DE69104777T2

DE69104777T2 - Orale Arzneimittelformen von biologisch aktiven Eiweisstoffen.

Info

Publication number: DE69104777T2
Application number: DE69104777T
Authority: DE
Inventors: Kazutoshi Maruyama; Hideaki Nomura
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1991-05-30
Publication date: 1995-04-06
Anticipated expiration: 2011-05-31
Also published as: JP3249147B2; EP0459795A1; DE69104777D1; US5597562A; EP0459795B1; JPH04253919A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft orale Arzneimittelformen, die die biologisch aktiven Proteine, Granulocyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF) und Erythropoietin (EPO) als aktive Inhaltsstoffe enthalten.
G-CSF ist ein hämatopoietischer Faktor, und es ist nachgewiesen worden, daß er im Medium von Kulturen der menschlichen Harnblasenkarzinom-Zellinie 5637 (ATCC HT8-9) auftritt (Welte et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 1526-1530 (1985)). Die DNA-Basensequenz, die das Gen für diesen hämatopoietischen Faktor kodiert, ist bestimmt worden (Japanische Patentanmeldung Auslegeschrift (KOHYO) No. 500636/88), was die Herstellung von G-CSF mit der Technik der genetischen Rekombination möglich macht.
G-CSF ist wirksam bei der Behandlung üblicher hämatopoietischer Störungen, bei derjenigen von hämatopoietischen Störungen, die durch Chemotherapie oder Radiotherapie verursacht worden sind, und bei Knochenmarktransplantation (Welte et al.: aaO).
Pharmazeutische Zubereitungen, die G-CSF enthalten, ergänzt mit verschiedenen Substanzen, die zu G-CSF hinzugegeben werden, um seine Inaktivierung und Adsorption an der Behälterwand bei Lagerung zu verhindern, sowie zur Stabilisierung von G- CSF, sind zu Patenten angemeldet worden, d.h. eine Zubereitung mit einem zugesetzten Tensid (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift (KOKAI) No. 146826/88), eine mit einem zugesetzten Saccharid (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift (KOKAI) No. 146827/88), eine mit einer zugesetzten hochmolekularen Verbindung (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift (KOKAI) No. 146828/88), eine mit einer zugesetzten Aminosäure, einem sulfurierten Reduktionsmittel oder einem Antioxidationsmittel (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift (KOKAI) No. 146829/88) bzw. eine mit einem zugesetzten Protein (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift (KOKAI) No. 152326/88). Alle diese Zubereitungen bestehen jedoch in der Form einer injizierbaren Lösung.
Eine Zubereitung mit verzögerter Freisetzung, die G-CSF umfaßt, eingebaut in einen Trägerstoff, der aus einem biologisch verträglichen Hochpolymer besteht, um die Inaktivierung von G- CSF zu verhindern und die Dauer seiner Arzneimittelwirkung zu verlängern, wenn er verabreicht wird, ist ebenfalls zum Patent angemeldet worden (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift (KOKAI) No. 91325/88). Außerdem ist über eine orale, enterisch beschichtete Zubereitung berichtet worden, die aus G-CSF, einem Tensid, einer Substanz in einem festen Zustand bei üblicher Temperatur und löslich in organischem Lösungsmittel und einem enterischen Material besteht, für orale Verabreichung (PCT-Offenlegungsschrift (KOKAI-KOHO) WO90/01329).
Andererseits ist EPO ein hämatopoietisches Hormon, das aus einem Glykoprotein mit einer ungefähren relativen Molekülmasse von 34.000 besteht und in großem Maße durch die Nieren produziert und von diesen sekretiert wird, was so wirkt, daß die Differenzierung erythroblastischer Vorläuferzellen zu Erythrocyten stimuliert wird.
Es ist gezeigt worden, daß EPO eine nützliche Substanz in der Erythropoietin-Therapie ist, repräsentiert durch die Therapie von Anämie, bei Menschen und anderen Säugetieren.
Als ein EPO aus natürlichen Quellen ist zum Beispiel eine Zubereitung bekannt, die aus Urin von Patienten mit aplastischer Anämie gereinigt ist (Miyake et al.: Journal of Biological Chemistry, Vol. 252, No. 15, S. 5558-5564, 1977). Das besagte Verfahren liefert wegen der niedrigen Ausbeuten jedoch nur eine begrenzte Menge und ist daher nicht für industrielle Produktion im Großmaßstab geeignet. Ein Verfahren zur Herstellung von EPO mit einer hohen Produktivität unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technik ist daher eingeführt worden (Japanische Patentschrift (KOKOKU) No. 17156/90).
Als pharmazeutische Zubereitungen, die EPO enthalten, sind zu Patenten angemeldet worden eine Zubereitung mit Serumalbumin, Dextran oder Polyethylenglykol, das zu EPO zu seiner Stabilisierung oder Verhinderung seiner Adsorption an der Behälterwand zugesetzt ist (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift (KOKAI) No. 91131/86 und (KOKAI) No. 97229/86), und eine Zubereitung für intranasale Verabreichung, die aus EPO und einem wäßrigen und/oder nicht-wäßrigen Medium besteht, das ein Tensid enthält, das für besagten Zweck zugesetzt ist ((KOKAI) No. 89627/87).
Biologisch aktive Proteine unterliegen im allgemeinen leicht einem Abbau durch Magensäure und durch Enzyme im Magen-Darm- Lumen oder in der Magen-Darm-Wand, und es ist wegen ihrer Molekülgrößen und komplizierten Molekülstrukturen extrem schwierig, sie aus dem Verdauungstrakt absorbieren zu lassen. Letzlich ist ihre klinische Anwendung auf parenterale Verabreichung durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion beschränkt gewesen.
Solche parenterale Verabreichung durch Injektion bringt allerdings Probleme durch den dem Patienten zugefügten Schmerz, die im Gewebe an der Injektionsstelle verursachte Schädigung und die fehlenden Möglichkeit der Selbstmedikation mit sich. Um diese Probleme zu umgehen, sind verschiedene Versuche mit anderen Verabreichungsverfahren unternommen worden. Diese schließen zum Beispiel intranasale Verabreichung (Pharm. Res., 21, 105 (1989)), orale Verabreichung (Res. Commun. Pathol. Pharmacol., 63, 53 (1989)), Trachealverabreichung (Diabetes, 20, 552 (1971), transdermale Verabreichung (J. Pharm. Sci., 78, 376 (1989)) und rektale Verabreichung (J. Pharm. Pharmacol., 33, 334 (1981)) ein, die alle Probleme mit sich bringen und von denen sich keines als von praktischem Nutzen erwiesen hat.
Dasselbe trifft sowohl für G-CSF als auch für EPO zu. Orale Zubereitungen sind erwünscht, für die das Verabreichungsverfahren seit vielen Jahrzehnten vorhanden und zugänglich gewesen ist und das sehr einfach ist, dem Patienten keine Schmerzen verursacht und Selbstmedikation ermöglicht. Versuche zur oralen Verabreichung dieser Substanzen sind jedoch extrem selten gewesen, verglichen mit anderen Verabreichungsverfahren. Nur solche Verabreichungsverfahren, wie zum Beispiel eines, bei dem der aktive Inhaltsstoff in Liposome eingeschlossen ist (Chem. Pharm. Bull., 30, 2245 (1982)), eines bei dem der aktive Inhaltsstoff in Mikrokapseln eingeschlossen ist (Japanische Patentanmeldung (TOKUGAN) No. 190833/88), und ein anderes, bei dem der aktive Inhaltsstoff mit azoaromatischem Copolymer beschichtet ist (Science, 233, 1081 (1986)), sind bekannt.
Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine orale Zubereitung von G-CSF oder EPO unter Umgehung dieser komplizierten Punkte zur Verfügung zu stellen.
Im Hinblick auf den oben beschriebenen Stand der Dinge führten die gegenwärtigen Erfinder Untersuchungen durch, die auf die Entwicklung pharmazeutischer Zubereitungen, die eine effiziente Absorption von G-CSF oder EPO aus dem Magen-Darm-Trakt liefern, und auf die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung dieser Zubereitungen abzielten, als ein Ergebnis haben sie festgestellt, daß es für diese Zwecke effektiv war, Tensid(e), Fettsäure(n) und enterische(s) Material(ien) zuzusetzen, was zum Erreichen dieser Erfindung führte.
Das heißt, daß die oralen Zubereitungen, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, dadurch gekennzeichnet sind, daß sie G-CSF oder EPO, Tensid(e), Fettsäure(n) und enterische (s) Material (ien) umfassen.
Fig. 1 zeigt grafisch das Ergebnis von Experiment 1.
Fig. 2 zeigt grafisch das Ergebnis von Experiment 2.
Fig. 3 zeigt grafisch das Ergebnis von Experiment 3.
Fig. 4 zeigt grafisch das Ergebnis von Experiment 4.
G-CSF, das aus einem Produkt isoliert und gereinigt ist, das aus einem Transformanten stammt, der erhalten ist durch Transformation über genetische Rekombination, kann als das G-CSF in den Zubereitungen dieser Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise wird Human-G-CSF verwendet, das im wesentlichen die unten beschriebene Aminosäuresequenz besitzt und von Escherichia coli über genetische Rekombination produziert wird. Der Ausdruck "im wesentlichen" bedeutet hier, daß die Aminosäuresequenz entweder identisch ist mit derjenigen von natürlichem G- CSF oder eine oder mehrere Aminosäureänderungen enthält (d.h. Deletion, Addition, Insertion und Verschiebung), die keine schädlichen funktionellen Unterschiede gegenüber natürlichem G-CSF bewirken.
Bevorzugter wird ein rekombinantes Human-G-CSF mit der obigen Aminosäuresequenz verwendet, in der n=1. Das oben beschriebene rekombinante Human-G-CSF kann zum Beispiel gemäß der Offenbarung der Japanischen Patentanmeldung Auslegeschrift (TOKUHYO) No. 500636/88 erhalten werden.
Das EPO, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, sind andererseits nicht nur diejenigen, die natürlicherweise bei Menschen und anderen Säugetieren, wie etwa Affen, auftreten, sondern auch Polypeptide, die die biologische Aktivität von natürlichem EPO besitzen und durch rekombinante DNA-Technik erhalten werden, repräsentiert durch besagtes rekombinantes EPO, das in der TOKKO No. 17156/90 offenbart ist, und auch ihre Analoga, die die biologische Aktivität von natürlichem EPO besitzen.
Das in dieser Erfindung verwendete EPO ist vorzugsweise ein EPO vom Human-Typ oder bevorzugter ein EPO vom Human-Typ, das durch rekombinante DNA-Technik erhalten ist.
Tenside, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen anionische Tenside, wie etwa Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Dioctylnatriumsulfonat, kationische Tenside, wie etwa Benzalkoniumchlorid und Benzethoniumchlorid, und nicht-ionische Tenside ein, wie etwa Lauromacrogol 400, Polyoxyl-40-Stearat, Polyoxyethylen hydriertes Castoröl 10, 50 und 60, Glycerinmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Saccharosefettsäureester, Methylcellulose und Carboxymethylcellulose. Ein oder eine Mischung von zwei oder mehr dieser Tenside wird verwendet. Vorzugsweise werden diese Tenside üblicherweise in einem Verhältnis zwischen 0,1 und 1.000 Gewichtsteilen zu einem Gewichtsteil G-CSF zugesetzt. Dasselbe trifft auch für EPO zu.
In der vorliegenden Erfindung verwendete Fettsäuren schließen diejenigen ein, die in eßbaren Pflanzen enthalten sind, wie etwa Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure, von denen eine oder eine Mischung von zwei oder mehr verwendet wird. Vorzugsweise werden diese Fettsäuren üblicherweise in einem Verhältnis zwischen 0,1 und 1.000 Gewichtsteilen zu einem Gewichtsteil G-CSF zugesetzt. Dasselbe trifft zu für EPO.
Unter diesen Fettsäuren sind Ölsäure und Linolsäure besonders bevorzugt.
Enterische Materialien, die in dieser Erfindung verwendet werden, schließen Celluloseacetatphthalat, Methylacrylat-Methacrylat-Copolymer, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat und Hydroxypropylmethylcelluloseacetatsuccinat ein, von denen eines oder eine Mischung von zwei oder mehr verwendet wird. Die enterischen Materialien können die Form von enterischen Kapseln, enterischer Beschichtung und dergleichen annehmen.
In der vorliegenden Erfindung werden Trägerstoffe verwendet, wenn dies als notwendig erachtet wird. Die Trägerstoffe, die in dieser Erfindung verwendet werden, schließen Stärken, Zukker, anorganische Substanzen, organische Säuren, Cellulosen, synthetische und semisynthetische Polymere, Aminosäuren und dergleichen ein. Die Stärken schließen Maisstärke, Weizenstärke, Kartoffelstärke und dergleichen ein. Die Zucker schließen Lactose, Glucose, Saccharose, Fructose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Sukrose und dergleichen ein. Die anorganischen Substanzen schließen Magnesiumstearat, Calciumphosphat, Calciumhydrogenphosphat, ausgefälltes Calciumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Magnesiumcarbonat, Natriumchlorid, Calciumsulfat usw. ein. Die organischen Säuren schließen Bernsteinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Äpfelsäure, Gluconsäure, Glucoronsäure und dergleichen ein. Die Cellulosen schließen mikrokristalline Cellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose-Natrium usw. ein. Die synthetischen und semisynthetischen Polymere schließen Polyvinylalkohol, Carboxyvinylpolymer, Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Natriumpolyacrylat und dergleichen ein. Die Aminosäuren schließen L-Arginin, D,L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Glutaminsäure usw. ein.
In den oralen Zubereitungen, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, ist die Absorption des hauptsächlichen Inhaltsstoffes, des biologisch aktiven Proteins, aus dem Magen-Darm-Trakt durch insbesondere die Zugabe von Fettsäure zur Arzneimittelzusammensetzung verstärkt. Man ist der Auffassung, daß dies auf synergistischen Wirkungen von Fettsäure und Tensid auf die Magen-Darm-Mucosa beruht, mit einem daraus folgenden Anstieg in der Absorbierbarkeit des biologisch aktiven Proteins, oder auf der Bildung eines Komplexes mit erhöhter Absorbierbarkeit durch kombinierte Wirkungen von Fettsäure und Tensid auf das biologisch aktive Protein.
Die folgenden Vorgehensweisen werden als praktikabel für das Verfahren zur Herstellung der oralen Arzneimittelzubereitungen, die durch diese Erfindung bereitgestellt werden, angesehen. Zum Beispiel werden ein Tensid und eine Fettsäure in einer Pufferlösung oder destilliertem Wasser gelöst und beschallt. Zu dieser Lösung wird eine Lösung von G-CSF oder EPO zugegeben und, wenn erforderlich, wird ein Trägerstoff ebenfalls zugegeben; die resultierende Mischung wird durch Rühren bei niedriger Temperatur vermischt. Die erhaltene Lösung wird dann zu Pulver lyophilisiert. Ein Trägerstoff wird zum Pulver zugegeben, falls erforderlich, und nach Vermischen wird die Mischung auf eine gleichmäßige Korngröße gesiebt und in enterische Kapseln abgefüllt. Bei einem anderen Verfahren werden ein Tensid und eine Fettsäure in einer Pufferlösung oder destilliertem Wasser gelöst. Zur resultierenden Lösung wird eine Massenlösung des biologisch aktiven Proteins zugegeben und, falls erforderlich, wird auch ein Trägerstoff zugegeben, gefolgt von Rühren bei niedriger Temperatur. Die erhaltene Lösung wird dann zu Pulver lyophilisiert. Ein Trägerstoff wird zum Pulver zugegeben, falls erforderlich, und die resultierende Mischung wird auf gleichmäßige Korngrößen gesiebt und zu Tabletten ausgeformt. Die Granülen werden enterisch beschichtet und in Hartgelatinekapseln abgefüllt.
Alternativ wird dem Pulver, falls erforderlich, ein Trägerstoff zugesetzt, und die resultierende Mischung wird auf Granülen gleichmäßiger Korngrößen gesiebt.
Organische Lösungsmittel können bei der Herstellung der oralen Arzneimittelform, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch eine Pufferlösung oder destilliertes Wasser verwendet, um Inaktivierung des Hauptinhaltstoffes, G-CSF oder EPO, zu vermeiden sowie den Einfluß von Restlösungsmitteln zu eliminieren. Außerdem ist es bevorzugt, thermische Behandlung im Herstellungsverfahren, wie in den oben beschriebenen Herstellungsbeispielen, zu vermeiden, um Inaktivierung von G-CSF oder EPO zu minimieren. Die Lyophilisierung ist nicht ein wesentlicher Prozeß bei der Herstellung der oralen Arzneimittelform, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, ist aber effektiv darin, hohe Gehalte des Hauptinhaltsstoffes in den pharmazeutischen Zubereitungen bereitzustellen.
Die folgenden Verfahren sind praktizierbar für die Herstellung der enterischen Kapseln. Zum Beispiel wird ein enterisches Material in einem organischen Lösungsmittel gelöst oder in destilliertem Wasser dispergiert und (harte oder weiche) Kapseln werden in die resultierende Lösung eingetaucht oder damit besprüht und dann trocknen gelassen. Bei einem anderen Verfahren wird ein enterisches Material in einem organischen Lösungsmittel gelöst oder in destilliertem Wasser dispergiert und Kapselkörperformen und Kappenformen werden in die resultierende Lösung eingetaucht, gefolgt von Trocknung und Entfernung ausgeformter Kapseln aus enterischem Material aus den Formen. In einem anderen Verfahren wird ein enterisches Material in einem organischen Lösungsmittel gelöst oder in destilliertem Wasser dispergiert und die äußeren Teile von Hartgelatinekapselkörpern und -kappen werden in die resultierende Lösung eingetaucht und dann getrocknet. Die getrockneten äußeren Teile werden in destilliertes Wasser gegeben, um innere Gelatine zu beseitigen, wieder gefolgt von Trocknung, um enterische Kapseln zu erhalten.
Die folgenden Beispiele werden als weitere Ausführungsformen dienen, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen.

Beispiel 1

0,20 g Polyoxyethylen hydriertes Castoröl 60 und 0,28 g Linolsäure wurden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und beschallt. Zu dieser Lösung wurden 200 ml einer G-CSF-Lösung (0,50 mg/ml) zugegeben und die resultierende Mischung wurde über Nacht in einem kalten Raum gerührt, gefolgt von Lyophilisation, um eine homogene, gefriergetrocknete Zubereitung zu erhalten.
4,0 g Hydroxypropylmethylcellulosephthalat wurden in 10 ml Methanol-Methylenchlorid-Gemisch (3:10) gelöst und die äußeren Teile von Hartgelatinekapselkörpern und -kappen wurden dann in die resultierende Lösung eingetaucht und anschließend gründlich getrocknet.
Die getrockneten äußeren Teile wurden in destilliertes Wasser gegeben, um innere Gelatine zu entfernen, und wieder getrocknet, um enterische Kapseln zu erhalten. Die oben beschriebene lyophilisierte Zubereitung wurde in diese enterischen Kapseln abgefüllt. Daneben wurde eine enterische Kapselzubereitung von G-CSF in derselben Art und Weise wie oben hergestellt, aber ohne die Zugabe von Linolsäure.

Beispiel 2

0,40 g Polyoxyl-40-Stearat und 0,2 g Ölsäure wurden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und beschallt. 200 ml einer G-CSF- Lösung (0,50 mg/ml) und 1,0 g Lactose wurden zu dieser Lösung zugegeben und die resultierende Lösung wurde über Nacht in einem kalten Raum gerührt, gefolgt von Lyophilisation, um eine homogene, gefriergetrocknete Zubereitung zu erhalten. Diese Zubereitung wurde mit zugesetzten 0,10 g Hydroxypropylcellulose zu Granülen verarbeitet und in enterische Kapseln abgefüllt, die in derselben Art und Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden waren.

Beispiel 3

0,50 g Polyoxy-40-Stearat und 0,20 g Linolsäure wurden in 100 ml Citratpufferlösung gelöst und beschallt. Zu dieser Lösung wurden 100 ml einer G-CSF-Lösung (2,0 mg/ml), 0,10 g L-Arginin und 1,0 g Saccharose zugegeben und die resultierende Mischung wurde über Nacht in einem kalten Raum gerührt, gefolgt Gefriertrocknung, um eine homogene, lyophilisierte Zubereitung zu erhalten. Zu dieser Zubereitung wurden 0,10 g Bernsteinsäure, 0,10 g mikrokristalline Cellulose und 0,10 g Magnesiumstearat zugegeben, vermischt und zu Tabletten ausgeformt. Die Tabletten wurden durch Besprühen mit einer Hydroxypropylmethylcelluloseacetatsuccinat-suspension und anschließendes Trocknen enterisch beschichtet.

Beispiel 4

0,40 g Saccharosefettsäureester und 0,10 g Linolsäure wurden in 100 ml Citratpufferlösung gelöst und beschallt. Zu dieser Lösung wurden 200 ml einer G-CSF-Lösung (2,0 mg/ml) und 1,0 g Lactose zugegeben und über Nacht in einem kalten Raum gerührt und die Mischung wurde gefriergetrocknet, um eine homogene, lyophilisierte Zubereitung zu erhalten. Diese Zubereitung wurde mit zugesetzten 0,1 g Hydroxypropylcellulose zu Granülen verarbeitet. Die Granülen wurden durch Besprühen mit einer Hydroxypropylmethylcelluloseacetatsuccinat-Suspension und anschließendes Trocknen enterisch beschichtet und in Hartgelatinekapseln abgefüllt.

Beispiel 5

0,40 g Saccharosefettsäureester und 0,30 g Linolsäure wurden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und beschallt. Zu dieser Lösung wurden 200 ml einer Lösung von EPO (25 x 10&sup4; Iu/ml) zugegeben und die Mischung wurde über Nacht in einem kalten Raum gerührt und gefriergetrocknet, um eine homogene, lyophilisierte Zubereitung zu erhalten. Zu dieser Zubereitung wurden 0,10 g Natriumphosphat zugegeben und die resultierende Mischung in enterische Kapseln abgefüllt, die aus Hydroxypropylmethylcellulose hergestellt worden waren.

Beispiel 6

Eine Lösung von 0,30 g Polyoxyl-40-Stearat und 0,20 g Ölsäure in 100 ml destilliertem Wasser wurden hergestellt und Beaufschlagung mit Ultraschall unterzogen. Zu dieser Lösung wurden 200 ml einer Lösung von EPO (25 x 10&sup4; Iu/ml) und 1,0 g Lactose zugegeben und die Mischung wurde über Nacht in einem kalten Raum gerührt und dann gefriergetrocknet, um eine homogene, lyophilisierte Zubereitung zu erhalten. Diese Zubereitung wurde zu einer gleichmäßigen Korngröße gesiebt, mit zugesetzten 0,20 g mikrokristalliner Cellulose und 0,05 g Magnesiumstearat vermischt und zu Tabletten ausgeformt. Die Tabletten wurden durch Besprühen mit einer Carboxymethylcellulose-Suspension und anschließende Trocknung enterisch beschichtet.

Beispiel 7

0,30 g Polyoxyl-40-Stearat und 0,20 g Linolsäure wurden unter Rühren in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und beschallt. Zu dieser Lösung wurden 200 ml einer Lösung von EPO (25 x 10&sup4; Iu/ml), 1,0 g D-Mannit und 0,10 g L-Arginin zugegeben, über Nacht in einem Kühlschrank gerührt und gefriergetrocknet, um eine homogene, lyophilisierte Zubereitung zu erhalten. Diese Zubereitung wurde mit zugesetzten 0,10 g Hydroxypropylcellulose zu Granülen verarbeitet und die Granülen wurden durch Besprühen mit einer Hydroxypropylmethylcelluloseacetatsuccinat-Suspension und anschließende Trocknung enterisch beschichtet und in Hartgelatinekapseln abgefüllt.

Beispiel 8

0,80 g Polyoxyl-40-Stearat und 0,80 g Linolsäure wurden in 100 ml Citratpufferlösung gelöst und beschallt. Zu 8 ml dieser Lösung wurden 2 ml G-CSF-Lösung (73 mg/ml) zugegeben und die resultierende Mischung wurde über Nacht in einem kalten Raum gerührt, um eine Testlösung zu ergeben.
Zusätzlich wurden drei andere Testlösungen gemäß derselben Vorgehensweise unter Zugabe von Ölsäure, Linoleinsäure anstelle von Linolsäure oder ohne die Zugabe von Fettsäure (für eine Kontrollösung) hergestellt.

Beispiel 9

Fünf Lösungen, die 1,6 g Polyoxyl-40-Stearat und 0 g, 0,4 g, 1,6 g, 3,2 g bzw. 6,4 g Linolsäure in 100 ml Citratpufferlösung enthielten, wurden hergestellt und beschallt. Zu 9 ml jeder Lösung wurde 1 ml G-CSF-Lösung (20 mg/ml) zugegeben und über Nacht in einem kalten Raum gerührt, um eine Testlösung zu ergeben.

Experiment 1

Männlichen Beagles (13 bis 15 Monate alt), die man für 20 Stunden hatte fasten lassen (denen man aber freien Zugang zu Wasser erlaubte), wurde oral eine Arzneimittelform dieser Erfindung verabreicht, die Linolsäure enthielt, hergestellt in Beispiel 1, oder dieselbe Arzneimittelform, die aber keine Linolsäure enthielt, in einer Dosis von 2,2 mg/kg G-CSF. Serielle 0,5 ml-Blutproben wurden seriell im Anschluß an die Verabreichung aus der antebrachialen Vene jeden Hundes abgenommen. Jede Blutprobe wurde in einem mit EDTA behandelten Polystyrolröhrchen gesammelt und einer Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Blut auf einem automatisierten Blutzellzähler unterzogen (Microcell Counter Sysmex CC-180A). Die seriellen Gesamtleukozytenzahlen sind in Figur 1 dargestellt.
Wie man sieht, stieg die Gesamtleukozytenzahl von 24 48 Stunden nach oraler Verabreichung der Linolsäure enthaltende Arzneimittelform, die von dieser Erfindung bereitgestellt wird, erreichte einen Peak nach 56 Stunden nach Verabreichung und kehrte zum Anfangsniveau nach 72 Stunden nach Verabreichung zurück. Im Gegensatz dazu wurde keine solche pharmakologische Wirkung bei Hunden beobachtet, die die Arzneimittelzubereitung erhalten hatten, die keine Linolsäure enthielt, und bei denjenigen, die eine Zubereitung erhalten hatten, die keinen G-CSF nicht enthielt (Kontrollsubstanzen).

Experiment 2

Männlichen Beagles (13 bis 15 Monate alt), die man für 20 Stunden hatte fasten lassen (denen man aber freien Zugang zu Wasser erlaubte), wurde oral eine Arzneimittelform, hergestellt in Beispiel 3, in einer Dosis von 2,0 mg/kg G-CSF verabreicht. 0,5 ml-Blutproben wurden seriell im Anschluß an die Verabreichung aus der antebrachialen Vene jeden Hundes abgenommen. Jede Blutprobe wurde in einem mit EDTA behandeltem Polystyrolröhrchen gesammelt und einer Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Blut auf einem automatisierten Blutzellzähler unterzogen (Microcell Counter Sysmex CC-180A). Die seriellen Gesamtleukozytenzahlen sind in Figur 2 dargestellt.
Wie man sehen kann, stieg die Gesamtleukozytenzahl von 8 24 Stunden nach oraler Verabreichung der Arzneimittelform dieser Erfindung an, erreichte nach 48 Stunden nach Verabreichung einen Peak und kehrte nach 72 Stunden nach Verabreichung zum anfänglichen Niveau zurück. Bei Hunden, denen man eine Zubereitung gegeben hatte, die keinen G-CSF enthielt (Kontrollsubstanzen), wurde andererseits keine derartige pharmakologische Wirkung beobachtet.

Experiment 3

Männlichen Ratten (SD-Stamm, 400 500 g Körpergewicht) wurde operativ eine Kanüle vom Magen zum Zwölffingerdarm eingepflanzt, und sie wurden für mehrere Tage in getrennte Käfige gesperrt. Nachdem die Wirkung der Operation nicht erkannt wurde, wurden Testlösungen, die in Beispiel 8 hergestellt sind, durch die Kanüle in einer Dosis von 15 mg/kg G-CSF in den Zwölffingerdarm der Ratten verabreicht.
0,3 ml-Blutproben wurden seriell im Anschluß an die Verabreichung aus der Drosselvene jeder Ratte abgenommen. Jede Blutprobe wurde in einem Polystyrolröhrchen gesammelt, das mit EDTA behandelt worden war, und ein Teil jeder Probe wurde einer Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Blut auf einem automatisierten Blutzellzähler (Microcell Counter Sysmex CC- 180A) unterzogen und ein anderer Teil wurde zur Bestimmung des Verhältnisses von Neutrophilen zu Gesamtleukozyten aus der Beobachtung von Abstrichen unter dem Mikroskop verwendet. Abstriche wurden hergestellt, indem Blutproben auf Objektträgergläsern verteilt und anschließend angefärbt wurden. Dann wurde die Neutrophilenzahl im Blut aus der Gesamtleukozytenzahl und dem Neutrophilenverhältnis berechnet. Ansteigendes Verhältnis der Neutrophilenzahl an jedem Sammelpunkt gegen den Anfangswert wurde in der Figur 3 dargestellt.
Wie man sehen kann, wurde ein merklicher Anstieg der Neutrophilenzahl von 6 Std. bis 48 Std. nach Verabreichung einer Fettsäure enthaltenden Lösung beobachtet, die gemäß dieser Erfindung hergestellt worden war. Im Gegensatz dazu war nur ein geringer Anstieg nach 6 Std. und 12 Std. nach Verabreichung einer Zubereitung ohne Fettsäure (Kontrolle) zu sehen. Unter den Fettsäuren zeigten Zubereitungen, die Ölsäure oder Linolsäure enthielten, große pharmakologische Wirkung.

Experiment 4

Männlichen Ratten (SD-Stamm, 400 500 g Körpergewicht) wurde operativ eine Kanüle vom Magen zum Zwölffingerdarm eingepflanzt und sie wurden mehrere Tage in getrennte Käfige gesperrt. Nachdem die Wirkung der Operation nicht erkannt wurde, wurden Testlösungen, die in Beispiel 9 hergestellt sind, durch die Kanüle in einer Dosis von 2,4 mg/kg G-CSF in den Zwölffingerdarm der Ratten verabreicht.
0,3 ml-Blutproben wurden seriell im Anschluß an die Verabreichung aus der Drosselvene jeder Ratte abgenommen. Jede Blutprobe wurde in einem Polystyrolröhrchen gesammelt, das mit EDTA behandelt worden war, und ein Teil jeder Probe wurde einer Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Blut auf einem automatisierten Blutzellzähler (Microcell Counter Sysmex CC- 180A) unterzogen und ein anderer Teil wurde zur Bestimmung des Verhältnisses von Neutrophilen zu Gesamtleukozyten aus der Beobachtung von Abstrichen unter dem Mikroskop verwendet. Abstriche wurden hergestellt, indem Blutproben auf Objektträgergläsern verteilt und anschließend angefärbt wurden. Dann wurde die Neutrophilenzahl im Blut aus der Gesamtleukozytenzahl und dem Neutrophilenverhältnis berechnet. Ansteigendes Verhältnis der Neutrophilenzahl an jedem Sammelpunkt gegenüber dem Anfangswert wurde in Figur 4 dargestellt.
Wie man sehen kann, war ein merklicher Anstieg in der Neutrophilenzahl nach 6 Std. und 12 Std. nach Verabreichung jeder Zubereitung, die 0,4%, 1,4%, 2,9% bzw. 5,8% Linolsäure enthielt, die mit dieser Erfindung hergestellt worden war, zu sehen. Andererseits wurde eine derartige pharmakologische Wirkung nie nach Verabreichung der Zubereitung ohne Linolsäure beobachtet. In diesem Experiment wurde keinerlei signifikanter Unterschied bei der Zugabe von 0,4 bis 5,8% Linolsäure festgestellt (in einem Verhältnis zwischen 1,9 und 45 Gewichtsteilen zu einem Gewichtsteil G-CSF).
Es ist bei den oralen Arzneimittelzubereitungen, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, somit gezeigt worden, daß die Inaktivierung des Hauptinhaltsstoffes während des Verfahrens der pharmazeutischen Herstellung vermieden werden kann, zusammen mit erwiesenen Wirkungen, wie erhöhte Absorption des Hauptinhaltsstoffes aus dem Darmtrakt insbesondere als ein Ergebnis des Zusatzes von Fettsäure zur Arzneimittelzusammensetzung.
Hiervon kann man sagen, daß dies nicht nur zu einer Dosisverringerung führt, sondern auch genaue Dosiskontrolle erleichtert und den praktischen Nutzen der biologisch aktiven Proteine in der Form oraler Zubereitungen erhöht.
Die in der vorstehenden Beschreibung, in den folgenden Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in jeder ihrer Kombinationen, Gegenstand für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen sein.

Claims

1. Eine orale Arzneimittelform, welche

(a) Granulocyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF) oder Erythropoietin (EPO),

(b) Tensid(e),

(c) Fettsäure(n) und

(d) enterisches Material

umfaßt.

2. Eine orale Arzneimittelform nach Anspruch 1, die von 0,1 bis 1.000 Gewichtsteile Tensid(e) pro 1 Gewichtsteil G-CSF oder EPO umfaßt.

3. Eine orale Arzneimittelform nach Anspruch 1 oder 2, die von 0,1 bis 1.000 Gewichtsteile Fettsäure(n) pro 1 Gewichtsteil G- CSF oder EPO umfaßt.

4. Eine orale Arzneimittelform nach Anspruch 1, 2 oder 3, die außerdem einen oder mehrere Trägerstoffe umfaßt.

5. Eine orale Arzneimittelform nach einem der vorangehenden Ansprüche, als eine enterische Kapsel oder mit einer enterischen Beschichtung.