DE69315483T2

DE69315483T2 - Vernetzbare Kollagenderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Herstellung von Biomaterialien

Info

Publication number: DE69315483T2
Application number: DE69315483T
Authority: DE
Inventors: Christian Gagnieu
Original assignee: Flamel Technologies SA
Current assignee: Flamel Technologies SA
Priority date: 1992-06-18
Filing date: 1993-06-17
Publication date: 1998-07-02
Anticipated expiration: 2013-06-18
Also published as: DE69315483D1; JPH0680935A; ES2113511T3; EP0575273A1; US5412076A; EP0575273B1; ATE160798T1; FR2692582B1; FR2692582A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue vernetzbare Kollagenderivate, die zur Verwendung bei der Herstellung von Biomaterialien geeignet sind, aus denen Produkte hergestellt werden können, die insbesondere in der Medizin und ganz besonders der Chirurgie oder der Kosmetologie verwendbar sind.
Von diesen Produkten können künstliche Gewebe oder künstliche Organe, wie z.B. künstliche Haut (Hautersatz), Knochenprothesen oder Knochenimplantate, Prothesen oder Implantate für den Ersatz von Bändern, kardiovaskuläre und intraokulare Prothesen und Implantate..., oder auch Verkapselungssysteme (Implantate, Mikrokugeln, Mikrokapseln), die in vivo die kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen ermöglichen, und Bioverkapselungssysteme angegeben werden.
Beispielhaft kann ferner auf medizinisches Zubehör hingewiesen werden, wie z.B. Nahtmaterialien oder Überzüge für die Biokompatibilisierung implantierbarer medizinischer Gegenstände, sowie injizierbare Kollagenlösungen oder Kollagensuspensionen, die zur Auffüllung und Rekonstruktion von Gewebe verwendet werden.
Bei all diesen biomedizinischen Anwendungen ist es unbedingt erforderlich, daß für das vernetzte Kollagen bestimmte physikalisch-chemische, mechanische oder biologische Eigenschaften in reproduzierbarer und kontrollierter Weise erzielt werden. Nur durch die perfekte Beherrschung der chemischen Modifizierungen des Kollagens, die große Palette der erfindungsgemäß hergestellten Produkte und die sich hieraus ergebende gute Anpassbarkeit der Vernetzungsverfahren ist es möglich, zufriedenstellend auf die meisten Zwänge zu reagieren, die bei der Erstellung der Qualitätsvorschriften für eine gegebene Anwendung auftauchen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen vernetzbaren Kollagen-Derivate sowie neue Zwischenprodukte, die bei diesem Verfahren entstehen, und schließlich das vernetzte Kollagen, das aus dem eingesetzten vernetzbaren Kollagen gebildet wird.
Bei dem Gebiet der Erfindung handelt es sich um das Gebiet biokompatiblet Materialien auf Kollagenbasis, die als Ausgangsmaterialien für die Herstellung von Gegenständen brauchbar sind, die dafür vorgesehen sind, mit dem menschlichen oder tierischen Körper in Kontakt gebracht oder in diesen implantiert zu werden, und die sich insbesondere in mechanischer Hinsicht am besten an biologische Materialien anpassen bzw. angleichen, um diese ersetzen zu können. Es wird im wesentlichen die Anwendung in der Humanmedizin oder der Tiermedizin angestrebt.
Kollagen ist ein bekanntes Protein, das in allen Bereichen der Organisation tierischer Gewebe vorhanden ist: es handelt sich um das Hauptprotein der Haut und des Bindegewebes. Kollagen weist von Natur aus biochemische und physikalisch-chemische Eigenschaften auf, die verhältnismäßig gut an lebende Medien angepaßt sind.
EP-A-0 049 469 offenbart die Umsetzung von Kollagen mit einem aktivierten Cystinester. EP-A-0 191 944 beschreibt die Umsetzung von Bernsteinsäureanhydrid mit den freien NH&sub2;- Gruppen von Kollagen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter dem Ausdruck Kollagen jedes Peptid mit den Eigenschaften bzw. der Beschaffenheit eines Kollagens verstanden, darunter insbesondere Gelatine.
Gegenwärtig sind weltweit verschiedene Kollagenqualitäten tierischer oder menschlicher Herkunft im Handel, die im wesentlichen zur Erzeugung von Biomaterialien oder kosmetischen Produkten dienen.
In den gegenwartig ublichen Anwendungen ist man mit den Eigenschaften der verschiedenen verfügbaren Qualitäten zufrieden.
So finden sich unter diesen Kollagenen hervorragende Trägermaterialien für das Anhaften, die Vermehrung und das Wachstum von Zellen, die für die Herstellung von Zellkulturmedien geschätzt werden.
Weiterhin macht man sich ihre Hydrophihe, ihre geringe Immunogenität und ihre hämostatischen Eigenschaften zunutze.
Die mechanischen Eigenschaften nativer Kollagene sind für einige Anwendungen annehmbar.
Es muß jedoch konzidiert werden, daß auf dem Gebiet implantierbarer medizinischer Gegenstände, wie z.B. Implantate und Prothesen, die im Handel erhältlichen nativen Kollagene hinsichtlich ihrer mechanischen Festigkeit und ihrer Beständigkeit gegenüber einer Proteolyse deutliche Mängel aufweisen.
Das Einbringen dieser Fremdkörper, um solche handelt es sich bei den Implantaten und Prothesen, in einen lebenden Organismus ruft eine Abstoßungsreaktion hervor, die sich insbesondere in Entzündungsreaktionen äußert, die unter anderem die Bildung von Kollagenase hervorrufen, die das Kollagen hydrolysiert. Hieraus ergibt sich zumindest eine Verschlechterung des mechanischen Verhaltens des Transplantats auf Kollagenbasis.
Es ist bekannt, daß die mechanischen Eigenschaften von Kollagen durch eine Vernetzung verbessert werden können.
Die Vernetzung verleiht den Kollagenfasern eine sehr große Zugfestigkeit und Reißfestigkeit aufgrund zahlreicher kovalenter Bindungen, die bei der Vernetzung zwischen den Kollagenketten erzeugt werden.
Es wurden zahlreiche Untersuchungen auf der Grundlage dieser wissenschaftlichen Erkenntnisse durchgeführt, um die Möglichkeiten für eine künstliche Vernetzung des Kollagens weiterzuentwickeln.
Hieraus sind drei Grundtypen von Techniken zur Vernetzung dieses Proteins hervorgegangen.
Die erste Technik besteht aus der Vernetzung mit Hilfe eines verbrückenden Mittels, bei der exogene, meistens bifunktionelle Moleküle aufgepfropft werden, durch die die Entstehung von Verbindungen ermöglicht wird. Zu den am häufigsten eingesetzten Reagenzien gehören:
- Mono- und Dialdehyde, wie z.B. Formaldehyd (mit dem Methylenbrücken erzeugt werden), Malonaldehyd und vor allem Glutaraldehyd (durch Imin- und Aldol-Bindungen vernetzend). Die wesentlichen Nachteile hängen mit den Endgruppen -CHO, die reizend wirken, und der Autopolymerisation der Dialdehyde, durch die sie cytotoxisch werden, zusammen.
- Dicarboxyverbindungen, die gegenwärtig im wesentlichen entweder für die Modifizierung des Kollagens oder für die Gerbung von Häuten eingesetzt werden und die Amidbindungen oder sogar Esterbindungen bilden.
- Diamine, wie z.B Hexamethylendiamin, die ausschießlich Amidbindungen bilden.
- Diisocyanate, darunter Hexamethylendiisocyanat, das für die Vernetzung durch Amidbindungen verwendet wird.
- Disulfonylfluoride, die Bindungen innerhalb der Ketten und zwischen den Ketten ausbilden.
Nach einer zweiten Technik wird die Erzeugung eines Netzwerks durch kovalente Bindungen zwischen den Kollagenmolekülen obne Pfropfung exogener Moleküle vorgenommen.
Die wichtigsten hierfür eingesetzten Verfahren sind:
- Die Bestrahlung (UV- oder γ-Strahlung), durch die gleichzeitig zu einem Teil eine oxidative Desaminierung stattfindet, wodurch die Vernetzung durch Imin- und Aldolbindungen ermöglicht wird, sowie die Bildung sehr reaktiver freier Radikale hervorgerufen wird, die kovalente Brücken erzeugen können. Diese Verfahrensweise weist den Nachteil auf, daß die Vernetzung des Kollagens nur in einem sehr engen Bereich niedriger Energien hervorgerufen wird, während sie bei höheren Energien sehr nachteilige Hydrolysen oder Denaturierungen des Produkts zur Folge hat.
- Die Dehydratisierung (unter schärferen Bedingungen: mehr als 100 ºC, unter Vakuum), die zur Bildung von Amid- und Esterbindungen sowie intramolekularen und intermolekularen Lysinoalanin-Bindungen führt. Von den verwendeten Reagenzien können die Carbodimide, wie z.B. Cyanamid und Dicyclohexylcarbodiimid, angegeben werden. Diese Art der Vernetzung befindet sich noch im experimentellen Stadium.
- Die enzymatische Vernetzung durch Proteine, die eine Wirkung wie Lysyloxydase zeigen (Enzym, das für die natürliche Vernetzung ursächlich ist). Diese Vernetzung wird zur Zeit noch erforscht.
- Die Oxidoreduktion, bei der eine oxidative Desaminierung der Amin-Endgruppen hervorgerufen wird, aus denen Aldehyd-Endgruppen entstehen. Es werden im wesentlichen Metallkationen (Cu²&spplus;, Fe²&spplus;, Al³&spplus;) in Kombination mit Cofaktoren (Ascorbat, Pyridoxal-5P) sowie Sulfite oder Nitrate verwendet. Dieses Verfahren wird weit verbreitet für die Gerbung von Leder verwendet.
- Die funktionelle Aktivierung, insbesondere von Carboxy- Gruppen, die Azide von Säuren liefern können, die eine sehr selektive Reaktivität gegenüber Endguppen -NH&sub2; aufweisen und zur Bildung einer Amidbindung führen. Auf diese Weise können unterschiedliche Biomaterialien erzeugt werden.
Bei der dritten Technik findet die Vernetzung durch Copolymerisation statt. Sie besteht darin, das Kollagen über kovalente Bindungen mit einem anderen Polymer zu verbinden, um mehr oder weniger verknäuelte Konformationen zu erhalten. Die am häufigsten mit Kollagen kombinierten Polymere sind:
- Acrylderivate, deren Toxizität häufig ein Hindernis für humanmedizinische Anwendungen vom Typ der Implantate darstellt,
- Acrylnitril-Styrol-Gemische,mit denen es bis heute nicht möglich war, über das Laborstadium hinauszugelangen,
- Polyurethane, die vor allem bei der Verstärkung von gegerbtem Leder verwendet werden,
- Polyalkohole,
- Silicone.
Die bei der Copolymerisation entstehenden Bindungen sind sehr verschieden und hängen von den mit dem jeweiligen Polymer eingebrachten Gruppen ab.
All diese Techniken weisen, ob sie nun physikalischer oder chemischer Art sind, zahlreiche Nachteile auf.
Zunächst führen die chemischen Vernetzungen zu toxischen Resten in dem vernetzten Kollagen. Bei den Resten kann es sich um nicht verbrauchte Reagenzien oder freie reaktive Gruppen handeln, die aus bifunktionellen Reagenzien stammen, die nur an einem einzigen Ende abreagiert haben.
Alle physikalischen Vernetzungen sind schwierig durchführbar und weisen eine mangelhafte Reproduzierbarkeit auf.
Diese beiden Arten der Vernetzung führen im allgemeinen zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Affinität der Gewebezellen für das modifizierte Kollagen.
Außerdem können sie nicht für die Herstellung von Formteilen aus Kollagenlösungen eingesetzt werden. Bei keiner dieser Vernetzungstechniken wird die Kinetik der Vernetzung oder des Vernetzungsgrades beherrscht.
Unter derartigen zufälligen Bedingungen ist es nicht möglich, einfache und ökonomische industrielle Produktionstechniken zu entwickeln, die zu Produkten führen, deren mechanische Qualität an die anvisierten Anwendungen angepaßt ist.
Aus diesem Grund wurden die Vernetzungstechniken in der großen Mehrzahl der Fälle eingeschränkt für anatomische Teile oder Gewebe, die Kollagen enthalten, verwendet.
Sie wurden noch seltener für die Vernetzung vorgeformter Teile aus Kollagen, im wesentlichen Folien oder Filze, eingesetzt.
Die Techniken sind auf jeden Fall unbrauchbar für das verbleibende große Gebiet der Anwendungen als Biomaterialien.
Im übrigen wurde vorgeschlagen, die am häufigsten in der Biologie auftretende Verbrückung mit S-S-Disulfid-Bindungen auszunutzen.
So wurde in dem Artikel mit dem Titel "Einbau von Cystinbrücken in Kollagen" - F. Schade und H. Zahn - Angew. Chem., 74, 904 (1962) die direkte Fixierung ohne Abstandshalter eines Cystinderivats an Kollagen beschrieben, um eine Vernetzung durch S-S-Brückenbildung zu versuchen.
In dieser kurzen Zusammenfassung ihrer Arbeiten behaupten die Autoren, daß sie über Disulfid-Brücken vernetztes Kollagen hergestellt haben.
Bei dem eingesetzten Vernetzungsmittel handelt es sich um ein Cystinderivat, bei dem die beiden Amingruppen des Cystins mit einer Schutzgruppe aus der Klasse der Carbobenzoxyl-Verbindungen geschützt wurden.
Nach dem Aufpfropfen auf das Kollagen wurden die Disulfid- Brücken reduziert und anschließend in basischem Medium mit Luftsauerstoff (Selbstvernetzungsfaktor) erneut oxidiert.
In diesem Artikel wird das direkte Aufpfropfen von Cystein auf Kollagen ohne Verwendung einer Abstandshalterverbindung (Spacerverbindung) gelehrt.
Zwanzig Jahre nach diesem ersten Artikel wird in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 049 469 ein Verband auf der Basis einer Kombination von Kollagen und Fibrinogen offenbart. In diesem Dokument wird das unmittelbare Einführen von Thiolgruppen in lösliches, aus Sehnen gewonnenes Kollagen beschrieben. Die Thiolgruppen werden mit Hilfe von N- Acetylhomocysteinthiolacton ohne einen Abstandshalter, der diese Verbindung mit dem Kollagen verbindet, eingebracht.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein modifiziertes, vernetzbares Kollagen vorzuschlagen, das in Wasser und/oder aprotischen organischen polaren Lösungsmitteln löslich ist und unsubstituierte oder substituierte Thiolgruppen trägt, die zu Cysteinresten oder Resten von Cysteinderivaten gehören und das in diesen Medien durch Bildung von Disulfid-Brücken unter Erhalt von Gelen oder vernetzten Produkten in Gegenwart milder Oxidationsmittel vernetzbar ist, und dabei eine hervorragende Beherrschung der Kinetik und des Vernetzungsgrads ermöglicht.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein mit Thiolgruppen versehenes Kollagen bereitzustellen, das in Gele oder vernetzte Produkte mit einer Vernetzungsdichte und demnach mechanischer Festigkeit umwandelbar ist und das vorher formbar ist, um an jede beliebige Anwendung angepaßt werden zu können.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein modifiziertes, vernetzbares Kollagen bereitzustellen, dessen Geschmeidigkeit und Vernetzungseigenschaften dieses Material zu einem für die Herstellung fester medizinischer Gegenstände vom Typ medizinischer Implantate oder Prothesen, beispielsweise durch Gießen oder Extrudieren, besonders geeigneten Ausgangsmaterial macht.
Der Anmelderin ist es außerdem nach Durchführung zahlreicher Versuche und Untersuchungen gelungen, die Hindernisse zu überwinden, die nach dem Stand der Technik bestehen, und obige und weitere Aufgaben zu lösen, indem Cysteinreste mindestens teilweise über Abstandshalterverbindungen (Spacerverbindungen) an das Kollagen gebunden werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach ein neues vernetzbares modifiziertes Kollagen, das in Wasser und/oder aprotischen polaren organischen Lösungsmitteln löslich ist und freie oder substituierte Thiolgruppen enthält, die von Cysteinresten oder von Resten von Cysteinderivaten getragen werden, die mindestens teilweise über Abstandshalterverbindungen (Spacerverbindungen) an das Kollagen gebunden sind.
Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen modifizierten Kollagens besteht darin, daß es industriell leicht formbar und handhabbar ist. Mit ihm können nicht toxische, nicht immunogene medizinische Gegenstände vom Typ der Implantate, Prothesen oder künstliche Haut hergestellt werden, deren mechanischen und biologischen Eigenschaften perfekt an die angestrebte Anwendung angepaßt sind.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter dem Ausdruck "vernetzbar" unterschiedslos modifizierte Kollagene verstanden, die zu einer spontanen Selbstvernetzung in Gegenwart von Luftsauerstoff, bei Umgebungstemperatur, gegebenenfalls in Gegenwart milder Hilfsmittel, wie z.B. von Oxidationsmitteln, die nicht unmittelbar an der Umsetzung beteiligt sind und sich in dem vernetzten Produkt nicht wiederfinden, imstande sind.
Die hervorragende Biokompatibilität dieses modifizierten Kollagens beruht teilweise auf der Tatsache, daß die unsubstituierten oder substituierten Thiolgruppen von Cysteinresten oder Resten entsprechender Cysteinderivate (im folgenden unterschiedslos unter dem allgemein zu verstehenden Ausdruck Cysteinreste zusammengefaßt) getragen werden, nämlich beispielsweise von Cystein selbst, Cystin, Homocystein, Homocystin, Cystamin und Cysteamin.
Erfindungsgemäß sind die Cysteinreste mindestens teilweise über Abstandshalterverbindungen (Spacerverbindungen) mit dem Kollagen verbunden. Jede Abstandshalterverbindung weist vorzugsweise mehrere Carboxygruppen auf. Noch bevorzugter ist die Abstandshalterverbindung eine Carboxy-Kohlenwasserstoff-Einheit, die vorzugsweise von einer Dicarbonsäure abstammt, die ein cyclisches Anhydrid zu bilden vermag. Die eingesetzte Dicarbonsäure kann aus der folgenden, nicht einschränkenden Liste ausgewählt werden: Bemsteinsäure, Glutarsäure, Phthalsäure, Itaconsäure, Maleinsäure, wobei Bemsteinsäure besonders bevorzugt ist.
Diese Abstandshalterverbindung ermöglicht die indirekte Aufpfropfung mindestens eines Teils der Cysteinreste auf die Aminosäuren des Kollagens mit freien Alkohol- oder Amingruppen. Andere Cysteinreste werden direkt an die Aminosäuren angebunden, die Carboxygruppen tragen (Glutaminsäure und Asparaginsäure).
Der Grad der Substitution des erfindungsgemäßen modifizierten Kollagens mit freien Thiolgruppen kann über einen großen Wertebereich variieren.
Dieses modifizierte Kollagen kann leicht durch die Oxidation der Thiolgruppen und die Erzeugung von Disulfid-Brücken in schwach oxidierender Umgebung in den vernetzten Zustand übergeführt werden. Unter physiologischen Bedingungen, in vivo, kann dies durch Autooxidation mit gelöstem Sauerstoff oder durch enzymatische Oxidation erfolgen, während unter nicht physiologischen Bedingungen, in vitro, die Oxidation mit in wirksamer Menge eingesetzten nicht toxischen Reagenzien wie Wasserstoffperoxid oder Luftsauerstoff beispielsweise in schwach basischem Medium durchgeführt werden kann.
Das vernetzte Polymer kann sehr zuverlässig und mit guten mechanischen Eigenschaften hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft ferner als neues Produkt ein modifiziertes, vernetzbares Kollagen, das in Wasser und/oder aprotischen polaren organischen Lösungsmitteln löslich ist und unsubstituierte oder substituierte Thiolgruppen aufweist, die von Cysteinresten oder Resten von Cysteinderivaten getragen werden, wobei die Reste
- an das Kollagen zumindest teilweise über Spacerverbindungen gebunden sind
- und folgender allgemeinen Formel entsprechen:
worin bedeuten:
- R&sub1; H oder COOR'&sub1;, worin R'&sub1; bedeutet: eine aliphatische und/oder aromatische und/oder cyclische Kohlenwasserstoffkette, vorzugsweise eine Alkyl-, Alkenyl-, Aryl- oder Aralkenylkette und besonders bevorzugt Methyl, Ethyl oder Allyl;
- R&sub2; Wasserstoff oder eine aliphatische und/oder aromatische und/oder cyclische, gegebenenfalls schwefelhaltige Kohlenwasserstoffkette, die vorzugsweise unter den Gruppen der folgenden allgemeinen Formel
in der y 1 oder 2 ist, ausgewählt ist
- x 1 oder 2.
Letztere können vom gleichen Typ sein wie die weiter oben beschriebenen.
Das vernetzte Kollagen kann aus dem oben angegebenen modifizierten selbstvernetzenden Kollagen hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft im übrigen ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten, vernetzbaren, in Wasser und/oder aprotischen polaren organischen Lösungsmitteln löslichen Kollagens, das freie Thiolgruppen enthält.
Dieses Verfahren besteht im wesentlichen darin, das Ausgangskollagen umzusetzen entweder nach:
- Weg I: in einem ersten Schritt mit dem Vorläufer der Abstandshalterverbindung und anschließend in einem zweiten Schritt mit einem Cysteinrest, oder nach
- Weg II: mit einer Reaktionsuntereinheit, die mindestens aus der Abstandshalterverbindung, die mit mindestens einem Cysteinrest verbunden ist, besteht.
Die beim Weg I aufeinanderfolgenden Schritte sind:
a&sub1; Solubilisierung des Ausgangskollagens in mindestens einem aprotischen polaren organischen Lösungsmittel,
b&sub1; Acylierung und Carboxylierung des gelösten Kollagens,
c&sub1; Aktivierung der freien Carboxygruppen des Kollagens,
d&sub1; Umsetzung des aktivierten Kollagens mit einem Cysteinrest mit einer oder mehreren geschützten Thiolgruppen und gegebenenfalls einer oder mehreren geschützten Carboxygruppen, um einen inerten Vorläufer (Precursor) des gewünschten modifizierten Kollagens herzustellen.
Nach einer ersten Ausführungsform von Weg I des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein zusätzlicher Schritt e&sub1; vorgesehen, der aus der direkten Aktivierung des inerten Vorläufers durch Bildung freier oder substituierter Thiolgruppen besteht, die zum angestrebten vernetzbaren modifizierten Kollagen führt. Diese Aktivierung kann insbesondere durch Reduktion erreicht werden.
Nach einer zweiten Ausführungsform von Weg I des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die folgenden ergänzenden Schritte vorgesehen:
- e1&sub1; - indirekte Aktivierung des inerten Vorläufers, vorzugsweise durch Oxidation, die zu über kettenverbindende Disulfid-Brücken vernetztern Kollagen führt,
- f1&sub1; - Umformung, vorzugsweise durch Reduktion, des vernetzten Kollagens in modifiziertes Kollagen, das stabilisierte freie oder substituierte Thiolgruppen trägt.
Die Schritte a&sub1; bis d&sub1;, e&sub1;, e&sub1; und f&sub1; werden im folgenden ausführlich beschrieben.
Nach Weg II umfaßt das Verfahren im wesentlichen die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte:
- a&sub2; - Solubilisierung des Ausgangskollagens in mindestens einem polaren organischen Lösungsmittel,
- b&sub2; - Herstellung der Untereinheit aus der Abstandshalterverbindung und dem Cysteinrest mit geschützten Thiolgruppen.
- c&sub2; - Aktivierung der freien Carboxygruppen der Untereinheit,
- d&sub2; - Umsetzung des Kollagens und der aktivierten Untereinheit um einen inerten Vorläufer des gewünschten modifizierten Kollagens herzustellen.
Um letzteres zu erhalten, reicht es aus, einen zusätzlichen Schritt e&sub2; durchzuführen, der aus einer Reduktion besteht, die zu Kollagen-SH führt.
Nach einer Alternative können auf den Schritt d&sub2; die Schritte e2&sub1; und f2&sub1; folgen, die den oben beschriebenen Schritten e1&sub1; und f1&sub1; entsprechen.
Die Schritte a&sub2; bis e&sub2;, e2&sub1; und f&sub2; werden im folgenden ausführlicher dargestellt.
Das bei diesem Verfahren verwendete Ausgangsmaterial kann tierisches oder menschliches Kollagen beliebigen Typs und vorzugsweise vom Typ I und/oder III oder IV sein, das in den aprotischen polaren organischen Lösungsmitteln solubilisierbar ist, das gegebenenfalls Telopeptide aufweist und in denaturierter Form (Einfachketten) oder in nicht denaturierter Form (Dreifachhelix) verwendet wird.
Es kann sich gegebenenfalls um ein Kollagen handeln, das beispielsweise durch Acylierung (z.B. Succinylierung) seiner Amingruppen oder durch Umwandlung in ein Säuresalz, beispielsweise Bernsteinsäuresalz, modifiziert ist.
Selbstverständlich kann das Ausgangsmaterial aus einem oder mehreren dieser verschiedenen Kollagen-Typen bestehen.
Gemäß Schritt a&sub1; oder a&sub2; wird das Ausgangskollagen in einem aprotischen polaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylacetamid (DMAC), Dimethylformamid (DMF) oder N-Methylpyrrolidon (NMP), solubilisiert.
Diese Solubilisierung wird vorzugsweise mit Hilfe eines Solubilisierungshilfsmittels, bei dem es sich um ein Lösungsmittel handeln kann, beispielsweise Methanol oder eine Carbonsäure, bei der es sich vorzugsweise um die in Schritt b eingesetzte Carbonsäure handelt, durchgeführt.
Wenn das Ausgangskollagen ein Kollagen mit Telopeptiden ist, kann dieses einer entsprechenden und an sich bekannten Vorbehandlung durch Reduktion, Alkalisierung, Ansäuerung und Fällung unterzogen werden. Mit dieser Behandlung wird die Verbesserung der Löslichkeit dieses Kollagens in dem Lösungsmittel von Schritt b&sub1; angestrebt.
Schritt b&sub1; ist ein Schritt zur Acylierung und Carboxylierung des solubilisierten bzw. gelösten Kollagens. Er wird vorzugsweise mit einem Dicarbonsäureanhydrid durchgeführt. Durch diese Reaktion kann eine der beiden COOH-Endgruppen der Dicarbonsäure über eine kovalente Bindung an eine freie OH- oder NH&sub2;-Gruppe der Aminosäuren angebunden werden. Am Ende trägt die Peptidkette freie COOH-Gruppen, die jeweils aus der anderen Carboxyendgruppe der Dicarbonsäure bestehen.
Da die reaktive Form in Form des Anhydrids vorliegen muß, werden als Dicarbonsäure die Dicarbonsäuren ausgewählt, die cyclische Anhydride zu bilden vermögen. Es handelt sich vorzugsweise um Dicarbonsäuren mit mindestens 4 Kohlenstoffatomen.
Beispielhaft kann die folgende Liste von Verbindungen angegeben werden: Bernsteinsäure, Glutarsäure, Phthalsäure, Itaconsäure, Citraconsäure und Maleinsäure. Diese Liste kann selbstverständlich auf alle Arten von Derivaten dieser Säuren erweitert werden.
Die Anhydride von Bernsteinsäure und Glutarsäure sind besonders bevorzugt.
Das Anhydrid wird vorteilhaft mit dem gelösten Kollagen in Gegenwart einer organischen Base, vorzugsweise einer tertiären Base, wie z.B. Triethylamin oder auch N-Methyl- oder N-Ethylmorpholin, zur Reaktion gebracht.
Nach Extraktion und Waschen wird ein mit der eingesetzten Säure substituiertes Kollagen gewonnen, wobei der Substitutionsgrad in Abhängigkeit vom Anteil des Anhydrids, das mit dem Kollagen umgesetzt wird, und/oder der Menge der eingesetzten Base eingestellt werden kann.
Ganz allgemein kann in Abhängigkeit von der Zahl der an dem Kollagen verfügbaren reaktiven Gruppen der Substitutionsgrad etwa 22 acylierte Aminosäuren pro 100 Aminosäuren des Kollagens und vorzugsweise 4 bis 22 acylierte Aminosäuren erreichen. Diese acylierten, beispielsweise succinylierten Kollagene, die vorzugsweise einen Substitutionsgrad von 4 bis 22 Acylresten pro 100 Aminosäuren aufweisen, stellen neue stabile Zwischenprodukte dar.
Die erhaltenen substituierten Kollagene sind unabhängig vom verwendeten Anhydrid in Wasser bei einem pH-Wert oberhalb 5,5 - 7 und in aprotischen polaren organischen Lösungsmitteln löslich.
Zur nicht einschränkenden Veranschaulichung kann angegeben werden, daß mit Bernsteinsäure substituierte Kollagene in Wasser bei einem pH-Wert unter 2,3 und oberhalb 5,5 löslich sind.
Nach der Acylierung/Carboxylierung weisen die Kollagene etwa 10 bis 30 %, bezogen auf die Zahl der Aminosäurereste, Aminosäurereste auf, die eine Carboxygruppe tragen. Es handelt sich in erster Linie um die Aminosäurereste, die mit dem Säureanhydrid reagiert haben, und in zweiter Linie um Glutaminsäure und Asparaginsäure, die in dem Ausgangskollagen vorhanden sind.
Nach Weg II besteht der Schritt b&sub2; darin, eine Reaktionsuntereinheit:
Abstandshalterverbindung-Cysteinrest oder
Abstandshalterverbindung-Cysteinrest- Abstandshalterverbindung
herzustellen.
Es handelt sich vorzugsweise um einen Cysteinrest vom Typ der weiter oben beschriebenen Cysteinreste, der an jedem seiner Enden einen Dicarbonsäurerest aufweist, wie z.B. einen wie weiter oben beschriebenen Dicarbonsäurerest, z.B. ein Disuccinylcystamin.
Schritt c&sub1; der Aktivierung der Carboxygruppen des carboxylierten Kollagens und Schritt c&sub2; der Aktivierung der reaktiven Untereinheit werden vorteilhaft durchgeführt:
- entweder mit einem Carbonsäurehalogenid, vorzugsweise einem Säurechlond, das zur Bildung gemischter Anhydride an jeder freien Carboxygruppe des acylierten Kollagens oder der reaktiven Untereinheit führt,
- oder mit Carbonyldiimidazol.
Wenn ein Säurechlorid verwendet wird, wird dieses im allgemeinen unter Alkyl- und/oder Arylchlorcarbonaten und sperrigen Carbonsäurechloriden ausgewählt.
Es wird vorzugsweise Ethylchlorformiat, aber auch Trimethylacetylchlorid verwendet.
Die Aktivierung erfolgt in einem polaren aprotischen Lösungsmittel (DMSO, DMF, DMAC, NMP, allein oder im Gemisch) vorzugsweise in Gegenwart einer tertiären organischen Base, wie z.B. Triethylamin oder N-Methyl- oder N-Ethylmorpholin, vorzugsweise Triethylamin.
Wenn Carbonyldiimidazol verwendet wird, erfolgt die Aktivierung in einem aprotischen polaren Lösungsmittel (ohne organische Base)
Diese Aktivierungsreaktion betrifft beim Kollagen sowohl die in Schritt b&sub1; eingebrachten Carboxygruppen als auch die Carboxygruppen der Glutaminsäure und der Asparaginsäure, was bei einem stark acylierten Kollagen insgesamt etwa 30 % entspricht, bezogen auf die Zahl der Aminosäuren.
Das acylierte, beispielsweise succinylierte und beispielsweise mit Ethylchlorformiat aktivierte Kollagen sowie die aktivierte Untereinheit stellen neue Reaktionszwischenprodukte dar.
Schritt d&sub1; besteht darin, das aktivierte Kollagen mit einem Cysteinrest mit einer oder mehreren geschützten Thiolgruppen umzusetzen, und Schritt d&sub2; besteht darin, das Kollagen mit einer aktivierten Untereinheit Abstandshalterverbindung-Cysteinrest umzusetzen, um einen inerten Vorläufer des gewünschten modifizierten Kollagens zu erhalten.
Unter Cysteinresten im Sinne der vorliegenden Erfindung wird jede Verbindung der allgemeinen Formel
verstanden, in der bedeuten:
- R&sub1; H oder COOR¹&sub1;, worin R¹&sub1; eine aliphatische und/oder aromatische und/oder cyclische Kohlenwasserstoffkette, vorzugsweise Alkyl-, Alkenyl-, Aryl- oder Aralkenylkette und noch bevorzugter Methyl, Ethyl oder Allyl, bedeutet,
- R&sub2; Wasserstoff oder eine aliphatische und/oder aromatische und/oder cyclische, gegebenenfalls schwefelhaltige Kohlenwasserstoffkette, die vorzugsweise unter den Gruppen der folgenden allgemeinen Formel
mit y = 1 oder 2
ausgewählt ist,
- x 1 oder 2.
Bei dem Weg 1 stellt der Substituent in R&sub2; ein Mittel zum Schutz der Thiolgruppen der Cysteinreste dar, um zu verhindem, daß diese mit den aktivierten COOH-Gruppen des Kollagens reagieren, wenn sie miteinander in Kontakt gebracht werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird beim Weg I als Cysteinrest der Cystindimethylester
oder S-Triphenylmethylcysteinmethylester
verwendet.
Das mit dem Cysteinrest oder der Untereinheit Abstandshalterverbindung-Cysteinrest substituierte Kollagen stellt einen inerten Vorläufer des modifizierten Kollagens dar, das hergestellt werden soll. Es handelt sich um ein neues und stabiles Reaktionszwischenprodukt.
Die Schritte e&sub1; und e&sub2; des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen aus einer Rückbildung der Thiolgruppen durch Entfernen der Schutzgruppe. Dies kann durch Reduktion mit einem Reduktionsmittel erfolgen, das vorzugsweise unter Mercaptanen und/oder reduzierenden Salzen und/oder reduzierenden organischen Verbindungen ausgewählt wird.
Bei dem Mercaptan kann es sich um Mercaptoethanol, Mercaptoessigsäure, Mercaptoethylamin, Benzylmercaptan, Thiokresol oder Dithiothreitol, wobei letztere Verbindung besonders bevorzugt ist, handeln.
Als reduzierendes Salz ist es möglich, beispielsweise auf Natriumborhydrid oder Natriumhydrogensulfit zurückzugreifen.
Phosphine, wie z.B. Tributylphosphin, eignen sich gut als organische reduzierende Verbindung.
Es können Gemische von Reduktionsmitteln verwendet werden, wie z.B. eine Kombination von Mercaptoethanol und Natriumborhydrid.
Die Reduktion kann in basischem oder neutralem wäßrigem Medium, in organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel in Gegenwart oder Abwesenheit von Wasser durchgeführt werden.
Die Reduktionsschritte e&sub1; und e&sub2; werden insbesondere ausgeführt, wenn die Gruppe R&sub2; des eingesetzten Cysteinrests eine Gruppe folgenden Typs ist:
mit y = 1 oder 2.
Die Schritte e&sub1; und e&sub2; bestehen aus einer Oxidation des inerten Vorläufers mit einem Oxidationsmittel, wie z.B. Iod in alkoholischer, beispielsweise methanolischer Lösung in einem Reaktionsmedium auf der Basis eines aprotischen organischen polaren, für das erfindungsgemäße Verfahren typischen Lösungsmittels, wie z.B. DMF. Man erhält ein über Disulfid-Brücken vernetztes Kollagen.
Es ist zweckmäßig, die Schritte f1&sub1; oder f2&sub1; zur Reduktion dieses vernetzten Kollagens durchzuführen, um das vernetzbare Kollagen mit freien oder substituierten SH-Gruppen zu erzeugen.
Diese Reduktion ist eine Reduktion vom Typ der in dem oben beschriebenen Schritt e&sub1; oder e&sub2; durchgeführten Reduktion.
Die Schritte e&sub1; und f&sub1; werden durchgeführt, wenn der inerte Vorläufer einen Cysteinrest mit einem Substituenten R&sub2; vom Typ CΦ&sub3; aufweist.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines in Wasser und/oder aprotischen polaren organischen Lösungsmitteln und unlöslichen vernetzten Kollagens, das darin besteht, die Schritte a, b, c, d und e&sub1;, oder e&sub2;, des oben beschriebenen Verfahrens durchzuführen.
Die Cysteinreste mit SH-Gruppen, die auf die Kollagenketten aufgepfropft sind, werden unter Erhalt von Disulfid-Brücken zwischen diesen Molekülen oxidiert. Diese Reaktion führt zur Bildung eines dreidimensionalen Netzwerks, das in physiologischen Medien unlöslich ist und in reduzierenden Medien, die die Disulfid-Brücken zu reduzieren vermögen, löslich ist.
Die Zahl der zwischen diesen verschiedenen Molekülen gebildeten Bindungen hängt vom Substitutionsgrad und den Oxidationsbedingungen ab.
Der Vernetzungsgrad ist für die mechanische Festigkeit und die Kinetik des biologischen Abbaus des erhaltenen vernetzten Produkts von entscheidender Bedeutung.
Das erfindungsgemäße vernetzbare Kollagen und das erfindungsgemäße vernetzte Kollagen enthalten ausschließlich Moleküle oder Derivate biologischer Herkunft, die leicht metabolisiert werden können unter Erhalt von Verbindungen, die vom tierischen Organismus als Metaboliten erkannt werden.
Die zur chemischen Modifizierung verwendeten Reagenzien sind entweder in nicht toxische Produkte umwandelbar oder leicht durch nicht denaturierende Verfahren, wie z.B. die Dialyse, entfembar.
Das modifizierte Kollagen in der reduzierten Form enthält keine restlichen aktivierten Gruppen, und das oxidierte vernetzte Kollagen kann nur Thiolgruppen enthalten, die nicht abreagiert sind. Diese Gruppen sind nicht toxisch, da sie in der Natur in einer großen Zahl tierischer Proteine vorhanden sind.
Die Oxidationsverfahren erfordern weder toxische Substanzen noch für lebendes Gewebe aggressive Bedingungen.
Die Erfindung eröffnet die sehr wünschenswerte Möglichkeit, alle Vorgänge bei der Vernetzung des Kollagens, darunter die Kinetik und den Vernetzungsgrad, zu steuern. Dies ist besonders für die Erzeugung gegossener oder extrudierter Gegenstände vom Typ der Implantate, Prothesen, Epikornealinsen etc. von Nutzen.
Ein weiterer, nicht zu vernachlässigender Vorteil der Erfindung besteht darin, daß sie die Einstellung der mechanischen Eigenschaften ermöglicht, indem die Zahl der pro Masseneinheit Kollagen eingebrachten Cysteinreste kontrolliert wird. Es ist ferner möglich, präzise eine Klasse vernetzter Produkte anzuvisieren, die den Qualitätsanforderungen genügen, die in Abhängigkeit von der angestrebten Anwendung aufgestellt werden und die die einschränkenden Bedingungen hinsichtlich der mechanischen Eigenschaften und die gewünschten Kinetiken des biologischen Abbaus vorgeben.
Die erfindungsgemäßen Produkte und die erfindungsgemäßen Verfahren finden unmittelbare Anwendung einerseits auf dem Gebiet der Humanmedizin und der Tiermedizin und andererseits auf dem Gebiet der Biologie.
In der Humanmedizin oder der Tiermedizin kann es sich um Implantate handeln, beispielsweise ophtalmologische Implantate, Prothesen, beispielsweise Knochenprothesen, Verbandmaterial in Form von Folien oder Filzen, künstliche Gewebe (Epidermis, Gefäße, Bänder, Knochen), Systeme zur Verkapslung (Mikrokugeln, Mikrokapseln), die die kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen in vivo ermöglichen, oder Systeme zur Bioverkapselung, Überzüge zur Biokompatibilisierung implantierbarer medizinischer Gegenstände oder auch Nähgut. Diese Produkte können außerdem mit mineralischen Füllstoffen (Hydroxyapatit, Korallenpulver, ...) kombiniert sein, um als Mittel zur Knochen- oder Knorpelauffüllung verwendet zu werden.
In der Biologie stellen die erfindungsgemäßen Materialien hervorragende Träger für zweidimensionale Zellkulturen (Filme oder Folien) und dreidimensionale Zellkulturen (Filze) dar.
Das erfindungsgemäße vernetzte Kollagen kann allein oder im Gemisch mit modifizierten oder nicht modifizierten biologischen Polymeren oder synthetischen Polymeren verwendet werden.
Weitere interessante Anwendungen der erfindungsgemäßen Produkte liegen auf dem Gebiet der Haftmittel, z.B. haftende Gegenstände und/oder haftende Biomaterialien, biologische oder chirurgische Klebstoffe.
Weitere Vorteile, Abwandlungen und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den folgenden Beispielen.

Beispiele

BEISPIEL 1: Synthese von Cysteinyl-Succinyl-Kollagen in vernetzter Form und in vernetzbarer Form aus Kollagen ohne Telopeptide (Atelokollagen) (Schritte a&sub1; bis d&sub1;, e1&sub1; und f1&sub1;) (Weg I)

Schritt a&sub1;: Solubilisierung des Ausgangs-Atelo-Kollagens:

32 g Bernsteinsäure werden in 270 ml Methanol gelöst. 25 g Atelokollagen (Rinderkollagen - Typ I + III - von der Gesellschaft SAPUC) werden in dieser Lösung suspendiert. Nach einstündigem Quellen werden 290 ml DMSO oder 375 ml NMP zugegeben, und das Medium wird bis zur vollständigen Auflösung bei 20 ºC gerührt. Das Medium wird anschließend durch ein 45-µm-Filter filtriert, wonach das Methanol unter vermindertem Druck (etwa 0,3 mbar) verdampft wird.

Schritt b&sub1;: Aktivierung und Carboxylierung des solubilisierten Kollagens:

Zu der am Ende von Schritt a&sub1; erhaltenen, methanolfreien Kollagenlösung werden 30 g (300 mmol) Bernsteinsäureanhydrid zugegeben, anschließend werden nach vollständigem Auflösen 75 ml (538 mmol) frisch destilliertes Triethylamin tropfenweise während 10 min zugegeben. Die Temperatur wird durch ein externes Thermostatisierungssystem bei 25 ºC gehalten. Die erhaltene Lösung wird 3 bis 15 h gerührt, wonach das succinylierte Kollagen durch Zugabe von zwei Volumina Ethylacetat ausgefällt wird. Der Niederschlag wird anschließend nacheinander in zwei Acetonbädem von jeweils 250 ml gewaschen. Der erhaltene Feststoff wird in 300 ml destilliertem Wasser gelöst, dessen pH-Wert auf 6,5 eingestellt wurde, wonach die Lösung gegen destilliertes Wasser, das auf pH-Wert 2 gebracht wurde (Ansäuerung mit 6N-HCl) dialysiert wurde. Nach der Lyophilisierung werden 21,5 g Kollagen mit 20 % succinylierten Aminosäuren erhalten.
Der Succinylierungsgrad wird nach zwei Methoden bestimmt:
- enzymatische quantitative Bestimmung der Bernsteinsäure nach Hydrolyse des Kollagens in saurem Medium,
- potentiometrische quantitative Bestimmung der Carboxygruppen.

Schritte c&sub1; und d&sub1;: Aktivierung des succinylierten Atelokollagens und Pfropfung von S-Triphenylmethylcysteinethylester:

4 g zu 20 % succinyliertes Kollagen (10,54 mmol Säuregruppen insgesamt), die in dem vorherigen Schritt hergestellt wurden, werden in 80 ml wasserfreiem DMF gelöst. Nach vollständigem Auflösen werden unter starkem Rühren 1,72 ml Triethylamin (12 mmol) zugegeben. Das Reaktionsmedium wird vor der tropfenweise Zugabe von 1,92 ml Ethylchlorformiat (20 mmol) auf -5 ºC gekühlt. Nach 15 min ist das succinylierte Kollagen aktiviert und Schritt c&sub1; beendet.
Schritt d&sub1; wird durch Zugabe von 7,2 g 5-Triphenylmethylcysteinethylester (18 mmol), die durch Zusammengeben von Cysteinethylester und Triphenylmethanol und BF&sub3;-Etherat (Temperatur über 50 ºC) hergestellt werden, zu dem Reaktionsmedium gestartet. Das Reaktionsmedium wird dann 16 h unter Rühren bei 20 - 25 ºC stehengelassen. Das gebildete Kollagenderivat wird anschließend durch Zugabe von 400 ml Ethylacetat ausgefällt. Nach erneutem Auflösen in DMF und erneutem Ausfällen mit Ethylacetat wird das erhaltene Kollagenderivat mit Methanol gewaschen, anschließend unter vermindertem Druck bei 20 - 25 ºC getrocknet. So werden 4,5 g trockenes Produkt erhalten.

Schritte e1&sub1; und f1&sub1; : Entfernung der Schutzgruppe - "CΦ&sub3;" - Herstellung von über Disulfid-Brücken vernetztem Kollagen:

Die in Schritt d&sub1; erzeugten 4,5 g Produkt werden 3 h unter Rühren in 45 ml DMF stehengelassen. Das Derivat wird in diesem Stadium vollständig solubilisiert. 1,45 g (7 mmol) in 20 ml Methanol gelöstes bd werden zugesetzt.
Es kommt zur Bildung eines Gels. Das Medium wird 18 h stehengelassen, anschließend mehrfach mit einem Wasser: Aceton/50:50-Gemisch (V:V) bis zur vollständigen Entfärbung gewaschen. Nach dreimaligem Waschen mit Ethylacetat wird das Produkt getrocknet. Es werden 3,46 g trockenes Endprodukt erhalten.
Der Substitutionsgrad des erhaltenen Kollagens liegt in der Größenordnung von 3 bis 5 Cysteinresten pro 100 Aminosäuren, was durch quantitative Bestimmung der Thiolgruppen mit DTNB ermittelt wurde.
Dieses vernetzte Derivat kann mit Dithiothreitol unter Erhalt des an der Luft, mit Wasserstoffperoxid oder Iod leicht vernetzbaren Thiol-Kollagen-Derivats reduziert werden.

BEISPIEL 2: Synthese von Cysteinyl-Succinyl-Kollagen in vernetzter Form und in vernetzbarer Form aus einem Atelokollagen-Succinylsalz (Weg I)

Vorbereitender Schritt: Herstellung des Atelokollagen-Succinylsalzes:

12 g Bernsteinsäure (102 mmol) werden in 225 ml Isopropanol gelöst. 12 g Atelokollagen werden zu diesem Reaktionsmedium gegeben, wonach 2 h bei 20 - 25 ºC mit einem Magnetrührer gerührt wird.
Nach Filtration durch ein 50-µm-Sieb werden die Kollagenfasern geschleudert und anschließend zweimal mit 150 ml Isopropanol gewaschen, wonach sie erneut filtriert werden.
Auf diese Weise werden 13 g trockenes Atelokollagen- Succinylsalz nach 4stündigem Trocknen unter vermindertem Druck bei 25 - 30 ºC gewonnen.

Schritte a&sub1; und b&sub1;: Solubilisierung des Salzes und Synthese von succinyliertem Atelokollagen aus dem succinylierten Salz:

10 g Atelokollagen-Succinylsalz werden in 240 ml eines DMF:DMSO/60:40-Gemischs (V:V) unter Rühren mit einem Magnetrührer gelöst. 3,9 g Bernsteinsäureanhydrid (39 mmol) sowie 8,7 ml frisch destilliertes Triethylamin (62,5 mmol) werden zu dem Medium gegeben. Das Reaktionsmedium wird 24 h unter Rühren mit einem Magnetrührer bei 20 - 25 ºC stehengelassen und anschließend gegen destilliertes Wasser dialysiert. Nach Ansäuern auf pH 2 - 4 wird das Produkt mit Aceton gefällt, bevor es gegen Wasser mit pH 2 dialysiert wird. Nach der Lyophilisierung werden 8 g trockenes Derivat erhalten, das zu 9,5 % succinyliert ist (potentiometrische Bestimmung).

Schritte c&sub1; und d&sub1;: Aktivierung des succinylierten Atelokollagens und Aufpfropfung des S-Triphenylmethylcysteinethylesters:

4,5 g Atelokollagen, das zu 9,5 % succinyliert ist (8,37 mol Säuregruppen insgesamt) werden während 18 h unter Rühren mit einem Magnetrührer bei 20 - 25 ºC in 90 ml wasserfreiem DMF aufgelöst. Nach Abkühlen des Mediums auf -5 bis -10 ºC werden 1,575 ml Triethylamin (11,3 mmol) zugegeben, wonach tropfenweise 1,2 ml Ethylchlorformiat (12,6 mmol) zugesetzt werden.
Nach 15minütigem Rühren bei -5/-10 ºC ist das succinylierte Kollagen aktiviert und Schritt c&sub1; beendet.
Schritt d&sub1; wird durch Zugabe von 6,8 g (16,5 mmol) S-Triphenylmethylcysteinmethylester zu dem Reaktionsmedium gestartet, das 1 h bei -5 ºC und anschließend 16 h bei 20 - 25 ºC mit einem Magnetrührer gerührt wird.
Das gebildete Derivat wird anschließend mit 400 ml Ethylacetat ausgefällt. Nach erneutem Auflösen in DMSO und erneutem Fällen in Ethylacetat wird das Derivat mit Methanol gewaschen und anschließend bei vermindertem Druck unter Erhalt von 7,6 g trockenem Produkt getrocknet.

Schritte e1&sub1; und f1&sub1; : Entfernung der Schutzgruppe - "CΦ&sub3;" - Herstellung des über Disulfid-Brücken vernetzten Kollagens:

Die 7,6 g des in Schritt d&sub1; gebildeten Produkts werden unter Rühren 3 h in 80 ml DMF stehengelassen. 100 ml Ethanol werden hinzugegeben. In diesem Stadium ist das Derivat vollständig solubilisiert. 1,77 g (7 mmol) Iod, die in 20 ml Methanol gelöst sind, werden dann zugegeben.
Es kommt zur Bildung eines Gels. Das Medium wird 18 h stehengelassen, anschließend mehrfach mit einem Wasser: Aceton/50:50-Gemisch (V:V) bis zur vollständigen Entfärbung gewaschen. Nach dreimaligem Waschen mit Ethylacetat wird das Produkt unter Erhalt von 6 g trockenem Endprodukt (Endderivat) getrocknet.
Der Substitutionsgrad des erhaltenen modifizierten Kollagens wird durch quantitative Bestimmung der Thiolgruppen mit DTNB zu 11 Cysteinresten pro 100 Aminosäuren geschätzt.
Dieses vernetzte Derivat kann mit Dithiothreitol unter Erhalt des leicht an der Luft, mit Luftsauerstoff oder Iod vernetzbaren Thiol-Kollagen-Derivats reduziert werden.

BEISPIEL 3: Synthese von Cysteinyl-Succinyl-Kollagen (vernetzt oder vernetzbar) aus Rinderkollagen mit Telopeptiden vom Typ I + III (Weg I)

Schritte a&sub1; und b&sub1;:

2,5 g Rinderkollagen mit Telopeptiden Typ I + III werden bei 50 ºC in 80 ml Wasser gelöst, und die erhaltene dünnflüssige Lösung wird 1 h bei dieser Temperatur gerührt. 0,25 g Dithiothreitol (1,11 mmol) werden dann nach Abkühlen der Kollagenlösung auf etwa 30 ºC zugegeben, und der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 9,5 gebracht. Die erhaltene Lösung wird 1 h gerührt, und anschließend wird der pH-Wert mit Chlorwasserstoffsäure auf 2,5 - 3 gesenkt. Das Kollagen wird anschließend mit 2 Volumina Aceton ausgefällt, mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen, anschließend durch Filtration gewonnen und bei vermindertem Druck getrocknet.
Das zuvor erhaltene pulverförmige Kollagen (2,2 g) wird in 20 ml Methanol suspendiert und 15 min gerührt, wonach 40 ml wasserfreies Dimethylsulfoxid, das 0,4 g Bernsteinsäure (3,39 mmol) enthält, zugegeben werden. Nach 30minütigem Rühren wird das Methanol unter vermindertem Druck bei 30 ºC verdampft. Zu der erhaltenen Lösung werden 2,91 g (29,1 mmol) Bernsteinsäureanhydrid zugegeben, wonach nach Auflösen des Bernsteinsäureanhydrids 4,5 ml (32,3 mmol) frisch destilliertes Triethylamin zugegeben werden. Das Medium wird 2 h bei 20 ºC gerührt. Das succinylierte Kollagen wird mit 200 ml Aceton ausgefällt und anschließend durch Filtration gewonnen. Der Niederschlag wird dann in 80 ml Wasser mit pH-Wert 8 aufgelöst, die Lösung wird 20 min bei 15 000 g zentrifugiert, und der Überstand wird gegen destilliertes Wasser dialysiert, dessen pH-Wert mit Chlorwasserstoffsäure bei etwa 2 gehalten wird. Das Dialysat wird unter Erhalt von 2,3 g succinyliertem Kollagen lyophilisiert, dessen Substitutionsgrad nach potentiometrischer Bestimmung 18 % beträgt.

Schritte c&sub1;, d&sub1; und e&sub1;:

1 g zu 18 % succinyliertes Rinderkollagen (etwa 2,52 mmol Carboxygruppen) wird in 25 ml wasserfreiem DMSO solubilisiert. Zu dieser sehr viskosen Lösung werden 0,55 g (3,39 mmol) pulverförmiges Carbonyldiimidazol gegeben. Das Medium wird unter vermindertem Druck entgast und 45 min gerührt. Die Zugabe von 0,8 g (2,35 mmol) Cystindimethylester, der in 5 ml wasserfreiem DMSO gelöst ist, ergibt nach einigen Minuten ein Gel, das 18 h im Dunkeln stehengelassen wird. Das Gel wird in 100 ml Aceton dispergiert und 2 h gerührt, wonach es in mehreren Acetonbädem gewaschen, durch Filtration gewonnen und unter vermindertem Druck getrocknet wird.
Das erhaltene modifizierte Kollagen (1 g) wird in 50 ml Wasser suspendiert, dessen pH-Wert bei 9,5 gehalten wird. 0,4 g (2,6 mmol) Dithiothreitol, die in 10 ml Wasser mit pH-Wert 9,5 gelöst sind, werden zugegeben, und das Medium wird 18 h bei 20 - 25 ºC gerührt. Die erhaltene Lösung wird 15 min bei 15 000 g zentrifugiert, der Überstand wird bis pH 1,8 angesäuert, und das erhaltene Gel wird gegen destilliertes Wasser mit pH 1,5 bis 1,8 dialysiert. Das Dialysat wird unter Erhalt von 0,985 g modifiziertem Kollagen mit einem Substitutionsgrad von etwa 9 Thiolgruppen pro 100 Aminosäuren des Ausgangskollagens lyophilisiert.

BEISPIEL 4: Synthese von Cysteamin-Succinyl-Kollagen aus Rinderkollagen mit Telopeptiden vom Typ I + III (Weg I)

Das Protokoll ist identisch mit dem Protokoll von Beispiel 3. 1,05 g thiolisiertes Kollagen werden aus 1 g succinyliertem Kollagen hergestellt. Der Pfropfungsgrad wird zu 14 % geschätzt, bezogen auf die Aminosäuren des Ausgangskollagens.

BEISPIEL 5: Synthese von Cysteaminyl-Succinyl-Kollagen aus Kollagen mit Telopeptiden und einer Disuccinyl- Cystamin-Reaktionsuntereinheit (Weg II)

2,2 g säurelösliches Kollagen (etwa 0,78 mmol Lysylreste) werden 15 min in 75 ml Methanol gerührt, anschließend werden 125 ml Dimethylsulfoxid zugegeben. Das Gemisch wird 15 min bei 40 ºC gerührt, anschließend wird das Methanol unter vermindertem Druck verdampft. 0,707 g (1,564 mmol) des Diimidazolids von Disuccinylcystamin (hergestellt durch Umsetzung von Bernsteinsäureanhydrid mit Cystamin in wäßrigem basischem Medium) werden in 20 ml DMSO gelöst, und die erhaltene Lösung wird zu der Kollagenlösung gegeben. Das Gemisch wird 20 h bei 20 - 25 ºC gerührt, anschließend wird das erhaltene Gel in 200 ml Aceton dispergiert, mit 2 x 100 ml dieses Lösungsmittels gewaschen, anschließend während 2 h mit 2 x 500 ml Wasser gewaschen, dessen pH-Wert mit Natriumhyäroxid bei 7 - 9,5 gehalten wird.
Das Gel wird durch Filtration gewonnen, anschließend wird es in 50 ml einer wäßrigen Dithiothreitollösung (0,5 g, 3,25 mmol), deren pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 9,5 eingestellt ist, eingebracht. Nach 18stündigem Rühren bei 20 - 25 ºC wird das Medium während 15 min auf 40 ºC gebracht, anschließend 10 min bei 15 000 g zentrifugiert. Der Uberstand wird dann auf pH 1,8 angesäuert und bei gleichem pH- Wert gegen Wasser dialysiert. Das Kollagenmedium wird dann unter Erhalt von 1,8 g Kollagen lyophilisiert, bei dem 3 % der Aminosäuren des Ausgangskollagens thiolisiert sind.

BEISPIEL 6: Synthese von Cysteaminyl-Succinyl-Kollagen aus Rinderatelokollagen vom Typ I + III (Weg I)

10 g zu 18 % succinyliertes Atelokollagen (etwa 25 mmol Carboxygruppen) werden in 150 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid gelöst. Die erhaltene viskose Lösung wird unter vermindertem Druck entgast, anschließend werden 9,1 g (56 mmol) pulverförmiges Carbonyldiimidazol auf einmal bei einer Temperatur von 20 - 25 ºC zugegeben. Nach Auflösen des Carbonyldiimidazols wird die erhaltene Lösung unter vermindertem Druck 1 bis 2 h entgast. 7,6 g (33,77 mmol) Cystaminhydrochlorid werden bei 40 ºC in 50 ml wasserfreiem DMSO gelöst, und die erhaltene Lösung wird auf einmal unter starkem Rühren zu der Lösung des aktivierten Kollagens gegeben. Das nach einigen Minuten erhaltene gelierte Medium wird 3 bis 24 h bei 20 - 25 ºC stehengelassen. Das Gel wird anschließend in 400 ml Ethylacetat dispergiert, durch Filtration gewonnen, anschließend zweimal mit 300 ml Aceton gewaschen. Das erhaltene körnige Produkt wird dann während 16 h in Wasser dispergiert, dessen pH-Wert mit Natriumhydroxid bei 10 gehalten wird, und anschließend durch Filtration gewonnen. Das erhaltene Produkt wird in 90 ml Wasser mit pH 10 suspendiert, anschließend werden 3,85 g (25 mmol) Dithiothreitol zugegeben, die in 20 ml Wasser mit pH 10 gelöst ist. Das erhaltene Gemisch wird 16 h bei 20 ºC gerührt und 15 min bei 15 000 g zentrifugiert. Der Überstand wird mit Chlorwasserstoff säure bis pH 1,8 angesäuert, anschließend gegen Wasser mit pH 1,5 - 2 dialysiert. Das Dialysat wird unter Erhalt von 10,7 g thiolisiertem Kollagen lyophilisiert. Die quantitative Bestimmung der Thiolgruppen nach der DTNB-Methode ergibt einen Substitutionsgrad von 15 % bezogen auf die Aminosäuren des Kollagens, was einem Substitutionsgrad von etwa 55 %, bezogen auf die Carboxygruppen des succinylierten Ausgangskollagens, entspricht.

BEISPIEL 7: Synthese von Cysteinyl-Succinyl-Kollagen aus Rinderatelokollagen vom Typ I + III (Weg I)

10 g zu 18 % succinyliertes Atelokollagen werden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 6 aktiviert. 8,5 g (25 mmol) Cystindimethylester werden in 10 ml wasserfreiem DMSO gelöst, anschließend wird die erhaltene Lösung zu der Lösung des aktivierten Kollagens gegeben. Das Medium wird 16 - 60 h bei 20 - 25 ºC gerührt. Das erhaltene Gel wird unter starkem Rühren in drei Volumina Aceton dispergiert, dreimal in 150 ml dieses Lösungsmittels gewaschen, anschließend durch Filtration gewonnen. Das modifizierte Kollagen kann dann durch Verdampfen des restlichen Acetons unter vermindertem Druck in Form eines Pulvers erhalten werden oder unmittelbar im folgenden Schritt verwendet werden. Das modifizierte Kollagen wird in 100 ml Wasser, dessen pH-Wert mit Natriumhydroxid bei 9,5 gehalten wird, suspendiert. Zu dieser Suspension werden 3,85 g (25 mmol) Dithiothreitol gegeben, die in 20 ml Wasser mit pH 9,5 gelöst sind. Das Gemisch wird 16 - 24 h bei 20 - 25 ºC gerührt und 15 min bei 15 000 g zentrifugiert. Der Überstand wird mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 1,8 angesäuert, anschließend gegen Wasser mit pH 1,5 - 2 dialysiert, bis mit DTNB ein negatives Testergebnis in den Dialysewassern erhalten wird. Das Dialysat wird lyophilisiert. Die quantitative Bestimmung der Thiolgruppen nach der DTNB-Methode ergibt einen Substitutionsgrad von etwa 9 %, bezogen auf die Aminosäuren des Kollagens.

BEISPIEL 8: Synthese von Cysteaminyl-Succinyl-Kollagen aus Atelokollagen (Weg II)

2,4 g Rinderatelokollagen vom Typ I + III (etwa 0,855 mmol Lysylreste) werden in 30 ml wasserfreiem DMSO nach den in Beispiel III Schritt b&sub1; beschriebenen Verfahren gelöst.
0,6 g (1,7 mmol) Disuccinylcystamin werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst, zu den 0,55 g (3,41 mmol) pulverförmiges Carbonyldiimidazol gegeben werden. Die Lösung wird unter vermindertem Druck entgast und 2 h gerührt.
Das erhaltene heterogene Gemisch wird zu der zuvor hergestellten Kollagenlösung gegeben, und die erhaltene Lösung wird 18 h bei 20 - 25 ºC gerührt. Das Kollagen wird dann durch Zugabe von drei Volumina Aceton ausgefällt und durch Filtration gesammelt. Der Niederschlag wird dann in 200 ml Wasser dispergiert, dessen pH-Wert im sauren Bereich gehalten wird, und die Suspension wird 18 h gerührt.
Der gewaschene Niederschlag wird in 50 ml Wasser dispergiert, dessen pH-Wert mit Natriumhydroxid bei 10 gehalten wird. Zu der erhaltenen Suspension werden 0,26 g (1,7 mmol) Dithiothreitol gegeben, die in 5 ml Wasser mit pH 10 gelöst sind. Das Medium wird 24 - 48 h bei 20 - 25 ºC gerührt, mit Chlorwasserstoffsäure bis zu pH 1,8 angesäuert, und das hergestellte Gel wird gegen Wasser mit einem pH-Wert von 1,5 - 2 dialysiert, anschließend unter Erhalt von 2,3 g modifiziertem Kollagen lyophilisiert. Die quantitative Bestimmung der Thiolgruppen nach der DTNB-Methode ergibt einen Substitutionsgrad von 3,1 %, bezogen auf die Aminosäuren des Ausgangskollagens, was einem Substitutionsgrad von etwa 100 % des Lysylreste entspricht.

BEISPIEL 9: Synthese von Cysteinyl-Succinyl-Kollagen aus Atelokollagen (Weg I)

4 g Atelokollagen (etwa 1,42 mmol Lysylreste) werden in DMSO nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll gelöst. 0,7 g (3 mmol Carboxygruppen) Disuccinylcystindimethylester werden in 10 ml DMSO gelöst, anschließend werden 0,486 g (3 mmol) Carbonyldiimidazol zugegeben. Die Lösung wird 1 h gerührt und unter vermindertem Druck entgast, anschließend wird sie zu der Kollagenlösung gegeben. Nach 72stündigem Ruhenlassen bei 20 - 25 ºC wird das Reaktionsmedium in 300 ml Aceton dispergiert, die feste Phase wird 1 h in 200 ml Aceton und anschließend 2 x 1 h in 500 ml Wasser, dessen pH-Wert mit Natriumhydroxid bei 9 - 9,5 gehalten wird, gewaschen. Das Gel wird durch Filtration gewonnen, anschließend wird es in 70 ml Wasser mit pH 9,5 dispergiert.
Zu dieser Suspension wird eine wäßrige Dithiothreitollösung mit pH 9,5 (6 ml, 0,7 g, 4,54 mmol) gegeben. Nach 18stündiger Reaktion wird das Medium 10 min auf 30 ºC erwärmt, anschließend 15 min bei 15 000 g zentrifugiert. Der Überstand wird wie in Beispiel 7 unter Erhalt von 3,9 g Kollagen, bei dem 2,4 - 2,8 % der Aminosäuren des Ausgangskollagens thiolisiert sind, behandelt.

OXIDATION-VERNETZUNG DER THIOLISIERTEN KOLLAGENE

Alle thiolisierten Kollagene sind in Gegenwart von Oxidationsmitteln oxidierbar und vernetzbar. Je nach den Bedingungen der Oxidation der gelösten Kollagene (wäßrige, organische oder gemischte Lösung, Temperatur, Ionenstärke, pH-Wert, Konzentration) und der Art des Oxidationsmittels äußert sich die Vernetzung in der Bildung eines Gels, eines Niederschlags, einer Veränderung der Viskosität der Lösung. Von den verwendeten Oxidationsmitteln können Sauerstoff allein, Sauerstoff in Gegenwart von UV-Strahlung, Wasserstoffperoxid in saurem, neutralem oder basischem Medium, bd in alkoholischer oder wäßriger Lösung angegeben werden, die Vernetzung kann außerdem mit nicht gelöstem thiolisiertem Kollagen, das in Form von Folien oder Pulvern vorliegt, beispielsweise durch Eintauchen in oxidierende Lösungen, durchgeführt werden.
Alle oxidierten Kollagene sind in wäßrigem und organischem Medium unlöslich, können aber in reduzierenden Lösungen mit basischem pH-Wert wie z.B. einer wäßrigen Dithiothreitollösung mit pH 9,5 solubilisiert werden.

BEISPIEL 10: Bildung eines Gels

0,5 g (die etwa 0,16 mmol Thiol-Gruppen enthalten) Atebkollagen aus Beispiel 8 werden bei 40 ºC in 10 ml Wasser gelöst, anschließend wird der pH-Wert der Lösung mit Natriumhydroxid auf 7 und mit 1M-Carbonatpuffer mit pH 9 auf 8,2 eingestellt. Die Lösung wird durch ein 0,22-µm-Filter filtriert und anschließend durch Absenken der Temperatur in ein Gel übergeführt.
Das hergestellte thermoreversible Gel wird in 150 ml 0,15-N-Natriumboratpuffer mit pH 8,2, der 0,15 % Wasserstoffperoxid enthält, eingetaucht und 6 - 24 h unter schwachem Rühren in dieser Lösung stehengelassen. Das erhaltene durchsichtige Gel wird dann in mehreren Wasserbädem gewaschen und kann in einer 25%igen wäßrigen Ethanollösung aufbewahrt werden.
Dieses Gel ist nicht mehr thermoreversibel und enthält keine freien Thiol-Gruppen mehr.

BEISPIEL 11: Bildung einer Folie

0,7 g des Kollagens aus Beispiel 8 (etwa 0,23 mmol Thiol- Ggruppen enthaltend) werden bei 40 ºC in 50 ml Wasser gelöst, anschließend wird der pH-Wert der Lösung wie in Beispiel 10 auf 8,2 eingestellt. Nach Filtration durch ein 0,22-µm-Filter wird die Lösung in eine Polystyrolschale (120 x 120 mm) gegossen und das Lösungsmittel bei 20 - 25 ºC an der freien Luft verdampft. Die so hergestellte Folie wird dann während 1 - 5 h in 100 ml einer Wasserstoffperoxidlösung (Beispiel 10) eingetaucht und anschließend mit Wasser gewaschen. Dieser Film kann im trockenen Zustand oder in einer 25%igen wäßrigen Ethanollösung aufbewahrt werden.

BEISPIEL 12: Ex-vivo-Bestimmung der Gewebehaftung

Die Bestimmung der Haft- oder Klebeeigenschaften der erfindungsgemäßen Produkte wurde mit Muskelgewebe von Kaninchen (Kaninchenrücken) durchgeführt. Diese Gewebe werden maximal 48 h bei 4 ºC in physiologischem Serum gelagert. Das Kaninchengewebe wird mit Hilfe einer elektrischen Schneidvorrichtung (Dicke der Streifen: 2,5 ± 0 5 mm) in Faserrichtung zerschnitten, anschließend werden quadratische Stücke von 25 mm x 25 mm aus den erhaltenen Streifen herausgeschnitten. Die Versuche werden mit einer herkömmlichen Zugvorrichtung durchgeführt, beispielsweise vom Typ Adamel Lhomarcy, Typ DY 34, das mit einem 100-N-Kraftmeßgerät ausgestattet ist. Diese Vorrichtung ermöglicht die Erstellung von Kraft-Dehnungs-Kurven. Es ist möglich, hieraus die maximale Abreißkraft oder die Klebekraft (Fmax) zu ermitteln, und die Haftenergie kann aus dem Inhalt der Fläche unter der Kurve berechnet werden.
Bei jedem Versuchstyp werden zwei Proben des Kaninchengewebes mit Hilfe eines Cyanacryl-Klebstoffs (beispielsweise unter der Marke LOCTITE superglue im Handel, flüssig oder als Gel) an inerten Trägern, Gläsern oder sehr fester Pappe mit größerer Abmessung, befestigt. Die Versuche werden nach einer 3minütigen Kontaktzeit unter einem Druck von 4 N durchgeführt.
Eine Lösung mit 5 % Cysteamin-Succinyl-Kollagen (hergestellt gemäß Beispiel 4) wird unter inerter Atmosphäre hergestellt. Ihr pH-Wert wird auf 7 bis 8 eingestellt. Vor dem Versuch werden die Oberflächen der Gewebe oberflächlich mit einer BETADINE -Lösung für die Haut getränkt (iodhaltiges Polyvinylpyrollidon).
100 µl der Kollagenlösung werden dann zwischen die beiden Gewebeproben gegeben, und man beobachtet eine zunehmende Gelbildung im Kontaktbereich mit der iodhaltigen Lösung (Oxidationsmittel).
Nachdem 3minütigem Kleben unter Druck (4 N) wird eine Klebekraft F = 315 ± 1,9 N (Mittelwert aus 14 Versuchen) und eine Haftenergie E = 7,0 ± 3,1 mJ erhalten.
Diese Werte sind von Interesse und können mit den Werten verglichen werden, die bei dem gleichen Test mit im Handel erhältlichen Klebstoffen auf Fibrinbasis erhalten werden. So betragen für den Klebstoff BIOCOL (Auftrag von 200 ml) die ermittelten Haftwerte F = 2,5 ± 1,6 N und E = 3,8 ± 2,0 mJ (Mittelwert von 17 Versuchen).

Claims

1. Modifiziertes vernetzbares Kollagen, das in Wasser und/oder organischen polaren aprotischen Lösungsmitteln löslich ist und unsubstituierte oder substituierte Thiolgruppen aufweist, die von Cysteinresten getragen werden,

wobei die Reste:

- an das Kollagen zumindest teilweise über Spacerverbindungen gebunden sind

- und folgender allgemeinen Formel entsprechen:

worin bedeuten:

- R&sub1; H oder COOR'&sub1;, worin R'&sub1; bedeutet: eine aliphatische und/oder aromatische und/oder cyclische Kohlenwasserstoffkette;

- R&sub2; Wasserstoff oder eine aliphatische und/oder aromatische und/oder cyclische gegebenenfalls schwefelhaltige Kohlenwasserstoffkette;

- x 1 oder 2.

2. Modifiziertes Kollagen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spacerverbindung eine Kohlenwasserstoffeinheit mit Carboxygruppe ist.

3. Modifiziertes Kollagen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenwasserstoffeinheit mit Carboxygruppe einer Dicarbonsäure abgeleitet ist, die befähigt ist, ein cyclisches Anhydrid zu bilden.

4. Modifiziertes Kollagen nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicarbonsäure unter den folgenden Verbindungen ausgewählt ist: Bernsteinsäure, Glutarsäure, Phthalsäure, Itaconsäure, Citraconsäure und Maleinsäure sowie deren Derivaten.

5. Modifiziertes Kollagen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reste, welche die unsubstituierten oder substituierten Thiolgruppen tragen, unter den folgenden Verbindungen ausgewählt sind: Cystein, Cystin, Homocystein, Homocystin, Cysteamin und Cystamin.

6. Vernetztes unlösliches Kollagen, dadurch gekennzeichnet, daß die Brücken zwischen den Ketten zumindest teilweise aus Disulfidbrücken bestehen, welche von den in Anspruch 1 definierten Cysteinresten gebildet werden, die an das Kollagen zumindest teilweise über Spacerverbindungen gebunden sind.

7. Vernetzes Kollagen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Kollagen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 hergestellt ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten vernetzbaren oder selbstvernetzenden in Wasser und/oder organischen polaren aprotischen Lösungsmitteln löslichen Kollagens, das unsubstituierte oder substituierte Thiolgruppen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus den folgenden Schritten besteht:

a&sub1; Solubilisierung des Ausgangskollagens in mindestens einem organischen polaren aprotischen Lösungsmittel,

b&sub1; Acylierung und Carboxylierung des gelösten Kollagens,

c&sub1; Aktivierung der freien Carboxygruppen des Kollagens,

d&sub1; Umsetzung des aktivierten Kollagens mit einem in Anspruch 1 definierten Cysteinrest mit einer oder mehreren geschützten Thiolgruppen und gegebenenfalls einer oder mehreren geschützten Carbonsäuregruppen, um einen inerten Precursor des gewünschten modifizierten Kollagens herzustellen,

e&sub1; direkte Aktivierung des inerten Precursors, die zu dem modifizierten Kollagen führt, das unsubstituierte oder substituierte stabilisierte Thiolgruppen trägt.

9. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten vernetzbaren oder selbstvernetzenden in Wasser und/oder organischen polaren aprotischen Lösungsmitteln löslichen Kollagen, das unsubstituierte oder substituierte Thiolgruppen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus folgenden Schritten besteht:

a&sub2; Solubilisierung des Ausgangskollagens in mindestens einem organischen polaren Lösungsmittel,

b&sub2; Herstellung der Untereinheit, die aus der Spacerverbindung und dem in Anspruch 1 definierten Cysteinrest mit geschützten Thiolgruppen besteht,

c&sub2; Aktivierung der freien Carboxygruppen der Untereinheit,

d&sub2; Umsetzung des Kollagens und der Untereinheit, um einen inerten Precursor des gewünschten modifizierten Kollagens herzustellen,

e&sub2; direkte Aktivierung des inerten Precursors, die zu dem modifizierten Kollagen führt, das unsubstituierte oder substituierte stabilisierte Thiolgruppen trägt.

10. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten vernetzbaren oder selbstvernetzenden in Wasser und/oder organischen polaren aprotischen Lösungsmittel löslichen Kollagens, das unsubstituierte oder substituierte Thiolgruppen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus folgenden Schritten besteht:

b&sub1; Acylierung und Carboxylierung des solubilisierten Kollagens,

c&sub1; Aktivierung der freien Carboxygruppen des Kollagens,

d&sub1; Umsetzung des aktivierten Kollagens mit einem in Anspruch 1 definierten Cysteinrest mit einer oder mehreren geschützten Thiolgruppen und gegebenenfalls einer oder mehreren geschützten Carboxygruppen, um einen inerten Precursor des gewünschten modifizierten Kollagens herzustellen,

e&sub1; indirekte Aktivierung des inerten Precursors, die zu Kollagen führt, das über Disulfidbrücken zwischen den Ketten vernetzt ist,

f&sub1; Umformung des vernetzten Kollagens in modifiziertes Kollagen, das unsubstituierte oder substituierte stabilisierte Thiolgruppen trägt.

11. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten vernetzbaren oder selbstvernetzenden in Wasser und/oder organischen polaren aprotischen Lösungsmittel löslichen Kollagens, das unsubstituierte oder substituierte Thiolgruppen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus den folgenden Schritten besteht:

a&sub2; Solubilisierung des Ausgangskollagens in mindestens einem polaren organischen Lösungsmittel,

b&sub2; Herstellung der Untereinheit aus der Spacerverbindung und einem in Anspruch 1 definierten Cysteinrest mit geschützten Thiolgruppen,

c&sub2; Aktivierung der freien Carboxygruppen der Untereinheit,

e&sub2; indirekte Aktivierung des inerten Precursors, die zu Kollagen führt, das über Disulfidbrücken zwischen den Ketten vernetzt ist,

f&sub2; Umformung des vernetzten Kollagens in modifiziertes Kollagen, das freie oder substituierte stabilisierte Thiolgruppen trägt.

12. Verfahren zur Herstellung eines unlöslichen vernetzten Kollagens, dadurch gekennzeichnet, daß es darin besteht, die Schritte a&sub1; bis e&sub1; des Verfahrens nach Anspruch 8 oder die Schritte a&sub2; bis e&sub2; des Verfahrens nach Anspruch 9 durchzuführen.

13. Zwischenprodukt, das bei der Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 12 erhalten wird, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Kollagen besteht, das mit einer Dicarbonsäure über mindestens einen Teil der reaktiven OH- und NH&sub2;-Gruppen reagiert hat, und daß es 4 bis 22 Carbonsäurepfropfungen pro 100 Aminosäuren aufweist.

14. Zwischenprodukt nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicarbonsäure die Bernsteinsäure oder Glutarsäure ist.

15. Verwendung des modifizierten vernetzbaren Kollagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder des nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12 hergestellten Kollagens oder des. vernetzten Kollagens nach Anspruch 6 oder 7 oder des nach dem Verfahren nach Anspruch 12 hergestellten Kollagens zur Herstellung von Gegenständen vom Typ der Implantate, Prothesen, künstlicher Haut, Verbände und Überzüge für Prothesen, die in der Medizin verwendbar sind.

16. Verwendung des modifizierten vernetzbaren Kollagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder des nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12 hergestellten Kollagens oder des vernetzten Kollagens nach Anspruch 6 oder 7 oder des nach dem Verfahren nach Anspruch 12 hergestellten Kollagens zur Herstellung von Gegenständen und/oder haftenden Biomaterialien und/oder biologischen oder chirurgischen Haftmitteln.