JP2959686B2 - 脂質の定量方法 - Google Patents
脂質の定量方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は脂質の簡便な定量法に関
する。
する。
【０００２】
【従来の技術】脂質は生体の構成成分として利用されて
おり、なかでもリン脂質は生体を構成する細胞の種々の
膜系、たとえば原形質膜、核膜、小胞体膜、ミトコンド
リア膜、ゴルジ体膜、リソソーム膜などを構成する主要
な脂質である。このリン脂質は分子内に極性基と疎水基
をあわせもつ両親媒性分子であるため、水溶液に懸濁す
るとその極性基に水分子が水和し、疎水性基は水の環境
から押し出されるため疎水性基どうしで集合する。集合
の仕方は、水和を含む親水性基の容積と疎水性基の占め
る容積のバランスにより異なり、ミセル、２分子膜構造
の脂質二重層、あるいはヘキサゴナルII構造が形成され
る。このうち脂質二重層構造が、生体膜の基本的な構造
であり、リン脂質の二重層は内部に水相を有する閉鎖小
胞（リポソーム）を形成し、膜蛋白質なども構成成分と
して加えることができるため物質透過や情報伝達などの
生体膜モデルとして広く用いられている。またリポソー
ムが水溶性物質を内水相に保持できることから薬剤カプ
セルとしての応用も期待されている。
おり、なかでもリン脂質は生体を構成する細胞の種々の
膜系、たとえば原形質膜、核膜、小胞体膜、ミトコンド
リア膜、ゴルジ体膜、リソソーム膜などを構成する主要
な脂質である。このリン脂質は分子内に極性基と疎水基
をあわせもつ両親媒性分子であるため、水溶液に懸濁す
るとその極性基に水分子が水和し、疎水性基は水の環境
から押し出されるため疎水性基どうしで集合する。集合
の仕方は、水和を含む親水性基の容積と疎水性基の占め
る容積のバランスにより異なり、ミセル、２分子膜構造
の脂質二重層、あるいはヘキサゴナルII構造が形成され
る。このうち脂質二重層構造が、生体膜の基本的な構造
であり、リン脂質の二重層は内部に水相を有する閉鎖小
胞（リポソーム）を形成し、膜蛋白質なども構成成分と
して加えることができるため物質透過や情報伝達などの
生体膜モデルとして広く用いられている。またリポソー
ムが水溶性物質を内水相に保持できることから薬剤カプ
セルとしての応用も期待されている。
【０００３】一方、リン脂質の定量法としては種々の方
法が知られている。例えば、試料に硫酸および過マンガ
ン酸塩を加え沸騰水浴中で加熱し、構成成分であるリン
酸を生じさせた後に、これにモリブデン酸アンモニウム
および還元剤を加え、その際生じるモリブデン青による
呈色状態を吸光度により計測する過マンガン酸塩灰化
法；試料中のリン脂質にホスホリパーゼＤを作用させ、
構成成分であるコリンを遊離させた後、生成したコリン
にコリンオキシダーゼを作用させてベタインと過酸化水
素を生成させ、生成した過酸化水素がペルオキシダーゼ
の存在下でフェノールと４−アミノアンチピリンを定量
的に酸化縮合させた際に生じる赤色キノン色素による呈
色状態を吸光度により計測するコリンオキシダーゼ・フ
ェノール法等が挙げられる。
法が知られている。例えば、試料に硫酸および過マンガ
ン酸塩を加え沸騰水浴中で加熱し、構成成分であるリン
酸を生じさせた後に、これにモリブデン酸アンモニウム
および還元剤を加え、その際生じるモリブデン青による
呈色状態を吸光度により計測する過マンガン酸塩灰化
法；試料中のリン脂質にホスホリパーゼＤを作用させ、
構成成分であるコリンを遊離させた後、生成したコリン
にコリンオキシダーゼを作用させてベタインと過酸化水
素を生成させ、生成した過酸化水素がペルオキシダーゼ
の存在下でフェノールと４−アミノアンチピリンを定量
的に酸化縮合させた際に生じる赤色キノン色素による呈
色状態を吸光度により計測するコリンオキシダーゼ・フ
ェノール法等が挙げられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】各種の定量法のなか
で、試料中の分析対象物に特徴的な吸光波長による吸光
度を測定する定量方法は、試料の吸光度を直接計測する
という簡単な操作での定量が可能であること、試料中の
分析対象物を他の物質と反応させずに計測できるので試
料を更に他の用途に利用できることなどの利点を有し、
より実用性の高いものといえる。
で、試料中の分析対象物に特徴的な吸光波長による吸光
度を測定する定量方法は、試料の吸光度を直接計測する
という簡単な操作での定量が可能であること、試料中の
分析対象物を他の物質と反応させずに計測できるので試
料を更に他の用途に利用できることなどの利点を有し、
より実用性の高いものといえる。
【０００５】しかしながら、リン脂質のような両親媒性
分子からなる脂質は、水性媒体中で種々の形態の集合体
を形成するので、光吸収により脂質濃度を見積もること
は、脂質集合体による光散乱のため不可能である。
分子からなる脂質は、水性媒体中で種々の形態の集合体
を形成するので、光吸収により脂質濃度を見積もること
は、脂質集合体による光散乱のため不可能である。
【０００６】また、従来例で挙げた過マンガン酸塩灰化
法では、数種類の試薬を順に加えねばならず操作が煩雑
である。その上、硫酸存在下に沸騰水浴中で加熱するた
め、突沸の危険があり、蒸発による測定の誤差も避けら
れない。またコリンオキシダーゼ・フェノール法では、
酵素の安定性に問題があり、冷暗所で試薬を保存しなけ
ればならず、時間をおいた測定値の再現性にも問題があ
る。
法では、数種類の試薬を順に加えねばならず操作が煩雑
である。その上、硫酸存在下に沸騰水浴中で加熱するた
め、突沸の危険があり、蒸発による測定の誤差も避けら
れない。またコリンオキシダーゼ・フェノール法では、
酵素の安定性に問題があり、冷暗所で試薬を保存しなけ
ればならず、時間をおいた測定値の再現性にも問題があ
る。
【０００７】本発明の目的は、極めて簡便な脂質の定量
法を提供することにあり、特に水性媒体中で集合体を形
成する両親媒性の脂質でも水性媒体中において極めて簡
便に定量できる方法を提供することにある。
法を提供することにあり、特に水性媒体中で集合体を形
成する両親媒性の脂質でも水性媒体中において極めて簡
便に定量できる方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の脂質の定量法
は、水性媒体中で脂質を含む試料を界面活性剤で処理し
て脂質と界面活性剤とのミセル状態を有する試料分散液
を調製する工程；および該試料分散液の紫外部の吸光度
を測定する工程とを有することを特徴とする。本発明の
脂質の定量法の１態様としては、脂質を含む第１の試料
を水性媒体中で、所定の条件で界面活性剤で処理して脂
質と界面活性剤とのミセル状態を有する、脂質濃度が既
知の第１の試料分散液を調製し、該第１の試料分散液を
用いて脂質濃度が既知であって、脂質濃度が異なる複数
の基準液を調製し、各々の基準液の紫外域の吸光度を測
定して、脂質濃度と吸光度との相関を求める工程；およ
び脂質を含んでいる可能性のある第２の試料を、水性媒
体中で該所定の条件下で界面活性剤で処理して脂質濃度
が未知の第２の試料溶液を調製し、該第２の試料溶液の
紫外域の吸光度を測定し、先に求めた相関関係から該第
２の試料中の脂質濃度を求める工程； を有する方法を挙げることができる。
は、水性媒体中で脂質を含む試料を界面活性剤で処理し
て脂質と界面活性剤とのミセル状態を有する試料分散液
を調製する工程；および該試料分散液の紫外部の吸光度
を測定する工程とを有することを特徴とする。本発明の
脂質の定量法の１態様としては、脂質を含む第１の試料
を水性媒体中で、所定の条件で界面活性剤で処理して脂
質と界面活性剤とのミセル状態を有する、脂質濃度が既
知の第１の試料分散液を調製し、該第１の試料分散液を
用いて脂質濃度が既知であって、脂質濃度が異なる複数
の基準液を調製し、各々の基準液の紫外域の吸光度を測
定して、脂質濃度と吸光度との相関を求める工程；およ
び脂質を含んでいる可能性のある第２の試料を、水性媒
体中で該所定の条件下で界面活性剤で処理して脂質濃度
が未知の第２の試料溶液を調製し、該第２の試料溶液の
紫外域の吸光度を測定し、先に求めた相関関係から該第
２の試料中の脂質濃度を求める工程； を有する方法を挙げることができる。
【０００９】本発明の方法では、脂質を界面活性剤によ
り処理して吸光法による定量を可能とするミセル状態と
する。例えば、リン脂質等の両親媒性脂質の集合体を水
性媒体中で界面活性剤で処理することにより、界面活性
剤とのミセル状態を形成する。
り処理して吸光法による定量を可能とするミセル状態と
する。例えば、リン脂質等の両親媒性脂質の集合体を水
性媒体中で界面活性剤で処理することにより、界面活性
剤とのミセル状態を形成する。
【００１０】使用する界面活性剤としては、紫外線領域
の波長で、光吸収を持たないものであれば、特に限定さ
れない。使用できる界面活性剤の例として、オクチルグ
ルコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）
やＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＨＥＣ
ＡＭＥＧ（６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−メ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシド）などが挙げられる。
の波長で、光吸収を持たないものであれば、特に限定さ
れない。使用できる界面活性剤の例として、オクチルグ
ルコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）
やＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＨＥＣ
ＡＭＥＧ（６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−メ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシド）などが挙げられる。
【００１１】界面活性剤での処理の仕方としては、超音
波処理、あるいは湯浴中での加熱が適当な方法である
が、超音波処理ならば１分間、加熱処理ならば６０℃の
温浴で１０分以上加熱すれば十分である。ただし、未知
試料と脂質の基準液には同じ処理を施す必要がある。
波処理、あるいは湯浴中での加熱が適当な方法である
が、超音波処理ならば１分間、加熱処理ならば６０℃の
温浴で１０分以上加熱すれば十分である。ただし、未知
試料と脂質の基準液には同じ処理を施す必要がある。
【００１２】この操作により、リン脂質が、リポソー
ム、平面膜あるいはヘキサゴナルII構造のような集合体
の形態をとるものであっても、これらの形態を脂質濃度
に比例した界面活性剤とのミセル状態に揃えることが出
来る。測定する紫外部の波長に吸収を持たない界面活性
剤を使用することにより、脂質と界面活性剤とのミセル
状態では紫外線の吸収は脂質のみにより起こり、吸光度
は脂質の濃度に依存する。したがって紫外部の吸光度を
測定することにより、逆に脂質濃度を知ることが出来
る。吸光度の測定に用いる波長は、脂質以外の物質が共
存しないことが明らかな状況では、２３０〜２９０nmの
どの波長を選んでも差し支えないが、他の物質の共存が
予想されるような時には、この共存物質の吸収が無いか
または少ない波長を選ぶ必要がある。生体膜を扱ったり
模倣する研究分野において、最も混在が予想される共存
物質は、蛋白質であるが、このような状況では、蛋白質
の極大吸収波長である２８０nmを避けて、２４０nm付近
の波長を用いることが望ましい。
ム、平面膜あるいはヘキサゴナルII構造のような集合体
の形態をとるものであっても、これらの形態を脂質濃度
に比例した界面活性剤とのミセル状態に揃えることが出
来る。測定する紫外部の波長に吸収を持たない界面活性
剤を使用することにより、脂質と界面活性剤とのミセル
状態では紫外線の吸収は脂質のみにより起こり、吸光度
は脂質の濃度に依存する。したがって紫外部の吸光度を
測定することにより、逆に脂質濃度を知ることが出来
る。吸光度の測定に用いる波長は、脂質以外の物質が共
存しないことが明らかな状況では、２３０〜２９０nmの
どの波長を選んでも差し支えないが、他の物質の共存が
予想されるような時には、この共存物質の吸収が無いか
または少ない波長を選ぶ必要がある。生体膜を扱ったり
模倣する研究分野において、最も混在が予想される共存
物質は、蛋白質であるが、このような状況では、蛋白質
の極大吸収波長である２８０nmを避けて、２４０nm付近
の波長を用いることが望ましい。
【００１３】本発明の方法では、脂質を水性媒体中で界
面活性剤により処理するが、これは脂質の存在形態が初
めから水溶液中に懸濁されていることを前提とするもの
ではない。例えば固形の試料であっても所定容積の界面
活性剤水溶液で処理すれば、試料を定量することが可能
である。
面活性剤により処理するが、これは脂質の存在形態が初
めから水溶液中に懸濁されていることを前提とするもの
ではない。例えば固形の試料であっても所定容積の界面
活性剤水溶液で処理すれば、試料を定量することが可能
である。
【００１４】反応系を構成する水性媒体としては、未知
試料と脂質基準液が同じｐＨ、イオン強度あるいは塩濃
度で処理されることを前提として、使用する界面活性剤
の可溶化能が保たれるイオン強度、ｐＨの範囲内であれ
ばその組成は特に限定されない。
試料と脂質基準液が同じｐＨ、イオン強度あるいは塩濃
度で処理されることを前提として、使用する界面活性剤
の可溶化能が保たれるイオン強度、ｐＨの範囲内であれ
ばその組成は特に限定されない。
【００１５】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
する。 実施例１ ３０ｍｇ／ミリリットルのアゾレクチン（大豆フォスフ
ァチジルコリン、typeIV S; Sigma 社）−クロロホルム
溶液、０．５ミリリットルをナス型フラスコに入れ、ロ
ータリーエバポレータを用いて溶媒を留去した後、デシ
ケータに入れ真空ポンプを用いて溶媒を完全に除いて脂
質薄膜を作った。次いでこれに１０mMの塩化カリウム水
溶液１．０ミリリットルを加えボルテックスミキサーで
５分間処理して脂質薄膜を分散させた。次いで水浴型超
音波発振装置（ソニファイアーＢ−１５型、ホップホー
ン使用；Branson社製）で３０分間処理してリポソーム
分散液（１５ｍｇ／ミリリットル）を得た。
する。 実施例１ ３０ｍｇ／ミリリットルのアゾレクチン（大豆フォスフ
ァチジルコリン、typeIV S; Sigma 社）−クロロホルム
溶液、０．５ミリリットルをナス型フラスコに入れ、ロ
ータリーエバポレータを用いて溶媒を留去した後、デシ
ケータに入れ真空ポンプを用いて溶媒を完全に除いて脂
質薄膜を作った。次いでこれに１０mMの塩化カリウム水
溶液１．０ミリリットルを加えボルテックスミキサーで
５分間処理して脂質薄膜を分散させた。次いで水浴型超
音波発振装置（ソニファイアーＢ−１５型、ホップホー
ン使用；Branson社製）で３０分間処理してリポソーム
分散液（１５ｍｇ／ミリリットル）を得た。
【００１６】このようにして調整したリポソーム分散液
の粒径分布を動的光散乱粒度計を用いて測定したところ
３０〜２６０nm（平均粒径１９０nm）の分布を持ってい
ることが分かった。
の粒径分布を動的光散乱粒度計を用いて測定したところ
３０〜２６０nm（平均粒径１９０nm）の分布を持ってい
ることが分かった。
【００１７】次いでこのリポソーム分散液を、１重量％
のオクチルグルコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコ
シド；和光純薬社）を含む１０mMの塩化カリウム水溶液
で、種々の濃度に希釈して、０〜１．５ｍｇ／ミリリッ
トルのリン脂質基準液を得た。
のオクチルグルコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコ
シド；和光純薬社）を含む１０mMの塩化カリウム水溶液
で、種々の濃度に希釈して、０〜１．５ｍｇ／ミリリッ
トルのリン脂質基準液を得た。
【００１８】このリン脂質基準液を水浴型超音波発振装
置で１分間処理した後、光路長１cmの石英セルに入れ、
分光光度計（自記分光光度計UV 3100-S;島津社製）を用
いて２４０nmにおける吸光度を測定した。対照として１
％のオクチルグルコシドを含む１０mMの塩化カリウム水
溶液の吸光度を用い、リン脂質濃度に対して吸光度をプ
ロットすると、原点を通る直線となった。直線の傾きか
ら、リン脂質濃度と吸光度の間には次の関係式が成立し
た。
置で１分間処理した後、光路長１cmの石英セルに入れ、
分光光度計（自記分光光度計UV 3100-S;島津社製）を用
いて２４０nmにおける吸光度を測定した。対照として１
％のオクチルグルコシドを含む１０mMの塩化カリウム水
溶液の吸光度を用い、リン脂質濃度に対して吸光度をプ
ロットすると、原点を通る直線となった。直線の傾きか
ら、リン脂質濃度と吸光度の間には次の関係式が成立し
た。
【００１９】吸光度＝０．４００×（リン脂質濃度、ｍ
ｇ／ミリリットル） 従って、未知試料を上記と同様にして処理し、吸光度を
測定すれば、この関係式から未知試料中のリン脂質の量
を求めることができる。 実施例２ 実施例１と同様にしてリポソーム分散液を調整した後、
液体窒素に浸すことにより凍結させた。続いてこれを室
温に放置して融解させた後、１分間、超音波処理した。
以上の凍結と融解操作を６回繰り返すことにより、比較
的大きい粒径のリポソーム分散液を調製できる。実施例
１と同様に動的光散乱粒度計を用いて、粒径分布を測定
したところ１３０〜５２０nm（平均粒径２８０nm）の分
布を持っていることが分かった。
ｇ／ミリリットル） 従って、未知試料を上記と同様にして処理し、吸光度を
測定すれば、この関係式から未知試料中のリン脂質の量
を求めることができる。 実施例２ 実施例１と同様にしてリポソーム分散液を調整した後、
液体窒素に浸すことにより凍結させた。続いてこれを室
温に放置して融解させた後、１分間、超音波処理した。
以上の凍結と融解操作を６回繰り返すことにより、比較
的大きい粒径のリポソーム分散液を調製できる。実施例
１と同様に動的光散乱粒度計を用いて、粒径分布を測定
したところ１３０〜５２０nm（平均粒径２８０nm）の分
布を持っていることが分かった。
【００２０】このようにして調製したリポソーム分散液
を実施例１と同様に１％のオクチルグルコシドを含む１
０mM塩化カリウム水溶液で希釈することにより、０〜
１．５ｍｇ／ミリリットルの濃度範囲のリン脂質基準液
を得た。続いてこの基準液を実施例１と同様に１分間超
音波処理した後、２４０nmにおける吸光度を測定した。
対照として１％のオクチルグルコシドを含む１０mMの塩
化カリウム水溶液の吸光度を用い、リン脂質濃度に対し
て吸光度をプロットすると、原点を通る直線となった。
直線の傾きから、リン脂質濃度と吸光度の間には次の関
係式が成立した。 吸光度＝０．４００×（リン脂質濃度、ｍｇ／ミリリッ
トル） 従って、未知試料を上記と同様にして処理し、吸光度を
測定すれば、この関係式から未知試料中のリン脂質の量
を求めることができる。
を実施例１と同様に１％のオクチルグルコシドを含む１
０mM塩化カリウム水溶液で希釈することにより、０〜
１．５ｍｇ／ミリリットルの濃度範囲のリン脂質基準液
を得た。続いてこの基準液を実施例１と同様に１分間超
音波処理した後、２４０nmにおける吸光度を測定した。
対照として１％のオクチルグルコシドを含む１０mMの塩
化カリウム水溶液の吸光度を用い、リン脂質濃度に対し
て吸光度をプロットすると、原点を通る直線となった。
直線の傾きから、リン脂質濃度と吸光度の間には次の関
係式が成立した。 吸光度＝０．４００×（リン脂質濃度、ｍｇ／ミリリッ
トル） 従って、未知試料を上記と同様にして処理し、吸光度を
測定すれば、この関係式から未知試料中のリン脂質の量
を求めることができる。
【００２１】
【発明の効果】本発明により、従来煩雑で手間のかかっ
ていたリン脂質定量操作が、１分間の超音波処理だけで
済むようになり、大幅に簡便化された。特に、本発明に
より、脂質を含む生体膜の研究や人工的に合成した脂質
を含む膜の組成の確認などにおける脂質集合体を試料と
する場合の脂質の定量のための極めて簡便な方法を提供
することができる。
ていたリン脂質定量操作が、１分間の超音波処理だけで
済むようになり、大幅に簡便化された。特に、本発明に
より、脂質を含む生体膜の研究や人工的に合成した脂質
を含む膜の組成の確認などにおける脂質集合体を試料と
する場合の脂質の定量のための極めて簡便な方法を提供
することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川口 正浩 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (72)発明者 大山 淳史 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/28 G01N 21/33 G01N 33/92
Claims (7)
- 【請求項１】 水性媒体中で脂質を含む試料を界面活性
剤で処理して脂質と界面活性剤とのミセル状態を有する
試料分散液を調製する工程；および該試料分散液の紫外
部の吸光度を測定する工程とを有することを特徴とする
脂質の定量方法。 - 【請求項２】 該界面活性剤が紫外部に吸収を持たない
ものである請求項１に記載の脂質の定量法。 - 【請求項３】 該紫外部の吸光度が波長２４０ｎｍにお
ける吸光度である請求項１に記載の脂質の定量法。 - 【請求項４】 該試料が、アゾレクチンから調製したリ
ポソームを含む請求項１に記載の脂質の定量法。 - 【請求項５】 該界面活性剤がｎ−オクチル−β−Ｄ−
グルコピラノシド、３−［（３−コラミドプロピル）ジ
メチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートおよび
６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−メチル−α−
Ｄ−グルコピラノシドから選ばれる１つである請求項１
に記載の脂質の定量法。 - 【請求項６】 上記界面活性剤での処理が、超音波処理
或いは湯浴中での加熱である請求項１に記載の脂質の定
量法。 - 【請求項７】 脂質を含む第１の試料を水性媒体中で、
所定の条件で界面活性剤で処理して脂質と界面活性剤と
のミセル状態を有する、脂質濃度が既知の第１の試料分
散液を調製し、該第１の試料分散液を用いて脂質濃度が
既知であって、脂質濃度が異なる複数の基準液を調製
し、各々の基準液の紫外域の吸光度を測定して、脂質濃
度と吸光度との相関を求める工程；および 脂質を含んで
いる可能性のある第２の試料を、水性媒体中で該所定の
条件下で界面活性剤で処理して脂質濃度が未知の第２の
試料溶液を調製し、該第２の試料溶液の紫外域の吸光度
を測定し、先に求めた相関関係から該第２の試料中の脂
質濃度を求める工程； を有することを特徴とする脂質の定量法。
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22896191A JP2959686B2 (ja) | 1991-09-09 | 1991-09-09 | 脂質の定量方法 |
| EP00107306A EP1022567B1 (en) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitative determination of lipid, and of co-existing two compounds |
| DE69233570T DE69233570T2 (de) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitativer Nachweis von Verbindungen in Coexistenz im System mit anderen Verbindungen |
| EP92115336A EP0531933B1 (en) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitative determination of lipids |
| DE69233452T DE69233452T2 (de) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitativer Nachweis vom Lipid, in reiner Form oder im Komplex mit anderen Verbindungen |
| EP96120379A EP0767384B1 (en) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitative determination compounds coexisting in a system with other compounds |
| AT92115336T ATE155249T1 (de) | 1991-09-09 | 1992-09-08 | Quantitativer nachweis vom lipid |
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