PT1496748E - Método e composição para a prevenção ou retardamento do endurecimento e dos seus efeitos durante o processo de cozimento de produtos de panificação. - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO E COMPOSIÇÃO PARA A PREVENÇÃO OU RETARDAMENTO DO ENDURECIMENTO E DOS SEUS EFEITOS DURANTE O PROCESSO DE COZIMENTO DE PRODUTOS DE PANIFICAÇÃO"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a um método e a uma composição para prevenir ou retardar o endurecimento e efeitos associados durante o processo de cozimento de produtos de panificação que compreendem, pelo menos, uma serina protease termoestável e/ou intermediário termoestável.

Antecedentes da invenção

Os consumidores preferem comprar pão fresco e desejam que o mesmo se mantenha fresco por muito tempo. Retardar o endurecimento tem sido sempre um desafio para os produtores de ingredientes de panificação. 0 facto de a produção de pão ser mais e mais centralizada e mais distante dos pontos de distribuição põe uma pressão ainda maior no desenvolvimento de aditivos e ingredientes para manter a maciez do pão. Do mesmo modo os papo-secos, os pães para hambúrguer, os bolos e os produtos de pastelaria estão sujeitos ao endurecimento e à perda de maciez. Há uma variedade de ingredientes conhecidos por retardar o endurecimento do pão e produtos macios de panificação. A gordura e os emulsionantes, tais como monoglicéridos destilados e estearoil lactilatos, já são 1 utilizados há décadas. Os mono-, di- e polissacáridos têm uma influência positiva sobre a retenção de água e aglutinação. A perda de água é, muitas vezes, associada com o endurecimento e os sacáridos têm uma influência positiva sobre a sensação na boca de produtos de panificação e, deste modo, diminuem a percepção de endurecimento. As amilases são conhecidas por terem um efeito benéfico sobre o endurecimento e a retrogradação do amido. 0 endurecimento do pão é um fenómeno complexo. É percebido como um amaciamento da crosta, um endurecimento do miolo e o desaparecimento do sabor de pão fresco. 0 endurecimento do miolo não é devido apenas à perda de água durante o armazenamento, conforme já foi demonstrado por Boussingault em ((1852) Ann. Chim. Phys. 3,36,490). É o resultado de vários processos físico-químicos. Durante anos, os investigadores tentaram solucionar estes processos e desenvolveram teorias diferentes. Há muitos anos, a firmeza do pão foi atribuída unicamente à retrogradação do amido (Katz, J.R. (1930) Z. Phys. Chem., 150, 37-59). Foi demonstrado por difracção de raio-X que o amido no pão forma uma estrutura microcristalina durante o armazenamento. Mais tarde, foi demonstrado que a fracção de amido solúvel em água diminuía durante o endurecimento do pão (Schoch et al. (1947) Cereal Chem., 24, 231-249), donde se conclui que, durante o cozimento os grânulos de amido absorvem água. As cadeias lineares de amilose tornam-se solúveis e difundem para a fase de água. Com o tempo, mais e mais amilose está presente na fase de água. Deste modo, a amilose é parcialmente lixiviada dos grânulos de amido dilatados. A amilopectina ramificada permanece nos grânulos. O processo de lixiviação é limitado pela água disponível. Durante o arrefecimento, a amilose retrograda muito 2 rapidamente e forma um gel. Crê-se que a retrogradação da amilopectina envolve, principalmente, a associação das suas ramificações externas e requer um tempo mais prolongado do que a retrogradação da amilose, dando proeminência ao processo de endurecimento que ocorre com o tempo depois do produto ter arrefecido, agrega mais lentamente, devido a interferências estereoquimicas. A amilopectina forma ligações intramoleculares. 0 papel proeminente do amido no endurecimento do pão está ainda ilustrado pela utilização de carbo-hidrases para diminuir ou desacelerar o endurecimento de produtos de panificação. Foi demonstrado (Conn J. F. et al. (1950) Cereal Chem., 27, 191-205) que as amilases de origem bacteriana ou fúngica reduzem a velocidade do endurecimento do pão e resultam numa estrutura de miolo menos firme. A adição de alfa-amilases ou beta-amilases termoestáveis é mais eficaz. No entanto, isto também resulta num miolo pegajoso e viscoso. O documento EP0412607 divulga a utilização de uma alfa-1,6-endoglucanase termoestável ou uma alfa-1,4-exoglucanase para reduzir o endurecimento; o documento EP0234858 divulga a utilização de uma beta-amilase maltogénica termoestável para reter a maciez do miolo.

No entanto, ainda não está claro se o efeito anti-endurecimento é devido às dextrinas produzidas ou às modificações da amilose e amilopectina e a consequente tendência a cristalizar. Além disso, a influência de emulsionantes como o monoestearato de glicerol e o estearoil lactilato de sódio parece confirmar o papel do amido na firmeza do miolo do pão (Schuster G. (1985) Emulgatoren fiir Lebensmittel - Spring Verlag 323-329). É a interacção entre estes emulsionantes e o amido que 3 resulta numa conformação de amido alterada que é responsável pela redução observada no endurecimento.

Uma vez que nem sempre houve uma boa correlação entre a estrutura do amido e o endurecimento (Zobel H.F. et al. (1959) Cereal Chem., 36, 441), foram também investigados outros constituintes da farinha de trigo. 0 papel das proteínas da farinha de trigo no processo de firmeza do miolo foi estudado, mas verificou-se que as mesmas eram menos importantes do que o amido (Cluskey, J.E. (1959) Cereal Chem., 36, 236-246.). (Dragsdorf, R.D. et al. (1980) Cereal Chem., 57, 310-314) estudaram a migração da água entre o amido e o glúten durante o armazenamento do pão. Estes autores concluíram que devido a uma alteração na cristalinidade do amido, o mesmo absorvia mais água, de modo que a água migra do glúten para o amido e assim fica disponível menos água livre.

Num estudo posterior (Martin et al. (1991) Cereal Chem., 68(5), 498-503 e 503-507), parece que as dextrinas de alto peso molecular não têm um efeito antifirmeza sobre o miolo do pão. Em vez disso, as dextrinas de alto DP podem enredar e/ou formar uma ligação de hidrogénio com as fibrilas da proteína, deste modo, efectivamente, reticulando o glúten. Consequentemente, a taxa de firmeza é aumentada. É referido que em farinhas de trigo mais fracas, o glúten interage de uma forma mais forte com os grânulos de amido. Isto resulta num miolo de pão que fica firme mais rapidamente. No entanto, um glúten de melhor qualidade e uma farinha de trigo mais forte também resultam num volume maior do pão e, deste modo, num miolo mais macio. Axford et al. (1968) citado em Faridi, H. (1985) Rheology of wheat products, AACC, p. 263-264) demonstraram que o volume específico do pão de forma era um factor primordial na medição tanto da taxa como da 4 extensão da firmeza. Deste modo, o papel do glúten na firmeza do pão ainda permanece questionável e foram feitas poucas tentativas para retardar a firmeza com base na modificação do glúten.

As proteases têm uma longa história de utilização no sector de panificação. As mesmas são, principalmente, utilizadas pelo padeiro para reduzir as necessidades de desenvolvimento mecânico da massa e glúten invulgarmente forte ou duro. As proteases diminuem a viscosidade e aumentam a extensibilidade da massa. No produto final as mesmas melhoram a compressibilidade da textura, o volume do pão de forma e a cor do pão. Além disso, o sabor pode ser intensificado pela produção de certos péptidos. As proteases suavizam o glúten enzimaticamente, em vez de mecanicamente. As mesmas reduzem a consistência da massa, diminuindo o valor farinográfico. As protease mais utilizadas em panificação são de Aspergillus oryzae e Bacillus subtilis. As proteases bacterianas neutras são de longe mais activas sobre o glúten do que as proteases alcalinas. A papaina, bromelaina e ficina são tiol-proteases extraídas da papaia, ananás e figos. Especialmente a papaina é muito reactiva em relação às proteínas do glúten. As proteases bacterianas e a papaina, especialmente as proteases neutras, são utilizadas em biscoitos, palitos de pão e bolachas tipo crackers onde é desejado um pronunciado afrouxamento da massa. No entanto, na produção de pão, é preferida uma hidrólise mais suave de proteases fúngicas.

As proteases também têm desvantagens importantes. A acção das proteases não é limitada em tempo, continua depois da mistura e, com o tempo, enfraquece a estrutura da massa. Este fenómeno aumenta o risco de enfraquecer a massa e aumenta a viscosidade da massa. Algumas vezes, a sua acção é até 5 intensificada pela queda do pH durante a fermentação. A utilização de proteases em panificação exige o controlo rigoroso da fermentação em volume e condições de prova da massa. As proteases são desactivadas durante o cozimento (Kruger, J.E. (1987) Enzymes and their role in cereal technology AACC 290— 304) . Especialmente as proteases de Bacillus neutros e papaina devem ser dosadas muito cuidadosamente, uma vez que as sobredoses afrouxam excessivamente a massa. Isto pode resultar no desmoronamento da massa antes de ser introduzida ao forno ou um volume menor do pão e uma estrutura de miolo mais aberta. Especialmente na Europa, onde as farinhas de trigo são mais fracas do que nos Estados Unidos ou no Canadá, o risco de sobredosar a protease está muito presente.

Além disso, as proteases também aumentam a pegajosidade porque por meio da acção hidrolítica, água é libertada do glúten (Schwimmer, S. (1981) Source book of food enzymology - AVI Publishing, 583-584) . Isto significa que, na prática, as proteases não são muito utilizadas na produção de pão na Europa. O documento GB-A-906344 descreve um aditivo anti-endurecimento do pão compreendendo gordura ou óleo e, pelo menos, uma enzima proteolitica de Bacillus subtilis ou

Aspergillus Oryzae. O documento EP021179 divulga a utilização de uma preparação de alfa-amilase em que a protease (desactivada) foi utilizada em combinação com emulsionantes para inibir o endurecimento.

Conforti et al. (1996) FSTA, 96(12), M0190 Resumo da apresentação) adicionaram uma mistura de enzima compreendendo 6 amilase bacteriana, amilase fúngica e protease fúngica a queques com gorduras substituídas. Os queques contendo gordura controlada eram mais macios. 0 tratamento enzimático diminuiu a taxa de endurecimento. Isto não é surpreendente, em virtude da presença de amilases. A lipase é também conhecida para amaciar o miolo do pão e para reduzir, de alguma forma, a taxa de firmeza do miolo do pão (documento W094/04035, exemplo 2). 0 documento EP-A-1186658 descreve uma solução enzimática com actividade proteolítica obtida cultivando Bacillus subtilis estirpe M2-4 tendo actividade de peptidase altamente resistente ao calor. Verificou-se que o volume do pão aumentou em 10% depois da adição da solução enzimática. 0 documento DD-A-156714 e Bácker e Konditor (1984) referem-se à preparação de uma termitase termoestável e a sua utilização em produtos de panificação (e. g., wafers) para enfraquecer o glúten.

Os documentos WO-A-0174169 e GB-A-375342 referem-se à incorporação de papaína, uma cisteína protease, em massas de pão e biscoitos como um agente amaciador do glúten. 0 documento US-A-3561975 divulga a utilização de proteases revestidas com banha em massas para tartes.

Os documentos RU(A)2177994, US-A-5569599, US-A-5124261 e US-A-5714373 descrevem a produção e utilização de algumas proteases termoestáveis como a queratinase, aqualisina I e uma protease de Thermococcus. 1

As proteases fúngicas são sensíveis a altas temperaturas. A sua potência de hidrólise proteica numa gama de moderada a alta de temperatura de cerca de 50 °C ou superior é normalmente fraca. Algumas proteases bacterianas neutras e alcalinas são resistentes a tratamentos de calor mais alto. Até o presente, têm sido escassos os relatos sobre proteases derivadas de bactéria com resistência ao calor que podem reter uma boa actividade de peptidase, por exemplo, numa gama de alta temperatura de cerca de 60 °C. O documento EP1186658 divulga tal enzima produzida por uma bactéria do género Bacillus subtilis, mais especificamente uma estirpe M2-4. A mistura enzimática divulgada, no entanto, perde completamente a sua actividade a uma temperatura de cerca de 70 °C. As proteases neutras termoestáveis do Bacillus, que podem ser tolerantes a agentes oxidantes, são preferidas nas formulações de detergentes. Do mesmo modo, as proteases alcalinas termoestáveis do Bacillus são utilizadas em formulações para lavagens e detergentes. A papaína é muito estável ao calor e requer um aquecimento prolongado a 90-100 °C para desactivação. A bromelaína é menos estável e pode ser desactivada à volta dos 70 °C. Outras proteases estáveis ao calor são produzidas pelo Bacillus licheniformis NS70 (Chemical Abstracts, 127, 4144 CA), Bacillus licheniformis MIR 29 (Chemical Abstracts, 116, 146805 CA), Bacillus stearothermophilus (Chemical Abstracts, 124, 224587 CA), Nocardiopsis (Chemical Abstracts, 114, 162444 CA) e Thermobacteroides {Chemical Abstracts, 116, 146805 CA) . Esta não é uma lista completa, mas ilustra a importância das serina proteases termoestáveis e a sua aplicação, principalmente em detergentes. Não é feita referência a propriedades relativas ao cozimento e anti-endurecimento. A lipase é também conhecida por amaciar o miolo do pão e, de certa forma, reduzir a taxa de firmeza do miolo do pão (documento W094/04035, exemplo 2).

As proteases fúngicas são sensíveis a altas temperaturas. Algumas proteases bacterianas neutras e alcalinas são resistentes a tratamentos a temperaturas mais elevadas. As proteases neutras termoestáveis de Bacillus, que podem ser tolerantes a agentes oxidantes, são preferidas em formulações de detergentes. Do mesmo modo, as proteases alcalinas termoestáveis de Bacillus são utilizadas em formulações para lavagens e detergentes. A papaína é muito estável ao calor e requer um aquecimento prolongado a 90-100 °C para desactivação. A bromelaína é menos estável ao calor e pode ser desactivada à volta dos 70 °C. Outras proteases estáveis ao calor são produzidas pelo Bacillus licheniformis NS70 (Chemical Abstracts, 127, 4144 CA), Bacillus licheniformis MIR 29 (Chemical Abstracts, 116, 146805 CA), Bacillus stearothermophilus (Chemical Abstracts, 124, 224587 CA), Nocardiopsis (Chemical Abstracts, 114, 162444 CA) e Thermobacteroides (Chemical Abstracts, 116, 146805 CA) . Esta não é uma lista completa, mas ilustra a importância das serina proteases termoestáveis e a sua aplicação, principalmente em detergentes. Não é feita referência a propriedades relativas ao cozimento e anti-endurecimento. A papaína é um constituinte proteoliticamente activo no látex da fruta tropical papaia. O látex seco em bruto contém uma mistura de, pelo menos, quatro cisteína proteinases. A termolisina é uma metaloendopeptidase extracelular segregada pela bactéria termofílica gram-positiva Bacillus thermoproteolyticus. 9

Estado da técnica A queratinase é uma protease que é activa sobre a queratina, uma escleroproteína que existe como constituinte na epiderme, cabelo de mamíferos, lã, unhas e penas. As aplicações práticas da enzima são como ingredientes em composições depilatórias; como auxílio na depilação de peles na produção de couro, na decomposição da queratina e reconstituição em materiais têxteis. Não é conhecida qualquer aplicação da referida enzima na indústria alimentar. A Thermus aquaticus é uma hipertermófila que pertence aos Archea. A bem conhecida "Taq polymerase"™ é isolada a partir deste organismo. 0 Pyrococcus furiosus é outro representante deste grupo. As proteases termoestáveis foram isoladas a partir destes organismos. A termitase é uma endopeptidase extracelular da Thermoactinomyces vulgaris. Em virtude da sua especificidade relativamente baixa de clivagem em relação a ligações com péptido, a termitase tem muitas aplicações. É adequada para produzir proteínas parcialmente hidrolisadas para a saúde e outras dietas especiais.

Sumário da invenção

Um primeiro aspecto da presente invenção está relacionado a um método para prevenir ou retardar o endurecimento e os efeitos associados durante o processo de cozimento de produtos de panificação, o referido método compreendendo o passo de adicionar uma quantidade suficientemente eficaz de, pelo menos, 10 uma protease termoestável aos ingredientes dos referidos produtos de panificação.

De uma forma preferida, as referidas proteases são proteases neutras ou alcalinas, de uma forma mais preferida, proteases alcalinas.

De uma forma preferida, a serina protease termoestável e/ou intermediário termoestável tem a sua actividade de temperatura óptima superior a 60 °C, de uma forma preferida, superior a 70 °C, de uma forma mais preferida, superior a 75 °C e até superior a 80 °C. A serina protease termoestável e/ou intermediária termoestável preferida utilizada no método de acordo com a invenção apresenta uma proporção entre a actividade da protease à temperatura óptima e a actividade da protease a 25 °C, superior a 10, de uma forma preferida, superior a 15. Como tal, a enzima está activa, de uma forma preferida, durante o processo de cozimento e, de uma forma preferida, não durante o processo de crescimento.

Tal serina protease termoestável e/ou intermediário termoestável pode ser obtida por extracção de organismos eucarióticos ou procarióticos que ocorrem naturalmente, por síntese ou por modificação genética por meio de um método bem conhecido de um especialista na técnica. A serina protease termoestável e/ou intermediário termoestável preferida é a Taq protease que pode ser isolada, de forma vantajosa, da estirpe Thermus aquaticus (LMG8924) ou é a queratinase, de uma forma preferida, isolada do Bacillus licheniformis (LMG7561) ou é a termitase isolada do Thermoactinomyces vulgaris. Todas estas três proteinases pertencem à classe das serina peptidases. A papaína (que 11 pertence à classe das cisteína peptidases) e a termolisina (que pertence à classe das metalopeptidases) também foram incluídas nos ensaios de panificação realizados, mas não foram capazes de reduzir o endurecimento e/ou tiveram efeitos secundários indesejáveis sobre o processo de panificação e os produtos resultantes.

No método de acordo com a invenção, a utilização da serina protease termoestável e/ou intermediário termoestável pode ser combinada com outra enzima, tal como uma α-amilase termoestável, β-amilase, amilase maltogénica termoestável intermediária, lipase, glicolsiltransferases ou pululanases. A protease termoestável também pode ser adicionada a um aditivo não enzimático, tal como um emulsificante (monoglicérido, diglicérido e/ou estearoil lactilatos). Outros emulsionantes adequados também podem ser adicionados à referida serina protease termoestável e/ou intermediária termoestável durante o processo de cozimento. Estão presentes efeitos sinérgicos ou cumulativos.

Deste modo, o método de acordo com a invenção resultará em produtos de panificação melhorados que são seleccionados, de uma forma preferida, do grupo que consiste em pão, papo-secos, roscas, donuts, artigos de pastelaria, pães para hambúrguer, pizzas, pão do tipo pita e bolos.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição anti-endurecimento para produtos de panificação compreendendo, pelo menos, uma protease termoestável.

Outra forma de realização da presente invenção é uma 12 composição melhoradora, mais especificamente, uma composição melhoradora de pão, compreendendo, pelo menos, uma serina protease termoestável e/ou intermediário termoestável e os ingredientes activos habituais para uma composição melhoradora. Uma composição melhoradora é um conceito bem conhecido entre os profissionais de panificação. É uma mistura de ingredientes activos, tais como enzimas e emulsionantes, que são misturados com os ingredientes habituais para produzir o pão, tais como farinha de trigo e água.

Uma outra forma de realização da presente invenção refere-se à utilização da referida protease termoestável e/ou intermediária termoestável, especialmente uma queratinase da invenção na indústria de alimento e, de uma forma mais específica, em produtos de panificação.

Descrição pormenorizada da invenção A invenção refere-se à utilização de uma serina protease termoestável e/ou intermediário termoestável em produtos de panificação. De uma forma preferida, estas serina proteases são proteases alcalinas, mas também podem ser proteases neutras. A preparação enzimática tem um efeito pronunciado sobre a maciez do miolo e sobre o retardamento do endurecimento de produtos cozidos. A preparação enzimática é caracterizada pelo facto de não ter efeito adverso sobre a reologia da massa, sobre a estrutura do miolo ou sobre o volume do pão resultante. A enzima tem uma baixa actividade à temperatura de 25 °C a 40 °C, o que significa que as mesmas terão baixa ou nenhuma actividade durante o repouso e/ou crescimento da massa. A enzima tem uma temperatura óptima de 60 °C - 80 °C ou superior. A enzima é ou 13 não é activada durante o processo de cozimento. As serina proteases termoestáveis e/ou intermediários termoestáveis de acordo com a presente invenção são caracterizadas por terem um efeito positivo como agentes anti-endurecimento. Este efeito é especialmente perceptivel em combinação com outras enzimas anti-endurecimento. Como exemplos de outras enzimas anti-endurecimento o especialista na técnica pode seleccionar amilases termoestáveis de Bacillus licheniformis ou Bacillus stearothermophilus e amilases maltogénicas termoestáveis (i. e., Novamyl® da Novozymes). 0 seu efeito é também aditivo ao efeito anti-endurecimento de mono- e diglicéridos, estearoil lactilatos e outros emulsionantes utilizados em panificação.

As serina proteases termoestáveis e/ou intermediários termoestáveis da invenção podem ser utilizadas em pão, papo-secos, roscas, donuts, artigos de pastelaria, pães para hambúrgueres, pizzas e pão do tipo pita, bolos e outros produtos de panificação em que o endurecimento e a inibição do mesmo é uma questão de qualidade. A serina protease termoestável e/ou intermediário termoestável da invenção pode ser produzida por procarióticos (bactérias) e eucarióticos (fungos, Archea, animais, plantas, etc.) e/ou podem ser produzidas por modificação genéticas ou mesmo por síntese com qualquer método conhecido na técnica.

Basicamente, as características mais importantes das proteases que são utilizadas nesta invenção são: 1) A sua termoestabilidade: A um pH em que a enzima é estável, as mesmas têm uma temperatura óptima que é superior a 60 °C, de uma forma preferida, superior a 14 70 °C e, de uma forma ainda mais preferida, superior a 75 °C, superior a 80 °C ou 85 °C. 2) A proporção entre a actividade à temperatura óptima e a 25 °C é, pelo menos, superior a 10 e, de uma forma preferida, superior a 15. 3) As mesmas pertencem ao grupo das serina proteases.

De uma forma preferida, as proteases da invenção não perdem a sua actividade a temperaturas superiores a 60 °C, de uma forma preferida, superiores a 70 °C, 75 °C, 80 °C ou mesmo 85 °C. As enzimas da presente invenção podem ainda estar activas às temperaturas internas muito elevadas que são atingidas no interior de um produto durante o cozimento (pelo menos, cerca de 75 °C para alimentos cozidos fermentados com levedura e, pelo menos, cerca de 90 °C - 95 °C para alimentos cozidos fermentados quimicamente, quando totalmente cozidos). Na gama óptima de temperatura, a temperatura pode variar em qualquer ponto de cerca de 60 °C a 61 °C, 62 °C, 63 °C, ... 84 °C, 85 °C, ... 89 °C, 90 °C, ... 94 °C, 95 °C com todos os números inteiros ai incluídos.

De uma forma preferida, a enzima da invenção é uma queratinase, uma Taq protease e/ou uma termitase. De uma forma preferida, a queratinase é produzida pelo Bacillus licheniformis (exemplo B. licheniformis LMG 7561) . De uma forma preferida, a Taq protease é produzida pelo Thermus aquaticus (exemplo Thermus aquaticus LMG 8924). De uma forma preferida, a termitase é produzida pelo Thermoactinomyces vulgar is.

As proteases podem ser obtidas a partir dos respectivos 15 microrganismos para utilização de qualquer técnica adequada. Por exemplo, a preparação da protease pode ser obtida por meio da fermentação de um microrganismo e o subsequente isolamento da preparação contendo a protease do caldo resultante por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como a centrifugação e a ultrafiltração. As proteases também podem ser obtidas por meio da clonagem da sequência de ADN que codifica para uma protease adequada num organismo hospedeiro, expressando a protease intra-ou extra-celular e recolhendo a enzima produzida. De uma forma preferida, a protease está presente numa forma que permite a dosagem exacta e/ou mais ou menos exacta. A dosagem pode ser difícil quando as proteases são parte de uma mistura natural complexa compreendendo mais de um tipo de enzimas. Neste caso, pode ser necessária a inclusão de um ou mais passos de purificação.

As proteases também podem ser obtidas por meio da evolução dirigida ou misturas génicas de serina proteases ou enzimas termoestáveis ou não termoestáveis. Contanto que tenham actividade de clivagem de péptido, as mesmas são consideradas como sendo proteases no âmbito desta invenção.

Surpreendentemente, a requerente verificou que a utilização de uma protease que não tinha acção perceptível sobre a reologia da massa tinha um efeito pronunciado sobre a maciez e o retardamento da dureza do miolo. Não houve efeito adverso sobre a elasticidade do miolo ou qualquer aumento da viscosidade do miolo em comparação com um controlo. 0 efeito foi aditivo a agentes anti-endurecimento conhecidos (tais como -amilases) e permite o desenvolvimento de pão e outros produtos de panificação com uma vida útil prolongada. 16 A escolha da protease é muito importante. A protease não deve exercer efeito adverso durante a mistura e a subsequente prova. Caso contrário, a dosagem que pode ser administrada é excessivamente baixa para diminuir a taxa de endurecimento e para manter uma boa elasticidade do miolo. Quanto mais elevada a temperatura óptima da enzima, mais baixo o efeito negativo sobre a estrutura do miolo e sobre a reologia da massa. A presente invenção será descrita daqui por diante em pormenor nos seguintes exemplos não limitativos e com referência as figuras anexas.

Breve descrição das figuras A figura 1 representa a temperatura óptima da protease expressa em função da actividade relativa (%) a um pH 7,0, numa solução tamponada de 0,1 M fosfato para aqualisina I (♦, linha cheia) e queratinase (·, linha tracejada). A figura 2 representa o efeito de retardamento da adição da Taq protease (OU: ♦, 800 U:) depois do endurecimento do pão na ausência e na presença de Novamyl® (0-8 g/100 kg de farinha de trigo). A figura 3 ilustra o efeito melhorado sobre o retardamento do endurecimento do pão a seguir à adição de queratinase (0 U: ♦, 800 U:) em pão na ausência e na presença de Novamyl® (0-8 g/100 kg de farinha de trigo). A figura 4 ilustra a temperatura óptima da termitase, expressa em função da sua actividade relativa (%) a um pH 7,0, 17 numa solução tamponada de 0,1 M fosfato. A figura 5 ilustra a estabilidade térmica da termitase, expressa em função da sua actividade relativa (%).

Descrição de uma forma de realização preferida

Uma das serina proteases preferidas utilizadas, é obtida a partir da estirpe LMG 7561 de Bacillus licheniformis e tem actividade de queratinase. Pela semelhança do aminoácido e a inibição do fluoreto de fenilmetilsulfonilo, a queratinase demonstrou ser uma serina protease. A queratinase em questão é obtida por meio da cultura da estirpe LMG 7561 de Bacillus licheniformis no seguinte meio: 0,5 g/L de NH4C1, 0,5 g/L de NaCl, 0,3 g/L de K2HP04, 0,4 g/L de KH2P04, 0,1 g/L de MgCl2.6H20, 2 g/L de ácido citrico, 0,1 g/L de extracto de levedura e 10 g/L de farinha de penas. O meio é ajustado a um pH 6,5 com ácido fosfórico. Não é imposto um controlo de pH. A incubação é realizada a 45 °C com arejamento (p2 60%, 1,25 vvm) durante 40 horas depois do que o meio é colhido para concentração adicional. O sobrenadante é, então, concentrado por ultrafiltração com membrana (limite molecular: 5.000 Da). A solução de queratinase em bruto obtida desta maneira é armazenada congelada até ser utilizada em testes de panificação. A solução de queratinase obtida desta maneira exibe uma actividade máxima a uma temperatura de 60 °C e um pH de 8,0. Na gama de pH de 7 a 9 foi medida mais de 85% de actividade máxima.

Quase não há qualquer perda de actividade enzimática enquanto se aquece a solução uma hora a 60 °C. Aquecer a enzima a 70 °C durante 14 minutos reduz a actividade em 50%. 18 A actividade foi medida na queratina. Para as medições padrão, 4 g de queratina foram dissolvidos em 100 mL de hidróxido de sódio. Depois da dissolução o pH é ajustado lentamente para 8,0 com 3,2 M ácido fosfórico. Adiciona-se áqua destilada para um volume final de 200 mL. 5 mL da solução substrato é pré-incubada a 60 °C. 1 mL da solução enzimática é adicionada e incubada a 60 °C. Em seguida, 5 mL de TCA (Ácido TriCloroAcético) a 14% são adicionados à solução enzimática encubada. A mesma é misturada durante 60 minutos. A solução é filtrada e a absorvância é medida a 275 nm relativa a um branco (enzima adicionada depois da adição de TCA).

A actividade é expressa como KU/mL _(A275nm da Enzima - A275nm do branco) * 11 0,0075 * 30 A fermentação continha 300 a 1500 KU/mL.

Para a finalidade de panificação a actividade foi expressa como mU/mL com base na determinação do comprimido protazim. Utilizou-se somente KU para demonstrar a presença da queratinase. A Taq protease em questão é obtida cultivando a estirpe LMG 8924 de Thermus aquaticus no seguinte meio: 1 g/L de triptona; 1 g/L de extracto de levedura; 100 mL/L de solução salina e 900 mL de água destilada. O pH é ajustado em 8,2 com 1 M NaOH antes da esterilização a 121 °C durante 15 minutos. A solução salina tem a seguinte composição: 1 g/L de ácido nitriloacético, 0,6 g/L de CaS04.2H20; 1 g/L de MgS04.7H20; 19 80 mg/L de NaCl, 1,03 g/L de KNO3; 6,89 g/L de NaN03; 2,8 g/L de Na2HPC>4.12H20; solução de 10 mL/L de FeCl3.6H20 (47 mg/100 mL) ; 10 mL/L de solução de elementos vestigiais e 1 1 de água destilada. A solução de elementos vestigiais tem a seguinte composição: 0,5 mL/L de H2S04; 1,7 g/L de MnS04.H20; 0,5 g/L de ZnS04.7H20; 0,5 g/L de H3B03; 25 mg/L de CuS04.5H20; 25 mg/L de

Na2Mo04.2H20; 4 6 mg/L de CoCl2.6H20 e 1 1 de água destilada. A incubação é feita a 60 °C com arejamento (p02 60%, 4 vvm) durante 24 horas, depois do que o meio é recolhido para concentração adicional. O Thermus aquaticus LMG 8924 produziu, pelo menos, dois tipos de proteases extra-celulares. Uma das proteases extra-celulares foi chamada aqualisina I, e é uma protease alcalina que foi segregada linearmente a partir da fase estacionária até quando as células deixaram de crescer. A temperatura óptima da actividade proteolítica era entre 70 e 80 °C. A outra foi chamada aqualisina II e é uma protease neutra, cuja produção apareceu a partir do dia 4 e a concentração desta protease continuou linearmente durante 5 dias. A actividade máxima foi obtida a 95 °C (a temperatura mais alta testada). O extracto de fermentação foi utilizado depois de 1 dia de fermentação para os testes de panificação. Como a fermentação foi interrompida depois de 1 dia, a protease presente é a aqualisina I. A aqualisina I é fortemente inibida pelos inibidores de serina protease microbiana e pode ser classificada como uma serina protease alcalina. O sobrenadante é, então, concentrado por ultrafiltração com membrana (limite molecular: 10.000 Da). A solução de Taq protease em bruto obtida desta maneira é armazenada congelada até ser utilizada em testes de panificação. A solução de Taq protease obtida desta maneira exibe uma 20 actividade máxima a uma temperatura de 80 °C. Quase não há qualquer perda de actividade enzimática enquanto se aquece a solução uma hora a 80 °C. Aquecer a enzima a 90 °C durante 10 minutos reduz a actividade em 60%. A actividade da protease foi medida em caseína reticulada com azurina (AZCL-caseína). É preparada corando e reticulando a caseína para produzir um material que hidrata em água, mas é insolúvel em água. A hidrólise por proteases produz fragmentos corados solúveis em água e a taxa de libertação destes (aumento em absorvância a 590 nm) pode ser relacionada directamente à actividade enzimática (Comprimidos Protazim AK, Irlanda). Um comprimido protazim AK é incubado em 100 mM Na2HP04.2H20; pH 7,0 a 60 °C durante 5 minutos. Adiciona-se uma alíquota de enzima (1,0 mL) e deixa-se a reacção continuar durante exactamente 10 minutos. A reacção é terminada pela adição de fosfato trissódio (10 mL, 2% p/v, pH 12,3). Deixa-se o tubo em repouso durante aproximadamente 2 minutos à temperatura ambiente e o conteúdo é filtrado. A absorvância do filtrado é medida a 590 nm versus um branco de substracto. A actividade é expressa como mU/mL = (34,2 * (Abs590 da enzima - Abs590 do branco) + 0,6 / diluição

No caso do microrganismo termofílico, Thermoactinomyces vulgarís, sabe-se que durante a fase logarítmica da multiplicação várias enzimas proteolíticas são segregadas no meio circundante. Entre os até cinco componentes proteolíticos do filtrado da cultura, uma protease domina totalizando 70 a 80% da actividade total, chamada termitase. 21 A termitase é uma serina proteinase extracelular, termoestável. 0 perfil do pH demonstra um ponto óptimo amplo entre pH 7,5 e 9,5. A enzima demonstra uma estabilidade máxima na gama de pH de 6,4 a 7,6 com crescente estabilidade para além do pH 8,0 e abaixo de 5,75, especialmente a temperaturas elevadas e periodos de tempo prolongados. Dependendo do tamanho do substrato, a termitase demonstra uma actividade máxima a temperaturas que variam de 65 °C (gelatina) , 70 °C (protamina) a 85 °C (azocaseina). A temperatura óptima é mais pronunciada com o substrato maior (azocaseina): a actividade a 85 °C é 12 vezes superior à actividade demonstrada a 25 °C. A termitase em questão é obtida por meio da cultura da estirpe b-1617 de Thermoactinomyces vulgaris NRRL num meio de cultura com a seguinte composição: amido de trigo (20 g/L), peptona bacteriológica (5 g/L), extracto de levedura (3 g/L) e extracto de malte (3 g/L) em água destilada. A incubação é feita a 45 °C com um arejamento de 12 1/min e uma rotação de 200 rpm. O sobrenadante foi recolhido depois de 24 horas de incubação. Devido ao facto de que o sobrenadante da cultura continha muita actividade da α-amilase, foi realizado um primeiro passo de purificação para separar a actividade da protease da actividade da α-amilase para realizar testes de panificação. O sobrenadante foi concentrado por ultrafiltração com membrana (limite molecular: 10.000 Da). A termitase foi purificada por cromatografia em coluna numa coluna S-sepharose (Pharmacia). A coluna foi equilibrada com 500 mM Na-tampão acetato (pH 4,5) e, em seguida com 10 mM Na-tampão acetato (pH 4,5) e 5 mM CaCl2. A actividade da α-amilase não ligou na coluna e a termitase foi eluida com 10 mM Na-tampão acetato (pH 4,5), 5 mM CaCl2 e 1 M NaCl. A fracção eluida foi dialisada contra 10 mM Na-tampão 22 acetato (pH 4,5) e 5 mM CaCl2 e utilizada para realizar testes de panificação.

As actividades secundárias, como a actividade da -amilase foram medidas por Phadebas Amylase Test™ (Pharmacia & Upjohn). 0 substrato é um polímero de amido reticulado insolúvel em água que leva um corante azul. É hidrolisado por -amilase para formar fragmentos azuis solúveis em água. A absorvância da solução azul é uma função da actividade da -amilase na amostra. A actividade secundária da xilanase foi medida pelo Xylanase Method™ (Megazyme). 0 substrato utilizado é o xilano reticulado com azurina. Este substrato é preparado corando e reticulando o xilano (de madeira de vidoeiro) altamente purificado para produzir um material que hidrata em água, mas é insolúvel em água. A hidrólise por endo-(l,4)- -D-xilanase produz fragmentos corados solúveis em água e a taxa de libertação destes (aumento em absorvância em 590 nm) pode ser relacionada directamente à actividade enzimática. A solução de Taq protease obtida não apresentou qualquer actividade secundária de -amilase ou xilanase. A solução de queratinase obtida não tinha actividade de xilanase e continha menos de 8 U/mL de actividade de a-amilase, conforme medido pelo teste Phadebas. A solução de terminase obtida depois do processo de purificação não apresentou qualquer actividade secundária de α-amilase ou xilanase. 23

Os testes de panificação foram realizados em 1 kg de pão. A receita básica era (em gramas):

Farinha de trigo (Duo): 1500 Água: 840

Levedura fresca (Bruggeman, Bélgica) : 75

Cloreto de Sódio: 30 Óleo de palma parcialmente hidrogenado 21

Monoglicéridos destilados: 3

Sacarose: 6 Ácido ascórbico: 0,06

Foi utilizado o seguinte processo de produção de pão: os ingredientes foram misturados durante 2' à baixa velocidade e 6' a alta velocidade num misturador Diosna SP24. A temperatura da massa final era de 29 °C. Depois da fermentação em volume durante 20' a 25 °C, foram feitas peças de 600 g de massa utilizando o conjunto Euro 200S (Bertand-Electrolux Baking) a R8/L19 e moldadas. As peças de massa são provadas a 35 °C durante 50' a uma humidade relativa de 95%. Em seguida, os pães são cozidos a 230 °C num forno MIWE CONDO (Michael Wenz -Arnstein - Alemanha) com vapor (0,1 L antes e 0,2 L depois de cozer os pães) . É óbvio para um especialista na técnica que se os mesmos resultados finais podem ser obtidos utilizando equipamento de outros fornecedores. A maciez do pão foi medida por um analisador de textura TA-XT2 (Stable Micro Systems UK) . O pão foi cortado em fatias e foi medida a força para obter-se uma deformação de 25% de 4 fatias de 1 cm. Isto é chamado de dureza. A dureza é medida no 24 dia 1 e no dia 6 depois do cozimento. A diferença entre as duas forças medidas é "a perda de maciez":

Perda de maciez = força de deformação no dia 6 - força de deformação no dia 1

Esta é uma medida relativa. Os valores absolutos não têm significado como tal, mas devem ser comparados a uma referência para interpretação. A elasticidade é a diferença entre a força acima mencionada e a força depois de 20 segundos de relaxação. Quando a elasticidade é inferior no pão de referência, isto significa que o miolo se torna menos flexível. Quando comprimido, o miolo não recupera o seu formato original. Isto significa que durante o corte em fatias ou a manipulação a estrutura do miolo pode ser perdida, de forma irreversível. É importante que ao utilizar uma enzima adicionada não haja perda de elasticidade em comparação com um pão de controlo. A adição das enzimas da presente invenção à massa do pão não alterou o tempo de prova, humidade do pão e volume específico do pão. O teor de humidade inicial do pão variou ligeiramente, mas todos os pões perderam, aproximadamente, a mesma quantidade de humidade durante os seis dias de armazenamento à temperatura ambiente. 25

Exemplos

Exemplo 1: Taq protease

Um pão foi cozido de acordo com o método acima referido com a adição de Taq protease (eventualmente na presença de doses diferentes de Novamyl® 10000 BG da Novozymes (Dinamarca)).

As doses estão expressas em 100 kg de peso da farinha de trigo utilizada no teste de panificação. A seguinte tabela 1 expressa a perda em maciez entre o dia 1 e o dia 6 depois do cozimento, conforme definido anteriormente.

Tabela 1: Maciez

Novamyl® g/100 kg 800 U Taq protease 0 U Taq protease 0 140 209 2,5 128 152 5 96 118 8 68 105 O exemplo demonstra que a utilização da Taq protease retardará o endurecimento no pão. Uma combinação de Taq protease com uma amilase maltogénica intermediária, termoestável (e. g., Novamyl®, enzima comercial da Novozymes) retardará o endurecimento no pão, de forma significativa. Deste modo, há um efeito sinérgico entre as serina proteases termoestáveis e as -amilases. Este efeito 26 torna-se mais pronunciado em doses mais elevadas de Novamyl® (ver a figura 2). A Tabela 2 demonstra que a elasticidade do miolo do pão quase não é afectada pela utilização da Taq protease.

Tabela 2: Elasticidade

Novamyl® g/100 kg 800 U Taq protease 0 U Taq protease 0 61,5 61,9 2,5 63,1 63,4 5 63,0 64,2 8 63,4 64,9

Exemplo 2: Queratinase

Um pão foi cozido de acordo com o método acima referido com a adição de queratinase (eventualmente na presença de Novamyl® 10 000 BG da Novozymes (Dinamarca)).

As doses na seguinte tabela 3 estão expressas em 100 kg de peso da farinha de trigo utilizada no teste de panificação. A tabela expressa a perda em maciez entre o dia 1 e o dia 6 depois do cozimento, conforme definido anteriormente. 27

Tabela 3: Maciez

Novamyl® g/100 kg 800 U queratinase 0 U queratinase 0 121 209 2,5 95 126 5 64 111 8 50 59

Fica claro a partir desta experiência que a adição da serina protease termoestável queratinase tem um efeito pronunciado sobre a maciez. Há um efeito cumulativo com as amilases maltogénicas termoestáveis como a Novamyl® (ver a figura 3). Verificou-se que a pequena quantidade de amilase presente na preparação não teve impacto sobre a maciez e a proporção de relaxação ao se testar esta amilase separadamente. A tabela 4 também demonstra que não há efeito adverso sobre a proporção de relaxação quando esta protease é utilizada.

Tabela 4: Elasticidade

Novamyl® g/100 kg 800 U queratinase 0 U queratinase 0 co CM CQ 63,6 2,5 64,3 65,0 5 65,5 65,8 8 65,4 65,8 28

Exemplo 3: Termitase

Um pão foi cozido de acordo com o método acima referido com a adição de termitase (eventualmente em combinação com Novamyl® 10 000 BG da Novozymes (Dinamarca)).

As doses na seguinte tabela 5 estão expressas em 100 kg de peso da farinha de trigo utilizada no teste de panificação. A tabela 5 expressa a perda em maciez entre o dia 1 e o dia 6 depois do cozimento conforme definido anteriormente.

Tabela 5: Maciez

Novamyl131 g/100 kg 10.500 U Termitase 0 U Termitase 0 140 197 2,5 87 107 5 65 102 8 62 68 É óbvio a partir desta experiência que a adição da serina protease termoestável termitase tem um efeito pronunciado sobre a maciez. Há também um efeito cumulativo com as amilases maltogénicas termoestáveis como a Novamyl®. Depois da purificação da termitase não havia alfa-amilase presente na preparação que pudesse ter um impacto sobre a maciez e a proporção de relaxação. A tabela 6 demonstra que não há efeito adverso sobre a proporção de relaxação quando esta protease é utilizada. 29

Tabela 6: Elasticidade

Novamyl* g/100 kg 10500 U Termitase 0 U Termitase 0 62 64 2,5 64 65 5 64,6 66,3 8 64,4 66,2 A actividade (%) relativa óptima da termitase de protease a um pH 7,0 numa solução tamponada de 0,1 M fosfato e a estabilidade térmica (expressa em função da estabilidade relativa a uma dada temperatura) são dadas nas figuras 4 e 5, respectivamente. 0 tratamento só com Taq protease, queratinase e/ou termitase, como uma mistura e/ou juntamente com amilases termoestáveis (e. g., Novamyl®), afecta, de forma significativa, a maciez do pão. O pão tratado com enzima era mais macio quando eram adicionadas a Taq protease, queratinase e/ou termitase. Os exemplos ilustram que as serina proteases termoestáveis de acordo com a presente invenção aumentam a vida útil dos produto panificados no que diz respeito à maciez e ao endurecimento.

Exemplo 4: Efeito da queratinase, termitase e Taq protease sobre a estrutura do miolo e as características sensoriais do pão

As serina proteases termoestáveis e/ou intermediários termoestáveis acima mencionadas de acordo com a presente invenção não tiveram um efeito negativo sobre a estrutura do miolo, ao passo que outras proteases não termoestáveis ou proteases que pertencem a outro grupo de proteases como a 30 papaína (cisteína peptidase) ou termolisina (metalopeptidase) tiveram. Por exemplo, a utilização da papaina ou da termolisina resultou em que estrutura do miolo se torna mais aberta, dependendo das doses que foram utilizadas. Do mesmo modo, não houve efeito sobre o volume dos produtos cozidos utilizando as serina proteases termoestáveis da invenção. A cor da crosta, o carácter da crosta, a cor do miolo, o aroma e o sabor do pão não mudaram de forma significativa com a adição de queratinase, Taq protease e/ou termitase.

Exemplo 5: Aplicação de Taq protease em bolo

Receita: Mistura de Bolo Satin Créme: 1000 g

Ovos: 350 g Óleo: 300 g Água: 225 g Método: Misturador: Hobart

Instrumento: Lâmina

Velocidade: 2 min velocidade 1 e 2 min velocidade 2, depois

Adicionar óleo e água, 1 min velocidade 1,

Raspar e 2 min velocidade 1

Peso da massa: 300 g

Temperatura: 180 °C

Tempo: 45 min

As doses na tabela 7 a seguir estão expressas em 100 kg de peso da farinha de trigo utilizada no teste de panificação. 31 A tabela 7 expressa a perda em maciez medida depois de 4 dias, 1 semana, 2 semanas e 3 semanas depois do cozimento.

Tabela 7: Maciez 0 U Taq protease 600 U Taq protease 1200 U Taq protease 4 dias 396 321 237 1 semana 492 379 298 2 semanas 542 457 268 4 semanas 687 441 308

Lisboa, 29 de Agosto de 2007 32

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a prevenção ou o retardar do endurecimento durante o processo de cozimento de produtos de panificação que compreende o passo de adicionar aos referidos produtos de panificação, pelo menos, uma serina protease termoestável com uma temperatura de actividade óptima superior a 60°C, sendo a referida protease adicionada numa quantidade que previne ou retarda o endurecimento durante o processo de cozimento.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a serina protease termoestável ter uma temperatura de actividade óptima superior a 70 °C e, de uma forma mais preferida, superior a 75 °C.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a proporção entre a actividade da protease à temperatura óptima e a actividade da protease a 25 °C ser superior a 10, de uma forma preferida, superior a 15.
4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a serina protease termoestável ser obtida de organismos eucarióticos ou procarióticos que ocorrem naturalmente, por meio de sintese ou por modificação genética.
5. 5. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a serina protease 1 termoestável ser uma protease neutra ou, de uma forma mais preferida, uma protease alcalina.
6. 6. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a referida protease ser seleccionada do grupo consistindo em aqualisina I, aqualisina II, termitase e queratinase.
7. 7. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a serina protease termoestável ser uma Taq protease isolada de Thermus aquaticus LMG 8924, uma queratinase, isolada do Bacillus licheniformis LMG 7561 e/ou uma termitase isolada de Thermoactinomyces vulgaris.
8. 8. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores compreendendo o passo de adicionar ainda um aditivo anti-endurecimento seleccionado do grupo consistindo numa α-amilase termoestável, numa β-amilase, numa amilase maltogénica termoestável intermediária, numa lipase, numa glicolsiltransferase, numa pululanase e emulsionantes, de uma forma preferida, em monoglicéridos, diglicéridos e/ou estearoil lactilatos.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o produto de panificação ser seleccionado do grupo consistindo em pão, papo-secos, roscas, donuts, artigos de Pastelaria, pães para hambúrguer, pizzas, pão do tipo pita e bolos. Lisboa, 29 de Agosto de 2007 2