри позволяват да се разреди цигареният дим с въздух до 50%. Активен въглен също се използва в комбинация с перфорирани филтри. Това може да доведе до рязко намаляване на отделяния катран и никотин в цигарения дим. Подобни технологии се използват главно в развитите страни, като Австрия, Канада, Франция, Германия, Швеция, Англия и САЩ. Средните стойности на отделяния катран и никотин в американската цигара бяха сведени от 38 ng и 2,7 ng през 1955 г. до /00015 mg и 1 mg ,съответно, през 1991 г. В Европейските страни тази тенденция към намаляване на отделянето на катран и никотин в цигарения дим продължава и сега. Горната допус тима граница за катрана от м. януари 1993 г. е определена на 15 mg , като същата предстои да бъде намалена до 12 mg от м. януари 1998 г. Независимо от това обаче, в някои други страни допустимото отделяне на катран в цигарения дим е mg (Mitacek, Е.J., Brunneman, K.D., Pollednak, A.P.q Hoffmann,D., and Suttajit, Μ., Prev.Med. 20: 764-773, 1991).

Промените, въведени при производството на цигари,са довели до специфичното отстраняване на някои токсични суб станции в цигарения дим, имат се предвид по-специално филтрите от целулозен ацетат, които бяха въведени именно за частичното отстраняване на полулетливите феноли и летливите N-нитрозамини (Brunnemann,K.D., Hoffman, D. Recent. Adv. Tobacco Res. 17: 71-112, 1989). Въглеродният окис се намалява селективно благодарение на използването на перфорирани филтри. Концентрацията на канцерогенни полициклични ароматни хидровъглероди (рАН) е редуцирана селективно благодарение на използването на тютюни, обогатени с нитрит. Незави симо от това, намаляването на РАН в тютюна чрез прилага.не на нитрит във високи концентрации води до нежелателно повишаване на канцерогенните N-нитрозамини. Необходимо е , следователно, да се търси намаляване на РАН с някакви други средства (Hoffman,D., Hoffman,I., Wynder,E. 1. Lung Cancer and the Changing Cigarette in Relevance to Human Cancer of N-Nitroso-compounds, Tobacco Smoke and Mycotoxins. 9eds. O’Neil, I.K., Chen, J., and Bartsch,H) Vol. 105:449-459 . 1991).

От изложеното по-горе става ясно, че се налага да бъде разработен филтър, който да е в състояние да задържа токсичните азотни окиси, свободните радикали, водородния пре кис, алдехидите и канцерогенните азотисти съединения, които

/00015

- 9 са причина за увреждащите въздействия на цигарения дим върху дихателната и сърдечно-съдовата система. За идентифициране на токсичните съединения, съдържащи се в цигарения дим, ние извършихме химични и биологични експерименти. Проведените химични експерименти включваха следното:

а) идентифициране и количествено определяне на N0 и Nox чрез използването на нов химичен и биологичен метод (разработен в нашата лаборатория);

б) идентифициране на свободните радикали чрез използване на луцигенин-индуцирана хемилуминисценция;

в) идентифициране на алдехидите и хинона чрез стимулиране на ензимната система луциферин-луцифераза (този метод също е разработен в нашата лаборатория);

г) идентифициране и количествено определяне на микроелементите с помощта на метода на окисляване на луциферина от луцифераза в присъствието на АТР (този метод също е разработен в нашата лаборатория);

д) идентифициране и количествено определяне на ΓΪ2θ2 с помощта на изолуминол-гмикропероксидаза-индуцирана хемилумин есценция;

е) идентифициране и количествено определяне на 0Ν00~πο спектрофотометричен начин и с луминол-индуцирана хемилуминесценция;

ж) идентифициране на канцерогенни нитрозо-съединения с луминол-индуцирана хемилумин ^.ценция.

Бяха извършени следните биологични експерименти:

а) идентифициране на N0 с помощта на изолирана активност на разтворима гуанилат циклаза в качеството на функционален параметър;

• · ·· ···· /00015

- 10 б) идентифициране на 0N00 чрез определяне на окислителния стрес на човешки еритроцити, индуциран от 0N00~;

в) идентифициране на CO чрез изолирана активност на разтворима гуанилат циклаза в качеството на функционален параметър.

Освен това бяха извършени и следните експерименти ин витро:

а) изолиране на алвеоларни макрофаги от бял дроб на плъх;

б) определяне на окислителния стрес на алвеоларни макрофаги, индуциран с терт-бутил-хидропероксидаза (t'.BHP);

в) определяне на NO/NO2~/ONOO , произведени от алвеоларни макрофаги;

г) определяне на произведен от алвеоларни макрофаги ;

д) въздействие на външния Н2О2 върху произвеждането на до от алвеоларни макрофаги.

Експериментите ин виво с доброволци бяха извършени с цел да се определят следните съединения:

а) определяне на N0 в издишвания въздух от непушачи;

б) определяне на N0 в издишвания въздух от пушачи;

в) определяне на N0 в издишвания цигарен дим;

г) определяне на 0Ν00 в издишвания цигарен дим;

д) определяне на свободните радикали в издишвания цигарен дим;

е) определяне на алдехидите в издишвания цигарен дим.

За определянето на N0, Nox а) съдържащ с в цигарения дим; б) произвеждан от алвеоларните макрофаги след провокиането им с цигарен дим, и в) съдържащ се в издишвания дим от • · • · · · · · /00015

доброволци, участващи в експеримента, ние разработихме камера от солидни пръчки от прозрачен плексиглас с диаметър 2,5 cm , които бяха издълбани от единия си край на винтонарезен струг, за да се получат идентични конични кухини във всяка една от плексигласовите пръчки, така че да се получи конично съединение, осигуряващо плътно прилягане между двете конични вдлъбнатини. Тънък тефлонов лист с квадратна форма (политетрафлуоретиден с дебелина 0,0015 инча) е поставен в конструкция тип сандвич между тези възли, които са осигурени посредством винтове с накатени глави. Двете входни тръби на всяка една страна на мембраната дават възможност да се инжектират биологично активни проби и реактивни субстанции, да се изтеглят или да се модифициратоткъм всяка една от страните на мембраната по време на биологичните реакции (Фиг. 1).

А. Определяне на С0 чрез хемилуминесценция

Бе изготвен стандартен разтвор на CO по литературни данни (Decloconstantinos, G., Villiotou,V., Fassitass,С. (1992 , J. Cardiovasc.Pharmacol. 12, S 63-65) и (Deliconstantinos, G., G. Villiotou, V., Stavrides, J.C., 1994, In: Biology of Nitric Oxide, eds. Feelish, M., Busse, R. , Moni% canda, S., Portland Press, in press). Реактивният разтвор съдържа балансиран солен разтвор на Hank (HBSS) , pH 7,4, Н2О2 (500 у/пМ), луминол (ЗО^пт) с общ обем 500/ⁿ Стъкленицата бе разбъркана енергично и емисията бе отчетена с луминометър Bedrthold AutoLumat LB953.

Б. Химично определяне на N0/N02~

Химичното определяне на N0 се базира на диазотизапоследващо окисда бъде прос в (DeliconstanCardiovasc.

12: 1992). д>лвеоларните макрофаги в HBSS цията на сулфаноламид ляване на скополатин, леден флуорометрично, tinos, G., Villiotou, Pharmacol .

с N0 при кисело pH и като този процес може както това е описано

V., Fassitass, C., J.

·· ··♦·

• · · · 4 « ·« · • · · · · 4 · · · · · ·· • ·· ··· 4 4 4 4 ··· • «4 4 4 4 4 4 · 4 4· /00015

- 12 £ (10 клетки/ml) бяха смеещи със 100/Ппот реагент, състоящ се от: 20% сулфаниламин в 20% Т^РОд ^и 25^яМ скополетин. Намаляването на флуоресценцията бе проследено при стайна температура (22^аС) с флуоресцентен спектрофотометър Aminco SPF-500. Флуоресценцията бе проследена непрекъснато във времето до поддаващия се на измерване наклон на кривата (приблизително 8 минути). След това измерените величини на наклона бяха превърнати в nmol на N0 с помощта на стандартна крива, построена с различни концентрации на чист N0. Нитритът (NC^ ), краен продукт от синтезата на N0 бе измерен на базата на тяхното натрупване в супернатантите на клетъчните култури посредством неговата реакция с реагента на Griess.

В. Спектроспско определяне на пероксинитрит (0N00 ) ONOO” бе синтезиран, титриран и съхранен съгласно описанието в . (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stav¾ rides, J.C., In: Biology of nitric oxide (eds. Feelisch, M., Busse, R., and Moncada, S), Portland Press (in press.) Поради нестабилността на 0N00 при pH 7,4, ултравиолетовите спектри бяха регистрирани веднага след приготовляване на разтвора от Н_о0_о и N0. Концентрацията на 0N00 бе опреде ²² -1-1 лена на база £.302 nm стойност за 1670 М cm . Ултра виолетовите спектри бяха показани след изваждане на базал ните ултравиолетови спектри за Н2О2 при съответните концентрации.

Г. Определяне на свободните радикали

Определянето на свободните радикали бе извършено с помощта на индуцирана с луцигенин/DAMCO (1,4 диазабицикло1 2,2,2юктан) хемилуминесценция , както това е описано вече в Deliconstantinos, G., Krueger, G.R.F., J. Viral Dis. 1: 22-27, 1993). Реакционната смес бе съставена от HBSS pH 7,4; луцигенин (30/пМ); DAMCO (100/гМ.). След енергично разбъпкване на стъкленицата емисията бе регистрирана с луминометър Bedrthold AutoLimat LB953. Бяха използвани вещества, задържащи кислородни свободни радикали ( SOD , манитол, • ·· · • · ·· /00015

- 13 хистидин, метионин).

Д. Определяне на микроелементи и алдехиди

Анализите се базираха на катализирано с луцифераза окисляване на D-луциферин в присъствието на АТР-магнезиева сол в съответствие с реакцията луцифеLH_?+ATPMg2⁺+0₉--²-^-^a---оксилуциферин+ATP+O«+PPi+Mg2⁺+ ^свет ^{z 1 L} лина

Микроелементите Cd^⁺, Cu^⁺, Fe^⁺ повишават луцифе разната активност и максималния хемилуминисцентен отговор се увеличвава пропорционално на концентрацията на микроелементите до 10 pH 7,4, с общ обем пп

Реакциите се осъществяват в

0,5 ml.

HBSS с

За определяне на алдехидите бе използвана същата ензимна система луциферин/луцифераза, но вече в отсъствието на АТР. Използваните реагенти бяха взети от кит за анализ на ATP (Calbiochem-Novabiochem СА, U.S.A.).

Е. Изолиране на алвеоларни макрофаги

В резюме, плъховете бяха умъртвявани с интравенозно инжектиране на натриев пентобарбитал, след отваряне на торса белите дробове бяха перфузирани с несъдържащ Са^ леден (4°С) буфериран с фосфат физиологичен разтвор ( pgg _}pH 7,4) _иизвадени цели от гръдната кухина. Хомогенатът от белия дроб на плъховете бе получен чрез няколкократно прекарване на тъканта през игла на спринцовка и след това пресяване през все по-фини филтри от неръждаема стомана в обхвата 32, 62 и 68 отвора на 1 инч, или съответна телена мрежа, под по стоянен поток от балансиран солен разтвор на Finkelstein ( FBSS,pH 7,4). Крайната суспензия от алвеоларни макрофаги бе сгъстена, филтрирана и центрифугирана при 300 Xg jb продължение на 10 минути , за да се пелетират клетките. Кле ·· ···· /00015

- 14 тъчната пелета, съдържаща повече от 98% макрофаги, бе промита и ресуспендирана в разтвор на Ringer Процедурата бе повg торена два пъти. Изолирани бяха приблизително 10x10 макрофаги от един плъх. Жизнеспособността бе оценявана според отблъскването на трипан блу.

Ж. Идентифициране на азотисти съединения

Нитрозо-съединенията бяха идентифицирани чрез бавното отделяне на азотен okhc(NO) след третиране с Реакционният разтвор бе съставен от диметил нитрозамин и/или диетил нитрозамин (1/пМ ); Η£θ2 ^00 /пМ); луминол (30 /ПМ) в HBSS ΡΏ 7,4, общ обем 0,5 ml. След енергично разбъркване на стъкленицата емисията бе регистрирана с луминометър Bedrthold AutoLumat LB953 За идентифициране на образСуването на 0N00 бяха използвани манитол (100 mM );DMSO (100 тМ) и цистеин (З7О тМ))·

3. Изолиране на алвеоларни макрофаги

В резюме, плъховете бяха умъртвявани с интравенозно инжектиране на натриев пентобарбитал, тораксът бе отво 2+ рен, белите дробове бяха перфузирани с несъдържащ Са леден буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS; рН7,4) и бяха извадени цели от гръдната кухина. Хомогенатът от белия дроб на плъха бе получен чрез многократно прекарване на тъканта през игла на спринцовка и последващо постепенно преминаване през все по-фини филтри от неръждаема стомана с обхват 32, 62 и 68 отвора на 1 инч (респективно мрежа) и при непрекъснат поток от балансиран солен разтвор на Finkelstein (FBSS; рН7,4) . Крайната суспензия от алвеоларни макрофаги бе сгъстена, филтрирана и центрифугирана при 300 Xg в продължение на 10 минути за да се пелетират клетките. Клетъчната пелета, съдържаща повече от 98% макрофаги, бе промита и ресуспендирана в разтвор на Ringer. Тази процедура бе повторена два пъти. От един плъх бяха изолирани ·· ·· ·· ···· ·· ·· /00015

- 15 Ο средно 10x10 макрофаги. Жизнеспособността бе определяна според отблъскването на трипан блу.

И. Окислителен стрес на алвеоларните макрофаги, индуциран с t-бутил-хидропрекис (t-BHP)

Генерирането на кислородни свободни радикали от алвеоларните макрофаги, индуцирано от t-BHP (2,5mM) ^{8е оп}Р^еД^еляопо метода на луминол-индуцираната хемилуминесценция. Хемилуминесцентният отговор бе регистриран в луминометър Bedrthold AutoLumat LB953> както това е' описано в: (Deliconstantinos, G. , Krueger,G.R.F., J.Viral Dis. 1,22-27,1993).

K. Определяне на водородния прекис ( Н2О2)

Изготвена бе смес от изолуминол/микропероксидаза (100 тМ натриев борат, 1 тМ изолуминол, 0,01 тМ микроперок сидаза в 70% вода и 30% метанол при pH 8)л.5О _ηχ .от този / θ реагент бяха смесени с изолираните алвеоларни лакрофаги (10 клетки) в HBSS в общ обем 0,5 ml. Хемилуминесцентният отго вор бе превърнат в nmol на Н2О2, като за целта бе използвана стандартна крива, построена с различни концентрации на чист Н2О2.

Л. Изготвяне и пречистване на разтворима гуанилат циклаза(зСС) за определяне на CO

Разтворима гуанилат циклаза (sGC) от човешки ендо тедни клетки бе подложена на пречистване чрез GTP-arapo_знахроматография. Цитозоли (10 mg протеин) бяха прибавени към GTP-arapc£_Ha колона (1,8x9 ст)предварително уравновесена с 25 тМ буфер на Tris-HCl ,рН 7,6, съдържащ 250тМ захароза и 10 тМ МпС1₂. След тоЬа sGC ^бе отмита от колоната с 5 _mj_ уравновесен буфер плюс 10 _тм GTP.

• · /00015

- 16 М. Определяне на цикличния монофосфат (cGMP)

Концентрациите на cGMP бяха определени с радиоизото пен имунен анализ след ацетилиране на пробите с оцетен ан дрид (Deliconstantinos, G., and Kopeikina, L., Anticancer

Res. 9: 753-760, 1989). Реактивната смес съдържаше трита ноламин (lmM); креатин фосфат (5 mM); MgCl₂ (3 тМ) ; ;изобутил-метилксантин (1 тМ), креатин киназа (0,6 единици);

(1 тМ), разтворима гуанилат циклаза (l^ng протеин) в общ обем 150/П1,Реакциите бяха инициирани чрез добавяне на GTP и бяха инкубирани в продължение на 10 минути при 37°С. Инку бационната среда бе аспирирана и cGMP бе екстрахиран чрез добавянето на ледена HCI (0,1 М). След 10 минути пробите бяха пренесени на плочка, изсушени и поставени наново в 5 п»М натриев ацетат (pH 4,75) за определяне HacGMP . Образува ният cGMP бе определен с помо щга на кит за анализ HacGMP (Amersham).

ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Целта на настоящото изобретение е да разработи и приложи методи, при които се използват биологични субстанции, които въздействат специфично и пречистват следните вещества:

а)	N0 ^и N0x,
б)	CO,
в)	Н₂°2
г)	свободни радикали,
д)	алдехид-хинони,
е)	канцерогенни азотисти	съединения,
ж)	задържат микроелементите	кадмий, мед, манган,
	лязо и пр., вдишвани	при	пушене на цигари.

Изобретението изхожда главно от положението, че:

а) съществува подбор от задържащи вещества, като хемоглобин или лизати от еритроцити или някакви други субстанции, съдържащи стереоскпецифично свързано желязо;

/00015

- 17 б) съществува подбор задържащи вещества, които съдържат порфиринов пръстен с желязо (например протопорфирин);

в) съществува подбор от задържащи вещества, които съдържат порфиринов пръстен, без да е задължително той да съдържа желязо;

г) съществува подбор от задържащи вещества, които съдържат порфиринов пръстен, попълнен с други метали, например

д) разработен е биотехнологичен процес за обогатява не на използваните досега конвенционални материали при производството на цигарени филтри, който процес да включва из броените по-горе задържащи биологични субстанции.

Основната идея на настоящото изобретение почива на концепцията, че импрегнирането на общоизвестните конвенциални цигарени филтри и/или на филтри, съдържащи активен въглен, може да бъде обогатено с биологични субстанции, харак2+ 2+ теризиращи се с присъствието на метални иони Fe , Си , Mg^Z+, попълнени с порфиринов пръстен, а така също и с Fe^Z+, свързани стереоспецифично към протеиновите молекули , позволявайки по този начин да бъдат задържани вредните съединения, съдържащи се в цигарата, още преди пушачът да вдъхне цигарения дим. Това е основната характеристика на предлаганото изобретение, което представлява безспорно иновация с голямо промишлено приложение.

МЕТОДИ ЗА ПРОМИШЛЕНО ПРИЛОЖЕНИЕ

Изобретението бе разработено с оглед на прилаганео му на промишлено равнище, по следния начин:

Изготвен е разтвор от lmg/ml хемоглобин и/или лизат от еритроцити в буфериран с фосфат физиологичен разтвор с pH 7,4. Разтворът бе прибавен към lOOtng активен въглен.Инкубацията бе извършена в продължение на 30 минути при стайна температура , след което сместа бе филтрирана с помощта • · • · · · · · : : ·.. :/οοσΐ5 • · · · · · · · ····

на филтърна хартия S&S Carl Schleicher & Schuel Co U.S.A. Количеството неабсорбиран хемоглобин от филтрата бе определено по спектрохроматографски начин. Обогатеният с хемоглобин въглен бе оставен да изсъхне при стайна темпера тура. Количеството от 200 mg сух въглен, обогатен с хемоглобин, бе поставено като конструкция тип сандвич между конвенциални цигарени филтри, така че целият цигарен дим, пре минаващ през филтрите, да бъде в контакт с активните групи на молекулите (Fe²⁺, Fe³⁺, -SH, -SH₂) - Фигура 2 .

В този си вид вече тези комбинирани материали могат да се използват за изработването на нов вид цигарени филтри, които ще наричаме от сега нататък биологични филтри.

Алтернативно хемоглобинът може да бъде заменен с биологични субстанции, характеризиращи се с присъствието на ме04* 2 + 2+ тални иони Fe , Cu , Mg , свързани с порфиринов пръс-„

2+ тен, както и с Ре , свързани стереоспецифично към протеинови молекули, като например трансферни, каталаза, прото порфирин, цитохром С, хлорофил.

Алтернативно, бе изготвен разтвор 5 mg/ml от хемоглобин и/или лизат от еритроцити в буфериран с фосфат физио логичен разтвор ( PBS) с pH 7,4, който разтвор бе сканиран при 25°С с помощта на записващ спектрофотометър Acta Beckman . Неизменно бяха наблюдавани върхови стойности на поглъщане при 540 nm и 575 nm (Smith,R.P., Kruszyma, Н. J.Pharmacol. Exper. Ther. 191, 557-563, 1974). Обикновени цигарени филтри бяха импрегнирани с тези разтвори, след което бяха изсушени на въздух при температура 25-35°С. При това положение тези съвместими материали са готови за използване при производството на новите цигарени филтри, които ние ще наричаме от сега нататък биологични филтри. Тези нови биологични филтри осигуряват цялостен контакт на вдишвания дим с активните групи на хемоглобинните молекули и/или на лизатите във филтъра, без да се променят физичните свойства или вкуса на ци гарения дим. По естетически съображения е възможно към външ ния край на биологичния филтър да се прибави малка част - око/00015

- 19 ло 3 ^ram·

Някои алтернативни промишлени методи предвиждат следното :

Изготвен е разтвор от 5 mg/ml протопорфирин в буферен разтвор (PBS) pH 7,4, сканиран при 25°С с помощта на записващ спектрофотометър Acta Beckman. Екситацията на протопорфирина с ултравиолетова светлина (498-408) дава оранжевочрвена флуоресценция между 620 и 630 nm. След това с горния разтвор бяха импрегнирани (напоени) обикновени цигарени филтри, които бяха изсушени на горещ въздух (25-35°С).

Алтернативно, разтвор от 5 mg/ml трансферни в PBS, pH 7,4 се сканира с помощта на записващ спектрофотометър Acta Beckman. ₽е⁺⁺⁺-трансферинът показва характерен спектър от 470 nm. Използва се описаният по-горе метод за изработване на биологичен филтър.

Алтернативно, изготвя се разтвор от 5 mg/ml от каталаза в PBS,pH 7,4. Използва се описаният по-горе метод за изработване на биологични филтри.

с w

Алтернативно, изготвя се разтвор от 5 mg/ml цитохром С в PBS,pH 7,4. Използва се описаният по-горе метод за изработване на биологични филтри.

Алтернативно, изготвя се разтвор от 5 mg/ml хлорофил в PBS,pH 7,4л Използва се описаният по-горе метод за изработване на биологични филтри.

Алтернативно, споменатите по-горе биологични субстан ции се поставят в конструкция тип сандвич между два обикновени филтри в твърда форма, така че целият цигарен дим, • · · ··

/00015

- 20 засмукан през филтъра, да влезе в контакт с активните гру94· 9 + пи на молекулите(Fe , Fe^J , -SH, -Nl^)·

АНАЛИЗ HA РЕЗУЛТАТИТЕ

Твърди се, че различните биологични субстанции, из ползвани за обогатяване на конвенционалните филтри, задържат токсичните съединения (N0, С0, свободни радикали, Н2О2, алдехиди и микроелементи, както и азотисти съединения), съдържащи се в цигарения дим, в различна степен, както това може да се види от следната таблица:

ЗАДЪРЖАЩИ ВЕЩЕСТВА	Ino %	CO %	Свободни радикали %	Η2θ2 %	Алдехида %	Нитрозо-съеданения %	Микроелементи 8%
Хемоглобин	90	90	90	80	90	90	95
Трансферни	85	90	60	60	60	75	50
Каталаза	85	90	90	90	80	80	80
Протопорфирин	85	90	70	80	70	75	80
Питофром С	85	80	70	80	60	60	70
Хлорофил	15	10	40	15	10	10	80

**· и ''

Определена бе степента на задържане на силноувреждащи субстанции в цигарения дим, като цигареният дим (20ml) е филтриран през биологичен филтър, сравнен с дима, ( 20ml) филтриран през конвенционален филтър. Само 1 ml цигарен дим, преминал през конвенционалния филтър бе сравнен с 40ml цигарен дим, преминал през биологичен филтър. Оказа се, че биологичния филтър има 40 пъти по-голяма способност да задържа микроелементи, в сравнение с познатите досега конвенционални филтри.

По-долу са приведени избрани представителни експериментални резултати, с оглед да се илюстрира по-добре действието на въпросните биологични субстанции.

а) Идентифициране на N0 , съдържащ се в цигарения дим, с помощта на метода на хемилуминисценцията

С·· ·· ·· ···· ·· ·· «·· · · · · · · • ···· · · · · ···· • · · · · · · ··· · · · ············ /00015

- 21 NO б® идентифициран c помощта на индуцирана с луминол хемилуминесценция, както това бе описано в експерименталния раздел. На Фигура 3 и Фигура 4 са показани данните от типичен експеримент за идентифициране и определяне на N0, както и за неговото пречистване след преминаване на цигарения дим през биологичен филтър. Видно е, че от хемоглобина са били задържани повече от 90% от N0 · Ефективността на биологичните филтри се проявява в задържането и неутрализирането на N0 _t който участва в токсични реакции както в белодробните клетки, така и белодробната течност, особено когато бъде включен в образуването на силния окислител 0Ν00.

б) Идентифициране на свободните радикали, съдържащи се в цигарения дим, с помощта на хемилуминесценция

Свободните радикали в цигарения дим бяха идентифицирани с помощта на хемилуминесцентния отговор, предизвикан от система луцигенин/DAMCO след реакция със свободните радикали. На Фигура 5 е показан характерен пик, регистриран до 2 секунди след хемилуминесцентния отговор, който след преминаване на дима през биологичен филтър бе инхибиран 100%. Задържането на свободните радикали от биологичния филтър потвърждава предположението, че може да се очаква намаляване на окислителния стрес в алвеоларните макрофаги, който цигареният дим причиняваше досега.

в) Идентифициране на Н2О2, съдържащ се в цигарения дим, с помощта на хемилуминесценция

Н2О2 бе определен чрез хемилуминесцентния отговор, получен от системата изолуминол/микропероксидаза. На Фигура 6 е показан характерният пик на хемилумин .· сценцията, дължащ се на присъствието на Н2О2 в цигарения дим. В присъствието на каталаза (100 единици/ml ) хемилуминесцентният отговор бе инхибиран приблизително 90%. При пропускане на цигарен дим през биологичен филтър задържането на хемилуминесцентния отговор възлиза на 80%. Системата изолуминол/микропероксида···· • · • ··· · · · · · ··· /00015

- 22 за е специфична за идентифицирането на Н2О2 . Свободните радикали, съдържащи се ζ цигарения дим, предизвикват хемилуми-у несцентен отговор _за' много кратко време ' след тяхното 7 влизане в реакция с изолуминола. Този твърде кратък хеми луминесцентен отговор е приблизително 10% от общата хемилуминесценция, предизвикана от Н2О2 в присъствието на свободни радикали, тъй като' каталазата инхибира максималния хе - -¼ милуминесцентен отговор цо 90%. Задържането на Н2О2 очевид- ' но намалява както окислителния стрес, така и произвеждането на no в алвеоларните макрофаги.

ί^;

г) Идентифициране на микроелементите и алдехидите, * съдържащи се в цигарения дим, с помощта на ензимната система луциферин/луцифераза

Микроелементите, съдържащи се в цигарения дим, бяха идентифицирани посредством тяхната способност да стимулират ^Алуциферазната активност. На Фигура 7 са изобразени:

1) хемилуминесцентен отговор, предизвикан от окисляването на луциферин в присъствието на АТР;

2) засилен хемилуминесцентен отговор в присъствието на cd² + иони (0,5 mg);

3) засилен хемилуминесцентен отговор в присъствието на Си + иони (0,5 mg);

4) засилен хемилуминесцентен отговор, предизвикан от цигарен дим (1 ml ) , и

5) инхибиране на хемилуминесцентния отговор ( в сравнение с отговора, предизвикан от цигарен дим), предизвикан от 40 ml цигарен дим, пропуснат през биологичен филтър. Видно е, че хемилуминесцентният отговор, предизвикан от микроелементите, съдържащи се в нормалния цигарен дим, е 40 пъти по-силен от отговора при дима, преминал през биологичен филтър. Задържането на микроелементи в биологичния филтър може да има както кратковременен, така и продължителен ефект. Кратковременното му действие може да доведе до инхибиране ·· • · · ·

’/oob’is

на редокс реакциите, така че те да не се осъществяват в белия дроб ( Fe, Μη)> ^а дълготрайното му действие ще се изрази в инхибиране на уврежданията на съставките и субстанциите в човешката кръв (^Jd).

Алдехидите, съдържащи се в цигарения дим, бяха идентифицирани и определени с помощта на същата ензимна система луциферин/луцифераза в отсъствието на АТР. А*лдехидите имат способността да предизвикват окисляване на луцеферина. На Фигура 6 е показан характерният хемилуминесцентен отговор, който може да продължи повече от час. Този хемилуминесцен тен отговор можа да бъде инхибиран 100%, след пропускане на същия цигарен дим през биологичен филтър - коетолпотвърждава голямата възможност на биологичния филтър да за държа токсичните алдехиди.

д) Идентифициране на нитрозо-съединенията , съдържащи се в цигарения дим

Идентифицирането на нитрозо-съединенията, съдържащи се в ьигарения дим, бе осъ ществено чрез проследяване на бавното отделяне на N0 °^т нитрозо-съединенията след тяхното третиране с Н2О2> Както е показано на Фигура 9, пик в хемилуминесцентния отговор бе получен някъде след 900 секунди. Преминаването на цигарения дим през биологичен филтър показа 90% инхибиране в наблюдавания хемилуминесцентен отговор, като пикът бе отчетен някъде към 1200 секунди. Показано е също така бавното отделяне на от натриев нитропрусид (SNP)^CJiefl третирането му с Н2О₂· На Фигура 10 е показано бавното отделяне на nq в двата случая: от нитрозо-съединенията диетил нитрозамин и диметил нитрозамин, и от хемоглобин, обогатен с нитрозо-съединения от цигарен дим, третиран с Н₂О₂· Ясно е,че N0,отделен от нитрозо-съединенията ,намиращи се в цигарения дим, които са образували присъединителни съединения с хемоглобина, следват същата схема на отделяне на НО както нитрозо-съединенията диетилнитрозамин и диметилнитрозамин. На Фигура 11 е показа• · • · • · /00015

но отделянето на N0 от нитрозо-съединенията в цигарения дим, образували присъединителни съединения с хемоглобина, след като присъединителните съединения хемоглобин/нитрозо-съедиение са били облъчени с (JVB (100 mJ/cni ) в продължение на една минута. Отделянето на N0 θ определено в присъствието на Н2О2, като хемилуминесцентен отговор се получава на първата секунда. Степенното нарастване, наблюдавано на Фигура 11, се дължи на въздействието на Н2О2 върху хемоглобина (реакция на Fenton ).

ί 4'.

е) Произвеждане на N0 от белодробните макрофаги /

Бяха проведени експерименти ин витро с помощта на спе циална камера, разработена в нашата лаборатория - вж. Фигура 1. Тефлоновата мембрана, отделяща двете части на камера та, е проницаема за газообразния N0 и 0Ν00- · Непровокираните белодробни и непроницаема за N0^ макрофаги, изолирани по начина, описан в експерименталния раздел, бяха суспендирани в буферен разтвор HBSS (1 ^х 10^-клетки/ml ) и поставе ни в отделение А на камерата. В отделение Б на камерата бе поставен 2,5ml реагент на Griess или реагент от сулфаниламид/скополетин. N0,отделен от макрофагите в отделение

А, преминава през тефлоновата мембрана в отделение Б и се свързва с реагента на GrieseiwH реагента от сулфаниламид/скополетин, като остава задържан там. Това доказва, че белодробните макрофаги произвеждат газообразен no. Количество то N0 , което в този случай ще се намира в отделение Б на камерата, бе определено по спектрофотометричен начин или по и N0₂- >^на определени флуорофотометричен начин. Количествата 0N00миращи се в отделение А на камерата, също бяха с помощта на реагента на Griess и/или реагент от сулфанил амид/скополетин.

Горните експерименти бяха повторени след провокиране на макрофагите с цигарен дим, преди поставянето им в отде·· · · · · ···· · · • ··· /00015

- 25 ление А на камерата. Резултатите, дадени на Фигура 12, показват, че цигареният дим .намалява¹ количеството N0 > произвеждано от белодробните макрофаги, съпътствано същевременно от увеличение на производството на 0N00- , така че показва? косвено бурното произвеждане,както на ЬЮ,така и на О^влизащи във взаимодействие за образуването на 0N00-.

Повтарянето на горните експерименти с използване на биологични филтри (например , когато цигареният дим бъде оставен да премине през биологичния филтър) показаха, че използваните биологични субстанции, отделят същите количе ства N02“ и ON00- в отделение А на камерата, и подобни количества ^0 ^в отделение Б на камерата, както макрофагите, които не са били провокирани с цигарен дим. В този контекст бяха използвани също и компонентите на реагента HaGtiess с цел да се изпита кинетиката на азотизация от междинното съединения (междинните съединения), получени по време на реакцията ^q/q във воден разтвор бавянето на цигарен дим (50 ml) към при pH физиологично. При100 тМ фосфагов разтвор pH 7,4, съдържащ 25 тМ сулфаниламин и 2,5 тМ N -(1-нафтил етилендиамин дихидрохлорид (NEDD) генерира абсорпция при kmax = 496 mm което говори за получаването на характерен азо продукт в резултат на азотизацията.

Интересно би било да се съпоставят горните констатации с очакваните за N0 реакции при физиологично релевантни условия, където са измерени максимални концентрации на в клетъчната микросреда от порядъка на 0,5-10 /пМ.

Концен трациите на N0 нарастват драстично по време на тютюнопушене, с пагубно въздействие върху белодробните клетки.

ж) Окислителен стрес на белодробните макрофаги

Резултатите относно въздействието на цигарения дим върху окислителния стрес на белодробните макрофаги са даде• · • · · ·· · · · · • · ··· · · · · · ··« • · · ♦ · · · · · · ·· /00015

ни на Фигура 13. Определянето на окислителния стрес с помощта на t-BHP показва, че цигареният дим предизвиква два пъти по-голям окислителен стрес отколкото непровокираните с цигарен дим макрофаги. След пропускане на цигарен дим през биологичен филтър, бе наблюдаван окислителен стрес, подобен на този при непровокирани белодробни макрофаги. По този начин ясно проличава елиминирането на окислителния стрес, пре>

дизвикан от действието на цигарения дим върху макрофагите. В този случай цигареният дим е освободен вече от субстанциите, предизвикващи окислителен стрес в белодробните макрофа ги.

з) Η2θ2’ ^пР^оизвежД^{ан от} белодробните макрофаги

Произведеният от макрофаги, провокирани с цигарен дим, 1^02 е 10 пъти повече от количеството, произведено от непровокирани макрофаги. Използването на ' . биологични филтри показва към 90% намаление на произвеждането на Η2θ2 ,($игу ра 14), в сравнение с отделянето при конвенционалните цигарени филтри. Видно е, че индуцирайки окислителен стрес в макрофагите, цигареният дим увеличава и производството на токсичен Η2θ2 ^{в тези} клетки.

г*

и) Двуфазни експерименти

Количеството цикличен GMP , произведено от N0 отделян от алвеоларните макрофаги, бе определено с помощта на камерата, показана на Фигура 1. В отделение А на камерата бе поставена разтворима гуанилат циклаза, а алвеоларните макрофаги бяха поставени в отделение Б на същата камера. Количествата N0, произведени от макрофагите, бяха определени след изтичане на 50 минути, с клетки провокирани и непровокирани с цигарен дим. Макрофагите, провокирани с цигарен дим (10 ml), отделиха около 10 пъти по-малко количество N0 ^в сравнение с клетките, нетретирани с цигарен дим, демонстрирайки по то-

/00015

- 27 зи начин десетократно по-слабо отделяне на 6МР.

Горната процедура бе повторена, като бе използван цигарен дим, преминал през биологичен филтър. Получена бе статистически несигнификантна разлика в сравнение с не провокираните макрофаги (контролата) -> Фигура 15. Натрупването на N0 в отделение Б бе увеличено повече от 5 пъти,когато алвеоларните макрофаги бяха третирани с Н2О2 (5 тМ) Фигура 16. Това подсказва, че Н2О2 увеличава отделянето на N0 посредством позитивен механизъм за обратна връзка.Биохимичната верига ь-аргинин/ N0 в макрофагите потвърждава концепцията, че цигареният дим причинява отделянето на N0/ 0N00-.

к) Идентифициране на въглеродния окис (С0) в цигарения дим

Присъствието на С0 в цигарения дим бе установено с помощта на биологичен метод, базиращ се на стимулацията на разтворимата гуанилат циклаза от С0.

Въвеждането на HBSS ,наситен с цигарен дим, в отделение А на камерата, в присъствието на суперокис, с цел да се неутрализира N0 , и въвеждането на разтворима гуанилат циклаза в отделение Б на камерата доведе до повишаване на отделянето на цикличен GMP вследствие на преминаването на С0 от отделение А в отделение Б. Пропускането на цигарения дим през биологичен филтър намали количеството на .получения cGMP близо 80% - Фигура 17. Посочените данни показват, че ток сичните субстанции NOx и С0, съдържащи се в цигарения дим , са задържани и неутрализирани от биологичния филътър.

ЕКСПЕРИМЕНТИ ИН ВИВО

а) Най-напред ние подтвърдихме присъствието на N0 и 0N00- ^в издишвания цигарен дим. С помощта на доброволци, участващи в експеримента, при пушене на цигари с конвенционален • « « ·· · • · ·· • · • ··· • · • · /00015

филтър бе установено присъствието на N0 в издишвания цигарен дим, идентифицирано след въвеждане на издишвания въздух в киселинен разтвор (50ш1 ) pH 4. Концентрацията на

N0 бе определена с луминол-индуцирана хемилуминесценция, като този метод бе описан в експерименталния раздел. Използвана бе стандартна крива, построена с предлагания в търговската мрежа N0. Концентрацията на N0 бе определена на 0,045 тМ · Експериментите бяха повторени с използване на биологични филтри, при които концентрацията на N0 във вдишвания въздух се оказа близо 70% по-ниска в сравнение с кон центрацията при конвенционалните филтри - Фиг. 18.

Концентрацията на 0NOO- бе определена с помощта на разтвор от NaOH 1.2М > като показа увеличение на абсорпцията при 303 _nm - Фигура 19 (£ = 1670 πΆπΓ¹ )НаЗОЗпш шите експерименти показаха, , че по време на пушене издишваният въздух съдържа големи количества 0Ν00- (пропускането 50 т1издишан дим през 5ml NaOH 1.2 М даде разтвор от 0,9 mM 0N00-). Отношението NO/ONOO- в издишвания дим бе определено на 1:20.

Следователно, NOx в белите дробове се трансформира ^в 0N00-, когато влезе във взаимодействие със суперокиса в ζ* белия дроб. Суперокисът се произвежда както от макрофагите, така и от редокс реакциите, протичащи в белите дробове при пушене. Цигарен дим, получен с помощта на помпа, не съдържа 0Ν00-, . но известно количество NOx влиза в реакция със суперокиса или кислорода и образува азотисти иони (no -). 0N00- се образува само когато цигареният дим навлезе^ белите дробове. Използването на биологични филтри намалява издишваните количества NO «ΟΝΟΟ-^ο 70%.

б) 0N00- влиза във взаимодействие с бикарбонатните иони в човешките еритроцити съгласно реакцията;

0N00- + НСО₃НСО₃ + N0₂ + он·· ·· ··· · · · · · · • · ··· · · · · · ·♦· • ·· · · · · ··· · · · • · · · · · · · ···· ·· ·· ·· · · · · · · /00015

- 29 Бикарбонатният радикал окислява както луминола, така и ароматните и хетероцикличните молекули. Като алтернатива, 0N00- може да окисли бикарбоната до пероксибикарбо нат, друг силно окисляващ радикал. От друга страна, суперокисната дисмутаза (SOD) катализира азотизацията οτΟΝΟΟи широка гама от фенолови съединения, в това число тирозина и протеините.

Следователно съществуват няколко възможни механизми, чрез които бикарбонатът и SOD могат да въздействат върху общата реактивност на 0N00- в клетките. Присъствието наОЬЮО-, образуван в белите дробове от вдишвания цигарен дим, предизвиква рязко повишаване на окислителния стрес в еретроцитите, което бе определено чрез хемилуминесцентния отговор, появяващ се след 5 секунди. Същият експеримент, проведен с биологичен филтър, показа близо 100% инхибиране на окислителния стрес в човешките еритроцити - Фигура 20. Хемоглобинът или лизатът от еритроцити, подложени на 0N00- (съдържащ се в издишвания цигарен дим), водят до заличаване на двете върхови стойности при 540 _Пш и 575 nm , наблюдавани нормално за хемоглобина.

Резултатите от представителен експеримент, подобен на описания по-горе, обхващат 12 доброволци и са показани на Фигура 21. Когато хемоглобинът и/или лизатът от еритроцити бяха подложени на въздействието на малко количество издишван дим (10 ml ), бе наблюдавано изместване на върховите стойности от 540 и 575 към 525 и 555 nm , дължащо се на образуването на нитрозил хемоглобин. Експериментите бяха повторени вече с биологичен филтър. Наблюдаваните върхови стойности в този случай запазиха характерните дължини на вълните.

в) Алдехидите бяха идентифицирани в издишвания от доброволци-пушачи цигарен дим посредством характерната вър• · • · · · • · /00015

- 30 хова стойност на хемилуминесценция. Експериментите бяха повторени с биологични филтри, като бе констатирано 90% намаление на хемилуминесцентния отговор в сравнение с максималния хемилуминисцентен отговор, регистриран при използването на конвенциални цигарени филтри - Фигура 22. Видно е, че биологичните филтри задържат и неутрализират алдехидите в цигарения дим, задържайки окислителите и инхибирайки явно инициирането на редокс реакции в белите дробове, които реакции биха довели до произвеждането на ендогенни алдехиди.

г) Свободните радикали бяха идентифицирани също с помощта на пушачи-доброволци, като се регистрира характерният за тези радикали хемилуминесцентен пик в издишвания цигарен въздух. Бяха използвани цигари с конвенционални и с биологични филтри. Доброволците бяха накарани да издишат цигарен дим (50 ml) в киселинен разтвор ^(0,01 N HCI,50m}pH 6,) като хемилуминесцентният отговор бе регистриран след интервал от 5 минути и след интервал от 60 минути. При pH 6 издишва нйят 0NO0- се разпада от само себе си. Спед време от 5 минути се наблюдава увеличение 160 % на хемилуминесцентния отговор при издишван цигарен дим, преминал през конвенционален филтър, в сравнение с този на цигарен дим, преминал през биологичен филтър - Фигура 23. Когато наситеният с издишван цигарен дим киселинен разтвор бе оставен да престои един час, разликата в хемилуминесцентния отговор се увеличи от 160% на 250 % - Фигура 24. Това напълно съответства на концепцията, че редокс реакциите се осъществяват непрекъснато в цигарения дим посредством хинон радикалите и произвеждат серия от активирани кислородни радикали, които са в състояние да причинят биологични увреждания.

ОБСЪЖДАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Нашите изследвания показаха, че алвеоларните макрофаги притежават ендогенна N0 синтаза, както и другите клетки • · ·· ♦· ···· • · ί'

/00015

и могат да отделят ΝΟ/ΟΝΟΟ- прадължително време след като са били подложени на действието на цигарен дим. Нещо повече, след като започне отделянето на N0 от тези клетки, произвеждането на N0 се превръща в самоподдържащ се процес, дори след отстраняване на възбудителя. Тази реакция е причина , еадържащият се в цигарения дим N0 да стимулира алвеоларни те макрофаги- да отделят N0 и ONOO-в продължение на няколко часа след отстраняване на възбудителя. Такава реакция може да бъде инициирана от произвеждането на Н2О2 в белите дробове след стимулиране на алвеоларните макрофаги с цигарен дим. Н2О2 може да стимулира активността на N0 синтазата в белодробните клетки , които произвеждат N0 и 0Ν00- в продължение на повече от час след отстраняването на възбудителя. Нашите експерименти показаха категорично, че пропускането на цигарения дим през биологичен филтър доведе до 90% намаляване (в сравнение с конвенционалния цигарен филтър) на окислителния стрес в алвеоларните макрофаги на плъх. Един образуван в белите дробове радикал 0Ν00- по всяка вероятност атакува и инактивира инхибитора на а1-протеиназата (alPI). Инхибирането на alPI в човешките бели дробове често причинява емфиземи, които намаляват белодробния капацитет. Статистически е доказано, че тютюнопушенето предразполага към развиването на емфизем (Southon, Р.А., Pwis, G. Free rar dicals in Medicine. Involvement in human Disease. Mayo Clin. Proc. 63: 390-408, 1988). В проведените ин виво експерименти с 12 доброволци-пушачи бе констатирано 90% намаление на издишваните NO/ONOO- при преминаване на цигарения дим през биологичен филтър.

Кислородните свободни радикали навярно също участват в патогенезата на предизвикания от имунни комплекси с участието на IgA алвеолит. Предварителното третиране на животни със суперокис дисмутаза, каталаза, улавящия желязото десфериоксамин или задържащия хидроксилния радикал DMSO потиска·. развиването на белодробни заболявания. И напротив,

• · /00015

белите дробове на нетретираните животни от контролата се характериират с наличието на увеличен брой алвеоларни макрофаги. Наблюдават се също така междинни едеми и кръвоизливи. Нещо повече, в този модел на белодробни увреждания L-аргининът има силно защитно действие, което може да се констатаира в намаляването на пропускливостта на кръвоносните съдове, на кръвоизливите и увреждането на съдовите ендотелни и алвеоларните епителни клетки. Тези находки потвърждават , че именно макрофагите се явяват източник на уврежданията, причинявайки N0,02-, Н₂0₂ и АН съедине ния (Mullingan, M.S., Jonhson, K.J., Ward, P.A., In: Biological Oxidants: Generation and Injurious Consequences (eds. Cochrane, C.G., and Gilbrone, M.A., Jr. Academic Press 157-172, 1992).

Задържането и неутрализирането на окислителите в цигарения дим с помощта на биологични филтри може да изиграе важна роля за намаляване на активността на редокс ензимите, които са пряко свързани с окислителния стрес на белодробните клетки. Биологичните филтри рязко намаляват окислителния стрес в белия дроб, предизвикан от вдишвания цигарен дим. Окислителният стрес в макрофагите на белия дроб и в ендотелните клетки на белодробните съдове може да бъде предизвикан от N0, Nox кислородни радикали и/или от алдехидите, съдържащи се в цигарения дим. Нещо повече, задържането на алдехидите и микроелементите (и по-специално Cd ) от биологичните филтри има и важно дългосрочно въздействие по отношение на антиоксидантите в плазмата и инхибирането на развиването на атеросклероза. Хемоглобинът съдържа някои неутрофилни цен трове, които влизат в ковалентни реакции с електрофилите. Тези центрове индуцират валиновите остатъци на N-края на и уЗ*веригата, N1 и N3 атоми на хистидиновите остатъци и сулфидрилната група на цистеиновите остатъци,Канцерогенното нитрозо-съединение 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридрил)1-бутанон (NNK) ,съдържащо се в тютюна се превръща- при изгарянето на цигарата в дим, като нивата му в самата димна

/00015 .

- 33 струя могат да варират от 4 до 1700 ng за една цигара. NNK може да образува присъединени съединения с хемоглобина (Hecht, R.C., Karan, S., and Carmella, S.G., In: Human carcinogen expose, eds. Garmer, R.C., Farmer, P.B., Steel, G.I., and Wricht, A.S.; IRL Press pp. 267-274, 1991). Ясно е, че единственият начин да се избегнат предизвикваните от тютюна заболявания е да се откажем както от дъвченето, така и от пушенето на тютюн. Все пак статистиката, обхващаща заклети пушачи, показва, че има смисъл да се търсят начини за намаляване на експозицията на тютюневи канцерогени и да се измени начинът на тяхното въздействие. Принципни подходи към тази цел са: 1) промени в самите тютюневи изделия; 2) инхибиране на метаболичната активация на тютюневите канцерогени и тяхното ендогенно образуване в някои макро- и микро -хра_ нителни вещества и хемозащитни агенти, и 3) задържане на канцерогените, съдържащи се в тютюна, с помощта на специфични филтри, прибавяни в тютюна на цигарата. Нашето изобретение, което предвижда използването на биологични субстанции за изработването на биологични филтри, разкрива в крайна сметка, че азотистите съединения, съдържащи се във вдишвания цигарен дим, биват задържани от биологичните субстанции, предпазвайки по този начин не само здравето на пушачите, но и на не пушачите.

Claims

Патентни претенции
6. Филтър съгласно една от който биологичната субстанция е в претенции 1 до 5, при твърдо състояние.
7. Цигара, характеризираща се с това, че е снабдена с филтър, съгласно една от претенциите 1 до 6.
8. Метод за изработване на филтър за тютюнев дим съгласно една от претенции 1 до 6, съдържащ конвенционален филтър за тютюнев дим, импрегниран с една или повече от споменатите биологични субстанции.
9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че филтърът включва активен въглен.
10. Метод съгласно една от претенции 8 до 10, характеризиращ се с това , че биологичната субстанция съдържа хемоглобин и/или лизат от еритроцити.
11. Метод съгласно една от претенции 8 до 10, характеризиращ се с това, че биологичната субстанция е приложена като разтвор 1-10 mg/ml в буфериран с фосфат физиологичен разтвор с pH 7,4
12. Метод за филтриране на тютюневия дим, включващ филтър съгласно една от претенции 1 до 6, през който преминава тютюневият дим.
13. Метод съгласно Претенция 12, характеризиращ се с това, че филтърът задържа 15 до 90% N0; Ю до 90% С0;

40 до 90% свободни радикали; 10 до 90% алдехиди; 10 до 90% канцерогенни азотисти съединения; 15 до 90% ^2 и 50 до

95% от микроелементите, съдържащи се в тютюневия дим-пре- -------ди преминаването му през филтъра.

r r < Г c c

WO 96/00019 f r < ^{r r} c r r c r r V ·ί ' e r r r r r r, r • rrr < (’ • » rer <

PCT/GR94/00015

Патентни претенции
14. Метод съгласно Претенция 13, характеризиращ се с това, че филтърът задържа 85 до 90% N0; 80 до 90% С0;

60 до 90% свободни радикали; 60 до 90% Н2О2; 60 до 90% алдехиди; 60 до 90% канцерогенни азотисти съединения и 70 до 95% от микроелементите, съдържащи се в тютюневия дим преди преминаването му през филтъра.