JP3187469B2 - 脂質の定量方法 - Google Patents
脂質の定量方法Info
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- JP3187469B2 JP3187469B2 JP22896091A JP22896091A JP3187469B2 JP 3187469 B2 JP3187469 B2 JP 3187469B2 JP 22896091 A JP22896091 A JP 22896091A JP 22896091 A JP22896091 A JP 22896091A JP 3187469 B2 JP3187469 B2 JP 3187469B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は脂質の簡便な定量法に関
する。
する。
【０００２】
【従来の技術】脂質は生体の構成成分として利用されて
おり、なかでもリン脂質は生体を構成する細胞の種々の
膜系、たとえば原形質膜、核膜、小胞体膜、ミトコンド
リア膜、ゴルジ体膜、リソソーム膜などを構成する主要
な脂質である。このリン脂質は分子内に極性基と疎水基
をあわせもつ両親媒性分子であるため、水溶液に懸濁す
るとその極性基に水分子が水和し、疎水性基は水の環境
から押し出されるため疎水性基どうしで集合する。集合
の仕方は、水和を含む親水性基の容積と疎水性基の占め
る容積のバランスにより異なり、ミセル、２分子膜構造
の脂質二重層、あるいはヘキサゴナルII構造が形成され
る。このうち脂質二重層構造が、生体膜の基本的な構造
であり、リン脂質の二重膜は内部に水相を有する閉鎖小
胞（リポソーム）を形成し、膜蛋白質なども構成成分と
して加えることができるため物質透過や情報伝達などの
生体膜モデルとして広く用いられている。またリポソー
ムが水溶性物質を内水相に保持できることから薬剤カプ
セルとしての応用も期待されている。
おり、なかでもリン脂質は生体を構成する細胞の種々の
膜系、たとえば原形質膜、核膜、小胞体膜、ミトコンド
リア膜、ゴルジ体膜、リソソーム膜などを構成する主要
な脂質である。このリン脂質は分子内に極性基と疎水基
をあわせもつ両親媒性分子であるため、水溶液に懸濁す
るとその極性基に水分子が水和し、疎水性基は水の環境
から押し出されるため疎水性基どうしで集合する。集合
の仕方は、水和を含む親水性基の容積と疎水性基の占め
る容積のバランスにより異なり、ミセル、２分子膜構造
の脂質二重層、あるいはヘキサゴナルII構造が形成され
る。このうち脂質二重層構造が、生体膜の基本的な構造
であり、リン脂質の二重膜は内部に水相を有する閉鎖小
胞（リポソーム）を形成し、膜蛋白質なども構成成分と
して加えることができるため物質透過や情報伝達などの
生体膜モデルとして広く用いられている。またリポソー
ムが水溶性物質を内水相に保持できることから薬剤カプ
セルとしての応用も期待されている。
【０００３】一方、リン脂質の定量法としては種々の方
法が知られている。例えば、試料に硫酸および過マンガ
ン酸塩を加え沸騰水浴中で加熱し、構成成分であるリン
酸を生じさせた後に、これにモリブデン酸アンモニウム
および還元剤を加え、その際生じるモリブデン青による
呈色状態を吸光度により計測する過マンガン酸塩灰化
法；試料中のリン脂質にホスホリパーゼＤを作用させ、
構成成分であるコリンを遊離させた後、生成したコリン
にコリンオキシダーゼを作用させてベタインと過酸化水
素を生成させ、生成した過酸化水素がペルオキシダーゼ
の存在下でフェノールと４−アミノアンチピリンを定量
的に酸化縮合させた際に生じる赤色キノン色素による呈
色状態を吸光度により計測するコリンオキシダーゼ・フ
ェノール法等が挙げられる。
法が知られている。例えば、試料に硫酸および過マンガ
ン酸塩を加え沸騰水浴中で加熱し、構成成分であるリン
酸を生じさせた後に、これにモリブデン酸アンモニウム
および還元剤を加え、その際生じるモリブデン青による
呈色状態を吸光度により計測する過マンガン酸塩灰化
法；試料中のリン脂質にホスホリパーゼＤを作用させ、
構成成分であるコリンを遊離させた後、生成したコリン
にコリンオキシダーゼを作用させてベタインと過酸化水
素を生成させ、生成した過酸化水素がペルオキシダーゼ
の存在下でフェノールと４−アミノアンチピリンを定量
的に酸化縮合させた際に生じる赤色キノン色素による呈
色状態を吸光度により計測するコリンオキシダーゼ・フ
ェノール法等が挙げられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】各種の定量法のなか
で、試料中の分析対象物に特徴的な吸光波長による吸光
度を測定する定量方法は、試料の吸光度を直接計測する
という簡単な操作での定量が可能であること、試料中の
分析対象物を他の物質と反応させずに計測できるので試
料を更に他の用途に利用できることなどの利点を有し、
より実用性の高いものといえる。
で、試料中の分析対象物に特徴的な吸光波長による吸光
度を測定する定量方法は、試料の吸光度を直接計測する
という簡単な操作での定量が可能であること、試料中の
分析対象物を他の物質と反応させずに計測できるので試
料を更に他の用途に利用できることなどの利点を有し、
より実用性の高いものといえる。
【０００５】しかしながら、リン脂質のような両親媒性
分子からなる脂質は、水性媒体中で種々の形態の集合体
を形成するので、光吸収により脂質濃度を見積もること
は、脂質集合体による光散乱のため不可能である。
分子からなる脂質は、水性媒体中で種々の形態の集合体
を形成するので、光吸収により脂質濃度を見積もること
は、脂質集合体による光散乱のため不可能である。
【０００６】一方、従来例で挙げた過マンガン酸塩灰化
法では、数種類の試薬を順に加えねばならず操作が煩雑
である。その上、硫酸存在下に沸騰水浴中で加熱するた
め、突沸の危険があり、蒸発による測定の誤差も避けら
れない。またコリンオキシダーゼ・フェノール法では、
酵素の安定性に問題があり、冷暗所で試薬を保存しなけ
ればならず、時間をおいた測定値の再現性にも問題があ
る。
法では、数種類の試薬を順に加えねばならず操作が煩雑
である。その上、硫酸存在下に沸騰水浴中で加熱するた
め、突沸の危険があり、蒸発による測定の誤差も避けら
れない。またコリンオキシダーゼ・フェノール法では、
酵素の安定性に問題があり、冷暗所で試薬を保存しなけ
ればならず、時間をおいた測定値の再現性にも問題があ
る。
【０００７】本発明の目的は、簡便な脂質の定量法、特
に水性媒体中において集合体を形成する脂質の定量にも
好適であり、しかも簡便な脂質の定量法を提供すること
にある。
に水性媒体中において集合体を形成する脂質の定量にも
好適であり、しかも簡便な脂質の定量法を提供すること
にある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の脂質の定量方法
は、水性媒体中で、脂質を含む試料を界面活性剤で処理
して脂質と界面活性剤とのミセル状態を有する試料分散
液を調製する工程；および該試料分散液、２価の銅イオ
ンおよびビシンコニン酸を反応させ、次いで該試料分散
液の吸光度を測定する工程、を有することを特徴とす
る。また、本発明の他の脂質の定量方法としては、以下
の工程（ｉ）〜（iii）を含む方法を挙げることができ
る。 （ｉ）脂質を含む第１の試料を水性媒体中で所定の条件
で界面活性剤で処理して、該脂質と該界面活性剤とのミ
セル状態を有する、脂質濃度が既知の第１の試料分散液
を調製し、該第１の試料分散液を用いて脂質濃度が既知
であって、脂質濃度が異なる複数の基準液を調製する工
程； （ii）該複数の基準液の各々を、２価の銅イオンおよび
ビシンコニン酸と反応させ、次いで該基準液の各々の吸
光度を測定して脂質濃度と吸光度の相関を求める工程；
および （iii）脂質を含んでいる可能性のある第２の試料を、
水性媒体中で該所定の条件下で界面活性剤で処理して脂
質濃度が未知の第２の試料溶液を調製し、該第２の試料
溶液と２価の銅イオンおよびビシンコニン酸と反応させ
たのち、該第２の試料溶液の吸光度を測定し、上記工程
（ｉ）および（ii）で得た脂質濃度と吸光度の相関から
第２の試料中の脂質濃度を算出する工程。
は、水性媒体中で、脂質を含む試料を界面活性剤で処理
して脂質と界面活性剤とのミセル状態を有する試料分散
液を調製する工程；および該試料分散液、２価の銅イオ
ンおよびビシンコニン酸を反応させ、次いで該試料分散
液の吸光度を測定する工程、を有することを特徴とす
る。また、本発明の他の脂質の定量方法としては、以下
の工程（ｉ）〜（iii）を含む方法を挙げることができ
る。 （ｉ）脂質を含む第１の試料を水性媒体中で所定の条件
で界面活性剤で処理して、該脂質と該界面活性剤とのミ
セル状態を有する、脂質濃度が既知の第１の試料分散液
を調製し、該第１の試料分散液を用いて脂質濃度が既知
であって、脂質濃度が異なる複数の基準液を調製する工
程； （ii）該複数の基準液の各々を、２価の銅イオンおよび
ビシンコニン酸と反応させ、次いで該基準液の各々の吸
光度を測定して脂質濃度と吸光度の相関を求める工程；
および （iii）脂質を含んでいる可能性のある第２の試料を、
水性媒体中で該所定の条件下で界面活性剤で処理して脂
質濃度が未知の第２の試料溶液を調製し、該第２の試料
溶液と２価の銅イオンおよびビシンコニン酸と反応させ
たのち、該第２の試料溶液の吸光度を測定し、上記工程
（ｉ）および（ii）で得た脂質濃度と吸光度の相関から
第２の試料中の脂質濃度を算出する工程。
【０００９】本発明では、界面活性剤で脂質を処理する
ことで、定量分析を可能とする脂質と界面活性剤とのミ
セル状態を形成させる。例えば、リン脂質のような両親
媒性の脂質の場合には、水性媒体中で生じた脂質集合体
を界面活性剤で処理することで、脂質と界面活性剤との
ミセル状態を形成させる。このミセル状態において、脂
質が還元剤として作用して水性媒体中に存在させた２価
の銅イオンを１価の銅イオンに変換し、生成した１価の
銅イオンとビシンコニン酸（４，４’−ジカルボキシ−
２，２’−ビキノリン）のＮａ塩が紫紅色の錯化合物を
形成する。これらの反応は定量的に進行するので、該錯
化合物による呈色状態を吸光度により計測することで脂
質の定量が可能となる。
ことで、定量分析を可能とする脂質と界面活性剤とのミ
セル状態を形成させる。例えば、リン脂質のような両親
媒性の脂質の場合には、水性媒体中で生じた脂質集合体
を界面活性剤で処理することで、脂質と界面活性剤との
ミセル状態を形成させる。このミセル状態において、脂
質が還元剤として作用して水性媒体中に存在させた２価
の銅イオンを１価の銅イオンに変換し、生成した１価の
銅イオンとビシンコニン酸（４，４’−ジカルボキシ−
２，２’−ビキノリン）のＮａ塩が紫紅色の錯化合物を
形成する。これらの反応は定量的に進行するので、該錯
化合物による呈色状態を吸光度により計測することで脂
質の定量が可能となる。
【００１０】使用する界面活性剤としては、非イオン
性、陰イオン性の界面活性剤等、特に限定されない。例
えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＳＤＳ（ドデシル硫
酸ナトリウム）、Ｂｒｉｊｉ ３５、オクチルグルコシ
ド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）やＣＨ
ＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアン
モニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＨＥＣＡＭＥ
Ｇ（６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−メチル−
α−Ｄ−グルコピラノシド）、コール酸、デオキシコー
ル酸などが挙げられる。
性、陰イオン性の界面活性剤等、特に限定されない。例
えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＳＤＳ（ドデシル硫
酸ナトリウム）、Ｂｒｉｊｉ ３５、オクチルグルコシ
ド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）やＣＨ
ＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアン
モニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＨＥＣＡＭＥ
Ｇ（６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−メチル−
α−Ｄ−グルコピラノシド）、コール酸、デオキシコー
ル酸などが挙げられる。
【００１１】界面活性剤による処理の仕方としては、超
音波処理、あるいは温浴中での加熱が適当な方法である
が、特に限定はされない。超音波処理ならば１分間、加
熱処理ならば６０℃の温浴で１０分以上加熱すれば十分
である。ただし、未知試料と脂質の基準液は同じ処理を
施す必要がある。
音波処理、あるいは温浴中での加熱が適当な方法である
が、特に限定はされない。超音波処理ならば１分間、加
熱処理ならば６０℃の温浴で１０分以上加熱すれば十分
である。ただし、未知試料と脂質の基準液は同じ処理を
施す必要がある。
【００１２】この操作により、脂質が、リポソーム、平
面膜あるいはヘキサゴナルII構造のような集合体として
の形態を有するものであっても、これらを脂質濃度に比
例した界面活性剤とのミセル状態の形態を揃えることが
できる。脂質は、水性媒体中で界面活性剤により処理す
る必要があるが、これは脂質の存在形態が初めから水性
媒体中に懸濁されていることを前提とするものではな
い。例えば固形の試料であっても、これに所定容積の界
面活性剤水溶液を加えて処理すれば、試料における脂質
の定量が可能である。
面膜あるいはヘキサゴナルII構造のような集合体として
の形態を有するものであっても、これらを脂質濃度に比
例した界面活性剤とのミセル状態の形態を揃えることが
できる。脂質は、水性媒体中で界面活性剤により処理す
る必要があるが、これは脂質の存在形態が初めから水性
媒体中に懸濁されていることを前提とするものではな
い。例えば固形の試料であっても、これに所定容積の界
面活性剤水溶液を加えて処理すれば、試料における脂質
の定量が可能である。
【００１３】反応系を構成する水性媒体としては、未知
試料と脂質基準液が同じｐＨ、イオン強度あるいは塩濃
度で処理されることを前提として、使用する界面活性剤
の可溶化能が保たれるイオン強度、ｐＨの範囲内であれ
ばその組成は特に限定されない。但し、本発明の方法に
おける呈色反応の最適ｐＨが１１．２５であるため、水
性媒体に試料を加えた際に大幅にそのｐＨを酸性側にシ
フトさせてしまうような強酸性溶液を水性媒体として用
いることは好ましくない。
試料と脂質基準液が同じｐＨ、イオン強度あるいは塩濃
度で処理されることを前提として、使用する界面活性剤
の可溶化能が保たれるイオン強度、ｐＨの範囲内であれ
ばその組成は特に限定されない。但し、本発明の方法に
おける呈色反応の最適ｐＨが１１．２５であるため、水
性媒体に試料を加えた際に大幅にそのｐＨを酸性側にシ
フトさせてしまうような強酸性溶液を水性媒体として用
いることは好ましくない。
【００１４】なお、２価の銅イオンとビシンコニン酸に
よる呈色反応自体は、蛋白質の還元剤としての作用を利
用した蛋白質の定量方法（Anal. Biochem., 150, p76
(1985)）において知られている。すなわち、この方法
は、２価の銅イオンがアルカリ性で蛋白質の存在により
１価の銅イオンとなり、ビシンコニン酸分子と紫紅色の
錯化合物を形成する原理に基づく。本発明者らは、この
方法においては、蛋白質のみならず、同じような反応性
を持つ脂質に対しても、鋭敏な反応が生じることを見出
し本発明を完成させた。
よる呈色反応自体は、蛋白質の還元剤としての作用を利
用した蛋白質の定量方法（Anal. Biochem., 150, p76
(1985)）において知られている。すなわち、この方法
は、２価の銅イオンがアルカリ性で蛋白質の存在により
１価の銅イオンとなり、ビシンコニン酸分子と紫紅色の
錯化合物を形成する原理に基づく。本発明者らは、この
方法においては、蛋白質のみならず、同じような反応性
を持つ脂質に対しても、鋭敏な反応が生じることを見出
し本発明を完成させた。
【００１５】なお、蛋白質の定量方法が全て脂質の定量
方法に応用できるとは限らず、ビシンコニン酸を用いた
蛋白質の定量方法が脂質の定量に適用できることを新た
に見出したところに本発明の特徴がある。
方法に応用できるとは限らず、ビシンコニン酸を用いた
蛋白質の定量方法が脂質の定量に適用できることを新た
に見出したところに本発明の特徴がある。
【００１６】例えば、蛋白質定量法として広く知られて
いるLowry 法（J. Biol. Chim., vol. 193, p265, (195
1)) では、金属イオンであるモリブデンイオンやタング
ステンイオンが蛋白質の還元剤としての作用によって還
元されてリンモリブデンブルー、あるいは、リンタング
ステンブルーの青色を呈する。この青色を代表する波長
での吸光度を測定して、蛋白質を定量する。従ってこの
方法においても還元作用のある脂質の定量への適用が期
待て゛きるが、実際には、その感度は、蛋白質に対して
の場合の約１／１００と極めて低いものであった。これ
に対して、本発明の方法における感度は、蛋白質の場合
の１／３とやや低下するにすぎず、しかも、本発明の方
法は他の従来の脂質の定量法に比べて感度が良いので、
操作の簡便性を加味して総合的に判断すれば、本発明の
定量法は極めて実用性の高いものといえる。
いるLowry 法（J. Biol. Chim., vol. 193, p265, (195
1)) では、金属イオンであるモリブデンイオンやタング
ステンイオンが蛋白質の還元剤としての作用によって還
元されてリンモリブデンブルー、あるいは、リンタング
ステンブルーの青色を呈する。この青色を代表する波長
での吸光度を測定して、蛋白質を定量する。従ってこの
方法においても還元作用のある脂質の定量への適用が期
待て゛きるが、実際には、その感度は、蛋白質に対して
の場合の約１／１００と極めて低いものであった。これ
に対して、本発明の方法における感度は、蛋白質の場合
の１／３とやや低下するにすぎず、しかも、本発明の方
法は他の従来の脂質の定量法に比べて感度が良いので、
操作の簡便性を加味して総合的に判断すれば、本発明の
定量法は極めて実用性の高いものといえる。
【００１７】本発明の定量方法では、界面活性剤で処理
した試料分散液に、ビシンコニン酸、２価の銅イオンを
含む呈色試薬を加えて反応させ、脂質が存在を示す紫紅
色の呈色状態を吸光度により計測する。ビシンコニン酸
及び２価の銅イオンの添加量は、試料中に含まれる脂質
の全量が反応できる過剰量とされるが、通常ビシンコニ
ン酸の最終濃度が１％程度、銅イオンが０．０１〜０．
１％程度とし、この添加量で定量可能なように試料分散
液を必要に応じて希釈すると良い。反応条件は、適宜選
択できるが、例えば６０℃で、１時間程度の加温処理が
利用できる。加温処理した場合は、室温まで冷却してか
ら例えば５６２ｎｍの波長等で吸光度を測定し、定量す
る。この方法による脂質の定量は、試薬の添加が一度で
よく、しかも、呈色物質が長時間にわたって安定である
という特長を有し、ほかの脂質定量法に比べて感度がよ
いばかりでなく、非常に簡便であるという利点がある。
した試料分散液に、ビシンコニン酸、２価の銅イオンを
含む呈色試薬を加えて反応させ、脂質が存在を示す紫紅
色の呈色状態を吸光度により計測する。ビシンコニン酸
及び２価の銅イオンの添加量は、試料中に含まれる脂質
の全量が反応できる過剰量とされるが、通常ビシンコニ
ン酸の最終濃度が１％程度、銅イオンが０．０１〜０．
１％程度とし、この添加量で定量可能なように試料分散
液を必要に応じて希釈すると良い。反応条件は、適宜選
択できるが、例えば６０℃で、１時間程度の加温処理が
利用できる。加温処理した場合は、室温まで冷却してか
ら例えば５６２ｎｍの波長等で吸光度を測定し、定量す
る。この方法による脂質の定量は、試薬の添加が一度で
よく、しかも、呈色物質が長時間にわたって安定である
という特長を有し、ほかの脂質定量法に比べて感度がよ
いばかりでなく、非常に簡便であるという利点がある。
【００１８】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
する。 実施例１ ３０ｍｇ／ミリリットルのアゾレクチン（大豆フォスフ
ァチジルコリン、typeIV S; Sigma 社）−クロロホルム
溶液の０．５ミリリットルをナス型フラスコに入れ、ロ
ータリーエバポレータを用いて溶媒を留去した後、デシ
ケータに入れ真空ポンプを用いて溶媒を完全に除いて脂
質薄膜を作った。次いで１０mMの塩化カリウム水溶液
１．０ミリリットルをこれに加えボルテックスミキサー
で５分間処理して脂質薄膜を分散させた。次いで水浴型
超音波発振装置（ソニファイアーＢ−１５型、ホップホ
ーン使用；Branson社製）で３０分間処理してリポソー
ム分散液（１５ｍｇ／ミリリットル）を得た。
する。 実施例１ ３０ｍｇ／ミリリットルのアゾレクチン（大豆フォスフ
ァチジルコリン、typeIV S; Sigma 社）−クロロホルム
溶液の０．５ミリリットルをナス型フラスコに入れ、ロ
ータリーエバポレータを用いて溶媒を留去した後、デシ
ケータに入れ真空ポンプを用いて溶媒を完全に除いて脂
質薄膜を作った。次いで１０mMの塩化カリウム水溶液
１．０ミリリットルをこれに加えボルテックスミキサー
で５分間処理して脂質薄膜を分散させた。次いで水浴型
超音波発振装置（ソニファイアーＢ−１５型、ホップホ
ーン使用；Branson社製）で３０分間処理してリポソー
ム分散液（１５ｍｇ／ミリリットル）を得た。
【００１９】このようにして調製したリポソーム分散液
の粒経分布を、動的光散乱粒度計により測定したところ
３０〜２６０nm（平均粒径１９０nm）の分布を持ってい
ることが分かった。
の粒経分布を、動的光散乱粒度計により測定したところ
３０〜２６０nm（平均粒径１９０nm）の分布を持ってい
ることが分かった。
【００２０】次いでこのリポソーム分散液を、１重量％
のオクチルグルコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコ
シド；和光純薬社）を含む１０mMの塩化カリウム水溶液
で、種々の濃度に希釈して、０〜５０μｇ／ミリリット
ルのリン脂質基準液を得た後、これらのリン脂質基準液
を水浴型超音波発振装置で１分間処理した。
のオクチルグルコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコ
シド；和光純薬社）を含む１０mMの塩化カリウム水溶液
で、種々の濃度に希釈して、０〜５０μｇ／ミリリット
ルのリン脂質基準液を得た後、これらのリン脂質基準液
を水浴型超音波発振装置で１分間処理した。
【００２１】このリン脂質基準液のそれぞれの０．５ミ
リリットルに等量のＢＣＡ呈色液を加え、混合した後、
６０℃で１時間加温した。加温後、室温まで冷却してか
ら、光路長１cmのセルを用いて、５６２nmでの吸光度を
測定した。その値から、リポソームを含まない場合の吸
光度を減じ、リポソームの濃度を横軸に、吸光度を縦軸
によってプロットすると、これらの点は、原点を通る直
線にのり、その傾きは３．８９×１０-2となった。
リリットルに等量のＢＣＡ呈色液を加え、混合した後、
６０℃で１時間加温した。加温後、室温まで冷却してか
ら、光路長１cmのセルを用いて、５６２nmでの吸光度を
測定した。その値から、リポソームを含まない場合の吸
光度を減じ、リポソームの濃度を横軸に、吸光度を縦軸
によってプロットすると、これらの点は、原点を通る直
線にのり、その傾きは３．８９×１０-2となった。
【００２２】従って、上記と同様の操作で未知試料を処
理し吸光度を測定すれば、得られた吸光度（Ｙ）から未
知試料中の脂質濃度（Ｘμｇ／ミリリットル）を、Ｙ＝
３．８９×１０-2Ｘから求めることができる。
理し吸光度を測定すれば、得られた吸光度（Ｙ）から未
知試料中の脂質濃度（Ｘμｇ／ミリリットル）を、Ｙ＝
３．８９×１０-2Ｘから求めることができる。
【００２３】
【発明の効果】本発明により、従来煩雑で手間のかかっ
ていたリン脂質定量操作が、極めて簡便になった。特
に、本発明により、脂質を含む生体膜の研究や人工的に
合成した脂質を含む膜の組成の確認などにおける脂質集
合体を試料とする場合の脂質の定量のための極めて簡便
な方法を提供することができる。
ていたリン脂質定量操作が、極めて簡便になった。特
に、本発明により、脂質を含む生体膜の研究や人工的に
合成した脂質を含む膜の組成の確認などにおける脂質集
合体を試料とする場合の脂質の定量のための極めて簡便
な方法を提供することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大山 淳史 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (72)発明者 川口 正浩 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/92 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (5)
- 【請求項１】 水性媒体中で、脂質を含む試料を界面活
性剤で処理して脂質と界面活性剤とのミセル状態を有す
る試料分散液を調製する工程；および該試料分散液、２
価の銅イオンおよびビシンコニン酸を反応させ、次いで
該試料分散液の吸光度を測定する工程、 を有することを特徴とする脂質の定量方法。 - 【請求項２】 該界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウ
ム、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、３−
［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１
−プロパンスルホネート、６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカル
バモイル）−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、コー
ル酸およびデオキシコール酸から選ばれる１つである請
求項１記載の定量方法。 - 【請求項３】 上記界面活性剤による処理が超音波処
理、あるいは湯浴中での加熱である請求項１記載の定量
方法。 - 【請求項４】 上記吸光度の測定が、波長５６２ｎｍで
の測定である請求項１記載の定量方法。 - 【請求項５】 （ｉ）脂質を含む第１の試料を水性媒体
中で所定の条件で界面活性剤で処理して、該脂質と該界
面活性剤とのミセル状態を有する、脂質濃度が既知の第
１の試料分散液を調製し、該第１の試料分散液を用いて
脂質濃度が既知であって、脂質濃度が異なる複数の基準
液を調製する工程； （ii）該複数の基準液の各々を、２価の銅イオンおよび
ビシンコニン酸と反応させ、次いで該基準液の各々の吸
光度を測定して脂質濃度と吸光度の相関を求める工程；
および （iii）脂質を含んでいる可能性のある第２の試料を、
水性媒体中で該所定の条件下で界面活性剤で処理して脂
質濃度が未知の第２の試料溶液を調製し、該第２の試料
溶液と２価の銅イオンおよびビシンコニン酸と反応させ
たのち、該第２の試料溶液の吸光度を測定し、上記工程
（ｉ）および（ii）で得た脂質濃度と吸光度の相関から
第２の試料中の脂質濃度を算出する工程； を有することを特徴とする脂質の定量方法。
Priority Applications (12)
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