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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen
Bestimmung von Lipid.
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Lipide
sind Aufbaukomponenten von Zellen oder Organismen. Unter den Lipiden
ist Phospholipid ein Hauptlipid beim Aufbau von verschiedenen Membranen
in der Zelle, wie etwa Plasmamembran, Kernmembran, Membran des endoplasmatischen
Retikulums, Membran des Mitochondriums, Membran des Golgi-Apparats,
Lysozym-Membran und dergleichen. Das Phospholipid ist ein amphoteres
Molekül
mit sowohl einer polaren Gruppe als auch einer heterophoben Gruppe
in dem Molekül.
Wenn Phospholipid in Wasser suspendiert wird, werden die polaren
Gruppen mit Wassermolekülen
hydratisiert, und die hydrophoben Gruppen werden aus der wässrigen
Umgebung ausgeschlossen, um eine Zusammenlagerung der hydrophoben
Gruppen der Lipide zu verursachen. Folglich werden Mizellen, Lipid-Zweifachschichten
mit einer bimolekularen Membranstruktur oder hexagonale II-Strukturen
gebildet: der Zustand des Zusammenlagerns, abhängig von der Balance der Volumen
der hydratisierten hydrophilen Gruppen und der hydrophoben Gruppen.
Unter derartigen Strukturen ist die Lipid-Zweifachschicht die Basisstruktur
von Biomembranen. Die Zweifachschicht von Phospholipid bildet ein
geschlossenes Vesikel (Liposom), welches Membranprotein oder dergleichen
als dessen Bestandteil einbauen kann und eine wässrige Phase darin einschließen kann.
Daher wird die Phospholipid-Zweifach-Schichtstruktur häufig als ein Modell
einer Biomembran für
Substanzdurchdringung, Informationsübertragung usw. verwendet.
Ferner ist das Liposom für
die Verwendung für
eine Medizinkapsel vielversprechend, da das Liposom eine wasserlösliche Substanz
in dessen innerer wässriger Phase
zurückhalten
kann.
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Viele
Verfahren sind zur quantitativen Bestimmung von Phospholipid bekannt,
einschließlich eines
Nass-Verbrennungsverfahrens
(Hoeflmayr, J. and Fried, R,; Med. und Ern., 7, 9–10 (1966))
und ein Cholinoxidase-Phenolverfahren
(Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T. und Tanimizu, I., Clin. Chim.
Acta 79 93–98
(1977)). In dem Nass-Verbrennungsverfahren wird das Phospholipid
ermittelt, indem Schwefelsäure
und ein Permanganatsalz zu einer Probe gegeben wird; die Probe in
einem siedenden Wasserbad erhitzt wird, um die zusammensetzende
Phosphorsäure
freizusetzen; Ammoniummolybdat und ein Reduktionsmittel hinzugegeben
wird; und das Lichtabsorptionsvermögen gemessen wird, das durch
blaues Molybdän
verursacht wird, das hierdurch gebildet wird. Cholinoxidase-Phenolverfahren
wird das Phospholipid ermittelt, indem Phospholipase D mit dem Phospholipid
in einer Probe umgesetzt wird, um das Zusammensetzungscholin freizusetzen;
ferner Cholinoxidase mit dem resultierenden Cholin umgesetzt wird,
um Betain und Wasserstoffperoxid zu bilden; und Lichtabsorptionsvermögen des
Produktes einer quantitativen Kondensationsoxidation von Phenol
mit 4-Amino-antipyridin gemessen wird, die durch Wasserstoffperoxid
in Gegenwart von Peroxidase verursacht wird.
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Das
vorstehend erwähnte
Nass-Verbrennungsverfahren besitzt den Nachteil, dass der Betrieb
der sequenziellen Zugabe von mehreren Reagenzien aufwendig ist,
und die Gefahr von Siedeverzug und Messfehler durch Verdampfung
aufgrund von Erhitzen in Gegenwart von Schwefelsäure in einem siedenden Wasserbad.
Das Cholinoxidase-Phenolverfahren
besitzt den Nachteil der Instabilität des Enzyms, des Bedarfs zum
Lagern der Reagenzien in einer Kalt- und Dunkelbedingung, und der
nicht ausreichenden Reproduzierbarkeit der Messdaten, die zu unterschiedlichen
Zeiten erhalten wurden.
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Im
Allgemeinen wird Absorptions-spektrochemische quantitative Analyse,
bei welcher das Absorptionsvermögen
bei einer Absorptions-Wellenlänge
gemessen wird, die für
den Gegenstand der Analyse in der Probe charakteristisch ist, weithin
praktisch zur quantitativen Bestimmung einer Substanz verwendet,
da der Betrieb der direkten Messung des Absorptionsvermögens einfach
ist, und der Analysegegenstand nicht mit einer anderen Substanz
umgesetzt werden muss, wodurch ermöglicht wird, dass die Probe
später
für eine
andere Verwendung zur Verfügung
steht.
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Jedoch
ist dieses Analyseverfahren nicht zur Bestimmung von Lipiden verwendet
worden, da Lipide, wie etwa Phospholipid, das aus amphoteren Molekülen zusammengesetzt
ist, in einem wässrigen Medium
ein Aggregat in verschiedenem Zustand bildet, welches Licht streut
und eine präzise
Messung der Lipidkonzentration durch Lichtabsorptionsvermögen verhindert.
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Die
Zusammensetzungskomponenten von lebender Materie, wie etwa Lipide,
Proteine, Nukleinsäuren,
Zuckern werden häufig
in einem coexistierenden Zustand verwendet. Daher ist eine quantitative
Bestimmung von derartigen coexistierenden Substanzen ein wichtiges
Verfahren.
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Biomembranen
besitzen in einer Struktur einer Zweischicht-Membran, die hauptsächlich aus
Lipidmolekülen
zusammengesetzt ist, und Protein sammelt sich darin durch nicht-kovalente
Bindungen, wodurch dieses als eine Barriere zum Beibehalten des
inneren Mediums funktioniert. Das Verhältnis von Lipid zu Protein
in Biomembranen unterscheidet sich erheblich, abhängig von
den jeweiligen Membranen. In Membranen von Mitochondrien ist z.
B. Protein 4mal so viel wie Lipid vorhanden. Im Gegensatz dazu ist
in einigen Biomembranen Lipid in der mehrfachen Menge wie Protein
vorhanden. Demgemäß ist das Verhältnis von
Lipid zu Protein in Biomembranen in jeweiligen Organen ein wichtiger
Gegenstand der Untersuchung.
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Verschiedene
Biomembran-Modelle, in welchen Lipid und Protein coexistieren, werden
weithin bei der Untersuchung der Struktur und der Funktion der Biomembranen
verwendet. Die Beispiele beinhalten Proteoliposom, welches geschlossene
Vesikel besitzt, die aus künstlichen,
bimolekularen Lipidmembranen zusammengesetzt sind, die darin Protein
enthalten; Feinteilchen von Glasperlen oder ein Hochpolymer, welche
Lipid oder Protein aufweisen, die auf deren Oberfläche adsorbiert
sind; eine planare Lipidmembran, die in einem kleinen Loch in einem Substrat
aus Teflon oder dergleichen (eine schwarze Lipidmembran) gebildet
ist, oder ein planarer bimolekularer Film, der wieder aufgebaut
wurde, indem geheftet wurde oder Proben pipettiert wurden, in welchen
Protein eingebaut wird; und Langmuir-Blodgett aufgebaute Filme (LB-Bild-up-Filme),
in welchen ein Lipid-Protein cexistierendes System in Schichten
in einem molekularen Niveau aufgebaut wird. In diesen künstlichen
Filmen ist zudem die Bestimmung des Lipids und des Proteins beim
Bewerten von dessen Funktion wichtig.
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Wenn
das optimale Verhältnis
von Lipid zu Protein in natürlichen
oder künstlich
synthetisierten Membranstrukturen durch quantitative Bestimmung erhalten
werden kann, und eine Membran effektiv gemäß dem abgeleiteten Verhältnis synthetisiert
werden kann, dann können
verschiedene Membranstrukturen industriell bei geringen Kosten synthetisiert
werden, ohne wertvolles Protein zu verschwenden.
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Weitere
Beispiele von Lipid-Protein coexistierenden Systemen schließen Liposom
ein, d. h. ein geschlossenes Vesikel, das aus Phospholipidmembran
zusammengesetzt ist, in welchem ein funktionales Protein, wie etwa
ein wasserlösliches
Enzym, eingeschlossen ist; und Emulsionen, in welchen Lipid und
Protein einfach in einem flüssigen
Medium vermischt werden.
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Bis
jetzt wird bei der Bestimmung von Lipid und Protein in einem coexistierenden
System die Bestimmung von Lipid durch das Vorhandensein von Protein
beeinträchtigt,
und die Bestimmung von Protein wird durch das Vorhandensein von
Lipid beeinträchtigt.
Daher konnten Lipid und Protein in einem coexistierenden Zustand
nicht präzise
bestimmt werden. Bei der Bestimmung von Lipid durch die vorstehend
erwähnte
Absorptionsvermögensmessung
ist der Einfluss des Absorptionsvermögens von coexistierendem Protein
nicht vernachlässigbar.
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Verschiedene
Verfahren zum Bestimmen von Proteinen sind bekannt, einschließlich Kolorimetrie
unter Verwendung eines Metallions, UV-Absorptionsverfahren, basierend
auf Tyrosin und Tryptophan, und ein UV-Absorptionsverfahren, basierend
auf Peptidbindungen. Ein typisches Verfahren der Kalorimetrie ist
ein Lowery-Verfahren (J. Biol. Chim., Band 193, Seite 265 (1951)),
das ein Phenolreagenz verwendet. Dieses Verfahren verwendet eine
blaue Farbe, die durch Reaktion eines Phenols mit Protein entwickelt
wurde. Die Hauptkomponente des Reagenz ist Phosphomolybdat oder
Phosphowolframat, der aus dem Metalloxid und Phosphorsäure gebildet
wurde. Dieser Komplex reagiert mit einem Reduktionsmittel, wie etwa
Protein, um blaue Farbe von Phosphomolybdat-blau oder Phosphowolframat-blau
zu entwickeln. Das Protein wird durch Messung des Absorptionsvermögens ermittelt,
das durch die Farbe verursacht wurde. In einem Farbreaktionsverfahren, das
ein BCA-Verfahren genannt wird, wandelt vorhandenes Protein ein
Kupfer(II)ion in ein Kupfer(I)ion in einem alkalischen Medium um,
und das Kupfer(I)ion bildet eine kupferfarbene Komplexverbindung
mit Bicinchonsäuremolekül (d. h.,
BCA: 4,4'-Dicarboxy-2,2'-bichinolin). Das
Protein wird gemäß dem Absorptionsvermögen dieser
Komplexverbindung bestimmt.
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Im
Gegensatz dazu beinhaltet das UV-Absorptionsverfahren zur Bestimmung
von Protein die Messung der Absorption bei 280 nm, die durch Tyrosin
oder Tryptophan verursacht wurde, und eine Messung der Absorption
bei 215 bis 225 nm, die durch die Peptidbindung verursacht wurde.
Die beiden Messverfahren sind vorteilhaft, da das Verfahren einfach
ist und die Probe im Vergleich zu Farbentwicklungsverfahren nicht
verloren geht, aber ist dadurch nachteilhaft, dass die Messung von
Protein auf dem Gehalt von Tyrosin oder Tryptophan basiert und das Bestimmungsergebnis
erheblich abhängig
von der Art des Proteins variiert und für Störsubstanzen, wie etwa Nukleinsäure, empfänglich ist,
welche eine Absorption in diesem Absorptionsbereich besitzt.
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Bei
diesen bekannten Verfahren zur Bestimmung von Protein wird coexistierendes
Lipid auch einer Reaktion unterzogen, um eine Farbe zu entwickeln.
Zum Beispiel wird in dem Lowry-Verfahren und anderen Verfahren,
die ein Phenolreagenz verwenden, das Phosphomolybdat durch das Protein
reduziert, um eine blaue Farbe von Phosphomolybdat-blau zu entwickeln,
und gleichzeitig entwickelt das coexistierende Lipid, welches eine
Reduktionsaktivität,
wie das Protein zeigt, auf ähnliche
Weise eine Farbe.
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Demgemäß müssen diese
bei der quantitativen Bestimmung von sowohl Lipid als auch Protein, die
in einem System coexistieren, vor der Bestimmung von Lipid und Protein
separiert werden.
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Die
Separierung wird gewöhnlich
durch ein Extraktionsverfahren ausgeführt, in welchem die Lipidkomponente
in der Probe in einer organischen Lösungsmittelschicht aufgelöst wird
und als eine organische Lösungsmittelfraktion
wiedergewonnen wird, und die Proteinkomponente, die in dem organischen Lösungsmittel
unlöslich
ist, wird als eine wässrige Fraktion
wiedergewonnen. Die erhaltene organische Lösungsmittelfraktion wird konzentriert
und zur Trockene eingedampft, und wird quantitativ als die Lipidfraktion
bestimmt. Die wässrige
Fraktion, die das Protein enthält,
wird konzentriert und das Protein darin wird quantitativ durch verschiedene
Verfahren bestimmt.
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So
ist die herkömmliche
Bestimmung von Lipid und Protein, die in einem System coexistieren, extrem
kompliziert.
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In
herkömmlichen
Verfahren besteht trotz der komplizierten Verfahren die Tendenz,
dass das Protein in die organische Lösungsmittelschicht eindringt,
und die Tendenz, dass das Lipid in die wässrige Schicht zu einem gewissen
Teil eindringt, da die Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel
auf einer äquilibrierten
Verteilung basiert, was häufig
einen Bestimmungsfehler verursacht. Darüber hinaus ist der Verlust
der Probe im Extraktionsverfahren nicht vernachlässigbar, so dass eine relativ
große Menge
einer Probe benötigt
wird. Darüber
hinaus können
bei der Bestimmung von Lipid und Protein, die in einer Membranstruktur
enthalten sind, stark hydrophobes Protein, wie etwa Membran-Protein,
die organische Lösungsmittelfraktion
mit hoher Wahrscheinlichkeit kontaminieren, und das Lipid und das Protein
können
möglicherweise
in einem unseparierten Zustand in der organischen Schicht existieren, was
eine präzise
quantitative Bestimmung verhindert.
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Die
vorstehende Diskussion bezieht sich auf ein Zwei-Komponenten-System, das Lipid und Protein
enthält.
Die gleiche Diskussion kann in Bezug auf ein Zwei-Komponenten-System
durchgeführt
werden, das zwei Komponenten enthält, die aus Lipiden, Zuckern,
Nukleinsäuren,
Pigmenten und verschiedenen Medizinen ausgewählt sind.
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US-A-4,839,294
offenbart ein enzymfreies, nicht hydrolysierendes Assay, das zur
Bestimmung eines Lipidgehalts eines Lipid enthaltenden Fluids nützlich ist,
welches umfasst: Ausbilden eines wasserunlöslichen Komplexes eines aufgeladenen
Farbstoffes und eines entgegengesetzt aufgeladenen Detergens, Inkubieren
des Farbstoff-Detergens-Komplexes in einer wässrigen Dispersion eines lipidhaltigen
Fluids, wodurch dem lipidhaltigen Fluid eine charakteristische Farbe
verliehen wird, wobei die charakteristische Farbe ein Lichtabsorptionsvermögen zeigt,
und Messen des Lichtabsorptionsvermögens der charakteristischen
Farbe, wodurch der Lipidgehalt des Fluids ermittelt wird.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein erheblich vereinfachtes
Verfahren zum Bestimmen im wässrigen
Medium von Lipid, insbesondere ein vereinfachtes Verfahren zum Bestimmen von
amphoterem Lipid, welches sich unter wässrigen Bedingungen aneinanderlagert.
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Die
vorstehenden Aufgaben werden erreicht, indem ein Verfahren gemäß Anspruch
1 bereitgestellt wird. Eine bevorzugte Ausführungsform wird in Anspruch
2 dargestellt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Lipid bereitgestellt,
das umfasst: Herstellen einer flüssigen Probendispersion,
indem eine Probe mit einem oberflächenaktiven Mittel in einem
wässrigen
Medium behandelt wird, Umsetzen der flüssigen Probendispersion mit
einem Reagenz, das Kupfer(II)ion und Bicinchonsäure enthält, um das Kupfer(II)ion zu
Kupfer(I)ion zu reduzieren, und Messen eines gefärbten Zustandes, der durch
Komplexbildung von Bicinchonsäure
mit Kupfer(I)ion entwickelt wurde.
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Zunächst wird
das Verfahren zum Bestimmen von Lipid in der vorliegenden Erfindung
nachstehend beschrieben.
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In
beliebigen der Lipid-Bestimmungsverfahren in der vorliegenden Erfindung
wird das Lipid mit einem oberflächenaktiven
Mittel behandelt, um eine Micelle auszubilden, die aus dem Lipid
und dem oberflächenaktiven
Mittel zusammengesetzt ist, um die quantitative Bestimmung zu ermöglichen.
Zum Beispiel wird im Fall eines amphoteren Lipids, wie etwa Phospholipid,
Lipidaggregat, das in einem wässrigen
Medium gebildet wurde, mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt,
um einen Mizellzustand zu bilden, der aus dem Lipid und dem oberflächenaktiven
Mittel zusammengesetzt ist. Die geeignete Behandlung mit einem oberflächenaktiven
Mittel ist eine Ultraschallbehandlung oder eine Wasserbad-Erhitzungsbehandlung.
Eine Minute der Ultraschallbehandlung, oder Erhitzen auf ein Wasserbad bei
60°C für 10 Minuten
oder länger
ist ausreichend. Eine unbekannte Probe und eine Standardprobe sollten
auf die gleiche Weise behandelt werden.
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Durch
eine derartige Behandlung wird das Phospholipid mit einem oberflächenaktiven
Mittel in einen Mizellzustand entsprechend der Lipidkonzentration
gebracht, unabhängig
von der Form des Aggregats, wie etwa Liposom, eine planare Membran, und
eine hexagonale(II) Struktur.
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In
dem Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Lipid funktioniert
das Lipid mit einem oberflächenaktiven
Mittel in einem Mizellzustand als ein Reduktionsmittel, um Kupfer(II)ion
in Kupfer(I)ion in einem wässrigen
Medium umzuwandeln. Das resultierende Kupfer(I)ion bildet mit dem
Natriumsalz von Bicinchonsäure
(4,4'-Dicarboxy-2,2'-bichinolin) eine Komplexverbindung
mit einer purpurnen Farbe. Da diese Reaktion quantitativ voranschreitet,
kann Lipid quantitativ durch Messung des Absorptionsvermögens bestimmt
werden, das durch die Farbe der Komplexverbindung verursacht wurde.
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Das
oberflächenaktive
Mittel, das bei dieser Bestimmung nützlich ist, beinhaltet nichtionische oberflächenaktive
Mittel, und anionische oberflächenaktive
Mittel, aber diese sind nicht besonders begrenzt. Die spezifischen
Beispiele sind Triton X-100, SDS (Natriumdodecylsulfat), Briji 35,
Octylglucosid (n-Octyl-β-D-glucopyranosid),
CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat),
HECAMEG (6-O-(N-Heptylcarbamoyl)-methyl-α-D-glucopyranosid), Cholinsäure, Deoxycholinsäure und
dergleichen.
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Die
Farbreaktion des Kupfer(I)ions mit Bicinchonsäure ist zudem als ein Verfahren
zur Bestimmung von Protein bekannt, in dem die reduzierende Wirkung
von Protein verwendet wird (Anal. Biochem., 150, Seite 76 (1985)).
Dieses Verfahren basiert auf dem Prinzip, dass das Kupfer(II)ion
sich in der Gegenwart von Protein in einem alkalischen Medium in Kupfer(I)ion
umwandelt, und das resultierende Kupfer(I)ion eine purpurfarbene
Komplexverbindung mit dem Bicinchonsäuremolekül ausbildet. Die Erfinder der
vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass diese Reaktion
nicht nur auf Protein empfindlich ist, sondern auch auf Lipid, das
eine ähnliche
Reaktivität
zeigt, und die vorliegende Erfindung, basierend auf diesen Erkenntnissen,
vervollständigt.
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Nicht
alle Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Protein sind auf
die quantitative Bestimmung von Lipid anwendbar. Die vorliegende
Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass herausgefunden wurde,
dass das Verfahren zur Bestimmung von Protein durch die Verwendung
von Bicinchonsäure
auf die quantitative Bestimmung von Lipid anwendbar ist. Zum Beispiel
kann das zuvor erwähnte Lowry-Verfahren
zur Proteinbestimmung, welches die reduzierende Wirkung von Protein
verwendet, als nützlich
zur Lipidbestimmung durch die Verwendung von Lipid, das eine reduzierende
Wirkung zeigt, anstelle von Proteinen, vermutet werden. Tatsächlich jedoch
ist die Empfindlichkeit auf Lipid so gering wie ungefähr 1/100
derjenigen von Protein. Im Gegensatz dazu ist die Empfindlichkeit
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung nur geringfügig niedriger
als diejenige für
Protein, ungefähr
1/3 derjenigen von Protein, und ist so empfindlicher als herkömmliche Verfahren
zur quantitativen Lipidbestimmung. Ferner ist dieses Verfahren beim
Betrieb einfach. Daher ist das zweite Verfahren zur Bestimmung von
Lipid der vorliegenden Erfindung leicht umzusetzen, wenn als Ganzes
betrachtet.
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Bei
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine flüssige Probendispersion,
die durch Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel ausgebildet
wurde, mit einem Farbreagenz umgesetzt, das Bicinchonsäure und
Kupfer(II)ion enthält,
und das Absorptionsvermögen,
das durch die purpurne Farbe verursacht wird, die durch das Vorhandensein von
Lipid entwickelt wird, wird gemessen. Die Bicinchonsäure und
Kupfer(II)ion werden im Überschuss der
Menge für
die Reaktion des gesamten Lipids in der Probe zugegeben. Gewöhnlich beträgt die Endkonzentration
der Bicinchonsäure
ungefähr
1%, und diejenige des Kupfer(II)ions beträgt von ungefähr 0,01
bis 0,1%, und die Probendispersion wird verdünnt, um in dieser Reagenzkonzentration
gemessen zu werden. Die Reaktionsbedingung kann in geeigneter Weise
ausgewählt
werden. Zum Beispiel kann eine Erhitzungsbehandlung bei ungefähr 60°C für ungefähr eine
Stunde praktiziert werden, und auf Raumtemperatur abgekühlt werden,
und das Absorptionsvermögen
kann bei einer Wellenlänge
von z. B. 526 nm gemessen werden. Dieses Verfahren zur Bestimmung
von Lipid besitzt Vorteile, dass die Reagenzien alle auf einmal
zugegeben werden und die gefärbte
Substanz für
eine lange Zeit stabil ist, die Empfindlichkeit höher als bei
anderen Lipid-Bestimmungsverfahren ist, und das Verfahren sehr einfach ist.
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In
dem vorstehenden Verfahren zur Lipidbestimmung der vorliegenden
Erfindung wird das Lipid mit einem oberflächenaktiven Mittel in einem
wässrigen
Medium behandelt. Jedoch muss das Lipid, das bestimmt wird, ursprünglich nicht
in einem Zustand der Suspension in einem wässrigen Medium sein. Zum Beispiel,
wenn die Probe fest ist, wird die Bestimmung ermöglicht, indem die Feststoffprobe
mit einem vorgeschriebenen Volumen einer wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven
Mittels behandelt wird.
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Die
Zusammensetzung des wässrigen
Mediums zum Zusammensetzen des Reaktionssystems ist nicht besonders
begrenzt, wenn die Ionenstärke und
der pH innerhalb der Bereiche sind, in welchen die Auflösungsfähigkeit
des oberflächenaktiven
Mittels beibehalten wird. Die unbekannte Probe und die Standardprobe
sollten bei dem gleichen pH und der gleichen Ionenstärke oder
Salzkonzentration behandelt werden. In dem Verfahren zur Bestimmung
der vorliegenden Erfindung beträgt
der optimale pH-Wert zur Farbreaktion 11,25. Daher ist es unerwünscht, eine
stark saure Lösung
zu verwenden, welche den pH des Mediums erheblich zur sauren Seite
verschiebt.
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Die
vorliegende Erfindung wird nachstehend im Detail anhand von Beispielen
beschrieben.
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Referenzbeispiel 1 (außerhalb
des Umfangs der vorliegenden Erfindung)
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In
einen Rundkolben wurden 0,5 ml einer Asolektin-Lösung mit einer Konzentration
von 30 mg/ml (Sojabohnen- Phosphatidylcholin,
Typ IV-S; von Sigma Co.) in Chloroform platziert. Das Lösungsmittel
wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers abgezogen, und
dann vollständig
in einer Trocknungsvorrichtung im Vakuum entfernt, um einen dünnen Film
aus Lipid auszubilden. Hierzu wurde 1,0 ml wässrige 10 mM Kaliumchloridlösung zugegeben
und mit einem Vortex-Mischgerät
5 Minuten behandelt, um den dünnen
Lipidfilm zu dispergieren. Dann wurde dieser mit einem Ultraschalloszillator vom
Wasserbad-Typ (Sonifier Typ B-15, unter Verwendung eines Manschettenhorns,
hergestellt von Branson Co.) für
30 Minuten, um eine Liposomdispersion (15 mg/ml) zu erhalten.
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Die
so hergestellte flüssige
Liposom-Dispersion besaß eine
Teilchengrößenverteilung
in dem Bereich von 30 bis 260 nm (durchschnittlicher Teilchendurchmesser
von 190 nm) durch die Verwendung einer dynamischen, Licht streuenden
Teilchengrößen-Analysiervorrichtung
(DLS-700, Otsuka Electronics Co. LTD.).
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Diese
Liposomdispersion wurde mit wässriger
10 mM Kaliumchloridlösung,
die 1 Gew.-% Octylglucosid (n-Octyl-β-D-glucosid;
hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) enthielt, auf
verschiedene Konzentrationen verdünnt und die verdünnte Dispersion
wurde mit einem Ultraschall-Oszillator vom Wasserbadtyp für eine Minute
behandelt, um Phospholipid-Standards in einem Konzentrationsbereich
von 0 bis 1,5 mg/ml zu erhalten.
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Die
Standard-Phospholipid-Flüssigkeit
wurde in eine Quarzzelle mit einem optischen Weg von 1 cm gestellt,
und das Absorptionsvermögen
wurde bei 240 nm mittels eines Spektrofotometers (UV-VIS-NIR Aufzeichnungs-Spektrometer UV
3100S, Shimadzu Corporation) gemessen. Die Werte des Absorptionsvermögens wurde
als eine Funktion der Phospholipidkonzentration unter Verwendung
als eine Referenz des Absorptionsvermögens von wässriger 10 mM Kaliumchloridlösung, die
1% Octylglucosid enthielt, aufgezeichnet. So wurde eine gerade Linie,
die durch den Ursprung trat, erhalten. Aus dem Gradienten der Linie
ergab sich die folgende Relation zwischen der Phospholipidkonzentration
und dem Absorptionsvermögen: (Absorptionsvermögen) = 0,400 × (Phospholipid-Konzentration,
mg/ml).
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Demgemäß kann die
Menge an Phospholipid in einer unbekannten Probe ermittelt werden,
indem die unbekannte Probe auf die vorstehend beschriebene Weise
behandelt wird, das Absorptionsvermögen gemessen wird, und mit
der vorstehenden Gleichung berechnet wird.
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Referenzbeispiel 2 (außerhalb
des Umfangs der vorliegenden Erfindung)
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Eine
flüssige
Liposom-Dispersion wurde auf die gleiche Wiese wie in Referenzbeispiel
1 hergestellt. Die Dispersion wurde durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff
eingefroren, durch Stehenlassen bei Raumtemperatur aufgetaut, dann
wurde diese einer Ultraschallbehandlung für eine Minute unterzogen. Dieses
Auffrier- und Tauverfahren wurde sechsmal ausgeführt, wodurch eine Liposom-Flüssigkeitsdispersion
mit relativ großem
Teilchendurchmesser hergestellt werden konnte. Die Teilchendurchmesserverteilung
war in dem Bereich von 130 bis 520 nm (durchschnittlicher Teilchendurchmesser:
280 nm), wobei auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 mittels einer
dynamischen, Licht streuenden Teilchengrößen-Analysiervorrichtung gemessen
wurde.
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Die
so hergestellte Liposom-Dispersion wurde mit wässriger 10 mM Kaliumchloridlösung, die
1 Gew.-% Octylglucosid enthielt, auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel
1 verdünnt,
die verdünnte Dispersion
wurde mit einem Ultraschall-Oszillator vom Wasserbad-Typ für eine Minute
auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1, behandelt, um Phospholipid-Standards
in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 1,5 mg/ml zu erhalten.
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Das
Absorptionsvermögen
des Standard-Phospholipids wurde bei 240 nm gemessen. Die Absorptionswerte
wurden als eine Funktion der Phospholipid-Konzentration durch Verwendung
als Referenz des Absorptionsvermögens
von wässriger 10
mM Kaliumchloridlösung,
die 1% Octylglucosid enthielt, aufgezeichnet. So wurde eine gerade
Linie, die durch den Ursprung trat, erhalten. Aus der Steigung der
Linie wurde der folgende Zusammenhang zwischen der Phospholipid-Konzentration und
dem Absorptionsvermögen
erhalten: (Absorptionsvermögen) = 0,400 × (Phospholipid-Konzentration,
mg/ml)
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Demgemäß kann die
Menge an Phospholipid in einer unbekannten Probe bestimmt werden,
indem die unbekannte Probe auf die gleiche Weise, wie vorstehend,
behandelt wird, das Absorptionsvermögen gemessen wird, und mit
der vorstehenden Gleichung berechnet wird.
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Beispiel 3
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Eine
Phospholipid-Standardflüssigkeit
wurde in dem Konzentrationsbereich von 0 bis 50 μg/ml auf die gleiche Weise wie
in Referenzbeispiel 1 hergestellt.
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Zu
jeweils 0,5 ml der Phospholipid-Standardlösungen wurde eine gleiche Menge
an BCA-Farb-Entwicklungslösung
(Micro BCA Protein Assay Reagent Kit, gekauft von Pierce) zugegeben und
vermischt, und bei 60°C
eine Stunde erhitzt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Das
Absorptionsvermögen
wurde bei 562 nm mit einer Zelle gemessen, die einen optischen Weg
von 1 cm besaß.
Aus dem gemessenen Absorptionsvermögen wurde das Absorptionsvermögen der
Kontrolle, die kein Liposom enthielt, abgezogen. Das resultierende
Absorptionsvermögen
wurde aufgezeichnet, wobei das Absorptionsvermögen auf der Ordinate und die
Liposom-Konzentration auf der Abszisse aufgetragen wurde. Die Werte
liegen auf einer Linie, die den Ursprung schneidet, wobei die Steigung
der Linie 3,89 × 10–2 beträgt.
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Demgemäß kann die
Menge an Lipid (X μg/ml)
in einer unbekannten Probe bestimmt werden, indem die unbekannte
Probe auf die vorstehende Weise behandelt wird, das Absorptionsvermögen (Y) gemessen
wird, und mit der folgenden Relation berechnet wird: Y
= 3,89 × 10–2X.
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Die
vorliegende Erfindung vereinfacht die Bestimmung von Phospholipid,
welche herkömmlicherweise
mit einem erheblichen Arbeitsaufwand ausgeführt wird, in besonderem Maße. Insbesondere stellt
die vorliegende Erfindung ein extrem vereinfachtes Verfahren zur
quantitativen Bestimmung von Lipid in einer Probe von Lipid-Aggregat
bereit, welches bei der Untersuchung von Biomembran, die Lipid enthält, und
bei der Bestätigung
der Zusammensetzung einer Lipid enthaltenden Membran, die künstlich
synthetisiert wurde, erfüllt
wird.
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Lipid
wird quantitativ bestimmt, indem eine Probe mit einem oberflächenaktiven
Mittel in einem wässrigen
Medium behandelt wird, um eine flüssige Probendispersion zu erhalten,
dann die Dispersion mit einem Reagenz, das Kupfer(II)ion und Bicinchonsäure enthält, umgesetzt
wird, um das Kupfer(II)ion zu Kupfer(I)ion zu reduzieren; und Messen
des gefärbten
Zustandes, das durch Komplexbildung von Bicinchonsäure mit
Kupfer(I)ion entwickelt wurde. Dieses Verfahren kann effektiv auf
die Bestimmung von amphoterem Lipid, das die Tendenz des Zusammenlagerns
in einem wässrigen
Medium besitzt, angewendet werden.