DE60311968T2

DE60311968T2 - Band-durchflusszytometrie und zellsortierung

Info

Publication number: DE60311968T2
Application number: DE60311968T
Authority: DE
Inventors: H. Bernhard H. Seattle WEIGL; H. Ronald L. Redmond BARDELL; H. Jon W. Redmond HAYENGA
Original assignee: Micronics Inc
Current assignee: Micronics Inc
Priority date: 2002-03-14
Filing date: 2003-03-10
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2023-03-11
Also published as: EP1487581B1; EP1483564B1; WO2003078065A1; WO2003078972A8; EP1487581A1; US7223371B2; DE60315811D1; US20030175990A1; ATE370787T1; WO2003078972A1; ATE354792T1; JP2005519751A; DE60311968D1; JP2005520150A; EP1483564A1; AU2003220121A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen mikrofluidische Geräte zum Durchführen analytischer Tests und insbesondere ein mikrofluidisches Gerät und ein Verfahren zum hydrodynamischen Fokussieren und Sortieren von Zellen.
Hintergrund der Erfindung
Mikrofluidische Geräte werden zunehmend für die Durchführung von analytischen Tests populär. Von der Halbleiterindustrie für die Miniaturisierung von Elektronik entwickelte Werkzeuge ermöglichen die Herstellung und preiswerte Massenproduktion von komplizierten Fluidsystemen. Mikrofluidische Systeme werden zunehmend bei der Durchführung einer Vielzahl analytischer Techniken für die Erfassung von Information in mehreren Disziplinen genutzt, welche das medizinische Gebiet, Biowissenschaften und Medikamentensuche und Entwicklung umfassen.
Es gibt viele unterschiedliche Möglichkeiten mikrofluidische Geräte herzustellen, welche herkömmliche lithographische Techniken, Soft-Lithographie und Laminat-Technologien umfassen. In einer Herstellung als Laminat besteht das Gerät aus Materialschichten oder Laminaten, die beispielsweise durch einen Laser oder Stanzung auf die gewünschte Form zugeschnitten, und dann mit einer bestimmten Kleberform, am häufigsten durch druckempfindlichen oder wärmeaktivierten Kleber, zusammengehalten werden. Mylar-Kunststoff wird üblicherweise verwendet, obwohl auch andere Materialien, wie zum Beispiel Glas und Polydimethylsiloxan (PMDS) ebenfalls in Laminat-Geräte eingebaut wurden. Ein mikrofluidischer Geräteaufbau kann eine mehrschichtige laminierte Struktur enthalten, wobei jede Schicht Kanäle und Strukturen aufweist, die aus einem Laminat-Material hergestellt wurden, welche Mikro-Hohlräume oder -Kanäle wo Fluide strömen erzeugen. Ein Mikro-Kanal ist im Allgemeinen als ein Fluidkanal mit wenigstens einer Innenquerschnittabmessung definiert, die kleiner als 500 Mikrometer und typischerweise zwischen etwa 0,1 Mikrometer und etwa 500 Mikrometer groß ist. Entweder wird extern unter Druck gesetztes Fluid in das Laminat gedrückt oder innerhalb des Laminats befindliche Strukturen bewirken die Steuerung und das Pumpen von Fluiden durch diese Kanäle.
Unter mikrofluidischen Bedingungen strömen Fluide üblicherweise in einer sehr vorhersagbaren laminaren Weise, und ermöglichen dadurch, dass mehrere Fluide unmittelbar nebeneinander in demselben Kanal ohne turbulente Vermischung oder die Notwendigkeit einer physikalischen Trennung durch eine Membrane strömen. Kleinere Partikel diffundieren typischerweise schnell quer durch die Begrenzungsschicht, während große Moleküle und Partikel, wie zum Beispiel Zellen, typischerweise nur minimal diffundieren.
WO98/10267 stellt ein Mikro-Durchflusssystem zum Trennen von Partikeln dar, das ein im Mikromaßstab hergestelltes Element mit einem Durchflusskanal (5), der darin zur Führung eines Stroms eines die Partikel enthaltenden Fluids durch den Durchflusskanal definiert ist, eine erste Einlasseinrichtung (2) die an einem Ende des Durchflusskanals zur Eingabe des Fluids in den Durchflusskanal positioniert ist, und eine erste Auslasseinrichtung (7), die an dem anderen Ende des Durchflusskanals zur Ausgabe des Fluids aus dem Durchflusskanal positioniert ist, aufweist, wobei der Strom des die Partikel enthaltenden Fluids in einer solchen Weise gesteuert wird, dass ein Partikel pro Zeitpunkt einen Querschnitt des Durchflusskanals passiert, wobei sich das Element in einem Feld befindet, das im Wesentlichen senkrecht zu einer Längsachse des Durchflusskanals ist, so dass sich in dem Durchflusskanal befindende und gegenüber dem Feld quer zu dem Durchflusskanal empfindliche Partikel in der Richtung des Feldes abgelenkt werden.
Das US Patent Nr. 5 716 852 lehrt ein Verfahren zum Analysieren des Vorhandenseins und der Konzentration kleiner Partikel in einer Durchflusszelle unter Anwendung von laminarer Strömung und Diffusionsprinzipen, und ist hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit für alle Zwecke beinhaltet. Beschrieben wird ein Kanalzellensystem zum Detektieren des Vorhandenseins von Analytpartikeln in einem Probenstrom unter Verwendung eines laminaren Durchflusskanals mit wenigstens zwei Einlasseinrichtungen, welche einen Indikatorstrom und einen Probenstrom erzeugen, wobei der laminare Durchflusskanal eine Tiefe, die ausreichend klein ist, um einen laminaren Durchfluss der Ströme zu erzwingen, und eine Länge, die für eine Diffusion von Partikeln in dem Analyt in den Indikatorstrom, um einem Detektionsbereich auszubilden, hat, und einen Auslass aus dem Kanal zum Erzeugen eines einzelnen gemischten Stroms hat. Diese Vorrichtung, welche als ein T-Sensor bekannt ist, kann eine externe Detektionseinrichtung zum Detektieren von Diffusionsgrenzen in dem Indikatorstrom enthalten. Diese Detektionseinrichtung kann durch jede beliebige im Fachgebiet bekannte Einrichtung bereitgestellt werden, einschließlich optischer Einrichtungen, wie zum Beispiel optische Spektroskopie oder Absorptionsspektroskopie von Fluoreszenz.
Durchfluss-Zytometrie ist ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen von Lichtstreuungs-, Fluoreszenz- und Absorptionseigenschaften von einzelnen Zellen oder Partikeln wenn diese in einer Fluidsuspension fließen. Entwickelte durchflusszytometrische Verfahren ermöglichen die Bestimmung von Zellenmerkmalen wie zum Beispiel Größe, Zellmembranpermeabilität, intrazellularen pH und die Werte zellularer Komponenten, wie zum Beispiel Nukleinsäuren, Protein, Oberflächenrezeptorexpression und intrazellularer Kalziumwerte. Einige Systeme ermöglichen eine Sortierung oder Trennung von Partikeln oder Zellen anhand der gezeigten Eigenschaften. Durchfluss-Zytometrie wird zunehmend in der Grundlagenforschung sowie in klinischen, biologischen und Umweltanwendungen eingesetzt.
Derzeit verwendet der Stand der Technik in der Durchfluss-Zytometrie und Zellsortierungstechnologie einen hydrodynamisch fokussierten Kernstrom, welcher in zwei Dimensionen grob auf die Größe einer Zelle in den Abmessungen senkrecht zum Fluss fokussiert ist. Dieses erzeugt einen einlagigen Zellstrom, welcher einem Lichtstreuungs-, Fluoreszenzdetektor- oder bildbasierenden Zellendetektorsystem präsentiert werden kann. Die Zellsortierungstechnologie kombiniert im Wesentlichen eine piezoelektrische Tropfenerzeugung und elektrostatische Ablenkung. Auf diese Weise werden Zellen in Mikrotröpfchen unterteilt und jedes Mikrotröpfchen so geladen, dass es elektrostatisch in getrennte Fächer zur Sortierung umgelenkt werden kann. Dieses Verfahren leidet unter der erheblichen Einschränkung, dass die Detektoren nur eine Zelle pro Zeiteinheit detektieren und lenken können. Um große Zellmengen zu verarbeiten, müssen die Fluidsysteme in einer solchen Weise laufen, dass das Fluid die Detektoren bei extrem hohen Geschwindigkeiten passiert. Das Fluid muss den Detektor mit Geschwindigkeiten von 1 bis 10 Metern pro Sekunde passieren, um den erforderlichen Durchsatz für einige Anwendungen zu erzielen. Aufgrund dieser Einschränkungen kann das Suchen nach sel tenen Zellen oder Partikeln, wie zum Beispiel Krebszellen in einem Flüssigpräparat, Stammzellen, fötalen Zellen oder anderen ineffizient, zeitaufwendig und teuer sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein mikrofluidisches Gerät gemäß Anspruch 1 und ein Verfahren zum hydrodynamischen Fokussieren einer Probenlösung in einem Band und zum Sortieren von Zellen auf der Basis eines gewünschten Merkmals gemäß Anspruch 7 bereit.
Ein mikrofluidisches Gerät zum Sortieren von Zellen wird hierin bereitgestellt. Das Gerät enthält einen Eingangskanal, einen Primärkanal, wenigstens zwei Zweigkanäle, welche sich an einer Verzweigungsstelle mit dem Primärkanal treffen, und eine Trägerlösungsdüse, die stromaufwärts von der Verzweigungsstelle angeordnet ist. Eine Probenlösung, welche eine Population von Zellen enthalten kann, kann in den Eingangskanal eingegeben und hydrodynamisch in ein Probenband fokussiert werden. Das Gerät besteht auch aus einem Partikelumlenksystem, um einen Fluiddurchfluss und insbesondere den Durchfluss des Probenbandes in einen Zweigkanal auf der Basis eines detektierten Zellenmerkmales zu lenken.
Ferner wird ein Verfahren zum Sortieren von Zellen in einer im Mikromaßstab hergestellten Struktur beschrieben. Das Verfahren besteht aus einer hydrodynamischen Fokussierung einer Population von Zellen in ein Probenband, dem Durchfließenlassen des Bandes durch einen Kanal, die Ermittlung des Vorhandenseins oder der Menge einer Markierung auf jeder Zelle, und die Umlenkung von Zellen in einen speziellen Zweigkanal auf der Basis des Vorhandenseins oder der Menge einer Markierung auf jeder Zelle.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 stellt eine Seitenansicht einer mikrofluidischen Gerätes zum Sortieren von Zellen gemäß der Erfindung dar;
2 stellt eine dreidimensionale Ansicht einer mikrofluidischen Gerätes zum Sortieren von Zellen gemäß der Erfindung dar;
3 ist eine Seitenansicht einer Trägerlösungsdüse der vorliegenden Erfindung;
4 ist eine Draufsicht auf die Trägerlösungsdüse von 3;
5A uns 5B sind eine schematische Ansicht eines Abschnittes einer Sortiereinheit gemäß einer Ausführungsform der Erfindung während der Lenkung eines Durchflusses eines Probenbandes unter Verwendung einer Fluidverdrängung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Begriff "mikrofluidisch" ist im Allgemeinen als ein Substrat mit einem Fluidkanal mit wenigstens einer Innenquerschnittabmessung definiert, die kleiner als 500 Mikrometer und typischerweise zwischen etwa 0,1 Mikrometer und etwa 500 Mikrometer groß ist. Der Begriff "Kanal", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen mikrofluidischen Kanal und beschreibt Fluidelemente, die so dimensioniert sind, dass ein Durchfluss darin im Wesentlichen laminar ist. Die Begriffe "oben", "unten" und "Seite" bezeichnen die Orientierung in den Zeichnungen, welche nicht notwendigerweise die Orientierung der Elemente im Betrieb ist.
So wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Kasette" ein mikrofluidisches Gerät, welches typisch, jedoch nicht notwendigerweise wegwerfbar ist, und welche mit Mess-, Pump-, elektronischen, fluidischen oder anderen Vorrichtungen verbunden werden kann. Die Kassette kann unter einer Vielfalt von Verfahren, einschließlich jedoch ohne Einschränkung herkömmlicher Lithographietechniken, Soft-Lithographie, Laminat-Technologien im Mikromaßstab hergestellt werden. Beispielsweise kann die Kassette aus jedem gießbaren, bearbeitbaren oder ätzbaren Substrat im Mikromaßstab hergestellt werden. Der Begriff "Bearbeitung", so wie er hierin verwendet wird, umfasst ohne Einschränkung Drucken, Stanzen, Schneiden und Laserabtrag. Die Kassette kann in einer einzigen Schicht hergestellt werden, in einem Paar von miteinander verbundenen Schichten, oder aus mehreren miteinander laminierten Schichten. Der Begriff "Schicht" bezieht sich auf jedes festes, flexibles oder anderweitiges Substrat. Die Kanäle können in einem Siliziumsubstrat geätzt sein und mit einer Abdeckschicht abgedeckt sein, welches eine transparente Abdeckschicht sein kann. In einer Laminat-Ausführungsform werden die Kanalwände durch Entfernung von Material von wenigstens einer Schicht definiert, um somit Kanäle und Leerräume zu erzeugen, und durch die Positionierung zusätzlicher Schichten auf jeder Seite der geänderten Schichten. Jede von den Schichten kann Fluidkanäle enthalten. In einigen Fällen ist der Kanal einfach ein Loch (oder ein Fluiddurchtrittsloch) um das Fluid zu der nächsten Fluidlaminatschicht zu führen. Beliebige zwei benachbarte Laminatschichten können miteinander verbunden sein, um ein komplexeres Einzelteil auszubilden.
So wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Durchfluss" jeden Typ von Bewegung einer Flüssigkeit oder eines Feststoffes durch ein mikrofluidisches Gerät oder in einem Verfahren gemäß der Erfindung. Unter mikrofluidischen Bedingungen ist ein Fluiddurchfluss durch eine niedrige Reynoldszahl gekennzeichnet und ist laminar, wobei jede Vermischung benachbarter Fluide hauptsächlich durch Diffusion erfolgt. Durchfluss beinhaltet auch, ohne Einschränkung, jeden Fluidstrom, sowie jedes Materials, Zellen oder Partikel die sich darin mit dem, innerhalb dem oder gegen den Fluidstrom bewegen. Jede Art von Kraft kann aufgebracht werden, um einen Durchfluss zu erzeugen (einschließlich jedoch ohne Einschränkung Druck, Kapillarwirkung, magnetische und elektromagnetische Kraft, Elektrophorese, Dielektrophorese, Elektroosmose, optische Pinzetten und jede Kombination davon.
Die Elemente des Durchflusssystems dieser Erfindung, die "verbunden" sind, sind fluidmäßig verbunden. Der Begriff "zwischen" bezeichnet die fluidische Positionierung, welche nicht notwendigerweise der geometrischen Positionierung entspricht.
So wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Zelle" jede Zelle, Virus, Material oder Partikel mit einer mikroskopischen Größe ähnlich der einer biologischen Zelle. Eine biologische Zelle umfasst ohne Einschränkung jedes prokarytische, eukarytische, bakterielle, fungale Lebewesen, Pflanze, Algenzelle oder sonstiges. Die Größe einer Zelle reicht typischerweise von etwa 0,1 bis 120 Mikrometer im Durchmesser, wobei sie typischerweise etwa 1 bis 50 Mikrometer im Durchmesser ist. Zellen können lebend oder tot, geladen oder ungeladen sein. Zellen können kugelförmig oder nicht kugelförmig einschließlich ohne Einschränkung länglich, abgeflacht, verformt und alle beliebigen asymmetrischen Zellen sein. Der Begriff "Zelle" umfasst auch mikroskopische Kügelchen, Liposome, Emulsionen, zellulare Komponenten und komplexe Organellen oder irgendwelche anderen Partikel mit Zellengröße.
Der Begriff "Markierung" bezieht sich auf ein Molekül oder eine Zusammensatzung von Molekülen, die durch optische, spektroskopische, photochemische, biochemische, immunologische, chemische oder magnetische Einrichtungen detektierbar sind. Markierungen können spezifisch an selektierte Zellen gebunden sein, müssen es aber nicht. Solche Kennzeichnungen oder Markierungen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, gefärbte, radioaktive, fluoreszierende, ultraviolette oder magnetische Moleküle oder Partikel die mit Antikörpern oder anderen Molekülen oder Partikeln, die bekanntermaßen Zellen oder zellulare Komponenten binden, Zweierbindungen haben. Antikörper werden oft als Markierungskomponenten aufgrund ihrer Fähigkeit verwendet, sich an spezifische Zelltypen zu hängen. Weitere reaktive Markierungskomponenten, die als Alternativen zu Antikörpern dienen können umfassen, sind jedoch darauf beschränkt, genetische Sonden, Farbstoffe, Fluorochrome, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Zucker, Polynukleotide, Enzyme, Coenzyme, Cofaktoren, Antibiotika, Steroide, Hormone oder Vitamine. Die Markierung erzeugt oft ein messbares Signal, welches mit oder ohne einer bestimmten Art von Stimulationsereignis detektiert werden und dazu benutzt werden kann, das Vorhandensein einer gebundenen Markierung zu detektieren und möglicherweise die Menge der gebundenen Markierung in einer Probe zu quantifizieren. Ferner kann die Markierung eine detektierbare intrinsische Eigenschaft der Zelle wie zum Beispiel Zellengröße oder Morphologie sein, welche beispielsweise durch Messen von Lichtsteuerungseigenschaften detektierbar ist. Die Markierung kann direkt detektierbar oder indirekt detektierbar sein oder in Verbindung mit einer anderen Markierung arbeiten. Für weitere Beispiele von Markierungen siehe die in dem Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 9th Ed. Molecular Probes, INC., Eugene, Oregon aufgelisteten.
So wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Markieren" auf den Prozess der Anbringung oder Doppelbindung einer Markierung an Zellen, was, manchmal nach einer weiteren Verarbeitung die Trennung dieser Zellen aus einer heterogenen Suspension und/oder Detektion, Analyse oder Zählung gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
Der Begriff Zell-"Merkmal" und Zell-"Charakteristik" kann austauschbar verwendet werden und bezieht sich auf jede Eigenschaft einer Zelle die durch Markierung detektierbar ist. Nicht einschränkende Beispiele umfassen Größe, Form, Gestalt, Vorhandensein oder Menge eines speziellen zellularen Moleküls (zum Beispiel Protein, Nukleotid, Lipid, Kohlenhydrat, Hormon, und so weiter) die innerhalb oder außerhalb der Zelle angeordnet sind, oder jede Kombination davon, eine Expression eines Gens oder Proteins, eine Zellpermeabilität, Affinität für einen Farbstoff, Zellenzyklusstadium, Anzahl mitotischer Unterteilungen oder jeder beliebigen Kombination davon.
Eine Sortiereinheit ermöglicht die Sortierung von Zellen gemäß der Erfindung und besteht aus einem Eingangskanal, einem Primärkanal, wenigstens zwei Zweigkanälen, einer Trägerlösungsdüse und einem Prüfbereich. Eine Sortiereinheit besteht ferner aus einem Zellumlenkungssystem, welches dem Durchfluss von Zellen einen Wechsel der Richtung und einen Eintritt in einen oder mehreren Zweigkanäle abhängig von einem Signal ermöglicht, das in Verbindung mit einer Überprüfung in dem Prüfbereich empfangen wird. Ein Eingangskanal ist ein Kanal zum Aufnehmen einer Probenlösung und ist mit der Trägerlösungsdüse verbunden. Die Probenlösung ist ein Fluid, das durch den Eingangskanal und die Trägerlösungsdüse fließt und hydrodynamisch in dem Primärkanal fokussiert wird. Die Probenlösung enthält typischerweise, jedoch nicht notwendigerweise eine Population von Zellen.
Der Primärkanal ermöglicht den Vorbeifluss von Zellen an dem Prüfbereich und ermöglicht eine Sortierung gemäß der Erfindung. Der Primärkanal besteht aus einem mit einem Trägerlösungsbehälter verbundenen ersten Ende und einem mit wenigstens zwei Zweigkanälen, die sich an einer Zweigungsstelle treffen, verbundenen zweiten Ende.
Ein Zweigkanal ist ein Kanal, der mit einem Primärkanal verbunden ist. Typischerweise empfängt ein Zweigkanal Zellen abhängig von dem interessierenden Zellenmerkmal gemäß einer Detektion in dem Prüfbereich und Sortierung in dem Zellumlenksystem. Ein Zweigkanal kann mit anderen Kanälen verbunden sein, um eine zusätzliche Sortierung zu ermöglichen. Alternativ kann ein Zweigkanal in einer Mulde oder einem Behälter enden, um eine Sammlung oder Entsorgung der Zellen zu ermöglichen.
Eine Verzweigungsstelle ist ein Bereich, in welchem der Primärkanal und wenigstens zwei Zweigkanäle miteinander verbunden sind. Es ist die Verzweigungsstelle, wo der Fluss der Zellen die Richtung zum Eintreten in einem oder mehrere andere Kanäle (zum Beispiel einen Zweigkanal) in Abhängigkeit von dem in Verbindung mit einer Prüfung in dem Abfragesystem empfangenen Signal ändern kann. Der Prüfbereich kann entlang des Primärkanals entweder unmittelbar an oder stromaufwärts vor der Verzweigungsstelle angeordnet sein.
Die Trägerlösungsdüse ist typischerweise entlang des Primärkanals angeordnet und ist mit einem Eingangskanal verbunden. Die Trägerlösungsdüse ermöglicht die Einführung und hydrodynamische Fokussierung einer Probenlösung in dem Primärkanal. Die Trägerlösungsdüse gemäß der Erfindung ermöglicht eine hydrodynamische Fokussierung beispielsweise in einer die Erzeugung eines Probenbandes ermöglichenden Dimension.
Ein Probenband wird beispielsweise durch hydrodynamische Fokussierung einer Probenlösung in nur einer Dimension hergestellt. Die Breite des Probenbandes ist typischerweise größer als die Höhe. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bestehen Dimensionen eines Probenbandes aus einer Formation von Zellen mit einer Höhe wenigstens der einer einzelnen Zelle und einer Breite von wenigstens zwei Zellen. Das Band kann wenigstens eine Zelle in der Länge sein und kann sich ferner abhängig von der Menge der darin enthaltenen Zellen in der Probenlösung erstrecken.
Der Prüfbereich ist typischerweise entlang einem Abschnitt des Primärkanals angeordnet, wo die zu sortierenden Zellen zur Sortierung auf der Basis eines Merkmals, das vorbestimmt ist, überprüft werden. In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Abschnitt des Probenbandes bei seinem Durchfluss durch den Prüfbereich untersucht, was eine Überprüfung mehrerer Zellen gleichzeitig ermöglicht. Der Begriff "mehrere" bezieht sich auf eine Zahl gleich oder größer als zwei. Das vorbestimmte Merkmal wird beispielsweise durch Testen des Vorhandenseins oder der Menge einer Markierung detektiert oder gemessen. Beispielsweise kann der Prüfbereich mit einer Auswertevorrichtung verbunden sein.
Die Auswertevorrichtung ermöglicht eine Identifikation, Detektion und/oder manchmal die Quantifizierung wenigstens eines durch eine Markierung oder mehrere Markierungen ermittelten Zellenmerkmals. Beispielsweise kann die Auswertevorrichtung aus einem oder mehreren Mikroskopen, Kameras, Bildaufnehmern, Dioden, Lichtstimulationsvorrichtungen (zum Beispiel Laser, Lampen, und so weiter), Photovervielfacherröhren und Prozessoren (zum Beispiel Computern und Software) und jeder Kombination davon bestehen, welche zusammenarbeiten, um ein ein Zellenmerkmal oder eine Markierung repräsentierendes Signal zu detektieren, und welche die Ermittlung und Richtung der Sortierung von Zellen in einen speziellen Zweigkanal zu ermöglichen.
Das Zellumlenksystem ist eine Einrichtung, mittels welchen der Fluss der Zellen die Richtung ändern kann, um in einen oder mehreren von den Zweigkanälen abhängig von einem Signal einzutreten, das in Verbindung mit einer Überprüfung in dem Prüfbereich empfangen wird. Ein Zellumlenksystem kann eine Vielzahl von Sortierungstechniken verwenden, um den Fluss der Zellen in einen speziellen Zweigkanal zu ändern oder zu lenken, einschließlich ohne Einschränkung elektrischer, elektroosmotischer, ventilgesteuerter, magnetischer, fluidverdrängungsgesteuerter und druckgesteuerter Sortierung und so weiter. 1 stellt eine Seitenansicht einer Sortiereinheit 10 gemäß einer exemplarischen Ausführungsform der Erfindung dar. Eine Sortiereinheit 10 ermöglicht eine Sortierung von Zellen gemäß der Erfindung und besteht aus einem Eingangskanal 12, einem Primärkanal 14, wenigstens zwei Zweigkanälen 16, 18, einer Trägerlösungsdüse 20 und einem Prüfbereich 22. Der Primärkanal 14 besteht aus einem ersten Ende, das typischerweise mit einem Trägerfluid-Behälter 24 verbunden ist, welcher beispielsweise entweder innerhalb oder getrennt von dem gleichen in Mikromaßstab hergestelltem Substrat angeordnet sein kann, das den Primärkanal 14 enthält. Der Primärkanal 14 besteht ferner aus einem zweiten Ende, das mit wenigstens zwei Zweigkanälen 16, 18 verbunden ist, welche an einer Verzweigungsstelle 26 verbunden sind. Ein Prüfbereich 22 ist entlang des Primärkanals 14 positioniert, und zwischen der Verzweigungsstelle 26 und der Trägerlösungsdüse 20 angeordnet. Ein Eingangskanal 12 steht mit dem Primärkanal 14 in Verbindung, indem er mit der Trägerlösungsdüse 20 verbunden ist. Der Eingangskanal 12 ist auch mit einem Probenfluidbehälter 28 verbunden. Eine Sortiereinheit besteht ferner aus einem (in 1 nicht dargestellten) Zellumlenksystem, welches typischerweise in der Nähe oder unmittelbar an der Verzweigungsstelle angeordnet ist. Ein Zellumlenksystem ermöglicht eine Änderung der Richtung des Zellflusses und einen Eintritt in einen oder mehrere Zweigkanäle in Abhängigkeit von einem in Verbindung mit einer Auswertung in dem Prüfbereich empfangenen Signal.
2 stellt eine dreidimensionale Ansicht einer Sortiereinheit 30 gemäß einer weiteren exemplarischen Ausführungsform der Erfindung dar. Die Sortiereinheit 30 von 2 besteht aus einem Eingangskanal 32, einem Primärkanal 34, wenigstens zwei Zweigkanälen 36, 38, einer Trägerlösungsdüse 40 und einem Prüfbereich 42. Um den Betrieb der Sortiereinheit 30 darzustellen, ist ein Band 44 mit der Sortiereinheit 30 in 2 dargestellt. Eine Trägerlösung kann in dem Trägerlösungsfluidbehälter 46 eingegeben werden und dazu gebracht werden, durch die den Primärkanal 34 einschließende Sortiereinheit 30 zu fließen. Die Probenlösung kann in den Probenbehälter 48 eingegeben werden und kann durch den Eingangskanal 32 hindurch und in den Primärkanal 34 fließen. Die Trägerlösung kann in dem Primärkanal 34 durch die Trägerlösungsdüse 40 eintreten. Bei der Trägerlösungsdüse 40 wird die Probenlösung 54 durch eine Trägerlösung 52 umgeben und zu einem Probenband 44 fokussiert, wie man es in den 3 und 4 sehen kann. Die Trägerlösung 52 bildet zwei Hochdruckströme über und unter der Probenlösung 54, welche bei einem niedrigeren Druck fließt und es wird ein Probenband 44 ausgebildet. Das Probenband 44 kann ferner geometrisch an einem Eintritt 56 zu einem schmaleren Abschnitt des Primärkanals 34 fokussiert werden. Das Probenband 44 fließt durch den Primärkanal 34, an dem Prüfbereich 42 vorbei und zu der Verzweigungsstelle 58. In der Nähe der Verzweigungsstelle 58 ermöglicht ein Zellumlenksystem eine Richtungsänderung des Flusses der Zellen und einen Eintritt in einen oder mehrere von den Zweigkanälen 36, 38 abhängig von einem in Verbindung mit einer Überprüfung in dem Prüfbereich 42 empfangenen Signal.
In einem weiteren Beispiel einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können andere Einrichtungen zur unterschiedlichen Verhinderung eines Flusses zwischen zwei oder mehr Zweigkanälen verwendet werden. Beispielsweise beschreibt das Micronics Inc. erteilte US Patent Nr. 5 726 404 ventillose Flüssigkeitsmikroschalter und lehrt ein ventilloses Verfahren und eine Vorrichtung für eine Hochgeschwindigkeitsumschaltung des Flüssigkeitsflusses zwischen sich kreuzenden Mikrokanälen. Durch Manipulieren der Drücke, kann der Fluidfluss unterschiedlich in Abwesenheit von Ventilen verhindert werden, um die Führung des Probenbandes in einen oder mehrere Zweigkanäle 64 oder 66 zu ermöglichen.
Eine weitere exemplarische Ausführungsform der Erfindung mit einem Zellumlenksystem ist in den 5A und 5B dargestellt. Dargestellt ist wenigstens ein Abschnitt einer Sortiereinheit 80, die einen Abschnitt eines Primärkanals 82 und mehrere Zweigkanäle 64, 86 enthält, welche bei einer Verzweigungsstelle 8 verbunden sind. In dieser Ausführungsform kann ein Probenband 90 in einen oder mehrere Zweigkanäle 84, 86 mittels einer Fluidverdrängung gelenkt werden. Hier ist ein Kanal 92 dargestellt, der mit dem Primärkanal 82 zwischen der Verzweigungsstelle 88 und dem Prüfbereich 94 verbunden ist, wobei der Kanal 92 einen Eintritt von Fluid in den Primärkanal 82 stromaufwärts vor der Verzweigungsstelle 88 ermöglicht. Fluid kann durch den Primärkanal 82 und durch die Verzweigungsstelle 88 strömen. Zu Beginn tritt kein Fluid in den Primärkanal 82 aus dem Kanal 92 ein, und aufgrund der geometrischen Positionierung des Primärkanals 82 und der Zweigkanäle 84, 86 fließt ein Teil des Fluids, der das Probenband 90 enthält in den unteren Zweigkanal 86. Wenn eine gewünschte Markierung in den Prüfbereich 94 detektiert wird, kann Fluid in den Primärkanal 82 aus dem Kanal 92 eingegeben werden. Das eintretende Fluid verdrängt teilweise das durch den Primärkanal 82 strömende Fluid und bewirkt, dass das Band 90 in den oberen Zweigkanal 84 gelenkt wird.
Alternativ kann in einem weiteren Beispiel das Probenband 90 durch eine negative Fluidverdrängung, bei der Fluid aus dem Primärkanal 82 durch den Kanal 92 entnommen wird, in einen Zweigkanal gelenkt werden. In diesem Beispiel verringert die Entnahme von Fluid aus dem Primärkanal 92 dadurch, dass Fluid in den Kanal 92 fließt das Volumen des Fluids in dem Primärkanal 82 und leitet das Probenband 90 in den unteren Zweigkanal 86. Wenn die Entnahme von Fluid aus dem Primärkanal 82 durch den Kanal 92 unterbrochen wird, nimmt das Volumen des Fluids in dem Primärkanal 82 zu und das Probenband 90 wird in den oberen Zweigkanal 84 gelenkt.
Weitere Ausführungsform der Erfindung mit einem Zellumlenksystem können eine Vielzahl von Sortierungstechniken verwenden, um den Fluss von Zellen in einem speziellen Zweigkanal zu ändern oder zu lenken, welche andere Einrichtungen zur Fluidverdrängung, wie zum Beispiel Druck beinhalten.
Obwohl das vorstehend beschriebene Sortiergerät eine Y-förmige Verbindungsstelle verwendet, ist diese nicht notwendigerwreise erforderlich. Weitere Arten von Verbindungsstellen, einschließlich ohne Einschränkung, T-förmige Verbindungsstellen oder Verbindungsstellen, die durch eine Überkreuzung von mehr als vier Kanälen ausgebildet werden, könnten zur Sortierung gemäß der Erfindung verwendet werden.
Zusätzlich ist, obwohl nur eine Sortiereinheit in den vorstehenden Figuren dargestellt ist, die Erfindung nicht auf diese nur eine Konfiguration beschränkt. Eine Sortiereinheit gemäß den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist ohne weiteres mit anderen Strukturen auf demselben im Mikromaßstab hergestellten Substrat integrierbar. Beispielsweise können Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung eine Reihe hintereinander angeordneter Sortiereinheiten enthalten, die für die Trennung unterschiedlicher Zellen in eine Population über aufeinander folgende Sortieroperationen nützlich sind. Eine weitere Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine im Mikromaßstab hergestellte Kassette enthalten, um eine oder mehrere Sortiereinheiten aufzunehmen, oder eine Serie von hintereinander angeordneten Sortiereinheiten.
Weiter Anordnungen, Konfigurationen und Verfahren dürften für einen Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sein. Weitere Ausführungsformen, Kombinationen und Modifikationen dieser Erfindung sind für den Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet angesichts dieser Lehren ersichtlich. Daher soll diese Erfindung nur durch die nachstehenden Ansprüche beschränkt sein, welche alle derartigen Ausführungsformen und Modifikationen beinhalten, wenn diese in Verbindung mit der vorstehenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen betrachtet werden.

Claims

Mikrofluidisches Gerät zum Sortieren von Zellen mit: a. einem Eingangskanal (12) zum Aufnahmen einer Probenlösung; b. einem Primärkanal (14, 34, 82), wobei ein erstes Ende des Primärkanals mit einem Behälter (24, 46) für eine Trägerlösung verbunden ist und ein zweites Ende mit wenigstens zwei Zweigkanälen (16, 18, 36, 38, 84, 86) verbunden ist, welche an einer Verzweigungsstelle (26, 58, 88) miteinander verbunden sind; c. einer Trägerlösungsdüse (20, 40), welche stromaufwärts von der Verzweigungsstelle (26, 58, 88) angeordnet ist und derart mit dem Eingangskanal (12, 32) verbunden, dass Probenlösung, die in den Primärkanal (14, 34, 82) eindringt, durch die Trägerlösungsdüse (20, 40) fließt und hydrodynamisch zu einem Band (44, 90) fokussiert wird, welches zwischen mindestens zwei Schichten einer Trägerlösung komprimiert ist; d. einem Prüfbereich (22, 42, 94), welcher zwischen der Verzweigungsstelle (26, 58, 88) und der Trägerlösungsdüse (20, 40) angeordnet ist, wobei der Prüfbereich mit einer Auswertevorrichtung verbunden ist, um Zellen in dem Band (44, 90) gemäß mindestens eines Zellmerkmals auszuwerten, während das Band den Prüfbereich passiert; und e. einem Zellumlenkungssystem, das auf die Auswertevorrichtung reagiert und fähig ist, das Band (44, 90), basierend auf dem ausgewerteten Merkmal in einen Zweigkanal (16, 18, 36, 38, 84, 86) zu lenken, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellumlenkungssystem einen separaten Kanal (92) aufweist, um das Probenband (44, 90) zu lenken, wobei das Probenband durch Flüssigkeitsverdrängung aus oder in diesen Kanal (92) gelenkt wird.
Mikrofluidisches Gerät nach Anspruch 1, wobei das Zellumlenkungssystem einen Kanal (92) zum Einspeisen von Flüssigkeit aufweist, wobei der besagte Kanal stromaufwärts von der Verzweigungsstelle (88) angeordnet ist, und das Einspeisen von Flüssigkeit aus dem Kanal durch Kommunikation mit der Auswertevorrichtung bestimmt wird.
Mikrofluidisches Gerät nach Anspruch 1, wobei das Zellumlenkungssystem einen Kanal (92) zur Entnahme von Flüssigkeit aus dem Primärkanal aufweist, wobei der besagte Kanal stromaufwärts von der Verzweigungsstelle (88) angeordnet ist und das Einspeisen von Flüssigkeit aus dem Kanal durch Kommunikation mit der Auswertevorrichtung bestimmt wird.
Mikrofluidisches Gerät nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, welches zusätzlich ein Mittel zum geometrischen lenken des Bands (44, 90) aufweist.
Mikrofluidisches Gerät nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes ausgewertete Zellmerkmal durch Einsatz einer Markierung nachweisbar gemacht wird.
Mikrofluidisches Gerät nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei markierte Zellen ein fluoreszierendes Signal aussenden, welches von der Auswertevorrichtung, die ein optisches Erkennungsgerät aufweist, erfasst wird.
Methode zum Sortieren von Zellen in einem mikrofluidischen Gerät mit folgenden Schritten: a. hydrodynamisches Fokussieren einer Zellpopulation in ein Probenband (44, 90), welches zwischen wenigstens zwei Schichten einer Trägerzlösung komprimiert ist; b. Fließen des Probenbands (44, 90) durch einen Primärkanal (14, 34, 82) mit einem Prüfbereich (22, 42, 94); c. Ermitteln der Anwesenheit oder Menge einer Markierung auf jeder Zel le während sie den Prüfbereich passiert; und d. Umlenken der Zellen an der Verzweigungsstelle (26, 58, 88) in einen ersten Zweigkanal (16, 36, 84) oder einen zweiten Zweigkanal (18, 38, 86) basierend auf der Anwesenheit oder Menge einer Markierung auf jeder Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen durch Flüssigkeitsverdrängung umgelenkt werden, wobei die Flüssigkeit aus oder in den separaten Kanal (92), welcher mit dem Primärkanal (14, 34, 82) verbunden ist, verdrängt wird.
Methode nach Anspruch 7, die zusätzlich den Schritt aufweist, das Band stromaufwärts des Prüfbereichs geometrisch zu fokussieren.
Methode nach Anspruch 7, wobei der Schritt des Umlenkens der Zellen das Anordnen eines Kanals (92) beinhaltet, um Flüssigkeit stromaufwärts der Verzweigungsstelle (26, 58, 88) einzuspeisen, wobei das Einspeisen von Flüssigkeit aus dem Kanal (92) durch Kommunikation mit der Auswertevorrichtung bestimmt wird.
Methode nach Anspruch 7, wobei der Schritt des Umlenkens der Zellen das Anordnen eines Kanals (92) beinhaltet, um dem Primärkanal (14, 34, 82) stromaufwärts der Verzweigungsstelle (26, 58, 88) Flüssigkeit zu entnehmen, wobei das Einspeisen von Flüssigkeit aus dem Kanal (92) durch Kommunikation mit der Auswertevorrichtung bestimmt wird.