BRPI0309166B1 - Method and improvement for preventing or delaying resurrection during the process of cooking of bakery products - Google Patents

Abstract

"método e composição para a prevenção ou retardamento do ressecamento do pão e o seu efeito durante o processo de cozedura de produtos de padaria". a presente invenção é relativa a um método para a prevenção ou retardamento do ressecamento durante o processo de cozedura de produtos de padaria, que compreende a etapa de adicionar uma quantidade suficientemente eficaz de, pelo menos, uma protease de serina termoestável e/ou termoestável intermediária nesses produtos de padaria. a presente invenção é ainda relativa a um melhorador para a prevenção ou retardamento do ressecamento durante o processo de cozedura de produtos de padaria, caracterizado por compreender pelo menos uma protease de serina termoestável ou termoestável intermediária.

Description

"MÉTODO E MELHORADOR PARA A PREVENÇÃO OU RETARDAMENTO DO RESSECAMENTO DURANTE O PROCESSO DE COZEDURA DE PRODUTOS DE PADARIA" Campo da invenção [001] A presente invenção respeita a um método e a uma composição para a prevenção ou retardamento do ressecamento do pão e dos efeitos associados durante o processo da cozedura de produtos de padaria que compreende, pelo menos, uma protease de serina termoestável e/ou termoestável intermediária.

Estado da técnica anterior [002] Os consumidores preferem comprar pão fresco e querem que este fique fresco durante muito tempo. Retardar o ressecamento constituiu sempre um desafio para os produtores de ingredientes de padaria. O fato de a produção de pão ser cada vez mais centralizada e mais afastada dos pontos de distribuição aumenta a pressão no desenvolvimento de aditivos e ingredientes para manter a moleza do pão. Também os pãezinhos, os hambúrgueres, os bolos e os produtos de pastelaria estão sujeitos ao ressecamento e a uma perda de moleza. Existem ingredientes conhecidos por retardar o ressecamento do pão e de produtos de padaria fofos. A gordura e os emulsionadores tais como os monoglicerideos destilados e estearoilacetilatos já são usados há décadas. Os mono-, di- e polissacarideos têm uma influência positiva na retenção e ligação da água. A perda de água é muitas vezes associada ao ressecamento e os sacarideos têm uma influência positiva na degustação dos produtos de padaria e, consequentemente, diminuem a percepção do ressecamento. As amilases são conhecidas por terem um efeito benéfico no ressecamento e retrogradação do amido.

[003] O ressecamento do pão é um fenômeno complexo. É entendido como um amolecimento da côdea, um endurecimento do miolo e o desaparecimento do sabor de pão fresco. O endurecimento do miolo não é apenas devido a uma perda de água durante o armazenamento como foi já demonstrado por Boussingault em ((1852) Ann. Chim. Phys. 3, 36, 490) . É o resultado de vários processos fisico-quimicos. Ao longo dos anos, os investigadores tentaram deslindar estes processos e desenvolveram diferentes teorias.

[004] Nos primeiros tempos, o enri j ecimento do pão foi atribuído somente à retrogradação do amido (Katz, J. R. (1930) Z. Phys. Chem., 150, 37-59) . Foi mostrado através de difração de Raios-X que o amido do pão formava uma estrutura microcristalina durante o armazenamento. Mais tarde, foi mostrado que a fração de amido solúvel na água diminuía durante o ressecamento do pão (Schoch et al. (1947) Cereal Chem., 24, 231-249), o que conclui que durante a cozedura os grânulos de amido absorvem água. As cadeias de amilose linear tornam-se solúveis e difundem-se para a fase aquosa. Com o tempo, cada vez mais amilose fica presente na fase aquosa. Assim, a amilose é parcialmente lixiviada dos grânulos de amido inchado. A amilopectina ramificada permanece nos grânulos. O processo de lixiviação é limitado pela água disponível. Durante o arrefecimento, a amilose regride muito rapidamente e forma um gel. A retrogradação da amilopectina é suposta envolver, primeiramente, a associação dos seus ramos externos e requer mais tempo do que a retrogradação da amilose, o que lhe confere distinção no processo de ressecamento, que ocorre ao longo do tempo depois de o produto ter arrefecido, agregando mais lentamente, devido às interferências estereoquimicas. A amilopectina formou ligações intramoleculares. 0 papel proeminente do amido no ressecamento do pão é também ilustrado pelo uso de carbo-hidrases para diminuir ou atrasar o ressecamento de produtos de padaria. Foi mostrado (Conn J. F. et al. (1950) Cereal Chem., 27, 191-205) que as amilases de origem fúngica ou bacteriana atrasam a taxa de ressecamento do pão e resultam numa estrutura de miolo menos rija. A adição de α-amilases ou β-amilases termoestáveis é mais eficiente. No entanto, isto também resulta num miolo pastoso e pegajoso.

[005] O documento EP0412607 mostra o uso de uma a-1,6-endoglucanase ou de uma a-1,4-exoglucanase termoestável para reduzir o ressecamento; EP0234858 mostra o uso de uma β-amilase maltogênica termoestável para reter a moleza do miolo.

[006] No entanto, não é ainda claro se o efeito antiressecamento é devido às dextrinas produzidas ou à modificação da amilose e da amilopectina e à consequente tendência reduzida de cristalização. Além disso, a influência de emulsionadores tais como o gliceromonoestearato e o estearoilacetilato de sódio parecem confirmar o papel do amido no enrijecimento do miolo de pão. (Schuster G. (1985) Emulgatoren für Lebensmittel - Springer Verlag 323-329). É a interação entre estes emulsionadores e o amido que resulta numa conformação do amido alterada que contribui para a redução do ressecamento observada.

[007] Uma vez que não houve sempre uma boa correlação entre a estrutura do amido e o ressecamento (Zobel H.F. et al (1959) Cereal Chem., 36, 441), também foram investigados outros constituintes da farinha. 0 papel das proteínas da farinha no processo de enrijecimento do miolo foi estudado, mas averiguou-se que elas eram menos importantes que o amido (Cluskey, J. E. (1959) Cereal Chem., 36, 236-246). Dragsdorf, R. D. et al. ((1980) Cereal Chem., 57, 310-314) estudaram a migração da água entre o amido e o glúten durante o armazenamento do pão. Estes autores concluíram que devido a uma alteração na cristalinidade do amido, ele absorveu mais água, pelo que a água migrou do glúten para o amido e, por conseguinte, ficou disponível menos água livre.

[008] Num estudo posterior (Martin et al. (1991) Cereal Chem., 68(5), 498-503 e 503-507), viu-se que as dextrinas de elevado peso molecular não têm um efeito anti-enrijecimento no miolo de pão. Pelo contrário, as dextrinas de elevado DP podem enredar-se e/ou formar uma ligação de hidrogênio com fibrilas de proteína e, consequentemente, reticular o glúten. Consequentemente, a taxa de enrijecimento é aumentada. Está estabelecido que em farinhas mais fracas, o glúten interage mais fortemente com os grânulos de amido. Isto resulta num miolo de pão que enrijece mais depressa. Contudo, melhor qualidade de glúten e farinha mais forte também resulta num volume de pão mais elevado e, por conseguinte, num miolo mais mole. Axford et al. (1968) citado por Faridi, H. ((1985) Rheology of wheat products, AACC, p. 263-264) mostrou que o volume específico do pão era um importante fator na medição quer da taxa, quer da extensão do enrijecimento. Assim, o papel do glúten no enrijecimento do pão ainda permanece questionável e foram feitas poucas tentativas para atrasar o enrijecimento baseadas na modificação de glúten.

[009] As proteases têm uma longa história de utilização no setor da panificação. A maioria das vezes são usadas pelo padeiro para reduzir os requisitos mecânicos do desenvolvimento da massa de farinha com glúten invulgarmente forte ou duro. As proteases baixam a viscosidade e aumentam a extensibilidade da massa de farinha. No produto final, melhoram a compressibilidade da textura, o volume do pão e a cor do pão. Do mesmo modo, o sabor pode ser intensificado pela produção de alguns peptideos. As proteases amaciam o glúten enzimaticamente em vez de mecanicamente. Reduzem a consistência da massa de farinha, diminuindo o valor do gráfico da farinha. As proteases mais usadas na cozedura são de Aspergillus oryzae e Bacillus subtilis. As proteases bacterianas neutras são de longe mais ativas no glúten do que as proteases alcalinas. A papaina, a bromelaina e a ficina são proteases-tiol extraídas da papaia, do ananás e dos figos. A papaina, em especial, é muito reativa em relação às proteínas de glúten. As proteases bacterianas e a papaina, em especial as proteases neutras, são usadas nos biscoitos, barras de pão e bolachas, onde se requer um acentuado retardamento da massa de farinha. No entanto, na confecção do pão, é preferível uma hidrólise mais suave de proteases fúngicas.

[0010] As proteases também têm importantes desvantagens. A ação das proteases não é limitada no tempo, continua após a mistura e enfraquece a estrutura da massa de farinha com o tempo. Este fenômeno aumenta o risco de enfraquecimento da massa de farinha e torna a massa de farinha mais pegajosa. Por vezes, a sua ação é ainda acentuada pela descida do pH durante a fermentação. O uso de proteases na cozedura requer um controle estrito da fermentação em massa e de delineamento da massa de farinha. As proteases são desativadas durante a cozedura (Kruger, J. E. (1987) Enzymes and their role in cereal technology AACC 290-304). Em especial, as proteases neutras de Bacillus e a papaina deverão ser dosadas muito cuidadosamente uma vez que as sobredosagens retardam demasiadamente a massa de farinha. Isto pode resultar no colapso da massa de farinha antes de ir ao forno ou num menor volume do pão e numa estrutura de miolo mais aberta. Em especial na Europa, onde as farinhas são mais fracas do que nos Estados Unidos da América ou no Canadá, o risco da sobredosagem de protease está muito presente.

[0011] Além disso, as proteases também tornam a massa mais pegajosa porque a água é libertada do glúten através da ação hidrolitica (Schwimmer, S. (1981) Source book of food enzymology-AVI Publishing, 583-584). Isto significa que, na prática, as proteases não são muito usadas na confecção do pão na Europa.

[0012] O documento EP021179 mostra o uso de uma preparação de α-amilase na qual a protease (desativada) foi usada em combinação com emulsionadores para inibir o ressecamento.

[0013] Corforti et al. ((1996) FSTA, 96(12), MO190 Abstract of presentation) adicionaram uma mistura de enzimas compreendendo amilase bacteriana, amilase fúngica e protease fúngica, a bolos com gordura substituída. O bolo de controle dos contendo gordura foi mais tenro. O tratamento com enzimas diminuiu a taxa de ressecamento. Isto não é surpreendente, tendo em vista a presença das amilases.

[0014] A lipase também é conhecida por amolecer o miolo do pão e por, de algum modo, reduzir a taxa de enrijecimento do miolo de pão (W094/04035 exemplo 2).

[0015] As proteases fúngicas são sensíveis a elevadas temperaturas. 0 seu potencial de hidrólise das proteínas, para gama de temperaturas moderadas a elevadas de cerca de 50 °C ou superior, é normalmente pobre. Algumas proteases bacterianas neutras ou alcalinas são resistentes a tratamentos de calor mais elevado. Até hoje, os estudos acerca das proteases derivadas de bactérias com resistência ao calor que conseguem reter uma boa atividade de peptidase, por exemplo, numa gama de temperatura elevada de cerca de 60°C têm sido escassos. O documento EP1186658 mostra uma enzima assim, produzida por uma bactéria do gênero Bacillus subtilis, mais especificamente numa cepa M2-4. A mistura de enzimas descrita, porém, perde completamente a sua atividade a uma temperatura de cerca de 70°C. As proteases termoestáveis neutras de Bacillus, que podem ser resistentes aos agentes de oxidação, são preferíveis em formulações de detergentes. Por outro lado, proteases termoestáveis alcalinas de Bacillus são usadas em formulações de lavagem e de detergentes. A papaína é muito estável ao calor e requer um aquecimento prolongado a 90 - 100°C para ser desativada. A bromelaína é menos estável e pode ser desativada a cerca de 70°C. Outras proteases estáveis ao calor são produzidas por Bacillus licheniformis NS70 (Chemical Abstracts, 127, 4144 CA), Bacillus licheniformis MIR 29 (Chemical Abstracts, 116, 146805 CA) , Bacillus Stearothermophilus (Chemical Abstracts, 124, 224587 CA), Nocardiopsis (Chemical Abstracts, 114, 162444 CA) e Thermobacteroides (Chemical Abstracts, 116, 146805 CA) . Esta não é uma lista extensiva, mas ilustra a importância das proteases de serina termoestáveis e a sua aplicação, principalmente em detergentes. Não é feita qualquer referência às propriedades de cozedura e anti-ressecamento.

[0016] A lipase também é conhecida por amolecer o miolo do pão e por, de algum modo, reduzir a taxa de enrijecimento do miolo de pão (W094/04035 exemplo 2).

[0017] As proteases fúngicas são sensíveis a elevadas temperaturas. Algumas proteases bacterianas neutras ou alcalinas são resistentes a tratamentos de calor mais elevado. As proteases termoestáveis neutras de Bacillus, que podem ser resistentes aos agentes de oxidação, são preferíveis em formulações de detergentes. Por outro lado, proteases termoestáveis alcalinas de Bacillus são usadas em formulações de lavagem e de detergentes. A papaína é muito estável ao calor e requer um aquecimento prolongado a 90 - 100°C para ser desativada. A bromelaína é menos estável e pode ser desativada a cerca de 70°C. Outras proteases estáveis ao calor são produzidas por Bacillus licheniformis NS70 (Chemical Abstracts, 127, 4144 CA), Bacillus licheniformis MIR 29 (Chemical Abstracts, 116, 146805 CA) , Bacillus Stearothermophilus (Chemical Abstracts, 124, 224587 CA), Nocardiopsis (Chemical Abstracts, 114, 162444 CA) e Thermobacteroides (Chemical Abstracts, 116, 146805 CA). Esta não é uma lista extensiva, mas ilustra a importância das proteases de serina termoestáveis e a sua aplicação, principalmente em detergentes. Não é feita qualquer referência às propriedades de cozedura e antiressecamento.

[0018] A papaína é um constituinte ativo proteoliticamente no látex do fruto tropical papaia. O látex cru seco contém uma mistura de, pelo menos, quatro proteinases de cisteína.

[0019] A termolisina é uma metaloendopeptidase extracelular, segregada pela bactéria termofílica gram-positiva Bacillus thermoproteolyticus.

Estado da técnica [0020] A queratinase é uma protease que se encontra ativa na queratina, uma escleroproteina que existe como constituinte, na epiderme dos mamíferos, no cabelo, na lã, nas unhas e nas penas. As aplicações práticas da enzima são como ingrediente em composições depilatórias; como ajuda na depilação das peles na indústria do couro, na ruptura da queratina e reconstituição em tecidos têxteis. Não é conhecida a aplicação de tal enzima na indústria alimentar.

[0021] A Thermus aquaticus é uma hipertermófila pertencente às Arquea. A bem conhecida "Taq polimerase"® é isolada a partir deste organismo. A Pyrococcus furiosus é outra representante deste grupo. As proteases termoestáveis foram isoladas a partir destes organismos.

[0022] A termitase é uma endopeptidase extracelular da Thermoactinomyces vulgaris. Devido à sua especificidade de divagem relativamente baixa em relação às ligações de peptídeo, a termitase tem muitas aplicações. É adequada para produzir proteínas parcialmente hidrolisadas para a saúde e outras dietas especiais.

Sumário da invenção [0023] Um primeiro aspecto da presente invenção é relativo a um método para a prevenção ou retardamento do ressecamento e efeitos associados durante o processo de cozedura de produtos de padaria, compreendendo tal método a etapa de adicionar aos ingredientes de tais produtos de padaria uma quantidade suficientemente eficaz de, pelo menos, uma protease termoestável.

[0024] Preferencialmente, tais proteases são neutras ou proteases alcalinas, mais preferencialmente proteases alcalinas.

[0025] Preferencialmente, a protease de serina termoestável e/ou termoestável intermediária tem a sua temperatura ótima de atividade superior a 60 °C, preferencialmente superior a 70°C, mais preferencialmente superior a 75°C ou mesmo superior a 80°C. A protease de serina termoestável e/ou termoestável intermediária, utilizada preferencialmente no método segundo a invenção, apresenta uma relação entre a atividade da protease à temperatura ótima e a atividade da protease a 25°C, superior a 10, preferencialmente superior a 15. Como tal, a enzima ficará preferencialmente ativa durante o processo de cozedura e, preferencialmente, não durante o processo de crescimento.

[0026] Tal protease de serina termoestável e/ou termoestável intermediária pode ser obtida por extração a partir de organismos eucarióticos ou procarióticos que ocorrem naturalmente, por sintese ou por engenharia genética, por um método bem conhecido para um técnico na especialidade.

[0027] A protease de serina termoestável e/ou termoestável intermediária é preferencialmente a Taq protease que pode ser vantajosamente isolada a partir da cepa Thermus aquaticus (LMG8924) ou é a queratinase, preferencialmente isolada a partir do Bacillus licheniformis (LMG7561) ou é a termitase isolada a partir de Thermoactinomyces vulgaris. Estas três proteinases pertencem todas à classe das peptidases de serina. A papaina (pertencente à classe das peptidases de cisteina) e a termolisina (pertencente à classe das metalopeptidases) também foram incluídas nas experiências de cozedura realizadas, mas não foram capazes de reduzir o ressecamento e/ou tiveram efeitos colaterais indesejáveis e/ou efeitos negativos no processo de cozedura e nos produtos resultantes.

[0028] No método segundo a invenção a utilização da protease de serina termoestável e/ou termoestável intermediária pode ser combinada com outra enzima, tal como uma α-amilase termoestável, uma β-amilase, uma amilase maltogênica termoestável intermediária, uma lipase, glicosiltransferases ou pululanases. A protease termoestável também pode ser adicionada a um aditivo não enzimático tal como um emulsionador (monoglicerideo, diglicerideo e/ou estearoilacetilados) . Outros emulsionadores adequados também podem ser adicionados a tal protease de serina termoestável e/ou termoestável intermediária durante o processo de cozedura. Estão presentes efeitos cumulativos ou sinérgicos.

[0029] Portanto, o método segundo a invenção resultará em produtos de padaria melhorados que são preferencialmente selecionados do grupo que consiste em pão, pãezinhos fofos, pão fofo em forma de anel, roscas, pastelaria dinamarquesa, pães para hambúrguer, pizza, regueifa e bolos.

[0030] Um outro aspecto da presente invenção é relativo a uma composição anti-ressecamento para produtos de padaria compreendendo, pelo menos, uma protease termoestável.

[0031] Uma outra concretização da presente invenção é uma composição melhoradora, mais especificamente uma composição de melhoradora de pão, compreendendo, pelo menos, uma protease de serina termoestável e/ou termoestável intermediária e os ingredientes ativos usuais de uma composição melhoradora. Uma composição melhoradora é um conceito bem conhecido entre os padeiros. É uma mistura de ingredientes ativos tais como enzimas e emulsionadores, que são misturados com os ingredientes usuais para fazer pão, tais como a farinha e a água.

[0032] Uma outra concretização da presente invenção refere-se ao uso de tal protease termoestável e/ou termoestável intermediária, especialmente de uma queratinase da invenção, na indústria alimentar e mais especificamente nos produtos de padaria.

Descrição detalhada da invenção [0033] A invenção refere-se à utilização de uma protease de serina termoestável e/ou termoestável intermediária em produtos de padaria. Preferencialmente, estas proteases de serina são proteases alcalinas, mas também podem ser proteases neutras. A preparação enzimática tem um efeito pronunciado na moleza do miolo e no retardamento do ressecamento de produtos de padaria. A preparação enzimática é caracterizada pelo fato de não ter efeitos adversos na reologia da massa de farinha, na estrutura do miolo e no volume do pão resultante. A enzima tem uma baixa atividade a uma temperatura de 25°C a 40°C significando que terá baixa ou nenhuma atividade durante o repouso e/ou crescimento da massa de farinha. A enzima tem uma temperatura ótima de 60°C - 80°C ou superior. A enzima é ou não desativada durante o processo de cozedura. As proteases de serina termoestável e/ou termoestável intermediária segundo a presente invenção são caracterizadas por terem um efeito positivo como agentes antiressecamento. Este efeito é especialmente notável em combinação com outras enzimas antiressecamento. Como exemplos de outras enzimas antiressecamento o técnico na especialidade pode selecionar amilases termoestáveis de Bacillus licheniformis ou Bacillus Stearothermophilus e amilases maltogênicas termoestáveis (isto é Novamyl ® da Novozymes). 0 seu efeito também é cumulativo ao efeito anti-ressecamento dos mono- e diglicerideos, estearoilacetilatos e outros emulsionadores utilizados na cozedura.

[0034] As proteases de serina termoestável e/ou termoestável intermediária da invenção podem ser utilizadas no pão, pãezinhos fofos, pão fofo em forma de anel, dónutes, pastelaria dinamarquesa, pães para hambúrguer, pizza, regueifa, bolos e outros produtos de padaria onde o ressecamento e respectiva inibição seja uma questão de qualidade.

[0035] A protease de serina termoestável e/ou termoestável intermediária da invenção pode ser produzida por procariotas (bactéria) e eucariotas (fungos, Arquea, animais, plantas, etc) e/ou podem ser produzidos através de engenharia genética ou mesmo através de síntese com qualquer técnica conhecida na arte.

[0036] Basicamente, as características mais importantes das proteases que são usadas nesta invenção são: - A sua termoestabilidade: Para um pH em que as enzimas sejam estáveis, têm uma temperatura ótima que é superior a 60°C, preferencialmente superior a 70°C e até mais preferencial sendo superior a 75°C, superior a 80°C ou 85°C; - A relação entre a atividade à temperatura ótima e a 25°C é pelo menos superior a 10 e, preferencialmente, superior a 15; - Pertencem ao grupo das proteases de serina.

[0037] Preferencialmente, as proteases da invenção não perdem a sua atividade a temperaturas superiores a 60°C, preferencialmente superiores a 70°C, 75°C, 80°C ou mesmo 85°C. As enzimas da presente invenção podem ainda ficar ativas às temperaturas internas muito elevadas que são atingidas dentro de um produto durante a cozedura (pelo menos cerca de 75°C para alimentos cozidos levedados com fermento e pelo menos cerca de 90°C-95°C para alimentos cozidos levedados quimicamente, quando completamente cozidos). Dentro da gama ótima de temperatura, a temperatura pode variar entre qualquer ponto desde cerca de 60°C a 61°C, 62°C, 63°C, ...84°C, ...85°C, ...89°C, 90°C, ...94°C, 95°C com todos os números inteiros incluídos.

[0038] A enzima da invenção é preferencialmente uma queratinase, uma Taq protease e/ou uma termitase. A queratinase é preferencialmente produzida por Bacillus licheniformis (exemplo B. Licheniformis LMG 7561). A Taq protease é preferencialmente produzida por Thermus aquaticus (exemplo Thermus aquaticus LMG 8924). A termitase é preferencialmente produzida por Thermoactinomyces vulgaris.

[0039] As proteases podem ser obtidas a partir dos respectivos microrganismos através da utilização de qualquer técnica adequada. Por exemplo, a preparação da protease pode ser obtida pela fermentação de um microrganismo e o subsequente isolamento da preparação contendo a protease a partir do caldo, através de métodos conhecidos na arte tais como a centrifugação e a ultrafiltração. As proteases também podem ser obtidas através da clonagem da sequência de ADN que codifica para uma protease adequada, num organismo hospedeiro que exprime a protease intra- ou extra-celularmente, e recuperando a enzima produzida. Preferencialmente, a protease está presente numa forma que permite a dosagem exata ou mais ou menos exata. A dosagem pode ser difícil quando as proteases fazem parte de uma mistura natural complexa compreendendo mais do que um tipo de enzimas. Nesse caso, pode ser necessário incluir uma ou mais etapas de purificação.

[0040] As proteases também podem ser obtidas por evolução direta ou mistura de genes de proteases de serina termoestável ou não termoestável ou de enzimas. Desde que tenham atividade de divisão peptídica, são consideradas proteases no âmbito desta invenção.

[0041] Surpreendentemente, os inventores descobriram que a utilização de uma protease que não teve qualquer ação sensível na reologia da massa de farinha teve um efeito pronunciado na moleza e no retardamento do endurecimento do miolo. Não houve qualquer efeito adverso na elasticidade do miolo, nem este ficou mais pegajoso quando comparado com um controle. O efeito foi cumulativo ao de agentes anti-ressecamento conhecidos (tais como -amilases) e permite o desenvolvimento de pão e outros produtos moles de padaria com uma prolongada vida na prateleira.

[0042] A escolha da protease é muito importante. A protease não deve exercer qualquer efeito adverso durante a mistura e na subsequente delineação. Caso contrário, a dosagem que podería ser administrada seria demasiado baixa para diminuir a taxa de ressecamento e manter uma boa elasticidade do miolo. Quanto mais elevada for a temperatura ótima da enzima, mais baixo será o efeito negativo na estrutura do miolo e na reologia da massa de farinha.

[0043] A presente invenção será adiante descrita em pormenor nos seguintes exemplos não limitativos e com referência às figuras em anexo.

Breve descrição das figuras [0044] A figura 1 representa a temperatura ótima da protease expressa em função da atividade relativa (%), para um pH de 7,0, numa solução tampão de fosfato 0,1 M, para a aqualisina I (♦, linha continua) e a queratinase (·, linha interrompida).

[0045] A figura 2 representa o efeito da adição da Taq protease (0 U: ♦, 800 U: Δ ) no retardamento do ressecamento do pão na ausência e presença de Novamyl ® (0-8 g/100 kg de farinha).

[0046] A figura 3 mostra o efeito melhorado no retardamento do ressecamento do pão após a adição de queratinase (0 U: ♦, 800 U: Δ) ao pão na ausência ou presença de Novamyl ® (0-8 g/100 kg de farinha).

[0047] A figura 4 mostra a temperatura ótima da termitase, expressa em função da sua atividade (%) relativa, para um pH de 7,0, numa solução tampão de fosfato 0,1 M.

[0048] A figura 5 mostra a estabilidade térmica da termitase, expressa em função da sua atividade (%) relativa. Descrição de uma concretização preferencial da invenção [0049] Uma das proteases de serina utilizadas é obtida da cepa Bacillus licheniformis LMG 7561 e tem atividade de queratinase. Através de semelhança de aminoácidos e de inibição de fluoreto de fenilmetilsulfonila, demonstrou-se que a queratinase era uma protease de serina. A queratinase em questão é obtida cultivando a cepa Bacillus licheniformis LMG 7561 no seguinte meio: 0,5 g/1 NH4CI, 0,5 g/1 NaCl, 0,3 g/1 K2HP04, 0,4 g/1 KH2P04, 0,1 g/1 MgCl2.6H20, 2 g/1 ácido cítrico, 0,1 g/1 extrato de levedura e 10 g/1 de pó de penas. 0 meio é ajustado para um pH de 6,5 com ácido fosfórico. Não é imposto qualquer controle de pH. A incubação é feita a 45°C com ventilação (p2 60%, 1,25 vvm) durante 40 horas após o que o meio é recolhido para posterior concentração. O sobrenadante é então concentrado através de ultrafiltração de membrana (corte molecular: 5.000 Da) . A solução de queratinase crua obtida por esse método é armazenada congelada até ser usada em testes de cozedura.

[0050] A solução de queratinase obtida por esse método mostra atividade máxima a uma temperatura de 60° C e um pH de 8,0. Numa gama de pH de 7 a 9 foi medida mais do que 85% da atividade máxima. Quase não se verifica qualquer perda da atividade enzimática enquanto se aquece a solução durante uma hora a 60°C. Aquecer a enzima a 70°C durante 14 minutos reduz a atividade em 50%.

[0051] A atividade foi medida na queratina. Para medidas padrão, foram dissolvidos 4 g de queratina em 100 ml de hidróxido de sódio. Após a dissolução o pH é lentamente ajustado até 8,0 com ácido fosfórico 3,2 M. Adiciona-se água destilada até um volume final de 200 ml. São pré-incubados 5 ml da solução de substrato, a 60 °C. É adicionado 1 ml da solução de enzimas e incubado a 60°C. Depois, adicionam-se 5 ml de TCA (ácido TriCloroAcético) a 14% à solução de enzimas incubada. Mistura-se durante 60 minutos. A solução é filtrada e a absorvência é medida a 275 nm relativamente a uma solução controle (enzima adicionada após a adição do TCA).

[0052] A atividade é expressa em KU/ml (A275nm Enzima - A 275nmControle) * 11 ã”! 0,0075 * 30 [0053] A fermentação continha 300 a 1500 KU/ml.

[0054] Para fins de cozedura a atividade foi expressa como mU/ml baseada na determinação com Protazyme Tablets. Os KU foram apenas utilizados para demonstrar a presença da queratinase.

[0055] A Taq protease em questão é obtida através da cultura da cepa Thermus aquaticus LMG 8924 no seguinte meio: I g/1 triptona; 1 g/1 de extrato de levedura; 100 ml/1 de solução salina e 900 ml de água destilada. O pH é ajustado até 8,2 com NaOH 1 M antes da esterilização a 121°C durante 15 minutos. A solução salina tem a seguinte composição: 1 g/1 de ácido nitriloacético, 0,6 g/1 CaS04.2H20; 1 g/1 MgS04.7H20; 80 mg/1 NaCl, 1,03 g/1 KN03, 6,89 g/1 NaN03, 2,8 g/1 Na2HPC>4.12H20, 10 ml/1 de solução de FeCl3.6H20 (47 mg/100 ml) , 10 ml/1 de solução de elemento marcador e 1 1 de água destilada. A solução de elemento marcador tem a seguinte composição: 0,5 ml/1 de H2SC>4, 1,7 g/1 MnS04.H20, 0,5 g/1 ZnS04.7H20, 0,5 g/1 H3BO3, 25 mg/1 CuS04.5H20, 25 mg/1 Na2Mo04.2H20, 46 mg/1 CoCl2.6H20 e 1 1 de água destilada. A incubação é feita a 60°C com ventilação (p02 60%, 4 vvm) durante 24 horas após o que o meio é recolhido para posterior concentração. A Thermus aquaticus LMG 8924 produziu pelo menos dois tipos de proteases extracelulares. Uma das proteases extracelulares foi designada aqualisina I e é uma protease alcalina que foi segregada linearmente da fase estacionária anterior até ao término do crescimento das células. A temperatura ótima da atividade proteolitica situou-se entre 70 e 80°C. A outra foi designada aqualisina II e é uma protease neutra, cuja produção apareceu a partir do 4.° dia e cuja concentração progrediu linearmente durante 5 dias. A atividade máxima foi obtida a 95°C (a temperatura mais elevada testada). 0 extrato de fermentação foi utilizado após 1 dia de fermentação para os testes de cozedura. Uma vez que a fermentação foi interrompida após 1 dia, a protease presente é a aqualisina I. A aqualisina I é fortemente inibida pelos inibidores microbianos da protease de serina e pode ser classificada como uma protease de serina alcalina.

[0056] O sobrenadante é então concentrado por ultrafiltração de membrana (corte molecular: 10.000 Da) . A solução de Taq protease crua obtida por esse método é armazenada congelada até ser utilizada em testes de cozedura.

[0057] A solução de Taq protease obtida por esse método mostra atividade máxima a uma temperatura de 80°C. Quase não existe qualquer perda de atividade enzimática enquanto se aquece a solução durante 1 hora a 80°C. Aquecer a enzima a 90°C durante 10 minutos reduz a atividade em 60%.

[0058] A atividade da protease foi medida em caseina reticulada com azurina (AZCL-caseina). Esta é preparada tingindo e reticulando a caseina para produzir um material que se hidrata na água, mas que é insolúvel na água. A hidrólise através das proteases produz elementos tingidos solúveis em água e a taxa de libertação destes (aumento na absorvência a 590 nm) pode ser diretamente relacionada com a atividade enzimática (Protazyme AK Tablets, Megazime, Irlanda). Uma protazyme AK tablet é incubada em lOOmM Na2HP04.2H2O; pH 7,0 a 60°C durante 5 minutos. Uma fração de enzimas (1,0 ml) é adicionada e a reação é deixada prosseguir durante 10 minutos exatos. A reação é terminada pela adição de fosfato de tri-sódio (10 ml, 2%p/v, pH 12,3) . O tubo é deixado à temperatura ambiente durante aproximadamente 2 minutos e os conteúdos são filtrados. A absorvência do filtrado é medida a 590 nm em relação a um substrato de controle.

[0059] A atividade é expressa como MU/ml = (34,2 * (AbS5go enzima - AbS5go controle) + 0,6 / diluição [0060] No caso do microrganismo termofilico, Thermoactinomyces vulgaris, sabe-se que durante a fase logaritmica da multiplicação várias enzimas proteoliticas são segregadas para o meio circundante. De entre os até cinco componentes proteoliticos do filtrado da cultura, predomina uma protease com cerca de 70 a 80% da atividade total, denominada termitase.

[0061] A termitase é uma proteinase de serina termoestável extracelular. O perfil de pH mostra um alargado ótimo, entre pH 7,5 e 9,5. A enzima demonstra a estabilidade máxima na gama de pH de 6,4 a 7,6 com instabilidade crescente acima de pH 8,0 e abaixo de 5,75, especialmente a elevadas temperaturas e por períodos de tempo mais longos. Dependendo do tamanho do substrato, a termitase mostra atividade máxima a temperaturas variando de 65°C (gelatina), 70°C (protamina) a 85°C (azocaseína) . A temperatura ótima é mais pronunciada com o maior substrato (azocaseína) : a atividade a 85°C é 12 vezes superior à atividade revelada a 25°C.

[0062] A termitase em questão é obtida cultivando a cepa Thermoactinomyces vulgaris NRRL b-1617 num meio de cultura com a seguinte composição: amido de trigo (20 g/1), peptona bacteriológica (5 g/1), extrato de levedura (3 g/1) e extrato de malte (3 g/1) em água destilada. A incubação é feita a 45°C com uma ventilação de 12 1/min e uma rotação de 200 rpm. 0 sobrenadante foi recolhido após 24h de incubação. Devido ao fato de o sobrenadante da cultura conter uma grande atividade de α-amilase, foi realizada uma primeira etapa de purificação para separar a atividade de protease da atividade de a-amilase, para se realizarem experiências de cozedura. 0 sobrenadante foi concentrado através de ultrafiltração de membrana (corte molecular: 10.000 Da) . A termitase foi purificada por cromatografia de coluna numa coluna S-sepharose (Pharmacia). A coluna foi equilibrada com 500mM de tampão Na-acetato (pH 4,5) e posteriormente com 10 mM de tampão Na-acetato (pH 4,5) e 5mM CaCl2. A atividade da a-amilase não ficou fixa à coluna e a termitase foi eluida com 10 mM de tampão Na-acetato (pH 4,5), 5 mM CaCl2 e 1 M NaCl. A fração eluida foi dialisada contra lOmM de tampão Na-acetato (pH 4,5) e 5mM CaCl2 e utilizada para realizar experiências de cozedura.

[0063] Atividades paralelas como a atividade da a-amilase foram medidas pelo Phadebas Amylase Test® (Pharmacia & Upjohn). O substrato é um polímero de amido reticulado insolúvel na água, contendo um corante azul. É hidrolisado pela α-amilase para formar fragmentos azuis solúveis na água. A absorvência da solução azul é uma função da atividade da a-amilase na amostra.

[0064] A atividade paralela de xilanase foi medida pelo Xylazyme Method® (Megazyme). O substrato utilizado é xilano reticulado com azurina. Este substrato é preparado tingindo e reticulando xilano altamente purificado (da madeira de bétula) para produzir um material que se hidrata na água mas que é insolúvel na água. A hidrólise através de endo-(l,4)--D-xilanase produz fragmentos tingidos solúveis na água, e a taxa de libertação destes (aumento na absorvência a 590 nm) pode ser diretamente relacionada com a atividade enzimática.

[0065] A solução de Taq protease obtida não mostrou qualquer atividade paralela de α-amilase ou xilanase.

[0066] A solução de queratinase obtida não tinha atividade de xilanase e continha menos do que 8 U/ml de atividade de a-amilase tal como medida pelo teste Phadebas.

[0067] A solução de termitase obtida após o processo de purificação não mostrou qualquer atividade paralela de a-amilase ou de xilanase.

[0068] Os testes de cozedura foram realizados num quilo de pão. A receita básica foi (em gramas): Farinha (Duo): 1500 Água: 840 Fermento fresco (Bruggeman, Bélgica): 75 Cloreto de sódio: 30 Óleo de palma parcialmente hidrogenado: 21 Monoglicerideos destilados: 3 Sacarose: 6 Ácido ascórbico: 0,06 Foi utilizado o seguinte processo de confecção de pão: [0069] Os ingredientes foram misturados durante 2' a baixa velocidade e 6' a alta velocidade num misturador Diosna SP24. A temperatura final da massa de farinha foi 29°C. Após a fermentação da massa durante 20' a 25°C, foram feitas 600 g de fatias de massa de farinha utilizando o Euro 200S (Bertrand-Electrolux Baking) regulado para R8/L19 e moldadas. As fatias de massa de farinha são delineadas a 35°C durante 50' a 95% de relativa umidade. Então, os pães são cozidos a 230°C num forno MIWE CONDO (Micheal Wenz - Arnstein - Germany) a vapor (0,1 L antes e 0,2 L após cozer os pães). É óbvio para um técnico na especialidade que os mesmos resultados finais podem ser obtidos utilizando equipamento de outros fornecedores.

[007 0] A moleza do pão foi medida por um analisador de textura TA-XT2 (Stable Micro Systems UK). O pão foi fatiado e foi medida a força para se obter uma deformação de 25% de 4 fatias de lcm. Isto designa-se por dureza. A dureza é medida no l.° dia e no 6.° dia após a cozedura. A diferença entre as duas forças medidas é a "perda de moleza".

[0071] Perda de moleza = força de deformação ao 6.° dia -força de deformação ao 1.° dia [0072] É uma medida relativa. Os valores absolutos não têm significado enquanto tais, devendo ser comparados a uma referência para interpretação.

[0073] A elasticidade é a diferença entre a força acima mencionada e a força após 20 segundos de relaxamento. Quando a elasticidade é mais baixa do que no pão de referência, tal significa que o miolo se torna menos resiliente. O miolo, quando comprimido, não readquire a sua forma original. Isto significa que durante o corte ou o manuseamento a estrutura do miolo se pode perder irreversivelmente. É importante que, ao usar uma enzima adicional não exista perda de elasticidade em comparação a um pão de controle.

[0074] A adição das enzimas da presente invenção à massa de farinha do pão não alterou o tempo de delineamento, a umidade do pão e o volume especifico do pão. O conteúdo inicial de umidade do pão variou ligeiramente, mas todos os pães perderam aproximadamente a mesma quantidade de umidade durante seis dias de armazenamento à temperatura ambiente.

Exemplos Exemplo 1: Taq protease [0075] Foi cozido um pão segundo o método· acima mencionado com adição de Taq protease [eventualmente na presença de diferentes doses de Novamyl® 10 000 BG da Novozymes (Dinamarca)).

[007 6] As dosagens são expressas por 100 kg de peso da farinha utilizada no teste de cozedura.

[0077] O seguinte Quadro I exprime a perda de moleza entre o Io, dia e o 6o. dia após a cozedura, como anteriormente definido.

Quadro 1: Moleza [0078] O exemplo mostra que a utilização da Taq protease retardará o ressecamento do pão. Uma combinação de Taq protease com uma amilase maltogênica termoestável intermediária (e.g. Novamyl®, enzima comercial da Novozymes) retardará significativamente o ressecamento· do pão. Assim, existe um efeito sinérgico entre as proteases de serína termoestávels e as -amilases, Este efeito torna-se mais pronunciado em doses mais elevadas de Novamyl® [ver figura 2) .

[0079] Q quadro 2 mostra que a elasticidade do miolo do pão é dificilmente afetada pela utilização da Taq protease. Quadro 2: Elasticidade Exemplo 2: Queratinase [0080] Um pão cozido segundo O método acima mencionado com a adição de queratinase {eventualmente na presença de Novamyl® 10 000 BG da Novozymes (Dinamarca)).

[0081] As dosagens no quadro 3 seguinte são expressas por 100 kg de peso da farinha utilizada no teste de cozedura.

[0082] O quadro exprime a perda de moleza entre o 1. ° dia e o 6.° dia após a cozedura, como anteriormente definido. Quadro 3: Moleza [0083] É claro por esta experiência que a adição da queratinase protease de serina termoestável tem um efeito pronunciado na moleza. Existe um efeito cumulativo cora as amilases maltoqênicas termoestáveis como a Novamyl® {ver figura 3) . Verificou-se que a pequena quantidade de amilase presente na preparação não tinha impacto na moleza e na taxa de relaxamento ao testar esta amilase separadamente.

[0084] [0080] Q quadro 4 também montra que não existem efeitos adversos na taxa de relaxamento quando esta protease é utilizada.

Quadro 4: Elasticidade Exemplo 3: Termitase [0085] Um pão cozido segundo o método acima mencionado com a adição de termitase {eventualmente em combinação cora Wovamyl® 10 000 BG da Novozymes (Dinamarca)).

[0086] As dosagens no quadro 5 seguinte são expressas por 100 kg de peso da farinha utilizada no teste de cozedura, [0087] o quadro 5 exprime a perda de moleza entre o l.° dia e o 6.° dia após a cozedura, como anteriormente definido.

Quadro 5: Moleza [0088] É claro por esta experiência que a adição da termitase protease de serina termoestável tem um efeito pronunciado na moleza. Existe também um efeito cumulativo com as amilases maltogênicas termoestáveis como a Novamyl®. Após a purificação da termitase não havia qualquer a-amilase presente na preparação que pudesse ter um impacto na moleza e na taxa de relaxamento.

[0089] Q quadro 6 mostra que também não existem efeitos adversos na taxa de relaxamento quando esta protease é utilizada.

Quadro 6: Elasticidade [0090] A atividade relativa ótima da termitase (I) de protease para um pH de 7,0 numa solução· tampão de fosfato 0,1 Mea estabilidade térmica (expressa em função da estabilidade relativa a uma dada temperatura) são dadas nas figuras 4 e 5 respectivamente.

[0091] Q tratamento com a Taq protease, a queratinase e/ou a termitase, sozinhas, misturadas e/ou juntamente com amilases termoestáveis (p. ex. Novamyl®) afeta significativamente a moleza do pão. 0 pão tratado com enzimas revelou-se mais fofo quando se adicionou a Taq protease, a queratinase e/ou a termitase. Os exemplos ilustram que as proteases de serina termoestáveis segundo a presente invenção aumentam a vida na prateleira dos produtos de padaria no tocante à moleza e ao ressecamento.

[0092] Exemplo 4; Efeito da queratinase, da termitase e da Taq protease na estrutura do miolo e nas características sensoriais do pão [0093] As supracitadas proteases de serina termoestáveis e/ou termoestáveis intermediárias segundo a presente invenção não tiveram um efeito negativo na estrutura no miolo, enquanto que outras proteases não termoestáveis ou proteases pertencentes a um outro grupo de proteases, como a papaína (cisteína peptidase) ou a termolisina (metalopeptidase), tiveram. A utilização, por exemplo, da papaína ou da termolisina fez com que a estrutura do miolo se tornasse mais aberta, dependendo das doses que foram utilizadas. Também não se verificou qualquer efeito no volume dos produtos cozidos ao utilizar as proteases de serina termoestáveis da invenção.

[0094] A cor da côdea, a qualidade da côdea, a cor do miolo, o aroma e o sabor do pão não se alteraram significativamente com a adição da queratinase, da Taq protease e/ou da termitase.

Exemplo 5; Aplicação da Taq protease num bolo Receita: Mistura de bolo creme acetinado : 1000 g Ovos: 350 g Óleo: 300 g Água: 225 g Método: Misturadora: Hobart Instrumento: Pá Velocidade: 1 minuto de rotação 1 e 2 minutos de rotação 2 então adicionar óleo e água, 1 minuto rotação 1, raspar e 2 minutos rotação 1 Peso da massa de farinha com ovos: 300 g Temperatura: 180°C Tempo: 45 minutos [0095] As dosagens no quadro 7 seguinte são expressas por 100 kg de peso da farinha utilizada no teste de cozedura.

[0096] O quadro 7 exprime a perda de moleza medida após 4 dias, 1 semana, 2 semanas e 3 semanas após a cozedura.

Quadro 7: Moleza REIVINDICAÇÕES

Claims (9)

1. Método para a prevenção ou retardamento do ressecamento durante o processo de cozedura de produtos de padaria, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de adicionar uma quantidade suficientemente eficaz de pelo menos, uma protease de serina tendo uma temperatura de atividade ótima maior que 60°C nos referidos produtos de padaria, sendo que a razão entre a temperatura ótima de atividade da protease e a atividade da protease a 25°C é maior que 10.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a protease de serina ter uma temperatura ótima de atividade superior a 7 0 gC.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a relação entre a atividade da protease à temperatura ótima e a atividade da protease a 252C ser superior a 15.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de a protease de serina ser obtida por extração a partir de organismos eucarióticos ou procarióticos que ocorrem naturalmente, por síntese ou por engenharia genética.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de a protease de serina ser uma protease neutra ou uma protease alcalina.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de a dita protease ser selecionada do grupo consistindo de aqualisina I, aqualisina II, termitase e queratinase.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de a protease de serina ser uma Taq protease isolada a partir de Thermus aquaticus LMG 8924, uma queratinase isolada a partir de Bacillus licheniformis LMG 7561 e/ou uma termitase isolada a partir de Thermoactinomyces vulgaris.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de compreender ainda a etapa de adicionar um aditivo anti-ressecamento selecionado do grupo consistindo de α-amilase termoestável, β-amilase, amilase maltogênica termoestável intermediária, lipase, glicosiltransferases, pululanases e emulsionadores, preferencialmente monoglicerideos, diglicerideos e/ou estearoilacetilatos.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de o produto de padaria ser selecionado do grupo que consiste em pão, pãezinhos fofos, pão fofo em forma de anel, dónutes, pastelaria dinamarquesa, pães para hambúrguer, pizza, regueifa e bolos.