DE69233570T2

DE69233570T2 - Quantitativer Nachweis von Verbindungen in Coexistenz im System mit anderen Verbindungen

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Publication number: DE69233570T2
Application number: DE69233570T
Authority: DE
Inventors: Nobuko Ohta-ku Yamamoto; Yasuko Ohta-ku Tomida; Junji Ohta-ku Ohyama; Tsuyoshi Ohta-ku Nomoto; Masahiro Ohta-ku Kawaguchi
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1991-09-09
Filing date: 1992-09-08
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2012-09-09
Also published as: EP1022567B1; EP0767384A2; DE69220739D1; DE69233452T2; US5770452A; DE69233452D1; ATE284035T1; US5491093A; EP0531933A3; EP0767384B1; ATE155249T1; ATE312353T1; EP0531933A2; EP1022567A1; DE69233570D1; EP0531933B1; EP0767384A3; DE69220739T2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein einfaches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von jeder von zwei Komponenten, wie etwa Lipid und Protein, die in einem System koexistieren, ohne die Komponenten zu separieren.
Lipide sind Aufbaukomponenten von Zellen oder Organismen. Unter den Lipiden ist Phosphorlipid ein Hauptlipid beim Aufbau von verschiedenen Membranen in der Zelle, wie etwa Plasmamembran, Zellkernmembran, endoplasmatisches Reticulummembran, Mitochondrienmembran, Golgiapparatmembran, Lyosommembran und dergleichen. Das Phosphorlipid ist ein amphiphiles Molekül mit sowohl einer polaren Gruppe als auch einer hydrophoben Gruppe in dem Molekül. Wenn Phosphorlipid im Wasser suspendiert wird, werden die polaren Gruppen mit Wassermolekühlen hydratisiert, und die hydrophoben Gruppen werden aus der wässrigen Umgebung ausgeschlossen, um ein Sammeln der hydrophoben Gruppen der Lipide zu verursachen. Folglich werden Micellen, Lipidzweichfachschichten mit einer bimolekularen Membranstruktur, oder hexagonale II-Strukturen ausgebildet: Der Zustand des Sammelns abhängig von der Balance der Volumen der hydratisierten hydrophilen Gruppen und der hydrophoben Gruppen. Unter derartigen Strukturen ist die Lipid-Zweichfachschicht die Basisstruktur von Biomembranen. Die Zweifachschicht von Phosphorlipid bildet ein geschlossenes Vesikel (Liposom), welches Membranprotein oder dergleichen als einen Aufbaustoff davon einbauen kann und eine wässrige Phase darin einschließen kann. Daher wird die Phosphorlipidzweifachschicht-Struktur häufig als ein Modell für eine Biomembran für Substanzeindringung, Informationsübertragung usw. verwendet. Ferner ist das Liposom zur Verwendung als eine Medizinkapsel viel versprechend, da das Liposom eine wasserlösliche Substanz in deren internen wässrigen Phase halten kann.
Viele Verfahren sind zur quantitativen Bestimmung von Phosphorlipid bekannt, einschließlich eines Nassverbrennungsverfahren (Hoeflmayr, J. und Fried, R; Med. und Ern., 7, 9–10 (1966)) und ein Cholinoxidase-Phenolverfahren (Takayama, M., Itho, S. Nagasaki, T. und Tanimizu, I., Clin. Chim. Acta 79 93–98 (1977)). In den Nassverbrennungsverfahren wird das Phosphorlipid bestimmt, indem Schwefelsäure und ein Permanganatsalz zu einer Probe gegeben wird; die Mischung in einem siedenden Wasserbad erhitzt wird, um die zusammensetzende Phosphorsäure zu befreien; Ammoniummolybdat und ein Reduktionsmittel hierzu gegeben wird; und Messlichtabsorption, die durch Molebdemblau, das hierdurch ausgebildet wird, gemessen wird. In dem Cholinoxidase-Phenolverfahren wird das Phosphorlipid bestimmt, indem Phosphorlipase D mit dem Phosphorlipid in eine Probe umgesetzt wird, um das zusammensetzende Cholin zu befreien; ferner Cholinoxidase mit dem resultierenden Cholin umgesetzt wird, um Betain und Wasserstoffperoxid auszubilden; und Lichtabsorptionsvermögendes Produktes einer quantitativen Kondensationsoxidation von Phenol 4-Amino-Antipyrin gemessen wird, die durch Wasserstoffperoxid in der Gegenwart von Peroxidase verursacht wird.
Das vorstehend erwähnte Nassverbrennungsverfahren besitzt Nachteile bezüglich der Umständlichkeit des Verfahrens der aufeinander folgenden Zugabe von mehreren Reagenzien, und die Gefahr von Verschütt- und Messfehler durch Verdampfung auf Grund des Erhitzens in der Gegenwart von Schwefelsäure in einem siedenden Wasserbad. Das Cholinoxidase-Phenolverfahren besitzt Nachteile bezüglich der Instabilität des Enzyms, des Bedarfs der Lagerung der Reagenzien in der Kälte und Dunkelheit, und der unzureichenden Reproduzierbarkeit der Messdaten, die während dem Verstreichen von Zeit erhalten wird.
Im Allgemeinen wird eine absorptionsspektrochemische quantitative Analyse, in welcher das Absorptionsvermögen bei einer Absorptionswellenlängeneigenschaft des Analysegegenstands in der Probe gemessen wird, weithin praktisch in der quantitativen Bestimmung einer Substanz wegen der Einfachheit des Verfahrens der direkten Messung von Absorptionsvermögen, und der fehlenden Notwendigkeit des Umsetzens des Analysegegenstands mit einer anderen Substanz verwendet, was die Verwendung der Probe später für eine andere Verwendung ermöglicht. Jedoch ist dieses Analyseverfahren bei der Bestimmung von Lipiden nicht verwendet worden, da Lipide, wie etwa Phosphorlipid, das aus amphiphilen Molekülen zusammengesetzt ist, in einem wässrigem Medium ein Aggregat in verschiedenem Zustand bilden, welches Licht streut und eine genaue Messung der Lipidkonzentration durch Lichtabsorptionsvermögen verhindert.
US-A-4839294 offenbart ein enzymfreies, nicht hydrolisierendes Messverfahren, das zur Bestimmung eines Lipidgehalts eines lipidhaltigen Fluids nützlich ist, welches umfasst: Ausbilden eines wasserunlöslichen Komplexes eines geladenen Farbstoffes und eines entgegengesetzt geladenen Detergents, Inkubieren des Farbstoffdetergentskomplexes in einer wässrigen Dispersion eines lipidhaltigen Fluids, wodurch dem lipidhaltigen Fluid eine charakteristische Farbe verliehen wird.
Die Zusammensetzungskomponenten von lebender Materie, wie etwa Lipide, Proteine, Nucleinsäuren, Zuckern, werden häufig in einem koexistierenden Zustand gehandhabt. Daher ist eine quantitative Bestimmung von derartigen koexistierenden Substanzen ein wichtiges Verfahren.
GB-A-2043244 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von zwei oder mehr Komponenten in einer flüssigen Probe. In dem Verfahren werden Reagenzien für die verschiedenen Komponenten zu der Probe gegeben, wobei die Zusammensetzung der Reagenzien derart ausgewählt wird, dass die separaten Komponenten für unterschiedliche Bestimmungen sich nicht gegenseitig stören. Absorptionen der jeweiligen Reaktionsprodukte werden in der Probe bei zwei verschiedenen Wellenlängen gemessen.
Biomembrane besitzen die Struktur einer zweischichtigen Membran, die hauptsächlich aus Lipidmolekülen zusammengesetzt ist, und Protein sich darin durch nichtcovalente Bindungen sammelt, wodurch diese als Barriere zum Beibehalten des inneren Mediums funktionieren. Das Verhältnis von Lipid zu Protein in Biomembranen unterscheidet sich erheblich abhängig von den jeweiligen Membranen. In den Mitochondrienmembranen ist z.B. Protein viermal so viel wie Lipid enthalten. Im Gegensatz dazu ist in einigen Biomembranen Lipid einige Male soviel wie Protein enthalten. Demgemäß ist das Verhältnis von Lipid zu Protein in Biomembran in jeweiligen Organen ein wichtiger Gegenstand der Untersuchung.
Verschiedene Biomembranmodelle, in welchen Lipid und Protein koexistieren, werden weithin bei der Untersuchung der Struktur und der Funktion der Biomembranen verwendet. Die Beispiele beinhalten Proteoliposom, welches geschlossene Vesikel besitzt, die aus einer künstlichen bimolekularen Lipidmembran zusammengesetzt sind, die darin Protein enthalten; Feinteilchen aus Glasperlen oder einem Hochpolymer, welche Lipid oder Protein besitzen, das auf deren Oberfläche adsorbiert ist; eine planare Lipidmembran, die in einem kleinen Loch in einem Substrat aus Teflon oder dergleichen (einer schwarzen Lipidmembran), oder ein planarer bimolekularer Film, der umgebaut wurde, indem eingestochen oder patchpipitiert wurde, in welchen Protein eingebaut wurde; und Langmuir-Blodgett Aufbaufilme (LB Aufbaufilme), in welchen ein Lipidprotein koexistierendes System in Schichten in einem molekularen Niveau aufgebaut ist. In diesen künstlichen Filmen ist auch die Bestimmung des Lipids und des Proteins beim Bewerten von deren Funktion wichtig.
Wenn das optimale Verhältnis von Lipid zu Protein in natürlichen oder künstlich sensitisierten Membranstrukturen durch quantitative Bestimmung erhalten werden kann, und eine Membran effektiv gemäß dem abgeleiteten Verhältnis synthetisiert werden kann, dann können unterschiedliche Membranstrukturen industriell bei niedrigen Kosten synthetisiert werden, ohne wertvolles Protein zu verschwenden.
Weitere Beispiele für Lipid-Protein koexistierende Systeme beinhalten Liposom, das heißt ein geschlossenes Vesikel, das aus Phosphorlipidmembran zusammengesetzt ist, in welchem ein funktionales Protein, wie etwa wasserlösliches Enzym eingeschlossen ist; und Emulsionen, in welchen Lipid und Protein einfach in einem flüssigen Medium vermischt werden.
Bisher wird bei der Bestimmung von Lipid und Protein in einem koexistierenden System die Bestimmung von Lipid durch das Vorhandensein von Protein beeinträchtigt, und die Bestimmung von Protein wird durch das Vorhandensein von Lipid beeinträchtigt. Daher konnten Lipid und Protein nicht genau in einem koexistierenden Zustand bestimmt werden. Bei der Bestimmung von Lipid durch die vorstehend erwähnte Absorptionsvermögensmessung, ist der Einfluss des Absorptionsvermögens von koexistierendem Protein nicht vernachlässigbar.
Verschiedene Verfahren zum Bestimmen von Protein sind bekannt, einschließlich Colorimetry, die ein Metallion verwendet, UV-Absorptionsverfahren, basierend auf Tyrosin und Triptophan, und UV-Absorptionsverfahren, basierend auf Peptidbindungen. Ein typisches Verfahren der Colorimetry ist ein Lowery-Verfahren (J. Biol. Chim., Band 193, Seite 265 (1951)), das ein Phenolreagenz verwendet. Dieses Verfahren verwendet eine blaue Farbe, die durch Reaktion eins Phenols mit Protein entwickelt wird. Die Hauptkomponente des Reagenz ist Phosphormolybdate oder Phosphorwolframat, ein kompliziertes Komplex, der aus dem Metalloxid und Phosphorsäure gebildet wird. Dieser Komplex reagiert mit einem Reduktionsmittel, wie etwa Protein, um blaue Farbe von Phospormolybdatblau oder Phosphorwolframtat blau zu entwickeln. Das Protein wird durch Messung des Absorptionsvermögens, das durch die Farbe verursacht wird, bestimmt. In einem Farbreaktionsverfahren, das BCA-Verfahren genannt wird, wandelt Protein ein Kupfer(II)Ion in ein Kupfer(I)Ion in einem alkalischem Medium um, und das Kupfer(I)Ion bildet eine purpurfarbene Komplexverbindung mit Bizinnchonsäuremolekül (das heißt BCA: 4,4'-dicarbonsäure-2,2'-biquinolin). Das Protein wird gemäß dem Absorptionsvermögen dieser Komplexverbindung bestimmt.
Im Gegensatz dazu beinhaltet das UV-Absorptionsverfahren zur Bestimmung von Protein die Messung von Absorption bei 280 nm, die durch Tyrosin oder Triptophan verursacht wird, und Messung der Absorption von 215 bis 225 nm, die durch die Peptidbindung verursacht wird. Beide Messverfahren sind dadurch vorteilhaft, dass das Verfahren einfach ist und die Probe nicht im Vergleich mit Farbentwicklungsverfahren verloren geht, aber sind darin nachteilhaft, dass die Messung von Protein auf dem Gehalt von Tyrosin oder Triptophan basiert und das Bestimmungsergebnis abhängig von den Arten des Proteins erheblich variiert und auf eine Störsubstanz, wie Nucleinsäure, empfindlich ist, welche eine Absorption in diesem Absorptionsbereich besitzt.
In diesen Verfahren zum Bestimmen von Protein wird koexistierendes Lipid auch einer Reaktion zur Entwicklung von Farbe unterzogen. Zum Beispiel wird in dem Lowry-Verfahren und anderen Verfahren, die ein Phenolreagent verwenden, das Phosphormolybdat durch das Protein reduziert, um eine blaue Farbe von Phosphormolybdat blau zu entwickeln, und gleichzeitig entwickelt das koexistierende Lipid, welches eine Reduktionsaktivität ähnlich dem Protein zeigt, auf ähnliche Weise Farbe.
Demgemäß müssen bei der quantitativen Bestimmung von jeweils Lipid und Protein, die einem System koexistieren, diese vor der Bestimmung von Lipid und Protein separiert werden.
Die Separierung wird gewöhnlich durch ein Extraktionsverfahren durchgeführt, in welchem die Lipidkomponente in der Probe in einer organischen Lösungsmittelschicht aufgelöst wird und als eine organische Lösungsmittelfraktion wiedergewonnen wird, und die Proteinkomponente, die in dem organischen Lösungsmittel unlöslich ist, wird als eine wässrige Fraktion wiedergewonnen. Die erhaltene organische Lösungsmittelfraktion wird bis auf trockene konzentriert und verdampft, und wird quantitativ als die Lipidfraktion bestimmt. Die wässrige Fraktion, die das Protein enthält, wird konzentriert und das Protein darin wird quantitativ durch verschiedene Verfahren bestimmt.
So ist die herkömmliche Bestimmung von Lipid und Protein, die in einem System koexistieren, extrem kompliziert.
In herkömmlichen Verfahren ist es trotz der komplizierten Verfahren wahrscheinlich, dass das Protein in die organische Lösungsmittelschicht eindringt, und, dass das Lipid in die wässrige Schicht in bestimmten Verhältnissen eindringt, da die Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel auf einer Gleichgewichtsverteilung basiert, welche häufig einen Bestimmungsfehler verursacht. Darüber hinaus ist der Verlust der Probe bei dem Extraktionsverfahren nicht vernachlässigbar, sodass eine relativ große Menge einer Probe benötigt wird. Darüber hinaus können bei der Bestimmung von Lipid und Protein, die in einer Membranstruktur enthalten sind, stark hydrophobes Protein, die in einer Membranstruktur enthalten sind, stark hydrophobes Protein, wie etwa Membranprotein, die organische Lösungsmittelfraktion mit hoher Wahrscheinlichkeit kontaminieren, und das Lipid und das Protein können möglicherweise in einem nicht separierten Zustand in der organischen Schicht existieren, welches eine genaue quantitative Bestimmung verhindert.
Die vorstehende Diskussion bezieht sich auf ein Zweikomponentensystem, das Lipid und Protein enthält. Die gleiche Diskussion kann bezogen auf ein Zweikomponentensystem, das zwei Komponenten enthält, ausgewählt aus Lipiden, Zuckern, Nucleinsäuren, Pigmenten und verschiedenen Medikamenten, durchgeführt werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein vereinfachtes Verfahren zur quantitativen Bestimmung jeweils von zwei Komponenten, wie etwa Lipid und Protein, die in einem Zweikomponentensystem koexistieren, ohne die Komponenten zu separieren, durchzuführen, um die vorstehend erwähnten Probleme beim Bestimmen der Komponenten in dem Zweikomponentensystem zu lösen.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Verbindung A und einer Verbindung B in einer unbekannten Probe, die die Verbindung A und die Verbindung B in einem flüssigem Medium enthält, bereitgestellt, das die Bestimmung der Verbindung A durch ein Bestimmungsverfahren a, um einen Messwert Va zu erhalten und danach Bestimmen der Verbindung B durch ein Bestimmungsverfahren b, um einen Messwert Vb zu erhalten, umfasst, wobei das Ergebnis der Bestimmung einer Verbindung das Ergebnis der Bestimmung der anderen Verbindung beeinflusst und jeweilige tatsächliche Konzentrationen (x, und y) der Verbindung A und der Verbindung B aus den Gleichungen (I) und (II) abgeleitet werden: Va = x·a1 + y·a2 (I) Vb = x – b1 + y – b2 (II)worin a₁ eine Konzentrationskonstante der Verbindung A in dem Bestimmungsverfahren a ist, wenn die Verbindung A allein in dem flüssigem Medium existiert; a₂ eine Konzentrationskonstante der Verbindung B in dem Bestimmungsverfahren a ist, wenn die Verbindung B allein in dem flüssigem Medium existiert, b₁ eine Konzentrationskonstante der Verbindung A in dem Bestimmungsverfahren b ist, wenn die Verbindung A allein in dem flüssigem Medium existiert; b₂ eine Konzentrationskonstante der Verbindung B in dem Bestimmungsverfahren b ist, wenn die Verbindung B allein in dem flüssigem Medium existiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht ein Ergebnis zur quantitativen Bestimmung von koexistierendem Phosphorlipid und Protein gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 veranschaulicht ein Ergebnis zur quantitativen Bestimmung von Protein in einem Phosphorlipid-Protein koexistierenden System gemäß einem herkömmlichen Verfahren.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Zunächst werden zwei Verfahren zum Bestimmen von Lipid, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, nachstehend beschrieben.
In diesen Lipidbestimmungsverfahren, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wird das Lipid mit einem oberaktiven Mittel behandelt, um eine Micelle zu bilden, aus dem Lipid und dem oberflächenaktiven Mittel zusammengesetzt ist, um die quantitative Bestimmung zu ermöglichen. Zum Beispiel wird im Fall eines amphiphiden Lipids, wie etwa Phosphorlipid, ein Lipidaggregat, das in einem wässrigem Medium gebildet wird, mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt, um einen Micellenzustand zu bilden, der aus dem Lipid und dem oberflächenaktiven Mittel zusammengesetzt ist. Die geeignete Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel ist eine Ultraschallbehandlung oder eine Wasserbaderhitzungsbehandlung. Eine Minute der Ultraschallbehandlung, oder Erhitzen auf ein Wasserbad bei 60°C für 10 Minuten oder länger ist ausreichend. Eine unbekannte Probe und eine Standardprobe sollten auf die gleiche Weise behandelt werden.
Durch eine derartige Behandlung wird das Phosphorlipid mit einem oberflächenaktiven Mittel in einem Micellenzustand entsprechend der Lipidkonzentration unabhängig von der Form des Aggregats, wie etwa Liposom, einer planaren Membran, und einer hexagonalen II-Struktur, gebracht.
In einem ersten Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Lipid wird mit einem oberflächenaktiven Mittel, das keine UV-Absorption in dem gemessenen UV-Bereich zeigt, die UV-Absorption nur durch das Lipid in einem Lipidoberflächenaktiven Mittel Micellenzustand verursacht und das Absorptionsvermögen hängt nur von der Konzentration des Lipids ab, sodass die Lipidkonzentration bestimmt wird, indem das UV-Absorptionsvermögen gemessen wird. Irgendeine Wellenlänge kann für die Absorptionsvermögensmessung innerhalb des Bereichs von 230 bis 290 nm ausgewählt werden, wenn irgendeine Substanz, die sich von Lipid unterscheidet, nicht existiert. Jedoch muss, wenn eine andere Substanz angenommen wird, die Wellenlänge derart ausgewählt werden, dass die koexistierende Substanz keine oder wenig Absorptionsvermögen zeigt. In Forschungsgebieten, in denen eine Biomembran gehandhabt oder eine solche vorkommt, ist die angenommene koexistierende Substanz in den meisten Fällen Protein. Unter diesen Umstand wird die Wellenlänge vorzugsweise bei ungefähr 240 nm ausgewählt, wobei die maximale Absorption des Proteins von 280 nm vermieden wird.
Irgendein oberflächenaktives Mittel kann verwendet werden, welches keine Absorption in dem UV-Bereich zeigt. Ein Beispiel für ein nützliches oberflächenaktives Mittel beinhaltet Octylglucosid (n-octyl-β-D-glucopyranosid), CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-Propansulfonat, und HECAMEG (6-O-(N-heptylcarbamoyl)-methyl-α-D-glucopyranosid).
In einem zweiten Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Lipid fungiert das Lipid mit einem oberflächenaktiven Mittel in einem Micellenzustand als reduzierendes Mittel, um ein Kupfer(II)Ion in ein Kupfer(I)Ion in einem wässrigen Medium umzuwandeln. Das resultierende Kupfer (I) Ion bildet mit dem Natriumsalz von Bicinchonsäure (4,4'-dicarbonsäure-2,2'-biquinolin) eine Komplexverbindung mit purpurner Farbe. Da diese Reaktion quantitativ voranschreitet, kann Lipid quantitativ durch Messung des Absorptionsvermögens bestimmt werden, das durch die Farbe der Komplexverbindung verursacht wird.
Das oberflächenaktive Mittel, das bei dieser Bestimmung nützlich ist, beinhaltet nichtionische oberflächenaktive Mittel, und anionische oberflächenaktive Mittel, aber diese sind nicht besonders begrenzt. Die spezifischen Beispiele sind Triton X-100, SDS (Natrium Dodecylsulfat), Biiji 35, Octylglucoside (n-octyl-β-D-glucopyranosid), CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat), HECAMEG (6-O-(N-heptylcarbamoyl)-methyl-α-D-glucopyranosid), Cholinsäure, Deoxycholinsäure, und dergleichen.
Die Farbreaktion von Kupfer(II)Ionen mit Bicinchonsäure ist auch als ein Verfahren zur Bestimmung von Protein bekannt, indem die reduzierende Wirkung von Protein verwendet wird (Anal. Biochem., 150, Seite 76 (1985)). Dieses Verfahren basiert auf dem Prinzip, dass das Kupfer (II)Ion in Kupfer(I)Ion in Gegenwart von Protein in einem alkalischen Medium umgewandelt wird, und das resultierende Kupfer(I)Ion eine Purpurfarbene Komplexverbindung mit dem Bicinchonsäuremolekül bildet. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass dies Reaktion nicht nur auf Protein sondern auch auf Lipid, das eine ähnliche Reaktivität zeigt, empfindlich ist, und die vorliegende Erfindung basierend auf diese Entdeckung vervollständigt.
Nicht alle Verfahren zur quantitativen Bestimmung vom Protein sind auf die quantitative Bestimmung von Lipid anwendbar. Das Verfahren zur Bestimmung von Proteinen durch Verwendung von Bicenchonsäure ist auf die quantitative Bestimmung von Lipid anwendbar. Zum Beispiel kann erwartet werden, dass da zuvor erwähnte Lowry-Verfahren zur Proteinbestimmung, welches eine reduzierende Wirkung von Protein verwendet, zur Proteinbestimmung durch Verwendung eines Lipids, das eine reduzierende Wirkung an Stelle von Protein zeigt, nützlich ist. Tatsächlich ist jedoch die Empfindlichkeit gegenüber Lipid ungefähr 100stel derjenigen gegenüber Protein. Im Gegensatz dazu ist die Empfindlichkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung nur geringfügig geringer als diejenige gegenüber Protein, ungefähr ein drittel derjenigen gegenüber Protein, was empfindlicher als herkömmliche quantitative Lipidbestimmungsverfahren ist. Ferner ist dieses Verfahren beim Betrieb einfach. Daher ist das zweite Verfahren zur Bestimmung von Lipid leicht in der Praxis umsetzbar, wenn als ein Ganzes betrachtet.
In dem zweiten Verfahren wird eine Lipidprobendispersion, die durch Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel gebildet wurde, mit einem Farbreagent umgesetzt, das Bicinchonsäure und Kupfer(II)Ion enthält, und das Absorptionsvermögen, das durch die purpurne Farbe verursacht wird, die durch das Vorhandensein von Lipid entwickelt wurde, wird gemessen. Die Bicinchonsäure und das Kupfer(II)Ion werden im Überschuss der Menge zur Reaktion des gesamten Lipids in der Probe zugegeben. Gewöhnlich beträgt die Endkonzentration der Bicinchonsäure ungefähr 1%, und diejenige des Kupfer(II)Ions von ungefähr 0,01 bis 0,1%, und die Probendispersion wird verdünnt, um in dieser Reagenzkonzentration gemessen zu werden. Die Reaktionsbedingung kann in geeigneter Weise ausgewählt werden. Zum Beispiel kann eine Erhitzungsbehandlung der ungefähr 60°C für ungefähr eine Stunde praktiziert werden, und auf Raumtemperatur abgekühlt werden, und das Absorptionsvermögen kann bei einer Wellenlänge von z.B. 526 nm gemessen werden. Dieses Verfahren zur Bestimmung von Lipid besitzt Vorteile, dass die Reagenzien auf einmal zugegeben werden und der gefärbte Zustand für eine lange Zeit stabil ist, die Empfindlichkeit höher als bei anderen Lipidbestimmungsverfahren ist, und das Verfahren sehr einfach ist.
Bei den vorstehenden zwei Verfahren zur Lipidbestimmung wird das Lipid mit einem oberflächenaktiven Mittel in einem wässrigen Medium behandelt. Jedoch muss das Lipid, das bestimmt wird, nicht ursprünglich in einem Suspensionszustand in einem wässrigen Medium sein. Zum Beispiel wenn die Probe fest ist, wird die Bestimmung durchführbar gemacht, indem die Feststoffprobe mit einem vorgeschriebenen Volumen einer wässrigen oberflächenaktiven Mittellösung behandelt wird.
Die Zusammensetzung des wässrigen Mediums zum Zusammensetzen des Reaktionssystems ist nicht besonders begrenzt, wenn die Ionenstärke und er PH innerhalb der Bereiche sind, in welchen die Lösungsfähigkeit des oberflächenaktiven Mittels beibehalten wird. Die unbekannte Probe und die Standardprobe sollten bei dem gleichen PH und der gleichen Ionenstärke oder Salzkonzentration behandelt werden. In dem zweiten Verfahren zur Bestimmung der vorliegenden Erfindung beträgt der optimale PH-Wert zur Farbreaktion 11,25. Daher ist es unerwünscht, eine Stark saure Lösung zu verwenden, welche die PH des Mediums auf eine saure Seite verschieben wird.
Das Verfahren zur Bestimmung von zwei koexistierenden Komponenten gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird nachstehend beschrieben.
Die Kombination der Verbindung A und Verbindung B als die zwei Komponenten in der vorliegenden Erfindung ist derart, dass das Ergebnis der Bestimmung einer Komponente das Ergebnis der Bestimmung der andern Komponente beeinflusst. Die zwei Komponenten werden zusätzlich zu der Kombination von Lipid und Protein aus Lipiden, Zuckern, Nucleinsäuren, färbenden Stoffen und anderen Medikamenten ausgewählt. Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann Testmenge einer unbekannten Probe durch Einführung eines Bestimmungsverfahrens minimiert werden, welches die Probe durch Umsetzung nicht zerstört, wie etwa Absorptionsmessung, als wenigstens eine der Bestimmungsverfahren a und b.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird im Detail anhand spezifischer Beispiele beschrieben, wo die Verbindung A Lipid ist und die Verbindung B Protein ist.
Zunächst wird durch das Bestimmungsverfahren a, das zur Lipidbestimmung ausgewählt wurde, eine Kalibrierungskurve (eine lineare Funktion) für das allein existierende Lipid hergestellt, und ein Gradient der Kurve (eine Konzentrationskonstante a₁) wird abgeleitet. Dann erhält man die folgende Gleichung: VLa = La·a1 (III)worin La eine Konzentration des Lipids ist, und VLa ein Messwert gemäß dem Bestimmungsverfahren a ist.
Eine unbekannte Probe, die sowohl Lipid als auch Protein enthält, wird durch das Bestimmungsverfahren a unter den gleichen Bedingungen wie bei Herstellung der Kalibierierungskurven analysiert, um eine Messwert Va zu erhalten. Da die unbekannte Probe sowohl Lipid als auch Protein enthält, entspricht der Wert Va einer scheinbaren Lipidkonzentration, die durch das Vorhandensein des Proteins beeinflusst wird. Wenn die tatsächliche Lipidkonzentration x beträgt und die tatsächliche Proteinkonzentration y beträgt, ist die folgende Gleichung aus den vorstehenden Gleichungen (III) und (IV) gültig: Va = x·a1 + y·a2 (V)
Andererseits wird durch das Bestimmungsverfahren b, das zur Proteinbestimmung ausgewählt ist, eine Kalibrierungskurve (eine Linearfunktion) für allein existierendes Lipid hergestellt, und der Gradient der Kurve (eine Konzentrationskonstante b₁) wird abgeleitet. Dann erhält man die folgende Gleichung: VLb = Lb·b1 (VI)worin Lb die Konzentration des Lipids ist und VLb ein Messwert gemäß dem Bestimmungsverfahren b ist.
Ferner wird für allein existierendes Protein eine Kalibrierungskurve (eine lineare Funktion) mit dem Bestimmungsverfahren b, und ein Gradient der Kurve (eine Konzentrationskonstante a₂)wird abgeleitet. Dann erhält man die folgende Gleichung: VPb = Pb·b2 (VII)worin Pb die Konzentration des Proteins ist, und VPb ein Messwert gemäß dem Bestimmungsverfahren b ist.
Eine unbekannte Probe, die sowohl Lipid als auch Protein enthält, wird durch das Bestimmungsverfahren b unter den gleichen Bedingungen wie bei Herstellung der Kalibrierungskurven analysiert, um einen Messwert Vb zu erhalten. DA die unbekannte Probe sowohl Lipid als auch Protein enthält, entspricht der Wert Vb einer scheinbaren Proteinkonzentration, die durch das Vorhandensein des Lipids beeinflusst wird. Daher ist, unter der Annahme der tatsächlichen Lipidkonzentration als x und der tatsächlichen Proteinkonzentration als y die folgende Gleichung aus den vorstehenden Gleichungen (VI) und (VII) gültig: Vb = x·b1+ y·b2 (VIII)
In den vorstehenden Gleichungen (V) und (VIII) wurden die Konzentrationskonstanten bereits ermittelt. Daher können die tatsächlichen Konzentrationen des Lipids und des Proteins erhalten werden, indem die Messwerte auf die Gleichungen angewendet werden und die gekoppelten linearen Gleichungen gelöst werden.
Wenn eines aus Lipid und Protein in einer extrem niedrigen Menge vorliegt und gemäß dem angewendeten Bestimmungsverfahren praktisch vernachlässigbar ist, kann die scheinbare Konzentration der anderen als die tatsächliche Konzentration betrachtet werden.
Ein beliebiges Verfahren der Analyse eines Zweikomponentensystems aus Lipid und Protein kann angewendet werden, vorausgesetzt, dass die vorstehende Berechnung angewendet werden kann. Zum Beispiel werden zur Bestimmung von Lipid das erste Verfahren und das zweite Verfahren, die vorstehend beschrieben wurden, erwähnt.
Bei Herstellung der Kalibrierungskurve in dem ersten Verfahren zur Bestimmung von Lipid wird idealerweise das Lipid, das kein Protein enthält und in der gleichen Form wie dasjenige in der unbekannten Probe ist, als das Standardlipid verwendet, und eine Serie von Lösungen von unbekannten Lipidkonzentrationen werden hergestellt. Zum Beispiel, wenn der Gegenstand, der bestimmt wird Proteoliposom ist, ist es bevorzugt, Liposom herzustellen und eine bekannte Konzentrationsserie des Liposoms bereitzustellen. In der Praxis kann jedoch eine einfache Emulsion von Lipid und einem oberflächenaktiven Mittel zur Kalibrierung stattdessen verwendet werden. Wenn der Gegenstand, der bestimmt wird, Proteoliposom ist, wird ein oberflächenaktives Mittel, wie etwa Octylglucosid, zu Lipid für Proteoliposom bei einer Endkonzentration von 1% gegeben; die Mischung wird einer Ultraschallbehandlung unterzogen; und das Absorptionsvermögen wird bei einer optischen Wellenlänge von 1 cm bis einer Wellenlänge 240 nm gemessen. Der Messwert entspricht der Summe der Absorption, die durch das Lipid und das Octylglucosid verursacht wird. Demgemäß wird eine Lösung, die kein Lipid enthält, auf die gleiche Weise Behandelt, und der Beitrag des Octylglucosids wird berechnet, um einen Leerwert zu erhalten.
Andererseits beinhaltet das Verfahren zur Bestimmung von Protein ein BCA-Verfahren, ein Lowry-Verfahren und dergleichen, wie vorstehend erwähnt. In dem Lowry- Verfahren wird die Kalibrierungskurve hergestellt, indem jeweils eine alkalische Kupferlösung zu einer bekannten Menge von Lipid oder einer bekannten Menge von Protein gegeben wird, die Mischung für 10 Minuten stehengelassen wird; dann eine Folin-Lösung hinzugegeben wird; und nach 30 Minuten oder länger hiervon das Absorptionsvermögen bei 750 nm gemessen wird, um die Kalibrierungskurve herzustellen. Separat wird eine Kontrolllösung, welche weder Lipid noch Protein enthält, hergestellt und das Absorptionsvermögen dieser Lösung wird von dem Absorptionsvermögen bei jeder Konzentration von Lipid oder Protein abgezogen, um wahre Kalibrierungskurven (lineare Funktionen) für das Lipid und das Protein zu erhalten.
Die Kombination des Verfahrens zur Bestimmung von Lipid und des BCA-Verfahrens oder des Lowry-Verfahrens ermöglicht in vorteilhafter Weise eine quantitative Analyse einer Probe, in welcher Lipid in einer komplexen Struktur, wie etwa einer Membranstruktur, ist. Ferner ermöglicht die Kombination dieser Bestimmungsverfahren auf eine einfache Weise die Bestimmung von Lipid und Protein sogar in einem komplizierten Zwei-Komponentensystem, wie etwa Protein, das in einer Liposommembran oder einem Vesikel, inkorporiert ist; Glasperlen oder Feinpolymerteilchen mit Lipid und Protein, die auf deren äußeren Oberfläche adsorbiert sind; schwarze Membranen, die Protein enthalten; planare bimolekulare Filme, die Protein enthalten, die durch ein Anhaftverfahren oder Probenpipetierverfahren umgebaut wurden, und LB-Filme, die aus Protein und Lipid in gemischter Weise ausgebildet wurden.
Im Übrigen zerstört das erste Verfahren zur Bestimmung von Lipid nicht die Probe durch Reaktion mit einem Reagenz oder andere Ursachen. Daher kann die Probe, die diesem Verfahren zur Bestimmung unterzogen wird, ferner einer anderen Bestimmung unterzogen werden, wodurch die Menge zum Testen von unbekannten Proben minimiert wird. Ferner beinhaltet die Kombination dieser drei Verfahren zur Bestimmung relativ wenige Schritte als ein Ganzes, und ist angesichts des Minimierens des Verlustes der Probe bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung wird in größerem Detail anhand von Beispielen beschrieben.
Beispiel 1
Zunächst wurden Proben zur Herstellung der Kalibrierungskurven für jeweilige Messungen hergestellt. Sojabohnenphosphorlipid (Asolectin), das 15 mg Lipid entspricht, wurde in ein Testrohr mit einer Länge von ungefähr 130 mm und einem Durchmesser von 10 mm gestellt, und ein ml wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung und 50 μl wässrige 20%ige Octylglucosidlösung wurden hierzu gegeben. Die Mischung wurde mittels eines Ultraschalloszillators vom Wasserbadtyp eine Minute behandelt, um das Lipid zu dispergieren. Diese Suspension von Lipidmicellen wurde in Testrohre gefüllt, um 10 Niveaus von Volumen der Suspension bereitzustellen, wobei um 10 μl in einer Reihe von 100 μl bis 10 μl variiert wurde. Separat wurde die Kontrolle, die kein Lipid enthielt, hergestellt.
Dann wurde zu den jeweiligen Testrohren, 10 mm Kaliumchloridlösung, das 1% Octylglucosid enthielt zugegeben, um das Endvolumen von jeder Probe auf 1 ml einzustellen, und jede der verdünnten Proben wurde mit einem Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp eine Minute behandelt. Dann wurde das Absorptionsvermögen der behandelten Probe mit einer Zelle von 1 cm bei einer Wellenlänge von 240 nm gemessen. Ein Absorptionsvermögen von 0,0489, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle war, die kein Lipid enthielt, wurde von jeder der vorstehend gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierenden Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei das Absorptionsvermögen der Ordinate und die Lipidkonzentration als die Abszisse genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient a₁ der Linie betrug 0,400 × 10^–3.
Dementsprechend ergibt sich: AL = 0,400 × 10–3x,worin x (μg/ml) die Endkonzentration des Lipids in der unbekannten Probe ist.
Das Protein, das zur Kalibrierung verwendet wurde, war das Gleiche wie dasjenige, das in die unbekannte Probe eingebaut war. In diesem Beispiel wurde Bacteriorhodopsin verwendet, welches ein Membranprotein ist. Dieses Protein wurde gewonnen, indem eine purpurfarbene Membran aus einer hyperhalophilien Bakterie, Halobakterium Halobium, extrahiert wurde [Method. enzymol., 31, Seiten 667–78 (1974)], und Lipid aus der purpurfarbenen Membran gemäß dem Verfahren von K.S. Huang entfernt wurde [Proc. Natl., Acad. Sci., USA, 77, Seite 323 (1980)]. Eine wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung, die dieses Bacteriorhodopsin bei einer Konzentration von 500 μg/ml enthielt wurde in 8 Testrohre in Mengen gefüllt, die um 2.5 μl variierten, von 20 μl bis 2,5 μl.
In jede der Testrohre wurden 50 μl wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung gefüllt, die Octylglucosid bei einer Konzentration von 20% enthielt. Ferner wurden 10 mm Kaliumchloridlösung zu jeder Probe bis auf das Gesamtvolumen von 1 ml gegeben. Die jeweiligen Mischungen wurden mit einem Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp eine Minute behandelt. Deren Lichtabsorptionsvermögen wurde bei 240 nm mit einer 1 cm Zelle gemessen. Ein Absorptionsvermögen von 0,0489, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle war, die kein Protein enthielt, wurde von jeder der vorstehenden gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierenden Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei das Absorptionsvermögen das die Ordinate und die Proteinkonzentration als die Abszisse genommen wurden. die aufgetragenen Werte ergaben eine Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient b1 der Linie betrug 2,7 × 10^–3. Demgemäß ergab sich: AP = 2,7 × 10–3yworin y (μg/ml) die Endkonzentration des Proteins in der unbekannten Probe ist.
Anschließend wurde in Kalibrierungskurven für Lipid und Protein für das Lowry-Verfahren hergestellt. 10 Volumen, die um 10 μl variierten, von 100 μl bis 10 μl aus Lipidsuspensionsflüssigkeit wurden in 10 Teströhren jeweils eingefüllt. IN jede von diesen wurde eine wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, auf ein Endvolumen von 250 μl gefüllt. Dann wurden 500 μl alkalische Kupferlösung (zusammengesetzt aus: 0,2 N NaOH, die 4% NA₂CO₃ und 2% Natriumdodecylsulfat enthielt, 2% CuSO₄·5 H₂O, und 4% Natriumcitrat in dem Verhältnis von 100:1:1) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten stehengelassen. Ferner wurde hierzu 10 μl Phenolreagenz gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen. Dann wurde das Absorptionsvermögen bei 750 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen wurde mit der Kontrolllösung gemessen, welche weder Lipid noch Protein enthielt. Ein Absorptionsvermögen von 0,058, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle war, die kein Lipid enthielt, wurde von jeder der vorstehenden gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierenden Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei das Absorptionsvermögen als die Ordinate und die Lipidkonzentration als die Abszisse genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf eine Linie, die durch den Ursprung ging, der Gradient a₂ der Linie betrug 3,03 × 10^–4. Demgemäß ergab sich: BL. = 3,03 × 10–4xworin x (μg/ml) die Endkonzentration des Lipids in der unbekannten Probe ist.
Auf die gleiche Weise wie in der zuvor erwähnten Proteinbestimmung durch Absorptionsvermögen wurden 8 Proben von Bacteriorhodopsin hergestellt. Ein wässriges 10 nm Kaliumchloridlösung, das 1% Octylglucosid enthielt, wurde zu jeder der Proben bis auf das Endvolumen von 250 μl gegeben. Hierzu wurde 500 μl alkalische Kupferlösung gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen. Ferner wurde hierzu 100 μl des Phenolregents gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen gelassen. Das Absorptionsvermögen wurde bei 750 nm für jede der Proben gemessen. Ein Absorptionsvermögen von 0,058, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle war, die kein Protein enthielt, wurde von jeder der vorstehenden gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierenden Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei das Absorptionsvermögen als die Ordinate und die Proteinkonzentration als die Abszisse genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung ging, der Gradient b₂ der Linie betrug 2,99 × 10^–2. Demgemäß ergab sich: BP. = 2,99 × 10–2yworin y (μg/ml) die Endkonzentration des Protein in der unbekannten Probe ist.
Eine unbekannte Probe, die der Bestimmung unterzogen wurde, wurde durch Beschichten von Glasperlen mit einer Flachen Membran hergestellt. In diesem Beispiel wurde die flache Membran, die gemäß dem in der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 2-59075 beschrieben wurde, hergestellt. Zunächst wurden 0,5 g poröse Glasperlen (hergestellt von Asahi Glass Co., Ltd.; Teilchendurchmesser: 5 μm, spezifische Oberfläche: 200 m²/g) mit einer erhitzten 5%igen Lösung von Extran (hergestellt von Merck Co.) gewaschen, unter Verwendung einer Ultraschallwaschvorrichtung vom Wasserbadtyp 30 Minuten behandelt, mit fließendem Wasser 30 Minuten gewaschen, und in einem Ofen bei einer Temperatur von 110 bis 150°C getrocknet. Die getrockneten Galsperlen wurden in eine Lösung gefüllt, die aus 2 ml Octadecyltrichlorosilan, 140 ml n-hexadecan, 30 ml Kohlenstofftetachlorid, und 20 ml Chlorophorm zusammengesetzt war, gefüllt und wurden darin bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Dann wurden Glasperlen herausgenommen, dreimal mit Chloroform gewaschen, und einmal mit Ethanol, und in einem Ofen bei 110°C getrocknet. Folglich wurden Alkylgruppen auf die Oberflächen der Glasperlen eingeführt.
Anschließend wurde Proteoliposom wie nachstehend hergestellt. Eine Lösung aus Sojabohnenphosphorlipid (Acolectin), das 150 mg Lipid entsprach, in Chloroform wurde in einen 30 ml Rundkolben gefüllt. Das Lösungsmittel wurde mittels eines Rotationsverdampfers verdampft, und ferner vollständig in einem Desiccator durch Vakuum entfernt. Hierzu wurde 10 ml wässrige 100 mm Kaliumchloridlösung gegeben, und die Mischung wurde mittels einer Vortex-Mischvorrichtung 5 Minuten behandelt, um den Lipid-Dünnfilm zu dispergieren. Die Dispersion wurde ferner mittels eines Ultraschalloszillators vom Probentyp 30 Minuten behandelt, um eine Suspension eines unilamellaren Liposoms mit einem mittleren Durchmesser von 200 nm herzustellen. 1 mg Bacteriorhodopsin, welches ein Membranprotein ist, wurde zu dieser Lipsomsuspension gegeben. Die Flüssigkeit wurde durch flüssigen Stickstoff oder Trockeneis-Aceton eingefroren, bei Raumtemperatur aufgetaut, und mittels einer Vortex-Mischvorrichtung 30 Sekunden behandelt. Dieses Einfrier- und Auftauverfahren wurde sechsmal wiederholt. Folglich wurde ein unilamellares Proteoliposom gebildet, welches einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von ungefähr 300 nm besaß.
Diese Proteoliposomlösung wurde in einen Entwicklungsbehälter gefüllt, und die vorstehend hergestellten alkylierten Glasperlen wurden darin eingetaucht. In ungefähr 30 Minuten wurde das Proteoliposom vollständig gespalten, und eine Zweischicht-Lipidflachmembran, die aus Bacteriorhodopsin- Phosphorlipid zusammengesetzt war, wurde auf der Oberfläche der Glasperlen gebildet. Gemäß diesem Verfahren wird angenommen, dass das Proteoliposom nicht in die Poren des Porösglases eindringt, da das Proteoliposom einen Teilchendurchmesser besitzt, der viel größer als die durchschnittliche Porengröße des porösen Glases ist.
Die Glasperlen, die mit einer planaren Zweischicht-Membran beschichtet sind, die Bacteriorhodopsin enthielten, wurden in 1 ml wässrige 10 nm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, eingetaucht, und wurde mittels eines Ultraschalloszillators vom Wasserbadtyp 10 Minuten behandelt. Durch diese Behandlung wurde die flache Membran auf der Oberfläche der Glasperlen von den Glasperlen eloiert und die Zweischichtlipidmembranstruktur wurde in einen monomeren Zustand zerstört. 100 μl der Monomerlösung wurden herausgenommen und einer Messung des Absorptionsvermögens bei 240 nm unterzogen. Das Absorptionsvermögen nach dem Abziehen des Absorptionsvermögens bei 0,048 der Kontrolle, die kein Liposom enthielt, betrug 0,250. In diesem Fall ist die Menge des Proteins viel geringer als die Menge des Lipids. Daher ergibt sich durch Vernachlässigen des zweiten Ausdrucks in der Gleichung (5): 0,250 = 0,400 × 10–3xx = 625
Somit betrug das Lipid 625 μg/ml.
Anschließend wurde die Bestimmung durch das Lowry-Verfahren durchgeführt. 100 μl der vorstehenden Monomerlösung, welche aus den mit bimolekularer Planarmembran beschichteten Glasperlen abgeleitet wurde, als die unbekannte Probe, wurde mit wässriger 10 nm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, auf ein Endvolumen von 250 μl verdünnt. Hierzu wurde 500 μl alkalische Kupferlösung gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen. Dann wurden 100 μl Phenolreagent zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen gelassen. Dann wurde deren Absorptionsvermögen bei 750 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,058 der Kontrollprobe und angesichts des Verdünnungsverhältnisses, betrug 0,310. Daher ergab sich: 0,310 = 3,03 × 10–4x + 2,99 × 10–2y.
Indem der vorstehend abgeleitete Wert von 625 (μg/ml) für x in dieser Gleichung abgezogen wurde, ergab sich der Wert von y, das heißt die Menge des Proteins mit 4,03 (μg/ml).
Diese Werte stimmten gut mit den Werten überein, die durch Extraktion der Glasperlen mit einer Mischung aus organischem Lösungsmittel und einem wässrigem Lösungsmittel erhalten wurden.
Beispiel 2
Proben zur Herstellung der Kalibrierungskurven für die jeweiligen Messungen wurden zunächst hergestellt. Eine Lösung aus Sojabohnenphosphorlipid (Asolectin) in Chloroform, die 15 mg Lipid entsprach, wurde in ein Testrohr mit einem Durchmesser von ungefähr 10 nm und einer Länge von ungefähr 130 mm gefüllt. Das Lösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer verdampft und vollständig in einem Desiccator in einem Vakuum entfernt, um ein Dünnfilm aus Lipid auf der inneren Wand des Testrohrs auszubilden. Hierzu wurde 1 ml wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung gegeben, und der Inhalt des Testrohrs wurde mittels einer Vortex-Mischvorrichtung 5 Minuten behandelt, um den Lipid-Dünnfilm zu dispergieren, und dann mittels eines Ultraschalloszillators vom Probentyp 30 Minuten behandelt, um eine flüssige Suspension aus unilamellaren Liposom mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 100 nm auszubilden.
Zehn Fraktionen der flüssigen Liposomsuspension, die im Volumen um 10 μl von 100 μl bis 10 μl variierte, wurden jeweils in 10 Testrohre aufgenommen. 50 μl wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung, die 20% Octylglucosid enthielt, wurden zu jeder der Testrohre gegeben. Separat wurde eine Probe, die kein Liposom enthielt, als die Kontrolle bereitgestellt. Ferner wurde 10 mm Kaliumchloridlösung in jede Probe bis auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gefüllt. Die jeweiligen Mischungen wurden mit einem Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp 1 Minute behandelt. Deren Lichtabsorptionsvermögen wurde bei 240 nm mit einer Quarzzelle mit einem optischen Weg einer 1 cm Zelle gemessen. Ein Absorptionsvermögen von 0,0489, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle, die kein Liposom enthielt, war, wurde von jedem der vorstehend gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierenden Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei die Liposomkonstellation als die Abszisse und das Absorptionsvermögen als die Ordinate genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung ging, der Gradient a₁ der Linie betrug 0,400 × 10^–3. Demgemäß ergab sich: AL = 0,400 × 10–3x,worin x (μg/ml) die Endkonzentration des Lipids in der unbekannten Probe ist.
Das Protein, das zur Kalibrierung verwendet wurde, war das Gleiche wie dasjenige, das in einer unbekannten Probe eingebaut war. In diesem Beispiel wurde Bacteriorhodopsin, das in Beispiel 1 beschrieben wurde, verwendet.
Das Bacteriorhodopsin wurde in einer wässrigen 10 nm Kaliumchloridlösung bei einer Konzentration von 1 mg/ml suspendiert. Die Suspension wurde in 8 Testrohre in Mengen, die um 2,5 μl variierten, in einer Reihe von 20 μl bis 2,5 μl gefüllt. In jedes der Testrohre wurde 50 μl wässrige 10 ml Kaliumchloridlösung, die Octylglucosid bei einer Konzentration von 20% enthielt, gefüllt. Ferner wurde 10 nm Kaliumchloridlösung zu jeder Probe bis auf das Gesamtvolumen von 1 ml gegeben und genug gemischt. Die jeweiligen Mischungen wurden mit einem Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp 1 Minute behandelt. Deren Lichtabsorptionsvermögen wurde bei 240 nm mit einer Quarzzelle mit einem optischen Weg von 1 cm gemessen. Ein Absorptionsvermögen von 0,0489, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle, die kein Protein enthielt, war, wurde von jeder der vorstehend gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierende Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei die Endproteinkonzentration als die Abszisse genommen wurde, und das Absorptionsvermögen als die Ordinate. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung ging, der Gradient b₁ der Linie betrug 2,70 × 10^–3. Demgemäß ergab sich: AP = 2,70 × 10–3y,worin y (μg/ml) die Endkonzentration des Proteins in der unbekannten Probe ist.
Anschließend wurden Kalibrierungskurven für Liposomen und Proteine für das BCA-Verfahren hergestellt. Die vorstehend hergestellte flüssige Liposomsuspension wurde in 10 Testrohre in Menge, die um 5 μl variierten, in einer Reihe von 50 μl bis 5 ml gefüllt. Zu jeder von diesen wurde 50 μl wässrige 10 nm Kaliumchloridlösung, die 20% Octylglucosid enthielt, gegeben. Separat wurde die Kontrollprobe auch bereitgestellt, welche kein Liposom enthielt. Ferner wurde 10 nm Kaliumchloridlösung zu jeder Probe bis auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gegeben. Zu jedem der Testrohre wurde das BCA-Farbreagent in einem Volumen, das der Probe entsprach, gegeben, und die Reaktion wurde bei 60°C 60 Minuten durchgeführt. Dann wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Absorptionsvermögen bei Raumtemperatur bei 562 nm wurde gemessen. Die Absorptionsvermögenswerte nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,533 der Kontrolle, die kein Liposom enthielt, wurden auf eine Ordinate aufgetragen, wobei die Lipidkonzentration als die Abszisse und das Absorptionsvermögen als die Ordinate hergenommen wurden. Die aufgetragenen Werte lagen auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient a₂ der Linie betrug 3,89 × 10^–2. Demgemäß ergab sich: BL = 3,89 × 10–2xworin x (μg/ml) die Endkonzentration des Proteins in der unbekannten Probe ist.
Auf die gleiche Weise wie bei der vorstehend erwähnten Proteinbestimmung durch Absorptionsvermögen, wurden 8 Proben aus Bacteriorhodopsin hergestellt, und das Endvolumen wurde auf 1 ml eingestellt. Zu jeder der Testrohre wurde das BCA-Farbreagenz in einem Volumen gegeben, das der Probe entsprach, und die Reaktion wurde bei 60°C 60 Minuten durchgeführt. Dann wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Absorptionsvermögen bei Raumtemperatur bei 562 nm wurde gemessen. Die Absorptionsvermögenswerte nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,533 der Kontrolle, die kein Bacteriorhodopsin enthielt, wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei die Bacteriorhodopsinkonzentration als die Abszisse und das Absorptionsvermögen als die Ordinate hergenommen wurden. Die aufgetragenen Werte lagen auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient b₂ der Linie betrug 9,63 × 10^–2. Demgemäß ergab sich: BP = 9,63 × 10–2y,worin y (μg/ml) die Endkonzentration des Proteins in der unbekannten Probe ist.
Als eine unbekannte Probe wurde eine Proteoliposomprobe hergestellt. Eine flüssige Liposomsuspension wurde hergestellt, welche Lipid 15 mg/ml gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren enthielt. Diese Liposomflüssigkeitssuspension wurde 10fach mit wässriger 10 mm Kaliumchloridlösung verdünnt. 133 μl dieser verdünnten Suspension (äquivalent zu 200 μg wurde herausgenommen, und hierzu 40 μg Bacteriorhodopsin, welches ein Membranprotein ist, zugegeben. Die Mischung wurde mittels en Ultraschalloszillators vom Wasserbadtyp 30 Sekunden behandelt. Das Proteoliposom das auf eine derartige Weise hergestellt wurde, wurde auf ein Endvolumen von 200 μl mit wässriger 10 nm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, verdünnt, und durch einen Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp eine Minute behandelt. Dann wurde das Absorptionsvermögen bei 240 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen nach Subtraktion des Absorptionsvermögens von 0,0489 der Kontrolle, die kein Proteoliposom enthielt, betrug 0,94. Daher war die nachstehende Gleichung bei Betrachtung des Verdünnungsverhältnisses gültig: 0,94 × 10 = 0,400 × 103x + 2,70 × 10–3y
Dann wurde eine Bestimmung gemäß dem BCA-Verfahren durchgeführt. Die unbekannte Probe, welche bei der vorstehenden Absorptionsvermögensmessung verwendet wurde, wurde ferner auf ein Endvolumen von 500 μl mit wässriger 10 mm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, verdünnt. Hierzu wurde das BCA-Farbreagenz in einem Volumen, das der Probenlösung entsprach, zugegeben. Die Reaktion wurde bei 60°C für 60 Minuten durchgeführt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Absorptionsvermögen wurde bei Raumtemperatur bei 562 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen nach Subtraktion des Absorptionsvermögens von 0,533 der Kontrolle, die kein Proteoliposom enthielt, betrug 1,16. Daher war die nachstehende Gleichung angesichts des Verdünnungsverhältnisses gültig: 1,16 × 50 = 3,89 × 102x + 9,63 × 10–2y
Die Werte von x und y wurden aus den vorstehenden Gleichungen unter Berücksichtigung des Verdünnungsverhältnisses erhalten. Der Wert von x, d.h. die Menge des Lipids, wurde mit 1000 μg/ml) festgestellt, und der Wert von y, das heißt die Menge des Proteins, wurde mit 200 (μg/ml) festgestellt. Diese Werte stimmen mit der Menge von 200 μg von Lipid und 40 μg von Protein (beides in 200 μl) bei der Herstellung des Proteoliposoms überein.
Beispiel 3
Proben zur Herstellung der Kalibrierungskurven für die jeweiligen Messungen wurden zunächst hergestellt. Eine Lösung von Sojabohnenphosphorlipid (Asolectin) in Chloroform, die 15 mg Lipid entsprach, wurde in ein Testrohr von ungefähr 10 mm im Durchmesser ungefähr 130 mm in der Länge gestellt. Das Lösungsmittel wurde mit einer Rotationsverdampfungsvorrichtung verdampft, und vollständig in einem Desiccator im Vakuum entfernt. Hierzu wurden 1 ml wässriger 10 nm Kaliumchloridlösung gegeben, und der Inhalt des Testrohrs wurde mittels einer Vortex-Mischvorrichtung 5 Minuten behandelt, um den Lipid-Dünnfilm, der sich darin gebildet hatte, zu dispergieren, und wurde dann mittels eines Ultraschalloszillators vom Probentyp 30 Minuten behandelt, um eine Flüssigkeitssuspension von unilamellaren Liposom mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 100 nm auszubilden.
10 Fraktionen der Liposomflüssigkeitssuspension, die im Volumen um 10 μl variierte, wurden in einer Reihe von 100 μl bis 10 μl in 10 Testrohre jeweils aufgenommen. 50 μl wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung, die 20% Octylglucosid enthielt, wurde zu jedem der Testrohre zugegeben. Separat wurde eine Probe, die kein Liposom enthielt, als Kontrolle bereitgestellt. Ferner wurde wässriges 10 nm Kaliumchloridlösung zu jeder Probe bis auf ein Gesamtvolumen von 1 ml zugegeben. Die beiliegenden Mischungen wurden mit einem Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp 1 Minute behandelt. Deren Lichtabsorptionsvermögen wurde bei 240 nm mit einer Quarzzelle mit einem optischen Weg von 1 cm gemessen. Ein Absorptionsvermögen von 0,0489, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle war, die kein Liposom enthielt, wurde von jeder der vorstehend gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierenden Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei die Liposomenkonzentration als die Abszisse und das Absorptionsvermögen als die Ordinate genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, wobei der Gradient a₁ der Linie 0,400 × 10^–3 betrug. Demgemäß war: AL = 0,400 × 10–3x,worin x (μg/ml) die Endkonzentration des Lipids in der unbekannten Probe ist.
Das Protein, das zur Kalibrierung verwendet wurde, war das gleiche wie dasjenige, das in einer unbekannten Probe eingebaut war. In diesem Beispiel wurde Bacteriorhodopsin, das in Beispiel 1 beschrieben wurde, verwendet.
Das Bacteriorhodopsin wurde in wässriger 10 nm Kaliumchloridlösung bei einer Konzentration von 100 mg/ml suspendiert. Die Suspension wurde in 8 Testrohre in Mengen, die von 2,5 μl in einer Reihe von 20 μl bis 2,5 μl variierten, eingefüllt. In jede der Testrohre wurde 50 μl wässrige 10 ml Kaliumchloridlösung, die 20% Octylglucosid enthielt, zugegeben. Ferner wurde 10 nm Kaliumchloridlösung zu jeder Probe bis auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gegeben. Die jeweiligen Mischungen wurden mit einem Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp 1 Minute behandelt. Deren Absorptionsvermögen wurde bei 240 nm mit einer Quarzzelle mit einem optischen Weg von 1 cm gemessen. Ein Absorptionsvermögen von 0,0489, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle war, die kein Protein enthielt, wurde von jeder der vorstehend gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierenden Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei die Proteinkonzentration als die Abszisse und Absorptionsvermögen als die Ordinate genommen wurde. Die aufgetragenen Werte waren auf eine Linie, die durch den Ursprung trat, und der Gradient b₁ der Linie betrug 2,70 × 10^–3. Demgemäß war: AP = 2,70 × 10–3y,worin y (μg/ml) die Endkonzentration des Proteins in der unbekannten Probe ist.
Anschließend wurde in Kalibrierungskurven Liposomen und Proteine für das Lowry-Verfahren hergestellt. 10 Volumen, die um 10 μl in einer Reihe von 100 μl bis 10 μl der Lipidsuspensionsflüssigkeit variierten, wurde in 10 Testrohre jeweils gefüllt. Zu jeder von diesen wurde wässrige 10 nm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, bis auf ein Endvolumen von 250 μl gegeben.
Hierzu wurde 500 μl alkalische Kupferlösung (zusammengesetzt aus 0,2 N NaOH, das 4% Na₄CO₃ und 2 Natriumdodecylsulfat enthielt, 2% CuSO₄·5H₂O, und 4% Natriumcitrat in dem Verhältnis von 100:1:1 zusammengesetzt war) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen. Hierzu wurde ferner 100 μl des Phenolreagents gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen gelassen. Dann wurde das Absorptionsvermögen bei 750 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen wurde auch mit der Kontrolllösung gemessen, welche weder Lipid noch Protein enthielt. Ein Absorptionsvermögen von 0,058, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle war, die kein Lipid enthielt, wurde von jeder der vorstehend gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierenden Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei das Absorptionsvermögen als die Ordinate und die Lipidkonzentration als die Abszisse genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient a₂ der Linie betrug 3,03 × 10^–9. Demgemäß war: BL = 3,03 × 10–4xworin x (μg/ml) die Endkonzentration des Lipids in der unbekannten Probe ist.
Auf die gleiche Weise wie bei der zuvor erwähnten Proteinbestimmung durch Absorptionsvermögen wurden 8 Proben von Bacteriorhodopsin hergestellt. Ein wässries10 nm Kaliumchlorid, das 1% Octylglucosid enthielt, wurde zu jeder der Proben bis auf ein Endvolumen von 250 μl gegeben. Hierzu wurde 500 μl einer alkalischen Kupferlösung gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen. Ferner wurde hierzu 100 μl des Phenolreagents hinzugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen. Dann wurde das Absorptionsvermögen bei 750 nm von jeder der Proben gemessen. Das Absorptionsvermögen von 0,058, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle war, die kein Protein enthielt, wurde von jeder der vorstehend gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierenden Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei das Absorptionsvermögen als die Ordinate und die Proteinkonzentration als die Abszisse hergenommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient b₂ der Linie betrug 2,99 × 10^–2. Demgemäß war: BP = 2,99 × 10–2y,worin y (μg/ml)die Endkonzentration des Proteins in der unbekannten Probe ist.
Als eine unbekannte Probe wurde ein Proteoliposomprobe hergestellt. Eine Lösung aus Sojabohnenphosphorlipid (Asolectin) in Chloroform, die 360 μg Lipid entsprach, wurde in ein Testrohr mit einem Durchmesser von 10 nm und einer Länge von 130 mm gefüllt. Das Lösungsmittel wurde mit einer Rotationsverdampfungsvorrichtung verdampft, und vollständig in einem Desiccator im Vakuum entfernt.
Hierzu wurde 1 ml wässrige 10 ml Kaliumchloridlösung gegeben, und der Gehalt des Testrohrs wurde mittels einer Vortex-Mischvorrichtung 5 Minuten behandelt, um den darin gebildeten Lipid-Dünnfilm zu dispergieren, und dann mittels eines Ultraschalloszillators vom Probentyp 30 Minuten behandelt, um eine Flüssigkeitssuspension von unilamellaren Liposom mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 100 nm auszubilden.
Zu dieser Liposomsuspension wurde 10 μg Bacteriorhodopsin gegeben, welche ein Membranprotein ist. Diese Flüssigkeit wurde in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis-Aceton gefroren, bei Raumtemperatur aufgetaut, und mittels einer Vortex-Mischvorrichtung 30 Sekunden behandelt. Dieses Verfahren wurde sechsmal wiederholt. Folglich wurde Proteoliposom ausgebildet, welches einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von ungefähr 300 nm besitzt.
Zu 100 μl dieser Proteoliposomlösung wurde 5 μl einer wässrigen 10 ml Kaliumchloridlösung, die 20% Octylglucosid enthielt, gegeben, und die Mischung wurde mittels eines Ultraschalloszillators vom Wasserbadtyp 1 Minute behandelt. Dann wurde das Absorptionsvermögen bei 240 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,0489 der Kontrollprobe, die kein Liposom enthielt, betrug unter Berücksichtigung des Verdünnungsverhältnisses 0,160. Daher war: 0,160 = 0,400 × 10–3x + 2,70 × 10–3y
Anschließend wurde die Bestimmung durch das Lowry-Verfahren praktiziert. Die Proteoliposomlösung (105 μl), welche zur Bestimmung des Lipids verwendet worden war, wurde als die unbekannte Probe mit wässriger 10 ml Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, auf ein Gesamtvolumen von 250 μl verdünnt. Hierzu wurde 500 μl alkalische Kupferlösung gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen. 100 μl Phenolreagenz wurde hier zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen. Dann wurde das Absorptionsvermögen hiervon bei 750 nm gemessen, das Absorptionsvermögen nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,058 der Kontrollprobe und unter Berücksichtigung des Verdünnungsverhältnisses betrug 0,358. Daher war: 0,358 = 3,03 × 10–4x + 2,99 × 10–2y
Die Werte von x und y wurden aus den vorstehenden Gleichungen erhalten. Der Wert von x, das heißt die Menge des Lipids wurde mit 342 (μg/ml) bestimmt, und der Wert von y, das heißt die Menge des Proteins wurde mit 8,50 (μg/ml) bestimmt. Diese Werte stimmen grob mit 360 μg des Lipids und 10 μg des Proteins überein, die bei der Herstellung der Probe zugegeben wurden.
Beispiel 4
Vier Kalibrierungskurven für Standardlösungen, die Lipid oder Protein enthielt, wurden durch zwei Verfahren zur Bestimmung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 erhalten.
Als eine unbekannte Probe wurde eine Proteoliposomprobe hergestellt. Eine Lösung aus Sojabohnenphosphorlipid (Asolectin) in Chloroform, die 600 μg Lipid entsprach, wurde in ein Testrohr mit einem Durchmesser von ungefähr 10 nm und einer Länge von ungefähr 130 nm gefüllt. Das Lösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer verdampft, und vollständig in einem Desiccator im Vakuum entfernt. Hierzu wurde 1 ml wässriger 10 nm Kaliumchloridlösung gegeben, und der Inhalt des Testrohrs wurde mittels einer Vortex-Mischvorrichtung 5 Minuten behandelt, um den Lipid-Dünnfilm, der darin gebildet wurde, zu dispergieren, und dann mittels eines Ultraschalloszillator vom Probentyp 30 Minuten behandelt, um eine Flüssigkeitssuspension eines unilamellaren Liposoms mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 100 nm auszubilden.
Zu dieser Liposomsuspension wurde 5 mg Bacteriorhodopsin gegeben, welches ein Membranprotein ist. Diese Flüssigkeit wurde in Flüssigen Stickstoff oder in Trockeneis-Aceton gefroren, bei Raumtemperatur aufgetaut, und dann mittels einer Vortex-Mischvorrichtung 30 Sekunden behandelt. Dieses Einfrier- und Auftauverfahren wurde sechsmal wiederholt. Demgemäß wurde ein Proteoliposom gebildet, welches einen durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 300 nm besitzt.
Zu 100 μl dieser Proteoliposomlösung wurde 5 μl wässrige 10 ml Kaliumchloridlösung, die 20% Octylglucosid enthielt, gegeben, und die Mischung wurde mittels eines Ultraschalloszillators vom Wasserbadtyp 1 Minute behandelt. Dann wurde das Absorptionsvermögen bei 240 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,0489 der Kontrollprobe, die kein Proteoliposom enthielt, betrug 0,25. In diesem System betrug das Verhältnis des Lipids zu dem Protein 120:1, daher wurde die Menge des Proteins als vernachlässigbar im Vergleich mit der Menge des Lipids angenommen. Demgemäß war: 0,25 = 0,400 × 10–3xx = 625 (μg/ml)
Anschließend wurde die Bestimmung durch das Lowry-Verfahren praktiziert. 100 μl der Proteoliposomlösung, welche zur Bestimmung von Lipid verwendet wurde, wurde als die unbekannte Probe mit wässriger 10 nm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, auf ein Volumen von 250 μl verdünnt. Hierzu wurde 500 μl einer alkalischen Kupferlösung gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten stehengelassen. 100 μl eines Phenolreagents wurde hier zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen. Dann wurde deren Absorptionsvermögen bei 750 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,058 der Kontrollprobe und unter Berücksichtigung eines Verdünnungsverhältnisses betrug 0,335. Daher war: 0,335 = 3,03 × 10–9x + 2,99 × 10–2y
Die Werte von y, das heißt der Menge des Proteins, wurden mit 4,90 (μg/ml) gestimmt, indem 625 μg/ml für x in der vorstehenden Gleichung substituiert wurde. Die Werte von x und y stimmen grob mit 600 μg des Lipids und 5 μg des Proteins überein, die bei der Herstellung der Probe zugegeben wurde.
Beispiel 5
Die Kalibrierungskurven wurden durch das 240 nm-Absorptionsvermögensverfahren und BCA-Verfahren erhalten, um eine Standardlösung zu Messen, die unabhängig Lipid oder Protein enthielt. Eine Flüssigkeitssuspension von Sojabohnenphosphorlipid (Asolectin, 15 mg/ml) wurde in 10 Testrohre in Mengen gefüllt, die um 10 μl in einer Reihe von 100 μl bis 10 μl variierten. In jede der Testrohre wurde 50 μl wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung, die 20% Octylglucosid enthielt, gegeben. Separat wurde eine Kontrollprobe, die kein Lipid enthielt, bereitgestellt. Dann wurde zu den jeweiligen Testrohren wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung gegeben, um das Endvolumen von jeder Probe auf 1 ml einzustellen, und jede der verdünnten Proben wurde mit einem Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp 1 Minute behandelt. Dann wurde das Absorptionsvermögen der behandelten Probe mit einer Quarzzelle von 1 cm über eine Wellenlänge von 240 nm gemessen. Ein Absorptionsvermögen von 0,0489, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle war, die kein Lipid enthielt, wurde von jedem der vorstehend gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierenden Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei das Absorptionsvermögen als die Ordinate und die Lipidkonzentration als die Abszisse genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient a₁ Linie betrug 0,400 × 10^–3. Demgemäß war: AL = 0,400 × 10–3x,worin x (μg/ml) die Endkonzentration des Lipids in der unbekannten Probe ist.
Das Protein, das zur Kalibrierung verwendet wurde, war das Gleiche, das in die Probe mit unbekannter Konzentration eingebaut wurde. In diesem Beispiel wurde Bacteriorhodopsin verwendet, welches ein Membranprotein ist. Dieses Protein wurde abgeleitet, indem eine purpurfarbene Membran aus einem hyperhalophilen Bakterium, Halobacteriumhalobium extrahiert wurde [Method. Enzymol., 31, Seiten 667–78 (1974)], und Lipid aus der purpurfarbenen Membran gemäß dem Verfahren von K.S. Huang entfernt wurde (Proc. Natl., Acad. Sci., USA, 77, Seite 323 (1980)].
Das vorstehend erhaltene Bacteriorhodopsin wurde in wässriger 10 nm Kaliumchloridlösung bei einer Konzentration von 1 mg/ml suspendiert. Diese Suspension wurde in 8 Testrohre in Mengen, die um 2,5 μl in einer Reihe von 20 μl bis 2,5 μl variierten, gefüllt. Zu jeder der Testrohre wurde 50 μl wässrige 10 nm Kaliumchloridlösung, die 20% Octylglucosid enthielt, gegeben. Ferner wurde eine 10 nm Kaliumchloridlösung in jede Probe bis zu dem Gesamtvolumen von 1 ml gegeben. Die jeweiligen Mischungen wurden mit einem Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp 1 Minute behandelt. Deren Lichtabsorptionsvermögen wurde bei 240 nm mit einer 1 cm Quarzzelle gemessen. Ein Absorptionsvermögen von 0,0489, welches das Absorptionsvermögen der Kontrolle war, die kein Protein enthielt, wurde von jedem der vorstehend gemessenen Absorptionsvermögenswerte abgezogen. Die resultierenden Absorptionsvermögenswerte wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei das Absorptionsvermögen als die Ordinate und die Proteinkonzentration als die Abszisse genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient b₁ der Linie betrug 2,70 × 10^–3. Demgemäß war: AP = 2,70 × 10–3y,worin y (μg/ml) die Endkonzentration des Proteins in der unbekannten Probe ist.
Anschließend wurden Kalibrierungskurven für Lipid und Protein für das BCA-Verfahren hergestellt. Die Lipidflüssigkeitssuspension, die vorstehend hergestellt wurde, wurde auf 10 Testrohre in Mengen gefüllt, die um 5 μl in einer Reihe von 50 μl bis 5 μl variierten. Zu jeder von diesen wurde 50 μl wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung gegeben, die 20% Octylglucosid enthielt. Dann wurde zu den jeweiligen Testrohren wässrige 10 nm Kaliumchloridlösung gegeben, um das Endvolumen auf 1 ml zu bringen. Separat wurde die Kontrollprobe auch bereitgestellt, welche kein Liposom enthielt. Zu jeden der Testrohre wurde das BCA-Farbreagenz in einem Volumen gegeben, das der Probe entsprach, und die Reaktion wurde bei 60°C für 60 Minuten durchgeführt. Dann wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Absorptionsvermögen wurde bei 562 nm gemessen. Die Absorptionsvermögenswerte nach Subtraktion des Absorptionsvermögens von 0,533 der Kontrolle, die kein Lipid enthält, wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei die Lipidkonzentration als die Abszisse und das Absorptionsvermögen als die Ordinate genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient a₂ der Linie betrug 3,89 × 10^–2. Demgemäß war: BL = 3,89 × 10–2x,worin x (μg/ml) die Endkonzentration des Lipids in der unbekannten Probe ist.
Auf die gleiche Weise wie bei der zuvor erwähnten Proteinbestimmung durch Absorptionsvermögen bei 240 nm wurden 8 Proben von Bacteriorhodopsin hergesellt, und das Endvolumen wurde auf 1 ml eingestellt. Zu jeder der Testrohre wurde das BCA-Farbreagenz in einem Volumen gegeben, das der Probe entsprach, und die Reaktion wurde bei 60°C 60 Minuten durchgeführt. Dann wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Absorptionsvermögen wurde bei Raumtemperatur bei 562 nm gemessen. Die Absorptionsvermögenswerte nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,533 der Kontrolle, die kein Bacteriorhodopsin enthielt, wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei die Bacteriorhodopsinkonzentration als die Abszisse und die Absorptionsvermögen als die Ordinate genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient b₂ der Linie betrug 9,63 × 10^–2. Demgemäß war: BP = 9,63 × 10–2yworin y (μg/ml) die Endkonzentration des Proteins in der unbekannten Probe ist.
Ein LB-Aufbaufilm wurde als eine unbekannte Probe hergestellt. Ein Milliliter einer Lösung aus Sojabohnenphosphorlipid (Asolectin 15 mg/ml) in Chloroform wurde in ein Testrohr mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Länge von 130 mm gefüllt. Das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers verdampft, und dann vollständig in einem Desiccator im Vakuum entfernt, um einen Lipid-Dünnfilm auf der inneren Wand des Testrohrs auszubilden. Hierzu wurde 1 ml einer wässrigen 10 ml Kaliumchloridlösung gegeben, und der Inhalt des Testrohrs wurde mittels einer Vortex-Mischvorrichtung 5 Minuten behandelt, um den darin gebildeten Lipid-Dünnfilm zu dispergieren, und dann mittels eines Ultraschalloszillators vom Probentyp 30 Minuten behandelt, um eine Flüssigkeitssuspension eines unilamellaren Liposoms mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 100 mm zu bilden. 3 mg Bacteriorhodopsin, ein Membranprotein, wurde zu der Liposomsuspension gegeben und die Suspension wurde mittels eins Ultraschalloszillators vom Wasserbadtyp 30 Sekunden behandelt.
100 μl der Proteoliposomsuspension wurde in eine LB-filmbildende Wanne, die wässriges 10 mm Kaliumchloridlösung und 20 mm Calziumchloridlösung hielt, getropft, und die Lösung wurde 30 Minuten leicht gerührt. Hierdurch wurde die Liposomsuspension, die das Bacteriorhodopsin enthielt, gespalten und in einen einschichtigen Film auf der Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche entwickelt. Der Oberflächendruck des Films wurde bei einem zweckmäßigem Wert gehalten, indem die Entwicklungsfläche des Films begrenzt wurde, um sich nicht exzessiv unter Verwendung Separators oder eines Aufschwimmens auszubreiten. Unter Beibehaltung dieses Oberflächendrucks wurde ein reines Substrat (Glassubstrat mit 45 mm im Quadrat, das für die Hydrophilizität mit Corning #7059 behandelt wurde) eingetaucht und langsam in eine vertikale Richtung ausgezogen. Durch dieses Verfahren wird die Orientierung der hydrophilen Gruppe und der hydrophoben Gruppe des Lipidfilms bei der Aufwärtsbewegung und der Abwärtsbewegung des Substrats umgedreht, so wird ein "Y-Typ-Film" gebildet, in welchem hydrophobe Teile einer Schichtfläche zu hydrophoben Teile einer anderen Schicht und hydrophile Teile einer Schichtfläche zu hydrophilen Teilen einer anderen Schicht zwischen den Schichten gebildet werden. So wurden 200 Schichten des einschichtigen Films, das heißt 100 Schichten des zweischichtigen Films aufgebaut. Die gleichen Aufbaufilme wurden auf 4 Substraten hergestellt.
Die Substrate wurden langsam herausgenommen. Dann wurden die 4 Substrate in 0,2 ml wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, eingetaucht. Die Lösung wurde langsam bei Raumtemperatur 60 Minuten gerührt, und anschließend unter Verwendung eines Ultraschalloszillators vom Wasserbadtyp 1 Minute behandelt. 0,2 ml der Lösung wurde herausgenommen, und dessen Absorptionsvermögen wurde bei 240 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,0489 der Kontrolle, die weder Lipid noch Protein enthielt, und angesichts des Verdünnungsverhältnisses betrug 0,212. Daher war die nachstehende Gleichung gültig: 0,212 = 0,400 × 10–3x + 2,70 × 10–3y
Dann wurde eine Bestimmung gemäß dem BCA-Verfahren durchgeführt. Die unbekannte Probe, welche bei der vorstehenden Absorptionsvermögensmessung verwendet wurde, wurde ferner 5fach verdünnt, um eine wässrige 10 nm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt zu ergeben. Hierzu wurde das BCA-Farbreagenz in einem Volumen gegeben, das der Probenlösung entsprach. Die Reaktion wurde bei 60°C 60 Minuten durchgeführt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Absorptionsvermögen wurde bei 562 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,533 der Kontrolle, die kein Proteoliposom enthielt, betrug 1,31. Daher war die nachstehende Gleichung angesichts des Verdünnungsverhältnisses gültig: 1,31 × 10–3 = 3,89 × 10–2x + 9,63 × 10–2y
Die Werte von x und y wurden aus den vorstehenden Gleichungen erhalten. Der Wert von x, das heißt die Menge des Lipids wurde mit 225 (μg/ml) festgestellt, und der Wert von x, das heißt die Menge des Proteins wurde mit 45 (μg/ml) festgestellt. Dies Werte stimmen mit dem Verhältnis des Lipid zu dem Protein (15 mg:3mb) überein, die bei der Herstellung des LB-Aufbaufilms verwendet wurde.
Beispiel 6
Lipid und Protein wurden von Leberzellenmitochondrien eines Meerschweins bestimmt. Zunächst mussten die Kalibrierungskurven mit bekannten Mengen von Lipid und Protein erhalten werden. Im Allgemeinen sind bei der Analyse eines natürlichen Gegenstands dessen Lipid-Inhaltsstoffe und die Protein-Inhaltsstoffe nicht bekannt. Daher ist es unmöglich, die gleichen Lipid- und Protein-Inhaltsstoffe wie diejenigen in unbekannten Proben bei der Herstellung der Kalibrierungskurven zu verwenden. In diesem Beispiel wurden daher die Kalibrierungskurven, unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Lipid und Protein erhalten. Hierdurch wurden die Mengen von Lipid und Protein in der Mitochondrienprobe ungefähr bestimmt, und die Genauigkeit der Bestimmung wurde untersucht, indem die erhaltenen Werte mit berichteten Werten verglichen wurden. So wurden Sojabohnenphosphorlipid (Azolectin) und BSA (Albumin-Rinderserum) zur Kalibrierung des Lipids unterschnittene des Proteins verwendet.
Die Kalibrierungskurve für Lipid wurde unter Verwendung von Sojabohnenphosphorlipid hergestellt. Eine Lösung von Sojabohnenphosphorlipid, die 3 mg Lipid in Chloroform entsprach wurde in ein Testrohr gefüllt. Das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers abgedampft, und dann vollständig im Vakuum entfernt. Hierzu wurde 1 ml einer 10 mm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, (pH: 5,6) zugegeben und der abgedampfte Rest wurde aufgelöst.
Für die Kalibrierungskurve des BCA-Verfahrens wurden 0,5 ml dieser Lösung herausgenommen, und wurden 5fach mit wässriger 10 mm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, verdünnt. Diese verdünnte Lösung wurde in einigen Schritten weiter verdünnt, um Proben für die Kalibrierung herzustellen. Zu jeder der verdünnten Proben wurde eine gleiche Menge des BCA-Farbreagenz gegeben und vermischt. Die Mischung wurde auf 60°C 60 Minuten erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Absorptionsvermögen der Probe bei 562 nm mit einer Zelle mit einem optischen Weg 1 cm gemessen. Die Absorptionsvermögenswerte nach Abzug des Absorptionsvermögens der Kontrolle, die kein Lipid enthielt, wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei die Lipidkonzentration als die Abszisse und das Absorptionsvermögen als die Ordinate genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient a₁ betrug 3,89 × 10^–2.
Demgemäß war: AL = 3.89 × 10–2xworin x (μg/ml) die Konzentration des Lipids in der unbekannten Probe ist.
Die verbleibenden 0,5 ml der Lösung wurden zur Kalibrierung für das Lowry-Verfahren verwendet. Die Probe wurde in einigen Schritten verdünnt, um die Proben zur Kalibrierung herzustellen. Zu der Probe wurde eine alkalische Kupferlösung in einer doppelten Menge der Probenlösung gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen. Hierzu wurde das Phenoreagenz (kommerzielles Reagenz, das zwiefach mit Wasser verdünnt wurde) in einer Menge von 0,4 Volumen der Probenlösung gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen. Das Absorptionsvermögen wurde bei 750 nm gemessen. Die gemessenen Absorptionsvermögenswerte wurden auf die gleiche Weise wie in dem BCA-Verfahren ausgetragen. Der Gradient der Linie a₂ betrug 3,03 × 10^–4. Daher war: BL = 3,03 × 10–4x
Anschließend wurde eine Kalibrierungskurve von Protein unter Verwendung von BSA (Albumines Rinderserum) hergestellt. Eine wässrige Lösung von Albuminen Rinderserum wurde bei einer Konzentration von 50 μg(ml hergestellt. Diese Lösung wurde auf die gleiche Weise wie in dem Fall des Lipids verdünnt, um Endkonzentrationen von 10 nm Kaliumchlorid und 1% Octylglucosid zu ergeben. Die Farben wurden durch das BCA-Verfahren und das Lowry-Verfahren entwickelt, und die Absorption wurde auf die gleiche Weise wie bei dem Lipid gemessen. Die Auftragung der gemessenen Werte ergab b₁ und b₂ von jeweils 9,63 × 10^–2, und 2,99 × 10^–2. Demgemäß war: AP = 9,63 × 10–2y BP = 2,99 × 10–2yworin y (μg/ml) die Proteinkonzentration ist.
Daher werden A^L+P, und B^L+P durch die folgenden Gleichungen gezeigt: AL+P = 3,89 × 10–2x + 9,63 × 10–2y BL+P = 3,03 × 10–4x + 2,99 × 10–2y
Die unbekannte Probe von Mitochondrien wurde aus einer Leber eines Meerschweinchens hergestellt. Die Leber eines Meerschweinchens wurde derart herausgenommen, dass sie nicht durch benachbartes Gewebe, soweit möglich, kontaminiert wurde, diese wurde geringfügig in wässriger 250 mm Rohrzuckerlösung gewaschen, fein mit Scheren geschnitten, und mit einer Glas-Homogenisiervorrichtung behandelt. Hierzu wurde 250 mm Rohrzucker gegeben, um eine 10% Suspension auszubilden, diese Suspension wurde bei 600 × g 10 Minuten zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde ferner bei 5.500 × g 20 Minuten zentrifugiert, um das Prezipitat zu sammeln. Das Prezipitat wurde wiederum in 250 mm Zuckerrohrlösung suspendiert, und bei 6000 × g 15 Minuten zentrifugiert. Dieses gesammelte Prezitipat wurde einmal mehr bei 6000 × g 15 Minuten zentrifugiert, um eine Mitochondrienfraktion zu erhalten. Zu diesen ausgewählten Mitochondrien wurde eine Lösung aus 10 nm Kaliumchlorid, die 1% Octylglucosid enthielt, in einer Menge von 10 ml pro Gramm der ursprünglichen Leberzellen gegeben, und gut gerührt um die Mitochondrien aufzulösen. Soweit notwendig, wurde die Mischung mit einem Ultraschalloszillator von Wasserbadtyp zur vollständigen Auflösung behandelt. Diese Lösung wurde als die unbekannte Probe verwendet.
Diese Probe wurde 100fach mit einer wässrigen Lösung aus 10 nm Kaliumchloridlösung unterschnittene 1% Octylglucosid verdünnt. 0,5 ml dieser Probe wurde einer Messung durch das BCA-Verfahren unterzogen. Das Absorptionsvermögen von (A^L+P) nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,533 der Kontrolle, die keine Probe enthielt, betrug 1,23. Demgemäß ergab sich: 1,23 × 200 = 3,89 × 10–2x + 9,63 × 10–2yworin der Faktor 200 auf der linken Seite dem Verdünnungsverhältnis entspricht.
Die unbekannte Probe wurde 30fach verdünnt. 0,5 ml der verdünnten Lösung wurde der Messung durch das Lowry-Verfahren unterzogen. Das Absorptionsvermögen von (B^L+P) nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,058 der Kontrolle, die keine Probe enthielt, betrug 1,20. Demgemäß ergab sich: 1,20 × 60 = 3,03 × 10–9x + 2,99 × 10–2y
Die Werte von x und y wurden abgeleitet, indem die vorstehenden gekoppelten Gleichungen gelöst wurden. x = 3,71 × 10–2 y = 2,40 × 10–3
Das Verhältnis von Lipid zu Protein betrug ungefähr 1:6,43, welches bedeutet, dass ein Gramm der Leberzelle 24 mg Mitochondrienprotein enthielt. Dies stimmt ungefähr mit den durchschnittlichen Werten überein (Verhältnis von Gesamtlipid zu Protein von 1:6,30, und Proteingehalt von 15 bis 30 mg pro Gramm von Leberzellen, in Meerschweinchenzellen).
Beispiel 7
Um die Kalibrierungskurven zu erhalten, wurden eine Standardlösung auf Lipid oder Protein für die jeweiligen Messungen zunächst hergestellt. Eine Lösung aus Sojabohnenphosphorlipid (Asolectin) in Chloroform, die 15 mg entsprach, wurde in ein Testrohr mit einem Durchmesser von ungefähr 10 nm und einer Länge von ungefähr 130 nm gefüllt. Das Lösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer verdampft, und vollständig im Vakuum entfernt. Hierzu wurden 1 ml wässrige 10 mm Kaliumchloridlösung gegeben, und der Inhalt des Testrohrs wurde mittels eines Vortex-Mischgeräts 5 Minuten behandelt, um den darin gebildeten Lipid-Dünnfilm zu dispergieren, und dann mittels eines Ultraschalloszillators vom Probentyp 30 Minuten behandelt, um eine Flüssigkeitssuspension unterschnittene unilamellaren Liposom mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 100 nm auszubilden.
Fraktionen der Liposomflüssigkeitssuspension, die in einer Reihe im Volumen von 100 μl bis 10 ml variierten, wurden jeweils in Testrohre aufgenommen. 50 μl einerwässrigen 10 nm Kaliumchloridlösung, die 20% Octylglucosid enthielt, wurde zu jeder der Testrohre gegeben. Separat wurde eine Probe, die keine Liposom enthielt, auch als die Kontrolle bereitgestellt. Ferner wurden 10 nm Kaliumchloridlösung zu jeder Probe zu dem Gesamtvolumen von 1 ml gegeben. Die jeweiligen Mischungen wurden mit einem Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp 1 Minute behandelt.
Für die Kalibrierung für das BCA-Verfahren wurden 0,5 ml von jeder dieser Proben herausgenommen, und wurden 30fach mit wässriger 10 nm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, verdünnt. Zu 0,5 ml der verdünnten Probe wurde eine gleiche Menge des BCA-Farbreagenz gegeben und vermischt. Die Mischung wurde auf 60°C 60 Minuten erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Absorptionsvermögen der Probe bei 562 nm mit einer Zelle mit einem optischen Weg von 1 cm gemessen. Die Absorptionswerte nach Abzug des Absorptionsvermögens der Kontrolle, die kein Liposom enthielt, wurden auf eine Koordinate aufgetragen, wobei die Lipidkonzentration als die Abszisse und das Absorptionsvermögen als die Ordinate genommen wurden. Die aufgetragenen Werte waren auf einer Linie, die durch den Ursprung trat, der Gradient a₁ betrug 3,89 × 10^–2. Demgemäß ergab sich: AL = 3,89 × 10–2xworin x (μg/ml) die Konzentration des Lipids in der unbekannten Probe ist.
Die verbleibenden 0,5 ml der Lösung wurden zur Kalibrierung durch das Lowry-Verfahren verwendet. Zu 0,5 ml der Probe wurden 1,00 ml der alkalischen Kupferlösung gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen. Hierzu wurde 0,20 ml des Phenolreagenz (kommerzielles Reagenz, das zweifach verdünnt wurde) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen gelassen. Das Absorptionsvermögen wurde bei 750 nm gemessen. Die gemessenen Absorptionsvermögenswerte wurden auf die gleiche Weise wie in dem BCA-Verfahren aufgetragen. Der Gradient der Linie a₂ betrug 3,03 × 10^–4. Daher ergab sich: BL = 3,03 × 10–4x
Anschließend wurde eine Kalibrierungskurve von Protein unter Verwendung des gleichen Proteins wie in der unbekannten Probe erhalten. In diesem Beispiel wurde Bacteriorhodopsin, ein Membranprotein in Beispiel 1, verwendet. Dieses Bacteriorhodopsin wurde bei einer Konzentration von 20 μg/ml aufgelöst, und wurde in einigen Schritten weiter verdünnt, um Proben zur Kalibrierung bereitzustellen. Diese Proben wurden wie in dem Fall des Lipids eingestellt, um Endkonzentrationen von 10 nm Kaliumchlorid und 1% Octylglucosid zu ergeben. Die Farben wurden durch das BCA-Verfahren und das Lowry-Verfahren entwickelt, und die Absorption wurde auf die gleiche Weise wie im Fall des Lipids gemessen. Das Auftragen der gemessenen Werte ergab b₁ und b₂ von jeweils 9,63 × 10^–2, und 2,99 × 10^–2. Demgemäß ergab sich: AP = 9,63 × 10–2y BP = 2,99 × 10–2yworin y (μg/ml) die Endkonzentration des Proteins in der unbekannten Probe ist. Daher werden A^L+P, und B^L+P, das Absorptionsvermögen des koexistierenden Systems durch folgende Gleichungen gezeigt: AL+P = 3,89 × 10–2x + 9,63 × 10–2y (3) BL+P = 3.03 × 10–4x + 2,99 × 10–2y (4)
Als eine unbekannte Probe wurde eine Proteoliposomprobe hergestellt. Eine Liposomflüssigkeitssuspension (Lipidgehalt: 15 mg/ml) wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt. Diese Liposomflüssigkeitssuspension wurde 10fach mit wässriger 10 nm Kaliumchloridlösung verdünnt. 300 μl dieser verdünnten Suspension (äquivalent zu 450 μg Lipid) wurden herausgenommenen und hierzu 45 μg Bacteriorhodopsin gegeben. Diese Mischung wurde mittels eines Ultraschalloszillators vom Wasserbadtyp 30 Sekunden behandelt, und bei Raumtemperatur 2 Stunden leicht gerührt. Das auf eine derartige Weise hergestellte Proteoliposom wurde auf ein Volumen von 1 ml verdünnt, um eine Endkonzentration von 10 nm Kaliumchlorid und 1% Octylglucosid zu ergeben, und durch einen Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp 1 Minute behandelt.
50 μl der unbekannten Probe wurden herausgenommen, mit einer wässrigen Lösung aus 10mm Kaliumchlorid und 1% Octylglucosid behandelt, und einer Messung durch das BCA-Verfahren unterzogen. Das Absorptionsvermögen von A^L+P, betrug nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,533 der Kontrolle, die kein Proteoliposom enthielt, 1,09. Demgemäß ergab sich: 1,09 × 20 = 3,89 × 10–2x + 9,63 × 10–2y (5)worin der Faktor 20 auf der linken Seite dem Verdünnungsverhältnis entspricht.
0,5 ml der verbleibenden unbekannten Probe wurde eine Messung durch das Lowry-Verfahren unterzogen. Das Absorptionsvermögen von B^L+P betrug nach Abzug des Absorptionsvermögens von 0,058 der Kontrolle, die kein Proteoliposom enthielt, 0,743. Demgemäß ergab sich: 0,743 × 2 = 3,03 × 10–4x + 2,99 × 10–2y (5) Die Werte von x und y wurden abgeleitet, indem die vorstehenden Lineargleichungen gelöst wurden.
X = 449
Y = 45
Diese Werte stimmen mit 450 μg des Lipids und 45 μg des Proteins, die bei der Herstellung des Proteoliposoms verwendet wurden, überein.
Beispiel 8
Proteoliposom, welches Bacteriorhodopsin beinhaltet, wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 hergestellt, bis darauf, dass das Verhältnis des Phosphorlipidproteins 60 betrug. Das hergestellte Proteoliposom wurde durch Gelfiltrationschromatography fraktioniert. Bio Rad A150m (hergestellt von Bio Rad Co.) wurde als ein Inerte Träger zur Gelfiltrationschromatography verwendet. Die Säule besaß einen Durchmesser von 1 cm und eine Länge von 40 cm. Die Säule wurde zuvor mit wässriger 10 mm Kaliumchloridlösung equilibriert. Die Menge der Probe, die in die Säule gefüllt wurde, betrug ca. 600 μl. Die Stromrate betrug ungefähr 13,3 μl/min. Fraktionen von 15 Tropfen (ungefähr 300 μl) wurden jeweils gesammelt.
50 μl Proben aus jeder Fraktion wurden jeweils in Eppendorf-Röhren gefüllt. Hierzu wurden 140 μl 10 nm Kaliumchloridlösung und 10 μl wässrig 20%ige Octylglucosidlösung gegeben. Die Mischungen wurden jeweils mit einem Ultraschalloszillator vom Wasserbadtyp eine Minute behandelt. Die aufgelösten Proben wurden einer Messung der Absorption bei 240 nm unterzogen. Die Proben nach der Absorptionsvermögensmessung wurden wieder gewonnen und der Messung durch das Lowry-Verfahren unterzogen. Das Lipid und das Protein von jeder der Fraktionen wurde durch Lineargleichungen, die die gemessenen Absorptionsvermögenswerte, Abs 240 und Abs^Lowery verwendeten. Die Ergebnisse der Bestimmung der Fraktionen werden in 1 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 1
Das Protein in jeder der Fraktionen, die im Beispiel 8 erhalten wurden, wurde durch ein herkömmliches Verfahren bestimmt, in welchem Proteine und Lipid vor der Bestimmung separiert wurden.
50 μl Proben wurden in Eppendorf-Rohren jeweils aufgenommen. Hierzu 1 ml Methanol gegeben. Die Mischung wurde einer Vortex-Behandlung unterzogen, und dann bei 15000 u/min 20 Minuten zentrifugiert, im ein Prezipitat wiederzugewinnen. 1 ml eines gemischten Lösungsmittels, das Toluol und Diethylether zusammengesetzt war (2:1), wurde zu dem Prezipitat gegeben, und das Prezipitat wurde durch Vortex-Behandlung dispergiert. Das Prezipitat wurde durch Zentrifuge wiederum wieder gewonnen. Das wieder gewonnene Prezipitat wurde in 50 μl wässriger 1%iger Natriumdodecylsulfatlösung aufgelöst und wurde der Bestimmung von Protein gemäß dem Lowry-Verfahren unterzogen.
Die Ergebnisse der Bestimmung von Protein von jeder Fraktion werden in 2 gezeigt.
Die Unstetigkeit der Elutionskurve in 2 wird durch einen Fehler bei der organischen Lösungsmittelextraktion verursacht. Im Gegensatz dazu wird in 1, das die Ergebnisse von Beispiel 8 veranschaulicht, eine derartige Unstetigkeit nicht gefunden und die gemessenen Werte sind auf einer glatten Linie. Demgemäß kann der Schluss gezogen werden, dass die vorliegende Erfindung eine hohe Genauigkeit bei geringfügiger Variation im Vergleich mit herkömmlichen Verfahren ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ein einfaches und präzises Verfahren zur quantitativen Bestimmung von zwei Komponenten, wie etwa eine Kombination von Lipid und Protein, welche nicht in einem koexistierenden Zustand auf Grund der wechselseitigen Störung bestimmt werden konnten, direkt ohne arbeitsreiches Separierungsverfahrens, wie Extraktion.
In der vorliegenden Erfindung werden zwei verschiedene Spezies, die einander stören, bei deren quantitativer Bestimmung jeweils bestimmt, indem zwei verschiedene Bestimmungsverfahren mit der gleichen Probe durchgeführt werden, gefolgt von Berechnung unter Verwendung der erhaltenen Werte.

Claims

Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Verbindung A und einer Verbindung B in einer unbekannten Probe, die die Verbindung A und die Verbindung B in einem flüssigen Medium enthält, das umfasst: Bestimmen der Verbindung A durch ein Bestimmungsverfahren a, um einen gemessenen Wert Va zu erhalten, und Bestimmen der Verbindung B durch ein Bestimmungsverfahren b, um einen gemessenen Wert Vb zu erhalten, wobei das Ergebnis der Bestimmung einer Verbindung das Ergebnis der Bestimmung der anderen Verbindung beeinflusst, und Ableiten jeweiliger tatsächlicher Konzentrationen (x und y) der Verbindung A und der Verbindung B aus den Gleichungen (I) und (II): Va = x·a1 + y·a2 (I) Vb = x·B1 + y·b2 (II)worin a₁ eine Konzentrationskonstante der Verbindung A in dem Bestimmungsverfahren a ist, wenn die Verbindung A in dem flüssigem Medium allein existiert; a₂ eine Konzentrationskonstante der Verbindung B in dem Bestimmungsverfahren b ist, wenn die Verbindung B in dem flüssigem Medium allein existiert; b₂ eine Konzentrationskonstante der Verbindung B in dem Bestimmungsverfahren b ist, wenn die Verbindung B in dem flüssigem Medium allein existiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung A ein Lipid und die Verbindung B ein Protein ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Bestimmungsverfahren a ein Verfahren der Messung der inherenten Absorption der Verbindung ist, und das Bestimmungsverfahren b eine Messung der Farbentwicklung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Bestimmungsverfahren a ein Verfahren zur Lipidbestimmung ist, das Löslichmachen der Probe mit einem oberflächenaktiven Mittel und anschließendes Messen des UV-Absorptionsvermögens umfasst, und das Bestimmungsverfahren b ein Lowry-Verfahren ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Bestimmungsverfahren a ein Verfahren zur Lipidbestimmung ist, das Löslichmachen der Probe mit einem oberflächenaktiven Mittel und anschließendes Messen des UV-Absorptionsvermögens umfasst, und das Bestimmungsverfahren b ein BCA-Verfahren ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei sowohl das Bestimmungsverfahren a als auch b Messungen der Farbentwicklung sind.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Bestimmungsverfahren a ein BCA-Verfahren ist und das Bestimmungsverfahren b ein Lowry-Verfahren ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Probe ein Proteoliposom ist.