JP2959596B2 - ２種の化合物の共存系における定量法 - Google Patents
２種の化合物の共存系における定量法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、脂質と蛋白質の共存系
のような２成分系の各成分を、それぞれの成分を分離す
ることなく共存状態のままで簡便に定量分析できる定量
法に関する。
のような２成分系の各成分を、それぞれの成分を分離す
ることなく共存状態のままで簡便に定量分析できる定量
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体の種々の構成単位についての研究や
生体由来の各種物質の機能の研究やその応用についての
検討などにおいて、脂質、蛋白質、核酸、糖類などは互
いに共存した状態で取り扱われことが多い物質であり、
共存状態にあるこれらの物質を定量することはこれらの
研究において重要な作業の１つである。
生体由来の各種物質の機能の研究やその応用についての
検討などにおいて、脂質、蛋白質、核酸、糖類などは互
いに共存した状態で取り扱われことが多い物質であり、
共存状態にあるこれらの物質を定量することはこれらの
研究において重要な作業の１つである。
【０００３】例えば、生体膜は主に脂質分子により形成
された二重層膜であり、そこに蛋白質が非共有結合によ
って集合した構造体を形成して、それぞれの内部環境を
保つ障壁として働いている。生体膜の脂質と蛋白質の割
合はそれぞれの膜で大きく異なり、例えば、ミトコンド
リアでは蛋白質が脂質の４倍、逆に、脂質の方が蛋白質
の数倍もあるような生体膜も存在する。従って、それぞ
れの器官によって生体膜の脂質と蛋白質の比を知ること
は重要な課題である。
された二重層膜であり、そこに蛋白質が非共有結合によ
って集合した構造体を形成して、それぞれの内部環境を
保つ障壁として働いている。生体膜の脂質と蛋白質の割
合はそれぞれの膜で大きく異なり、例えば、ミトコンド
リアでは蛋白質が脂質の４倍、逆に、脂質の方が蛋白質
の数倍もあるような生体膜も存在する。従って、それぞ
れの器官によって生体膜の脂質と蛋白質の比を知ること
は重要な課題である。
【０００４】また、脂質と蛋白質を共存させた種々の生
体膜モデルが生体膜の構造と機能を研究する目的で広く
利用されている。そのような目的に用いるものとして、
例えば、人工的に作製された脂質２分子膜からなる閉鎖
小胞（リポソ−ム）の膜内に蛋白質を含有させたプロテ
オリポソーム；ガラスビーズや高分子微粒子の表面に脂
質と蛋白質を吸着させた被覆微粒子；テフロン等の基板
に設けた小孔内に形成した平面脂質膜（黒膜）や、はり
合せ法、パッチピペット法等によって再構成した平面２
分子膜に蛋白質を組み込んだもの；基板上に脂質と蛋白
質の共存系を分子レベルでの層状に累積するラングミュ
ア・ブロジェット累積膜（ＬＢ累積膜）等をあげること
ができる。これらの人工的に形成される各種の膜構造に
おいても、脂質と蛋白質の量を定量することはその機能
を評価する上で重要である。
体膜モデルが生体膜の構造と機能を研究する目的で広く
利用されている。そのような目的に用いるものとして、
例えば、人工的に作製された脂質２分子膜からなる閉鎖
小胞（リポソ−ム）の膜内に蛋白質を含有させたプロテ
オリポソーム；ガラスビーズや高分子微粒子の表面に脂
質と蛋白質を吸着させた被覆微粒子；テフロン等の基板
に設けた小孔内に形成した平面脂質膜（黒膜）や、はり
合せ法、パッチピペット法等によって再構成した平面２
分子膜に蛋白質を組み込んだもの；基板上に脂質と蛋白
質の共存系を分子レベルでの層状に累積するラングミュ
ア・ブロジェット累積膜（ＬＢ累積膜）等をあげること
ができる。これらの人工的に形成される各種の膜構造に
おいても、脂質と蛋白質の量を定量することはその機能
を評価する上で重要である。
【０００５】また、天然の膜構造、あるいは人工的に合
成した膜構造の定量分析結果をもとに、最適脂質／蛋白
質比を求め、その比率にしたがって効率よく膜構造を合
成できれば、貴重な蛋白質を浪費することなく、しか
も、工業的に低コストで各種膜構造を合成できる。
成した膜構造の定量分析結果をもとに、最適脂質／蛋白
質比を求め、その比率にしたがって効率よく膜構造を合
成できれば、貴重な蛋白質を浪費することなく、しか
も、工業的に低コストで各種膜構造を合成できる。
【０００６】なお、脂質と蛋白質の共存系としては、上
述の膜構造以外にも、脂質膜からなる閉鎖小胞であるリ
ポソームの内部に酵素等の機能性蛋白質を内包させたも
の、単に液媒体中に脂質と蛋白質が混在するエマルジョ
ン等の種々の混在系もある。脂質、なかでも生体内にお
いて重要な役割を有するリン脂質の定量方法としては、
リン脂質を分解して生じる無機リンをリン酸の形で定量
する方法、酵素を用いる方法、及び紫外光での吸収強度
を測定する方法等が知られている。
述の膜構造以外にも、脂質膜からなる閉鎖小胞であるリ
ポソームの内部に酵素等の機能性蛋白質を内包させたも
の、単に液媒体中に脂質と蛋白質が混在するエマルジョ
ン等の種々の混在系もある。脂質、なかでも生体内にお
いて重要な役割を有するリン脂質の定量方法としては、
リン脂質を分解して生じる無機リンをリン酸の形で定量
する方法、酵素を用いる方法、及び紫外光での吸収強度
を測定する方法等が知られている。
【０００７】無機リンを生じさせてリン酸として定量す
る方法には、抽出法あるいは沈殿法によりリン脂質を分
離した後、湿式灰化し、生じたリン酸を定量してリン脂
質質量を求める方法や、トリクロロ酢酸でリン脂質を分
離し、硫酸および過マンガン酸塩を加えて沸騰水溶中で
加熱し有機物の大部分を酸化分解し、生じた無機リン酸
にモリブデン酸アンモニウム及び還元剤を加えて呈色し
た青色を測定する方法がある。
る方法には、抽出法あるいは沈殿法によりリン脂質を分
離した後、湿式灰化し、生じたリン酸を定量してリン脂
質質量を求める方法や、トリクロロ酢酸でリン脂質を分
離し、硫酸および過マンガン酸塩を加えて沸騰水溶中で
加熱し有機物の大部分を酸化分解し、生じた無機リン酸
にモリブデン酸アンモニウム及び還元剤を加えて呈色し
た青色を測定する方法がある。
【０００８】酵素を用いた方法では、試料中のリン脂質
にホスホリパーゼＤを作用させてコリンを遊離させ、遊
離したコリンをコリンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ
共存下でフェノールと４−アミノアンチピリンによる呈
色反応を利用し比色定量し、リン脂質含量を求める方法
がある。また、遊離したコリンをコリンオキシダーゼと
反応させた後、３、５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−アニリンと
４−アミノアンチピリンを発色剤とした定量法もある。
にホスホリパーゼＤを作用させてコリンを遊離させ、遊
離したコリンをコリンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ
共存下でフェノールと４−アミノアンチピリンによる呈
色反応を利用し比色定量し、リン脂質含量を求める方法
がある。また、遊離したコリンをコリンオキシダーゼと
反応させた後、３、５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−アニリンと
４−アミノアンチピリンを発色剤とした定量法もある。
【０００９】一方、蛋白質の定量法としては、金属イオ
ンを利用した呈色法とチロシン、トリプトファンに基づ
く光吸収、或は、ペプチド結合による光吸収を測定する
ＵＶ法がある。呈色法の代表的なものとして、Ｌｏｗｒ
ｙ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｉｍ．，ｖｏｌ．１９３，ｐ
２６５，（１９５１））などのフェノール試薬を用いる
方法がある。この方法は、フェノール類と蛋白質が反応
して青色を示すのが特徴であって、試薬の主な成分はリ
ンモリブデン酸とリンタングステン酸である。これらの
金属の酸化物がリン酸と複雑な錯化合物を形成して、リ
ンモリブデン酸、或は、リンタングステン酸となる。こ
の混合物が蛋白質等の還元剤と反応して、リンモリブデ
ンブルー、或は、リンタングステンブルーの青色を呈す
る。この吸光度を測定して蛋白質が定量される。ＢＣＡ
法と呼ばれる呈色反応は、２価の銅イオンがアルカリ性
で蛋白質の存在により１価の銅イオンとなり、これがビ
シコニン酸（ＢＣＡ、４、４´−ジカルボキシ−２、２
´−ビキノリン）分子と紫紅色の錯化合物を形成する。
この錯化合物の吸収強度を基に蛋白質を定量する。
ンを利用した呈色法とチロシン、トリプトファンに基づ
く光吸収、或は、ペプチド結合による光吸収を測定する
ＵＶ法がある。呈色法の代表的なものとして、Ｌｏｗｒ
ｙ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｉｍ．，ｖｏｌ．１９３，ｐ
２６５，（１９５１））などのフェノール試薬を用いる
方法がある。この方法は、フェノール類と蛋白質が反応
して青色を示すのが特徴であって、試薬の主な成分はリ
ンモリブデン酸とリンタングステン酸である。これらの
金属の酸化物がリン酸と複雑な錯化合物を形成して、リ
ンモリブデン酸、或は、リンタングステン酸となる。こ
の混合物が蛋白質等の還元剤と反応して、リンモリブデ
ンブルー、或は、リンタングステンブルーの青色を呈す
る。この吸光度を測定して蛋白質が定量される。ＢＣＡ
法と呼ばれる呈色反応は、２価の銅イオンがアルカリ性
で蛋白質の存在により１価の銅イオンとなり、これがビ
シコニン酸（ＢＣＡ、４、４´−ジカルボキシ−２、２
´−ビキノリン）分子と紫紅色の錯化合物を形成する。
この錯化合物の吸収強度を基に蛋白質を定量する。
【００１０】これに対して、ＵＶ法では、チロシン、ト
リプトファンに基づく２８０ｎｍの吸収を測定し、定量
する場合とペプチド結合による２１５−２２５ｎｍの吸
収を測定する方法がある。いずれの方法も呈色法に比べ
ると、操作が簡単で、しかも、試料の損失がないという
利点があるものの、チロシン、トリプトファンの含量に
依存した蛋白量が測定されるために、蛋白質間の変動が
大きいという欠点を持つ。更に、この領域に吸収を持つ
核酸等の妨害物質の影響を受やすい。
リプトファンに基づく２８０ｎｍの吸収を測定し、定量
する場合とペプチド結合による２１５−２２５ｎｍの吸
収を測定する方法がある。いずれの方法も呈色法に比べ
ると、操作が簡単で、しかも、試料の損失がないという
利点があるものの、チロシン、トリプトファンの含量に
依存した蛋白量が測定されるために、蛋白質間の変動が
大きいという欠点を持つ。更に、この領域に吸収を持つ
核酸等の妨害物質の影響を受やすい。
【００１１】
【本発明が解決しようとする課題】従来においては、脂
質と蛋白質が共存する系におけるこれらのそれぞれの量
を定量する場合、脂質の定量法において蛋白質の存在
が、また蛋白質の定量法において脂質の存在が定量結果
に影響をおよぼすために、正確な定量分析が行なえない
ので、脂質と蛋白質とを分離してからそれぞれの定量法
によって分析するという手法が用いられてきた。
質と蛋白質が共存する系におけるこれらのそれぞれの量
を定量する場合、脂質の定量法において蛋白質の存在
が、また蛋白質の定量法において脂質の存在が定量結果
に影響をおよぼすために、正確な定量分析が行なえない
ので、脂質と蛋白質とを分離してからそれぞれの定量法
によって分析するという手法が用いられてきた。
【００１２】実際に、蛋白質の定量法として良く知られ
た方法は、脂質も反応し、発色してしまう。例えば、Ｌ
ｏｗｒｙ法に代表されるフェノール試薬を用いる定量法
では蛋白質によりリンモリブデン酸が還元されてリンモ
リブデンブルーの青色を呈する。そのため、蛋白質と同
様に還元作用を有する脂質対しても同様の発色が生じ
る。また、吸光度の測定によって脂質を定量する方法で
は、蛋白質に由来する吸光度の寄与も無視できない。
た方法は、脂質も反応し、発色してしまう。例えば、Ｌ
ｏｗｒｙ法に代表されるフェノール試薬を用いる定量法
では蛋白質によりリンモリブデン酸が還元されてリンモ
リブデンブルーの青色を呈する。そのため、蛋白質と同
様に還元作用を有する脂質対しても同様の発色が生じ
る。また、吸光度の測定によって脂質を定量する方法で
は、蛋白質に由来する吸光度の寄与も無視できない。
【００１３】さらに、脂質と蛋白質を分離してからそれ
ぞれを定量分析にかける場合、２つの定量分析に十分な
量の分析用の試料を準備する必要があり、単一の系の場
合の２倍の試料量が必要になる。
ぞれを定量分析にかける場合、２つの定量分析に十分な
量の分析用の試料を準備する必要があり、単一の系の場
合の２倍の試料量が必要になる。
【００１４】脂質と蛋白質を分離する方法としては、通
常、抽出法によって試料の脂質成分を有機溶媒層に溶解
させ有機溶媒画分とし、蛋白質成分は有機溶媒に不溶な
水性画分として回収する操作が利用されている。そし
て、分取した有機溶媒画分を濃縮乾固して脂質画分とし
て定量する。また、蛋白質を含む水性画分も濃縮し、種
々の方法で蛋白定量することになる。
常、抽出法によって試料の脂質成分を有機溶媒層に溶解
させ有機溶媒画分とし、蛋白質成分は有機溶媒に不溶な
水性画分として回収する操作が利用されている。そし
て、分取した有機溶媒画分を濃縮乾固して脂質画分とし
て定量する。また、蛋白質を含む水性画分も濃縮し、種
々の方法で蛋白定量することになる。
【００１５】このように、脂質と蛋白質とが混在する系
におけるこれらの定量は、極めて煩雑な作業を必要とす
るものであった。
におけるこれらの定量は、極めて煩雑な作業を必要とす
るものであった。
【００１６】更に、従来の方法においては、このような
煩雑な操作を行なうにもかかわらず、有機溶媒での抽出
はあくまで平衡分配であるため、有機溶媒層に蛋白質
が、水層にも、ある割合で脂質が混入し易く、誤差を生
じる場合も多い。その上、抽出処理工程における試料の
ロスも無視できず、比較的多量の試料が要求される。ま
た、脂質と蛋白質を含む膜構造における脂質と蛋白質の
定量において上記の抽出工程を行なうと、膜蛋白質のよ
うな、疎水性の強い蛋白質の場合には、有機溶媒画分中
に混入する可能性も高く、しかも脂質と蛋白質が不分離
のまま有機層に存在する可能性もあり、このような場合
には正確な定量分析が不可能となる。
煩雑な操作を行なうにもかかわらず、有機溶媒での抽出
はあくまで平衡分配であるため、有機溶媒層に蛋白質
が、水層にも、ある割合で脂質が混入し易く、誤差を生
じる場合も多い。その上、抽出処理工程における試料の
ロスも無視できず、比較的多量の試料が要求される。ま
た、脂質と蛋白質を含む膜構造における脂質と蛋白質の
定量において上記の抽出工程を行なうと、膜蛋白質のよ
うな、疎水性の強い蛋白質の場合には、有機溶媒画分中
に混入する可能性も高く、しかも脂質と蛋白質が不分離
のまま有機層に存在する可能性もあり、このような場合
には正確な定量分析が不可能となる。
【００１７】以上、脂質と蛋白質の２成分系について述
べたが、脂質、糖、核酸、色素及び各種薬剤から選択し
た２成分系についても同様のことがいえる。本発明は上
述の２成分系における各成分の定量における問題点に鑑
みなされたものであり、２成分を分離することなく２成
分系における各成分の定量を２成分が共存している状態
で分析できる、簡便な定量方法を提供することをその目
的とする。
べたが、脂質、糖、核酸、色素及び各種薬剤から選択し
た２成分系についても同様のことがいえる。本発明は上
述の２成分系における各成分の定量における問題点に鑑
みなされたものであり、２成分を分離することなく２成
分系における各成分の定量を２成分が共存している状態
で分析できる、簡便な定量方法を提供することをその目
的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明の定量法は、液媒
体中に化合物Ａ、Ｂを含む未知試料を定量法ａで分析し
て分析値Ｖａを得る過程と、該未知試料を定量法ｂで分
析して分析値Ｖｂを得る過程と、下記式（Ｉ）及び（I
I）から化合物Ａ、Ｂのそれぞれの実際の濃度（ｘ、
ｙ）を求める過程 Ｖａ＝ｘ・ａ1＋ｙ・ａ2 ・・・（Ｉ） Ｖｂ＝ｘ・ｂ1＋ｙ・ｂ2 ・・・（II） ａ1：液媒体中に化合物Ａが単独で存在する場合の定量
法ａにおける濃度定数 ａ2：液媒体中に化合物Ｂが単独で存在する場合の定量
法ａにおける濃度定数 ｂ1：液媒体中に化合物Ａが単独で存在する場合の定量
法ｂにおける濃度定数 ｂ2：液媒体中に化合物Ｂが単独で存在する場合の定量
法ｂにおける濃度定数 ｘ：未知試料中の化合物Ａの実際の濃度 ｙ：未知試料中の化合物Ｂの実際の濃度 とを有することを特徴とする。
体中に化合物Ａ、Ｂを含む未知試料を定量法ａで分析し
て分析値Ｖａを得る過程と、該未知試料を定量法ｂで分
析して分析値Ｖｂを得る過程と、下記式（Ｉ）及び（I
I）から化合物Ａ、Ｂのそれぞれの実際の濃度（ｘ、
ｙ）を求める過程 Ｖａ＝ｘ・ａ1＋ｙ・ａ2 ・・・（Ｉ） Ｖｂ＝ｘ・ｂ1＋ｙ・ｂ2 ・・・（II） ａ1：液媒体中に化合物Ａが単独で存在する場合の定量
法ａにおける濃度定数 ａ2：液媒体中に化合物Ｂが単独で存在する場合の定量
法ａにおける濃度定数 ｂ1：液媒体中に化合物Ａが単独で存在する場合の定量
法ｂにおける濃度定数 ｂ2：液媒体中に化合物Ｂが単独で存在する場合の定量
法ｂにおける濃度定数 ｘ：未知試料中の化合物Ａの実際の濃度 ｙ：未知試料中の化合物Ｂの実際の濃度 とを有することを特徴とする。
【００１９】化合物Ａ、Ｂの組合せとしては、脂質と蛋
白質の組合の他、脂質、糖、核酸、色素及び各種薬剤か
ら選択した２成分系など一方の定量法における結果に他
方が影響するような組合せを挙げることができる。な
お、本発明の方法においては、定量法ａ、ｂの少なくと
も一方に、例えば、化合物自体の吸光度を測定する方法
などのような試料を反応によって破壊しない方法を利用
することで、未知試料のサンプリング量を最小減に抑え
ることができる。
白質の組合の他、脂質、糖、核酸、色素及び各種薬剤か
ら選択した２成分系など一方の定量法における結果に他
方が影響するような組合せを挙げることができる。な
お、本発明の方法においては、定量法ａ、ｂの少なくと
も一方に、例えば、化合物自体の吸光度を測定する方法
などのような試料を反応によって破壊しない方法を利用
することで、未知試料のサンプリング量を最小減に抑え
ることができる。
【００２０】以下、化合物Ａが脂質、化合物Ｂが蛋白質
である場合を具体例として本発明の方法を詳細に説明す
る。
である場合を具体例として本発明の方法を詳細に説明す
る。
【００２１】先ず、脂質定量用に選択した定量法ａによ
って、脂質が単独で存在する場合の検量線（一次関数）
を作成し、その傾き（濃度定数ａ1 ）を求める。ここ
で、脂質の濃度をＬａ、定量法ａによる測定値をＶＬａ
とすると、 ＶＬａ＝Ｌａ・ａ1 ・・・ （III ） の関係が成立する。
って、脂質が単独で存在する場合の検量線（一次関数）
を作成し、その傾き（濃度定数ａ1 ）を求める。ここ
で、脂質の濃度をＬａ、定量法ａによる測定値をＶＬａ
とすると、 ＶＬａ＝Ｌａ・ａ1 ・・・ （III ） の関係が成立する。
【００２２】次に、蛋白質が単独で存在する場合に定量
法ａで分析したときの検量線（一次関数）を作成し、そ
の傾き（濃度定数ａ2 ）を求める。ここで、蛋白質の濃
度をＰａ、定量法ａによる測定値をＶＰａとすると、 ＶＰａ＝Ｐａ・ａ2 ・・・ （IV） の関係が成立する。
法ａで分析したときの検量線（一次関数）を作成し、そ
の傾き（濃度定数ａ2 ）を求める。ここで、蛋白質の濃
度をＰａ、定量法ａによる測定値をＶＰａとすると、 ＶＰａ＝Ｐａ・ａ2 ・・・ （IV） の関係が成立する。
【００２３】次に、脂質と蛋白質を共に含む未知試料を
検量線を作成したときと同じ条件で定量法ａで分析し、
分析値Ｖａを求める。ここで、未知試料中には脂質と蛋
白質が共に含まれるのでこのＶａは蛋白質の存在に影響
された見かけの脂質濃度に対応するものとなる。そこ
で、未知試料中の脂質の実際の濃度をｘ、蛋白質の実際
の濃度をｙとすると、上記式（III ）及び（IV）から Ｖａ＝ｘ・ａ1 ＋ｙ・ａ2 ・・・ （Ｖ） となる。
検量線を作成したときと同じ条件で定量法ａで分析し、
分析値Ｖａを求める。ここで、未知試料中には脂質と蛋
白質が共に含まれるのでこのＶａは蛋白質の存在に影響
された見かけの脂質濃度に対応するものとなる。そこ
で、未知試料中の脂質の実際の濃度をｘ、蛋白質の実際
の濃度をｙとすると、上記式（III ）及び（IV）から Ｖａ＝ｘ・ａ1 ＋ｙ・ａ2 ・・・ （Ｖ） となる。
【００２４】更に、蛋白質定量用に選択した定量法ｂに
よって、脂質が単独で存在する場合の検量線（一次関
数）を作成し、その傾き（濃度定数ｂ1 ）を求める。こ
こで、脂質の濃度をＬｂ、定量法ｂによる測定値をＶＬ
ｂとすると、 ＶＬｂ＝Ｌｂ・ｂ1 ・・・ （VI） の関係が成立する。
よって、脂質が単独で存在する場合の検量線（一次関
数）を作成し、その傾き（濃度定数ｂ1 ）を求める。こ
こで、脂質の濃度をＬｂ、定量法ｂによる測定値をＶＬ
ｂとすると、 ＶＬｂ＝Ｌｂ・ｂ1 ・・・ （VI） の関係が成立する。
【００２５】また、蛋白質が単独で存在する場合に定量
法ｂで分析したときの検量線（一次関数）を作成し、そ
の傾き（濃度定数ｂ2 ）を求める。ここで、蛋白質の濃
度をＰｂ、定量法ｂによる測定値をＶＰｂとすると、 ＶＰｂ＝Ｐｂ・ｂ2 ・・・ （VII ） の関係が成立する。
法ｂで分析したときの検量線（一次関数）を作成し、そ
の傾き（濃度定数ｂ2 ）を求める。ここで、蛋白質の濃
度をＰｂ、定量法ｂによる測定値をＶＰｂとすると、 ＶＰｂ＝Ｐｂ・ｂ2 ・・・ （VII ） の関係が成立する。
【００２６】次に、脂質と蛋白質を共に含む未知試料を
検量線を作成したときと同じ条件で定量法ｂで分析し、
分析値Ｖｂを求める。ここで、未知試料中には脂質と蛋
白質が共に含まれるのでＶｂは脂質の存在に影響された
見かけの蛋白質濃度に対応したものとなる。
検量線を作成したときと同じ条件で定量法ｂで分析し、
分析値Ｖｂを求める。ここで、未知試料中には脂質と蛋
白質が共に含まれるのでＶｂは脂質の存在に影響された
見かけの蛋白質濃度に対応したものとなる。
【００２７】そこで、定量法ａにおけるのと同様に、未
知試料中の脂質の実際の濃度をｘ、蛋白質の実際の濃度
をｙとすると、上記式VIおよびVII から Ｖｂ＝ｘ・ｂ1 ＋ｙ・ｂ2 ・・・ （VIII） となる。
知試料中の脂質の実際の濃度をｘ、蛋白質の実際の濃度
をｙとすると、上記式VIおよびVII から Ｖｂ＝ｘ・ｂ1 ＋ｙ・ｂ2 ・・・ （VIII） となる。
【００２８】上記式Ｖ及びVIIIにおいて、各濃度定数は
予め求めてあるので、未知試料を直接分析した際の分析
値をそれぞれ当てはめて、上記式Ｖ及びVIIIの連立２元
一次方程式を解くことで、実際の脂質の濃度及び蛋白質
の濃度を求めることが可能となる。
予め求めてあるので、未知試料を直接分析した際の分析
値をそれぞれ当てはめて、上記式Ｖ及びVIIIの連立２元
一次方程式を解くことで、実際の脂質の濃度及び蛋白質
の濃度を求めることが可能となる。
【００２９】なお、脂質及び蛋白質のどちらかの量が他
の量よりも極めて少なく、用いた定量法において実質的
に無視できる場合には、見かけの濃度を実際の濃度とみ
なして計算することができる。定量法として吸光度の測
定を利用する方法を用いた場合の本発明の脂質及び蛋白
質の混合系の定量法の１態様としては、 液体サンプル中に存在する脂質及び蛋白質の各々を該液
体サンプルから分離することなく定量する方法であっ
て、 （ｉ）脂質について、濃度が既知であって且つ異なる濃
度を有する第１の液体標準サンプル群を用意し、該第１
の液体標準サンプル群の各々のサンプルの吸光度を、第
１の方法（ａ）を用いて測定し、脂質の標準液体サンプ
ル群の濃度と吸光度の相関を求め、脂質の吸光度係数
（ａ1）を算出する工程； （ii）蛋白質について、濃度が既知であって且つ異なる
濃度を有する第１の液体標準サンプル群を用意し、該第
１の液体標準サンプル群の各々のサンプルの吸光度を、
第１の方法（ａ）を用いて測定し、蛋白質の標準液体サ
ンプル群の濃度と吸光度の相関を求め、蛋白質の吸光度
係数（ａ2）を算出する工程； （iii）脂質について、濃度が既知であって且つ異なる
濃度を有する第２の標準液体サンプル群を用意し、該第
２の液体サンプル群の各々の吸光度を第２の方法（ｂ）
を用いて測定し、脂質の標準液体サンプル群の濃度と吸
光度の相関を求め、脂質の吸光度係数（ｂ1）を算出す
る工程； （iv）蛋白質について、濃度が既知であって且つ異なる
濃度を有する第２の標準液体サンプル群を用意し、該第
２の液体サンプル群の各々の吸光度を第２の方法（ｂ）
を用いて測定し、蛋白質の標準液体サンプル群の濃度と
吸光度の相関を求め、蛋白質の吸光度係数（ｂ2）を算
出する工程；及び （ｖ）脂質及び蛋白質が各々未知の濃度（ｘ、ｙ）にて
共存している液体サンプルを用意し、該第１及び第２の
各々の方法（ａ）及び（ｂ）を用いて該液体サンプルの
吸光度（Ｖａ）及び（Ｖｂ）を測定し、こうして得た値
を下記（Ｉ）及び（II）に示す方程式に代入して該サン
プル中の脂質及び蛋白質の濃度（ｘ、ｙ）を求める工
程、を有し、 Ｖａ＝ｘ・ａ1＋ｙ・ａ2 ・・・（Ｉ） Ｖｂ＝ｘ・ｂ1＋ｙ・ｂ2 ・・・（II） 該第１の方法（ａ）及び該第２の方法（ｂ）は互いに異
なる方法であり、該第１の方法（ａ）及び第２の方法
（ｂ）の少なくとも一方は、脂質、蛋白質、または脂質
及び蛋白質と、試薬との反応によって呈色させる工程を
含むものであり、更に、該第１の方法（ａ）及び第２の
方法（ｂ）は、サンプル中に脂質のみ、もしくは蛋白質
のみが存在している場合には該サンプル中の脂質または
蛋白質の定量が可能な方法であることを特徴とする定量
法を挙げることができる。
の量よりも極めて少なく、用いた定量法において実質的
に無視できる場合には、見かけの濃度を実際の濃度とみ
なして計算することができる。定量法として吸光度の測
定を利用する方法を用いた場合の本発明の脂質及び蛋白
質の混合系の定量法の１態様としては、 液体サンプル中に存在する脂質及び蛋白質の各々を該液
体サンプルから分離することなく定量する方法であっ
て、 （ｉ）脂質について、濃度が既知であって且つ異なる濃
度を有する第１の液体標準サンプル群を用意し、該第１
の液体標準サンプル群の各々のサンプルの吸光度を、第
１の方法（ａ）を用いて測定し、脂質の標準液体サンプ
ル群の濃度と吸光度の相関を求め、脂質の吸光度係数
（ａ1）を算出する工程； （ii）蛋白質について、濃度が既知であって且つ異なる
濃度を有する第１の液体標準サンプル群を用意し、該第
１の液体標準サンプル群の各々のサンプルの吸光度を、
第１の方法（ａ）を用いて測定し、蛋白質の標準液体サ
ンプル群の濃度と吸光度の相関を求め、蛋白質の吸光度
係数（ａ2）を算出する工程； （iii）脂質について、濃度が既知であって且つ異なる
濃度を有する第２の標準液体サンプル群を用意し、該第
２の液体サンプル群の各々の吸光度を第２の方法（ｂ）
を用いて測定し、脂質の標準液体サンプル群の濃度と吸
光度の相関を求め、脂質の吸光度係数（ｂ1）を算出す
る工程； （iv）蛋白質について、濃度が既知であって且つ異なる
濃度を有する第２の標準液体サンプル群を用意し、該第
２の液体サンプル群の各々の吸光度を第２の方法（ｂ）
を用いて測定し、蛋白質の標準液体サンプル群の濃度と
吸光度の相関を求め、蛋白質の吸光度係数（ｂ2）を算
出する工程；及び （ｖ）脂質及び蛋白質が各々未知の濃度（ｘ、ｙ）にて
共存している液体サンプルを用意し、該第１及び第２の
各々の方法（ａ）及び（ｂ）を用いて該液体サンプルの
吸光度（Ｖａ）及び（Ｖｂ）を測定し、こうして得た値
を下記（Ｉ）及び（II）に示す方程式に代入して該サン
プル中の脂質及び蛋白質の濃度（ｘ、ｙ）を求める工
程、を有し、 Ｖａ＝ｘ・ａ1＋ｙ・ａ2 ・・・（Ｉ） Ｖｂ＝ｘ・ｂ1＋ｙ・ｂ2 ・・・（II） 該第１の方法（ａ）及び該第２の方法（ｂ）は互いに異
なる方法であり、該第１の方法（ａ）及び第２の方法
（ｂ）の少なくとも一方は、脂質、蛋白質、または脂質
及び蛋白質と、試薬との反応によって呈色させる工程を
含むものであり、更に、該第１の方法（ａ）及び第２の
方法（ｂ）は、サンプル中に脂質のみ、もしくは蛋白質
のみが存在している場合には該サンプル中の脂質または
蛋白質の定量が可能な方法であることを特徴とする定量
法を挙げることができる。
【００３０】脂質と蛋白質の２成分系の定量に用いる定
量法としては、上記の計算が成り立つ方法であれば、制
限なく利用可能である。例えば、脂質の定量方法として
は、水性媒体中で試料を界面活性剤で処理して、紫外部
の吸光度を計測する紫外部計測法及びビシコニン酸を利
用するＢＣＡ法を挙げることができる。
量法としては、上記の計算が成り立つ方法であれば、制
限なく利用可能である。例えば、脂質の定量方法として
は、水性媒体中で試料を界面活性剤で処理して、紫外部
の吸光度を計測する紫外部計測法及びビシコニン酸を利
用するＢＣＡ法を挙げることができる。
【００３１】紫外部計測法は、水性媒体中で試料を界面
活性剤で処理して試料分散液を調整する過程と、該試料
分散液の紫外部の吸光度を計測する過程とを有する定量
方法である。
活性剤で処理して試料分散液を調整する過程と、該試料
分散液の紫外部の吸光度を計測する過程とを有する定量
方法である。
【００３２】この紫外部計測法では、試料中の特に脂質
成分を界面活性剤により処理して吸光法による定量を可
能とするミセル状態とする。例えば、リン脂質等の両親
媒性脂質の集合体を水性媒体中で界面活性剤で処理する
ことにより、界面活性剤とのミセル状態を形成する。使
用する界面活性剤としては、紫外線領域の波長での光吸
収の測定の障害とならないものであれば、特に限定され
ない。使用できる界面活性剤の例として、オクチルグル
コシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）や
ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＨＥＣＡ
ＭＥＧ（６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−メチ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシド）などが挙げられる。
成分を界面活性剤により処理して吸光法による定量を可
能とするミセル状態とする。例えば、リン脂質等の両親
媒性脂質の集合体を水性媒体中で界面活性剤で処理する
ことにより、界面活性剤とのミセル状態を形成する。使
用する界面活性剤としては、紫外線領域の波長での光吸
収の測定の障害とならないものであれば、特に限定され
ない。使用できる界面活性剤の例として、オクチルグル
コシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）や
ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＨＥＣＡ
ＭＥＧ（６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−メチ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシド）などが挙げられる。
【００３３】界面活性剤での処理の仕方としては、超音
波処理、あるいは湯浴中での加熱が適当な方法である
が、超音波処理ならば１分間、加熱処理ならば６０℃の
温浴で１０分以上加熱すれば十分である。ただし、未知
試料と脂質の基準液には同じ処理を施す必要がある。
波処理、あるいは湯浴中での加熱が適当な方法である
が、超音波処理ならば１分間、加熱処理ならば６０℃の
温浴で１０分以上加熱すれば十分である。ただし、未知
試料と脂質の基準液には同じ処理を施す必要がある。
【００３４】この操作により、脂質が、リポソーム（プ
ロテオリポソーム）、平面膜あるいはヘキサゴナルII構
造のような集合体の形態をとるものであっても、これら
の形態をその濃度に比例した界面活性剤とのミセル状態
に揃えることが出来る。測定する紫外部の波長に吸収を
持たない界面活性剤を使用した場合には、試料と界面活
性剤とのミセル状態において吸光度は試料の濃度に依存
することになる。
ロテオリポソーム）、平面膜あるいはヘキサゴナルII構
造のような集合体の形態をとるものであっても、これら
の形態をその濃度に比例した界面活性剤とのミセル状態
に揃えることが出来る。測定する紫外部の波長に吸収を
持たない界面活性剤を使用した場合には、試料と界面活
性剤とのミセル状態において吸光度は試料の濃度に依存
することになる。
【００３５】吸光度の測定に用いる波長は、２３０〜２
９０nmの範囲から選択することができるが、蛋白質の極
大吸収波長である２８０nmを避けて、２４０nm付近の波
長を用いることが望ましい。
９０nmの範囲から選択することができるが、蛋白質の極
大吸収波長である２８０nmを避けて、２４０nm付近の波
長を用いることが望ましい。
【００３６】この方法では、試料を水性媒体中で界面活
性剤により処理するが、これは試料の存在形態が初めか
ら水溶液中に懸濁されていることを前提とするものでは
ない。例えば固形の試料であっても所定容積の界面活性
剤水溶液で処理すれば、試料を定量することが可能であ
る。反応系を構成する水性媒体としては、未知試料と検
量線用の基準液が同じｐＨ、イオン強度あるいは塩濃度
で処理されることを前提として、使用する界面活性剤の
可溶化能が保たれるイオン強度、ｐＨの範囲内であれば
その組成は特に限定されない。
性剤により処理するが、これは試料の存在形態が初めか
ら水溶液中に懸濁されていることを前提とするものでは
ない。例えば固形の試料であっても所定容積の界面活性
剤水溶液で処理すれば、試料を定量することが可能であ
る。反応系を構成する水性媒体としては、未知試料と検
量線用の基準液が同じｐＨ、イオン強度あるいは塩濃度
で処理されることを前提として、使用する界面活性剤の
可溶化能が保たれるイオン強度、ｐＨの範囲内であれば
その組成は特に限定されない。
【００３７】この紫外部計測法を利用する場合の検量線
の作成には、理想的には、未知試料における形態と同様
の形態で蛋白質を含まない脂質を用意し、その既知濃度
シリーズを作成するのが好ましい。例えば、未知試料が
プロテオリポソームの場合、リポソームを形成してその
既知濃度シリーズを作成するのが好ましい。しかしなが
ら、実際には、脂質と界面活性剤の単純なエマルジョン
を作製し、検量することで代用できる。例えば、未知試
料がプロテオリポソームの場合、プロテオリポソーム形
成用に用いる脂質に界面活性剤、例えば、オクチルグル
コシドを最終濃度１％になるように加え、超音波処理を
行ない、２４０ｎｍにて光路長１ｃｍで吸収強度を測定
する。この時得られる値は脂質による吸収とオクチルグ
ルコシドによる吸収との和である。従って、脂質が入っ
ていない試料にも同様な操作を行い、オクチルグルコシ
ドの寄与を算出し、ブランクとする。
の作成には、理想的には、未知試料における形態と同様
の形態で蛋白質を含まない脂質を用意し、その既知濃度
シリーズを作成するのが好ましい。例えば、未知試料が
プロテオリポソームの場合、リポソームを形成してその
既知濃度シリーズを作成するのが好ましい。しかしなが
ら、実際には、脂質と界面活性剤の単純なエマルジョン
を作製し、検量することで代用できる。例えば、未知試
料がプロテオリポソームの場合、プロテオリポソーム形
成用に用いる脂質に界面活性剤、例えば、オクチルグル
コシドを最終濃度１％になるように加え、超音波処理を
行ない、２４０ｎｍにて光路長１ｃｍで吸収強度を測定
する。この時得られる値は脂質による吸収とオクチルグ
ルコシドによる吸収との和である。従って、脂質が入っ
ていない試料にも同様な操作を行い、オクチルグルコシ
ドの寄与を算出し、ブランクとする。
【００３８】ＢＣＡ法は、水性媒体中で試料を界面活性
剤で処理して試料分散液を調製し、、該試料分散液に２
価の銅イオンとビシコニン酸とを反応させて、脂質及び
蛋白質が存在する場合に２価の銅イオンから生じる１価
の銅イオンとビシコニン酸の反応による錯化合物の形成
に伴う呈色状態を計測する方法であり、脂質定量及び蛋
白質の定量に利用できる。
剤で処理して試料分散液を調製し、、該試料分散液に２
価の銅イオンとビシコニン酸とを反応させて、脂質及び
蛋白質が存在する場合に２価の銅イオンから生じる１価
の銅イオンとビシコニン酸の反応による錯化合物の形成
に伴う呈色状態を計測する方法であり、脂質定量及び蛋
白質の定量に利用できる。
【００３９】この方法においても、上述の紫外部計測法
と同様に界面活性剤で試料を処理することで、定量分析
を可能とする試料中の脂質と界面活性剤とのミセル状態
を形成させる。このミセル状態において、脂質及び蛋白
質が還元剤として作用して水性媒体中に存在させた２価
の銅イオンを１価の銅イオンに変換し、生成した１価の
銅イオンとビシコニン酸（４，４’−ジカルボキシ−
２，２’−ビキノリン）のＮａ塩が紫紅色の錯化合物を
形成する。これらの反応は定量的に進行するので、該錯
化合物による呈色状態を吸光度により計測することで脂
質及び蛋白質の定量が可能となる。
と同様に界面活性剤で試料を処理することで、定量分析
を可能とする試料中の脂質と界面活性剤とのミセル状態
を形成させる。このミセル状態において、脂質及び蛋白
質が還元剤として作用して水性媒体中に存在させた２価
の銅イオンを１価の銅イオンに変換し、生成した１価の
銅イオンとビシコニン酸（４，４’−ジカルボキシ−
２，２’−ビキノリン）のＮａ塩が紫紅色の錯化合物を
形成する。これらの反応は定量的に進行するので、該錯
化合物による呈色状態を吸光度により計測することで脂
質及び蛋白質の定量が可能となる。
【００４０】使用する界面活性剤としては、非イオン
性、陰イオン性の界面活性剤等、特に限定されず、例え
ば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＳＤＳ（ドデシル硫酸
ナトリウム）、Ｂｒｉｊｉ ３５、オクチルグルコシド
（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）やＣＨＡ
ＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモ
ニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＨＥＣＡＭＥＧ
（６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−メチル−α
−Ｄ−グルコピラノシド）、コール酸、デオキシコール
酸などが挙げられる。
性、陰イオン性の界面活性剤等、特に限定されず、例え
ば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＳＤＳ（ドデシル硫酸
ナトリウム）、Ｂｒｉｊｉ ３５、オクチルグルコシド
（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）やＣＨＡ
ＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモ
ニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＨＥＣＡＭＥＧ
（６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−メチル−α
−Ｄ−グルコピラノシド）、コール酸、デオキシコール
酸などが挙げられる。
【００４１】界面活性剤による処理の仕方としては、超
音波処理、あるいは温浴中での加熱が適当な方法である
が、特に限定はされない。超音波処理ならば１分間、加
熱処理ならば６０℃の温浴で１０分以上加熱すれば十分
である。ただし、未知試料と脂質の基準液は同じ処理を
施す必要がある。
音波処理、あるいは温浴中での加熱が適当な方法である
が、特に限定はされない。超音波処理ならば１分間、加
熱処理ならば６０℃の温浴で１０分以上加熱すれば十分
である。ただし、未知試料と脂質の基準液は同じ処理を
施す必要がある。
【００４２】この操作により、脂質が、リポソーム、平
面膜あるいはヘキサゴナルII構造のような集合体として
の形態を有するものであっても、これらを試料濃度に比
例した界面活性剤とのミセル状態の形態に揃えることが
できる。試料は、水性媒体中で界面活性剤により処理す
る必要があるが、これは試料の存在形態が初めから水性
媒体中に懸濁されていることを前提とするものではな
い。例えば固形の試料であっても、これに所定容積の界
面活性剤水溶液を加えて処理すれば定量が可能である。
反応系を構成する水性媒体としては、未知試料と検量線
作成用の基準液が同じｐＨ、イオン強度あるいは塩濃度
で処理されることを前提として、使用する界面活性剤の
可溶化能が保たれるイオン強度、ｐＨの範囲内であれば
その組成は特に限定されない。但し、この方法における
呈色反応の最適ｐＨが１１．２５であるため、水性媒体
に試料を加えた際に大幅にそのｐＨを酸性側にシフトさ
せてしまうような強酸性溶液を水性媒体として用いるこ
とは好ましくない。
面膜あるいはヘキサゴナルII構造のような集合体として
の形態を有するものであっても、これらを試料濃度に比
例した界面活性剤とのミセル状態の形態に揃えることが
できる。試料は、水性媒体中で界面活性剤により処理す
る必要があるが、これは試料の存在形態が初めから水性
媒体中に懸濁されていることを前提とするものではな
い。例えば固形の試料であっても、これに所定容積の界
面活性剤水溶液を加えて処理すれば定量が可能である。
反応系を構成する水性媒体としては、未知試料と検量線
作成用の基準液が同じｐＨ、イオン強度あるいは塩濃度
で処理されることを前提として、使用する界面活性剤の
可溶化能が保たれるイオン強度、ｐＨの範囲内であれば
その組成は特に限定されない。但し、この方法における
呈色反応の最適ｐＨが１１．２５であるため、水性媒体
に試料を加えた際に大幅にそのｐＨを酸性側にシフトさ
せてしまうような強酸性溶液を水性媒体として用いるこ
とは好ましくない。
【００４３】なお、２価の銅イオンとビシコニン酸によ
る呈色反応自体は、蛋白質の還元剤としての作用を利用
した蛋白質の定量方法（Anal. Biochem., 150, p76 (19
85))において知られている。本発明者らは、この方法
が、蛋白質のみならず、同じような反応性を持つ脂質に
対しても、鋭敏に反応することを見出し、本発明で利用
し得る定量方法としてこの方法を例示している。なお、
蛋白質の定量にこの方法を利用する場合は、この文献に
従って定量分析を行なうことができる。この定量法で
は、界面活性剤で処理した試料分散液に、ビシコニン
酸、２価の銅イオンを含む呈色試薬を加えて反応させ、
脂質が存在を示す紫紅色の呈色状態を吸光度により計測
する。ビシコニン酸及び２価の銅イオンの添加量は、試
料中に含まれる反応成分の全量が反応できる過剰量とさ
れるが、通常ビシコニン酸の最終濃度が１％程度、銅イ
オンが０．０１〜０．１％程度とし、この添加量で定量
可能なように試料分散液を必要に応じて希釈すると良
い。反応条件は、適宜選択できるが、例えば６０℃、１
時間程度の加温処理が利用できる。加温処理した場合
は、室温まで冷却してから例えば５２６nmの波長等で吸
光度を測定し、定量する。この方法による定量は、試薬
の添加が一度でよく、しかも、呈色物質が長時間にわた
って安定であるという特長を有し、ほかの脂質定量法に
比べて感度がよいばかりでなく、非常に簡便であるとい
う利点がある。
る呈色反応自体は、蛋白質の還元剤としての作用を利用
した蛋白質の定量方法（Anal. Biochem., 150, p76 (19
85))において知られている。本発明者らは、この方法
が、蛋白質のみならず、同じような反応性を持つ脂質に
対しても、鋭敏に反応することを見出し、本発明で利用
し得る定量方法としてこの方法を例示している。なお、
蛋白質の定量にこの方法を利用する場合は、この文献に
従って定量分析を行なうことができる。この定量法で
は、界面活性剤で処理した試料分散液に、ビシコニン
酸、２価の銅イオンを含む呈色試薬を加えて反応させ、
脂質が存在を示す紫紅色の呈色状態を吸光度により計測
する。ビシコニン酸及び２価の銅イオンの添加量は、試
料中に含まれる反応成分の全量が反応できる過剰量とさ
れるが、通常ビシコニン酸の最終濃度が１％程度、銅イ
オンが０．０１〜０．１％程度とし、この添加量で定量
可能なように試料分散液を必要に応じて希釈すると良
い。反応条件は、適宜選択できるが、例えば６０℃、１
時間程度の加温処理が利用できる。加温処理した場合
は、室温まで冷却してから例えば５２６nmの波長等で吸
光度を測定し、定量する。この方法による定量は、試薬
の添加が一度でよく、しかも、呈色物質が長時間にわた
って安定であるという特長を有し、ほかの脂質定量法に
比べて感度がよいばかりでなく、非常に簡便であるとい
う利点がある。
【００４４】一方、蛋白質の定量方法としては、上述の
ＢＣＡ法、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法等を挙げることが
できる。ローリー法における検量線の作成は、既知量の
脂質と既知量の蛋白質のそれぞれにアルカリ性銅溶液を
加え、１０分間放置する。その後、Ｆｏｌｉｎ溶液を加
えて混合し、３０分以上経過してから、７５０ｎｍでの
吸光度を測定し検量線を作成する。このとき、脂質も蛋
白質も含まない溶液をコントロールとして作製し、脂質
と蛋白質について得られた各濃度での吸収強度からこの
値を引いて真の脂質と蛋白質の検量線（一次関数）を得
る。
ＢＣＡ法、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法等を挙げることが
できる。ローリー法における検量線の作成は、既知量の
脂質と既知量の蛋白質のそれぞれにアルカリ性銅溶液を
加え、１０分間放置する。その後、Ｆｏｌｉｎ溶液を加
えて混合し、３０分以上経過してから、７５０ｎｍでの
吸光度を測定し検量線を作成する。このとき、脂質も蛋
白質も含まない溶液をコントロールとして作製し、脂質
と蛋白質について得られた各濃度での吸収強度からこの
値を引いて真の脂質と蛋白質の検量線（一次関数）を得
る。
【００４５】以上の紫外部計測法、ＢＣＡ法およびロー
リー法を組み合わせて用いた場合には、脂質が膜構造等
の複雑な構造を形成した試料であっても定量が可能であ
るという利点がある。また、これらの定量方法の組合せ
によれば、リポソームの膜中に、あるいはその小胞内に
蛋白質を組み込んだもの、ガラスビーズや高分子微粒子
の外表面に脂質と蛋白質を吸着させた被覆微粒子、蛋白
質を含む黒膜、はり合せ法やパッチピペット法により再
構成した蛋白質を含む平面２分子膜、蛋白質と脂質が混
在するＬＢ累積膜などの構造が複雑な２成分系の試料に
おいても脂質と蛋白質のそれぞれの簡便な操作による定
量が可能となる。
リー法を組み合わせて用いた場合には、脂質が膜構造等
の複雑な構造を形成した試料であっても定量が可能であ
るという利点がある。また、これらの定量方法の組合せ
によれば、リポソームの膜中に、あるいはその小胞内に
蛋白質を組み込んだもの、ガラスビーズや高分子微粒子
の外表面に脂質と蛋白質を吸着させた被覆微粒子、蛋白
質を含む黒膜、はり合せ法やパッチピペット法により再
構成した蛋白質を含む平面２分子膜、蛋白質と脂質が混
在するＬＢ累積膜などの構造が複雑な２成分系の試料に
おいても脂質と蛋白質のそれぞれの簡便な操作による定
量が可能となる。
【００４６】なお、紫外部計測法は、試料が試薬等と反
応して破壊されることがないので、この方法に使用した
試料を次の他の定量工程に供することができ、未知試料
のサンプリング量を最小限にすることができる。また、
上記の３つの定量方法の組み合わせは、全体的な工程数
も比較的少なく、試料のロスを最小限とする上でも好ま
しい組合せである。
応して破壊されることがないので、この方法に使用した
試料を次の他の定量工程に供することができ、未知試料
のサンプリング量を最小限にすることができる。また、
上記の３つの定量方法の組み合わせは、全体的な工程数
も比較的少なく、試料のロスを最小限とする上でも好ま
しい組合せである。
【００４７】
【実施例】以下、実施例により本発明の方法を更に詳細
に説明する。 実施例１ まず、それぞれの方法で検量線を作成するための試料を
作製する。直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程度の試験管
に脂質重量１５ｍｇに相当する大豆リン脂質（アゾレク
チン）を入れ、１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を１ｍｌ、
および、２０％オクチルグルコシド溶液５０μｌを加
え、水浴型超音波発振装置で１分間処理して脂質を分散
させる。このミセル化した脂質懸濁液を１００μｌから
１０μｌまで１０μｌずつ分注し、容量の異なる１０種
類の脂質懸濁液を試験管に準備する。また、脂質を含ま
ない試料もコントロールとして用意する。
に説明する。 実施例１ まず、それぞれの方法で検量線を作成するための試料を
作製する。直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程度の試験管
に脂質重量１５ｍｇに相当する大豆リン脂質（アゾレク
チン）を入れ、１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を１ｍｌ、
および、２０％オクチルグルコシド溶液５０μｌを加
え、水浴型超音波発振装置で１分間処理して脂質を分散
させる。このミセル化した脂質懸濁液を１００μｌから
１０μｌまで１０μｌずつ分注し、容量の異なる１０種
類の脂質懸濁液を試験管に準備する。また、脂質を含ま
ない試料もコントロールとして用意する。
【００４８】次に各試料の最終容量が１ｍｌになるよう
に１％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム
を加えて、１ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの吸光度を
測定する。その値から脂質を含まない場合の吸光度を
０．０４８９を減じ、脂質の濃度を横軸に、吸光度を縦
軸にとってプロットするとこれらの点は原点を通る直線
にのり、その傾きａ1 は０．４００×１０-3となった。
従って、未知試料の脂質終濃度をｘ（μｇ／ｍｌ）とす
ると、 ＡL ＝０．４００×１０-3ｘ となる。
に１％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム
を加えて、１ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの吸光度を
測定する。その値から脂質を含まない場合の吸光度を
０．０４８９を減じ、脂質の濃度を横軸に、吸光度を縦
軸にとってプロットするとこれらの点は原点を通る直線
にのり、その傾きａ1 は０．４００×１０-3となった。
従って、未知試料の脂質終濃度をｘ（μｇ／ｍｌ）とす
ると、 ＡL ＝０．４００×１０-3ｘ となる。
【００４９】蛋白質としては、未知試料に組み込んだも
のと同じものを使用する。例えば、本実施例では、膜蛋
白質であるバクテリオロドプシンを用いる。この蛋白質
は、高度好塩菌Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏ
ｂｉｕｍより紫膜を抽出し［Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．，３１，ｐ６６７−７８（１９７４）］、さらに
Ｋ．−Ｓ．Ｈｕａｎｇらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７７，ｐ３２３（１９８
０）］を用いて、紫膜を脱脂質して得たものである。こ
のバクテリオロドプシンを５００μｇ／ｍｌ含む１０ｍ
Ｍ塩化カリウム水溶液を調整し、それを２０μｌから
２．５μｌまで２．５μｌずつ容量の異なる蛋白質溶液
を８種類試験管に調製する。
のと同じものを使用する。例えば、本実施例では、膜蛋
白質であるバクテリオロドプシンを用いる。この蛋白質
は、高度好塩菌Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏ
ｂｉｕｍより紫膜を抽出し［Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．，３１，ｐ６６７−７８（１９７４）］、さらに
Ｋ．−Ｓ．Ｈｕａｎｇらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７７，ｐ３２３（１９８
０）］を用いて、紫膜を脱脂質して得たものである。こ
のバクテリオロドプシンを５００μｇ／ｍｌ含む１０ｍ
Ｍ塩化カリウム水溶液を調整し、それを２０μｌから
２．５μｌまで２．５μｌずつ容量の異なる蛋白質溶液
を８種類試験管に調製する。
【００５０】次に、各試験管に２０％オクチルグルコシ
ドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液５０μｌをそれぞ
れの試験管に加える。次に各試料の最終容量が１ｍｌに
なるように１０ｍＭ塩化カリウムを加えて水浴型超音波
発振装置で１分間処理し、１ｃｍのセルを用いて２４０
ｎｍの吸光度を測定する。その値から蛋白質を含まない
場合の吸光度０．０４８９を減じ、蛋白質の濃度を横軸
に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれらの点は
原点を通る直線にのり、その傾きｂ1 は２．７×１０-3
となった。従って、未知試料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ
／ｍｌ）とすると、 ＡP ＝２．７×１０-3ｙ となる。
ドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液５０μｌをそれぞ
れの試験管に加える。次に各試料の最終容量が１ｍｌに
なるように１０ｍＭ塩化カリウムを加えて水浴型超音波
発振装置で１分間処理し、１ｃｍのセルを用いて２４０
ｎｍの吸光度を測定する。その値から蛋白質を含まない
場合の吸光度０．０４８９を減じ、蛋白質の濃度を横軸
に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれらの点は
原点を通る直線にのり、その傾きｂ1 は２．７×１０-3
となった。従って、未知試料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ
／ｍｌ）とすると、 ＡP ＝２．７×１０-3ｙ となる。
【００５１】次にＬｏｗｒｙ法で脂質と蛋白質の検量線
を作製した。１００μｌから１０μｌまで１０μｌずつ
容量の異なる１０種類のオクチルグルコシドを含む脂質
懸濁液を試験管に取り、それを最終容量２５０μｌにな
るように１％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カ
リウム水溶液を加える。そこに５００μｌのアルカリ性
銅溶液（４％Ｎａ2 ＣＯ3 および２％ドデシル硫酸ナト
リウムを含む０．２ＮＮａＯＨ溶液：２％ＣｕＳＯ4 ・
５Ｈ2 Ｏ：４％クエン酸ナトリウム＝１００：１：１）
を加え、室温で１５分放置する。次に１００μｌのフェ
ノール試薬を加え、室温で３０分放置後７５０ｎｍでの
吸光度を測定する。脂質も蛋白質も含まない溶液をコン
トロールとして用意し、同様の測定を行なう。各濃度で
の吸光度から脂質を含まない場合の吸光度０．０５８を
減じ、脂質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロ
ットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、その傾
きａ2 は３．０３ｘ１０-4となった。従って、未知試料
の脂質終濃度をｘ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢL ＝３．０３×１０-4ｘ となる。
を作製した。１００μｌから１０μｌまで１０μｌずつ
容量の異なる１０種類のオクチルグルコシドを含む脂質
懸濁液を試験管に取り、それを最終容量２５０μｌにな
るように１％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カ
リウム水溶液を加える。そこに５００μｌのアルカリ性
銅溶液（４％Ｎａ2 ＣＯ3 および２％ドデシル硫酸ナト
リウムを含む０．２ＮＮａＯＨ溶液：２％ＣｕＳＯ4 ・
５Ｈ2 Ｏ：４％クエン酸ナトリウム＝１００：１：１）
を加え、室温で１５分放置する。次に１００μｌのフェ
ノール試薬を加え、室温で３０分放置後７５０ｎｍでの
吸光度を測定する。脂質も蛋白質も含まない溶液をコン
トロールとして用意し、同様の測定を行なう。各濃度で
の吸光度から脂質を含まない場合の吸光度０．０５８を
減じ、脂質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロ
ットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、その傾
きａ2 は３．０３ｘ１０-4となった。従って、未知試料
の脂質終濃度をｘ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢL ＝３．０３×１０-4ｘ となる。
【００５２】吸光度法の場合と同様な方法でバクテリオ
ロドプシンについても８種類の試料を用意し、最終容量
２５０μｌになるように蒸留水を加える。そこに、５０
０μｌのアルカリ性銅溶液を加え、室温で１５分放置す
る。次に１００μｌのフェノール試薬を加え、室温で３
０分放置後７５０ｎｍでの吸光度を測定する。各濃度で
の吸光度から蛋白質を含まない場合の吸光度０．０５８
を減じ、蛋白質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとって
プロットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、そ
の傾きｂ2 は２．９９×１０-2となった。従って、未知
試料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢP ＝２．９９×１０-2ｙ となる。
ロドプシンについても８種類の試料を用意し、最終容量
２５０μｌになるように蒸留水を加える。そこに、５０
０μｌのアルカリ性銅溶液を加え、室温で１５分放置す
る。次に１００μｌのフェノール試薬を加え、室温で３
０分放置後７５０ｎｍでの吸光度を測定する。各濃度で
の吸光度から蛋白質を含まない場合の吸光度０．０５８
を減じ、蛋白質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとって
プロットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、そ
の傾きｂ2 は２．９９×１０-2となった。従って、未知
試料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢP ＝２．９９×１０-2ｙ となる。
【００５３】次に未知試料としての平面膜をコートした
ガラスビーズを調整する。本実施例では特開平２−５９
０７５の作製方法により平面膜を作製した。まず、多孔
質ガラスビーズ（旭硝子社製、粒径５μｍ、比表面積２
００ｍ2／ｇ）０．５ｇを過熱した５％エキストラン
（メルク社製）溶液で洗浄し、水浴型超音波洗浄器で３
０分処理する。流水で３０分間洗浄した後、１１０−１
５０度のオーブンで乾燥する。２ｍｌオクタデシルトリ
クロロシラン、１４０ｍｌｎ−ヘキサデカン、３０ｍｌ
四塩化炭素、２０ｍｌクロロホルム、の溶液に乾燥した
ガラスビーズを浸し、室温で２時間攪拌する。ガラスビ
ーズを取り出し、クロロホルムで３回、エタノールで１
回洗浄後、１１０度のオーブンで乾燥する。その結果、
ガラスビーズ表面にアルキル基が導入される。
ガラスビーズを調整する。本実施例では特開平２−５９
０７５の作製方法により平面膜を作製した。まず、多孔
質ガラスビーズ（旭硝子社製、粒径５μｍ、比表面積２
００ｍ2／ｇ）０．５ｇを過熱した５％エキストラン
（メルク社製）溶液で洗浄し、水浴型超音波洗浄器で３
０分処理する。流水で３０分間洗浄した後、１１０−１
５０度のオーブンで乾燥する。２ｍｌオクタデシルトリ
クロロシラン、１４０ｍｌｎ−ヘキサデカン、３０ｍｌ
四塩化炭素、２０ｍｌクロロホルム、の溶液に乾燥した
ガラスビーズを浸し、室温で２時間攪拌する。ガラスビ
ーズを取り出し、クロロホルムで３回、エタノールで１
回洗浄後、１１０度のオーブンで乾燥する。その結果、
ガラスビーズ表面にアルキル基が導入される。
【００５４】次にプロテオリポソームを調整する。つま
り、３０ｍｌナス型フラスコに脂質重量１５０ｍｇに相
当する大豆リン脂質（アゾレクチン）のクロロホルム溶
液を入れ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留
去した後、デシケーターに入れ、真空ポンプを用いて溶
媒を完全に除く。１００ｍＭ塩化カリウム水溶液を１０
ｍｌ加え、ｖｏｌｔｅｘミキサーで３０秒処理して脂質
薄膜を分散させた後、プローブ型超音波発振装置で３０
分間処理して直径１００ｎｍの一枚膜のリポソームの懸
濁液を得る。このリポソーム懸濁液に膜蛋白質であるバ
クテリオロドプシンを１ｍｇを加える。次にこの溶液を
液体窒素またはドライアイス−アセトンで凍結、室温で
融解、ｖｏｌｔｅｘミキサーで３０秒処理する操作を６
回繰り返す。その結果、平均粒径３００ｎｍ程度の一枚
膜プロテオリポソームが生成された。
り、３０ｍｌナス型フラスコに脂質重量１５０ｍｇに相
当する大豆リン脂質（アゾレクチン）のクロロホルム溶
液を入れ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留
去した後、デシケーターに入れ、真空ポンプを用いて溶
媒を完全に除く。１００ｍＭ塩化カリウム水溶液を１０
ｍｌ加え、ｖｏｌｔｅｘミキサーで３０秒処理して脂質
薄膜を分散させた後、プローブ型超音波発振装置で３０
分間処理して直径１００ｎｍの一枚膜のリポソームの懸
濁液を得る。このリポソーム懸濁液に膜蛋白質であるバ
クテリオロドプシンを１ｍｇを加える。次にこの溶液を
液体窒素またはドライアイス−アセトンで凍結、室温で
融解、ｖｏｌｔｅｘミキサーで３０秒処理する操作を６
回繰り返す。その結果、平均粒径３００ｎｍ程度の一枚
膜プロテオリポソームが生成された。
【００５５】このプロテオリポソーム溶液を展開層に入
れ、先に調製したアルキル化されたガラズビーズを浸
す。約３０分でプロテオリポソームは完全に開裂し、基
盤上にバクテリオロドプシン−リン脂質の脂質の二分子
平面膜が形成された。この方法では、プロテオリポソー
ムの粒径が多孔質ガラスの平均孔よりもかなり大きいた
め、細孔内に脂質膜が入り込むことは少ないと考えられ
る。
れ、先に調製したアルキル化されたガラズビーズを浸
す。約３０分でプロテオリポソームは完全に開裂し、基
盤上にバクテリオロドプシン−リン脂質の脂質の二分子
平面膜が形成された。この方法では、プロテオリポソー
ムの粒径が多孔質ガラスの平均孔よりもかなり大きいた
め、細孔内に脂質膜が入り込むことは少ないと考えられ
る。
【００５６】このようにしてバクテリオロドプシンを含
む二分子平面膜がコートされたガラスビーズを１ｍｌの
１％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水
溶液に浸し、１０分間水浴型超音波発振機で処理する。
この操作により、ガラスビーズ表面の平面膜は、ガラス
ビーズから浴離し、また脂質二分子膜もその構造が壊さ
れて、モノマー状態に移行する。このモノマー溶液のう
ち１００μｌを取り、２４０ｎｍでの吸光度を測定し、
リポソームを含まない場合の吸光度０．０４８９を引く
と、０．２５０が得られた。この場合、蛋白質量は脂質
量に比べて非常に少ないと見なされるので、第２項を無
視すると、 ０．２５０＝０．４００×１０-3ｘ ｘ＝６２５ ｘ、つまり、脂質量は６２５μｇ／ｍｌであることが分
かった。
む二分子平面膜がコートされたガラスビーズを１ｍｌの
１％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水
溶液に浸し、１０分間水浴型超音波発振機で処理する。
この操作により、ガラスビーズ表面の平面膜は、ガラス
ビーズから浴離し、また脂質二分子膜もその構造が壊さ
れて、モノマー状態に移行する。このモノマー溶液のう
ち１００μｌを取り、２４０ｎｍでの吸光度を測定し、
リポソームを含まない場合の吸光度０．０４８９を引く
と、０．２５０が得られた。この場合、蛋白質量は脂質
量に比べて非常に少ないと見なされるので、第２項を無
視すると、 ０．２５０＝０．４００×１０-3ｘ ｘ＝６２５ ｘ、つまり、脂質量は６２５μｇ／ｍｌであることが分
かった。
【００５７】次にＬｏｗｒｙ法で定量した。上記の未知
試料としての二分子平面膜がコートされたガラスビーズ
から得たモノマー溶液のうち１００μｌをとり、１％オ
クチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を
加えて最終容量２５０μｌにする。これにアルカリ性銅
溶液５００μｌを加え、室温で１５分放置した後、１０
０μｌのフェノール試薬を加えて、室温で３０分放置し
た後、７５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果からコ
ントロールの０．０５８を引き、希釈倍率を考慮する
と、０．３１０が得られた。
試料としての二分子平面膜がコートされたガラスビーズ
から得たモノマー溶液のうち１００μｌをとり、１％オ
クチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を
加えて最終容量２５０μｌにする。これにアルカリ性銅
溶液５００μｌを加え、室温で１５分放置した後、１０
０μｌのフェノール試薬を加えて、室温で３０分放置し
た後、７５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果からコ
ントロールの０．０５８を引き、希釈倍率を考慮する
と、０．３１０が得られた。
【００５８】 ０．３１０＝３．０３×１０-4ｘ＋２．９９×１０-2ｙ この式に、先程求めたｘの値６２５（μｇ／ｍｌ）を代
入すると、ｙ、すなわち蛋白質量は４．０３（μｇ／ｍ
ｌ）であることがわかった。
入すると、ｙ、すなわち蛋白質量は４．０３（μｇ／ｍ
ｌ）であることがわかった。
【００５９】この値は、ガラスビーズを有機溶媒と水溶
液の混合系で抽出した場合の値とよく一致した。 実施例２ まず、それぞれの方法で検量線を作成するための試料を
作製する。直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程度の試験管
に脂質重量１５ｍｇに相当する大豆リン脂質（アゾレク
チン）のクロロホルム溶液を入れ、ロータリーエバポレ
ーターを用いて溶媒を留去した後、デシケーターに入れ
真空ポンプを用いて溶媒を完全に除き、試験管内壁に脂
質薄膜を形成させる。１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を１
ｍｌ、加え、ｖｏｒｔｅｘミキサーで３０秒処理して脂
質薄膜を分散させた後、プローブ型超音波発振装置で３
０分間処理して直径１００ｎｍの一枚膜のリポソームの
懸濁液を得る。
液の混合系で抽出した場合の値とよく一致した。 実施例２ まず、それぞれの方法で検量線を作成するための試料を
作製する。直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程度の試験管
に脂質重量１５ｍｇに相当する大豆リン脂質（アゾレク
チン）のクロロホルム溶液を入れ、ロータリーエバポレ
ーターを用いて溶媒を留去した後、デシケーターに入れ
真空ポンプを用いて溶媒を完全に除き、試験管内壁に脂
質薄膜を形成させる。１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を１
ｍｌ、加え、ｖｏｒｔｅｘミキサーで３０秒処理して脂
質薄膜を分散させた後、プローブ型超音波発振装置で３
０分間処理して直径１００ｎｍの一枚膜のリポソームの
懸濁液を得る。
【００６０】１００μｌから１０μｌまで１０μｌずつ
容量の異なる１０種類のリポソーム懸濁液を試験管に取
り、そこに２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩
化カリウム水溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加え
る。また、リポソームを含まない試料も盲検用として準
備する。次に各試料の最終容量が１ｍｌになるように１
０ｍＭ塩化カリウムを加えて水浴型超音波発振装置で１
分間処理し、光路長１ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの
吸光度を測定する。その値からリポソームを含まない場
合の吸光度０．０４８９を減じ、リポソームの濃度を横
軸に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれらの点
は原点を通る直線にのり、その傾きａ1 は０．４００×
１０-3となった。従って、未知試料の脂質終濃度をｘ
（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡL ＝０．４００×１０-3ｘ となる。
容量の異なる１０種類のリポソーム懸濁液を試験管に取
り、そこに２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩
化カリウム水溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加え
る。また、リポソームを含まない試料も盲検用として準
備する。次に各試料の最終容量が１ｍｌになるように１
０ｍＭ塩化カリウムを加えて水浴型超音波発振装置で１
分間処理し、光路長１ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの
吸光度を測定する。その値からリポソームを含まない場
合の吸光度０．０４８９を減じ、リポソームの濃度を横
軸に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれらの点
は原点を通る直線にのり、その傾きａ1 は０．４００×
１０-3となった。従って、未知試料の脂質終濃度をｘ
（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡL ＝０．４００×１０-3ｘ となる。
【００６１】蛋白質としては、濃度未知試料に組み込む
ものと同じものを使用し、ここでは実施例１で用いたバ
クテリオロドプシンを使用した。
ものと同じものを使用し、ここでは実施例１で用いたバ
クテリオロドプシンを使用した。
【００６２】バクテリオロドプシンを１０ｍＭ塩化カリ
ウム水溶液に１ｍｇ／ｍｌで懸濁する。それを２０μｌ
から２．５μｌずつ２．５μｌまで８種類を試験管に分
取する。そこに２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍ
Ｍ塩化カリウム水溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加
える。次に各試料の最終容量が１ｍｌになるように１０
ｍＭ塩化カリウムを加えて十分混和して、水浴型超音波
発振装置で１分間処理し、光路長１ｃｍのセルを用いて
２４０ｎｍの吸光度を測定する。その値から蛋白質を含
まない場合の吸光度０．０４８９を減じ、蛋白質の終濃
度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれ
らの点は原点を通る直線にのり、その傾きｂ1 は２．７
０ｘ１０-3となった。従って、未知試料の蛋白質終濃度
をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡP ＝２．７０ｘ１０-3ｙ となる。
ウム水溶液に１ｍｇ／ｍｌで懸濁する。それを２０μｌ
から２．５μｌずつ２．５μｌまで８種類を試験管に分
取する。そこに２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍ
Ｍ塩化カリウム水溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加
える。次に各試料の最終容量が１ｍｌになるように１０
ｍＭ塩化カリウムを加えて十分混和して、水浴型超音波
発振装置で１分間処理し、光路長１ｃｍのセルを用いて
２４０ｎｍの吸光度を測定する。その値から蛋白質を含
まない場合の吸光度０．０４８９を減じ、蛋白質の終濃
度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれ
らの点は原点を通る直線にのり、その傾きｂ1 は２．７
０ｘ１０-3となった。従って、未知試料の蛋白質終濃度
をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡP ＝２．７０ｘ１０-3ｙ となる。
【００６３】次にＢＣＡ法でリポソームと蛋白質の検量
線を作製した。上記の方法で作製したリポソーム懸濁液
を５０μｌから５μｌまで５μｌずつ１０種類を試験管
に取り、各試験管に２０％オクチルグルコシドを含む１
０ｍＭ塩化カリウム水溶液５０μｌを加える。次に各試
料の最終容量が１ｍｌになるように１０ｍＭ塩化カリウ
ムを加える。また、リポソームを含まない試料も盲検用
として準備する。各試験管に試料と等量のＢＣＡ呈色試
薬を加え、６０分、６０℃にて反応させた後、冷却して
室温にて５６２ｎｍでの吸光度を測定した。リポソーム
を含まない場合の吸光度０．５３３を減じ、脂質の濃度
を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれら
の点は原点を通る直線にのり、その傾きａ2 は３．８９
ｘ１０-2となった。従って、未知試料の脂質終濃度をｘ
（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢL ＝３．８９×１０-2ｘ となる。
線を作製した。上記の方法で作製したリポソーム懸濁液
を５０μｌから５μｌまで５μｌずつ１０種類を試験管
に取り、各試験管に２０％オクチルグルコシドを含む１
０ｍＭ塩化カリウム水溶液５０μｌを加える。次に各試
料の最終容量が１ｍｌになるように１０ｍＭ塩化カリウ
ムを加える。また、リポソームを含まない試料も盲検用
として準備する。各試験管に試料と等量のＢＣＡ呈色試
薬を加え、６０分、６０℃にて反応させた後、冷却して
室温にて５６２ｎｍでの吸光度を測定した。リポソーム
を含まない場合の吸光度０．５３３を減じ、脂質の濃度
を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれら
の点は原点を通る直線にのり、その傾きａ2 は３．８９
ｘ１０-2となった。従って、未知試料の脂質終濃度をｘ
（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢL ＝３．８９×１０-2ｘ となる。
【００６４】吸光度法の場合と同様な方法でバクテリオ
ロドプシンの８種類の試料を用意し、最終容量を１ｍｌ
とする。各試験管に試料と等量のＢＣＡ呈色試薬を加
え、６０分、６０℃にて反応させた後、冷却して室温に
て５６２ｎｍでの吸光度を測定した。バクテリオロドプ
シンを含まない場合の吸光度０．５３３を減し、バクテ
リオロドプシンの濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとって
プロットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、そ
の傾きｂ2 は９．６３ｘ１０-2となった。従って、未知
試料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢP ＝９．６３×１０-2ｙ となる。
ロドプシンの８種類の試料を用意し、最終容量を１ｍｌ
とする。各試験管に試料と等量のＢＣＡ呈色試薬を加
え、６０分、６０℃にて反応させた後、冷却して室温に
て５６２ｎｍでの吸光度を測定した。バクテリオロドプ
シンを含まない場合の吸光度０．５３３を減し、バクテ
リオロドプシンの濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとって
プロットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、そ
の傾きｂ2 は９．６３ｘ１０-2となった。従って、未知
試料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢP ＝９．６３×１０-2ｙ となる。
【００６５】次に未知試料としてのプロテオリポソーム
を調整する。前述の方法に従いリポソームの懸濁液（脂
質重量にして１５ｍｇ／ｍｌ）を得る。このリポソーム
懸濁液を１０ｍＭ塩化カリウムにて１０倍希釈したうえ
で１３３μｌ（２００μｇ相当）を分取し、膜蛋白質で
あるバクテリオロドプシンを４０μｇ加え、水浴型超音
波発振装置にて３０秒処理する。このプロテオリポソー
ム溶液を最終容量２００μｌの１％オクチルグルコシド
−１０ｍＭ塩化カリウム水溶液として、水浴型超音波発
振装置で１分間処理する。その後、２４０ｎｍでの吸光
度を測定し、プロテオリポソームを含まない場合の吸光
度０．０４８９を引くと、０．９４が得られた。つま
り、希釈倍率を考慮すると（３）式が成立する。
を調整する。前述の方法に従いリポソームの懸濁液（脂
質重量にして１５ｍｇ／ｍｌ）を得る。このリポソーム
懸濁液を１０ｍＭ塩化カリウムにて１０倍希釈したうえ
で１３３μｌ（２００μｇ相当）を分取し、膜蛋白質で
あるバクテリオロドプシンを４０μｇ加え、水浴型超音
波発振装置にて３０秒処理する。このプロテオリポソー
ム溶液を最終容量２００μｌの１％オクチルグルコシド
−１０ｍＭ塩化カリウム水溶液として、水浴型超音波発
振装置で１分間処理する。その後、２４０ｎｍでの吸光
度を測定し、プロテオリポソームを含まない場合の吸光
度０．０４８９を引くと、０．９４が得られた。つま
り、希釈倍率を考慮すると（３）式が成立する。
【００６６】 ０．９４×１０＝０．４００×１０-3ｘ＋２．７０×１０-3ｙ（３） 次にＢＣＡ法で定量した。上記の方法で吸光度を測定し
た未知試料２００μｌを更に希釈して最終容量５００μ
ｌの１％オクチルグルコシド−１０ｍＭ塩化カリウム水
溶液とする。試料と等量のＢＣＡ呈色試薬を加え、６０
分、６０℃にて反応させた後、冷却して室温にて５６２
ｎｍでの吸光度を測定した。プロテオリポソームを含ま
ない場合の吸光度０．５３３を引くと、１．１６が得ら
れた。つまり希釈倍率を考慮すると（４）式が成立す
る。
た未知試料２００μｌを更に希釈して最終容量５００μ
ｌの１％オクチルグルコシド−１０ｍＭ塩化カリウム水
溶液とする。試料と等量のＢＣＡ呈色試薬を加え、６０
分、６０℃にて反応させた後、冷却して室温にて５６２
ｎｍでの吸光度を測定した。プロテオリポソームを含ま
ない場合の吸光度０．５３３を引くと、１．１６が得ら
れた。つまり希釈倍率を考慮すると（４）式が成立す
る。
【００６７】 １．１６×５０＝３．８９×１０-2ｘ＋９．６３×１０-2ｙ（４） 試料の希釈倍率を考慮し、得られた２式からｘおよび、
ｙを求めると、ｘすなわち脂質量は１０００（μｇ／ｍ
ｌ）、ｙすなわち蛋白質量は２００（μｇ／ｍ１）であ
ることがわかった。この量はプロテオリポソーム調整時
の脂質量２００μｇ、蛋白質４０μｇ（いずれも２００
μｌ当たり）と一致している。
ｙを求めると、ｘすなわち脂質量は１０００（μｇ／ｍ
ｌ）、ｙすなわち蛋白質量は２００（μｇ／ｍ１）であ
ることがわかった。この量はプロテオリポソーム調整時
の脂質量２００μｇ、蛋白質４０μｇ（いずれも２００
μｌ当たり）と一致している。
【００６８】実施例３ まず、それぞれの方法で検量線を作成するための試料を
作製する。直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程度の試験管
に脂質重量１５ｍｇに相当する大豆リン脂質（アゾレク
チン）のクロロホルム溶液を入れ、ロータリーエバポレ
ーターを用いて溶媒を留去した後、デシケーターに入
れ、真空ポンプを用いて溶媒を完全に除く。１０ｍＭ塩
化カリウム水溶液を１ｍｌ加え、ｖｏｌｔｅｘミキサー
で３０秒処理して脂質薄膜を分散させた後、プローブ型
超音波発振装置で３０分間処理して直径１００ｎｍの一
枚膜のリポソームの懸濁液を得る。
作製する。直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程度の試験管
に脂質重量１５ｍｇに相当する大豆リン脂質（アゾレク
チン）のクロロホルム溶液を入れ、ロータリーエバポレ
ーターを用いて溶媒を留去した後、デシケーターに入
れ、真空ポンプを用いて溶媒を完全に除く。１０ｍＭ塩
化カリウム水溶液を１ｍｌ加え、ｖｏｌｔｅｘミキサー
で３０秒処理して脂質薄膜を分散させた後、プローブ型
超音波発振装置で３０分間処理して直径１００ｎｍの一
枚膜のリポソームの懸濁液を得る。
【００６９】１００μｌから１０μｌまで１０μｌずつ
容量の異なる１０種類のリポソーム懸濁液を試験管に取
り、そこに２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩
化カリウム水溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加え
る。また、リポソームを含まない試料もコントロールと
して準備する。次に各試料の最終容量が１ｍｌになるよ
うに１０ｍＭ塩化カリウムを加えて水浴型超音波発振装
置で１分間処理し、１ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの
吸光度を測定する。その値からリポソームを含まない場
合の吸光度０．０４８９を減じ、リポソームの濃度を横
軸に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれらの点
は原点を通る直線にのり、その傾きａ1 は０．４００×
１０-3となった。従って、未知試料の脂質終濃度をｘ
（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡL ＝０．４００×１０-3ｘ となる。
容量の異なる１０種類のリポソーム懸濁液を試験管に取
り、そこに２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩
化カリウム水溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加え
る。また、リポソームを含まない試料もコントロールと
して準備する。次に各試料の最終容量が１ｍｌになるよ
うに１０ｍＭ塩化カリウムを加えて水浴型超音波発振装
置で１分間処理し、１ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの
吸光度を測定する。その値からリポソームを含まない場
合の吸光度０．０４８９を減じ、リポソームの濃度を横
軸に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれらの点
は原点を通る直線にのり、その傾きａ1 は０．４００×
１０-3となった。従って、未知試料の脂質終濃度をｘ
（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡL ＝０．４００×１０-3ｘ となる。
【００７０】蛋白質としては、未知試料に組み込んだも
のと同じものを使用し、ここでも実施例１で用いたバク
テリオロドプシンを使用した。バクテリオロドプシンを
１００μｍ／ｍｌ含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を調
整し、それを２０μｌから２．５μｌずつ２．５μｌま
で容量の異なる蛋白質溶液を８種類試験管に調整する。
そこに２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カ
リウム水溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加える。次
に各試料の最終容量が１ｍｌになるように１０ｍＭ塩化
カリウムを加えて水浴型超音波発振装置で１分間処理
し、１ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの吸光度を測定す
る。その値から蛋白質を含まない場合の吸光度０．０４
８９を減じ、蛋白質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にと
ってプロットするとこれらの点は原点を通る直線にの
り、その傾きｂ1 は２．７ｘ１０-3となった。従って、
未知試料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡP ＝２．７０ｘ１０-3ｙ となる。
のと同じものを使用し、ここでも実施例１で用いたバク
テリオロドプシンを使用した。バクテリオロドプシンを
１００μｍ／ｍｌ含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を調
整し、それを２０μｌから２．５μｌずつ２．５μｌま
で容量の異なる蛋白質溶液を８種類試験管に調整する。
そこに２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カ
リウム水溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加える。次
に各試料の最終容量が１ｍｌになるように１０ｍＭ塩化
カリウムを加えて水浴型超音波発振装置で１分間処理
し、１ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの吸光度を測定す
る。その値から蛋白質を含まない場合の吸光度０．０４
８９を減じ、蛋白質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にと
ってプロットするとこれらの点は原点を通る直線にの
り、その傾きｂ1 は２．７ｘ１０-3となった。従って、
未知試料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡP ＝２．７０ｘ１０-3ｙ となる。
【００７１】次にＬｏｗｒｙ法でリポソームと蛋白質の
検量線を作製した。１００μｌから１０μｌうつ１０μ
ｌまで容量の異なる１０種類のリポソーム懸濁液を試験
管に取り、それを最終容量２５０μｌとする。そこに５
００μｌのアルカリ性銅溶液（４％Ｎａ2 ＣＯ3 及び２
％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．２Ｎ ＮａＯＨ溶
液：２％ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ：４％クエン酸ナトリウ
ム＝１００：１：１）を加え、室温で１５分放置する。
次に１００μｌのフェノール試薬を加え、室温で３０分
放置後７５０ｎｍでの吸光度を測定する。リポソームも
蛋白質も含まない溶液をコントロールとして用意し、同
様の測定を行なう。各濃度での吸光度から脂質を含まな
い場合の吸光度０．０５８を減じ、脂質の濃度を横軸
に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれらの点は
原点を通る直線にのり、その傾きａ 2 は３．０３ｘ１０
-4となった。従って、未知試料の脂質終濃度をｘ（μｇ
／ｍｌ）とすると、 ＢL ＝３．０３ｘ１０-4ｘ となる。
検量線を作製した。１００μｌから１０μｌうつ１０μ
ｌまで容量の異なる１０種類のリポソーム懸濁液を試験
管に取り、それを最終容量２５０μｌとする。そこに５
００μｌのアルカリ性銅溶液（４％Ｎａ2 ＣＯ3 及び２
％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．２Ｎ ＮａＯＨ溶
液：２％ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ：４％クエン酸ナトリウ
ム＝１００：１：１）を加え、室温で１５分放置する。
次に１００μｌのフェノール試薬を加え、室温で３０分
放置後７５０ｎｍでの吸光度を測定する。リポソームも
蛋白質も含まない溶液をコントロールとして用意し、同
様の測定を行なう。各濃度での吸光度から脂質を含まな
い場合の吸光度０．０５８を減じ、脂質の濃度を横軸
に、吸光度を縦軸にとってプロットするとこれらの点は
原点を通る直線にのり、その傾きａ 2 は３．０３ｘ１０
-4となった。従って、未知試料の脂質終濃度をｘ（μｇ
／ｍｌ）とすると、 ＢL ＝３．０３ｘ１０-4ｘ となる。
【００７２】吸光度法の場合と同様な方法でバクテリオ
ロドプシンの８種類の試料を用意し、最終容量２５０μ
ｌになるように蒸留水を加える。そこに、５００μｌの
アルカリ性銅溶液を加え、室温で１５分放置する。次に
１００μｌのフェノール試薬を加え、室温で３０分放置
後７５０ｎｍでの吸光度を測定する。各濃度での吸光度
から蛋白質を含まない場合の吸光度０．０５８を減じ、
蛋白質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロット
するとこれらの点は原点を通る直線にのり、その傾きｂ
2 は２．９９ｘ１０-2となった。従って、未知試料の蛋
白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢP ＝２．９９×１０-2ｙ となる。
ロドプシンの８種類の試料を用意し、最終容量２５０μ
ｌになるように蒸留水を加える。そこに、５００μｌの
アルカリ性銅溶液を加え、室温で１５分放置する。次に
１００μｌのフェノール試薬を加え、室温で３０分放置
後７５０ｎｍでの吸光度を測定する。各濃度での吸光度
から蛋白質を含まない場合の吸光度０．０５８を減じ、
蛋白質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロット
するとこれらの点は原点を通る直線にのり、その傾きｂ
2 は２．９９ｘ１０-2となった。従って、未知試料の蛋
白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢP ＝２．９９×１０-2ｙ となる。
【００７３】次に未知試料としてのプロテオリポソーム
を調整する。つまり、直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程
度の試験管に脂質重量３６０μｇに相当する大豆リン脂
質（アゾレクチン）のクロロホルム溶液を入れ、ロータ
リーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、デシケ
ーターに入れ、真空ポンプを用いて溶媒を完全に除く。
１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を１ｍｌ加え、ｖｏｌｔｅ
ｘミキサーで３０秒処理して脂質薄膜を分散させた後、
プローブ型超音波発振装置で３０分間処理して直径１０
０ｎｍの一枚膜のリポソームの懸濁液を得る。
を調整する。つまり、直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程
度の試験管に脂質重量３６０μｇに相当する大豆リン脂
質（アゾレクチン）のクロロホルム溶液を入れ、ロータ
リーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、デシケ
ーターに入れ、真空ポンプを用いて溶媒を完全に除く。
１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を１ｍｌ加え、ｖｏｌｔｅ
ｘミキサーで３０秒処理して脂質薄膜を分散させた後、
プローブ型超音波発振装置で３０分間処理して直径１０
０ｎｍの一枚膜のリポソームの懸濁液を得る。
【００７４】このリポソーム懸濁液に膜蛋白質であるバ
クテリオロドプシンを１０μｇを加える。次にこの溶液
を液体窒素またはドライアイス−アセトンで凍結、室温
で融解、ｖｏｌｔｅｘミキサーで３０秒処理する操作を
６回繰り返す。その結果、平均粒径３００ｎｍ程度のプ
ロテオリポソームが生成された。
クテリオロドプシンを１０μｇを加える。次にこの溶液
を液体窒素またはドライアイス−アセトンで凍結、室温
で融解、ｖｏｌｔｅｘミキサーで３０秒処理する操作を
６回繰り返す。その結果、平均粒径３００ｎｍ程度のプ
ロテオリポソームが生成された。
【００７５】このプロテオリポソーム溶液のうち１００
μｌを取り、５０μｌの２０％オクチルグルコシドを含
む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液５μｌを加え、水浴型超
音波発振装置で１分間処理する。その後、２４０ｎｍで
の吸光度を測定し、リポソームを含まない場合の吸光度
０．０４８９を引き、希釈倍率を考慮すると、０．１６
０が得られた。つまり、 ０．１６０＝０．４００×１０-3ｘ＋２．７×１０-3ｙ となった。
μｌを取り、５０μｌの２０％オクチルグルコシドを含
む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液５μｌを加え、水浴型超
音波発振装置で１分間処理する。その後、２４０ｎｍで
の吸光度を測定し、リポソームを含まない場合の吸光度
０．０４８９を引き、希釈倍率を考慮すると、０．１６
０が得られた。つまり、 ０．１６０＝０．４００×１０-3ｘ＋２．７×１０-3ｙ となった。
【００７６】次にＬｏｗｒｙ法で定量した。脂質定量に
用いた未知試料としてのプロテオリポソームの溶液１０
５μｌに１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を加えて最終容量
２５０μｌにする。これにアルカリ性銅溶液５００μｌ
を加え、室温で１５分放置した後、１００μｌのフェノ
ール試薬を加えて、室温で３０分放置した後、７５０ｎ
ｍの吸光度を測定した。その結果からコントロールの
０．０５８を引き、希釈倍率を考慮すると、０．３５８
が得られた。つまり、 ０．３５８＝３．０３×１０-4ｘ＋２．９９×１０-2ｙ となった。
用いた未知試料としてのプロテオリポソームの溶液１０
５μｌに１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を加えて最終容量
２５０μｌにする。これにアルカリ性銅溶液５００μｌ
を加え、室温で１５分放置した後、１００μｌのフェノ
ール試薬を加えて、室温で３０分放置した後、７５０ｎ
ｍの吸光度を測定した。その結果からコントロールの
０．０５８を引き、希釈倍率を考慮すると、０．３５８
が得られた。つまり、 ０．３５８＝３．０３×１０-4ｘ＋２．９９×１０-2ｙ となった。
【００７７】得られた２式からｘおよび、ｙを求める
と、ｘ、すなわち脂質量は、３４２（μｇ／ｍｌ）、
ｙ、すなわち蛋白質は８．５０（μｇ／ｍｌ）であるこ
とがわかった。この量は、最初に加えた脂質量３６０μ
ｇ、蛋白質量１０μｇとほぼ一致している。
と、ｘ、すなわち脂質量は、３４２（μｇ／ｍｌ）、
ｙ、すなわち蛋白質は８．５０（μｇ／ｍｌ）であるこ
とがわかった。この量は、最初に加えた脂質量３６０μ
ｇ、蛋白質量１０μｇとほぼ一致している。
【００７８】実施例４ 実施例３と同様にして二つの方法で脂質、及び、蛋白質
に対する検量線を作成した。
に対する検量線を作成した。
【００７９】次に未知試料としてのプロテオリポソーム
を調整する。つまり、直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程
度の試験管に脂質重量６００μｇに相当する大豆リン脂
質（アゾレクチン）のクロロホルム溶液を入れ、ロータ
リーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、デシケ
ーターに入れ、真空ポンプを用いて溶媒を完全に除く。
１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を１ｍｌ加え、ｖｏｌｔｅ
ｘミキサーで３０秒処理して脂質薄膜を分散させた後、
プローブ型超音波発振装置で３０分間処理して直径１０
０ｎｍの一枚膜のリポソームの懸濁液を得る。
を調整する。つまり、直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程
度の試験管に脂質重量６００μｇに相当する大豆リン脂
質（アゾレクチン）のクロロホルム溶液を入れ、ロータ
リーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、デシケ
ーターに入れ、真空ポンプを用いて溶媒を完全に除く。
１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を１ｍｌ加え、ｖｏｌｔｅ
ｘミキサーで３０秒処理して脂質薄膜を分散させた後、
プローブ型超音波発振装置で３０分間処理して直径１０
０ｎｍの一枚膜のリポソームの懸濁液を得る。
【００８０】このリポソーム懸濁液に膜蛋白質であるバ
クテリオロドプシンを５μｇを加える。次にこの溶液を
液体窒素またはドライアイス−アセトンで凍結、室温で
融解、ｖｏｌｔｅｘミキサーで３０秒処理する操作を６
回繰り返す。その結果、平均粒径３００ｎｍ程度のプロ
テオリポソームが生成された。
クテリオロドプシンを５μｇを加える。次にこの溶液を
液体窒素またはドライアイス−アセトンで凍結、室温で
融解、ｖｏｌｔｅｘミキサーで３０秒処理する操作を６
回繰り返す。その結果、平均粒径３００ｎｍ程度のプロ
テオリポソームが生成された。
【００８１】このプロテオリポソーム溶液のうち１００
μｌを取り、５０μｌの２０％オクチルグルコシド溶液
５μｌを加え、水浴型超音波発振装置で１分間処理す
る。その後、２４０ｎｍでの吸光度を測定し、リポソー
ムを含まない場合の吸光度０．０４８９を引くと、０．
２５が得られた。この系では、蛋白質と脂質の比が１２
０：１であり、脂質の量に比べて蛋白質の量がこの測定
法では無視できる程度に少ないと見なすことができる。
従って、 ０．２５＝０．４００×１０-3ｘ ｘ＝６２５（μｇ／ｍｌ） 次にＬｏｗｒｙ法で定量した。脂質定量に用いた未知試
料としてのプロテオリポソームの溶液１００μｌに１０
ｍＭ塩化カリウム水溶液を加えて最終容量２５０μｌに
する。これにアルカリ性銅溶液５００μｌを加え、室温
で１５分放置した後、１００μｌのフェノール試薬を加
えて、室温で３０分放置した後、７５０ｎｍの吸光度を
測定した。その結果からコントロールの０．０５８を引
き、希釈倍率を考慮すると、０．３３５が得られた。
μｌを取り、５０μｌの２０％オクチルグルコシド溶液
５μｌを加え、水浴型超音波発振装置で１分間処理す
る。その後、２４０ｎｍでの吸光度を測定し、リポソー
ムを含まない場合の吸光度０．０４８９を引くと、０．
２５が得られた。この系では、蛋白質と脂質の比が１２
０：１であり、脂質の量に比べて蛋白質の量がこの測定
法では無視できる程度に少ないと見なすことができる。
従って、 ０．２５＝０．４００×１０-3ｘ ｘ＝６２５（μｇ／ｍｌ） 次にＬｏｗｒｙ法で定量した。脂質定量に用いた未知試
料としてのプロテオリポソームの溶液１００μｌに１０
ｍＭ塩化カリウム水溶液を加えて最終容量２５０μｌに
する。これにアルカリ性銅溶液５００μｌを加え、室温
で１５分放置した後、１００μｌのフェノール試薬を加
えて、室温で３０分放置した後、７５０ｎｍの吸光度を
測定した。その結果からコントロールの０．０５８を引
き、希釈倍率を考慮すると、０．３３５が得られた。
【００８２】 ０．３３５＝３．０３ｘ１０-4ｘ＋２．９９ｘ１０-2ｙ この式にｘの値として６２５μｇを代入して、ｙを求め
ると、蛋白質量は４．９０（μｇ／ｍｌ）であることが
わかった。この値は、最初に加えた脂質量６００μｇと
蛋白質５μｇとほぼ一致している。
ると、蛋白質量は４．９０（μｇ／ｍｌ）であることが
わかった。この値は、最初に加えた脂質量６００μｇと
蛋白質５μｇとほぼ一致している。
【００８３】実施例５ 先ず２４０ｎｍおよびＢＣＡ法での脂質のみと蛋白質の
みの検量線を作成する。大豆リン脂質懸濁液（アゾレク
チン、１５ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌから１０μｌずつ
１０μｌまで異なる１０種類を試験管に取り、そこに２
０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水
溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加える。また、脂質
を含まない試料も盲検用として準備する。次に各試料の
最終容量が１ｍｌになるように１０ｍＭ塩化カリウムを
加えて水浴型超音波発振装置で１分間処理し、光路長１
ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの吸光度を測定する。そ
の値から脂質を含まない場合の吸光度０．０４８９を減
じ、脂質の終濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロ
ットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、その傾
きａ1 は０．４００×１０-3となった。従って、未知試
料の脂質終濃度をｘ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡL ＝０．４００×１０-3ｘ となる。
みの検量線を作成する。大豆リン脂質懸濁液（アゾレク
チン、１５ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌから１０μｌずつ
１０μｌまで異なる１０種類を試験管に取り、そこに２
０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水
溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加える。また、脂質
を含まない試料も盲検用として準備する。次に各試料の
最終容量が１ｍｌになるように１０ｍＭ塩化カリウムを
加えて水浴型超音波発振装置で１分間処理し、光路長１
ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの吸光度を測定する。そ
の値から脂質を含まない場合の吸光度０．０４８９を減
じ、脂質の終濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロ
ットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、その傾
きａ1 は０．４００×１０-3となった。従って、未知試
料の脂質終濃度をｘ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡL ＝０．４００×１０-3ｘ となる。
【００８４】蛋白質としては、濃度未知試料に組み込む
ものと同じものを使用する。例えば、本実施例では、膜
蛋白質であるバクテリオロドプシンを用いる。この蛋白
質は、高度好塩菌Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌ
ｏｂｉｕｍより紫膜を抽出し、［Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ，ｖｏｌ．３１，ｐ６６７−７８（１９７
４）］さらにＫ．−Ｓ．Ｈｕａｎｇらの方法［Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，ｖｏｌ．
７７，ｐ３２３（１９８０）］を用いて、紫膜を脱脂質
して得たものである。
ものと同じものを使用する。例えば、本実施例では、膜
蛋白質であるバクテリオロドプシンを用いる。この蛋白
質は、高度好塩菌Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌ
ｏｂｉｕｍより紫膜を抽出し、［Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ，ｖｏｌ．３１，ｐ６６７−７８（１９７
４）］さらにＫ．−Ｓ．Ｈｕａｎｇらの方法［Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，ｖｏｌ．
７７，ｐ３２３（１９８０）］を用いて、紫膜を脱脂質
して得たものである。
【００８５】上述の方法で得たバクテリオロドプシンを
１０ｍＭ塩化カリウム水溶液に１ｍｇ／ｍｌで懸濁す
る。それを２０μｌから２．５μｌずつ２．５μｌまで
８種類を試験管に分取する。そこに２０％オクチルグル
コシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液５０μｌをそ
れぞれの試験管に加える。次に各試料の最終溶液が１ｍ
ｌになるように１０ｍＭ塩化カリウムを加えて十分混和
して、水浴型超音波発振装置で１分間処理し、光路長１
ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの吸光度を測定する。そ
の値から蛋白質を含まない場合の吸光度０．０４８９を
減じ、蛋白質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプ
ロットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、その
傾きｂ1 は２．７０ｘ１０-3となった。従って、未知試
料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡP ＝２．７０ｘ１０-3ｙ となる。
１０ｍＭ塩化カリウム水溶液に１ｍｇ／ｍｌで懸濁す
る。それを２０μｌから２．５μｌずつ２．５μｌまで
８種類を試験管に分取する。そこに２０％オクチルグル
コシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液５０μｌをそ
れぞれの試験管に加える。次に各試料の最終溶液が１ｍ
ｌになるように１０ｍＭ塩化カリウムを加えて十分混和
して、水浴型超音波発振装置で１分間処理し、光路長１
ｃｍのセルを用いて２４０ｎｍの吸光度を測定する。そ
の値から蛋白質を含まない場合の吸光度０．０４８９を
減じ、蛋白質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプ
ロットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、その
傾きｂ1 は２．７０ｘ１０-3となった。従って、未知試
料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＡP ＝２．７０ｘ１０-3ｙ となる。
【００８６】次にＢＣＡ法で脂質と蛋白質の検量線を作
製した。上記の方法で作製した脂質懸濁液を５０μｌか
ら５μｌまで５μｌずつ１０種類を試験管に取り、各試
験管に２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カ
リウム水溶液５０μｌを加える。次に各試料の最終容量
が１ｍｌになるように１０ｍＭ塩化カリウムを加える。
また、脂質を含まない試料も盲検用として準備する。各
試験管に試料と等量のＢＣＡ呈色試薬を加え、６０分、
６０℃にて反応させた後、冷却して室温にて５６２ｎｍ
での吸光度を測定した。脂質を含まない場合の吸光度
０．５３３を減じ、脂質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸
にとってプロットするとこれらの点は原点を通る直線に
のり、その傾きａ2 は３．８９ｘ１０-2となった。従っ
て、未知試料の脂質終濃度をｘ（μｇ／ｍｌ）とする
と、 ＢL ＝３．８９ｘ１０-2ｘ となる。
製した。上記の方法で作製した脂質懸濁液を５０μｌか
ら５μｌまで５μｌずつ１０種類を試験管に取り、各試
験管に２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カ
リウム水溶液５０μｌを加える。次に各試料の最終容量
が１ｍｌになるように１０ｍＭ塩化カリウムを加える。
また、脂質を含まない試料も盲検用として準備する。各
試験管に試料と等量のＢＣＡ呈色試薬を加え、６０分、
６０℃にて反応させた後、冷却して室温にて５６２ｎｍ
での吸光度を測定した。脂質を含まない場合の吸光度
０．５３３を減じ、脂質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸
にとってプロットするとこれらの点は原点を通る直線に
のり、その傾きａ2 は３．８９ｘ１０-2となった。従っ
て、未知試料の脂質終濃度をｘ（μｇ／ｍｌ）とする
と、 ＢL ＝３．８９ｘ１０-2ｘ となる。
【００８７】吸光度法の場合と同様な方法でバクテリオ
ロドプシンの８種類の試料を用意し、最終容量を１ｍｌ
とする。各試験管に試料と等量のＢＣＡ呈色試薬を加
え、６０分、６０℃にて反応させた後、冷却して室温に
て５６２ｎｍでの吸光度を測定した。バクテリオロドプ
シンを含まない場合の吸光度０．５３３を減じ、バクテ
リオロドプシンの濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとって
プロットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、そ
の傾きｂ2 は９．６３ｘ１０-2となった。従って、未知
試料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢP ＝９．６３ｘ１０-2ｙ となる。
ロドプシンの８種類の試料を用意し、最終容量を１ｍｌ
とする。各試験管に試料と等量のＢＣＡ呈色試薬を加
え、６０分、６０℃にて反応させた後、冷却して室温に
て５６２ｎｍでの吸光度を測定した。バクテリオロドプ
シンを含まない場合の吸光度０．５３３を減じ、バクテ
リオロドプシンの濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとって
プロットするとこれらの点は原点を通る直線にのり、そ
の傾きｂ2 は９．６３ｘ１０-2となった。従って、未知
試料の蛋白質終濃度をｙ（μｇ／ｍｌ）とすると、 ＢP ＝９．６３ｘ１０-2ｙ となる。
【００８８】次に未知試料としてのＬＢ累積膜を調整す
る。大豆リン脂質（アゾレクチン、１５ｍｇ／ｍｌ）ク
ロロホルム溶液を直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍの試験
管に１ｍｌ入れ、ロータリーエバポレーターを用いて溶
媒を留去した後、デシケーターに入れ真空ポンプを用い
て溶媒を完全に除き、試験管内壁に脂質薄膜を形成させ
る。１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を１ｍｌ加え、ｖｏｒ
ｔｅｘミキサーで３０秒処理して脂質薄膜を分散させた
後、プローブ型超音波発振装置で３０分間処理して直径
１００ｎｍの１枚膜リポソームの懸濁液を得る。このリ
ポソーム懸濁液を膜蛋白質であるバクテリオロドプシン
３ｍｇを加え、水浴型超音波発振装置にて３０秒処理す
る。
る。大豆リン脂質（アゾレクチン、１５ｍｇ／ｍｌ）ク
ロロホルム溶液を直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍの試験
管に１ｍｌ入れ、ロータリーエバポレーターを用いて溶
媒を留去した後、デシケーターに入れ真空ポンプを用い
て溶媒を完全に除き、試験管内壁に脂質薄膜を形成させ
る。１０ｍＭ塩化カリウム水溶液を１ｍｌ加え、ｖｏｒ
ｔｅｘミキサーで３０秒処理して脂質薄膜を分散させた
後、プローブ型超音波発振装置で３０分間処理して直径
１００ｎｍの１枚膜リポソームの懸濁液を得る。このリ
ポソーム懸濁液を膜蛋白質であるバクテリオロドプシン
３ｍｇを加え、水浴型超音波発振装置にて３０秒処理す
る。
【００８９】次に１０ｍＭ塩化カリウムおよび２０ｍＭ
塩化カルシウム水溶液が入っているＬＢ累積膜作成用ト
ラフにリポソーム懸濁液を１００μｌ滴下し、３０分間
静かに攪拌する。この操作によって、気液界面にてバク
テリオロドプシンを含むリポソーム懸濁液が単分子膜状
に開裂展開する。次にこの展開相が水槽上を自由に拡散
し広がりすぎないように仕切り板もしくは浮き子を設
け、展開膜の展開面積を制限して膜を適切な表面圧に維
持する。この表面圧を維持しながら清浄な基盤（４５ｍ
ｍ角ガラス基盤：親水処理済コーニング＃７０５９）を
静かに垂直に浸漬して下降または上昇を繰り返す。この
方法だと、脂質膜の親水基・疎水基の方向が基盤の上昇
行程と下降行程で逆になるので、累積膜の各層間は脂質
の疎水部分どうし、親水部分どうしが向かい合う“Ｙ型
膜”が形成される。単分子膜にして２００層すなわち２
分子膜にして１００層累積する。同様の基盤を４枚作成
する。基盤を静かに引上げて１％オクチルグルコシドを
含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液０．２ｍｌに浸漬し、
静かに６０分、室温にて攪拌する（４枚とも）。続けて
水浴型超音波発振装置で１分間処理する。その後溶液の
みを０．２ｍｌ取り、２４０ｎｍでの吸光度を測定し、
脂質・蛋白質を含まない場合の吸光度０．０４９８を引
き、希釈倍率を考慮すると、０．２１２が得られた。つ
まり、（３）式が成立する。
塩化カルシウム水溶液が入っているＬＢ累積膜作成用ト
ラフにリポソーム懸濁液を１００μｌ滴下し、３０分間
静かに攪拌する。この操作によって、気液界面にてバク
テリオロドプシンを含むリポソーム懸濁液が単分子膜状
に開裂展開する。次にこの展開相が水槽上を自由に拡散
し広がりすぎないように仕切り板もしくは浮き子を設
け、展開膜の展開面積を制限して膜を適切な表面圧に維
持する。この表面圧を維持しながら清浄な基盤（４５ｍ
ｍ角ガラス基盤：親水処理済コーニング＃７０５９）を
静かに垂直に浸漬して下降または上昇を繰り返す。この
方法だと、脂質膜の親水基・疎水基の方向が基盤の上昇
行程と下降行程で逆になるので、累積膜の各層間は脂質
の疎水部分どうし、親水部分どうしが向かい合う“Ｙ型
膜”が形成される。単分子膜にして２００層すなわち２
分子膜にして１００層累積する。同様の基盤を４枚作成
する。基盤を静かに引上げて１％オクチルグルコシドを
含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液０．２ｍｌに浸漬し、
静かに６０分、室温にて攪拌する（４枚とも）。続けて
水浴型超音波発振装置で１分間処理する。その後溶液の
みを０．２ｍｌ取り、２４０ｎｍでの吸光度を測定し、
脂質・蛋白質を含まない場合の吸光度０．０４９８を引
き、希釈倍率を考慮すると、０．２１２が得られた。つ
まり、（３）式が成立する。
【００９０】 ０．２１２＝０．４００×１０-3ｘ＋２．７０×１０-3ｙ（３） 次にＢＣＡ法で定量した。上記の方法で吸光度を測定し
た未知試料を更に５倍に希釈して１％オクチルグルコシ
ド−１０ｍＭ塩化カリウム水溶液とする。試料と等量の
ＢＣＡ呈色試薬を加え、６０分、６０℃にて反応させた
後、冷却して室温にて５６２ｎｍでの吸光度を測定し
た。試料を含まない場合の吸光度０．５３３を引くと、
１．３１が得られた。つまり希釈倍率を考慮して（４）
式が成立する。
た未知試料を更に５倍に希釈して１％オクチルグルコシ
ド−１０ｍＭ塩化カリウム水溶液とする。試料と等量の
ＢＣＡ呈色試薬を加え、６０分、６０℃にて反応させた
後、冷却して室温にて５６２ｎｍでの吸光度を測定し
た。試料を含まない場合の吸光度０．５３３を引くと、
１．３１が得られた。つまり希釈倍率を考慮して（４）
式が成立する。
【００９１】 １．３１×１０-3＝３．８９×１０-2ｘ＋９．６３×１０-2ｙ（４） 試料の希釈倍率を考慮し、得られた２式からｘおよび、
ｙを求めると、ｘすなわち脂質量は２２５（μｇ／ｍ
ｌ）、ｙすなわち蛋白質量は４５（μｇ／ｍｌ）である
ことがわかった。この量はＬＢ累積膜作製時の脂質量と
蛋白質量の比（１５ｍｇ：３ｍｇ）と一致している。
ｙを求めると、ｘすなわち脂質量は２２５（μｇ／ｍ
ｌ）、ｙすなわち蛋白質量は４５（μｇ／ｍｌ）である
ことがわかった。この量はＬＢ累積膜作製時の脂質量と
蛋白質量の比（１５ｍｇ：３ｍｇ）と一致している。
【００９２】実施例６ 本実施例では、モルモット肝臓細胞のミトコンドリアに
ついて脂質量と蛋白質量を定量する。本実施例では、ま
ず、既知量の脂質、蛋白質で検量線を作成しなければな
らないが、ミトコンドリアのように生体成分を未知試料
として分析する場合、脂質組成や蛋白質組成は、まった
く判明していないことが多い。したがって、未知試料と
同じ脂質、蛋白質を用いての検量線作成は難しいことに
なる。そこで、ここでは、一般に市販されている脂質、
蛋白質をもちいて検量線を作成し、従来法による文献値
と比較して、その精度を検定する意味もあって、ミトコ
ンドリア試料の脂質量、蛋白質量を近似定量することと
した。脂質と蛋白質の検量線用試料としては、大豆リン
脂質（アゾレクチン）とＢＳＡ（牛血清アルブミン）を
使用する。
ついて脂質量と蛋白質量を定量する。本実施例では、ま
ず、既知量の脂質、蛋白質で検量線を作成しなければな
らないが、ミトコンドリアのように生体成分を未知試料
として分析する場合、脂質組成や蛋白質組成は、まった
く判明していないことが多い。したがって、未知試料と
同じ脂質、蛋白質を用いての検量線作成は難しいことに
なる。そこで、ここでは、一般に市販されている脂質、
蛋白質をもちいて検量線を作成し、従来法による文献値
と比較して、その精度を検定する意味もあって、ミトコ
ンドリア試料の脂質量、蛋白質量を近似定量することと
した。脂質と蛋白質の検量線用試料としては、大豆リン
脂質（アゾレクチン）とＢＳＡ（牛血清アルブミン）を
使用する。
【００９３】まず、大豆リン脂質を用いて脂質の検量線
を作成する。脂質重量３ｍｇに相当する大豆リン脂質の
クロロホルム溶液を試験管にとり、ロータリーエバポレ
ーターを用いて溶媒を留去した後、真空ポンプで溶媒を
完全に除く。これに、１０ｍＭ塩化カリウム（ｐ．Ｈ．
５．６）、１％オクチルグルコシドを含む溶液を１ｍｌ
加え、よく溶かす。
を作成する。脂質重量３ｍｇに相当する大豆リン脂質の
クロロホルム溶液を試験管にとり、ロータリーエバポレ
ーターを用いて溶媒を留去した後、真空ポンプで溶媒を
完全に除く。これに、１０ｍＭ塩化カリウム（ｐ．Ｈ．
５．６）、１％オクチルグルコシドを含む溶液を１ｍｌ
加え、よく溶かす。
【００９４】この試料の内、０．５ｍｌをＢＣＡ法の検
量線用に分取する。分取した試料を１％オクチルグコシ
ドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液で５０倍に希釈
し、この溶をさらに何段階かに希釈したものを試料とす
る。これに等量のＢＣＡ呈色液を加え、混合した後、６
０℃、６０分間加温する。加温後、室温まで冷却してか
ら、光路長１ｃｍのセルを用いて、５６２ｎｍ吸光度を
測定する。その値から脂質を含まない場合の吸光度を減
じ、脂質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロッ
トすると、これらの点は、原点を通る直線にのり、その
傾き、ａ1 は、３．８９×１０-2となった。つまり、未
知試料の脂質濃度をｘ（ｍｇ／ｍｌ）とすると、 ＡL ＝３．８９×１０-2ｘ となる。
量線用に分取する。分取した試料を１％オクチルグコシ
ドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液で５０倍に希釈
し、この溶をさらに何段階かに希釈したものを試料とす
る。これに等量のＢＣＡ呈色液を加え、混合した後、６
０℃、６０分間加温する。加温後、室温まで冷却してか
ら、光路長１ｃｍのセルを用いて、５６２ｎｍ吸光度を
測定する。その値から脂質を含まない場合の吸光度を減
じ、脂質の濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとってプロッ
トすると、これらの点は、原点を通る直線にのり、その
傾き、ａ1 は、３．８９×１０-2となった。つまり、未
知試料の脂質濃度をｘ（ｍｇ／ｍｌ）とすると、 ＡL ＝３．８９×１０-2ｘ となる。
【００９５】残り０．５ｍｌの試料を何段階かに希釈し
て試料し、Ｌｏｗｒｙ法の検量線を作成する。試料の
２．０倍のアルカリ性銅溶液を加え、１５分間、室温で
放置する。その後、試料の０．４倍のフェノール試薬
（市販品を水で２倍に希釈したもの）を加え、３０分
間、室温放置後、ＢＣＡ法と同様の方法で７５０ｎｍの
吸光度を測定し、プロットすると、その傾き、ａ2 は、
３．０３×１０-4となった。したがって、ＢL は、次式
で表される。
て試料し、Ｌｏｗｒｙ法の検量線を作成する。試料の
２．０倍のアルカリ性銅溶液を加え、１５分間、室温で
放置する。その後、試料の０．４倍のフェノール試薬
（市販品を水で２倍に希釈したもの）を加え、３０分
間、室温放置後、ＢＣＡ法と同様の方法で７５０ｎｍの
吸光度を測定し、プロットすると、その傾き、ａ2 は、
３．０３×１０-4となった。したがって、ＢL は、次式
で表される。
【００９６】ＢL ＝３．０３×１０-4ｘ 次に、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を用いて、蛋白質の
検量線を作成する。この牛血清アルブミンを、５０μｇ
／ｍｌとなるように調整し、さらにこれを何段階かに希
釈して検量線作成用の試料とする。これを脂質の場合と
同じように、最終濃度１０ｍＭ塩化カリウム、１％オク
チルグルコシドになるように調整し、ＢＣＡ法、Ｌｏｗ
ｒｙ法で呈色反応を行い、吸光度を測定する。プロット
の結果、ｂ1 、ｂ2 は、それぞれ、９．６３×１０-2、
２．９９×１０-2となった。つまり、 ＡP ＝９．６３×１０-2ｙ ＢP ＝２．９９×１０-2ｙ となった。
検量線を作成する。この牛血清アルブミンを、５０μｇ
／ｍｌとなるように調整し、さらにこれを何段階かに希
釈して検量線作成用の試料とする。これを脂質の場合と
同じように、最終濃度１０ｍＭ塩化カリウム、１％オク
チルグルコシドになるように調整し、ＢＣＡ法、Ｌｏｗ
ｒｙ法で呈色反応を行い、吸光度を測定する。プロット
の結果、ｂ1 、ｂ2 は、それぞれ、９．６３×１０-2、
２．９９×１０-2となった。つまり、 ＡP ＝９．６３×１０-2ｙ ＢP ＝２．９９×１０-2ｙ となった。
【００９７】よって、ＡL+P 、ＢL+P は、次式で表され
る。
る。
【００９８】 ＡL+P ＝３．８９×１０-2ｘ＋９．６３×１０-2ｙ（３） ＢL+P ＝３．０３×１０-4ｘ＋２．９９×１０-2ｙ（４） 次に、未知試料であるミトコンドリアをモルモットの肝
細胞から調整する。まず、モルモットの肝臓をなるべく
周囲の組織が混入しないように取り出す。２５０ｍＭ蔗
糖液中でかるく洗い、はさみで細切した後、ガラス製ホ
モジナイザーで処理し、最終的には、１０倍量の２５０
ｍＭ蔗糖液を加えて１０％懸濁液をつくる。この懸濁液
を、まず、６００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をさ
らに、５５００×ｇ、２０分間遠心して沈殿を集める。
沈殿を２５０ｍＭの蔗糖液に再懸濁し、今度は、６００
０×ｇ、１５分間の遠心で沈殿を集める。もう一度６０
００×ｇ、１５分の遠心を繰り返してミトコンドリア画
分とする。沈殿したミトコンドリアに、もとの肝細胞１
ｇにつき１０ｍｌの割合で１０ｍＭ塩化カリウム、１％
オクチルグルコシド溶液を加え、よく攪拌して溶かす。
必要なら水浴型超音波発振装置で処理し、完全に溶解
し、未知試料とする。
細胞から調整する。まず、モルモットの肝臓をなるべく
周囲の組織が混入しないように取り出す。２５０ｍＭ蔗
糖液中でかるく洗い、はさみで細切した後、ガラス製ホ
モジナイザーで処理し、最終的には、１０倍量の２５０
ｍＭ蔗糖液を加えて１０％懸濁液をつくる。この懸濁液
を、まず、６００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をさ
らに、５５００×ｇ、２０分間遠心して沈殿を集める。
沈殿を２５０ｍＭの蔗糖液に再懸濁し、今度は、６００
０×ｇ、１５分間の遠心で沈殿を集める。もう一度６０
００×ｇ、１５分の遠心を繰り返してミトコンドリア画
分とする。沈殿したミトコンドリアに、もとの肝細胞１
ｇにつき１０ｍｌの割合で１０ｍＭ塩化カリウム、１％
オクチルグルコシド溶液を加え、よく攪拌して溶かす。
必要なら水浴型超音波発振装置で処理し、完全に溶解
し、未知試料とする。
【００９９】この試料を、１０ｍＭ塩化カリウム、１％
オクチルグルコシド溶液で１００倍希釈した後、０．５
ｍｌの試料をＢＣＡ法で測定した。試料を含まない場合
の吸光度０．５３３を減じた吸光度、ＡL+P は、１．２
３であった。つまり、 １．２３×２００＝３．８９×１０-2ｘ＋９．６３＋１０-2ｙ（５） が成立する。左辺を２００倍したのは、希釈率を考慮し
たものである。
オクチルグルコシド溶液で１００倍希釈した後、０．５
ｍｌの試料をＢＣＡ法で測定した。試料を含まない場合
の吸光度０．５３３を減じた吸光度、ＡL+P は、１．２
３であった。つまり、 １．２３×２００＝３．８９×１０-2ｘ＋９．６３＋１０-2ｙ（５） が成立する。左辺を２００倍したのは、希釈率を考慮し
たものである。
【０１００】未知試料を３０倍希釈した後、０．５ｍｌ
を用いてＬｏｗｒｙ法の測定を行い、ＢＣＡ法と同様に
脂質を含まない場合の吸光度０．０５８を減じると、Ｂ
L+Pは、１．２０であった。つまり、次式が成立する。 １．２０×６０＝３．０３×１０-4ｘ＋２．９９×１０-2ｙ（６） （５）、（６）式を連立方程式として、ｘ、ｙを求める
と、 ｘ＝３．７１×１０2 ｙ＝２．４０×１０3 となる。
を用いてＬｏｗｒｙ法の測定を行い、ＢＣＡ法と同様に
脂質を含まない場合の吸光度０．０５８を減じると、Ｂ
L+Pは、１．２０であった。つまり、次式が成立する。 １．２０×６０＝３．０３×１０-4ｘ＋２．９９×１０-2ｙ（６） （５）、（６）式を連立方程式として、ｘ、ｙを求める
と、 ｘ＝３．７１×１０2 ｙ＝２．４０×１０3 となる。
【０１０１】脂質／蛋白質比は、およそ、１：６．４３
となり、肝細胞１ｇ当たり２４ｍｇのミトコンドリア蛋
白質があったことになる。この量は、従来の文献値（モ
ルモット肝細胞の全ミトコンドリア脂質／蛋白質比１：
６．３０、蛋白質量は、肝細胞１ｇ当たり１５−３０ｍ
ｇ）とほぼ一致する。
となり、肝細胞１ｇ当たり２４ｍｇのミトコンドリア蛋
白質があったことになる。この量は、従来の文献値（モ
ルモット肝細胞の全ミトコンドリア脂質／蛋白質比１：
６．３０、蛋白質量は、肝細胞１ｇ当たり１５−３０ｍ
ｇ）とほぼ一致する。
【０１０２】実施例７ 最初に、それぞれの方法で脂質の検量線を作成するため
の試料を作製する。直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程度
の試験管に脂質重量１５ｍｇに相当する大豆リン脂質
（アゾレクチン）のクロロホルム溶液を入れ、ロータリ
ーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、真空ポン
プを用いて溶媒を完全に除く。塩酸または水酸化カリウ
ムでｐＨ．５．６に調整した１０ｍＭ塩化カリウム水溶
液を１ｍｌ加え、ｖｏｌｔｅｘミキサーで３０秒処理し
て脂質薄膜を分散させた後、プローブ型超音波発振装置
で３０分間処理して直径１００ｎｍの一枚膜のリポソー
ムの懸濁液を得る。
の試料を作製する。直径１０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ程度
の試験管に脂質重量１５ｍｇに相当する大豆リン脂質
（アゾレクチン）のクロロホルム溶液を入れ、ロータリ
ーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、真空ポン
プを用いて溶媒を完全に除く。塩酸または水酸化カリウ
ムでｐＨ．５．６に調整した１０ｍＭ塩化カリウム水溶
液を１ｍｌ加え、ｖｏｌｔｅｘミキサーで３０秒処理し
て脂質薄膜を分散させた後、プローブ型超音波発振装置
で３０分間処理して直径１００ｎｍの一枚膜のリポソー
ムの懸濁液を得る。
【０１０３】１００μｌから１０μｌまでの容量の異な
るいくつかのリポソーム懸濁液を試験管に取り、そこに
２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム
水溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加える。また、リ
ポソームを含まない試料もコントロールとして準備す
る。次に、各試料の最終容量が１ｍｌになるように１０
ｍＭ塩化カリウム水溶液を加え、水浴型超音波発振装置
で１分間処理する。
るいくつかのリポソーム懸濁液を試験管に取り、そこに
２０％オクチルグルコシドを含む１０ｍＭ塩化カリウム
水溶液５０μｌをそれぞれの試験管に加える。また、リ
ポソームを含まない試料もコントロールとして準備す
る。次に、各試料の最終容量が１ｍｌになるように１０
ｍＭ塩化カリウム水溶液を加え、水浴型超音波発振装置
で１分間処理する。
【０１０４】この試料の内、０．５ｍｌをＢＣＡ法の検
量線用に分取する。分取した試料を１％オクチルグコシ
ドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液で３０倍に希釈
し、その内の０．５ｍｌに等量のＢＣＡ呈色液を加え、
混合した後、６０℃、６０分間加温する。加温後、室温
まで冷却してから、光路長１ｃｍのセルを用いて、５６
２ｎｍ吸光度を測定する。その値からリポソームを含ま
ない場合の吸光度を減じ、リポソームの濃度を横軸に、
吸光度を縦軸にとってプロットすると、これらの点は、
原点を通る直線にのり、その傾き、ａ1 は、３．８９×
１０-2となった。したがって、未知試料の脂質濃度をｘ
（ｍｇ／ｍｌ）とすると、 ＡL ＝３．８９×１０-2ｘ となる。
量線用に分取する。分取した試料を１％オクチルグコシ
ドを含む１０ｍＭ塩化カリウム水溶液で３０倍に希釈
し、その内の０．５ｍｌに等量のＢＣＡ呈色液を加え、
混合した後、６０℃、６０分間加温する。加温後、室温
まで冷却してから、光路長１ｃｍのセルを用いて、５６
２ｎｍ吸光度を測定する。その値からリポソームを含ま
ない場合の吸光度を減じ、リポソームの濃度を横軸に、
吸光度を縦軸にとってプロットすると、これらの点は、
原点を通る直線にのり、その傾き、ａ1 は、３．８９×
１０-2となった。したがって、未知試料の脂質濃度をｘ
（ｍｇ／ｍｌ）とすると、 ＡL ＝３．８９×１０-2ｘ となる。
【０１０５】次に、残り０．５ｍｌの試料を用いて、Ｌ
ｏｗｒｙ法の検量線を作成する。０．５ｍｌの試料に
１．００ｍｌのアルカリ性銅溶液を加え、１５分間、室
温で放置する。その後、０．２０ｍｌのフェノール試薬
（市販品を水で２倍に希釈したもの）を測定し、プロッ
トすると、その傾き、ａ2 は、３．０３×１０-4となっ
た。したがって、ＢL は、次式で表される。
ｏｗｒｙ法の検量線を作成する。０．５ｍｌの試料に
１．００ｍｌのアルカリ性銅溶液を加え、１５分間、室
温で放置する。その後、０．２０ｍｌのフェノール試薬
（市販品を水で２倍に希釈したもの）を測定し、プロッ
トすると、その傾き、ａ2 は、３．０３×１０-4となっ
た。したがって、ＢL は、次式で表される。
【０１０６】ＢL ＝３．０３×１０-4ｘ 蛋白質の検量線を作成するためには、未知試料に組み込
んだものと同じものを使用する。本実施例では、実施例
１で用いた膜蛋白質であるバクテリオロドプシンを使用
する。
んだものと同じものを使用する。本実施例では、実施例
１で用いた膜蛋白質であるバクテリオロドプシンを使用
する。
【０１０７】このバクテリオロドプシンを、２０μｇ／
ｍｌとなるように調整し、さらにこれを何段階かに希釈
して検量線作成用の試料とする。これを脂質の場合と同
じように、最終濃度１０ｍＭ塩化カリウム、１％オクチ
ルグルコシドになるように調整し、ＢＣＡ法、Ｌｏｗｒ
ｙ法で呈色反応を行い、吸光度を測定する。プロットの
結果、ｂ1 、ｂ2 は、それぞれ、９．６３×１０-2、
２．９９×１０-2となった。つまり、 ＡP ＝９．６３×１０-2ｙ ＢP ＝２．９９×１０-2ｙ となった。よって、ＡL+P 、ＢL+P は、次式で表され
る。 ＡL+P ＝３．８９×１０-2ｘ＋９．６３×１０-2ｙ（３） ＢL+P ＝３．０３×１０-4ｘ＋２．９９×１０-2ｙ（４） 次に、未知試料としてのプロテオリポソームを調整す
る。前述の方法に従いリポソームの懸濁液（脂質量、１
５ｍｇ／ｍｌ）を得る。この懸濁液を１０ｍＭ塩化カリ
ウム水溶液で１０倍に希釈したうえで、３００μｌ（脂
質量、４５０μｇ）を分取し、バクテリオロドプシン、
４５μｇを加える。水浴型超音波発振装置で３０秒処理
した後、室温で２時間ゆっくり攪拌する。このプロテオ
リポソーム懸濁液を、容量１ｍｌ、最終濃度１０ｍＭ塩
化カリウム、１％オクチルグルコシドとなるように調整
し、水浴型超音波発振装置で１分間処理する。
ｍｌとなるように調整し、さらにこれを何段階かに希釈
して検量線作成用の試料とする。これを脂質の場合と同
じように、最終濃度１０ｍＭ塩化カリウム、１％オクチ
ルグルコシドになるように調整し、ＢＣＡ法、Ｌｏｗｒ
ｙ法で呈色反応を行い、吸光度を測定する。プロットの
結果、ｂ1 、ｂ2 は、それぞれ、９．６３×１０-2、
２．９９×１０-2となった。つまり、 ＡP ＝９．６３×１０-2ｙ ＢP ＝２．９９×１０-2ｙ となった。よって、ＡL+P 、ＢL+P は、次式で表され
る。 ＡL+P ＝３．８９×１０-2ｘ＋９．６３×１０-2ｙ（３） ＢL+P ＝３．０３×１０-4ｘ＋２．９９×１０-2ｙ（４） 次に、未知試料としてのプロテオリポソームを調整す
る。前述の方法に従いリポソームの懸濁液（脂質量、１
５ｍｇ／ｍｌ）を得る。この懸濁液を１０ｍＭ塩化カリ
ウム水溶液で１０倍に希釈したうえで、３００μｌ（脂
質量、４５０μｇ）を分取し、バクテリオロドプシン、
４５μｇを加える。水浴型超音波発振装置で３０秒処理
した後、室温で２時間ゆっくり攪拌する。このプロテオ
リポソーム懸濁液を、容量１ｍｌ、最終濃度１０ｍＭ塩
化カリウム、１％オクチルグルコシドとなるように調整
し、水浴型超音波発振装置で１分間処理する。
【０１０８】この未知試料の内、５０μｌを分取し、１
０ｍＭ塩化カリウム、１％オクチルグルコシド溶液で希
釈後、ＢＣＡ法で測定した。プロテオリポソームを含ま
ない場合の吸光度０．５３３を減じた吸光度、ＡL+P
は、１．０９であった。つまり、 １．０９×２０＝３．８９×１０-2ｘ＋９．６３＋１０-2ｙ（５） が成立する。左辺を２０倍したのは、希釈率を考慮した
ものである。
０ｍＭ塩化カリウム、１％オクチルグルコシド溶液で希
釈後、ＢＣＡ法で測定した。プロテオリポソームを含ま
ない場合の吸光度０．５３３を減じた吸光度、ＡL+P
は、１．０９であった。つまり、 １．０９×２０＝３．８９×１０-2ｘ＋９．６３＋１０-2ｙ（５） が成立する。左辺を２０倍したのは、希釈率を考慮した
ものである。
【０１０９】残りの未知試料の内、０．５ｍｌを用いて
Ｌｏｗｒｙ法の測定を行い、ＢＣＡ法と同様にプロテオ
リポソームを含まない場合の吸光度０．０５８を減じる
と、ＢL+P は、０．７４３であった。つまり、次式が成
立する。
Ｌｏｗｒｙ法の測定を行い、ＢＣＡ法と同様にプロテオ
リポソームを含まない場合の吸光度０．０５８を減じる
と、ＢL+P は、０．７４３であった。つまり、次式が成
立する。
【０１１０】 ０．７４３×２＝３．０３×１０-4ｘ＋２．９９×１０-2ｙ（６） （５）、（６）式を連立方程式として、ｘ、ｙを求める
と、 ｘ＝４４９ ｙ＝４５ となる。この量は、プロテオリポソーム調整時の脂質量
４５０μｇ、蛋白質量４５μｇと一致している。
と、 ｘ＝４４９ ｙ＝４５ となる。この量は、プロテオリポソーム調整時の脂質量
４５０μｇ、蛋白質量４５μｇと一致している。
【０１１１】
【発明の効果】本発明によれば、脂質と蛋白質のような
共存状態ではこれらが互いに影響し合って定量できなか
った２成分系の定量分析が、抽出などの煩雑な操作を必
要とする分離工程なしに、混在状態のまま直接、かつ簡
便にそれぞれ正確に定量できるようになった。
共存状態ではこれらが互いに影響し合って定量できなか
った２成分系の定量分析が、抽出などの煩雑な操作を必
要とする分離工程なしに、混在状態のまま直接、かつ簡
便にそれぞれ正確に定量できるようになった。
フロントページの続き (72)発明者 川口 正浩 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (72)発明者 大山 淳史 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (56)参考文献 特開 平２−59669（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/68 G01N 21/75 G01N 33/92
Claims (15)
- 【請求項１】 液媒体中に化合物Ａ、Ｂを含む未知試料
を定量法ａで分析して分析値Ｖａを得る過程と、該未知
試料を定量法ｂで分析して分析値Ｖｂを得る過程と、下
記式（Ｉ）及び（II）から化合物Ａ、Ｂのそれぞれの実
際の濃度（ｘ、ｙ）を求める過程 Ｖａ＝ｘ・ａ1＋ｙ・ａ2 ・・・（Ｉ） Ｖｂ＝ｘ・ｂ1＋ｙ・ｂ2 ・・・（II） ａ1：液媒体中に化合物Ａが単独で存在する場合の定量
法ａにおける濃度定数 ａ2：液媒体中に化合物Ｂが単独で存在する場合の定量
法ａにおける濃度定数 ｂ1：液媒体中に化合物Ａが単独で存在する場合の定量
法ｂにおける濃度定数 ｂ2：液媒体中に化合物Ｂが単独で存在する場合の定量
法ｂにおける濃度定数 ｘ：未知試料中の化合物Ａの実際の濃度 ｙ：未知試料中の化合物Ｂの実際の濃度 とを有することを特徴とする定量法。 - 【請求項２】 化合物Ａが脂質で、化合物Ｂが蛋白質で
ある請求項１記載の定量法。 - 【請求項３】 定量法ａが化合物自体の吸光度を測定す
る方法であり、定量法ｂが発色を利用した方法である請
求項１または２記載の定量法。 - 【請求項４】 定量法ａが試料を界面活性剤で可溶化し
た後、紫外部の吸光度を測定する方法であり、定量法ｂ
がローリー（Ｌｏｗｒｙ）法である請求項３記載の定量
法。 - 【請求項５】 定量法ａが試料を界面活性剤で可溶化し
た後、紫外部の吸光度を測定する方法であり、定量法ｂ
がＢＣＡ法である請求項３記載の定量法。 - 【請求項６】 定量法ａ及びｂが発色を利用した方法で
ある請求項１または２記載の定量法。 - 【請求項７】 定量法ａがＢＣＡ法であり、定量法ｂが
ローリー法である請求項５記載の定量法。 - 【請求項８】 試料がプロテオリポソームである請求項
１〜７のいずれかに記載の定量法。 - 【請求項９】 液体サンプル中に存在する脂質及び蛋白
質の各々を該液体サンプルから分離することなく定量す
る方法であって、 （ｉ）脂質について、濃度が既知であって且つ異なる濃
度を有する第１の液体標準サンプル群を用意し、該第１
の液体標準サンプル群の各々のサンプルの吸光度を、第
１の方法（ａ）を用いて測定し、脂質の標準液体サンプ
ル群の濃度と吸光度の相関を求め、脂質の吸光度係数
（ａ 1 ）を算出する工程； （ii）蛋白質について、濃度が既知であって且つ異なる
濃度を有する第１の液体標準サンプル群を用意し、該第
１の液体標準サンプル群の各々のサンプルの吸光度を、
第１の方法（ａ）を用いて測定し、蛋白質の標準液体サ
ンプル群の濃度と吸光度の相関を求め、蛋白質の吸光度
係数（ａ 2 ）を算出する工程； （iii）脂質について、濃度が既知であって且つ異なる
濃度を有する第２の標準液体サンプル群を用意し、該第
２の液体サンプル群の各々の吸光度を第２の方法（ｂ）
を用いて測定し、脂質の標準液体サンプル群の濃度と吸
光度の相関を求め、脂質の吸光度係数（ｂ 1 ）を算出す
る工程； （iv）蛋白質について、濃度が既知であって且つ異なる
濃度を有する第２の標準液体サンプル群を用意し、該第
２の液体サンプル群の各々の吸光度を第２の方法（ｂ）
を用いて測定し、蛋白質の標準液体サンプル群の濃度と
吸光度の相関を求め、蛋白質の吸光度係数（ｂ 2 ）を算
出する工程；及び （ｖ）脂質及び蛋白質が各々未知の濃度（ｘ、ｙ）にて
共存している液体サンプルを用意し、該第１及び第２の
各々の方法（ａ）及び（ｂ）を用いて該液体サンプルの
吸光度（Ｖａ）及び（Ｖｂ）を測定し、こうして得た値
を下記（Ｉ）及び（II）に示す方程式に代入して該サン
プル中の脂質及び蛋白質の濃度（ｘ、ｙ）を求める工
程、を有し、 Ｖａ＝ｘ・ａ 1 ＋ｙ・ａ 2 ・・・ （Ｉ） Ｖｂ＝ｘ・ｂ 1 ＋ｙ・ｂ 2 ・・・ （II） 該第１の方法（ａ）及び該第２の方法（ｂ）は互いに異
なる方法であり、該第１の方法（ａ）及び第２の方法
（ｂ）の少なくとも一方は、脂質、蛋白質、または脂質
及び蛋白質と、試薬との反応によって呈色させる工程を
含むものであり、更に、 該第１の方法（ａ）及び第２の方法（ｂ）は、サンプル
中に脂質のみ、もしくは蛋白質のみが存在している場合
には該サンプル中の脂質または蛋白質の定量が可能な方
法であることを特徴とする定量法。 - 【請求項１０】 該第１の方法（ａ）が該液体サンプル
を界面活性剤で処理して該液体サンプル中の脂質と該界
面活性剤とのミセル状態を有する試料分散液の紫外部の
吸光度を測定する工程を含む方法であり、該第２の方法
（ｂ）がローリー法である請求項９記載の定量法。 - 【請求項１１】 該第１の方法（ａ）が該液体サンプル
を界面活性剤で処理して該液体サンプル中の脂質と該界
面活性剤とのミセル状態を有する試料分散液の紫外部の
吸光度を測定する工程を含む方法であり、該第２の方法
（ｂ）がＢＣＡ法である請求項９記載の定量法。 - 【請求項１２】 該第１の方法（ａ）がローリー法であ
り、該第２の方法がＢＣＡ法である請求項９記載の定量
法。 - 【請求項１３】 該紫外部が波長２４０ｎｍである請求
項１０または１１記載の定量法。 - 【請求項１４】 該ローリー法が、該液体サンプル、ア
ルカリ性銅溶液、及びフェノール試薬を反応させた後、
該試料溶液の波長７５０ｎｍでの吸光度を測定する工程
を含む請求項１０または１２記載の定量法。 - 【請求項１５】 該ＢＣＡ法が、該液体サンプルを界面
活性剤で処理して該液体サンプル中の脂質と該界面活性
剤とのミセル状態を有する試料分散液、２価の銅イオ
ン、およびビシコニン酸を反応させた後、該試料分散液
の波長５２６ｎｍにおける吸光度を測定する工程を含む
請求項１１または１２記載の定量法。
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23191491A JP2959596B2 (ja) | 1991-09-11 | 1991-09-11 | ２種の化合物の共存系における定量法 |
| EP00107306A EP1022567B1 (en) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitative determination of lipid, and of co-existing two compounds |
| DE69233570T DE69233570T2 (de) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitativer Nachweis von Verbindungen in Coexistenz im System mit anderen Verbindungen |
| EP92115336A EP0531933B1 (en) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitative determination of lipids |
| DE69233452T DE69233452T2 (de) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitativer Nachweis vom Lipid, in reiner Form oder im Komplex mit anderen Verbindungen |
| EP96120379A EP0767384B1 (en) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitative determination compounds coexisting in a system with other compounds |
| AT92115336T ATE155249T1 (de) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitativer nachweis vom lipid |
| DE69220739T DE69220739T2 (de) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitativer Nachweis vom Lipid |
| AT96120379T ATE312353T1 (de) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitativer nachweis von verbindungen in coexistenz im system mit anderen verbindungen |
| AT00107306T ATE284035T1 (de) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitativer nachweis vom lipid, in reiner form oder im komplex mit anderen verbindungen |
| US07/942,417 US5491093A (en) | 1991-09-09 | 1992-09-09 | Quantitative determination of lipid, and of co-existing two compounds |
| US08/458,258 US5770452A (en) | 1991-09-09 | 1995-06-02 | Quantitative determination of lipid, and of co-existing two compounds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23191491A JP2959596B2 (ja) | 1991-09-11 | 1991-09-11 | ２種の化合物の共存系における定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0572209A JPH0572209A (ja) | 1993-03-23 |
| JP2959596B2 true JP2959596B2 (ja) | 1999-10-06 |
Family
ID=16931040
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23191491A Expired - Fee Related JP2959596B2 (ja) | 1991-09-09 | 1991-09-11 | ２種の化合物の共存系における定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2959596B2 (ja) |
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1991
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0572209A (ja) | 1993-03-23 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |