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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft die präparatorische
Chemie, wie sie bezüglich
Ansamycinen angewendet wird, Verbindungen, die z. B. als Antibiotika
und bei der Behandlung von verschiedenen proliferativen Krankheiten, z.
B. Krebs, nützlich
sind.
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HINTERGRUND
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Die
folgende Beschreibung umfasst Informationen, die beim Verstehen
der vorliegenden Erfindung nützlich
sein können.
Es ist kein Eingeständnis,
dass Beliebige der hierin bereitgestellten Informationen Stand der
Technik oder relevant für
die vorliegend beanspruchten Erfindungen sind oder dass eine beliebige
Publikation, auf die speziell oder implizit Bezug genommen wird,
Stand der Technik ist.
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17-Allylaminogeldanamycin
(17-AAG) ist ein synthetisches Analogon von Geldanamycin (GDM).
Beide Moleküle
gehören
zu einer breiten Klasse von antibiotischen Molekülen, die als Ansamycine bekannt
sind. GDM, wie zuerst vom Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus
isoliert, war ursprünglich
als ein potenter Inhibitor von gewissen Kinasen identifiziert und
es wurde später
gezeigt, dass es durch Stimulieren der Kinasedegradation, speziell
durch Targeting von "molekularen
Chaperonen", z.
B. Hitzeschock-Protein 90s (HSP90s), wirkt. Anschließend wurde
für verschiedene
andere Ansamycine gezeigt, dass sie mehr oder weniger eine derartige
Aktivität
aufweisen, wobei 17-AAG unter den Vielversprechendsten ist und Gegenstand
von intensiven klinischen Studien ist, die gegenwärtig vom
National Cancer Institute (NCI) durchgeführt werden. Siehe, z. B., Federal
Register, 66(129): 35443-35444; Erlichman et al., Proc. AACR (2001),
42, Abstract 4474.
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HSP90s
sind allgegenwärtige
Chaperonproteine, die beim Falten, Aktivieren und Assemblieren einer großen Bandbreite
von Proteinen involviert sind, einschließlich Schlüsselproteinen, die in Signaltransduktion, Zellzyklussteuerung
und Transkriptionsregulation involviert sind. Forscher haben berichtet,
dass HSP90 Chaperonproteine mit wichtigen Signalproteinen in Zusammenhang
stehen, wie beispielsweise Steroidhormonrezeptoren und Proteinkinasen,
einschließlich
z. B. Raf-1, EGFR, Kinasen der v-Src Familie, Cdk4, und ErbB-2 (Buchner
J., 1999, TIBS, 24:136-141; Stepanova, L. et al., 1996, Genes Dev.
10:1491-502; Dai, K. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:22030-4). Studien weisen
ferner darauf hin, dass gewisse Co-Chaperone, z. B. Hsp70, p60/Hop/Stil,
Hip, Bag1, HSP40/Hdj2/Hsj1, Immunophiline, p23, und p50, HSP90 in
seiner Funktion helfen können
(siehe, z. B., Caplan, A., 1999, Trends in Cell Biol., 9: 262-68).
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Ansamycinantibiotika,
z. B. Herbimycin A (HA), Geldanamycin (GM) und 17-AAG üben ihre
Antikrebswirkungen vermutlich durch festes Binden der N-Terminus-Tasche
von HSP90 aus (Stebbins, C. et al., 1997, Cell, 89:239-250). Diese
Tasche ist hochgradig konserviert und weist eine schwache Homologie
zur ATP-Bindungsstelle der DNA-Gyrase auf (Stebbins, C. et al.,
supra; Grenert, J. P. et al., 1997, J. Biol. Chem., 272:23843-50).
Ferner wurde sowohl für
ATP als auch ADP gezeigt, dass sie diese Tasche mit niedriger Affinität binden
und dass sie eine schwache ATPase-Aktivität aufweist (Proromou, C. et
al., 1997, Cell, 90: 65-75; Panaretou, B. et al., 1998, EMBO J.,
17: 4829-36). In vitro und in vivo Studien haben gezeigt, dass eine
Belegung dieser N-terminalen
Tasche durch Ansamycine oder andere HSP90 Inhibitoren die HSP90
Funktion verändert
und die Proteinfaltung inhibiert. Bei hohen Konzentrationen wurde
für Ansamycine
und andere HSP90-Inhibitoren gezeigt, dass sie ein Binden von Proteinsubstraten
an HSP90 verhindern (Scheibel, T., H. et al., 1999, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 96:1297-302; Schulte, T. W. et al., 1995, J. Biol.
Chem. 270: 24585-8; Whitesell, L., et al., 1994, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:8324-8328). Für
Ansamycine wurde auch gezeigt, dass sie die AT-abhängige Freisetzung
von Chaperonassoziierten Proteinsubstraten hemmen (Schneider, C., L.
et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:14536-41; Sepp-Lorenzino
et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:16580-16587). In beiden Fällen werden
die Substrate durch Ubiquitin-abhängige Prozesse im Proteasom abgebaut
(Schneider, C., L., supra; Sepp-Lorenzino, L, et al., 1995, J. Biol.
Chem., 270:16580-16587; Whitesell, L. et al., 1994, Proc. Natl.
Acad Sci. USA, 91: 8324-8328).
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Diese
Substratdestabilisierung tritt in Tumorzellen und nicht transformierten
Zellen gleichermaßen
auf, und es wurde gezeigt, dass sie besonders wirksam an einer Untergruppe
von Signalregulatoren ist, z. B. Raf (Schulte, T. W. et al, 1997,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 239:655-9; Schulte, T. W., et al.,
1995, J. Biol. Chem. 270:24585-8), Kernsteroidrezeptoren (Segnitz,
B., und U. Gebring. 1997, J. Biol. Chem. 272:18694-18701; Smith,
D. F. et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15:6804-12), v-src (Whitesell,
L., et al., 1994, Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:8324-8328) und gewissen
Transmembran-Tyrosinkinasen (Sepp-Lorenzino, L. et al., 1995, J.
Biol. Chem. 270:16580-16587) wie beispielsweise dem EGF-Rezeptor
(EGFR) und Her2/Neu (Hartmann, F., et al., 1997, Int. J. Cancer
70:221-9; Miller, P. et al., 1994, Cancer Res. 54:2724-2730; Mimnaugh, E.
G., et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:22796-801; Schnur, R et al.,
1995, J. Med Chem. 38:3806-3812),
CDK4, und mutantem p53 (Erlichman et al., Proc. AACR (2001), 42,
Abstract 4474). Der Ansamycin-induzierte Verlust dieser Proteine
führt zur
selektiven Störung
gewisser Regulationswege und resultiert im Wachstumsstillstand in
spezifischen Phasen des Zellzyklus (Muise-Heimericks, R. C. et al.,
1998, J. Biol. Chem. 273:29864-72) und Apoptose und/oder in der
Differenzierung von so behandelten Zellen (Vasilevskaya, A. et al.,
1999, Cancer Res., 59:3935-40).
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Ansamycine
verheißen
folglich viel für
die Behandlung und/oder Prävention
von vielen Typen von Krebs und proliferativen Störungen. Gegenwärtig jedoch
zeigen die verschiedenen bekannten Verfahren zur Herstellung von
Ansamycinen eines oder mehrere von niedriger Ausbeute, niedriger
Reinheit, Instabilität,
Umwelttoxizität
assoziiert mit der Verwendung von halogenierten organischen Lösungsmitteln
und zusätzliche
Nebenkosten in Bezug auf Zeit, Ausgaben, Abfallbeseitigung und Gesundheitsrisiken
für jene,
die die so hergestellten Arzneimittel nehmen. Beispiele von bekannten
Verfahren umfassen Sasaki et al,
US
4,261,989 , übertragen
an Kaken Chemical Co, Ltd., das die Synthese von verschiedenen Ansamycinderivaten
einschließlich 17-AAG
unter Verwendung verschiedener organischer Lösungsmittel und mühsamer Extraktionsverfahren verwendet,
sowie Schnur et al,
U.S. 5,932,566 and
PCT/IB94/00160 (
WO 95/01342 ), übertragen
an Pfizer Inc., das ähnliche
Verfahren beschreibt.
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Es
ist ein Gegenstand der Erfindung, eine oder mehrere der Unzulänglichkeiten
des existierenden Stands der Technik zu verbessern, d. h. das Verbessern
von einem oder mehreren von niedriger Ausbeute, niedriger Reinheit,
Instabilität,
Umwelttoxizität
assoziiert mit der Verwendung von halogenierten organischen Lösungsmitteln
und zusätzliche
Nebenkosten in Bezug auf Zeit, Ausgaben, Abfallbeseitigung und Gesundheitsrisiken.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
gibt mehrere erfinderische Aspekte. In einem ersten Aspekt zeichnet
sich die Erfindung durch ein effizientes chemisches Verfahren zur
Herstellung von Ansamycinen aus, das die Verwendung von sowohl flüchtigen
aprotischen als auch flüchtigen
protischen Lösungsmitteln
einsetzt. Das Verfahren ist inter alia für die Herstellung von Benzochinon-Geldanamycin-Derivaten,
z. B. 17-AAG oder dessen 4,5-Dihydro-Analogon aus Benzochinon-Geldanamycinen
(GDM), nützlich.
Eine Ausführungsform
des letzteren Aspekts kombiniert z. B. 4,5-Dihydrogeldanamycin oder
Geldanamycin (oder andere Benzochinon-Geldanamycine mit reaktiven Resten,
z. B. einem Methoxy am Benzochinon-Teil) und ein Nucleophil in einem
flüchtigen
aprotischen Lösungsmittel,
z. B. einem von Tabelle 1 ausgewählten
Element, um ein Rohprodukt zu produzieren, das dann mittels Verdampfung
konzentriert wird und wobei zum resultierenden Produkt ein flüchtiges
protisches Lösungsmittel
zugegeben wird, entweder als eine Waschlösung oder unter Bedingungen,
die geeignet sind zum Kristallisieren oder Präzipitieren des Ansamycinprodukts
aus der Lösung.
In beiden Fallen werden beide Lösungsmittelarten
passend entfernt, z. B. durch Filtration, Zentrifugieren, Dekantieren
und/oder Verdampfen. Die Vorteile, die von der speziellen Ausführungsform
abhängen,
umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, reduzierte Aufreinigungsarbeit,
erhöhte
Ausbeute und/oder Reinheit und die Verwendung von klinisch akzeptablen
Reagenzien.
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Im
Folgenden ist ein exemplarisches Reaktionsschema für einen
Aspekt und eine Ausführungsform der
Erfindung dargestellt:
R
1 und R
2 sind entweder
beide Wasserstoff, wobei in diesem Fall die Bindung zwischen C4
und C5 eine Einfachbindung ist, oder andernfalls sind R
1 und
R
2 beide nicht vorhanden, wobei in diesem
Fall eine Doppelbindung zwischen C4 und C5 vorliegt. Die gestrichelte
Linie zwischen C4 und C5 verdeutlicht beide Möglichkeiten. Nu-H ist ein Nucleophil,
das die R
3O-Gruppe an Position 17 während der
Reaktion ersetzt. R
3 ist vorzugsweise ein
Alkoxy von 1–4
Kohlenstoffen, vorzugsweise Methoxy. Die Reaktion findet in einem
flüchtigen
aprotischen Lösungsmittel
statt, z. B. einem das aus den folgenden Möglichkeiten ausgewählt ist:
THF, Ethylether, MTBE, THP, Dioxan, Ethyl-sec-butylether, Methylbutylether, Ethylacetat
oder Methylacetat, und resultiert in einem substituierten Rohprodukt.
Nichthalogenierte Lösungsmittel
sind bevorzugt. In manchen Ausführungsformen wird
das Nucleophil langsam zu dem zu substituierenden Benzochinongeldanamycin-Derivat
zugegeben, dass vorwiegend ein einfach substituiertes Produkt erzeugt
wird. Dieser Schritt kann optional überwacht werden mittels z.
B. einer chromatographischen Technik, z. B. TLC, HPLC oder einer
anderen derartigen Technik, die im Stand der Technik allgemein bekannt
ist, z. B. Spektrometrie, NMR, etc., um die Vervollständigung
der Reaktion zu beurteilen. Derartige Techniken können auch
bei anschließenden
Schritten in Verfahren verwendet werden, wie z. B. den unten beschriebenen.
In bevorzugten Ausführungsformen
wird die Reaktion, bis zur Vervollständigung fortgesetzt, dass im
Wesentlichen das gesamte Benzochinonansamycin-Reagens in sein korrespondierendes Derivat
umgewandelt wird.
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Folgend
auf die Herstellung des substituierten Rohprodukts in flüchtigem
aprotischen Lösungsmittel wird
das Produkt mittels Verdampfen konzentriert und dann mit oder in
einem flüchtigen
protischen Lösungsmittel,
z. B. Isopropanol, Ethanol und/oder Wasser, aufgeschlämmt oder
gelöst.
Der Begriff "aufgeschlämmt" wie hierin verwendet
bezeichnet eine Suspension eines Feststoffs in einer Flüssigkeit
unter Bedingungen, in denen der Feststoff, z. B. Ansamycin, sich
nicht nennenswert löst.
Auf diese Weise kann ein "Waschen" bewirkt werden,
speziell wenn Verunreinigungen eine größere Löslichkeit unter derartigen
Bedingungen aufweisen, als dies der Feststoff tut. Beispiel 1 unten
ist veranschaulichend. Eine Alternative oder Ergänzung zu einem Waschen ist
ein Kristallisationsverfahren, z. B. wie unten in Beispiel 2 verkörpert.
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Jedes
der flüchtigen
aprotischen und protischen Lösungsmittel
kann bequem bzw. geeignet entfernt werden, z. B. durch Verdampfen,
was in Kombination mit Zentrifugieren, Wärme und/oder Vakuum stattfinden kann.
Wie ein Fachmann erkennen wird, können auch niedrigere Temperaturen
verwendet werden, vorausgesetzt, der Druck wird darauf abgestimmt
verringert (erhöhtes
Vakuum). Wärme-
oder Standardraumtemperaturtrocknen können in manchen Ausführungsformen
allein verwendet werden. Einer oder mehrere Filterschritte können ebenfalls
eingesetzt werden, und Waschen auf dem/den Filter(n) unter Verwendung
des/der flüchtigen protischen
Lösungsmittel(s)
kann bequem verwendet werden, um Verunreinigungen zu reduzieren.
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In
manchen Ausführungsformen
werden Nucleophile verwendet und ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Aminen, Thiolen, Thiolaten, Thioether, Alkoholen und Alkoxiden,
von denen jedes eine oder mehrere funktionelle Gruppen darstellt,
besitzt oder so modifiziert werden kann, diese zu besitzen, an die
zusätzliche
chemische Reste später
gebunden werden können,
z. B. um das resultierende Benzochinonansamycin-Derivat an eine
andere Struktur zu binden. In manchen bevorzugten Ausführungsformen
ist das Nucleophil ein primäres
oder sekundäres
Amin mit folgender Struktur:
wobei R
4 und
R
5 unabhängig
Wasserstoff, (C
1-C
12)
Alkyl oder (C
1-C
12)
Alkyl, optional substituiert mit Allyl-, Propargyl-, Hydroxy-, Amino-,
Mercapto-, Carboxylato- oder Halogen-funktionellen Gruppen, darstellen.
Eine nicht erschöpfende
Liste von Aminen im Allgemeinen, die verwendet werden können, umfasst
jene, die sich in Tabelle I der
US4261989 ,
erteilt an Sasaki, finden. Es wird erkannt werden, dass andere funktionelle
Gruppen, wie beispielsweise Olefine, auch angebunden werden können. In
manchen Ausführungsformen,
z B. wie in der Produktion von 17-AAG oder dem 4,5-Dihydro-Analogon,
ist das Nucleophil Allylamin. Andere nützliche Nucleophile, die verwendet
werden können,
umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf jene, die im Abschnitt
der detaillierten Beschreibung auftreten.
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In
manchen Ausführungsformen
kann es nützlich
sein, eine reduzierte Beleuchtung in einem oder mehreren der Schritte
des Verfahrens zu verwenden, um eine Photodegradation von Produkten
und/oder Recktanten zu verhindern oder zu minimieren. Zu diesem
Zweck kann das Endprodukt auch in einem lichtgeschützten Behälter gelagert
werden, um die Produktstabilität
und Haltbarkeit zu erhalten oder zu fördern.
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Der
vorherige Verfahrensaspekt der Erfindung kann sich durch jede beliebige
Kombination der angegebenen Ausführungsformen
auszeichnen, die konsistent miteinander sind. In einem breiteren
Verfahrensaspekt zeichnet sich die Erfindung durch Verfahren des
Konzentrierens und/oder Reinigens von Ansamycinen aus. Die Verfahren
verwenden flüchtige
aprotische Lösungsmittel,
vorzugsweise nichthalogenierte Lösungsmittel,
gefolgt von Verdampfen und Waschen oder Kristallisation unter Verwendung
eines flüchtigen
protischen Lösungsmittels,
wie beispielsweise jenen, die unten in den Beispielen 1 und 2 verwendet
werden. Andere Aspekte der Erfindung zeichnen sich durch die Produkte
aus, die durch derartige Verfahren hergestellt werden, und jedes
Produkt kann gemäß einer
der vorangehend erwähnten
Verfahrensausführungsformen
hergestellt werden.
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In
einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung aus durch ein
Verfahren zur Herstellung von 17-AAG, umfassend Bereitstellen von
17-AAG, aufgelöst
in einer protischen Lösungsmittellösung, und
Kristallisieren des 17-AAG von der protischen Lösungsmittellösung, wobei
die protische Lösungsmittellösung im
Wesentlichen frei von Wasser ist, und dann Entfernen der protischen
Lösungsmittellösung. Der
Begriff "Herstellung" meint z. B. Konzentrieren,
Reinigen oder Umwandeln einer existierenden polymorphen Form von 17-AAG
in eine andere Form von 17-AAG. Wenn auf diesem Begriff der Übergangsausdruck "umfassend" folgt, kann er auch
zusätzliche
spätere
Schritte umfassen, wie beispielsweise Auflösen in einer Lösung, Erzeugen
einer Formulierung etc. Der Begriff "entfernen" impliziert nicht zwingend die vollständige Entfernung,
jedoch bevorzugt die substanzielle Entfernung, sodass vorwiegend
der Feststoff 17-AAG nach diesem Schritt zurückbleibt, mit optional kleineren
Fraktionen an Lösungsmittel
vorhandenen. In einer Ausführungsform
ist das protische Lösungsmittel
Isopropanol und das 17-AAG zeigt nach Kristallisieren aus und Entfernen
des Isopropanols einen Schmelzpunkt von etwa 146°C bis 153°C oder etwa 155°C oder weniger.
Ein damit verbundener, jedoch anderer Aspekt hat die Bildung eines
Polymorphen von 17-AAG von höherem
Schmelzpunkt zur Folge, vorzugsweise eines, das einen Schmelzpunkt
im Bereich von etwa 200°C
oder mehr zeigt. In manchen bevorzugten Ausführungsformen ist der Schmelzpunkt
etwa 206–212°C. Dies kann
durch Kristallisation in einer protischen Lösungsmittellösung, z.
B. Ethanol, bewerkstelligt werden, die Wasser enthalten kann oder nicht
enthalten kann. Die Anmelder haben beobachtet, dass das Vorhandensein
von Wasser im Lösungsmittel üblicherweise
die letztendliche Schmelztemperatur des resultierenden 17-AAG-Polymorphs erhöht. Die
durch die vorangehenden Verfahren erzeugten Verbindungen werden
auch beansprucht mit oder ohne einem oder mehreren anderen beigemischten
Agenzien. Optional werden derartige Zusammensetzungen in einem lichtgeschützten Behälter verpackt,
um eine Degradation zu verhindern, zu minimieren oder zu verzögern. Es
ist zu erwarten, dass andere lipophile Verbindungen ähnlich zu
Polymorphen mit verschiedenem Schmelzpunkt führen. Diese Polymorphe zeichnen
sich aus oder zeichnen sich wahrscheinlich aus durch verschiedene
Nützlichkeiten,
z. B. die Formen von niedrigem Schmelzpunkt sind einfacher zu lösen und
zu formulieren, und für die
Formen von höherem
Schmelzpunkt wird erwartet, dass sie eine längere Stabilität zeigen.
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In
einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung aus durch ein
Verfahren der Umwandlung einer ersten polymorphen Form eines Ansamycins
in eine zweite polymorphe Form eines Ansamycins, umfassend Auflösen eines
Ansamycins einer ersten polymorphen Form in einer protischen Lösungsmittellösung unter
Bedingungen, die ausreichend sind, um eine zweite polymorphe Form
von Ansamycin zu erhalten. Ein Typ mit hohem Schmelzpunkt kann in
eine Form mit niedrigem Schmelzpunkt umgewandelt werden und umgekehrt. Das
Ansamycin ist vorzugsweise 17-AAG, es wird jedoch erwartet, dass
das Verfahren auch eine Nützlichkeit für andere
lipophile Verbindungen aufweist, und ein Beleg dafür ist in
den Beispielen 1–5
gezeigt. Potentielle Ausführungsformen
dieses Aspekts können
Merkmale der Ausführungsformen
des vorherigen Aspekts verfolgen.
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Vorteile,
die durch diese Erfindung realisiert werden, abhängig vom präzisen Aspekt und präziser Ausführungsform,
umfassen eines oder mehrere von hoher Ausbeute, hoher Reinheit,
Stabilität,
reduzierte Toxizität
bezüglich
Umwelt und Patient, sowie zusätzliche
einhergehender Reduktionen der Zeit, der Ausgaben, der Einfachheit
der Formulierung und der Abfallagerung und -entsorgung. Andere Vorteile,
Aspekte und Ausführungsformen
werden aus den Figuren, der detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen, die
folgen, ersichtlich werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein HPLC-Chromatogramm von 17-Allylaminogeldanamycin, das erhalten
wurde mittels einer Zorbax 300 SB-C8 (250 cm × 4,1 mm, 5 μ)-Säule, mobile
Phase: Acetonitril (0,05% TFA):Wasser (0,05% TFA); 30:70; Flussrate:
1 ml/min, detektiert bei 254 nm; die Retentionszeit für den gezeigten
Peak erscheint bei 16,49 min.
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2 zeigt
ein 1H NMR (400 mHz, CDCl3)-Spektrum.
Die chemische Verschiebung und Multiplizitäten sind konsistent mit der
Formation des gewünschten
Produkts.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zur Herstellung von Ansamycinen,
z. B. Benzochinonansamycine und Derivate davon, z. B. 17-AAG und
sein 4,5-Dihydro-Analogon. Die Verfahren vermeiden zeitaufwändige und
teure Aufarbeitungen, die mit Extraktionen und präparativen
chromatographischen Separationen verbunden sind, während eine
gute Reinheit und Ausbeute geboten werden.
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In
manchen Aspekten und Ausführungsformen
umfasst das Verfahren einen nucleophilen Angriff in einem oder mehreren
flüchtigen
aprotischen Lösungsmitteln,
z. B. einem Ether oder Acetat, vorzugsweise nicht halogeniert und
unter Bedingungen, die geeignet sind zum Lösen sowohl von Recktanten als
auch Produkt(en). Das/die resultierende(n) Produkt(e) wird/werden
dann mittels Verdampfen konzentriert und zum konzentrierten Produkt
wird ein flüchtiges
protisches Lösungsmittel
zugegeben, z. B. ein flüchtiger
Alkohol und/oder Wasser, unter Bedingungen, bei denen das flüchtige protische
Lösungsmittel
entweder dem Zweck einer Waschung oder als (Re)Kristallisationsmedium
dient. Filtration, Zentrifugieren, Dekantieren und/oder Verdampfen
können
verwendet werden, um bei beiden Verfahren zu helfen. Das/die resultierende(n)
Produkt(e) kann/können
direkt oder indirekt für
einen Zweck verwendet werden, der mit Ansamycinen in Verbindung
steht, z. B. als Antibiotika oder als Antikrebsmittel. Bei indirekter
Verwendung ist/sind das/die Produkt(e) nützlich z. B. als (ein) Intermediat(e)
in der Synthese von noch weiteren Ansamycinderivaten, z. B. jene
beschrieben in
US5932566 und
PCT/IB94/00160 (
WO95/01342 ),
erteilt an Schnur et al. und übertragen
an Pfizer Inc..
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Vor
der Erfindung waren DMF, DMSO, CH2Cl2, und CHCl3 die
Medien der Wahl zur Herstellung von Ansamycinen und der Durchführung von
Substitutionen und nucleophilen Additionen daran. Diese Reagenzien und
Verfahren erfordern arbeitsintensive Aufarbeitungen und mehrere
Wasserwaschungen und EtOAc-Extraktionen. Die Verwendung von chlorierten
Lösungsmitteln
insbesondere wird im heutigen regulatorischen Klima missbilligt.
Chlorierte Lösungsmittel
sind nicht umweltfreundlich und Rückstandsexpositionen stellen
ein potentielles Gesundheitsrisiko dar. Darüber hinaus haben die Anmelder
herausgefunden, dass derartige Lösungsmittel
Abbau- bzw. Degradationsprodukte fördern, die die Reinheit und
Ausbeute verschlechtern. Das erfinderische Verfahren ist viel direkter,
die Produkte werden typischerweise in größeren Ausbeuten und größerer Reinheit
gebildet und Umwelt- und Gesundheitsprobleme vermieden oder minimiert,
was sich folglich gut für kommerzielle
Anwendungen eignet.
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Der
Begriff "optional" wie in den Ansprüchen verwendet,
gibt an, dass das Durchführen
des Schritts, der diesem Begriff unmittelbar folgt, nicht notwendig
ist, um den Anspruch zu erfüllen.
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Die
Begriffe "entfernen" und "konzentrieren" implizieren nicht
zwingend 100% Eliminierung von Lösungsmittel
und können
geringere Prozentsätze
der Entfernung oder Konzentration nach sich ziehen.
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Der
Begriff "nicht halogeniert" meint das Nicht-Enthalten
von einem oder mehreren Halogenatomen, z. B. F, Cl, Br, und I. Ein
veranschaulichendes halogeniertes Lösungsmittel umfasst CHCl3 (Chloroform).
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Mit 'Waschen" wird angedeutet,
dass das protische Lösungsmittel
unter den eingesetzten Bedingungen die Ansamycine nicht nennenswert
löst. Ein
Waschschritt kann die Erzeugung einer Aufschlämmung umfassen und weist in
jedem Fall den Effekt des Entfernens von Verunreinigungen auf.
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Mit "flüchtigem
aprotischen Lösungsmittel" ist eines mit einem
Siedepunkt von zwischen etwa 35 und 102°C gemeint. Bevorzugt sind jene
aprotischen Lösungsmittel,
die unten in Tabelle I gezeigt sind. Agrotische Lösungsmittel
werden für "nicht-strukturiert" gehalten, d. h.
es fehlt ihnen an einem ausgedehnten Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen
im reinen flüssigen
Zustand. Gewisse aprotische Lösungsmittel
jedoch weisen die Fähigkeit
des Auflösens
und Stabilisierens von Verbindungen oder Soluten auf, die selbst
protisch sind, beispielsweise Alkohole oder Wasser selbst. Wasser
und THF beispielsweise sind mischbar. Im Allgemeinen fehlt es aprotischen
Lösungsmitteln
an der Fähigkeit,
selbst in Ionen unter normalen Umständen zu dissoziieren.
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Mit "flüchtigem
protischen Lösungsmittel" wird umfasst z.
B. Isopropanol, Ethanol, Wasser und Mischungen davon. Wasser ist
ein klassisches protisches Lösungsmittel.
Wasser in der flüssigen
Phase ist charakterisiert durch ein ausgedehntes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen.
In der flüssigen
Phase bildet jedes individuelle Wassermolekül vier Wasserstoffbrückenbindungen
mit benachbarten Wassermolekülen
aus. Ein Auseinanderbrechen dieses ausgedehnten Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerks
benötigt
eine signifikante Zuführung
von Energie zur Folge und dieser Energieaufwand spiegelt sich im
relativ hohen Siedepunkt (100°C)
für eine
Verbindung mit relativ niedrigem Molekulargewicht wieder. Alkohole,
speziell Alkohole von niedrigem Molekulargewicht (jene mit weniger
als 12 Kohlenstoffatomen) zeigen ähnliche Eigenschaften wie Wasser.
Im flüssigen
Zustand ist ein Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk
aufgebaut. Alkohole weichen jedoch in der Anzahl der aufgebauten
Wasserstoffbrückenbindungen
ab: Nur drei Wasserstoffbrückenbindungen treten
zwischen Alkohollösungsmittelmolekülen auf,
wohingegen vier derartige Bindungen typischerweise in flüssigem Wasser
vorliegen. Dies überträgt sich
in der Tat in eine größere "Lockerheit" zwischen Alkohollösungsmittelmolekülen, was
sich als niedrigere Siedepunkte und Gefriertemperaturen relativ
zu Wasser manifestiert. Eine physikalische Eigenschaft von Wasser/Alkohol-Mischungen
ist die Bildung von azeotropen Mischungen. Die Zugabe eines Alkohols
zu Wasser bewirkt eine Abnahme im Siedepunkt von Wasser. Die folgende
Tabelle veranschaulicht, dass die Zugabe von 10% Ethanol zu Wasser
ein Lösungsmittel
erzeugen wird, das flüchtiger
ist als Wasser selbst. Tabelle I
| Gew-%
Ethanol | Gefrierpunkt
(°C) | Siedepunkt
(°C) |
| 0 | 0 | 100 |
| 10 | –4,5 | 91,45 |
| 20 | –10,7 | 87,15 |
| 40 | –27,0 | 83,1 |
| 50 | –37,0 | 81,90 |
| 60 | –45,0 | 81,0 |
| 70 | –53,0 | 80,20 |
| 80 | –64,5 | 79,35 |
| 90 | –109 | 78,5 |
| 92,4 | –123 | 78,24 |
| 95,57 | –119,3 | 78,15 |
| 100 | –114,5 | 78,3 |
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Tabelle
I stellt ferner dar, dass Mischungen, die hauptsächlich Ethanol sind, z. B.
annähernd
95% Ethanol, 5% Wasser, bei derselben Temperatur wie reines Ethanol
sieden. Aus diesem Grund ist es in der Praxis unmöglich, reines
Ethanol durch Destillieren von Wasser/Ethanol-Mischungen zu erhalten,
eine gut bekannte Tatsache auf dem Gebiet des Destillierens von
Spirituosen. Eine weitere Charakteristik von protischen Lösungsmitteln
ist ihre Tendenz, zu einem gewissen Ausmaß einer Selbstionisation zu
unterliegen. Wasser beispielsweise dissoziiert in entgegengesetzt
geladene Ionen gemäß der folgenden
Gleichung: 2H2O ↔ H3O+ + –OH
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Reines
Wasser selbst dissoziiert zu einem kleinen jedoch messbaren Ausmaß und dies
führt zum
gut bekannten Wert von [H3O+]
= 10–7 (oder
pH 7) für
reines Wasser bei 25°C.
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Eine "nicht oxidierende
Umgebung" bedeutet
nicht, dass keine Oxidation möglich
ist oder tatsächlich auftritt,
lediglich, dass eine derartige Möglichkeit
reduziert ist. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf,
die Verwendung von reduzierter Beleuchtung und/oder reduziertem
gasförmigen
Sauerstoff. Das Letztere tritt auf z. B. wenn Luft oder Sauerstoff
durch Stickstoff- und/oder
Argongas ersetzt wird.
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Ansamycine und Benzochinonansamycine
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Der
Begriff "Ansamycin" ist im Stand der
Technik gut bekannt und betrifft eine breite Klasse von Strukturen,
die durch aliphatische Ringe von verschiedener Länge und Zusammensetzung, gegenüberliegende
Enden von aromatischen Ringstrukturen überbrückend, sowie deren reduzierte Äquivalente
charakterisiert sind. Subsumiert innerhalb dieser breiten Klasse
ist die Unterklasse, Benzochinonansamycine. Veranschaulichende Spezies
umfassen:
-
Ein "Benzochinonansamycin" wie hierin verwendet,
besitzt einen Benzochinonrest und umfasst jedes beliebige im Stand
der Technik bekannte Benzochinonansamycin. In manchen Aspekten,
die sich durch nucleophile Addition auszeichnen, umfassen diese
vorzugsweise einen Alkoxyrest auf dem Benzochinonteil des Moleküls, vorzugsweise
ein Methoxy, und vorzugsweise bei der 17-Position, das durch ein Nucleophil ersetzt werden
kann. Das Ergebnis der Reaktion ist die Bildung eines "Benzochinonansamycin-Derivats". Ansamycine und
Benzochinonansamycine gemäß der Erfindung
können
synthetisch, natürlich
auftretend oder eine Kombination der beiden sein, d. h. "semisynthetisch". Sie können auch
monomer oder dimer sein. Veranschaulichende Beispiele von dimeren
Ansamycinen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf jene, die sich bei
Rosen et al., Internationale Anmeldung PCT US00/09512 (
WO 00/61578 ), eingereicht am 7. April
2000 und veröffentlicht
am 19. Oktober 2000, finden. Andere exemplarische Benzochinonansamycine,
die bei den Verfahren der Erfindung nützlich sind, sowie deren Verfahren
zur Herstellung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf
jene, die z. B. in den
US Patenten
3,595,955 (beschreibend die Herstellung von Geldanamycin),
4,261,989 ,
5,387,584 , und
5,932,566 beschrieben sind. Geldanamycin
ist auch kommerziell verfügbar,
z. B. von CN-Biosciences, einer Konzerngesellschaft von Merck KGaA,
Darmstadt, Deutschland, mit Hauptsitz in San Diego, Kalifornien,
USA (Kat. Nr. 345805). Die biochemische Reinigung von 4,5-Dihydrogeldanamycin
und seines Hydrochinons von Kulturen von Streptomyces hygroscopicus
(ATCC 55256) ist beschrieben in der internationalen Anmeldung Nummer
PCT/CTS92/10189, übertragen
an Pfizer Inc., veröffentlicht
als
WO93/14215 am 22.
Juli 1993, wobei Callen et al. als Erfinder aufgeführt sind;
ein alternatives Verfahren der Synthese für 4,5-Dihydrogeldnanamycin
durch katalytische Hydrierung von Geldanamycin ist auch bekannt.
Siehe z. B. Progress in the Chemistry of Organic Natural Products,
Chemistry of the Ansamycin Antibiotics, 33 1976, S. 278.
-
Nucleophile
-
Viele
Arten von Nucleophile existieren, die in den hierin beschriebenen
erfinderischen Verfahren verwendet werden können. Bevorzugt werden jene,
die von der Gruppe bestehend aus Thiolen, Thiolaten, Thioether,
Alkoholen und Alkoxiden ausgewählt
sind, von denen jedes eine oder mehrere funktionelle Gruppen darstellt,
besitzt oder so modifiziert werden kann, diese zu besitzen, an welche
zusätzliche
chemische Reste später
gebunden werden können,
Z. B. Antikörper.
In manchen bevorzugten Ausführungsformen
ist das Nucleophil ein primäres
oder sekundäres
Amin mit der Struktur:
wobei R
4 und
R
5 unabhängig
Wasserstoff, (C
1-C
12)
Alkyl oder (C
1-C
12)
Alkyl, optional substituiert mit Allyl-, Propargyl-, Hydroxy-, Amino-,
Mercapto-, Carboxylato- oder Halogen-funktionellen Gruppen, darstellen.
Eine nicht erschöpfende
Liste von Aminen im Allgemeinen, die verwendet werden können, umfasst
jene, die sich in Tabelle I der
US4261989 ,
erteilt an Sasaki, finden. Es wird erkannt werden, dass andere funktionelle
Gruppen, wie beispielsweise Olefine, auch angebunden werden können. In
manchen Ausführungsformen,
z B. wie in der Produktion von 17-AAG oder dem 4,5-Dihydro-Analogon,
ist das Nucleophil Allylamin. Allylamin und andere hierin beschriebene
Nucleophile sind kommerziell verfügbar z. B. von Sigma-Aldrich.
Die folgende Tabelle veranschaulicht manche bevorzugten Nucleophile,
die in verschiedenen Ausführungsformen
der Erfindung verwendet werden können. Tabelle
II
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Flüchtige
aprotische Lösungsmittel
-
Exemplarische
flüchtige
aprotische Lösungsmittel,
die in verschiedenen Ausführungsformen
der Erfindung nützlich
sind, umfassen jene, die in Tabelle 111 gezeigt sind: Tabelle
III
-
Diese
Liste ist lediglich veranschaulichend und Durchschnittsfachleute
werden erkennen, dass andere flüchtige
aprotische Lösungsmittel
auch existieren, die verwendet werden können. Ether und Acetate sind
besonders nützlich,
da sie polare aprotische Medien sind; sie lösen eine Vielzahl organischer
Verbindungen, sie teilen Eigenschaften sowohl von Wasser als auch
Kohlenwasserstoffen und sie haben Alkyl-"Teile" und Sauerstoffatome mit freien Elektronenpaaren.
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Reaktionsgefäße
-
Geeignete
Reaktionsgefäße für die vorliegende
Erfindung sind kommerziell erhältliche
Glasreaktionskolben, ausgerüstet
mit Schliffglasverbindungen. Typischerweise werden derartige Gefäße mit Teflon
oder einem anderen inerten Material beschichteten magnetischen Rührstäben, z.
B. beschichtet mit PTFE oder einer anderen inerten Beschichtung,
verwendet. In „scaled-up" industriellen Synthesen
sind viele Metallreaktionsgefäße versiegelbar
und folglich von Haus aus lichtgeschützt. Mechanisches Rühren mittels
Rührschäften und/oder
-paddeln, die in das Reaktionsgefäß eingebracht sind, kann ebenfalls
verwendet werden. Zum Ausschluss von Licht kann einfaches Abdunkeln
des Raumlichts ausreichend sein. Alternativ können die Reaktionskolben und
beliebige Teile der Reaktion mit lichtempfindlichen Material in
Aluminiumfolie gewickelt werden oder in einer anderen Art von lichtgeschützten Behälter abgefüllt oder
verpackt werden, wie im Stand der Technik bekannt ist.
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Eine
Reaktion, die eine kontrollierte bzw. gesteuerte Rate der Zugabe
erfordert, kann in einem Mehrhalsrundkolben durchgeführt werden,
der mit einem zusätzlichen
Trichter (Tropftrichter) ausgerüstet
ist. Ein einfacher Zugabetrichter ist ähnlich einem Scheidetrichter,
mit einer männlichen
Standardkonusschliffverbindung am Auslass; die tropfenweise Zugabe
eines flüssigen
Recktanten oder einer Lösung
erlaubend, wobei der Absperrhahn als ein Mittel zum Steuern der
Tropfrate dient. Teflonabsperrhähne
sind für
Zugabetrichter bevorzugt, so dass die Verwendung von Absperrhahnfett,
das in organische Lösungsmittel
ausgelaugt werden kann und die gewünschten Produkte kontaminieren
kann, vermieden wird.
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In
vielen Reaktionen von kleinem Maßstab ist es häufig geeignet,
Zugaben von Flüssigkeiten
mit einer Spritze durchzuführen,
was eine präzise
Steuerung über
das Volumen an Reagenz, zugegeben pro Zeiteinheit, erlaubt. Noch
ein anderer Weg ein flüssiges
Reagenz zuzugeben ist über
eine Spritzenpumpe, wie allgemein im Stand der Technik bekannt ist.
Justierbare Flussratenpumpen und -apparate können auch verwendet werden.
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Reaktionsüberwachung
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Der
Anspruchsbegriff "überwacht
mittels einer chromatographischen Technik" meint, die Anwesenheit und/oder die
Menge eines gewünschten
Produkts, oder, alternativ, die Abwesenheit und/oder Menge eines
Reagenz oder unerwünschten
Produkts zu bestimmen. Mehrere Verfahren sind im Stand der Technik
bekannt, von denen ein paar unten diskutiert werden.
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TLC
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Dünnschichtchromatographie
(TLC) ist eine Form von Adsorptionschromatographie, bei der eine
dünne Schicht
von Adsorbens bzw. Adsorptionsmittel, getragen auf einer flachen
Oberfläche,
als eine stationäre Phase
verwendet wird. Die häufigsten
Adsorptionsmittel, die in der TLC verwendet werden, sind Silikagel
und Aluminiumoxid. Kieselgur und Zellulose werden weniger häufig verwendet.
Die Elution oder Entwicklung eines TLC-Chromatogramms wird bewerkstelligt
durch Kapillarbewegung des Lösungsmittels
die dünne
Schicht an Adsorbens hinauf.
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Das
für die
TLC verwendete Eluens ist abhängig
von der Art des Adsorbens und der Affinität der zu analysierenden Verbindung
zu dem Adsorbens. TLC ist sehr nützlich
für die Überwachung
des Fortschritts von Reaktionen, beim Detektieren von Intermediaten
in Reaktionen, beim Analysieren von Rohprodukten oder unbekannten
Mischungen, um die Anzahl von Komponenten zu bestimmen, und zum Überprüfen der
Effizienz von Reinigungsverfahren. Für farblose organische Verbindungen
kann eine Visualisierung der Verbindung auf dem Adsorbens mittels
einer Anzahl von im Stand der Technik bekannten Techniken bzw. Verfahren
bewerkstelligt werden. In der vorliegenden Erfindung jedoch sind
das Ausgangsmaterial als auch das Produkt jeweils gelb bzw. violett
gefärbt
und sind für
das Auge sichtbar.
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HPLC
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Bei
der Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) wird die flüssige
Phase mittels Druck über die stationäre Phase
getrieben, wobei der Fluss des Eluens durch eine das Adsorbens enthaltende
Säule erhöht wird.
Lösungsmittelmischungen
und Lösungsmittelgradienten
können
unter Verwendung moderner kommerzieller Instrumente eingesetzt werden.
UV-Detektoren variabler Wellenlänge
werden typischerweise für
die optimale Detektion der Ausgangsmaterialien und Produkte verwendet
und es können,
mit geeigneter Kalibrierung des Signals, Mengen an detektierten
Materialien unter Verwendung von kommerziell erhältlicher Software quantifiziert
werden.
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Lösungsmittelentfernung
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Es
ist häufig
notwendig, eine Lösung
zu konzentrieren oder Lösungsmittel
vollständig
zu entfernen, um ein gewünschtes
Produkt von einer Reaktionsmischung, einem Extrakt, einer chromatographischen
Fraktion oder von Mutterlaugen einer (Re)Kristallisation zu erhalten.
Dies kann durchgeführt
werden durch einfache oder partielle Destillationstechniken bei
Atmosphärendruck
oder unter reduziertem Druck. Manchmal wird Atmosphärendruckdestillation
verwendet, um den Großteil
der Lösungsmittel
zu entfernen, und verbleibende Spuren werden dann bei reduziertem
Druck entfernt. In jedem Fall muss der Stabilität und Flüchtigkeit des gewünschten
Produkts Berücksichtigung
geschenkt werden, d. h. es muss aufgepasst werden, dass eine Produktzersetzung
aufgrund von Überhitzen
vermieden wird.
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Kommerziell
erhältliche
Rotationsverdampfungsvorrichtungen existieren, um eine Lösungsmittelentfernung
und Lyophilisierung zu bewerkstelligen. Andere einfache Vorrichtungen
sind dem Fachmann bekannt. Verfahren zum Entfernen von Lösungsmittel
bei reduzierten Temperaturen unter entsprechend höherem Vakuum
sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.
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Filtration
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Filtration
ist die Separation bzw. Trennung von unlöslichen Feststoffen aus einer
Flüssigkeit
mittels einer porösen
Barriere, die als ein Filter bekannt ist; die Flüssigkeit passiert durch den
Filter, während
der Feststoff auf dem Filter zurückgehalten
wird. Die Flüssigkeit
gelangt durch den Filter mittels Schwerkraft (Gravitationsfiltration)
und/oder mittels Saugen (Saugfiltration). Das Verfahren der Filtration
wird verwendet, um eine Lösung
zu klären
und/oder einen Feststoff zu sammeln. Die am häufigsten in der organischen
Chemie verwendeten Filter sind Filterpapier und gesinterte Glasfritten,
von denen beide kommerziell von einer Vielzahl von Quellen erhältlich sind
und dem Fachmann geläufig
sind. Saugfiltration setzt typischerweise Büchner-, Hirsch oder gesinterte
Glasfritten ein. Bei der Saugfiltration wird der Druck unterhalb
des Filters mittels eines Absauggeräts oder eines anderes erzeugten
Vakuums reduziert; Atmosphärendruck
treibt dann die Flüssigkeit
durch den Filter.
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(Re)Kristallisation
-
Kristallisation
ist die Abscheidung von Kristallen aus einer Lösung oder Schmelze eines gegebenen Materials.
Während
des Verfahrens der Kristallbildung tendieren ähnliche Moleküle dazu,
an einen wachsenden Kristall angelagert zu werden, der aus derselben
Art von Molekülen
zusammengesetzt ist, aufgrund eines besseren Passens in ein Kristallgitter
für Moleküle derselben
Struktur als für
andere Moleküle.
Wenn es dem Kristallisationsverfahren erlaubt wird, unter beinahe
Gleichgewichtsbedingungen aufzutreten, wird die Präferenz von
Molekülen,
sich auf Oberflächen
abzuscheiden, die aus ähnlichen
Molekülen
zusammengesetzt sind, zu einer Zunahme in der Reinheit des kristallinen
Materials führen.
Folglich ist das Verfahren der Kristallisation ein wichtiges Verfahren
der Reinigung. Kristallisation wird unter dem breiteren Begriff "Präzipitation" subsumiert, der
andeutet, dass eine gelöste
Verbindung aufhört,
gelöst
zu sein, und effektiv eine feste Form außerhalb der Lösung annimmt,
ob "kristallisiert" oder nicht. Die
Präzipitation
oder Kristallisation kann über
eine anhaltende Zeitdauer auftreten, z. B. Sekunden bis Stunden
oder Tage. Diese Verfahren hängen
auch von der Temperatur ab, wie in Beispiel 2 unten demonstriert,
und hängen
ferner von den Eigenschaften des speziellen Lösungsmittels und den verwendeten
Soluten bzw. gelösten
Stoffen ab, mit einem Löslichkeitsdifferential über warme
gegenüber
kälteren
Temperaturen. Der Begriff "Rekristallisation" bedeutet, dass eine
oder mehrere vorherige Kristallisationen der Verbindung bereits
durchgeführt
worden sind, gleich ob unter Verwendung desselben Lösungsmittels
und derselben Bedingungen oder nicht, und ob ausreichend zum Erzielen
eines Polymorphs desselben oder eines anderen Schmelzpunkts oder
nicht.
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In
der Tat ist ein Aspekt der Erfindung die Fähigkeit, verschiedene polymorphe
Strukturen zu bilden und zu verwerten. Die Anmelder haben die Möglichkeit
für mehrere
relativ reine Formen (Polymorphe) von 17-AAG identifiziert, wobei
manche einen relativ niedrigen Schmelzpunkt von etwa 147–153°C besitzen,
z. B. wenn von im Wesentlichen reinem Isopropanol kristallisiert,
und manche durch einen höheren
Schmelzpunkt von zwischen etwa 200–212°C charakterisiert sind, z. B.
wenn von Ethanol kombiniert mit einer Fraktion von Wasser kristallisiert.
Das Wasser kann mit dem Ethanol vorgemischt sein oder später zur
Ethanollösung,
die bereits 17-AAG darin gelöst
enthält,
zugegeben werden. Die Form von 17-AAG mit niedrigerem Schmelzpunkt ist
leichter lösbar
bei Raumtemperatur in einer Vielzahl von Lösungsmitteln und Ölen als
die Form von 17-AAG mit höherem
Schmelzpunkt und bietet potentielle Vorteile für die Formulierung des 17-AAG
als ein Arzneimittel oder eine pharmazeutische Zusammensetzung.
Die Form mit höherem
Schmelzpunkt kann Vorteile einer größeren chemischen Stabilität unter
verschiedenen Bedingungen bieten, d. h. eine längere Haltbarkeit unter verschiedenen
Lagerbedingungen zeigen. Abhängig
vom Endziel kann man einfach die eine Form in die andere umwandeln,
einfach durch Auflösen
und Kristallisieren im geeigneten Lösungsmittel. Ein ähnliches
Phänomen wird
beobachtet unter Verwendung von 17-Aminogeldanamycin ("17-AG"; siehe Beispiele
5, 6), wobei vorgeschlagen wird, dass verschiedene polymorphe Formen
für andere
Ansamycine und wahrscheinlich auch andere damit nicht in Beziehung
stehende Verbindungen erzielt werden können.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Synthese von 17-Allylaminogeldanamycin
(17-AAG)
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Zu
45,0 g (80,4 mmol) Geldanamycin in 1,45 I trockenem THF in einem
trockenen 2 I-Kolben wurden tropfenweise über 30 Minuten 36,0 ml (470
mmol) Allylamin in 50 ml trockenem THF zugegeben. Die Reaktionsmischung
wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff für ca. 4 h gerührt, zu
welcher Zeit eine TLC-Analyse anzeigte, dass die Reaktion beendet
war [(GDM: hellgelb: Rf = 0,40; (5% MeOH – 95% CHCl3);
17-AAG: violett: Rf = 0,42 (5% MeOH – 95% CHCl3)].
Das Lösungsmittel
wurde mittels Rotationsverdampfung entfernt und das Rohmaterial
wurde in 420 ml H2O:EtOH (90:10) bei 25°C aufgeschlämmt, filtriert
und bei 45°C
für 24
h getrocknet, um 40,9 g (66,4 mmol) 17-AAG als violette Kristalle
(82,6% Ausbeute, > 98%
rein nach HPLC, überwacht bei
254 nm) zu ergeben. Schmelzpunkt 206–212°C. 1H NMR und HPLC sind konsistent
mit dem gewünschten Produkt.
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Beispiel 2
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Kristallisation von 17-AAG in Isopropanol
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Ein
alternatives Verfahren der Reinigung ist, anstatt Kristallisieren
in Ethanol, das rohe 17-AAG von Beispiel 1 in 800 ml 2-Propylalkohol
(Isopropanol) bei 80°C
zu lösen
oder unter Rückfluss
(annähernd
82,2°C) und
dann auf Raumtemperatur zu kühlen.
Filtration, gefolgt von Trocknen bei 45°C für 24 h ergibt 44,6 g (72,36 mmol)
17-AAG als violette Kristalle (90% Ausbeute, > 99% rein nach HPLC, überwacht bei 254 nm). Schmelzpunkt
147–153°C. 1H NMR
und HPLC sind konsistent mit dem gewünschten Produkt.
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Beispiel 3
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Ethanolwaschen des 17-AAG Polymorphs von
Beispiel 2
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Ein
alternatives Verfahren der Reinigung ist es, das 17-AAG-Produkt
von Beispiel 2 in 400 ml H2O:EtOH (90:10)
bei 25°C
aufzuschlämmen,
zu filtrieren und bei 45°C
für 24
h zu trocknen, um 42,4 g (68,6 mmol) 17-AAG als violette Kristalle
(95% Ausbeute, > 99%
rein nach HPLC, überwacht
bei 254 nm) zu ergeben. Schmelzpunkt 147–153°C. 1H NMR und HPLC sind konsistent
mit dem gewünschten
Produkt.
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Beispiel 4
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Polymorphe Umwandlung: Rekristallisation
von 17-AAG in Ethanol
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Ein
alternatives Verfahren der Reinigung ist es, das 17-AAG-Produkt
von Beispiel 2 in 300 ml EtOH unter Rückfluss (annähernd 80°C) zu lösen, gefolgt
von der Zugabe von 1200 ml H2O und Kühlen auf
Raumtemperatur. Die Feststoffe wurden mittels Filtration gesammelt
und bei 45 °C
für 24
h getrocknet, um 41,0 g (67 mmol) von 17-AAG als violette Kristalle
(93% Ausbeute, > 99%
rein nach HPLC, überwacht
bei 254 nm) zu ergeben. Schmelzpunkt 206–212°C. 1H NMR und HPLC sind konsistent
mit dem gewünschten
Produkt.
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Beispiel 5
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Synthese von 17-Aminogeldanamycin (17-AG)
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Zu
2,0 g (3,57 mmol) Geldanamycin in 40 ml trockenem THF in einem flammengetrockneten
Kolben wurden 2,55 ml (17,8 mmol, Lösung in Methanol, ca. 7 N)
Ammoniak unter Stickstoff zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde
bei Raumtemperatur für
24 h gerührt,
zu welcher Zeit eine TLC-Analyse anzeigte, dass die Reaktion vollständig war.
Das Lösungsmittel
wurde durch Rotationsverdampfen entfernt und das Rohmaterial wurde
in 30 ml EtOH gelöst
und durch Zugabe von 120 ml Wasser kristallisiert, um 1,8 g (3,30
mmol) 17-AG als rote Kristalle (99% rein nach HPLC) zu ergeben.
Schmelzpunkt 284–286°C. 1H NMR
und HPLC sind konsistent mit dem gewünschten Produkt.
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Beispiel 6
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Rekristallisation von 17-AG in Isopropanol
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Ein
alternatives Verfahren der Reinigung von 17-AG von Beispiel 5 ist,
das 17-AG Endprodukt in 30 ml, im Wesentlichen reinem 2-Propylalkohol
(Isopropanol) bei 80°C
oder unter Rückfluss
(annähernd
82,2°C) zu
lösen und
dann auf Raumtemperatur zu kühlen.
Filtration, gefolgt von Trocknen bei 45°C für 24 h ergibt 1,5 g (2,7 mmol)
17-AAG als violette Kristalle (76% Ausbeute, > 99% rein nach HPLC, überwacht bei 254 nm) zu ergeben.
Schmelzpunkt 267–271°C. 1H NMR
und HPLC sind konsistent mit dem gewünschten Produkt.
Andere
Ausführungsformen
liegen innerhalb der folgenden Ansprüche
