DE60314617T2

DE60314617T2 - Verfahren und zusammensetzung für die vorbeugung gegen das altwerden bzw. die verzögerung des altwerdens und auswirkung auf den backvorgang bei backwaren

Info

Publication number: DE60314617T2
Application number: DE60314617T
Authority: DE
Inventors: Filip Arnaut; Fabienne Verte; Nicole Vekemans
Original assignee: Puratos NV
Current assignee: Puratos NV
Priority date: 2002-04-05
Filing date: 2003-04-07
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2023-04-08
Also published as: CN1649501A; EP1496748B1; CN100456935C; EP1790230A2; EP1496748A2; AU2003227126A8; CA2481290C; WO2003084334A2; US9456616B2; AU2003227126A1; EP1790230B1; PT1496748E; ES2289312T3; EP1790230A3; US20050255204A1; DK1790230T3; US20160374355A1; MXPA04009726A; DK1496748T3; BR0309166A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Zusammensetzung zum Verhindern oder Verzögern des Altbackenwerdens und damit verbundener Wirkungen während des Backprozesses von Backwaren, die mindestens eine intermediär thermostabile und/oder thermostabile Serinprotease umfasst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Verbraucher bevorzugen, frisches Brot zu kaufen und sie wollen, dass es für eine lange Zeit frisch bleibt. Das Verzögern des Altbackenwerdens ist immer eine Herausforderung für die Hersteller von Backzutaten gewesen. Die Tatsache, dass die Herstellung von Brot mehr und mehr zentralisiert ist und weiter entfernt von den Vertriebsstellen, legt einen um so größeren Druck auf die Entwicklung von Zusatzmitteln und Zutaten, um die weiche Konsistenz des Brotes zu erhalten. Auch weiche Brötchen, Hamburger-Brötchen und Feinbackwaren unterliegen dem Altbackenwerden und einem Verlust der Weichheit. Es gibt eine Anzahl von Zutaten, die bekannt sind, das Altbackenwerden von Brot und weichen Backwaren zu verzögern. Fett und Emulgatoren, wie destillierte Monoglyceride und Stearoyllactylate, werden bereits seit Jahrzehnten benutzt. Mono-, Di- und Polysaccharide haben einen positiven Einfluss auf die Wasser-Rückhaltung und -bindung. Wasserverlust ist oftmals mit Altbackenwerden verbunden und die Saccharide haben einen positiven Einfluss auf das Geschmacksempfinden der gebackenen Produkte und vermindern dementsprechend die Wahrnehmung des Altbackenwerdens. Amylasen sind bekannt dafür, dass sie eine günstige Auswirkung auf das Altbackenwerden und die Retrogradation der Stärke haben.
Das Altbackenwerden des Brotes ist ein komplexes Phänomen. Es wird empfunden als eine Erweichung der Kruste, einem Verhärten der Krume und dem Verschwinden des frischen Brotgeschmacks. Das Verhärten der Krume ist nicht nur durch einen Verlust von Wasser während der Lagerung verursacht, wie bereits durch Boussingault in ((1852) Ann. Chim. Phys. 3, 36, 490) bewiesen. Es ist das Ergebnis einer Anzahl von physiko-chemischen Prozessen. Über die Jahre hinweg haben Forscher versucht, diese Prozesse zu enträtseln und unterschiedliche Theorien entwickelt.
In der Anfangszeit wurde das Hartwerden des Brotes einzig auf die Retrogradation der Stärke zurückgeführt (Katz, J.R. (1930) Z. Phys. Chem., 150, 37-59). Es wurde durch Röntgenbeugungsanalyse gezeigt, dass die Stärke im Brot eine mikrokristalline Struktur während der Lagerung ausbildet. Später wurde gezeigt, dass die wasserlösliche Stärkefraktion während des Altbackenwerdens des Brotes sich verminderte (Schoch et al. (1947) Cereal Chem., 24, 231-249), woraus sich schließen lässt, dass die Stärkekörner während des Backens Wasser absorbieren. Die linearen Amyloseketten werden löslich und diffundieren in die Wasserphase. Mit der Zeit ist immer mehr Amylose in der Wasserphase vorhanden. Somit ist die Amylose teilweise aus den angeschwollenen Stärkekörnern ausgewaschen. Das verzweigte Amylopektin verbleibt in den Körnern. Der Auslaugungsprozess ist durch das verfügbare Wasser limitiert. Während des Abkühlens retrogradiert die Amylose sehr schnell und bildet ein Gel. Es wird geglaubt, dass die Retrogradation des Amylopektins hauptsächlich die Verbindung seiner äußeren Zweige beinhaltet und eine längere Zeit beansprucht wie die Retrogradation der Amylose, wodurch es eine Bedeutung in dem Prozess des Altbackenwerdens bekommt, der über die Zeit nach dem Abkühlen des Produktes auftritt, und es langsamer aufgrund von stereochemischen Interferenzen aggregiert. Das Amylopektin bildete intramolekulare Bindungen aus. Die prominente Rolle von Stärke im Altbackenwerden von Brot ist weiterhin veranschaulicht durch die Verwendung von Carbohydrasen zum Vermindern oder Verlangsamen des Altbackenwerdens von Backwaren. Es wurde gezeigt (Conn J. F. et al. (1950) Cereal Chem., 27, 191-205), dass Amylasen bakteriellen oder pilzlichen Ursprungs die Geschwindigkeit des Altbackenwerdens von Brot verlangsamen und in einer weniger starren Krumenstruktur resultiert. Die Zugabe von thermostabilen alpha-Amylasen oder beta-Amylasen ist meist wirksam. Jedoch resultiert dies auch in einer gummiartigen und klebrigen Krume.
Das Dokument EP 0 412 607 offenbart die Verwendung von einer thermostabilen Alpha-1,6-Endoglucanase oder einer Alpha-1,4-Exoglucanase zur Reduktion des Altbackenwerdens; EP 0 234 858 offenbart die Verwendung einer thermostabilen maltogenen beta-Amylase zur Erhaltung der Krumenweichheit.
Jedoch ist es noch nicht klar, ob die das Altbackenwerden hemmende Wirkung durch die produzierten Dextrine verursacht wird oder durch die Veränderung von der Amylose und Amylopektin und der daraus folgenden verringerten Tendenz zu kristallisieren. Auch der Einfluss von Emulgatoren wie Glycerolmonostearat und Natrium-Stearoyllactylat scheint die Rolle der Stärke in dem Hartwerden der Brotkrume zu bestätigen (Schuster G. (1985) Emulgatoren für Lebensmittel – Springer Verlag, 323-329)
Es ist die Interaktion zwischen diesen Emulgatoren und der Stärke, die in einer geänderten Konformation der Stärke resultiert, die für die beobachtete Reduktion des Altbackenwerdens verantwortlich ist.
Da es nicht immer eine gute Korrelation zwischen der Stärkestruktur und dem Altbackenwerden gab (Zobel H.F. et al (1959) Cereal Chem., 36, 441), wurden andere Mehlbestandteile auch untersucht. Die Rolle von Mehlproteinen in dem Prozess des Hartwerdens der Krume ist untersucht worden, aber es wurde gefunden, dass sie weniger wichtig waren als Stärke (Cluskey, J.E. (1959) Cereal Chem., 36, 236-246), (Dragsdorf, R. D. et al., (1980) Cereal Chem., 57, 310-314) untersuchten die Wasserwanderung zwischen Stärke und Gluten während der Brotlagerung. Diese Autoren folgerten, dass aufgrund einer Änderung in der Kristallinität der Stärke sie mehr Wasser adsorbierte, somit das Wasser von Gluten zur Stärke wandert und dadurch weniger freies Wasser verfügbar ist.
In einer späteren Studie (Martin et al., (1991) Cereal Chem., 68(5), 498-503 und 503-507) ergibt es sich, dass die Dextrine mit hohem Molekulargewicht keinen das Hartwerden hemmenden Effekt auf die Brotkrume haben. Anstatt, die hohen DP-Dextrine können mit Proteinfibrillen verknüpfen und/oder eine Wasserstoffbindung bilden und somit effektiv das Gluten vernetzen. Infolgedessen ist die Verfestigungsrate erhöht. Es wird festgelegt, dass in schwächeren Mehlen das Gluten stärker mit den Stärkekörnern interagiert. Dies resultiert in einer Brotkrume, die schneller verfestigt. Jedoch resultieren eine bessere Glutenqualität und stärkeres Mehl auch in einem höheren Laibvolumen und somit in einer weichere Krume. Axford et al. (1968) zitiert in Faridi, H. (1985) Rheology of wheat products, AACC, S. 263-264) zeigten, dass das spezifische Laibvolumen ein Hauptfaktor in der Messung der Rate und des Ausmaßes der Verfestigung war. Somit bleibt die Rolle von Gluten bei der Brotverfestigung immer noch fraglich und wenige Versuche sind unternommen worden, um die Verfestigung basierend auf Gluten-Modifikation zu verlangsamen.
Proteasen haben eine lange Verwendungsgeschichte auf dem Backsektor. Sie werden hauptsächlich durch den Bäcker verwendet, um die Anforderungen der mechanischen Teigzubereitung für ungewöhnlich starkes oder zähes Gluten zu vermindern. Sie erniedrigen die Viskosität und erhöhen die Dehnbarkeit des Teiges. Im Endprodukt verbessern sie die Komprimierbarkeit der Textur, das Laibvolumen und die Brotfarbe. Auch der Geschmack kann durch die Produktion von bestimmten Peptiden verbessert werden. Die Proteasen machen das Gluten eher enzymatisch als mechanisch mürbe. Sie vermindern die Konsistenz des Teiges, wobei der Farinograph-Wert abnimmt. Die am meisten beim Backen verwendeten Proteasen sind aus Aspergillus oryzae und Bacillus subtilis. Die neutralen bakteriellen Proteasen sind bei weitem aktiver an Gluten als die alkalischen Proteasen. Papain, Bromelain und Ficin sind Thiol-Proteasen die aus Papaya, Ananas und Feigen extrahiert werden. Besonders Papain ist sehr reaktiv gegenüber Glutenproteinen. Bakterielle Proteasen und Papain, besonders neutrale Proteasen, werden für Kekse, Brotsticks und Cracker verwendet, wo eine deutliche Lockerung des Teiges gewollt ist. Jedoch ist in der Brotherstellung eine eher milde Hydrolyse durch Pilz-Proteasen bevorzugt.
Proteasen haben auch größere Nachteile. Das Wirken der Proteasen ist nicht zeitlich begrenzt, es besteht nach dem Mischen weiter und schwächt mit der Zeit die Teigstruktur. Dieses Phänomen steigert das Risiko der Schwächung des Teiges und erhöht die Klebrigkeit des Teiges. Manchmal ist ihre Wirkung durch den pH-Abfall während der Gärung sogar erhöht. Die Verwendung von Proteasen zum Backen erfordert die strikte Kontrolle der hauptsächlichen Fermentations- und Gärbedingungen des Teiges. Die Proteasen werden während des Backens inaktiviert (Kruger, J.E. (1987) Enzymes and their role in cereal technology AACC 290-304). Besonders neutrale Proteasen aus Bacillus und Papain sollten sehr vorsichtig dosiert werden, da Überdosierung den Teig zu sehr lockert. Dies kann im Zusammenbruch des Teiges vor dem Einschieben in den Ofen oder einem geringeren Brotvolumen und einer offeneren Krumenstruktur resultieren. Besonders in Europa, wo die Mehlsorten weicher sind wie in den Vereinigten Staaten oder Kanada, ist das Risiko der Überdosierung der Protease sehr vorhanden.
Weiterhin steigern Proteasen auch die Klebrigkeit, da durch die hydrolytische Wirkung Wasser aus dem Gluten freigesetzt wird (Schwimmer, S. (1981) Source book of food enzymology, AVI-Publishing, 583-584). Dies bedeutet, dass in der Praxis Proteasen zur Brotherstellung in Europa kaum verwendet werden. GB-A-906344 beschreibt einen das Altwerden hemmenden Brotzusatz, umfassend Fett oder Öl und mindestens ein proteolytisches Enzym aus Bacillus Subtilis oder Aspergillus Oryzae.
Das Dokument EP 021 179 offenbart die Verwendung einer alpha-Amylase-Präparation, in der die Protease (inaktiviert) in Kombination mit Emulgatoren benutzt wurde, um das Altbackenwerden zu hemmen.
Conforti et al. (1996) FSTA, 96(12), M0190 Abstrakt der Präsentation) fügten eine Enzymmischung, umfassend eine bakterielle Amylase, eine Pilzamylase und eine Pilzprotease, zu fettsubstituierten Muffins hinzu. Der Fett enthaltende Kontroll-Muffin war zarter. Die Enzymbehandlung verminderte die Rate des Altbackenwerdens. Dies ist angesichts der Gegenwart von Amylasen nicht überraschend.
Lipasen sind auch bekannt, die Brotkrume weich zu machen und etwas die Verfestigungsrate der Brotkrume zu reduzieren ( WO 94/04035 , Beispiel 2). EP-A-1 186 658 beschreibt eine Enzymlösung mit proteolytischer Aktivität, erhalten durch die Kultivierung von Bacillus subtilis Stamm M2-4, der eine hohe hitze-resistente Peptidaseaktivität besitzt. Es wurde gefunden, dass das Brotvolumen um 10% nach der Zugabe der Enzymlösung zunahm.
DD-A-156 714 und Bäcker und Konditor (1984) beziehen sich auf die Herstellung einer hitzestabilen Thermitase und ihre Benutzung in Backwaren (z.B. Waffeln), um das Gluten weich zu machen.
WO-A-0 174 169 und GB-A-375 342 beziehen sich auf die Einarbeitung von Papain, einer Cysteinprotease, in Brot- und Biskuitteig als ein Erweichungsmittel des Glutens.
US-A-3 561 975 offenbart die Verwendung von Fett umhüllten Proteasen in Tortenteigen.
RU(A)2 177 994 , US-A-5 569 599 , US-A-5 124 261 und US-A-5 714 373 beschreiben die Herstellung und die Verwendung einiger hitzestabiler Proteasen, wie Keratinase, Aqualysin I und einer Protease aus Thermococcus.
Pilzproteasen sind empfindlich gegenüber hohen Temperaturen. Ihre Wirksamkeit in der Proteinhydrolyse in einem moderaten bis hohen Temperaturbereich von etwa 50°C oder höher ist normalerweise schwach. Einige bakterielle neutrale und alkalische Proteasen sind resistent gegenüber Behandlungen mit hoher Hitze. Bis jetzt sind Berichte über aus Bakterien erhaltene Proteasen mit Hitzeresistenz, die eine gute Peptidaseaktivität behalten können, zum Beispiel in einem hohen Temperaturbereich von etwa 60°C, spärlich gewesen. Das Dokument EP-1 186 658 offenbart solch ein Enzym, hergestellt durch ein Bakterium der Gattung Bacillus subtilis, spezifischer einen M2-4 Stamm. Die offengelegte Enzymmischung verliert jedoch komplett ihre Aktivität bei einer Temperatur von etwa 70°C. Neutrale thermostabile Proteasen von Bacillus, die tolerant gegenüber oxidierenden Wirkstoffen sein können, werden in Detergenz-Rezepturen bevorzugt. Auch werden alkalische thermostabile Proteasen aus Bacillus in Wasch- und Detergenz-Rezepturen verwendet. Papain ist sehr hitzestabil und benötigt eine längere Erhitzung bei 90 – 100°C zur Inaktivierung. Bromelain ist weniger stabil und kann bei rund 70°C inaktiviert werden. Andere hitzestabile Proteasen werden hergestellt durch Bacillus licheniformis NS70 (Chemical Abstracts, 127, 4144 CA), Bacillus licheniformis MIR 29 (Chemical Abstracts, 116, 146805 CA), Bacillus stearothermophilus (Chemical Abstracts, 124, 224587 CA), Nocardiopsis (Chemical Abstracts, 114, 162444 CA) und Thermobacteroides (Chemical Abstracts, 116, 146805 CA). Dies ist keine erschöpfende Liste, aber sie veranschaulicht die Bedeutung von den thermostabilen Serinproteasen und ihrer Anwendung, meistens in Detergenzien. Es wurde kein Verweis auf Backeigenschaften und auf das Altwerden hemmende Eigenschaften gemacht.
Lipasen sind auch bekannt, die Brotkrume weich zu machen und etwas die Verfestigungsrate der Brotkrume zu reduzieren ( WO 94/04035 , Beispiel 2).
Pilzproteasen sind empfindlich gegenüber hohen Temperaturen. Einige bakterielle neutrale und alkalische Proteasen sind resistent gegenüber Behandlungen mit hoher Hitze. Neutrale thermostabile Proteasen von Bacillus, die tolerant gegenüber oxidierenden Wirkstoffen sein können, werden in Detergenz-Rezepturen bevorzugt. Auch werden alkalische thermostabile Proteasen aus Bacillus in Wasch- und Detergenz-Rezepturen verwendet. Papain ist sehr hitzestabil und benötigt eine längere Erhitzung bei 90 – 100°C zur Inaktivierung. Bromelain ist weniger stabil und kann bei rund 70°C inaktiviert werden. Andere hitzestabile Proteasen werden hergestellt durch Bacillus licheniformis NS70 (Chemical Abstracts, 127, 4144 CA), Bacillus licheniformis MIR 29 (Chemical Abstracts, 116, 146805 CA), Bacillus stearothermophilus (Chemical Abstracts, 124, 224587 CA), Nocardiopsis (Chemical Abstracts, 114, 162444 CA) und Thermobacteroides (Chemical Abstracts, 116, 146805 CA). Dies ist keine erschöpfende Liste, aber sie veranschaulicht die Bedeutung von den thermostabilen Serinproteasen und ihrer Anwendung, meistens in Detergenzien. Es wurde kein Verweis Backeigenschaften und auf das Altwerden hemmende Eigenschaften gemacht.
Papain ist ein proteolytisch aktiver Bestandteil in dem Milchsaft der tropischen Papaya-Frucht. Der rohe getrocknete Milchsaft enthält eine Mischung von mindestens vier Cysteinproteasen.
Thermolysin ist eine extrazelluläre Metalloendopeptidase, die durch das Gram-positive thermophile Bakterium Bacillus thermoproteolyticus sezerniert wird.
STAND DER TECHNIK
Die Keratinase ist eine Protease, die an Keratin aktiv ist, einem Skleroprotein, das als ein Bestandteil in der Epidermis, in Haaren, Wolle, Nägeln und Federn von Säugern existiert. Praktische Anwendungen findet das Enzym als Inhaltsstoff in Enthaarungs-Kompositionen; als Enthaarungsmittel von Häuten in der Lederindustrie, dem Abbau von Keratin und der Wiedereinsetzung in textile Gewebe. Es ist keine Anwendung des Enzyms in der Lebensmittelindustrie bekannt.
Thermus aquaticus ist ein hyperthermophiles Enzym, was zu den Archaebakterien gehört. Die gut bekannte „Taq-Polymerase^TM" ist aus diesem Organismus isoliert. Pyrococcus furiosus ist ein weiterer Repräsentant aus dieser Gruppe. Von diesen Organismen wurden thermostabile Proteasen isoliert.
Thermitase ist eine extrazelluläre Endopeptidase aus Thermoactinomyces vulgaris. Aufgrund ihrer relativ geringen Spaltungsspezifität gegenüber Peptidbindungen besitzt die Thermitase viele Anwendungen. Sie ist geeignet für die Herstellung teilweise hydrolysierter Proteine für Gesundheits- und andere spezielle Diäten.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verhinderung oder Verminderung des Altbackenwerdens und verbundener Effekte während des Backprozesses von Backwaren, wobei das Verfahren den Schritt des Hinzufügens einer ausreichend wirksamen Menge von mindestens einer thermostabilen Protease zu den Bestandteilen der Backwaren umfasst.
Vorzugsweise sind die Proteasen neutrale oder alkalische Proteasen, äußerst bevorzugt alkalische Proteasen.
Vorzugsweise hat die intermediär thermostabile und/oder thermostabile Serinprotease ihre optimale Aktivitätstemperatur höher als 60°C, bevorzugt höher als 70°C, insbesondere höher als 75°C oder sogar höher als 80°C. Die bevorzugte intermediär thermostabile und/oder thermostabile Serinprotease, die in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, weist ein Verhältnis zwischen der Proteaseaktivität bei der optimalen Temperatur und bei 25°c von höher als 10 vor, bevorzugt höher als 15. Als solches wird das Enzym vorzugsweise während des Backprozesses aktiv sein und vorzugsweise nicht während dem Prozess des Gehens des Teiges.
Solche intermediär thermostabile und/oder thermostabile Serinprotease kann erhalten werden durch die Extraktion aus natürlich vorkommenden eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen, durch Synthese oder durch Gentechnologie durch eine dem Fachmann gut bekannte Methode.
Die bevorzugte intermediär thermostabile und/oder thermostabile Serinprotease ist die Taq-Protease, die vorteilhaft aus dem Stamm Thermus aquaticus (LMG8924) isoliert werden kann oder die Keratinase, vorzugsweise isoliert aus Bacillus licheniformis (LMG7561) oder ist die Thermitase, isoliert aus Thermoactinomyces vulgaris. Diese drei Proteasen gehören alle zu der Klasse der Serin-Peptidasen. Papain (zu der Klasse der Cystein-Peptidasen gehörig) und Thermolysin (zu der Klasse der Metallo-Peptidasen gehörig) wurden auch in die durchgeführten Backversuche eingeschlossen, waren aber nicht in der Lage, das Altbackenwerden zu verhindern und/oder hatten unerwünschte Nebenwirkungen und/oder negative Auswirkungen auf den Backprozess und die resultierenden Produkte.
In dem Verfahren gemäß der Erfindung kann die Verwendung der intermediär thermostabilen und/oder thermostabilen Serinprotease mit einem anderen Enzym, wie einer thermostabilen α-Amylase, β-Amylase, einer intermediär thermostabilen Maltogenamylase, Lipase, Glycosyltransferasen oder Pullanasen kombiniert werden. Die thermostabile Protease kann auch zu einem nicht-enzymatischen Additiv wie einem Emulgator (Monoglycerid, Diglycerid und/oder Stearoyllactylaten) hinzugefügt werden. Andere geeignete Emulgatoren können auch zu der intermediär thermostabilen und/oder thermostabilen Serinprotease während des Backprozesses hinzugefügt werden. Synergistische oder sich steigernde Wirkungen sind vorhanden.
Deshalb wird das Verfahren gemäß der Erfindung in verbesserten Backwaren resultieren, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Brot, weiche Brötchen, Bagel, Donuts, Plundergebäck, Hackfleischbrötchen („hamburger rolls"), Pizza, Fladenbrot und Gebäck.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine das Altwerden hemmende Mischung für Backwaren, die mindestens eine thermostabile Protease enthält.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Backmittelmischung, spezifischer eine Brot backmittelmischung, die mindestens eine intermediär thermostabile und/oder thermostabile Serinprotease und die gewöhnlichen aktiven Inhaltsstoffe einer Backmittel-Mischung umfasst. Eine Backmittelmischung ist ein gut bekanntes Konzept unter Bäckern. Es ist eine Mischung aus aktiven Inhaltsstoffen, wie Enzymen und Emulgatoren, die mit den gewöhnlichen Inhaltsstoffen der Brotherstellung, wie Mehl und Wasser, gemischt sind.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist bezogen auf die Verwendung der intermediär thermostabilen und/oder thermostabilen Protease, besonders einer Keratinase der Erfindung, in der Lebensmittelindustrie und spezifischer in Backwaren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Sie Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer intermediär thermostabilen und/oder thermostabilen Serinprotease in gebackenen waren. Vorzugsweise sind diese Serinproteasen alkalische Proteasen, aber sie können auch neutrale Proteasen sein. Die Enzympräparation hat eine deutliche Wirkung auf die Weichheit der Krume und die Verzögerung des Altbackenwerdens von Backwaren. Die Enzympräparation ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie keine gegenteiligen Wirkungen auf die Teigrheologie, auf die Krumenstruktur und auf das Volumen des resultierenden Brotes aufweist. Das Enzym hat eine geringe Aktivität bei einer Temperatur von 25°C bis 40°C, was bedeutet, dass es keine bis geringe Aktivität während dem Ruhen und/oder Gehen des Teiges aufweist. Das Enzym weist ein Temperaturoptimum von 60°C – 80°C oder höher auf. Das Enzym ist oder ist nicht inaktiviert während des Backprozesses. Die intermediär thermostabilen und/oder thermostabilen Serinproteasen sind gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass sie eine positive Wirkung als das Altwerden hemmende Mittel aufweisen. Diese Wirkung ist besonders erkennbar in Kombination mit anderen das Altwerden hemmenden Enzymen. Als Beispiele anderer das Altwerden hemmenden Enzyme kann der Fachmann thermostabile Amylasen aus Bacillus licheniformis oder Bacillus stearothermophilus und thermostabile Maltogenamylasen (d. h. Novamyl^® von Novozymes) auswählen. Ihre Wirkung ist auch additiv zu dem das Altwerden hemmenden Effekt von Mono- und Diglyceriden, Stearoyllactylaten und anderen Emulgatoren, die zum Backen verwendet werden.
Die intermediär thermostabilen und/oder thermostabilen Serinproteasen der Erfindung können verwendet werden in Brot, weichen Brötchen, Bagel, Donuts, Plundergebäck, Hackfleischbrötchen („hamburger rolls"), Pizza und Fladenbrot, Kuchen und anderen gebackenen Produkten, wo Altbakkenwerden und dessen Hemmung eine Frage der Qualität ist.
Die intermediär thermostabile und/oder thermostabile Serinprotease der Erfindung kann durch Prokaryoten (Bakterien) und Eukaryoten (Pilze, Archaebakterien, Tiere, Pflanzen usw.) hergestellt werden und/oder durch Gentechnologie oder sogar durch Synthese mit jeder dem Fachmann bekannten Technik hergestellt werden.
Grundsätzlich sind die wichtigsten Eigenschaften der Proteasen, die in dieser Erfindung verwendet werden, folgende:

1) Ihre Hitzebeständigkeit: Bei einem pH-Wert, wo das Enzym stabil ist, weisen sie ein Temperaturoptimum auf, das höher als 60°C liegt, vorzugsweise höher als 70°C und sogar insbesondere höher als 75°C, höher als 80°C oder 85°C.
2) Das Verhältnis zwischen der Aktivität bei der optimalen Temperatur und bei 25°C ist mindestens höher als 10 und bevorzugt höher als 15.
3) Sie gehören zu der Gruppe der Serinproteasen.

Vorzugsweise verlieren die Proteasen der Erfindung nicht ihre Aktivität bei Temperaturen höher als 60°C, bevorzugt höher als 70°C, 75°C, 80°C oder sogar 85°C. Die Enzyme der vorliegenden Erfindung können noch aktiv sein bei sehr hohen Innentemperaturen, die innerhalb eines Produktes während des Backens erreicht werden(mindestens etwa 75°C für mit Hefesauerteig gebackene Nahrungsmittel und mindestens 90 – 95°C für chemisch gesäuerte, gebackene Nahrungsmittel, wenn sie vollständig gebacken sind). Innerhalb des optimalen Temperaturbereiches kann die Temperatur irgendwo zwischen etwa 60°C bis 61°C, 62°C, 63°C, ... 84°C, 85°C, ... 89°C, 90°C, ... 94°C, 95°C und allen darin eingeschlossenen ganzzahligen Werten liegen.
Das Enzym der Erfindung ist bevorzugt eine Keratinase, eine Taq-Protease und/oder eine Thermitase. Die Keratinase wird vorzugsweise durch Bacillus licheniformis (Beispiel B. licheniformis LMG 7561) erzeugt. Die Taq-Protease wird vorzugsweise durch Thermus aquaticus (Beispiel Thermus aquaticus LMG 8924) erzeugt. Die Thermitase wird vorzugsweise durch Thermoactinomyces vulgaris erzeugt.
Die Proteasen können von den entsprechenden Mikroorganismen durch Verwendung jeder geeigneten Technik erhalten werden. Zum Beispiel kann die Protease-Präparation durch Fermentation eines Mikroorganismus und nachfolgender Isolierung der Protease-enthaltenden Fraktion aus der resultierenden Nährlösung mit dem Fachmann bekannten Methoden, wie Zentrifugation und Ultrafiltration, erhalten werden. Die Proteasen können auch erhalten werden durch Klonierung der für eine geeignete Protease kodierenden DNA-Sequenz in einem Wirtsorganismus, der die Protease intra- oder extrazellulär exprimiert und das Sammeln des hergestellten Enzyms. Vorzugsweise ist die Protease in einer Form vorhanden, die eine exakte und/oder mehr oder weniger exakte Dosierung erlaubt. Die Dosierung kann schwierig sein, wenn die Proteasen Teil einer komplexen natürlichen Mischung sind, die mehr als einen Typ der Enzyme umfasst. In einem solchen Fall könnte das Einfügen von einem oder mehreren Reinigungsschritten nötig sein.
Die Proteasen können auch erhalten werden durch die Methode der zielgerichteten Evolution („directed evolution”) oder das sogenannte „Gene Shuffling" von thermostabilen oder nicht thermostabilen Serinproteasen oder Enzymen. So lange sie Peptidspaltungsaktivität aufweisen, werden sie als Proteasen im Bereich dieser Erfindung angesehen.
Überraschend fanden die Erfinder, dass die Verwendung einer Protease, die keine wahrnehmbare Einwirkung auf die Teigrheologie aufwies, eine deutliche Wirkung auf die Weichheit und die Verzögerung der Krumenhärtung besaß. Es gab, verglichen mit der Kontrolle, keine gegenteilige Wirkung auf die Krumenelastizität oder keine Zunahme der Krumenklebrigkeit. Die Wirkung war additiv zu bekannten das Altwerden hemmenden Mitteln (wie -Amylasen) und gestattet die Entwicklung von Brot und anderen weichen Backwaren mit einer verlängerten Lagerfähigkeit.
Die Wahl von der Protease ist sehr bedeutend. Die Protease sollte keine nachteilige Wirkung während des Mischens und dem nachfolgenden Gärprozess ausüben. Ansonsten ist die Dosierung, die gehandhabt werden kann, zu gering, um die Rate des Altbackenwerdens herabzusetzen und eine gute Krumenelastizität zu erhalten. Je höher das Temperaturoptimum von dem Enzym, desto geringer ist die negative Wirkung auf die Krumenstruktur und auf die Teigrheologie.
Die vorliegende Erfindung wird ausführlich in dem folgenden, nicht beschränkten Beispiel in Bezugnahme auf die beiliegende Figur beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1 stellt das Temperaturoptimum der Protease als Funktion der relativen Aktivität (%) bei pH 7,0 in einer gepufferten 0,1 M Phosphatlösung für Aqualysin I (♦, volle Linie) und Keratinase (•, gepunktete Linie) dar.
Die 2 stellt die Verzögerungswirkung der Zugabe der Taq-Protease (0 U: ♦, 800 U:) auf das Altkbackwerden des Brotes in der Abwesenheit und Anwesenheit von Novamyl^® (0-8 g/100 kg Mehl) dar.
Die 3 zeigt die gesteigerte Wirkung auf das Verzögern des Altbackenwerdens des Brotes, nachfolgend auf die Zugabe der Keratinase (0 U: ♦, 800 U:) in das Brot in der Abwesenheit und Anwesenheit von Novamyl^® (0-8 g/100 kg Mehl).
Die 4 zeigt das Temperaturoptimum der Thermitase als Funktion ihrer relativen Aktivität (%) bei pH 7,0 in einer gepufferten 0,1 M Phosphatlösung.
Die 5 zeigt die thermale Stabilität der Thermitase als Funktion ihrer relativen Aktivität (%).
BESCHREIBUNG EINER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Eine der bevorzugten Serinproteasen, die verwendet wurden, ist aus dem Stamm Bacillus licheniformis LMG 7561 erhalten worden und weist Keratinase-Aktivität auf. Durch die Ähnlichkeit der Aminosäuren und der Hemmung durch Phenylmethylsulfonylfluorid wurde nachgewiesen, dass die Keratinase eine Serinprotease ist. Die in Frage kommende Keratinase ist erhalten worden durch Kultivieren des Stammes Bacillus licheniformis LMG 7561 in dem folgenden Medium: 0,5 g/l NH₄Cl, 0,5 g/l NaCl, 0,3 g/l K₂HPO₄, 0,4 g/l KH₂PO₄, 0,1 g/l 10 MgCl₂·6H₂O, 2 g/l Zitronensäure, 0,1 g/l Hefeextrakt und 10 g/l Federmehl. Das Medium wird auf pH 6,5 mit Phosphorsäure eingestellt. Keine Kontrolle des pH-Wertes wurde auferlegt. Die Inkubation ist bei 45°C mit Durchlüftung (P₂ 60%, 1,25 vvm) während 40 Stunden durchgeführt worden, nach denen das Medium zur weiteren Konzentrierung gesammelt wird. Der Überstand wird dann durch Membran-Ultrafiltration (Molekulare Ausschlussgrenze: 5.000 Da) konzentriert. Die auf diese Weise erhaltene rohe Keratinase-Lösung wird bis zur Verwendung in Backtests gefroren gelagert.
Die auf diese Weise erhaltene Keratinase-Lösung zeigt eine maximale Aktivität bei einer Temperatur von 60°C und einem pH-Wert von 8,0. In dem pH-Bereich von 7 bis 9 wurden mehr als 85% der maximalen Aktivität gemessen. Es ergibt sich fast kaum ein Verlust der Enzymaktivität während des Erhitzens der Lösung für eine Stunde bei 60°C. Erhitzen des Enzyms bei 70°C während 14 Minuten reduziert die Aktivität mit 50%.
Die Aktivität wurde mit Keratin gemessen. Für Standardmessungen wurden 4 g Keratin in 100 ml Natriumhydroxid aufgelöst. Nach der Auflösung wird der pH-Wert langsam mit 3,2 M Phosphorsäure auf 8,0 eingestellt. Destilliertes Wasser wird auf ein Endvolumen von 200 ml hinzugefügt. 5 ml der Substratlösung wird bei 60°C vorinkubiert, 1 ml der Enzymlösung hinzugefügt und bei 60°C inkubiert. Dann wird 5 ml von 14%-iger TCA (Trichloressigsäure) zu der inkubierten Enzymlösung hinzugefügt. Es wurde für 60 Minuten gemischt. Die Lösung wird filtriert und die Absorption bei 275 nm relativ zu einer leeren Lösung (Enzym nach der TCA-Zugabe hinzugefügt) gemessen.
Die Aktivität wird in KU/ml dargestellt.
Der Fermentationsansatz enthielt 300 bis 1500 KU/ml.
Zu Backzwecken wurde die Aktivität als mU/ml dargestellt, basierend auf der Protazym-Tabletten-Bestimmung. Die KU-Einheiten wurden nur verwendet, um die Anwesenheit der Keratinase zu beweisen.
Die in Frage kommende Taq-Protease ist erhalten worden durch Kultivieren des Stammes Thermus aquaticus LMG 8924 in dem folgenden Medium: 1 g/l Trypton; 1 g/l Hefeextrakt; 100 ml/l Salzlösung und 900 ml destilliertes Wasser. Der pH-Wert wird vor der Sterilisation bei 121°C für 15 Minuten mit 1 M NaOH auf 8,2 eingestellt. Die Salzlösung weist die folgende Zusammensetzung auf: 1 g/l Nitriloessigsäure, 0,6 g/l CaS0₄·2H₂0; 1 g/l MgSO₄·7H₂O; 80 mg/l NaCl, 1,03 g/l KNO₃; 6,89 g/l NaNO₃; 2,8 g/l Na₂HPO₄·12H₂O; 10 ml/l FeCl₃·6H₂O Lösung (47 mg/100 ml); 10 ml/l Spurenelement-Lösung und 1 1 destilliertes Wasser. Die Spurenelementlösung weist die folgende Zusammensetzung auf: 0,5 ml/l H₂SO₄; 1,7 g/l MnSO₄·H₂O; 0,5 g/l ZnSO₄·7H₂O; 0,5 g/l H₃BO₃; 25 mg/l CuSO₄·5H₂O; 25 mg/l Na₂MoO₄·2H₂O; 46 mg/l CoCl₂·6H₂O und 1 l destilliertes Wasser. Die Inkubation ist bei 60°C mit Durchlüftung (PO₂ 60% 4 vvm) während 24 Stunden durchgeführt worden, nach denen das Medium zur weiteren Konzentrierung gesammelt wird. Thermus aquaticus LMG 8924 produzierte mindestens zwei Arten von extrazellulären Proteasen. Eine der extrazellulären Proteasen wurde Aqualysin I genannt und ist eine alkalische Protease, die linear von der ersten stationären Phase bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Zellen aufhören zu wachsen, sezerniert wurde. Das Temperaturoptimum der proteolytischen Aktivität war zwischen 70 und 80°C. Die andere wurde Aqualysin II genannt und ist eine neutrale Protease, deren Produktion am Tag 4 begann und die Konzentration dieser Protease setzte sich linear für 5 Tage fort. Die Maximumaktivität wurde bei 95°C erhalten (die höchste getestete Temperatur). Der Fermentationsextrakt wurde nach Tag 1 der Fermentation für die Backtests verwendet. Da die Fermentation nach 1 Tag gestoppt wurde, ist das Aqualysin I die vorhandene Protease. Aqualysin I wird stark durch die mikrobiellen Serinprotease-Hemmstoffe gehemmt und kann als eine alkalische Serinprotease klassifiziert werden.
Der Überstand wird dann durch Membran-Ultrafiltration (Molekulare Ausschlussgrenze: 10.000 Da) konzentriert. Die auf diese Weise erhaltene rohe Taq-Protease-Lösung wird bis zur Verwendung in Backtests gefroren gelagert.
Die auf diese Weise erhaltene Taq-Protease-Lösung zeigt eine Maximumaktivität bei einer Temperatur von 80°C. Es ergibt sich fast kaum ein Verlust der Enzymaktivität während des Erhitzens der Lösung für eine Stunde bei 80°C. Erhitzen des Enzyms bei 90°C während 10 Minuten reduziert die Aktivität mit 60%.
Die Proteaseaktivität wurde mit Azurin-vernetztem Casein (AZCL-Casein) gemessen. Dieses wird hergestellt durch Färben und Vernetzen von Casein, um ein Material zu produzieren, das in Wasser quillt, aber in Wasser unlöslich ist. Die Hydrolyse durch Proteasen produziert wasserlösliche, gefärbte Fragmente und die Geschwindigkeit der Freisetzung dieser Fragmente (Zunahme in der Absorption bei 590 nm) kann direkt zu der Enzymaktivität in Beziehung gesetzt werden (Protazyme-AK Tabletten, Megazyme, Irland). Eine Protazyme-AK Tablette wird in 100 mM Na₂HPO₄·2H₂O_; pH 7.0 bei 60°C für 5 Minuten inkubiert. Ein Enzymaliquot (1,0 ml) wird hinzugegeben und der Reaktion gestattet, für genau 10 Minuten fortzudauern. Die Reaktion wird durch die Zugabe von Trinatriumphosphat (10 ml, 2% w/v, pH 12,3) beendet. Das Röhrchen wird für ungefähr 2 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann der Inhalt filtriert. Die Absorption des Filtrates wird bei 590 nm gegen einen Substrat-Leerwert gemessen.
Die Aktivität wird dargestellt in mU/ml = (34,2·(Abs590 Enzym – Abs590 Leerwert) + 0,6)/Verdünnung
Im Falle des thermophilen Mikroorganismus Thermoactinomyces vulgaris ist bekannt, dass während der logarithmischen Phase der Vermehrung mehrere proteolytische Enzyme in das umgebende Medium sezerniert werden. Unter den bis zu fünf proteolytischen Komponenten des Kulturfiltrates überwiegt eine Protease, Thermitase genannt, die sich auf 70 bis 80 der Gesamtaktivität beläuft.
Die Thermitase ist eine extrazelluläre, thermostabile Serinprotease. Das pH-Profil zeigt ein breites Optimum zwischen pH 7,5 und 9,5. Das Enzym demonstriert eine maximale Stabilität in dem pH-Bereich von 6,4 bis 7,6 mit zunehmender Instabilität oberhalb von pH 8,0 und unterhalb von pH 5,75, besonders bei erhöhten Temperaturen und längeren Zeitspannen. Die Thermitase zeigt, abhängig von der Größe des Substrates, eine Maximalaktivität bei Temperaturen, die sich zwischen 65°C (Gelatine), 70°C (Protamin) und 85°C (Azocasein) bewegen. Das Temperaturoptimum ist am ausgeprägtesten mit dem größten Substrat (Azocasein): Die Aktivität bei 85°C ist 12-fach über der bei 25°C gezeigten Aktivität.
Die in Frage kommende Thermitase wird erhalten durch die Kultivierung des Stammes Thermoactinomyces vulgaris NRRL b-1617 in einem Medium mit der folgenden Zusammensetzung: Weizenstärke (20 g/l), bakteriologisches Pepton (5 g/l), Hefeextrakt (3 g/l) und Malzextrakt (3 g/l) in destilliertem Wasser. Die Inkubation wird bei 45°C mit einer Durchlüftung von 12 l/Min und einer Umdrehung von 200 rpm durchgeführt. Der Überstand wurde nach einer Inkubation für 24 Stunden gesammelt. Aufgrund der Tatsache, dass der Kulturüberstand viel α-Amylaseaktivität enthielt, wurde ein erster Reinigungsschritt zur Abtrennung der Proteaseaktivität von der α-Amylaseaktivität durchgeführt, um Backversuche durchführen zu können. Der Überstand wurde durch Membran-Ultrafiltration (Molekulare Ausschlussgrenze: 10.000 Da) konzentriert. Die Thermitase wurde durch Säulenchromatographie an einer S-Sepharose-Säule (Pharmacia) gereinigt. Die Säule wurde mit 500 mM Na-Acetat-Puffer (pH-Wert 4,5) equilibriert und danach mit 10 mM Na-Acetat-Puffer (pH-Wert 4,5) und 5 mM CaCl₂. Die α-Amylaseaktivität wurde nicht an die Säule gebunden und die Thermitase wurde mit 10 mM Na-Acetat-Puffer (pH-Wert 4,5), 5 mM CaCl₂ und 1 M NaCl eluiert. Die eluierte Fraktion wurde gegen 10 mM Na-Acetat-Puffer (pH-Wert 4,5) und 5 mM CaCl₂ dialysiert und zur Durchführung der Backversuche verwendet.
Nebenaktivitäten, wie -Amylaseaktivität, wurden durch den Phadebas-Amylase-Test^TM (Pharmacia & Upjohn) gemessen. Das Substrat ist ein wasserunlösliches, vernetztes Stärkepolymer, das eine blaue Farbe trägt. Es wird durch -Amylase hydrolysiert, um wasserlösliche blaue Fragmente zu bilden. Die Absorption von der blauen Lösung ist eine Funktion der -Amylaseaktivität in der Probe.
Die Xylanase-Nebenaktivität wurde durch die Xylazyme-Methode^TM (Megazyme, Irland) gemessen. Das eingesetzte Substrat ist Azurin-vernetztes Xylan. Dieses Substrat wird hergestellt durch Färben und Vernetzen von hoch gereinigtem Xylan (von Birchwood), um ein Material zu produzieren, das in Wasser quillt, aber in Wasser unlöslich ist. Die Hydrolyse durch Endo-(1,4)-.-D-Xylanase produziert wasserlösliche, gefärbte Fragmente und die Geschwindigkeit der Freisetzung dieser Fragmente (Zunahme in der Absorption bei 590 nm) kann direkt zu der Enzymaktivität in Beziehung gesetzt werden.
Die erhaltene Lösung der Taq-Protease zeigte keine -Amylase- oder Xylanase-Nebenaktivität.
Die erhaltene Keratinase-Lösung wies keine Xylanaseaktivität auf und enthielt weniger als 8 U/ml α-Amylaseaktivität, wie durch den Phadebas-Test gemessen.
Die nach dem Reinigungsschritt erhaltene Lösung der Thermitase zeigte keine α-Amylase- oder Xylanase-Nebenaktivität.

Die Backversuche wurden in 1-kg Broten durchgeführt. Das Grundrezet war (in Gramm):

Mehl (Duo):	1500
Wasser:	840
Frische Hefe (Bruggeman, Belgien):	75
Natriumchlorid:	30
Teilweise hydriertes Palmöl:	21
Destillierte Monoglyceride:	3
Saccharose:	6
Ascorbinsäure:	0,06

Der folgende Prozess der Brotherstellung wurde verwendet:
Die Inhaltsstoffe wurden für 2 Minuten bei niedriger und für 6 Minuten bei hoher Geschwindigkeit in einem Diosna-SP24-Mischer gemischt. Die Teigendtemperatur war 29°C.
Nach der Hauptfermentation für 20 Minuten bei 25°C, wurden 600-g Teigstücke unter Verwendung des Euro-200S (Bertrand-Elektrolux Baking) mit der Einstellung R8/L19 hergestellt und geformt. Die Teigstücke wurden für 50 Minuten bei 35°C und 95% relativer Luftfeuchtigkeit gären lassen.
Dann wurden die Brote bei 230°C in einem MIWE-CONDO-Ofen (Michael Wenz – Arnstein – Deutschland) mit Dampf (0,1 L vor und 0,2 L nach dem Einschieben der Brote in den Ofen) gebacken. Es ist für einen Fachmann offensichtlich, dass dieselben Endresultate durch die Verwendung einer Ausstattung von anderen Lieferanten erhalten werden können.
Die Weichheit des Brotes wurde durch einen TA-XT2 Texturanalysator (Stable Micro Systems, UK) gemessen. Das Brot wurde geschnitten und die Kraft, die nötig ist, eine 25%-ige Deformation von 4 Scheiben von 1 cm Stärke zu erhalten, wurde gemessen. Diese nennt man die Härte. Die Härte wird am Tag 1 und am Tag 6 nach dem Backen gemessen. Der Unterschied zwischen den zwei Messkräften ist der „Verlust der Weichheit":
Verlust der Weichheit = Deformationskraft an Tag 6 – Deformationskraft an Tag 1
Es ist eine relative Messgröße. Die absoluten Werte haben als solche keine Bedeutung, aber sie sollten mit einer Referenz für die Interpretation verglichen werden.
Die Elastizität ist der Unterschied zwischen der oben genannten Kraft und der Kraft 20 Sekunden nach der Relaxation. Wenn die Elastizität geringer ist als im Referenz-Brot, besagt dies, dass die Krume weniger elastisch wird. Die Krume gewinnt nicht ihre ursprüngliche Gestalt zurück, wenn sie zusammengepresst wird. Dies bedeutet, dass während dem Schneiden oder der Verarbeitung die Krumenstruktur irreversibel verloren geht. Es ist entscheidend, dass durch die Verwendung eines zugefügten Enzyms kein Verlust der Elastizität im Vergleich zu dem Kontroll-Brot auftritt.
Das Hinzufügen der Enzyme der vorliegenden Erfindung zu dem Brotteig änderte nicht die Gärzeit, die Laibfeuchtigkeit und das spezifische Laibvolumen. Der anfängliche Feuchtigkeitsgehalt von Brot variiert leicht, aber all die Laibe verloren ungefähr dieselbe Menge an Feuchtigkeit während sechs Tagen der Lagerung bei Raumtemperatur.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: Tag-Protease
Ein Brot ist gemäß der oben genannten Methode mit Zusatz von Tag-Protease (eventuell in der Gegenwart von unterschiedlichen Dosen von Novamyl^® 10 000 BG von Novozymes (Dänemark))gebacken worden.
Die Dosierungen werden je 100 kg des in dem Backversuch verwendeten Mehlgewichtes ausgedrückt.
Die nachfolgende Tabelle 1 stellt den Verlust der Weichheit zwischen Tag 1 und Tag 6 nach dem Backen dar, wie vorhergehend definiert. Tabelle 1: Weichheit

Novamyl g/100 kg 800 U Taq-Protease 0 U Tag-Protease

0 140 209

2,5 128 152

5 96 118

8 68 105
Das Beispiel zeigt, dass die Verwendung der Taq-Protease das Altbackenwerden im Brot verzögert. Eine Kombination von Tag-Protease mit einer intermediär thermostabilen maltogenen Amylase (z. B. Novamyl^®, käufliches Enzym von Novozymes) wird das Altbackenwerden im Brot signifikant verzögern. So besteht eine synergistische Wirkung zwischen der thermostabilen Serinprotease und -Amylase. Diese Wirkung wird bei höheren Dosierungen von Novamyl^® deutlicher (siehe 2).
Tabelle 2 zeigt, dass die Elastizität von der Brotkrume kaum durch die Verwendung der Tag-Protease beein flusst wird. Tabelle 2: Elastizität

Novamyl^® g/100kg 800 U Taq-Protease 0 U Tag-Protease

0 61,5 61,9

2,5 63,1 63,4

5 63,0 64,2

8 63,4 64,9
BEISPIEL 2: Keratinase
Ein Brot wurde gemäß der oben genannten Methode mit Zusatz von Keratinase (eventuell in der Gegenwart von unterschiedlichen Dosen von Novamyl^® 10 000 BG von Novozymes (Dänemark)) gebacken.
Die Dosierungen in der nachfolgenden Tabelle 3 werden auf 100 kg des in dem Backversuch verwendeten Mehlgewichtes dargestellt.
Die Tabelle stellt den Verlust der Weichheit zwischen Tag 1 und Tag 6 nach dem Backen dar, wie vorhergehend definiert. Tabelle 3: Weichheit

Novamyl^® g/100 kg 800 U Keratinase 0 U Keratinase

0 121 209

2,5 95 126

5 64 111

8 50 59
Von diesem Experiment wird deutlich, dass der Zusatz der thermostabilen Serinprotease Keratinase eine deutliche Wirkung auf die Weichheit aufweist. Es gibt eine kumulative Wirkung mit der thermostabilen maltogenen Amylase wie Novamyl^® (siehe 3). Es wurde sichergestellt, dass das kleine Quantum der in der Präparation vorhandenen Amylase keinen Einfluss auf die Weichheit und das Relaxations-Verhältnis hatte durch getrenntes Untersuchen dieser Amylase.
Tabelle 4 zeigt auch, dass es keine gegenteilige Wirkung auf das Relaxations-Verhältnis gibt, wenn diese Protease verwendet wird. Tabelle 4: Elastizität

Novamyl^® g/100 kg 800 U Keratinase 0 U Keratinase

0 62,6 63,6

2,5 64,3 65,0

5 65,5 65,8

8 65,4 65,8
BEISPIEL 3: Thermitase
Ein Brot wurde gemäß der oben genannten Methode mit Zusatz von Thermitase (eventuell in der Gegenwart von unterschiedlichen Dosen von Novamyl^® 10 000 BG von Novozymes (Dänemark)) gebacken.
Die Dosierungen in der nachfolgenden Tabelle 5 werden auf 100 kg des in dem Backversuch verwendeten Mehlgewichtes dargestellt.
Die Tabelle 5 stellt den Verlust der Weichheit zwischen Tag 1 und Tag 6 nach dem Backen dar, wie vorhergehend definiert. Tabelle 5: Weichheit

Novamyl^® g/100 kg 10.500 U Thermitase 0 U Thermitase

0 140 197

2,5 87 107

5 65 102

8 62 68
Von diesem Experiment wird deutlich, dass der Zusatz der thermostabilen Serinprotease Thermitase eine deutliche Wirkung auf die Weichheit aufweist. Es gibt auch eine kumulative Wirkung mit der thermostabilen maltogenen Amylase wie Novamyl^®. Nach der Reinigung der Thermitase war keine alpha-Amylase in der Präparation vorhanden, die einen Einfluss auf die Weichheit und das Relaxations-Verhältnis hätte aufweisen können.
Tabelle 6 zeigt, dass es keine gegenteilige Wirkung auf das Relaxations-Verhältnis gibt, wenn diese Protease verwendet wird. Tabelle 6: Elastizität

Novamyl^® g/100 kg 10.500 U Thermitase 0 U Thermitase

0 62 64

2,5 64 65

5 64,6 66,3

8 64,4 66,2
[0086] Das relative Aktivitätsoptimum der Thermitase (%) bei pH 7,0, in einer gepufferten 0,1 M Phosphatlösung und die thermische Stabilität (dargestellt als Funktion oder der relativen Stabilität bei einer gegebenen Temperatur) sind in 4, beziehungsweise 5 gegeben.
Die Behandlung mit Taq-Protease, Keratinase und/oder Thermitase alleine, als Mischung und/oder zusammen mit thermostabilen Amylasen (z. B. Novamyl^®) wirkt sich bedeutsam auf die Weichheit aus. Das Enzym-behandelte Brot war weicher, wenn die Tag-Protease, Keratinase und/oder die Thermitase hinzugefügt wurden. Die Beispiele veranschaulichen, dass thermostabile Serinproteasen gemäß der vorliegenden Erfindung die Lagerfähigkeit von Backwaren steigern, soweit es die Weichheit und das Altbackenwerden betrifft.
BEISPIEL 4 Wirkung von Keratinase, Thermitase und Tag-Protease auf die Krumenstruktur und die sensorischen Eigenschaften von Brot
Die oben erwähnten intermediär thermostabilen und/oder thermostabilen Serinproteasen gemäß der vorliegenden Erfindung weisen keine negative Wirkung auf die Krumenstruktur auf, während andere nicht-thermostabile Proteasen oder Proteasen, die zu einer weiteren Gruppe von Proteasen gehören, wie Papain (Cysteinpeptidase) oder Thermolysin (Metallopeptidase), dieses taten. Die Verwendung von zum Beispiel Papain oder Thermolysin resultierte in einer Krumenstruktur, die offener wurde, abhängig von den verwendeten Dosierungen. Es ergab sich ebenfalls keine Wirkung auf das Volumen der gebackenen Produkte durch die Verwendung der thermostabilen Serinproteasen der Erfindung.

Die Krustenfarbe, die Eigenschaften der Kruste, die Farbe der Krume, Aroma und Geschmack des Brotes änderten sich nicht signifikant mit der Zugabe von Keratinase, Taq-Protease und/oder Thermitase. BEISPIEL 5: ANWENDUNG VON TAQ-PROTEASE IN KUCHEN

Rezept:	Mischung Satin Cremecake: 1.000 g
	Eier: 350 g
	Öl: 300 g
	Wasser: 225 g
Methode:	Mixer: Hobart
	Instrument: Rührstange
	Geschwindigkeit: 1 Minute Geschwindigkeit
	1 und 2 Minuten Geschwindigkeit 2, dann
	Zugabe von Öl und Wasser, 1 Minute Ge
	schwindigkeitl, abschaben und 2 Minuten
	Geschwindigkeit 1
	Teiggewicht: 300 g
	Temperatur: 180°C
	Zeit: 45 Minuten

Die Dosierungen in der nachfolgenden Tabelle 7 werden auf 100 kg des in dem Backversuch verwendeten Mehlgewichtes dargestellt.
Die Tabelle 7 stellt den Verlust der Weichheit dar, gemessen nach 4 Tagen, 1 Woche, 2 Wochen und 3 Wochen nach dem Backen. Tabelle 7: Weichheit

0 U Taq-Protease 600 U Taq-Protease 1.200 U Taq-Protease

4 Tage 396 321 237

1 Woche 492 379 298

2 Wochen 542 457 268

4 Wochen 687 441 308

Claims

Verfahren zum Verhindern oder Verzögern des Altbackenwerdens während des Backprozesses von Backprodukten, das den Zusatz von mindestens einer thermostabilen Serinprotease mit einem Temperaturoptimum der Aktivität höher als 60°C zu den Backprodukten umfasst, wobei die Protease in einer Menge zugesetzt wird, die das Altbackenwerden während des Backprozesses verhindert oder verzögert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die thermostabile Serinprotease ein Temperaturoptimum der Aktivität von höher als 70°C hat und insbesondere höher als 75°C.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis zwischen der Proteaseaktivität bei der optimalen Temperatur und der Proteaseaktivität bei 25°C höher als 10 ist, bevorzugt höher als 15.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die thermostabile Serinprotease durch Extraktion aus natürlich vorkommenden eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen, durch Synthese oder Gentechnologie erhalten ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die thermostabile Serinprotease eine neutrale Protease oder bevorzugt eine alkalische Protease ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aqualysin I, Aqualysin II, Thermitase oder Keratinase.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die thermostabile Serinprotease eine Taq-Protease ist, isoliert aus Thermus aquaticus LMG 8924, eine Keratinase, isoliert aus Bacillus licheniformis LMG 7561 und/oder eine Thermitase, isoliert aus Thermoactinomyces vulgaris.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend den Schritt des weiteren Hinzufügens eines Zusatzstoffes gegen Altbackenwerden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer thermostabilen α-Amylase, einer β-Amylase, einer Maltogenamylase mit mittlerer Thermostabilität, einer Lipase, Glycosyltransferasen, Pullanasen und Emulgatoren, besonders Monoglyceride, Diglyceride und/oder Stearoyllactylate.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Backprodukt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Brot, weichen Brötchen, Bagels, Donuts, Plundergebäck, Hackfleischbrötchen, Pizza, Fladenbrot und Gebäck.